Nature.com نى زىيارەت قىلغىنىڭىزغا رەھمەت. سىز چەكلىك CSS قوللىشى بىلەن توركۆرگۈ نۇسخىسىنى ئىشلىتىۋاتىسىز. ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى تەۋسىيە قىلىمىز (ياكى Internet Explorer دىكى ماسلىشىشچان ھالەتنى چەكلەڭ). ئۇنىڭدىن باشقا ، داۋاملىق قوللاشقا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ئۇسلۇب ۋە JavaScript بولمىغان تور بېكەتنى كۆرسىتىمىز.
بىرلا ۋاقىتتا ئۈچ تام تەسۋىر كارۇسېلنى كۆرسىتىدۇ. ئالدىنقى ۋە كېيىنكى كۇنۇپكىلارنى ئىشلىتىپ بىر قېتىمدا ئۈچ تام تەسۋىردىن ئۆتۈڭ ياكى ئاخىرىدا سىيرىلما كۇنۇپكىلارنى ئىشلىتىپ بىر قېتىمدا ئۈچ تام تەسۋىردىن ئۆتۈڭ.
ئۆزلۈكىدىن قۇراشتۇرۇلغان نېرۋا ئورگانىزملىرى ئىنسانلارنىڭ يېتىلىشى ۋە كېسەللىكلىرىنى ئۈلگە قىلىدىغان ۋىرۇس سەھنىسىدىكى ئۈمىدۋار. قانداقلا بولمىسۇن ، ئورگانىكلارنىڭ vivo دا بار بولغان ئۇلىنىشى كەمچىل بولۇپ ، ئۇ يېتىلىشنى چەكلەيدۇ ۋە ھەرىكەتنى كونترول قىلىدىغان باشقا توك يولى بىلەن بىرىكىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. بۇ يەردە بىز ئىنسانلارنىڭ غول ھۈجەيرىسىدىن ھاسىل بولغان پوستلاق قەۋىتىنىڭ يېڭى تۇغۇلغان بوۋاقلار يالىڭاچ چاشقانلىرىنىڭ سېزىم سېزىمچان پوستلاق قەۋىتىگە كۆچۈرۈلگەنلىكىنى سەزگۈ ۋە ھەرىكەتلەندۈرگۈچ كۈچ بىلەن مۇناسىۋەتلىك توك يولىغا مۇجەسسەملەنگەن پىشقان ھۈجەيرە تىپلىرىنى تەرەققىي قىلدۇرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىمىز. MRI بىر نەچچە غول ھۈجەيرە لىنىيىسى ۋە ھايۋانلاردا كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى ئورگانىزىمنىڭ ئۆسۈشىنى ئاشكارىلىدى ، يەككە يادرولۇق ئانالىزدا پوستلاق ئۆسمىسىنىڭ ئىلگىرىلىشى ۋە پائالىيەتكە تايىنىش پروگراممىسىنىڭ بارلىققا كەلگەنلىكى ئاشكارىلاندى. دەرۋەقە ، كۆچۈرۈلگەن پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسى ۋىرۇسقا سېلىشتۇرغاندا تېخىمۇ مۇرەككەپ مورفولوگىيەلىك ، ماس قەدەملىك ۋە ئىچكى پەردە خۇسۇسىيىتىنى نامايەن قىلىپ ، تىموتىي ئۇنىۋېرسال كېسەللىكى بىمارلىرىنىڭ نېرۋا كەمتۈكلىكىنى بايقىيالايدۇ. ئاناتومىيىلىك ۋە فۇنكسىيەلىك ئىز قوغلاش ئارقىلىق كۆچۈرۈلگەن ئورگانىكلارنىڭ تالاكورتىك ۋە پوستلاق پوستلاق قەۋىتىنى قوبۇل قىلىدىغانلىقىنى ، نېرۋا ھەرىكىتىنىڭ vivo خاتىرىسىدە بۇ كىرگۈزۈشلەرنىڭ ئىنسان ھۈجەيرىسىدە سەزگۈر ئىنكاس پەيدا قىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى. ئاخىرىدا ، پوستلاق قەۋىتى ئورگانىك چاشقان مېڭىسىدە ئاكوننى ئۇزارتىدۇ ، ئۇلارنىڭ ئوپتىكىلىق ئاكتىپلىنىشى مۇكاپات ئىزدەش ھەرىكىتىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. شۇڭا ، كۆچۈرۈلگەن ئادەم پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسى پىشىپ يېتىلىپ ، ساھىبجامالنىڭ ھەرىكىتىنى كونترول قىلىدىغان توك يولىغا قاتنىشىدۇ. بىز بۇ خىل ئۇسۇلنىڭ باشقا ئۇسۇللار ئارقىلىق بايقىغىلى بولمايدىغان بىماردىن ھاسىل بولغان ھۈجەيرىلەردە تاياقچە دەرىجىدىكى فېنوتىپلارنى بايقاشقا قۇلايلىق يارىتىشىنى ئۈمىد قىلىمىز.
تەرەققىي قىلىۋاتقان ئىنسان مېڭىسى كۆرۈنەرلىك ئۆز-ئۆزىنى تەشكىللەش جەريانى بولۇپ ، بۇ جەرياندا ھۈجەيرىلەر كۆپىيىدۇ ، پەرقلىنىدۇ ، يۆتكىلىدۇ ۋە ئۇلىنىدۇ ۋە سەزگۈ تەجرىبىسى ئارقىلىق تېخىمۇ مۇكەممەللەشتۈرۈلگەن ئىقتىدارلىق نېرۋا توك يولىنى شەكىللەندۈرىدۇ. ئىنسانلارنىڭ مېڭىسىنىڭ يېتىلىشىنى چۈشىنىشتىكى ئاچقۇچلۇق مەسىلە ، بولۇپمۇ كېسەللىك ئارقا كۆرۈنۈشىدە ، مېڭە توقۇلمىلىرىغا ئېرىشەلمەسلىك. ئۆزلۈكىدىن تەشكىللىنىدىغان ئورگانىكلار ، جۈملىدىن ئىنسانلارنىڭ پوستلاق قەۋىتى (HCO ؛ ئىنسانلارنىڭ پوستلاق قەۋىتى دەپمۇ ئاتىلىدۇ) 2،3،4،5،6 ھاسىل قىلالايدۇ. قانداقلا بولمىسۇن ، بىر قانچە چەكلىمىلەر ئۇلارنىڭ تېخىمۇ كەڭ قوللىنىلىشىنى نېرۋا توك يولىنىڭ تەرەققىياتى ۋە ئىقتىدارىنى چۈشىنىشكە چەك قويىدۇ. بولۇپمۇ vivo دا بار بولغان مەلۇم مىكرو مۇھىت ۋە سەزگۈ كىرگۈزۈشنىڭ بولماسلىقى بىلەن hCO نىڭ يېتىلىشىنىڭ چەكلىك ياكى ئەمەسلىكى ئېنىق ئەمەس. بۇنىڭدىن باشقا ، HCO ھەرىكەت ھەرىكەت نەتىجىسىنى ھاسىل قىلالايدىغان توك يولىغا بىرلەشتۈرۈلمىگەچكە ، ئۇلارنىڭ گېن جەھەتتىكى مۇرەككەپ ۋە ھەرىكەت نېرۋا پىسخىكا كېسەللىكلىرىنى مودېللاشتۇرۇشتىكى پايدىسى چەكلىك.
HCO نىڭ مۇكەممەل ھايات مېڭىسىگە كۆچۈرۈلۈشى بۇ چەكلىمىلەرنى يېڭىدۇ. ئىلگىرىكى تەتقىقاتلاردا چاشقان پوستلاق قەۋىتىگە كۆچۈرۈلگەن ئىنسانلارنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ھايات قېلىش ، تۈر قۇرۇش ۋە چاشقان ھۈجەيرىسى بىلەن ئالاقە قىلالايدىغانلىقى كۆرسىتىلدى .7،8،9،10،11،12 قانداقلا بولمىسۇن ، بۇ سىناقلار ئادەتتە قۇرامىغا يەتكەن ھايۋانلاردا ئېلىپ بېرىلىدىغان بولۇپ ، ماس قەدەملىك ۋە ئوقنىڭ بىرىكىشىنى چەكلەپ قويۇشى مۇمكىن. بۇ يەردە ، بىز hiPS ھۈجەيرىسىدىن ھاسىل بولغان 3D hCO نى كۆچۈرۈلگەن كۆچۈرۈش ئەندىزىسىنى تەسۋىرلەپ ئۆتىمىز ، بىز سۇلياۋ تەرەققىياتنىڭ دەسلەپكى باسقۇچىدا ئىممۇنىتېت كەمتۈك چاشقاننىڭ دەسلەپكى سېزىم سېزىمچان پوستلاق قەۋىتىگە (S1) كۆچۈردۇق. كۆچۈرۈلگەن hCO (t-hCO) نېرۋا ھۈجەيرىلىرى ماھىيەتلىك يېتىلىشنى باشتىن كەچۈرۈپ ، سېزىمچان ئىنكاس قايتۇرىدىغان تالاكورتىك ۋە پوستلاق پوستلاق قەۋىتىنى قوبۇل قىلىدۇ ۋە چاشقان مېڭىسىگە ئوقون مۆلچەرىنى كېڭەيتىپ ، مۇكاپات ئىزدەش ھەرىكىتىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ. T-hCO نىڭ پىشىپ يېتىلىشى تىموتىي ئۇنىۋېرسال كېسەللىكى (TS) بىمارلىرىدىكى نېرۋا خاراكتېرلىك كەمتۈكلۈكنى ئاشكارىلىدى ، بۇ ئېلېكتر بېسىمىغا سەزگۈر L تىپلىق CaV1.2 كالتسىي قانىلىنىڭ ئۆزگىرىشى (CACNA1C تەرىپىدىن كودلاشتۇرۇلغان).
Vivo دىكى توك يولىدىكى ئىنسانلارنىڭ پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، بىز مۇكەممەل 3D hCO نى تۇغۇتتىن كېيىنكى دەسلەپكى ئاتموسفېرا چاشقىنى (تۇغۇتتىن كېيىنكى 3-7 كۈن) نىڭ S1 غا كۆچۈردۇق (1a رەسىم ۋە 1a-c رەسىمنىڭ كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇماتلىرى). بۇ ۋاقىتتا ، تالاكورتىك ۋە پوستلاق پوستلاق قەۋىتىدىكى مۆلچەرى S1 نىڭ ئىچكى قىسمىنى تېخى تاماملىمىدى (13-نومۇر). شۇڭا ، بۇ خىل ئۇسۇل ئىچكى توك يولىغا بولغان تەسىرىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈرۈش بىلەن بىر ۋاقىتتا ، t-hCO بىر گەۋدىلىشىشنى ئەڭ زور دەرىجىدە ئاشۇرۇش ئۈچۈن لايىھەلەنگەن. T-hCO نىڭ تىرىك ھايۋانلاردىكى ئورنىنى تەسەۋۋۇر قىلىش ئۈچۈن ، بىز كۆچۈرۈلگەندىن 2-3 ئاي كېيىن چاشقاننىڭ T2 ئېغىرلىقتىكى MRI چوڭ مېڭىسىنى قايتا قۇردۇق (1b رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 1d رەسىم). t-hCO ئاسانلا كۆزىتىلدى ۋە t-hCO نىڭ ھەجىم ئۆلچىمى مۇقىم بۆلەكلەردىن ھېسابلانغانغا ئوخشاپ قالدى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات رەسىم 1d ، e; P> 0.05). t-hCO ئاسانلا كۆزىتىلدى ۋە t-hCO نىڭ ھەجىم ئۆلچىمى مۇقىم بۆلەكلەردىن ھېسابلانغانغا ئوخشاپ قالدى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات رەسىم 1d ، e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а оемемнее измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фик киованных срезов (расширенные funные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO ئاسانلا كۆزىتىلدى ، ھەجىمدىكى t-hCO ئۆلچەش مۇقىم بۆلەكلەر ئۈچۈن ھېسابلانغان بىلەن ئوخشاش (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 1d ، e; P> 0.05).很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO 的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图 1d 、 e ； P> 0.05 ）。很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO t-hCO легко наблюдался, а оемемнее измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фик киованных срезов (расширенные funные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO ئاسانلا كۆزىتىلدى ، ھەجىمدىكى t-hCO ئۆلچەش مۇقىم بۆلەكلەر ئۈچۈن ھېسابلانغانغا ئوخشاپ قالدى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 1d ، e; P> 0.05).كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى تەخمىنەن 2 ئاي ئىچىدە كۆچۈرۈلگەن ھايۋانلارنىڭ% 81 ىدە t-hCO نى ئېنىقلىدۇق (n = 72 ھايۋان ؛ 10 hiPS ھۈجەيرە لىنىيىسىدىن hCO ؛ قوشۇمچە 1-جەدۋەلدىكى hiPS ھۈجەيرە لىنىيىسى). بۇنىڭ ئىچىدە% 87 چوڭ مېڭە پوستلاق قەۋىتىگە جايلاشقان (1c رەسىم). ئوخشاش كۆچۈرۈلگەن چاشقاننىڭ كۆپ ۋاقىت نۇقتىسىدا تەرتىپلىك MRI سىكانىرلاش ئارقىلىق ، 3 ئاي ئىچىدە t-hCO ھەجىمىنىڭ توققۇز ھەسسە ئاشقانلىقىنى بايقىدۇق (1d رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 1-رەسىم). كۆچۈرۈلگەن ھايۋانلارنىڭ كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 12 ئاي ئىچىدە ھايات قېلىش نىسبىتى يۇقىرى (% 74) (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 1g ۋە قوشۇمچە 2-جەدۋەل) ، ئوچۇق-ئاشكارە ماتور ياكى ئەستە تۇتۇش قابىلىيىتى ، گىلوز ياكى ئېلېكتروئېنسفالوگرامما (EEG) تېپىلمىدى. سانلىق مەلۇمات 1g ۋە قوشۇمچە جەدۋەل 2). 1h - m and 3e).
a ، تەجرىبە لايىھىسىنىڭ سىخېمىسى. hiPS ھۈجەيرىسىدىن ھاسىل قىلىنغان hCO پەرقلەندۈرۈشنىڭ 30-60 كۈنلىرىدە يېڭى تۇغۇلغان يالىڭاچ چاشقاننىڭ S1 غا كۆچۈرۈلگەن. b ، T2 ئېغىرلىقتىكى تاجىسىمان ۋە گورىزونتال MRI رەسىملىرى كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 2 ئايدىن كېيىن S1 دا T-hCO نى كۆرسىتىدۇ. كىچىك بالداق ، 2 مىللىمېتىر. c ، ھەر بىر hiPS كاتەكچە لىنىيىسىدە كۆرسىتىلگەن ئويۇش مۇۋەپپەقىيەتلىرىنىڭ سانى (n = 108 ، تاياقچە ئىچىدىكى سانلار hIPS كاتەكچىسىدىكى t-hCO نىڭ مىقدارىنى كۆرسىتىدۇ) ۋە پوستلاق ياكى تارماق رايون (n = 88). d ، تاجسىمان ئارتېرىيەنىڭ MRI تەسۋىرى (سول تەرەپ ؛ كۆلەم بالدىقى ، 3 مىللىمېتىر) ۋە ماس كېلىدىغان 3D ھەجىملىك ​​قايتا قۇرۇش (كۆلەم بالدىقى ، 3 مىللىمېتىر) T-hCO نىڭ 3 ئاي ئىچىدە ئاشقانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. e, چاشقان چوڭ مېڭە پوستلاق قەۋىتىدىكى t-hCO ئەندىزىسىنى تەكشۈرۈش. تارازىسى ، 1 مىللىمېتىر. f, t-hCO نىڭ ۋەكىللىك ئىممۇنىتېتلىق خىمىيىلىك رەسىملىرى سولدىن ئوڭغا (پەرقلەندۈرۈش جەريانىدا): PPP1R17 (4 ئايلىق) ، NeuN (8 ئايلىق) ، SOX9 ۋە GFAP (8 ئايلىق) ، PDGFRα; (8 ئاي) ، MAP2 (8 ئاي) ۋە IBA1 (8 ئاي). Scale bar, 20 µm. HNA نىڭ ئورتاق ئىپادىلىنىشى ئىنسانلارنىڭ كېلىپ چىقىشىدىكى ھۈجەيرىلەرنى كۆرسىتىدۇ. g, snRNA-seq: Seurat بىرلەشتۈرۈلگەندىن كېيىنكى بارلىق يۇقىرى سۈپەتلىك T-hCO يادرولىرىنىڭ بىرلىككە كەلگەن كۆپ ئىقتىدارلىق ۋە مۆلچەرى (UMAP) چوڭ-كىچىكلىكىنى تۆۋەنلىتىش تەسۋىرى (n = 3 t-hCO ئەۋرىشكىسى ، n = 2 hiPS ھۈجەيرە لىنىيىسى). ئاسترونومىيە ، ئاسترونومىيە سىزىقىدىكى ھۈجەيرىلەر; دەۋرىيلىك پروگرامما ، ئايلانما ئەۋلادلار GluN DL ، چوڭقۇر گلۇتاماتىك نېرۋا ھۈجەيرىسى GluN DL / SP ، چوڭقۇر ۋە يەر ئاستى يەلتاشما نېرۋا ھۈجەيرىسى. GluN UL ، ئۈستۈنكى قەۋەت گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسى oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC ، oligodendrocyte progenitor ھۈجەيرىسى; RELN, reelin neurons. h ، گېن ئونتولوگىيەسى (GO) ئاتالغۇسىنى بېيىتىش ئانالىزى t-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، T-hCO گلۇتاماتىك نېرۋا ھۈجەيرىسىدە كۆرۈنەرلىك تەڭشەلگەن (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ). h ، گېن ئونتولوگىيەسى (GO) ئاتالغۇسىنى بېيىتىش ئانالىزى t-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، T-hCO گلۇتاماتىك نېرۋا ھۈجەيرىسىدە كۆرۈنەرلىك تەڭشەلگەن (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ). h Неerронами hco. h, گېن ئونتولوگىيىسى (GO) ئاتالغۇسىنى موللاشتۇرۇش ئانالىزى ، HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، T-hCO گلۇتاماتىك نېرۋا ھۈجەيرىسىدە كۆرۈنەرلىك ئاكتىپلاش (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ) گېنى موللاشتۇرۇش ئانالىزى. h ，与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化> 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因本体论 (GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 ，-t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 <

2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 GO GO GO GO GO GO GO س . h ، گېن كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تەڭشەلدى (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ) T-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىدە HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسى ئونتولوگىيەلىك (GO) بېيىش مۇددىتىنى تەھلىل قىلغان.چېكىتلىك سىزىقنىڭ ئاق قىممىتى 0.05 نى كۆرسىتىدۇ. i, UMAP تەسۋىر T-hCO دىكى GluN ھۈجەيرە تىپلىرىنى 22 snRNA-seq قۇرامىغا يەتكەن ماتورلۇق پوستلاق سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىن بەلگە يۆتكەش ئارقىلىق ئىشلىتىش. CT - پوستلاق ئۆسمىسى ھۈجەيرىسى ، ET - تاشقى ھۈجەيرە ھۈجەيرىسى ، IT - ئىچكى تېلېگراف ھۈجەيرىسى ، NP - مۆلچەرگە يېقىن.
ئاندىن بىز t-hCO نىڭ تور قۇرۇلمىسى ۋە ئومۇمىي ھۈجەيرە تەركىبىنى باھالىدۇق. چاشقاننىڭ ئىچكى ئاجراتما ھۈجەيرىسىنىڭ ئانتىتېلا داغلىنىشى T-hCO بىلەن قان تومۇرنىڭ قان ئايلىنىشىنى ئاشكارىلىدى ، IBA1 داغ بولسا پۈتۈن كۆچۈرۈلگەن چاشقان مىكروبلىرىنىڭ بارلىقىنى ئاشكارىلىدى (1f رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 3c ، d). ئىممۇنىتېتلاش ئارقىلىق ئىنسانلارنىڭ يادرو ئانتىگېن (HNA) مۇسبەت ھۈجەيرىلىرى PPP1R17 (پوستلاق قەۋىتى) ، NeuN (نېرۋا ھۈجەيرىسى) ، SOX9 ۋە GFAP (يەر شارىدىن ھاسىل بولغان ھۈجەيرىلەر) ياكى PDGFRα (oligodendrocyte ئەۋلادلىرى) نى ئورتاق ئىپادىلەيدىغان ئاكتىپ ھۈجەيرىلەرنى ئاشكارىلىدى (1f رەسىم). T-hCO نىڭ ھۈجەيرە تەركىبىنى يەككە ھۈجەيرە ئېنىقلىقتا تەتقىق قىلىش ئۈچۈن ، بىز تەخمىنەن 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش ئارقىلىق يەككە يادرولۇق RNA تەرتىپىنى (snRNA-seq) ئورۇنلىدۇق. كۆپ مىقداردا سۈزۈش ۋە چاشقان يادروسىنى ئېلىۋېتىش 21 مىڭ 500 يۇقىرى سۈپەتلىك ئىنسانلارنىڭ يەككە يادرو خەرىتىسىنى ھاسىل قىلدى (1g رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 4a رەسىم ، b). تىپىك ھۈجەيرە تىپىدىكى بەلگىلەرنىڭ ئىپادىلەش ئەندىزىسى چوڭ مېڭە پوستلاق قەۋىتىدىكى گۇرۇپپىلارنى ئېنىقلاپ چىقتى ، بۇلار چوڭقۇر ۋە يۈزەكى گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسى ، ئايلانما ئەۋلادلار ، ئولىگودېندروسسىت ۋە ئاسترونوتىك نەسەبىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (1g رەسىم ، كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 4c رەسىم ۋە قوشۇمچە 3-جەدۋەل). SATB2 ۋە CTIP2 نىڭ ئىممۇنىتېت كۈچىدە كۆرسىتىلىشىچە ، پوستلاق قەۋىتى بار بولسىمۇ ، t-hCO ئېنىق ئاناتومىيىلىك قاتلامنى كۆرسەتمىگەن (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 3a رەسىم). باسقۇچقا ماسلاشتۇرۇلغان snRNA-seq hCO كەڭ كۆلەمدە ئوخشىشىپ كېتىدىغان ھۈجەيرە سىنىپى ھاسىل قىلدى ، بۇنىڭ ئىچىدە ئولىگودېندروسسىتنىڭ يوقلىقى ۋە GABAergic نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ بارلىقى قاتارلىقلار بار ، بۇ بەلكىم يان تەرەپتىكى تۇغما ھۈجەيرىلەرنىڭ ۋىرۇس شارائىتىدا ئىلگىرى دوكلات قىلىنغان پايدىلىق ئامىللارنى ئەكس ئەتتۈرۈشى مۇمكىن (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 4f - i ۋە قوشۇمچە 4-جەدۋەل). ئوخشىمىغان گېن ئىپادىلەش ئانالىزىدا t-hCO بىلەن hCO ئارىسىدىكى گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ كۆرۈنەرلىك پەرقى ئاشكارىلاندى (قوشۇمچە 5-جەدۋەل) ، بۇلار ماس قەدەملىك سىگنال بېرىش ، ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك يەرلىكلەشتۈرۈش ۋە توك بېسىمى ئارقىلىق قانال پائالىيىتى قاتارلىق نېرۋا يېتىلىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك گېنلارنىڭ ئاكتىپلىنىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (1-رەسىم ۋە قوشۇمچە 5-جەدۋەل). جەدۋەل 6). بۇنىڭغا ئاساسەن ، پوستلاق قەۋىتىدىكى گلۇتاماتېرگىيىلىك T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى تېز سۈرئەتتە ترانسكرىپسىيەنىڭ يېتىلىشىنى نامايان قىلدى.
T-hCO دىكى بۇ ترانسكرىپسىيەلىك ئۆزگىرىشنىڭ vivo دىكى HCO بىلەن vivo دىكى T-hCO نىڭ مورفولوگىيەلىك پەرقى بىلەن مۇناسىۋىتى بار-يوقلۇقىنى ئايدىڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، بىز 7 ~ 8 ئاي پەرقلەندۈرۈلگەندىن كېيىن ، باسقۇچقا ماس كېلىدىغان بىئوسىتسىن بىلەن تولغان HCO ۋە HCO نى جىددىي بۆلەكلەردە قايتا قۇردۇق. hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى (2a رەسىم). t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى كۆرۈنەرلىك چوڭ بولۇپ ، سوما دىئامېتىرى 1.5 ھەسسە ، دانىخورەكنىڭ ئىككى ھەسسىسىگە تەڭ ، ئومۇمىي ھەزىم قىلىش ئۇزۇنلۇقىنىڭ ئومۇمىي مىقدارى ئالتە ھەسسە ئاشقان (2b رەسىم). ئۇنىڭدىن باشقا ، بىز T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدىكى ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك ئومۇرتقىنىڭ زىچلىقىنى HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىگە قارىغاندا كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈردۇق (2c رەسىم). بۇ T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ چوڭ ئۈچەي ياللۇغى ۋە شاخلىنىشنى باشتىن كەچۈرگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ ، بۇ ھۈجەيرىلەرنىڭ داۋاملىق كۆپىيىشىگە ئەگىشىپ ، كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن t-hCO نىڭ قويۇق ئۆسۈشىگە تۆھپە قوشىدۇ (1d رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات 1-رەسىم). بۇ بىزنىڭ ئېلېكترو فىزىئولوگىيىلىك خۇسۇسىيىتىمىزنى تەكشۈرۈشىمىزگە تۈرتكە بولدى. پەردىنىڭ سىغىمى سەككىز ھەسسە يۇقىرى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 8d رەسىم) ، ئارام ئېلىش ھالىتىدىكى پەردىنىڭ يوشۇرۇن كۈچى تېخىمۇ يۇقىرى قۇتۇپلاشقان (تەخمىنەن 20 mV) ، نۆۋەتتىكى ئوكۇل T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە ئەڭ يۇقىرى ھاياجانلىنىش نىسبىتىنى HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىگە قارىغاندا يۇقىرى كۆتۈردى. in vitro (رەسىم 2d) ، e) ، بۇ t-hCO نىڭ تېخىمۇ چوڭ ۋە مۇرەككەپ مورفولوگىيەلىك ئالاھىدىلىكى بىلەن بىردەك. بۇنىڭدىن باشقا ، T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە ئۆزلۈكىدىن ھاياجانلىنىشتىن كېيىنكى ئوپېراتسىيەدىن كېيىنكى ھادىسە (EPSC) نىڭ چاستوتىسى كۆرۈنەرلىك يۇقىرى بولغان (2-رەسىم) ، بۇ T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە كۆزىتىلگەن ھەزىم قىلىش ئومۇرتقىسىنىڭ زىچلىقىنىڭ كۆپىيىشىنىڭ ئىقتىدارنىڭ قوزغىلىشچانلىقى بىلەن مۇناسىۋەتلىك ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. جىنسىي مۇناسىۋەت. بىز گلۇتاماتېرگىيىلىك نېرۋا ھۈجەيرىسىنى خاتىرىلەش ئارقىلىق ۋىرۇستا HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ پىشىپ يېتىلمىگەنلىكىنى جەزملەشتۈردۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 6a-c).
a ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈلگەندىن كېيىن بىئوسىتسىن بىلەن تولغان HCO ۋە t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنى 3D قايتا قۇرۇش. b ، مورفولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلەرنىڭ مىقدارلىشىشى (n = 8 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 6 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0084 ، * P = 0.0179 ۋە *** P <0.0001). b ، مورفولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلەرنىڭ مىقدارلىشىشى (n = 8 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 6 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0084 ، * P = 0.0179 ۋە *** P <0.0001). b, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 كۈنرونوۋ hCO, n = 6 زونرونوۋ t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b ، مورفولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلەرنىڭ مىقدارلىشىشى (n = 8 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 6 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0084 ، * P = 0.0179 ، ۋە *** P <0.0001). b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 b, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 كۈنرونوۋ hCO, n = 6 زونرونوۋ t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b ، مورفولوگىيىلىك ئالاھىدىلىكلەرنىڭ مىقدارلىشىشى (n = 8 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 6 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0084 ، * P = 0.0179 ، ۋە *** P <0.0001).c ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈلگەندىن كېيىن hCO ۋە t-hCO ھەزىم قىلىش شاخلىرىنى 3D قايتا قۇرۇش. قىزىل يۇلتۇزلار كۆكرەك ئومۇرتقىسىنى كۆرسىتىدۇ. ئومۇرتقا ئارىلىق تەخسىسىنىڭ زىچلىق دەرىجىسى (n = 8 hCO نېرۋا ، n = 6 t-hCO نېرۋا; ** P = 0.0092). d ، ئارام ئېلىش پەردىسىنىڭ يوشۇرۇن مىقدارى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). d ، ئارام ئېلىش پەردىسىنىڭ يوشۇرۇن مىقدارى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). گ d ، ئارام ئېلىش پەردىسىنىڭ يوشۇرۇن مىقدارى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 گ d ، ئارام ئېلىش پەردىسىنىڭ يوشۇرۇن مىقدارى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). e ، نۆۋەتتىكى ئوكۇلنىڭ كۆپىيىشى ۋە HK ۋە t-hCO نىڭ قايتا-قايتا ھەرىكەت يوشۇرۇن كۈچى ۋە ئەڭ چوڭ ئوق چىقىرىش نىسبىتى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). e ، نۆۋەتتىكى ئوكۇلنىڭ كۆپىيىشى ۋە HK ۋە t-hCO نىڭ قايتا-قايتا ھەرىكەت يوشۇرۇن كۈچى ۋە ئەڭ چوڭ ئوق چىقىرىش نىسبىتى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). ، e ، نۆۋەتتىكى ئەڭ چوڭ ئېتىش نىسبىتىنىڭ ئېشىشى ۋە مىقدارلىشىشى كەلتۈرۈپ چىقارغان HCO ۋە t-hCO دا ھەرىكەت يوشۇرۇن كۈچى قايتا قوزغىتىش (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). e ，通过增加电流注入诱导的 hCO 和 t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（ n = 25 个 hCO 神经元， n = 16 个 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 n = 25 个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）。 ، e ، نۆۋەتتىكى تەمىنلەش ۋە ئەڭ يۇقىرى ئېتىش نىسبىتىنىڭ مىقدارى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 16 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ f ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈشتە hCO ۋە t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدىكى ئۆزلۈكىدىن EPSCs (sEPSCs) ۋە ماس قەدەملىك ھادىسىنىڭ قېتىم سانى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 17 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). f ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈشتە hCO ۋە t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدىكى ئۆزلۈكىدىن EPSCs (sEPSCs) ۋە ماس قەدەملىك ھادىسىنىڭ قېتىم سانى (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 17 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). e f ، ئۆزلۈكىدىن EPSCs (SEPSCs) hCO ۋە t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش ۋە ماس قەدەملىك ھادىسە نىسبىتىنى مىقدارلاشتۇرۇش (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 17 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001). f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 17 t-hCO 神经元； *** P <0.0001）. f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25hCO P <0.0001）. e f ، ئۆزلۈكىدىن EPSCs (SEPSCs) hCO ۋە t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش ۋە ماس قەدەملىك ھادىسە نىسبىتىنى مىقدارلاشتۇرۇش (n = 25 hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 17 t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ *** P <0.0001).1208-2 لىنىيىسىدىكى bf ، hCO ۋە t-hCO پاراللېل ھالەتتە ساقلانغان ئوخشاش پەرقلەندۈرۈش گۇرۇپپىسىدىن ئېلىندى. g ، گېننى بېيىتىش ئانالىزى (بىر تەرەپلىمە فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقى) گېننىڭ كۆرۈنەرلىك تەڭشىلىشى (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ) T-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، بالدۇر ئىنكاس قايتۇرۇلغان (ERG) ۋە ئىنسانلار توپىدىكى LRG دىن كەلگەن. g ، گېننى بېيىتىش ئانالىزى (بىر تەرەپلىمە فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقى) گېننىڭ كۆرۈنەرلىك تەڭشىلىشى (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ) T-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، بالدۇر ئىنكاس قايتۇرۇلغان (ERG) ۋە ئىنسانلار توپىدىكى LRG دىن كەلگەن. گ сравнению с глута свер ггуческрим зонронами hCO наб ниновов как раннего (ERG) ، تاك ۋە پوزدنېگو (LRG) چانوۋ ، ۋابىسياشىخ от отности, идентифицированных в исследовании на м мачах in vivo16 vitro17. g ، گېن گۇرۇپپىسىنى موللاشتۇرۇش (بىر قۇيرۇقلۇق بېلىقچىنىڭ ئېنىق سىنىقى) ، vivo چاشقىنى 16 ۋە ئىنسانلارغا خاس بولغان LRG دىكى دەسلەپكى (ERG) ۋە كېچىكىپ (LRG) ھەرىكەتچان تايىنىش گېنىدىكى HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، T-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، كۆرۈنەرلىك ئاكتىپلاش (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 يادرودا ئىپادىلىنىدۇ) گېنىنى ئانالىز قىلىش. g ， t-hCO 谷氨酸能神经元与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化> 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧 Fisher 精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG) 和晚期反应 (LRG) 活性依赖性基因的基因组 16 和体外神经元 17 中的人类特异性 LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 co hco 谷氨酸 神经 元 相比 t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 p <0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 集富集 isher isher r r r r r r r r基因组 16 和 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性 LRG。 گ فى Фиура) раннего ответа (ERG) ۋە позднего зы, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мшахах vivo16 ۋە ۋىجو 17 دىكى LRG ، специфичнее длячовее. g, t-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىلىرى HCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا كۆرۈنەرلىك تەڭشەلدى (تەڭشەلگەن P <0.05 ، قاتلىنىش ئۆزگىرىشى> 2 ، كەم دېگەندە% 10 بالدۇر ئىنكاس قايتۇرۇش (ERG) ۋە كېچىكىپ ئىنكاس قايتۇرۇش گېننى بېيىتىش ئانالىزى (بىر قۇيرۇقلۇق بېلىقچىنىڭ ئېنىق سىنىقى) ئىنكاس پائالىيىتىگە تايىنىدىغان گېنلار (LRGs) vivo چاشقان 16 ۋە ۋىرۇس نېرۋا ھۈجەيرىسىدە بايقالغان.چېكىتلىك سىزىق Bonferroni تۈزىتىلگەن P قىممىتىنى 0.05 كۆرسىتىدۇ. h, GluN گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشى (ھەر بىر گېننىڭ ساختا بوغچىسى ۋە تارازىسى) T-hCO گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىسىدىكى LRG گېنىنىڭ snRNA-seq كۆپەيتىلگەن نۇسخىسىدا كۆرۈنەرلىك تەڭشەلدى. i, t-hCO (ئۈستى) ۋە hCO (تۆۋەن) نېرۋا ھۈجەيرىسىدە SCG2 ئىپادىسىنى كۆرسىتىدىغان ئىممۇنىتېت كۈچى. ئاق يا ئوق SCG2 + كاتەكچىسىنى كۆرسىتىدۇ. Scale bar, 25 µm. سانلىق مەلۇماتلار ± ئۆلچەملىك ياتلىشىش دەپ ئىپادىلىنىدۇ.
Ex vivo پارچىلىرىدا كۆزىتىلگەن t-hCO نىڭ پائالىيىتىنىڭ كۈچىيىشىگە ئاساسەن ، snRNA-seq ۋىرۇستا HCO غا سېلىشتۇرغاندا ، T-hCO دىكى گېن خاتىرىسىنىڭ پائالىيەتكە تايىنىشچانلىقىنى تەڭشىدى. Glutamatergic t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى كېچىكىپ ئىنكاس قايتۇرۇش ھەرىكىتىنى تەڭشەيدىغان گېننىڭ تېخىمۇ يۇقىرى سەۋىيىسىنى ئىپادىلىدى (رەسىم 2g ، h) ، بۇلار چاشقان ۋە ئىنسانلارنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىسىدىكى ئىلگىرىكى تەتقىقاتلاردا بايقالغان. مەسىلەن ، BDNF18 ، SCG2 ۋە OSTN ، ئىپتىدائىي پائالىيەتنى كونترول قىلىدىغان گېن ، T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ئىپادىسىنىڭ كۈچىيىدىغانلىقىنى كۆرسەتتى (2g-i رەسىم). شۇڭا ، T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى ترانسكرىپسىيە ، مورفولوگىيە ۋە ئىقتىدار ئانالىزى ئارقىلىق HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا كۈچەيتىلگەن يېتىلىش ئالاھىدىلىكىنى نامايان قىلدى.
T-hCO نىڭ يېتىلىشىنىڭ ئىنسانلارنىڭ مېڭىسىنىڭ يېتىلىشى بىلەن بولغان باغلىنىشىنى تېخىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا باھالاش ئۈچۈن ، بىز ھامىلىنىڭ ۋە قۇرامىغا يەتكەنلەرنىڭ پوستلاق ھۈجەيرىسىنىڭ تىپلىرىنى 19،20 ۋە قۇرامىغا يەتكەن 21،22 ، شۇنداقلا پوستلاق گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشى توغرىسىدىكى كەڭ سانلىق مەلۇماتلارنى سېلىشتۇرۇش ئېلىپ باردۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 5-رەسىم). ). ئالدىنقى 24-خىزمەت بىلەن ، يەرشارىدىكى HCO ۋە t-hCO نىڭ 7-8 ئاي پەرقىدىكى ترانسكرىپسىيەنىڭ يېتىلىش ھالىتى vivo نىڭ تەرەققىيات ۋاقتى بىلەن ئاساسەن بىردەك بولۇپ ، ھامىلىنىڭ كېچىكىشى بىلەن ئەڭ باراۋەر (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات 5a رەسىم). تىلغا ئېلىشقا ئەرزىيدىغىنى ، بىز ياش-ئۆسمۈرلەر بىلەن سېلىشتۇرغاندا ، t-hCO دا خاتىرىلەنگەن پىشىپ يېتىلىشنىڭ يۇقىرى كۆتۈرۈلگەنلىكىنى ، شۇنداقلا سىناپتوگېنېز ، ئاستروگېنېز ۋە يىراقنى كۆرەلمەسلىك بىلەن مۇناسىۋەتلىك ترانسكرىپسىيەنى ئاكتىپلاشنى كۆردۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، رەسىم 5b-d). ھۈجەيرە سەۋىيىسىدە ، بىز T-hCO دا نېپىز پوستلاق قەۋىتىنىڭ كىچىكلىكىنى ئىسپاتلايدىغان پاكىتلارنى بايقىدۇق ، گلۇتاماتېرىيە نېرۋا ھۈجەيرىلىرى توپى قۇرامىغا يەتكەن L2 / 3 ، L5 ۋە L6 نېرۋا تارماق تىپلىرى بىلەن قاپلانغان (1i رەسىم). بۇنىڭغا سېلىشتۇرغاندا ، گلۇتاماتېرگىيىلىك T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى بىلەن ھامىلىنىڭ پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ ئۆز-ئارا قاپلىنىشى ھامىلىدارلىقنىڭ ئوتتۇرىلىرىدا تېخىمۇ چەكلىك ئىدى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 5e-j رەسىم). T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ ئىنسانلارنىڭ تۇغۇتتىن كېيىنكى يېڭى نېرۋا ھۈجەيرىسىگە ئوخشايدىغان ياكى ئوخشىمايدىغانلىقىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، بىز ئىنسانلارنىڭ تۇغۇتتىن كېيىنكى پوستلاق قەۋىتىنىڭ ئۆتكۈر بۆلەكلىرىدە ئىنسانلارنىڭ L2 / 3 ئېھرام نېرۋا ھۈجەيرىسىنى ئېلېكترو فىزىئولوگىيىلىك خاتىرىلەش ۋە ئاناتومىيىلىك قايتا قۇرۇشنى ئېلىپ باردۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 7a رەسىم). L2 / 3 ئېھرام نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ ئېلېكترو فىزىئولوگىيىلىك خۇسۇسىيىتى t-hCO ئېھرام نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭكىگە ئوخشايتتى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 7e رەسىم). مورفولوگىيە جەھەتتىن ئېلىپ ئېيتقاندا ، تۇغۇتتىن كېيىنكى ئىنسان ئەۋرىشكىسىدىكى L2 / 3 نېرۋا ھۈجەيرىلىرى HCO غا قارىغاندا T-hCO بىلەن تېخىمۇ ئوخشىشىپ كېتەتتى ، گەرچە L2 / 3 ھۈجەيرىسى ئۇزۇنراق بولسىمۇ ، ئومۇمىي شاخلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ۋە ئومۇرتقا زىچلىقى يۇقىرى بولغان (3g رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 7b- رەسىم). G).
a ، كونترول قىلىش ۋە TS hiPS ھۈجەيرە لىنىيىسى ئارقىلىق ئىشلەپچىقىرىلغان hCO نى يېڭى تۇغۇلغان چاشقانغا كۆچۈرۈش. b ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈلگەندىن كېيىن بىئوسىتسىن بىلەن تولغان T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنى 3D قايتا قۇرۇش. c ، ئوتتۇرىچە ھەزىم قىلىش ئۇزۇنلۇقىنىڭ مىقدارى (n = 19 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0041). d ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈشتە كونترول ۋە TS t-hCO دىن 3D قايتا ياسالغان ھەزىم قىلىش شاخلىرى ۋە ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك ئومۇرتقا زىچلىقىنى مىقدارلاشتۇرۇش (n = 16 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ، *** P <0.0001). d ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈشتە كونترول ۋە TS t-hCO دىن 3D قايتا ياسالغان ھەزىم قىلىش شاخلىرى ۋە ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك ئومۇرتقا زىچلىقىنى مىقدارلاشتۇرۇش (n = 16 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ، *** P <0.0001). د d ، كونترول قىلىش ۋە T-hCO TS دىن 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش ۋە ئومۇرتقا ئارىلىق تەخسىسىنىڭ زىچلىقىنى مىقدارلاشتۇرۇش (n = 16 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ، *** P <0.0001). d ，分化 8 个月时对照和 TS t-hCO 的 3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（ n = 16 个对照神经元， n = 21 个 TS 神经元， *** P <0.0001 ）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 （n = 16 个 神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 د d ، 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش ۋە ئومۇرتقا ئومۇرتقىسى زىچلىقىنى مىقدارلاشتۇرۇشتا كونترول قىلىش خاراكتېرلىك كۆكرەك شاخلىرى ۋە TS t-hCO نى 3D قايتا قۇرۇش (n = 16 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ، *** P <0.0001).قىزىل يۇلتۇزلار كۆكرەك ئومۇرتقىسىنى كۆرسىتىدۇ. e ، كونترولدىكى ئۆزلۈكىدىن EPSC ۋە TS t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى 8 ئاي پەرقلەنگەندىن كېيىن. f, يىغىندى چاستوتا سىيۇژىتى ۋە ماس قەدەملىك ھادىسىنىڭ چاستوتىسى ۋە ئامپلىتسىيەسىنىڭ مىقدارى (n = 32 كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 26 TS نېرۋا ھۈجەيرىسى ؛ ** P = 0.0076 ۋە P = 0.8102). g, Scholl تەھلىلى TS ۋە hCO ۋە t-hCO دىكى نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنى كونترول قىلىدۇ. داش سىزىقلىرى سېلىشتۇرۇش ئۈچۈن ئىنسانلارنىڭ L2 / 3 تۇغۇتتىن كېيىنكى ئېھرام نېرۋا ھۈجەيرىسىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (n = 24 كونترول t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 21 TS t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ، n = 8 كونترول hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى ۋە n = 7 TS hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى). سانلىق مەلۇماتلار ئوتتۇراھال ± ئۆلچەملىك ياتلىشىش سۈپىتىدە ئىپادىلىنىدۇ
T-hCO نىڭ ئىنسانلارنىڭ پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ مورفولوگىيەلىك ۋە ئىقتىدار ئالاھىدىلىكىنى يۇقىرى سەۋىيىدە كۆپەيتىش ئىقتىدارى بىزنى T-hCO نىڭ كېسەللىك فېنوتىپلىرىنى بايقاشقا ئىشلىتىشكە بولىدىغان ياكى بولمايدىغانلىقىنى تەتقىق قىلىشقا ئۈندىدى. بىز TS غا دىققەت قىلدۇق ، بۇ نېرۋا ھۈجەيرىسىدە پائالىيەتكە تايىنىدىغان گېننىڭ كۆچۈرۈلۈشىنى قوزغىتىدىغان CaV1.2 گېنىدىكى ئىقتىدارنىڭ ئۆزگىرىشىدىن كېلىپ چىققان ئېغىر نېرۋا تەرەققىيات قالايمىقانچىلىقى. بىز ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان ئالماشتۇرۇش (p.G406R) ۋە ئۈچ كونترولنى ئېلىپ يۈرگەن ئۈچ TS بىمارلىرىدىن hCO غا ئېرىشتۇق (3a رەسىم). كۆچۈرۈلگەندىن كېيىن ، بىز TS نېرۋا ھۈجەيرىسىدە ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك مورفولوگىيەنىڭ كونترول قىلىنغانغا سېلىشتۇرغاندا ئۆزگەرتىلگەنلىكىنى بايقىدۇق (3b رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 8a ، b) ، دەسلەپكى دانىخورەك سانى ئىككى ھەسسە ئاشتى ، ھەزىم قىلىش ئۇزۇنلۇقى ئوتتۇرىچە ۋە ئومۇمىي جەھەتتىن تۆۋەنلىدى (3c رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 8c رەسىم). بۇ كونترول نېرۋا ھۈجەيرىسىگە سېلىشتۇرغاندا ، ئومۇرتقىنىڭ قويۇقلۇقى ۋە TS دىكى ئۆزلۈكىدىن EPSC چاستوتىسىنىڭ كۆپىيىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك (3d - f ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 8g رەسىم). يەنىمۇ ئىلگىرىلىگەن ھالدا تەھلىل قىلىش ئارقىلىق كونترول قىلىشقا سېلىشتۇرغاندا t-hCO TS دىكى بىنورمال ئۈچەي ياللۇغى شاخلىرىنىڭ ئەندىزىسى ئاشكارىلاندى ، ئەمما ۋىرۇس TS hCO دا ئوخشاش پەرقلەندۈرۈش باسقۇچىدا ئەمەس (3g رەسىم). بۇ بىزنىڭ ئىلگىرىكى TS دىكى پائالىيەتكە تايىنىدىغان ھەزىم قىلىش خاراكتېرلىك كىچىكلەش توغرىسىدىكى دوكلاتلىرىمىز بىلەن بىردەك بولۇپ ، بۇ كۆچۈرۈش سۇپىسىنىڭ vivo دىكى كېسەللىك فېنوتىپلىرىنى بايقاش ئىقتىدارىنى گەۋدىلەندۈرىدۇ.
ئاندىن بىز t-hCO ھۈجەيرىلىرىنىڭ قانچىلىك دەرىجىدە چاشقان S1 غا بىرلەشتۈرۈلگەنلىكىنى سورىدۇق. چاشقاندىكى S1 يان تەرەپتىكى شامالدارىش ئاساسى ۋە ئارقا تالا يادروسىدىن ، شۇنداقلا يان تەرەپتىكى ماتور ۋە ئىككىلەمچى سېزىمچان پوستلاق قەۋىتى ۋە يان تەرەپتىكى S1 دىن كۈچلۈك ماس قەدەملىك كىرگۈزۈشنى قوبۇل قىلىدۇ (4a رەسىم). ئىچكى ھالەتنى ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئۈچۈن ، بىز HCO نى غالجىر ۋىرۇس- dG-GFP / AAV-G بىلەن يۇقۇملاندۇردۇق ۋە 3 كۈندىن كېيىن HCO نى S1 چاشقانغا كۆچۈردۇق. بىز كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 7 - 14 كۈندىن كېيىن ، يان تەرەپتىكى S1 ۋە شامالدارىش تاياقچە باكتېرىيەسىنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىسىدە قويۇق GFP ئىپادىسىنى كۆردۇق (رەسىم 4b ، c). بۇنىڭدىن باشقا ، تالالىق بەلگە تورى netrin G1 نىڭ ئانتىتېلا داغلىنىشى T-hCO دا تالا ئۇچىسىنىڭ بارلىقىنى ئاشكارىلىدى (4d رەسىم ، e). بۇ باغلىنىشچان پەرەزلەرنىڭ T-hCO ھۈجەيرىسىدە ماس قەدەملىك ئىنكاس پەيدا قىلالايدىغان-قىلالمايدىغانلىقىنى باھالاش ئۈچۈن ، بىز تالاكورتىك قەۋىتىنىڭ ئۆتكۈر بۆلەكلىرىدە ئادەم ھۈجەيرىسىدىن پۈتكۈل ھۈجەيرە خاتىرىسىنى ئورۇنلىدۇق. چاشقان S1 نىڭ ئېلېكتر غىدىقلىشى ، ئىچكى كاپسۇل ، ئاق ماددا ، T-hCO ئەتراپىدىكى تالا ياكى t-hCO دىكى ئوپسىن ئىپادىلەيدىغان تالا ئۇچىنى ئوپتىگېنتىك قوزغىتىش AMPA قوبۇل قىلغۇچى قارشى تۇرغۇچى NBQX نىڭ تەسىرىگە ئۇچرىغان T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىدە قىسقا مۇددەتلىك EPSC نى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. (4f رەسىم ، g ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 9a - g رەسىم). بۇ سانلىق مەلۇماتلار t-hCO نىڭ چاشقان مېڭىسىگە ئاناتومىيىلىك ھالدا بىرىكتۈرۈلگەنلىكىنى ۋە چاشقان ساھىبجامال توقۇلمىلىرى ئارقىلىق قوزغىتالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
a ، غالجىرلىقنى ئىز قوغلاش تەجرىبىسىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى. b, GFP ۋە ئىنسانلارغا خاس STEM121 ئىپادىسى t-hCO بىلەن چاشقان چوڭ مېڭە پوستلاق قەۋىتى (ئۈستۈنكى تاختا). چاشقاننىڭ يان تەرەپتىكى شامالدارىش ئاساسى يادروسى (VB) (سول تەرەپ سول تەرەپ) ۋە يان تەرەپ S1 (ئوڭ تەرەپ ئاستى) دىكى GFP ئىپادىسى كۆرسىتىلدى. Scale bar, 50 µm. قىزىل كۋادراتلار چوڭ مېڭىنىڭ رەسىم تارتىلغان جايلىرىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ. c ، GFP نى ئىپادىلەيدىغان ھۈجەيرىلەرنىڭ مىقدارى (n = 4 چاشقان). d, e - Net-G1 + t-hCO دىكى تالامىن تېرمىنالى. d t-hCO ۋە VB يادروسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان تاجىسىمان بۆلەكنى كۆرسىتىدۇ. كىچىك بالداق ، 2 مىللىمېتىر. e t-hCO (سولدا) ۋە VB (ئوڭدا) نېرۋا ھۈجەيرىسىدە Netrin G1 ۋە STEM121 ئىپادىسىنى كۆرسىتىدۇ. Scale bar, 50 µm. ئاپېلسىن چېكىتلىك سىزىق t-hCO چېگرىسىنى كۆرسىتىدۇ. f, g, T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ S1 چاشقان (f) ياكى ئىچكى كاپسۇل (g) دىكى ئېلېكتر غىدىقلىشىدىن كېيىنكى ئىزلىرى ، (بىنەپشە) ياكى (قارا) NBQX (سولدا). EPSC ئامپلىتسىيەسى NBQX (n = 6 S1 نېرۋا ھۈجەيرىسى ، * P = 0.0119 ؛ ۋە n = 6 ئىچكى كاپسۇل نېرۋا ھۈجەيرىسى ، ** P = 0.0022) (ئوتتۇرىدا). T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ نىسبىتى SPS (f) ياكى ئىچكى كاپسۇل (g) (ئوڭدا) نىڭ ئېلېكتر غىدىقلىشىغا قارىتا EPSC نى كۆرسىتىدۇ. ACSF ، سۈنئىي مېڭە سۇيۇقلۇقى. h ، 2P تەسۋىر تەجرىبىسىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى (سولدا). GCaMP6s نىڭ t-hCO (ئوتتۇرىدا) ئىپادىلىنىشى. كىچىك بالداق ، 100 µm. GCaMP6s نىڭ فلۇئورېسسېنسىيە ۋاقتى (ئوڭدا). i ، ئۆزلۈكىدىن پائالىيەت فلۇئورېسسېنسىيەسىنىڭ Z نومۇرى. j ، بۇرۇتنى غىدىقلاشنىڭ سىخېمالىق تەسۋىرى. k ، z نومۇر ئالغان 2P فلۇئورېسسېنسىيە ترايېكتورىيىسى بىر سىناقتا ، مەسىلەن ھۈجەيرىلەردە نۆل (سىزىقلىق سىزىق) دىكى پىچىرلاش ئېغىش بىلەن ماسلاشتۇرۇلغان. l ، نۆل (سىزىقلىق سىزىق) (قىزىل) ياكى ئىختىيارى شەكىللەنگەن ۋاقىت تامچىسى (كۈلرەڭ) دىكى بارلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ نوپۇس ئوتتۇرىچە z نومۇرى ئىنكاسى. m. ئوپتىكىلىق بەلگە تەجرىبىسىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى. n ، كۆك لازېر غىدىقلاش ياكى پىچىرلاش ئېغىش جەريانىدا t-hCO ھۈجەيرىسىدىكى خام توك بېسىمى ئەگرى سىزىقى. قىزىل ئوقلار نۇر (ئۈستى) ياكى ۋىۋىسكا ئېغىش (ئاستى) كەلتۈرۈپ چىقارغان تۇنجى تاياقنى كۆرسىتىدۇ. كۈلرەڭ سايە پىچىرلاش دەۋرىنى كۆرسىتىدۇ. o ، چوققا نۇر دولقۇنى ۋە پىچىرلاش ئېغىش ئىنكاسى. p ، بىر قېتىملىق ئۇرۇنۇشنىڭ تاياقلىرى ، مىسال كاتەكچىلىرىدىكى پىچىرلارنىڭ ئېغىشى بىلەن ماسلاشتۇرۇلغان. 0 ۋىۋىسكا ئېغىشنى كۆرسىتىدۇ (سىزىقچە سىزىق). q ، بارلىق سەزگۈر ھۈجەيرىلەرنىڭ نوپۇس ئوتتۇرىچە z نومۇرى ئېتىش نىسبىتى نۆل (سىزىقلىق سىزىق) (قىزىل) ياكى ئىختىيارى شەكىللەنگەن ۋاقىت تامچىسى (كۈلرەڭ) دىكى پىچىرلاش بىلەن ماسلىشىدۇ. r ، سەزگۈرلۈك بىرلىكىنىڭ نىسبىتى ۋىۋىسكا ئېغىش (n = 3 چاشقان) (سولدا) كۆرۈنەرلىك ئۆزگەرتىلگەن. چوققا z نومۇرى كېچىكىشى (n = 3 چاشقان ؛ n = 5 (سۇس يېشىل) ، n = 4 (قېنىق يېشىل) ، n = 4 (سىئەن) ۋىۋىسكا ئېغىش مودۇلى بىرلىكى) (ئوڭدا). سانلىق مەلۇماتلار ± ئۆلچەملىك ياتلىشىش دەپ ئىپادىلىنىدۇ
ئاندىن بىز vivo دىكى سەزگۈ غىدىقلاش ئارقىلىق t-hCO نى قوزغىتالامدۇ يوق دەپ سورىدۇق. بىز گېن ئارقىلىق كودلانغان كالتسىي كۆرسەتكۈچى GCaMP6 نى ئىپادىلەيدىغان hCO نى S1 چاشقانغا كۆچۈردۇق. 150 كۈندىن كېيىن ، بىز تالا فوتومېتىرىيىسى ياكى ئىككى فوتونلىق كالتسىي تەسۋىر ھاسىل قىلدۇق (4h رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10a رەسىم). بىز T-hCO ھۈجەيرىلىرىنىڭ ماس قەدەملىك رېتىملىق پائالىيەتنى كۆرسەتكەنلىكىنى بايقىدۇق (4i رەسىم ، كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10b رەسىم ۋە قوشۇمچە سىن 1). چوققا t-hCO پائالىيىتىنى خاراكتېرلەندۈرۈش ئۈچۈن ، بىز ناركوز قىلىنغان كۆچۈرۈلگەن چاشقانلاردا تاشقى ھۈجەيرە ئېلېكتىرو فىزىئولوگىيىلىك خاتىرىسىنى قىلدۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10c-f). بىز MRI ​​رەسىملىرىدىن ئىستېرېئولۇق كوئوردېنات ھاسىل قىلدۇق. شۇڭا ، بۇ خاتىرىلەنگەن ئورۇنلار ئىنسانلارنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىسىگە ۋەكىللىك قىلىدۇ ، گەرچە ئېلېكترو فىزىئولوگىيە يالغۇز بىر تۈرنىڭ ئېنىقلىنىشىغا يول قويمىسىمۇ. بىز ماس قەدەملىك پائالىيەتنىڭ پارتىلىشىنى كۆردۇق (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10-رەسىم). پارتىلاش تەخمىنەن 460 ms داۋاملاشقان بولۇپ ، تەخمىنەن 2 s جىمجىتلىق دەۋرى بىلەن ئايرىلغان (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10d رەسىم ، e). ئايرىم ئورۇنلار ئوتتۇرا ھېساب بىلەن ھەر قېتىمدا ئۈچ قېتىم ئەتراپىدا ئوق چىقاردى ، بۇ ھەر قېتىملىق پارتىلاشتا تەخمىنەن% 73. يەككە ئورۇنلارنىڭ پائالىيىتى بىر-بىرىگە زىچ مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، بۇ باغلىنىشلار ئوخشاش شارائىتتا خاتىرىلەنگەن ۋاكسىنا قىلىنمىغان ھايۋانلاردا بايقالغان ئورۇنلارنىڭكىدىن يۇقىرى بولغان (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10-رەسىم). ئېنىقلانغان ئىنساندىن ھاسىل بولغان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ تاياقچە ئىنكاسىنى تېخىمۇ ئايدىڭلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، بىز HCO بىلەن كۆچۈرۈلگەن ناركوز قىلىنغان چاشقان ئۈستىدە نۇرغا سەزگۈر تەجرىبە قانىلى رودوپسىن 2 (hChR2) نى ئىپادىلەپ ، كۆك نۇرنىڭ غىدىقلىشىغا قارىتا t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ قىسقا كېچىكىشنى تونۇشى (10 ms دىن تۆۋەن). t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرى كالتسىي تەسۋىرىدە كۆرۈلگەنگە ئوخشاش چاستوتا ئۆزلۈكىدىن پائالىيەتنىڭ پارتىلىشىنى ، شۇنداقلا نۇر بەلگىسى بولمىغان ئەھۋالدا T-hCO دا ئېلىپ بېرىلغان ئېلېكترو فىزىئولوگىيىلىك خاتىرىلەرنى كۆرسەتتى (كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10c-g رەسىم). HCO نىڭ ۋىرۇستا خاتىرىلەنگەن مۇناسىپ باسقۇچلىرىدا ئۆزلىكىدىن پائالىيەت كۆرۈلمىگەن. T-hCO نىڭ سەزگۈ غىدىقلاش ئارقىلىق قوزغىتىلغىلى بولىدىغان-بولمايدىغانلىقىنى باھالاش ئۈچۈن ، بىز چاشقان ۋىۋىسكىسىنى t-hCO دىن يىراقلاشتۇردۇق (4j رەسىم ، m ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10h ، k). ئىلگىرىكى تەتقىقاتلارغا قارىغاندا ، 8،10 ، بىر تۈركۈم t-hCO ھۈجەيرىلىرى شىۋىرغاننىڭ بۇزۇلۇشىغا قارىتا پائالىيەتنىڭ كۈچەيگەنلىكىنى كۆرسىتىپ بەردى ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار تاسادىپىي ۋاقىت تامغىسى بىلەن سېلىشتۇرۇلغاندا كۆرۈلمىدى (4k - q رەسىم ۋە كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇمات ، 10h - q). دەرۋەقە ، تەخمىنەن% 54 ئوپتىكىلىق بەلگە قويۇلغان يەككە ئورۇنلار شىۋىرغاندىن كېيىن قوزغىلىش نىسبىتىنى كۆرۈنەرلىك يۇقىرى كۆتۈردى ، ئەڭ يۇقىرى بولغاندا 650 ms (4-رەسىم). يىغىپ ئېيتقاندا ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار t-hCO نىڭ مۇۋاپىق ئىقتىدارلىق كىرگۈزۈشنى قوبۇل قىلىدىغانلىقىنى ۋە مۇھىتنىڭ غىدىقلىشى ئارقىلىق قوزغىتىلىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
ئاندىن بىز T-hCO نىڭ چاشقاندىكى توك يولىنى قوزغىتىپ ھەرىكەتنى كونترول قىلالايدىغان ياكى قىلالمايدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق. بىز ئالدى بىلەن T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ چاشقاننىڭ ئەتراپىدىكى توقۇلمىلارغا كىرىدىغان ياكى قاتناشمايدىغانلىقىنى تەكشۈردۇق. بىز HCO نى EYFP (hChR2-EYFP) غا بىرىكتۈرۈلگەن hChR2 كودلاش سىستېمىسى بىلەن يۇقۇملىدۇق. 110 كۈندىن كېيىن ، بىز EYFP ئىپادىسىنى ئىككى تەرەپلىك پوستلاق قەۋىتىدە ، يەنى ئاڭلاش ، ماتور ۋە سېزىمچان سېزىمچان پوستلاق قەۋىتىدە ، شۇنداقلا بوغماق ئۈچەي ، بېگېموت ۋە تالامۇس قاتارلىق كىچىك رايونلاردا كۆردۇق (5a رەسىم). بۇ ئۈنۈملۈك پەرەزلەرنىڭ چاشقان ھۈجەيرىسىدە ماس قەدەملىك ئىنكاس پەيدا قىلالايدىغان ياكى قىلالمايدىغانلىقىنى باھالاش ئۈچۈن ، بىز ئۆتكۈر مېڭە بۆلەكلىرىدە چاشقان چوڭ مېڭە پوستلاق ھۈجەيرىسىنى خاتىرىلەش ئارقىلىق hChR2-EYFP نى ئىپادىلەيدىغان T-hCO ھۈجەيرىسىنى ئوپتىكىلىق قوزغىدۇق. كۆك نۇر بىلەن T-hCO ئاكونلىرىنىڭ قوزغىتىلىشى NBQX تەرىپىدىن توسۇلۇپ قالغان چاشقان ئېھرامى پوستلاق قەۋىتى نېرۋا ھۈجەيرىسىدە قىسقا مۇددەتلىك EPSC نى قوزغىدى (رەسىم 5b - g). ئۇنىڭدىن باشقا ، بۇ ئىنكاسلار تېترودوتوكسىن (TTX) تەرىپىدىن توسۇلۇپ ، 4-ئامىنوپىرىدېن (4-AP) تەرىپىدىن ئەسلىگە كەلتۈرۈلۈپ ، ئۇلارنىڭ مونوپېنتىك ئۇلىنىش كەلتۈرۈپ چىقارغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (5e رەسىم).
a, axon ئىز قوغلاشنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى (سولدا). t-hCO EYFP ئىپادىسى (ئوڭدا). كىچىك بالداق ، 100 µm. A1 ، ئاڭلاش پوستلاق قەۋىتى ، ACC ، ئالدى مېڭە پوستلاق قەۋىتى ، d. چوڭ ئۈچەي ، چىش مىلىكى ، HPC ، بېگېموت دىئافراگما ، يان تەرەپتىكى كۆكرەك پەردىسى ، mPFC ، ئوتتۇرا ئالدى مېڭە پوستلاق قەۋىتى ، پىرى ، كۆكرەك پەردىسى پوستلاق قەۋىتى ، چوڭ ئۈچەي تاياقچە باكتېرىيەسى ، VPM ، تالمۇسنىڭ شامالدارىش مەركىزى ، VTA ، شامالدارىش رايونى. قىزىل كۋادراتلار چوڭ مېڭىنىڭ رەسىم تارتىلغان جايلىرىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ. b ، غىدىقلاش تەجرىبىسىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى. c, d, ئىنسانلارنىڭ (c) EYFP + t-hCO ياكى چاشقان (d) EYFP- ھۈجەيرىلىرىدىكى كۆك نۇر كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان فوتو نۇر (يۇقىرى) ۋە توك بېسىمىنىڭ (ئاستى) ئىنكاسىنىڭ مىسالى. e, f, TTX ۋە 4-AR (يېشىل) ، TTX (كۈلرەڭ) ياكى ACSF (قارا) (e) ، (بىنەپشە) ياكى (قارا)) NBQX (e) بىلەن T-hCO ئاكونلىرىنىڭ كۆك نۇرنى غىدىقلىغاندىن كېيىنكى چاشقان نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئىزلىرى. g ، چاشقان ھۈجەيرىسىدىكى كۆك نۇر كەلتۈرۈپ چىقارغان ئىنكاسلارنىڭ كېچىكىشى (n = 16 ھۈجەيرە) گورىزونتال تاياقچە ئوتتۇرىچە كېچىكىشنى كۆرسىتىدۇ (7.13 ms) (سولدا). NBQX (n = 7 ھۈجەيرە ؛ *** P <0.0001) (ئوتتۇرىدا) بىلەن خاتىرىلەنگەن ياكى نۇرسىز قوزغىتىلغان EPSC نىڭ ئامپلتۇدىسى. NBQX (n = 7 ھۈجەيرە ؛ *** P <0.0001) (ئوتتۇرىدا) بىلەن خاتىرىلەنگەن ياكى نۇرسىز قوزغىتىلغان EPSC نىڭ ئامپلتۇدىسى. Амплитуда в вввванных светом EPSC, зарегистрированных с или مەركىزى NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 ھۈجەيرە ؛ *** P <0.0001) (ئوتتۇرىدا) بىلەن خاتىرىلەنگەن نۇرسىز EPSC نىڭ ئامپلتۇدىسى.使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。 Амплитуда в вввванных светом EPSC, зарегистрированных с или مەركىزى NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 ھۈجەيرە ؛ *** P <0.0001) (ئوتتۇرىدا) بىلەن خاتىرىلەنگەن نۇرسىز EPSC نىڭ ئامپلتۇدىسى.كۆك نۇرغا (ئوڭدا) ئىنكاس قايتۇرىدىغان EPSC لارنى كۆرسىتىدىغان چاشقان ھۈجەيرىسىنىڭ نىسبىتى. h ، ھەرىكەت ۋەزىپىسىنىڭ سىخېما دىئاگراممىسى. d0, day 0. i. 1-كۈنى (سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوڭدا) ئۈلگىلىك ھايۋانلارنىڭ ئىپادىسى. 1-كۈنى (سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوڭ تەرەپ) (n = 150 كۆك نۇر سىنىقى ، n = 150 قىزىل چىراغ سىنىقى ؛ *** P <0.0001) كۈنىدە كۆرسىتىلگەن ئوتتۇرىچە يالىڭاچ سان. 1-كۈنى (سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوڭ تەرەپ) (n = 150 كۆك نۇر سىنىقى ، n = 150 قىزىل چىراغ سىنىقى ؛ *** P <0.0001) كۈنىدە كۆرسىتىلگەن ئوتتۇرىچە يالىڭاچ سان. Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 ىسپىتانييە سىنام светом, n = 150 ىسپيتانيا س كراسېنم سۋاتوم; *** P <0,0001). 1-كۈنى (سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوتتۇرىدا ئوڭدا) (n = 150 كۆك نۇر سىنىقى ، n = 150 قىزىل چىراغ سىنىقى ؛ *** P <0.0001) كۈنىدە كۆرسىتىلگەن يالىڭاچ سانى.第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0.0001 ）。第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0.001 Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 ىسپىتانييە سىنام светом, n = 150 ىسپيتانيا س كراسېنم سۋاتوم; *** P <0,0001). 1-كۈنى (سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوتتۇرىدا ئوڭدا) (n = 150 كۆك نۇر سىنىقى ، n = 150 قىزىل چىراغ سىنىقى ؛ *** P <0.0001) كۈنىدە كۆرسىتىلگەن يالىڭاچ سانى.1-كۈنى (ئوتتۇرىدا سولدا) ياكى 15-كۈنى (ئوڭدا) قىزىل ۋە كۆك نۇر سىنىقىنىڭ جۇغلانما يالىشى. NS, not significant. j, k, t-hCO بىلەن كۆچۈرۈلگەن بارلىق ھايۋانلارنىڭ ھەرىكەت ئالاھىدىلىكى 1 ياكى 15-كۈنى hChR2-EYFP (j) ياكى كونترول فتوروفور (k) نى ئىپادىلەيدۇ (hChR2-EYFP: n = 9 چاشقان ، ** P = 0.0049; كونترول: n = 9, P = 0.1497). l ، ئېتىبار نومۇرىنىڭ تەدرىجىي تەرەققىي قىلىشى (n = 9 hChR2, n = 9 كونترول ؛ ** P <0.001, *** P <0.0001). l ، ئېتىبار نومۇرىنىڭ تەدرىجىي تەرەققىي قىلىشى (n = 9 hChR2, n = 9 كونترول ؛ ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Э زانزون پوكازاتېليا предпоч сентия (n = 9 hChR2, n = 9 كاننىخ; ** P <0,001, *** P <0,0001). l ، ئېتىبار نومۇرى (n = 9 hChR2 ، n = 9 كونترول ؛ ** P <0.001 ، *** P <0.0001). l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0.001 ， *** P <0.0001 ）。 l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0.001 ， *** P <0.0001 ）。 ، l ، مايىل نومۇرلارنىڭ تەدرىجىي تەرەققىي قىلىشى (n = 9 hChR2, n = 9 كونترول ؛ ** P <0.001, *** P <0.0001).m, FOS ئىپادىسى S1 دىكى t-hCO نىڭ ئوپتىكىلىق ئاكتىپلىنىشىغا قارىتا. FOS ئىپادىلەش (سولدا) ۋە مىقدارلاشتۇرۇش (ھەر گۇرۇپپىغا n = 3 ؛ * P <0.05 ، ** P <0.01 ۋە *** P <0.001) (ئوڭدا) رەسىملەر كۆرسىتىلدى. FOS ئىپادىلەش (سولدا) ۋە مىقدارلاشتۇرۇش (ھەر گۇرۇپپىغا n = 3 ؛ * P <0.05 ، ** P <0.01 ۋە *** P <0.001) (ئوڭدا) رەسىملەر كۆرسىتىلدى. Показны изображения كاسرېسسىيسى FOS (слева) ۋە كولېچېستۋېننو определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS ئىپادىلەش (سولدا) ۋە مىقدارلاشتۇرۇش (ھەر گۇرۇپپىغا n = 3 ؛ * P <0.05 ، ** P <0.01 ، ۋە *** P <0.001) رەسىملەر (ئوڭدا) كۆرسىتىلدى.显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0.001 ）（右）的图像。显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0.001 ）（右）的图像。 Показны изображения كاسرېسسىيسى FOS (слева) ۋە كولېچېستۋېننو определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). FOS ئىپادىلەش (سولدا) ۋە مىقدارلاشتۇرۇش (ھەر گۇرۇپپىغا n = 3 ؛ * P <0.05 ، ** P <0.01 ، ۋە *** P <0.001) رەسىملەر (ئوڭدا) كۆرسىتىلدى.كىچىك بالداق ، 100 µm. بۇ سانلىق مەلۇماتلار BLA نىڭ ئۆلچەملىك خاتالىقى ، ئاساسىي تونېل ، MDT ، دوۋساقلىق تالالىق يادرو ، PAG ، كۆك رەڭلىك كۈلرەڭ.
ئاخىرىدا ، بىز t-hCO چاشقان ھەرىكىتىنى ئۆزگەرتەلەمدۇ يوق دەپ سورىدۇق. بۇنى سىناق قىلىش ئۈچۈن hChR2-EYFP ئىپادىلەيدىغان hCO نى S1 غا كۆچۈردۇق ، 90 كۈندىن كېيىن نۇر نۇر يەتكۈزۈش ئۈچۈن ئوپتىك تالانى t-hCO غا كۆچۈردۇق. ئاندىن بىز ئۆزگەرتىلگەن مەشغۇلات تەڭشىگۈچ ئەندىزىسى بىلەن چاشقانلارنى مەشىقلەندۈردۇق (5h رەسىم). بىز ھايۋانلارنى ھەرىكەت سىناق ئۆيىگە ئورۇنلاشتۇردۇق ۋە ئىختىيارىي ھالدا 5 سېكۇنت كۆك (473 nm) ۋە قىزىل (635 nm) لازېر غىدىقلاشنى قوللاندۇق. ھايۋانلار كۆك نۇرنى غىدىقلاش جەريانىدا يالىسا ، ئەمما قىزىل چىراغ غىدىقلاش جەريانىدا يالىمىغان بولسا ، سۇ مۇكاپاتىغا ئېرىشتى. مەشىقنىڭ بىرىنچى كۈنى ، ھايۋانلار كۆك ياكى قىزىل چىراغ بىلەن غىدىقلىغاندا يالاشتا ھېچقانداق پەرق يوق. قانداقلا بولمىسۇن ، 15-كۈنى ، hCOhR2-EYFP نى ئىپادىلەيدىغان hCO بىلەن كۆچۈرۈلگەن ھايۋانلار قىزىل نۇرنىڭ غىدىقلىشىغا سېلىشتۇرغاندا كۆك نۇر بىلەن غىدىقلانغاندا تېخىمۇ ئاكتىپ يالىتىشنى كۆرسەتتى. يالىڭاچ ھەرىكەتتىكى بۇ ئۆزگىرىشلەر كونترول فتوروفورنى ئىپادىلەيدىغان HCO بىلەن كۆچۈرۈلگەن كونترول ھايۋانلاردا كۆرۈلمىگەن (ئۆگىنىش مۇۋەپپەقىيەت قازىنىش نىسبىتى: hChR2% 89 ، EYFP 0% ، 5i-1 ۋە قوشۇمچە سىن 2). بۇ سانلىق مەلۇماتلار t-hCO ھۈجەيرىسىنىڭ چاشقان نېرۋا ھۈجەيرىسىنى قوزغىتىپ ، مۇكاپات ئىزدەش ھەرىكىتىنى قوزغىتالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردى. بۇ ھەرىكەت ئۆزگىرىشىدە قايسى چاشقان T-hCO نېرۋا توك يولىنىڭ بولۇشى مۇمكىنلىكىنى بىلىش ئۈچۈن ، بىز 90 مىنۇتتىن كېيىن تەربىيەلەنگەن ھايۋانلاردا T-hCO نى ئوپتىكىلىق قوزغىتىپ ، توقۇلمىلارنى يىغىۋالدۇق. ئىممۇنىتېت ئوپېراتسىيەسى ھەرىكەتچان ھەرىكەتچان FOS ئاقسىلىنىڭ ھەرىكەتچان ھەرىكەتكە قاتناشقان بىر نەچچە مېڭە رايونىدا ئىپادىلەنگەنلىكىنى ئاشكارىلىدى ، بۇلار ئوتتۇرا ئالدى مېڭە پوستلاق قەۋىتى ، ئوتتۇرا تالمۇس ۋە كۆكرەك پەردىسى كۈلرەڭ ماددىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. گۈرۈچ. 5m). ئومۇملاشتۇرغاندا ، بۇ سانلىق مەلۇماتلار t-hCO نىڭ چاشقان نېرۋا ھەرىكىتىنى تەقلىد قىلىپ ھەرىكەتنى قوزغىتالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
نېرۋا ئورگانىكلىرى ئىنسانلارنىڭ يېتىلىشى ۋە ۋىرۇستىكى كېسەللىكلەرنى تەتقىق قىلىدىغان ئۈمىدۋار سىستېمىغا ۋەكىللىك قىلىدۇ ، ئەمما ئۇلار vivo دا بار بولغان توك يولى ئوتتۇرىسىدىكى باغلىنىشنىڭ كەملىكى بىلەن چەكلىنىدۇ. بىز يېڭى بىر سۇپا ياساپ چىقتۇق ، بۇنىڭدا بىز HCO نى ئىممۇنىتېت كۈچى ئاجىز دەسلەپكى تۇغۇتتىن كېيىنكى چاشقاننىڭ S1 غا كۆچۈرۈپ ، ئىنسانلارنىڭ ھۈجەيرىسىنىڭ يېتىلىشى ۋە vivo دىكى ئىقتىدارىنى تەتقىق قىلدۇق. بىز T-hCO نىڭ vitro28 دە كۆرۈلمىگەن پىشقان ھۈجەيرە تىپلىرىنى تەرەققىي قىلدۇرىدىغانلىقىنى ۋە T-hCO نىڭ چاشقان مېڭىسىگە ئاناتومىيىلىك ۋە ئىقتىدار جەھەتتىن بىرلەشتۈرۈلگەنلىكىنى كۆرسىتىپ ئۆتتۇق. T-hCO نىڭ چاشقان نېرۋا توك يولىغا قوشۇلۇشى بىزگە ئىنسانلارنىڭ ھۈجەيرە پائالىيىتى ۋە ھايۋانلارنىڭ ھەرىكىتىنى تەتقىق قىلىش ئوتتۇرىسىدا باغلىنىش ئورنىتىشىمىزغا شارائىت ھازىرلاپ ، T-hCO نېرۋا ھۈجەيرىلىرىنىڭ چاشقان نېرۋا ھەرىكىتىنى تەقلىد قىلىپ ھەرىكەت ئىنكاسىنى قوزغىتالايدىغانلىقىنى كۆرسەتتى.
بىز تەسۋىرلىگەن سۇپا ئىلگىرىكى ھۈجەيرىلەرنى چاشقان مېڭىسىگە كۆچۈرۈش تەتقىقاتىغا قارىغاندا بىر قانچە ئەۋزەللىككە ئىگە. ئالدى بىلەن ، بىز HCO نى تۇغۇتتىن كېيىنكى دەسلەپكى چاشقاننىڭ تەرەققىي قىلىۋاتقان پوستلاق قەۋىتىگە كۆچۈردۇق ، بۇ ئاناتومىيىلىك ۋە ئىقتىدارنىڭ بىرلىشىشىنى ئاسانلاشتۇرىدۇ. ئىككىنچىدىن ، t-hCO MRI كۆزىتىش بىزگە تىرىك ھايۋانلارنىڭ كۆچۈش ئورنى ۋە ئۆسۈشىنى تەتقىق قىلىشقا شارائىت يارىتىپ بەردى ، بۇ بىزنىڭ ئۇزۇن مۇددەتلىك كۆپ خىل ھايۋانلارنى تەتقىق قىلىشىمىز ۋە بىر قانچە hiPS ھۈجەيرە لىنىيىسىنىڭ ئىشەنچلىكلىكىنى تۇرغۇزۇشىمىزغا شارائىت ھازىرلاپ بەردى. ئاخىرىدا ، بىز يەككە ھۈجەيرىلىك ئاسما ئوكۇلنى ئەمەس ، بەلكى مۇكەممەل ئورگانىكلارنى كۆچۈردۇق ، بۇ ئىنسانلار ھۈجەيرىسىگە بۇزغۇنچىلىق قىلمايدۇ ھەمدە چاشقان مېڭىسىدىكى ئىنسانلارنىڭ پوستلاق نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ بىرىكىشى ۋە ھاسىل بولۇشىنى ئىلگىرى سۈرىدۇ.
بىز بۇ سۇپىدا ئىلگىرلەشلەرگە قارىماي ، تەرەققىياتنىڭ دەسلەپكى باسقۇچىدا كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنمۇ ، ۋاقىتلىق ، بوشلۇق ۋە جانلىقلار ئارا چەكلىمىلەرنىڭ ئىنسانلارنىڭ نېرۋا توك يولىنىڭ شەكىللىنىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدىغانلىقىنى ئېتىراپ قىلىمىز. مەسىلەن ، t-hCO دا كۆزىتىلگەن ئۆزلۈكىدىن پائالىيەتنىڭ پوستلاق قەۋىتى جەريانىدا كۆرۈلگەن رېتىملىق پائالىيەتكە ئوخشاش تەرەققىيات ھادىسىسىگە ۋەكىللىك قىلىدىغان ياكى ۋەكىللىك قىلالمايدىغانلىقى ، ياكى t-hCO دا بار بولغان بېسىمنى كونترول قىلغۇچى ھۈجەيرە تىپىنىڭ يوقلۇقىدىن ئېنىق ئەمەس. ئوخشاشلا ، t-hCO دا لامپۇچكىنىڭ يوقلۇقى زەنجىرنىڭ ئۇلىنىشىغا قانچىلىك تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى ئېنىق ئەمەس. كەلگۈسىدىكى خىزمەتلەر ئىنسانلارنىڭ مىكروبلىرى ، ئىنسانلارنىڭ بالىياتقۇ ئىچكى ھۈجەيرىسى ۋە GABAergic پراكتىكانتلىرىنىڭ ئوخشىمىغان نىسبىتى قاتارلىق باشقا ھۈجەيرىلەرنى بىرلەشتۈرۈشكە مەركەزلەشتۈرىدۇ ، شۇنداقلا ئۆزگەرتىلگەن T-hCO دا نېرۋا بىر گەۋدىلىشىش ۋە پىششىقلاپ ئىشلەشنىڭ قانداق بولىدىغانلىقىنى چۈشىنىشكە ئەھمىيەت بېرىدۇ. بىمارلاردىن ئېرىشكەن ھۈجەيرىلەردە ترانسكرىپسىيە ، ماس قەدەملىك ۋە ھەرىكەت سەۋىيىسى.
ئومۇمىي جەھەتتىن ئالغاندا ، vivo سۇپىسىدىكى بۇ ۋىرۇسنىڭ چوڭ مېڭىسىنىڭ يېتىلىشى ۋە كېسەللىك تەتقىقاتىنى تولۇقلىيالايدىغان كۈچلۈك مەنبەگە ۋەكىللىك قىلىدۇ. بىزنىڭ مۆلچەرىمىزچە ، بۇ سۇپا بىزگە ئاسان ئېرىشكىلى بولمايدىغان بىمارلار ھۈجەيرىسىدە يېڭىچە دەرىجىدىكى فېنوتىپلارنى بايقىيالايدۇ ۋە يېڭى داۋالاش ئىستراتېگىيىسىنى سىنايدۇ.
بىز يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك HiPS ھۈجەيرىسىدىن hCO2.5 ھاسىل قىلدۇق. يەم-خەشەك قەۋىتىدە يېتىشتۈرۈلگەن hiPS ھۈجەيرىسىدىن hCO ئىشلەپچىقىرىشنى باشلاش ئۈچۈن ، hiPS ھۈجەيرىسىنىڭ مۇكەممەل مۇستەملىكىسى بىر تەرەپ قىلىش (0.35 mg / mL) ئارقىلىق مەدەنىيەت تاماقلىرىدىن چىقىرىۋېتىلىپ ، hiPS ھۈجەيرە مەدەنىيەت ۋاستىسى بار قاچا-قۇچىلارنى ئۆز ئىچىگە ئالغان دەرىجىدىن تاشقىرى تۆۋەن قوشۇمچە سۇلياۋ مەدەنىيەتكە يۆتكەلدى. . ئالدىنقى 5 كۈندە ، hiPS ھۈجەيرە ۋاستىسى ھەر كۈنى ئۆزگەرتىلىپ ، دورسومورفىن ۋە SB-431542 قوشۇلدى. توختىتىلغان ئالتىنچى كۈنى ، نېرۋا سىپروئىدلىرى نېرۋا ھۈجەيرىسى- A (10888 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) نى ئۆز ئىچىگە ئالغان نېرۋا ۋاسىتىلىرىگە يۆتكەلدى ، ۋىتامىن A (12587 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، GlutaMax (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، پېنىتسىللىن ۋە سترېپتومىيسىن (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى). . توختىتىلغان ئالتىنچى كۈنى ، نېرۋا سىپروئىدلىرى نېرۋا ھۈجەيرىسى- A (10888 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) نى ئۆز ئىچىگە ئالغان نېرۋا ۋاسىتىلىرىگە يۆتكەلدى ، ۋىتامىن A (12587 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، GlutaMax (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، پېنىتسىللىن ۋە سترېپتومىيسىن (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى). .توختىتىلغان ئالتىنچى كۈنى ، نېرۋا سپروئىدلىرى نېرۋا ۋاسال- A (10888 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، B-27 تولۇقلاش ۋىتامىن A (12587 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، GlutaMax (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، پېنىتسىللىن بولغان نېرۋا ۋاسىتىسىگە يۆتكەلدى.ۋە س كتوموزىن (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ۋە دوپولنېني ئەپيېردنىديمونوم روستا (EGF; ۋە streptomycin (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ۋە يۇقۇملۇق ئۆسۈش ئامىلى (EGF; 20 ng / ml; R&D سىستېمىسى) ۋە تالا ئۆسمىسىنىڭ ئۆسۈپ يېتىلىش ئامىلى 2 (FGF2; 20 ng / ml; R&D سىستېمىسى) بىلەن 24-كۈنىگىچە تولۇقلاندى.25-كۈندىن 42-كۈنىگىچە ، مېڭە ھاسىل قىلغان نېرۋا ئاجىزلىق ئامىلى (BDNF; 20 ng ml-1 ، Peprotech) ۋە نېرۋا ئاجىزلىقى 3 (NT3; 20 ng ml-1 ، Peprotech) ئوتتۇرا ھالغا قوشۇلۇپ ، ھەر كۈنى ئوتتۇراھال ئالماشتۇرۇلدى.在悬浮的第 6 天，将神经球体转移到含有 neurobasal-A （10888 ， ھاياتلىق تېخنىكىسى ）、不含维生素 A 的 B-27 补充剂（ 12587 ， ھاياتلىق تېخنىكىسى ）、 GlutaMax （1: 100 ， ھاياتلىق تېخنىكىسى ）、青霉素的神经培养基中和链霉素（ 1: 100在 悬浮 的 第 第 天 天 ob 含有 ob 含有 ob ob ob 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88----8 8 8 8 8 8 8 8 8: Ng 20 ng ml-1 ； r & d سىستېمىسى） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1 ； R&D سىستېمىسى ）直至第 24 天。 На 6-й день суспензии начросферы были переведены на добавку, содержащую нанробазал-А (10888 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، добавку В-27 витамина А (12587 ، ھاياتلىق تېخنىكىلىرى) ، GlutaMax (1: 100 ، ھايات) . (1: 100 6-كۈنى ، نېرۋا سىفىرلىق ئاسما ئوكۇل نېرۋا ھۈجەيرىسى- A (10888 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، B-27 تولۇقلىمىسى ۋىتامىن A (12587 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، GlutaMax (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) ، پېنىتسىللىن نېيتراللاشتۇرۇلغان سترېپتومسىن (1: 100 ، ھاياتلىق تېخنىكىسى) نىڭ كۆپىيىشىدىكى ئامىللار (2). (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D سىستېمىسى) до 24-г дня. R&D سىستېمىسى) 24-كۈنىگىچە.25-چېسلادىن 42-كۈنىگىچە ، مېڭە ھاسىل قىلغان نېرۋا ئاجىزلىق ئامىلى (BDNF; 20 ng ml-1 ، Peprotech) ۋە نېرۋا ئاجىزلىق ئامىلى 3 (NT3; 20 ng ml-1 ، Peprotech) ھەر كۈنى مەدەنىيەت ۋاسىتىلىرىگە قوشۇلدى. ئوتتۇراھال ئۆزگىرىش بىر قېتىم.43-كۈندىن باشلاپ ، hCO تولۇقلانمىغان نېرۋا ئۆسمىسى- A ۋاستىسى (NM; 1088022 ، تېرمو فىشېر) دا ساقلىنىپ ، ھەر 4-6 كۈندە بىر قېتىم ئۆزگىرىدۇ. يەم-خەشەكسىز شارائىتتا يېتىلدۈرۈلگەن hiPS ھۈجەيرىسىدىن hCO غا ئېرىشىش ئۈچۈن ، hiPS ھۈجەيرىلىرى Accutase (AT-104 ، يېڭىلىق يارىتىش ھۈجەيرىسى تېخنىكىسىدا) 37 سېلسىيە گرادۇستا 7 مىنۇت سىلىندى ، يەككە ھۈجەيرىگە ئايرىلدى ۋە AggreWell 800 تەخسىسىگە (34815 ، STEMCELL Technologies) قويۇقلاشتۇرۇلدى. Selleckchem). 24 سائەتتىن كېيىن ، قۇدۇقلاردىكى مېدىيالار دورسورمورفىن (2.5 mMM ؛ P5499 ، سىگما-ئالدرىچ) ۋە SB-431542 (10 μ mM , Tocrida). 2-كۈندىن 6-كۈنىگىچە ، Essential 6 ۋاستىسى ھەر كۈنى دورسومورفىن بىلەن ئالماشتۇرۇلۇپ ، SB-431542 تولۇقلاندى. ئالتىنچى كۈندىن باشلاپ ، نېرۋا سىفىرلىق ئاسما نېرۋا ھۈجەيرىسىگە يۆتكىلىپ ، يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك ساقلانغان.
بارلىق ھايۋان رەسمىيەتلىرى ستانفورد ئۇنىۋېرسىتېتى تەجرىبىخانىسى ھايۋاناتلارنى باشقۇرۇش باشقۇرۇش كومىتېتى (APLAC) تەستىقلىغان ھايۋانلارنى بېقىش كۆرسەتمىسى بويىچە ئېلىپ بېرىلدى. ھامىلىدارلار ئېففېكتى RNU (rnu / +) چاشقانلار سېتىۋېلىندى (چارلېس دەريا تەجرىبىخانىسى) ياكى ئۆي ئىگىلىرى. ھايۋانلار يېمەكلىك ۋە سۇ ئېلانلىرى بىلەن 12 سائەتلىك قاراڭغۇ دەۋردە ساقلانغان. يالىڭاچ (FOXN1 - / -) ئۈچ كۈندىن يەتتە كۈنگىچە بولغان چاشقان كۈچۈكلىرى ئۆلتۈرۈشتىن ئىلگىرى پىشىپ يېتىلمىگەن پىچىرلارنىڭ ئۆسۈشى بىلەن ئېنىقلانغان. كۈچۈكلەر (ئەر-ئايال)% 2-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىنىپ ، ئىستېرېئولۇق رامكىغا قويۇلدى. باش سۆڭەكنىڭ دىئامېتىرى S1 دىن 2-3 مىللىمېتىر ئەتراپىدا بولۇپ ، دۇرا ئانىسىنىڭ پۈتۈنلۈكىنى ساقلاش بىلەن بىللە ئېلىپ بېرىلدى. ئاندىن 30 گرادۇسلۇق يىڭنىنى (تەخمىنەن 0.3 مىللىمېتىر) ئىشلىتىپ ، دانىخورەكنى تېشىڭ. ئاندىن نېپىز 3 × 3 سانتىمېتىرلىق پارفىلغا HCO سۈرۈپ ، ئارتۇقچە ماددىلارنى ئېلىڭ. 23 G ، 45 ° يىڭنىگە چاپلانغان خامىلتون ئوكۇلنى ئىشلىتىپ ، ئاستا-ئاستا يىڭنىنىڭ ئەڭ ئۇچىغا ئاستا-ئاستا سىزىڭ. ئاندىن ئوكۇلنى ستېرېئوتىك ئۈسكۈنىگە ئۇلانغان ئوكۇل پومپىسىغا ئورنىتىڭ. ئاندىن يىڭنىنىڭ ئۇچىنى ئىلگىرى ياسالغان 0.3 مىللىمېتىر كەڭلىكتىكى تۆشۈك تۆشۈكنىڭ ئۈستىگە قويۇڭ (z = 0 mm) ھەمدە ئوكۇلنى 1-2 مىللىمېتىر (z = تەخمىنەن - 1.5 مىللىمېتىر) تارايتىپ ، يىڭنە دۇرا ئانا A. ئوتتۇرىسىدا قويۇق تامغا شەكىللەنگۈچە. ئاندىن شىپىرىسنى پوستلاق قەۋىتىنىڭ مەركىزىگە z = -0.5 مىللىمېتىر قىلىپ كۆتۈرۈڭ ھەمدە مىنۇتىغا 1-2 µl سۈرئەت بىلەن HCO نى ئوكۇل قىلىڭ. HCO ئوكۇلى تاماملانغاندىن كېيىن ، يىڭنىسى مىنۇتىغا 0.2-0.5 مىللىمېتىر سۈرئەت بىلەن چېكىندۈرۈلۈپ ، تېرە تىكىلىدۇ ، كۈچۈك دەرھال ئىسسىق ئىسسىنىش تاختىسىغا سېلىنىدۇ. بەزى ھايۋانلار قوش يۆنىلىشلىك كۆچۈرۈلگەن.
بارلىق ھايۋان رەسمىيەتلىرى ستانفورد ئۇنىۋېرسىتېتى APLAC تەستىقلىغان ھايۋانلارنى بېقىش كۆرسەتمىسى بويىچە ئېلىپ بېرىلدى. چاشقانلار (كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 60 كۈندىن كۆپرەك)% 5 ئىزوفلوران ناركوز دورىلىرى بىلەن ئوكۇل قىلىنغان ۋە تەسۋىر ھاسىل قىلىش جەريانىدا% 1-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىنغان. تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن ، 7 تېسلا خەلقئارالىق ئېلېكتر شىركىتى (IECO) ئاستا-ئاستا قوزغاتقۇچ بىلەن گورىزونتال تۆشۈكلۈك سايىلىغۇچ Bruker (Bruker Corp.) نى ئاكتىپلىق بىلەن قوغدىدى ، AVANCE ئارقىلىق ئىچكى دىئامېتىرى 120 مىللىمېتىر (600 mT / m ، 1000 T / m / s) بولغان قالقانسىمان تەدرىجىي قىستۇرۇلدى. III ، سەككىز قاناللىق كۆپ ئىقتىدارلىق RF ۋە كۆپ يادرولۇق ئىقتىدارلار ۋە ئۇنىڭغا قوشۇمچە Paravision 6.0.1 سۇپىسى. خاتىرىلەش ئاكتىپ دىئومېتىرىلىق RF كاتەكچىسى ئارقىلىق ئىچكى دىئامېتىرى 86 مىللىمېتىر ، تۆت قاناللىق كرىستال سوۋۇتۇلغان RF كاتەكچىسى ئارقىلىقلا قوبۇل قىلىنغان. Axial 2D Turbo-RARE (تەكرارلاش ۋاقتى = 2500 ms ، echo ۋاقتى = 33 ms ، 2 ئوتتۇرا ھېساب بىلەن) 16 پارچە تۇتۇلغان ، قېلىنلىقى 0.6 - 0.8 مىللىمېتىر ، 256 × 256 ئەۋرىشكە بار. بۇ سىگناللارنىڭ ئىچكى دىئامېتىرى 2 سانتىمېتىرلىق تۆت چاستوتالىق ئۆتكۈزگۈچ ھەجىمدىكى RF كاتەكچىسى ئارقىلىق قوبۇل قىلىنغان (Rapid MR International, LLC). ئاخىرىدا ، ئىچىگە ئورۇنلاشتۇرۇلغان Imaris (BitPlane) يۈزىنى مۆلچەرلەش ئىقتىدارىنى 3D تەسۋىرلەش ۋە ئاۋاز ئانالىزى ئۈچۈن ئىشلىتىڭ. مۇۋەپپەقىيەتلىك كۆچۈرۈلگەن كۆچۈرۈلگەن يېرىم شاردا ئۇدا T2 ئېغىرلىقتىكى MRI سىگنالىنىڭ رايونلىرى شەكىللەنگەن رايون دەپ ئېنىقلىما بېرىلدى. كۆچۈرۈلۈشنى رەت قىلىش كۆچۈرۈلگەن يېرىم شاردا ئۇدا T2 ئېغىرلىقتىكى MRI سىگنالىنىڭ رايونلىرىنى ھاسىل قىلمايدىغان كۆچەت دەپ ئېنىقلىما بېرىلگەن. Subcortical t-hCO كېيىنكى ئانالىزدىن چىقىرىۋېتىلدى.
ئىككى فوتونلىق كالتسىي تەسۋىر ھاسىل قىلىش ئۈچۈن hCO دىكى GCaMP6s نى مۇقىم ئىپادىلەش ئۈچۈن ، hiPS ھۈجەيرىلىرى pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro بىلەن يۇقۇملانغاندىن كېيىن ئانتىبىئوتىكلار تاللانغان. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، ھۈجەيرىلەر EDTA بىلەن پارچىلىنىپ ، پولىبرېن (5 mg / ml) ۋە 15 مىللىمېتىر ۋىرۇس بارلىقى ئۈچۈن تەخمىنەن 300،000 ھۈجەيرە زىچلىقىدا 1 مىللىلىتىرلىق 8 ۋاستىدە توختىتىلدى. ئاندىن بۇ ھۈجەيرىلەر ئاسما ھالەتتە 60 مىنۇت سىڭدۈرۈلۈپ ، ھەر قۇدۇققا 50 مىڭ ھۈجەيرە زىچلىقىدا ئۇرۇقلانغان. بىرىكتۈرۈلگەندىن كېيىن ، ھۈجەيرىلەر 5-10 mg mg-1 puromycin بىلەن 5-10 كۈن ياكى مۇقىم مۇستەملىكە پەيدا بولغۇچە داۋالاندى. ئۆتكۈر hCO يۇقۇملىنىش ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك بىر قىسىم ئۆزگەرتىشلەر بىلەن ئېلىپ بېرىلدى. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، 30-45 hCO كۈنىنى 1.5 مىللىمېتىر Eppendorf مىكرو ئېلېمېنت نەيچىسىگە 100 µl نېرۋا ۋاستىسى بار. ئاندىن تەخمىنەن 90 µl ۋاسىتە چىقىرىۋېتىلىدۇ ، 3-6 µl يۇقىرى دەرىجىدىكى لىمون ۋىرۇسى (0.5 x 108 دىن 1.2 x 109 غىچە) قوشۇلۇپ ، HCO ئىنكۇباتورغا 30 مىنۇت يۆتكىلىدۇ. ئاندىن ھەر بىر تۇرۇبىغا 90-100 µl ئوتتۇراھال قوشۇپ ، تۇرۇبىلارنى بىر كېچىدىلا ئىنكۇباتورغا قايتۇرۇڭ. ئىككىنچى كۈنى ، تۆۋەن چاپلاش تاختىسىدىكى HCO نى يېڭى نېرۋا ۋاسىتىسىگە يۆتكەڭ. 7 كۈندىن كېيىن ، hCO يۇقۇملىنىش سۈپىتىنى كۆرۈش ۋە باھالاش ئۈچۈن 24 قۇدۇق ئەينەك ئاستى تاختىغا يۆتكەلدى. pLV [Exp] -SYN1 :: EYFP-WPRE ۋە pLV [Exp] -SYN1 :: hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder تەرىپىدىن بارلىققا كەلگەن. Lentivirus كۆپىنچە تەجرىبىلەردە ئىشلىتىلىدۇ ، چۈنكى ئۇ ساھىبجامال گېنغا مۇجەسسەملەنگەن بولۇپ ، يۇقۇملانغان ھۈجەيرە لىنىيىسىدە مۇخبىر گېنىنى ئىپادىلەيدۇ. غالجىرلىقنى ئىز قوغلاش ئۈچۈن ، 30-45-كۈنلىرى hCO غا گىرىپتار بولغانلار ΔG-eGFP ۋە AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (پىلازما # 67528 ، ئەددىگېن) بىلەن يۇقۇملىنىپ ، 3 كۈن پاكىز يۇيۇلدى ۋە S1 دا چاشقانغا كۆچۈرۈلۈپ 7-14 كۈن ساقلاندى.
ئىممۇنىتېتلىق خىمىيىلىك دورىغا نىسبەتەن ، ھايۋانلار ناركوز قىلىندى ۋە يۈرەكتىن PBS بىلەن ساپلاشتۇرۇلدى ، ئۇنىڭدىن كېيىن% 4 پارافورمالدېگىد (PBS دىكى PFA ؛ ئېلېكترون مىكروسكوپ ئىلمى). چوڭ مېڭە% 4 PFA دا 2 سائەت ياكى بىر كېچىدە 4 سېلسىيە گرادۇستا مۇقىملاشتۇرۇلغان ، PBS دىكى% 30 لىك ساخاروزادا 48-72 سائەت ساقلانغان ، ھەمدە 1: 1 ،% 30 لىك ساخاروزا ئىچىگە قىستۇرۇلغان: OCT (توقۇلما-تېك OCT بىرىكمىسى 4583 ، ساكۇرا فىنېتېك) ۋە تاجىسىمان بۆلەكلەر خىروستات (لېيكا) ئارقىلىق 30 µm دا ياسالغان. قېلىن بۆلەكلەرنىڭ ئىممۇنىتېت ئوپېراتسىيەسى ئۈچۈن ، ھايۋانلارغا PBS ئارىلاشتۇرۇلدى ، چوڭ مېڭە پارچىلىنىپ ، تەۋرىنىش (لېيكا) ئارقىلىق 300-400 µm تاجىغا بۆلۈندى ۋە بۆلەكلەر% 4 PFA بىلەن 30 مىنۇت ئوڭشالدى. ئاندىن كرىستال ياكى قېلىن بۆلەكلەر PBS بىلەن يۇيۇلۇپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت توسۇۋېلىندى (% 10 نورمال ئېشەك قان زەردابى (NDS) ۋە% 0.3 Triton X-100 PBS دا سۇيۇلدى) ھەمدە ° C4 قا توسۇش ئېرىتمىسى بىلەن توسۇلدى. - ئىنكۇبلاش كرىزىسى بىر كېچىدىلا ، قېلىن بۆلەكلەر 5 كۈن سىلىندى. ئىشلىتىلگەن دەسلەپكى ئانتىتېلالار: NeuN غا قارشى تۇرۇش (مائۇس ، 1: 500 ؛ ab104224 ، abcam) CTIP2 (چاشقان ، 1: 300 ؛ ab18465 ، abcam) ، GFAP غا قارشى (توشقان ، 1: 1000 ؛ Z0334 ، داكو) ، GFP غا قارشى تۇرۇش (توخۇ ، 1: 1000 ؛ GTX13970 ، GeneTex) NeuN غا قارشى تۇرۇش (توشقان ، 1: 500 ؛ ABN78 ، Millipore) ، PDGFRA غا قارشى تۇرۇش 20357-1-AP ، Proteintech) ، SOX9 (ئۆچكە ، 1: 500 ؛ AF3075 ، R&D سىستېمىسى) ، Netrin G1a (ئۆچكە ، 1: 100 ؛ AF1166 ، R&D سىستېمىسى) ، STEM121 (چاشقان ، 1: 200; 1: 400; ئىشلىتىلگەن دەسلەپكى ئانتىتېلالار: NeuN غا قارشى (مائۇس ، 1: 500 ؛ ab104224 ، abcam) CTIP2 (چاشقان ، 1: 300 ؛ ab18465 ، abcam) ، GFAP غا قارشى (توشقان ، 1: 1000 ؛ Z0334 ، داكو) ، anti -GFP (توخۇ ، 1: 1000 ؛ GTX13970 ، GeneTex) ، NeuN غا قارشى تۇرۇش (توشقان ، 1: 500 ؛ ABN78 ، Millipore) ، PDGFRA غا قارشى تۇرۇش 20357-1-AP ، Proteintech) ، SOX9 (ئۆچكە ، 1: 500 ؛ AF3075 ، R&D سىستېمىسى) ، Netrin G1a (ئۆچكە ، 1: 100 ؛ AF1166 ، R&D سىستېمىسى) ، STEM121 (چاشقان ، 1: 200; 1: 400; Использовались следующие первичные антитела: କାନ-NeuN (мшиные, 1: 500; ab104224, abcam), نى- CTIP2 (كرىزىنيې ، 1: 300; ab18465 ، abcam), 1: 1000; GTX13970, GeneTex), ئانتىبىئوتىك دورىلار) 1: 200; Y40410, Takara Bio), ئىشلىتىلگەن دەسلەپكى ئانتىتېلالار: NeuN غا قارشى تۇرۇش (مائۇس ، 1: 500 ؛ ab104224 ، abcam) ، CTIP2 (چاشقان ، 1: 300 ؛ ab18465 ، abcam) ، GFAP غا قارشى تۇرۇش (توشقان ، 1: 1000 ؛ Z0334 ، داكو) ، GFP غا قارشى تۇرۇش abcam) ، NeuN غا قارشى (توشقان ، 1: 500 ؛ ABN78 ، Millipore) ، PDGFRA (توشقان ، 1: 200 ؛ sc-338 ، سانتا كرۇز) ، PPP1R17 (توشقان ، 1: 200 ؛ HPA047819 ، ئەتلەس ئانتىتېلا) ، RECA-1 (چاشقان ، 20357-1-AP ، Proteintech) ، SOX9 (ئۆچكە ، 1: 500 ؛ AF3075 ، R&D سىستېمىسى) ، netrin G1a (ئۆچكە ، 1: 100 ؛ AF1166 ، R&D سىستېمىسى) ، STEM121 غا قارشى تۇرۇش 1: 400;使用的一抗是：抗 NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， داكو ），抗 -GF P （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， Millipore ），抗 PDGFRA （兔， 1: 200 ； sc-338 ， Santa Cruz ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， ئەتلەس 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 （兔）, 1: 100 ； 20357-1-AP ， Proteintech ），抗 SOX9 （山羊， 1 G1a （山羊， 1: 100 ； AF1166 ， R & D سىستېمىسى ），抗 STEM121 （小鼠, 1: 200;使用的一抗是：抗 NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， داكو ），抗-GFP （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， Millipore ％弔，抗 1: 200 ； sc-338 ， Santa Cruz ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， ئەتلەس 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 100 ； 20357-1-AP ， Proteintech ），抗 SOX9 （山羊， 1: 500 ； G1a （山羊， 1: 100 ； AF1166 ， R & D سىستېمىسى ）頏 1:20 ,;Y40410 ، Takara Bio) ، SATB2 گە قارشى تۇرۇش (مائۇس ، 1:50 ؛ ab51502 ، abcam) ، GAD65 / 67 (توشقان ، 1: 400 ؛ ABN904 ، Millipore) ۋە IBA1 (ئۆچكە ، 1: 100 ؛ ab5076 ، abcam)。ئىشلىتىلگەن دەسلەپكى ئانتىتېلالار: NeuN غا قارشى تۇرۇش (مائۇس ، 1: 500 ؛ ab104224 ، abcam) ، CTIP2 (چاشقان ، 1: 300 ؛ ab18465 ، abcam) ، GFAP غا قارشى (توشقان ، 1: 1000 ؛ Z0334 ، داكو). GFP غا قارشى تۇرۇش (توخۇ ، 1: 1000 ؛ GTX13970 ، GeneTex) ، HNA غا قارشى تۇرۇش ئانتىتېلا) ، RECA-1 گە قارشى (مائۇس ، 1:50 ؛ ab9774 ، abcam) ، SCG2 (توشقان) ، 1: 100 ؛20357. . 20357-1-AP ، Proteintech) ، SOX9 (ئۆچكە ، 1: 500 ؛ AF3075 ، R&D سىستېمىسى) ، Netrin G1a (ئۆچكە ، 1: 100 ؛ AF1166 ، R&D سىستېمىسى) ، STEM121 (چاشقان ، 1: 200; 1: 400;بۆلەكلەر ئاندىن PBS بىلەن يۇيۇلۇپ ، ئىككىلەمچى ئانتىتېلا بىلەن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (توڭلىتىلغان بۆلەكلەر) ياكى بىر كېچە 4 سېلسىيە گرادۇس (قېلىن بۆلەكلەردە) سىڭدۈرۈلدى. Alexa Fluor ئىككىلەمچى ئانتىتېلا (ھاياتلىق تېخنىكىسى) توسۇش ئېرىتمىسىدە 1: 1000 سۇيۇلدى. PBS بىلەن يۇيۇلغاندىن كېيىن ، يادرو Hoechst 33258 (ھاياتلىق تېخنىكىسى) بىلەن تەسۋىرلەنگەن. ئاخىرىدا ، تام تەسۋىر سۇ يۈزى (Polysciences) ئارقىلىق قاپقاق (Fisher Scientific) مىكروسكوپقا قويۇلدى ۋە رەسىمدىكى Keyence فلۇئورېسسېنسىيە مىكروسكوپ (BZ-X ئانالىزچىسى) ياكى لېيكا TCS SP8 ماسلاشتۇرۇلغان مىكروسكوپ (Las-X) ئۈستىدە ئانالىز قىلىندى. بۇ رەسىملەر ImageJ پروگراممىسى (Fiji) ئارقىلىق بىر تەرەپ قىلىنغان. ئىنسانلارنىڭ نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ T-hCO ۋە چاشقان پوستلاق قەۋىتىدىكى نىسبىتىنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ، t-hCO نىڭ مەركىزىدە ، چاشقان پوستلاق قەۋىتىنىڭ چېتىدە ياكى يېنىدا 387.5 مىللىمېتىر كەڭلىكتىكى تىك تۆت بۇلۇڭلۇق رەسىم تارتىلغان. توقۇلما پەرقى توقۇلمىلارنىڭ سۈزۈكلۈكى ، HNA + يادروسى ۋە ياكى توقۇلمىلارنىڭ ئۆزلۈكىدىن ھاسىل بولۇشىنىڭ ئۆزگىرىشىنى باھالاش ئارقىلىق بېكىتىلدى. ھەر بىر رەسىمدە ، NeuN + ۋە HNA + ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئومۇمىي سانى ئوخشاش رايوندىكى NeuN + ھۈجەيرىلىرىنىڭ ئومۇمىي سانىغا ئايرىلدى. رەسىم تەكشىلىكىدىكى يادروسى بار ھۈجەيرىلەرنىڭلا سانىلىشىغا كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ھېسابلاشقا پەقەت Hoechst + بولغان ھۈجەيرىلەرلا كىرىدۇ. كەم دېگەندە 1 مىللىمېتىر بىلەن ئايرىلغان ئىككى پارچە رەسىم ئوتتۇرا ھېساب بىلەن ستاتىستىكىلىق خاتالىقنى ئازايتتى.
ئەۋرىشكە يىغىشتىن بىر ھەپتە بۇرۇن ، HCO كۆچۈرۈلگەن ھايۋانلارنى (تەخمىنەن 8 ئاي پەرقلەندۈرۈش) قاراڭغۇ ئۆيگە قويۇپ ، ۋىۋىسكا ئېسىپ ، سەزگۈنىڭ غىدىقلىشىنى ئەڭ تۆۋەن چەككە چۈشۈردى. يادرونىڭ ئايرىلىشى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ئېلىپ بېرىلغان بولۇپ ، بەزى ئۆزگەرتىشلەر ئېلىپ بېرىلغان. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، t-hCO ۋە hCO يۇيۇش سۇيۇقلۇقى مېخانىكىلىق ھۈجەيرە لىمزىسى ۋە 2 مىللىمېتىرلىق ئەينەك توقۇلما تارتقۇچ (D8938 ، Sigma-Aldrich / KIMBLE) ئارقىلىق يوقىتىلدى. ئاندىن خام يادرو 40 µm سۈزگۈچ ئارقىلىق سۈزۈلۈپ ، 320 گرامدا 4 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت مەركەزلەشتۈرۈلۈپ ، ساخاروزا زىچلىق دەرىجىسىنى ئۆلچەشتىن بۇرۇن. مەركەزدىن قاچۇرۇش باسقۇچىدىن كېيىن (3 سېلسىيە گرادۇس 20 سېلسىيە گرادۇس 4 سېلسىيە گرادۇس) ، ئەۋرىشكە% 0.04 BSA / PBS دا ئەسلىگە كەلتۈرۈلۈپ ، 0.2 بىرلىك µl-1 RNase ئىنگىبىتور (40 u µl-1 ، AM2682 ، ئامبون) قوشۇلدى ۋە 40 µm ئاقما سۈزگۈچتىن ئۆتتى. پارچىلىنىپ كەتكەن يادرو ئاندىن% 0.02 BSA بولغان PBS دا ئەسلىگە كەلتۈرۈلۈپ ، خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ ئۆزىكىگە يۈكلەندى (ھەر بىر يولدا 8000 ھۈجەيرە ئەسلىگە كېلىدۇ). snRNA-seq كۈتۈپخانىلىرى خىروم يەككە ھۈجەيرىسى 3 ′ GEM ، كۈتۈپخانا ۋە Gel Bead Kit v3 (10x گېنومىكا) بىلەن تەييارلانغان. snRNA-seq كۈتۈپخانىلىرى خىروم يەككە ھۈجەيرىسى 3 ′ GEM ، كۈتۈپخانا ۋە Gel Bead Kit v3 (10x گېنومىكا) بىلەن تەييارلانغان. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощу خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM ، كۇتۇپخانا ۋە گېلى مونچاق زاپچىسى v3 (10x گېنومىكا). SnRNA-seq كۈتۈپخانىلىرى خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM ، كۈتۈپخانا ۋە Gel Bead Kit v3 (10x گېنومىكا) ئارقىلىق تەييارلانغان. snRNA-seq 文库是使用 خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM 、 كۈتۈپخانا ۋە گېلى مونچاق زاپچىسى v3 (10x گېنومىكا) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用 خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM 、 كۈتۈپخانا ۋە گېلى مونچاق زاپچىسى v3 (10x گېنومىكا) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM ، كۈتۈپخانا ۋە گېلى مونچاق زاپچىسى v3 (10x گېنومىكا). SnRNA-seq كۇتۇپخانىسى خىروم يەككە ھۈجەيرە 3 ′ GEM ، كۇتۇپخانا ۋە Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ئارقىلىق تەييارلانغان.ئوخشىمىغان ئەۋرىشكىلەردىكى كۈتۈپخانىلار NovaSeq S4 (Illumina) دىكى Admera Health تەرىپىدىن رەتلەنگەن.
ھەر بىر قويۇق يادرو تاياقچە كودىنىڭ گېن ئىپادىلەش دەرىجىسى 10x Genomics CellRanger ئانالىز يۇمشاق دېتال بولىقى (6.1.2 نەشرى) ئارقىلىق مىقدارلاشقان. كونكېرت قىلىپ ئېيتقاندا ، بۇ ئوقۇشلار mkref بۇيرۇقى بىلەن بارلىققا كەلگەن ۋە ساننى ئۆز ئىچىگە ئالغان -include-introns = TRUE بۇيرۇقى بىلەن ساننى ئىشلىتىش ئارقىلىق ئىچكى رايونلارغا سىزىلغان ئوقۇشلۇقنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئىنسانلارنىڭ (GRCh38 ، ئانسامبىل ، 98-نەشرى) ۋە چاشقان (Rnor_6.0 ، ئانسامبىل ، 100-نەشرى) بىرلەشتۈرۈلگەن ماسلاشتۇرۇلغان. T-hCO ئەۋرىشكىسىگە نىسبەتەن ، ئىنسانلارنىڭ يادروسى مۇتەئەسسىپ تەلەپكە ئاساسەن ئېنىقلانغان بولۇپ ، سىزىلغان بارلىق خەرىتە ئوقۇشلىرىنىڭ كەم دېگەندە 95% ئادەم گېنلىرىغا ماس كېلىدۇ. كېيىنكى بارلىق ئانالىزلار R بوغچىسى (4.1.2 نەشرى) Seurat (4.1.1 نەشرى) 32 ئارقىلىق CellRanger دىن سۈزۈلگەن تاياقچە كودلار گۇرۇپپىسىدا چىقىرىلدى.
كېيىنكى ئانالىزغا پەقەت يۇقىرى سۈپەتلىك يادرونىڭلا كىرىشىگە كاپالەتلىك قىلىش ئۈچۈن ، ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن تەكرار سۈزۈش جەريانى يولغا قويۇلدى. بىرىنچىدىن ، 1000 دىن تۆۋەن ئۆزگىچە گېن بايقالغان تۆۋەن سۈپەتلىك يادرو ۋە ئومۇمىي خوندىرىئوسوم كېسىلىنىڭ% 20 تىن كۆپرەكى ئېنىقلىنىپ ئېلىۋېتىلىدۇ. ئۇنىڭدىن كېيىن ، خام گېن ماترىسسا sctransform (vst.flavor = "v2 ″) فۇنكسىيەسىنى ئىشلىتىپ دائىملىق مەنپىي بىنورمال چېكىنىش ئارقىلىق نورماللاشتى ، بۇمۇ سۈكۈتتىكى پارامېتىرلار ئارقىلىق 3000 خىل ئۆزگىرىشچان گېننى ئېنىقلاپ چىقتى. ئاساسلىق زاپچاس ئانالىز قىلىش (PCA) ئارقىلىق ئۈستۈنكى ئۆزگىرىشچان گېندا چوڭ-كىچىكلىكىنى ئۆلچەش ئېلىپ باردۇق. تەكرار گېن توپلاش (ئېنىقلىق دەرىجىسى = 1) گېننى نورمالسىز گېن سانى (10 پىرسەنتتىن تۆۋەن) ، نورمالسىز خوندىرىئوسوملۇق گېن سانى (ئوتتۇراھال 95 پىرسەنتتىن يۇقىرى) نى ئاساس قىلىپ ، تۆۋەن سۈپەتلىك توپ توپى ۋە ياكى قوش نىسبەتتىكى قوشكېزەك قوشكېزەكلەر (ئايرىم-ئايرىم ھالدا 3-نومۇرلۇق) يۇقارقى پارامېتىرلار بىلەن IntegrateData ئىقتىدارىنى ئىشلىتىپ ئاندىن يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك توپلاشتۇرۇلغان سانلىق مەلۇمات توپلىمىنىڭ يەنە بىر سۈپەتلىك سۈزۈش ئېلىپ بېرىلدى.
تۆۋەن سۈپەتلىك مېغىزنى ئېلىۋەتكەندىن كېيىن ، توپلاشتۇرۇلغان سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇماتلىرى گۇرۇپپىلىنىپ (ئېنىقلىق دەرىجىسى = 0.5) بولۇپ ، UMAP34 كۆرۈنۈش مەقسىتىگە قىستۇرۇلدى. ھەر بىر گۇرۇپپىنىڭ ماركا گېنى FindMarkers ئىقتىدارى ئارقىلىق نورمال گېن ئىپادىلەش سانلىق مەلۇماتلىرىدىن ھېسابلانغان سۈكۈتتىكى پارامېتىرلار ئارقىلىق بېكىتىلدى. بىز تۆرەلمە ۋە چوڭلارنىڭ پوستلاق قەۋىتى پايدىلىنىش سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن بەلگە گېنىنىڭ ئىپادىلىنىشى 19،20،21،35 ۋە ئىزاھلارنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق ئاساسلىق ھۈجەيرە سىنىپلىرىنى پەرقلەندۈرىمىز ۋە تۈرگە ئايرىيمىز. بولۇپمۇ ئايلانما ئالدىنقىلار MKI67 ۋە TOP2A نىڭ ئىپادىلىنىشى ئارقىلىق ئېنىقلاندى. تۇغما توپى مىتوتىك خاتىرىنىڭ يوقلۇقى ، كېچىكىپ مېتافا ھامىلىنىڭ پوستلاق قەۋىتىدە تەسۋىرلەنگەن كۆپ ئىقتىدارلىق گىللىق تۇغما توپى ۋە EGFR ۋە OLIG1 ئىپادىلىنىشى بىلەن ئېنىقلانغان. بىز ئاسترونومىيە ئاتالغۇسىنى ئىشلىتىپ ، ئاسترونومىيە پەرقلەندۈرۈشنىڭ بىر قانچە ھالىتىنى ئۆز ئىچىگە ئالىمىز. Astrocyte توپى يۇقىرى دەرىجىدىكى SLC1A3 ۋە AQP4 نى ئىپادىلەيدۇ ھەمدە ھامىلىنىڭ رادىئاتسىيە يىلىمى ۋە ياكى چوڭلار ئاسترونومىيىسىنىڭ كىچىك تىپلىرى بىلەن خەرىتە كۆرسىتىلگەن. OPC لار PDGFRA ۋە SOX10 نى ئىپادىلەيدۇ ، ئولىگودېندروسېتس بولسا يىراقنى كۆرەلمەسلىك بەلگىسىنى (MOG ۋە MYRF) ئىپادىلەيدۇ. گلۇتاماتېرگىيىلىك نېرۋا ھۈجەيرىلىرى نېرۋا خاتىرىسىنىڭ (SYT1 ۋە SNAP25) ، GABAergic بەلگىسىنىڭ يوقلۇقى (GAD2) ۋە NEUROD6 ، SLC17A7 ، BCL11B ياكى SATB2 نىڭ ئىپادىلىنىشى ئارقىلىق ئېنىقلانغان. GluN نېرۋا ھۈجەيرىلىرى تېخىمۇ يۇقىرى (SATB2 ئىپادىلەش ۋە BCL11B نىڭ يوقىلىشى) ۋە چوڭقۇر (BCL11B ئىپادىلەش) كىچىك تۈرلىرىگە ئايرىلدى. قىستۇرما تارماق (SP) نېرۋا ھۈجەيرىسى چوڭقۇر GluN بەلگىسىدىن باشقا ، ST18 ۋە SORCS1 قاتارلىق داڭلىق SP18 بەلگىسىنى ئىپادىلەيدۇ. خوروئىد ئەۋرىشىم ھۈجەيرىسىگە ئوخشاش ھۈجەيرىلەر TTR ئىپادىسى ئارقىلىق ئېنىقلانغان ، مېڭە پەردىسىگە ئوخشاش ھۈجەيرىلەر تالا ھۈجەيرىسىگە مۇناسىۋەتلىك گېننى ۋە پايدىلىنىش سانلىق مەلۇماتلىرى توپلانغان يۈرەك ۋە قان تومۇر ھۈجەيرىسىنى سىزىپ چىققان.
T-hCO بىلەن hCO تارماق تۈرلىرى ئارىسىدىكى گېن ئىپادىسىنى پەرقلىق تەھلىل قىلىش Libra R بولىقى (1.0.0 نەشرى) ئارقىلىق قوللىنىلغان ئەۋرىشكىلەردە كۆپەيتىلگەن يېڭىدىن ياسالغان ساختا تۈركۈمدە قوللىنىلدى. كونكرېت قىلىپ ئېيتقاندا ، edgeR خاتىرىلەش ئېھتىماللىقى سىنىقى (3.36.0 نەشرى ، R بولىقى) ھەر بىر ئەۋرىشكە كۆپەيتىش ئۈچۈن مەلۇم ھۈجەيرە سىنىپىدىكى ھۈجەيرىلەرنىڭ گېن سانىنى يىغىنچاقلاش ئارقىلىق گۇرۇپپىلار ئۈچۈن ئېلىپ بېرىلدى. ئىسسىقلىق خەرىتىسىنى تەسۋىرلەش ئۈچۈن ، ھەر بىر مىليون (CPM) قىممىتى نورماللاشتۇرۇلغان edgeR (cpm () ئىقتىدارى) ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ ۋە كۆلەملەشتۈرۈلىدۇ (ئوتتۇرىچە = 0 ، ئۆلچەملىك ياتلىشىش = 1). گېن ئونتولوگىيىسى (GO) كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تەڭشەلگەن T-hCO GluN گېنىنى بېيىتىش ئانالىزى ئېلىپ بېرىلدى (Benjamini-Hochberg كەم دېگەندە% 10 t-hCO GluN ھۈجەيرىسىدە ئىپادىلەنگەن P قىممىتى 0.05 دىن تۆۋەن بولغان P قىممىتى ۋە كەم دېگەندە 2 ھەسسە ئۆزگىرىشنىڭ ھەسسىلەپ ئېشىشى). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 نى ئىشلىتىپ ئورۇندىلىدۇ. بىز سۈكۈتتىكى پارامېتىرلار بىلەن ToppFun دېتالىنى ئىشلىتىمىز ھەمدە GO ئىزاھلانغان يۇقىرى قان بېسىم سىنىقىدىن ھېسابلانغان Benjamini-Hochberg تۈزىتىلگەن P قىممىتىنى دوكلات قىلىمىز.
بىزنىڭ snRNA-seq گۇرۇپپىمىزنى دەسلەپكى يەككە ھۈجەيرە RNA-seq ياكى قۇرامىغا يەتكەن snRNA-seq19,20,21,22 نىڭ پايدىلىنىش تەتقىقاتىدىكى ئىزاھلانغان ھۈجەيرە توپى بىلەن ماسلاشتۇرۇش ئۈچۈن ، بىز بىر جۈپ سانلىق مەلۇمات توپلاش ئۇسۇلىنى قوللاندۇق. بىز Seurat دىكى SCTransform (v2) نورماللاشتۇرۇش خىزمەت ئېقىمىنى ئىشلىتىپ ، سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇماتلىرى ئارىسىدىكى گۇرۇپپىلارنىڭ قاپلىنىشىنى بىرلەشتۈردۇق ۋە سېلىشتۇردۇق (يۇقىرىدىكىگە ئوخشاش پارامېتىرلارنى ئىشلىتىپ). يەككە سانلىق مەلۇمات سانلىق مەلۇماتلىرى ھېسابلاش ئۈنۈمى ئۈچۈن ھەر بىر گۇرۇپپىدا 500 ھۈجەيرە ياكى يادروغا ئىختىيارىي ھالدا ئايرىلدى. ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەنگە ئوخشاش ئۇسۇلنى قوللانغاندا ، گۇرۇپپىلارنىڭ قاپلىنىشى پايدىلىنىش گۇرۇپپىسىنىڭ بەلگىسى بىلەن قاپلانغان ھەر بىر توپلانغان گۇرۇپپىدىكى ھۈجەيرە ياكى يادرونىڭ نىسبىتى دەپ ئېنىقلىما بېرىلگەن. GluNs نى تېخىمۇ تۈرگە ئايرىش ئۈچۈن ، بىز GluN تارماق سانلىق مەلۇماتلىرى ئۈچۈن Seurat نىڭ TransferData خىزمەت ئېقىمىنى ئىشلىتىپ ، بىزنىڭ GluN ھۈجەيرىمىزگە پايدىلىنىش سانلىق مەلۇمات بەلگىسىنى تەقسىملىدۇق.
T-hCO ۋە hCO ئەۋرىشكىسىنىڭ يەر شارىدىكى ترانسكرىپسىيەسىنىڭ يېتىلىش ئەھۋالىنى باھالاش ئۈچۈن ، بىز چوڭ مېڭە ئەۋرىشكىسىنى BrainSpan / psychENCODE23 بىلەن سېلىشتۇرۇپ چىقتۇق ، بۇ ئىنسانلارنىڭ چوڭ مېڭىسىنىڭ يېتىلىشىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان چوڭ RNA تەرتىپىدىن تەركىب تاپقان. بىز ھامىلدارلىقتىن 10 ھەپتە كېيىن ، كېيىن 5567 گېندا (بىزنىڭ سانلىق مەلۇماتلىرىمىز بىلەن بىللە) پوستلاق قەۋىتى ئەۋرىشكىسىدىن PCA نى بىرلەشتۈردۇق. ئۇنىڭدىن باشقا ، بىز ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك مەنپىي بولمىغان ماترىسسا فاكتورى ئارقىلىق نېرۋا تەرەققىياتىنىڭ ئاساسلىق خاتىرىلەنگەن ئىمزالىرى بىلەن مۇناسىۋەتلىك گېنلارنى ھاسىل قىلدۇق. مەنپىي بولمىغان ماترىسسا فاكتورلاشتۇرۇش تەرتىپىدىن پايدىلىنىپ ھېسابلانغان ئەۋرىشكە ئېغىرلىقى ئەنجۈردە پىلانلانغان. جۇ قاتارلىقلار تەسۋىرلىگەن بەش ئىمزانىڭ ھەر بىرىنىڭ كېڭەيتىلگەن سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن 5b. يەنە كېلىپ پائالىيەتكە ترانسكرىپسىيە بەلگىسى ئىلگىرى ئېلان قىلىنغان تەتقىقاتلاردىن كەلگەن. بولۇپمۇ ERG ۋە LRG قوشۇمچە جەدۋەل 3 Hrvatin قاتارلىقلار. ئادەم بېيىغان LRG لار KCl قوزغىتىلغان ئىنسانلارنىڭ ھامىلىنىڭ چوڭ مېڭە مەدەنىيىتىدىن قولغا كەلتۈرۈلۈپ ، غىدىقلانغاندىن كېيىنكى 6 سائەتتىن كېيىن يىغىۋېلىندى ، سۈزۈلگەن گېن ئىنسانلاردا كۆرۈنەرلىك تەڭشەلدى ، ئەمما چاشقانلاردا ئەمەس (قوشۇمچە 4-جەدۋەل). بۇ گېن توپلىرىنى ئىشلىتىپ گېن توپلاشنى بېيىتىش ئانالىزى بىر تەرەپلىمە فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقىدىن پايدىلىنىپ ئېلىپ بېرىلدى.
چاشقاننى ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىپ ، مېڭىنى چىقىرىپ سوغۇق (تەخمىنەن 4 سېلسىيە گرادۇس) ئوكسىگېنلانغان (% 95 O2 ۋە% 5 CO2) ساخاروزا ئېرىتمىسى بار بۆلەكلەر: 234 mM ساخاروزا ، 11 مىللىمېتىر گلۇكوزا ، 26 mM NaHCO3 ، 2.5 mM KCl ، 1.25 mM. NaH2PO4 ، 10 mM MgSO4 ۋە 0.5 mM CaCl2 (تەخمىنەن 310 mOsm). T-hCO بولغان چاشقان مېڭىسىنىڭ تاجىسىمان بۆلەكلىرى (300-400 µm) ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك Leica VT1200 تەۋرىنىش ئارقىلىق ياسالغان. بۆلەكلەر ئۇدا تەييارلانغان ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسى ئوكسىگېن بىلەن ACSF نى ئۆز ئىچىگە ئالغان بۆلەك بۆلمىسىگە يۆتكەلدى: 10 mM گلۇكوزا ، 26 mM NaHCO3 ، 2.5 mM KCl ، 1.25 mM NaHPO4 ، 1 mM MgSO4 ، 2 mM CaCl2 ۋە 126 mM NaCl (298 mOsm). خاتىرىلەشتىن ئاز دېگەندە 45 مىنۇت بۇرۇن. بۆلەكلەر چۆمۈلدۈرۈلگەن كامېردا خاتىرىلەنگەن بولۇپ ، ئۇلار ئۇدا ACSF (% 95 O2 ۋە% 5 CO2 قاچىسى) بىلەن ئۇدا ياسالغان. بارلىق سانلىق مەلۇماتلار ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا خاتىرىلەندى. t-hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى 127 mM كالىي گلۇكونات ، 8 mM NaCl ، 4 mM ماگنىي ATP ، 0.3 mM ناترىي GTP ، 10 mM HEPES ۋە 0.6 mM EGTA ، pH 7.2 بولغان ئېرىتمە قاچىلانغان بوروسىلىك ئەينەك تۇرۇبا بىلەن ئاخىرلاشتى. ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئۈچۈن ، خاتىرىلەش ئېرىتمىسىگە بىئوسىن (% 0.2) قوشۇلدى.
سانلىق مەلۇماتلار MultiClamp 700B كۈچەيتكۈچ (مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) ۋە Digidata 1550B رەقەملىك رەقەملەشتۈرگۈچ (مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) ئارقىلىق سېتىۋېلىندى ، تۆۋەن سۈرئەتلىك 2 kHz سۈزۈلۈپ ، 20 kHz لىك رەقەملەشتۈرۈلۈپ ، Clampfit (مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) ، كېلىپ چىقىشى (OriginPro) ئارقىلىق تەھلىل قىلىندى. 2021b ، OriginLab). ۋە ئىختىيارى MATLAB ئىقتىدارلىرى (Mathworks). ئۇلىنىش يوشۇرۇن كۈچى JPCalc ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ ، تۈرلەر -14 mV نىڭ ھېسابلانغان قىممىتىگە تەڭشەلدى. IV مەشغۇلات -250 دىن 750 pA غىچە بولغان 10-25 pA باسقۇچلۇق بىر قاتار باسقۇچلاردىن تەركىب تاپقان.
تالامۇس ، ئاق ماددا ۋە S1 ئاسفېرېنتلىرى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك ، HCO نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ ياماق قىسقۇچ خاتىرىلەش جەريانىدا تالاكورتىك پارچىلىرىدا ئېلېكتر ئارقىلىق غىدىقلانغان. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، چوڭ مېڭە 3D بېسىش جەدۋىلىگە 10 ° بۇلۇڭغا يانتۇ قويۇلغان ، چوڭ مېڭىنىڭ ئالدى تەرىپى 35 ° بۇلۇڭدا كېسىلگەن. ئاندىن چوڭ مېڭە كېسىلگەن يۈزىگە چاپلانغان ۋە بۆلۈنۈپ ، تالاكورتىك شەكىللىك ئاقوننى ساقلاپ قالغان. ئىككى قۇتۇپلۇق تۇڭگان ئېلېكترود (0.5 MΩ) ئىككىنچى مىكرو كونتروللىغۇچقا ئورنىتىلغان ۋە ئىستراتېگىيىلىك ئورنىتىلغان بولۇپ ، ھەر بىر ھۈجەيرە (ئىچكى كاپسۇل ، ئاق ماددا ، S1 ۋە hCO) دىن ئىبارەت تۆت رايوننى قوزغىتىدۇ. 300 µA فازىكىلىق غىدىقلاشتىن كېيىن 0.03-0.1 Hz دىن كېيىن ماس قەدەملىك ئىنكاسلارنى خاتىرىلەڭ.
hChR2 ئىپادىلەيدىغان hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى 480 nm دە قوزغىتىلدى ، LED (Prizmatix) ھاسىل قىلغان نۇر تومۇرلىرى × 40 ئوبيېكتىپ (0.9 NA; Olympus) ئارقىلىق ھۈجەيرىلەرنىڭ يېنىدىكى HChR2 ئىپادىسىنى خاتىرىلىدى. يورۇتۇلغان مەيدان دىئامېتىرى تەخمىنەن 0.5 مىللىمېتىر ، ئومۇمىي قۇۋۋىتى 10-20 mW. تومۇرنىڭ كەڭلىكى 10 ms قىلىپ بېكىتىلدى ، بۇ ھەرىكەت ئۆگىنىش تەجرىبىسى جەريانىدا بېرىلگەن تومۇرغا ماس كېلىدۇ. ھەر خىل غىدىقلاش چاستوتىسى 1 دىن 20 Hz غىچە ئىشلىتىلگەن ، ئەمما مىقدارلاشتۇرۇشتا پەقەت بۇ يۈرۈشلۈكنىڭ بىرىنچى تومۇرى ئىشلىتىلگەن. پويىزنىڭ ئارىلىقى ئادەتتە 30 سېكۇنتتىن ئۇزۇن بولۇپ ، ماس قەدەملىك تورمۇزلىنىش ياكى يولنى ئاسانلاشتۇرىدۇ. HChR2 ئىنكاسىنىڭ يەككە ھەرىكەتچان ياكى ئەمەسلىكىنى سىناش ئۈچۈن ، بىز TTX (1 mMM) نى EPSC ئىنكاسى يوقالغۇچە مۇنچىغا سۈردۇق ، ئاندىن 4-ئامىنوپىرىدېن (4-AP; 100 mMM) نى قوللاندۇق. ئادەتتە ، بىر نەچچە مىنۇت ئىچىدە جاۋاب قايتۇرۇلىدۇ ، LED ئېتىش بىلەن EPSC ئەۋلاد ئوتتۇرىسىدا سەل ئۇزۇنراق كېچىكىش بولىدۇ. NBQX (10 μM) ئىنكاسنىڭ AMPA قوبۇللىغۇچ تەرىپىدىن قوزغىتىلغان ياكى ئەمەسلىكىنى سىناشقا ئىشلىتىلگەن.
ئۆتكۈر hCO بۆلەكلىرى ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك قۇرۇلدى. قىسقىچە قىلىپ ئېيتقاندا ، hCO بۆلەكلىرى% 4 لىك ئاگاروزاغا قىستۇرۇلۇپ ، 126 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 1.25 mM NaH2PO4 ، 1 mM MgSO4 ، 2 mM CaCl2 ، 26 mM NaHCO3 ۋە 10 mM d - (+) - گلۇكوزا بار بۆلۈملەرگە 200-300 µm لىك تېمپېراتۇرىدا كېسىلگەن. ئاندىن ، بىۋاسىتە SliceScope مىكروسكوپ (Scientifica) ئاستىدا hCO بۆلەكلىرىدە پۈتكۈل ھۈجەيرىلەرنىڭ ياماق لاگېر خاتىرىلىنىشى ئېلىپ بېرىلدى. بۆلەكلەر ACSF (95% O2 ۋە% 5 CO2) بىلەن مۇكەممەللەشتۈرۈلۈپ ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ھۈجەيرە سىگنالى خاتىرىلەندى. hCO نېرۋا ھۈجەيرىسى 127 mM كالىي گلۇكونات ، 8 mM NaCl ، 4 mM ماگنىي ATP ، 0.3 mM ناترىي GTP ، 10 mM HEPES ۋە 0.6 mM EGTA ، ئىچكى pH 7 ، 2 ، ئېرىتىلگەن ئېرىتمە قاچىلانغان بوروسىلىك ئەينەك تۇرۇبا ئارقىلىق قوللىنىلدى. ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئۈچۈن ، ئىچكى ھەل قىلىش چارىسىگە% 0.2 بىئوسىتسىن قوشۇڭ.
سانلىق مەلۇماتلار Clampex (Clampex 11.1 ، مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) تەرىپىدىن MultiClamp 700B كۈچەيتكۈچ (مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) ۋە Digidata 1550B رەقەملەشتۈرگۈچ (مولېكۇلا ئۈسكۈنىلىرى) ئارقىلىق سېتىۋېلىندى ، تۆۋەن سۈرئەتلىك 2 kHz لىق سۈزۈلدى ، 20 kHz لىك رەقەملەشتۈرۈلدى ، ھەمدە Clampfit (10.6 نەشرى) ئارقىلىق MAT MLAB ۋە MAT MATLAB). ئۇلىنىش يوشۇرۇن كۈچى JPCalc ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ ، تۈرلەر -14 mV ھېسابلانغان ئۇلىنىش يوشۇرۇن كۈچىگە تەڭشەلدى. IV مەشغۇلات -50 دىن 250 pA غىچە بولغان 5-10 pA باسقۇچتىكى بىر يۈرۈش نۆۋەتتىكى باسقۇچلاردىن تەركىب تاپقان.
چىشلەنگەن نېرۋا ھۈجەيرىسىنى مورفولوگىيەلىك قايتا قۇرۇش ئۈچۈن ، ئىچكى ھەل قىلىش چارىسىگە% 0.2 بىئوسىن (Sigma-Aldrich) قوشۇلدى. بۇ ھۈجەيرىلەر خاككېرلىق قىلغاندىن كېيىن كەم دېگەندە 15 مىنۇت باھالانغان. ئاندىن تۇرۇبا يولى ئاستا-ئاستا 1-2 مىنۇتقىچە سىزىلغان بولۇپ ، تىزىملانغان پەردە پۈتۈنلەي پېچەتلەنگۈچە. بۆلەك فىزىئولوگىيە تەرتىپىدىن كېيىن ، بۆلەكلەر% 4 PFA دا بىر كېچىدىلا 4 سېلسىيە گرادۇستا مۇقىملاشتۇرۇلدى ، PBS X3 بىلەن يۇيۇلدى ۋە سترېپتاۋىدىن بىرىكتۈرۈلگەن DyLight 549 ياكى DyLight 405 (ۋېكتور تەجرىبىخانىسى) بىلەن 1: 1000 سۇيۇلدى. بىئوسىتسىن (% 2; Sigma-Aldrich) بىلەن تولغان ھۈجەيرىلەرگە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا ياماق قىسقۇچ خاتىرىلەش جەريانىدا بەلگە قويۇلغان. ئاندىن بۇ بۆلەكلەر Aquamount (Thermo Scientific) ئارقىلىق مىكروسكوپ سىيرىلمىسىغا ئورنىتىلىپ ، ئەتىسى لېيكا TCS SP8 كونفېرانس مىكروسكوپتا سانلىق مەلۇماتنىڭ سۈزۈكلۈكى × 40 1.3 ، چوڭايتىش × 0.9-1.0 ، xy بولغان مايغا چۆمۈلۈش ئوبيېكتى ئارقىلىق تەسۋىرلەنگەن. ئەۋرىشكە ئېلىش نىسبىتى ھەر مىكروندا تەخمىنەن 7 پېكسىل. 1 µm ئارىلىقتىكى Z بۆلەكلىرى تەرتىپلىك قولغا كەلتۈرۈلدى ، ھەر بىر نېرۋا ھۈجەيرىسىنىڭ پۈتۈن ئۆسمە دەرىخىنى قاپلاش ئۈچۈن z شەكىللىك موزايكا ۋە لېيكانى ئاساس قىلغان ئاپتوماتىك تىكىش ئېلىپ بېرىلدى. كېيىن نېۋرونلار neuTube 40 كۆرۈنمە يۈزى ئارقىلىق يېرىم قولدا ئىز قوغلاندى ۋە SWC ھۆججىتى ھاسىل قىلىندى. ئاندىن بۇ ھۆججەتلەر SimpleNeuriteTracer41 Fiji قىستۇرمىسىغا يۈكلەندى (ImageJ ، 2.1.0 نەشرى ؛ NIH).
ئىنسانلارنىڭ پوستلاق توقۇلمىلىرى ستانفورد ئۇنۋېرسىتىتى ئورگان تەكشۈرۈش ھەيئىتى تەستىقلىغان كېلىشىمگە ئاساسەن ، ماقۇللۇق بىلەن ئېرىشكەن. ئىنسانلارنىڭ تۇغۇتتىن كېيىنكى توقۇلمىلىرىنىڭ ئىككى ئەۋرىشكىسى (3 ۋە 18 ياش) ئالدى مېڭە پوستلاق قەۋىتى (ئوتتۇرا ئالدى قاپارتمىسى) نى ئەسلىگە كەلتۈرۈش ئارقىلىق تۇتقاقلىق تۇتقاقلىق كېسىلىنى ئوپېراتسىيە قىلىشنىڭ بىر قىسمى سۈپىتىدە قولغا كەلتۈرۈلدى. ئەسلىگە كەلگەندىن كېيىن ، مۇز سوغۇق NMDG-aCSF تەركىبىدىكى توقۇلمىلارنى يىغىۋېلىڭ: تەركىبىدە 92 mM NMDG ، 2.5 mM KCl ، 1.25 mM NaH2PO4 ، 30 mM NaHCO3 ، 20 mM HEPES ، 25 mM گلۇكوزا ، 5 mM ناترىي ئاسكوربات ، 3 mM ناترىي pyruvate ، 0.5 mM2 PH 7.3-7.4 غا قويۇق ھىدرو كىسلاتا بىلەن تىترىت قىلىڭ. توقۇلمىلار 30 مىنۇت ئىچىدە تەجرىبىخانىغا يەتكۈزۈلۈپ ، تاجسىمان بۆلەكلەر يۇقىرىدا بايان قىلىنغان تەرتىپ بويىچە ئېلىندى.
بارلىق ھايۋان رەسمىيەتلىرى ستانفورد ئۇنىۋېرسىتېتى APLAC تەستىقلىغان ھايۋانلارنى بېقىش كۆرسەتمىسى بويىچە ئېلىپ بېرىلدى. چاشقانلار (كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 140 كۈندىن چوڭ)% 5 ئىزوفلوران ناركوز دورىلىرى بىلەن قوزغىلىپ ، ئوپېراتسىيىدە% 1-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىنغان. ھايۋانلار ئىستېرېئولۇق رامكىغا (Kopf) قويۇلدى ۋە سىجىل قويۇپ بېرىلگەن بۇپرېنورفىن (SR) تېرە ئاستىغا ئوكۇل قىلىندى. باش سۆڭىكى ئوچۇق ، تازىلانغان ۋە 3-5 سۆڭەك نەيچىسى قىستۇرۇلغان. T-hCO نى نىشانلاش ئۈچۈن ، بىز MRI ​​رەسىملىرىدىن ئىستېرېئولۇق كوئوردېنات ھاسىل قىلدۇق. قىزىقىش ئورنىدا بىر تۆشۈك تېشىپ ، تالا (دىئامېتىرى 400 مىللىمېتىر ، NA 0.48 ، Doric) hCO يۈزىدىن 100 µm تۆۋەنگە چۈشۈرۈلۈپ ، ئۇلترا بىنەپشە نۇر ئارقىلىق داۋالىغىلى بولىدىغان چىش سېمونت (Relyx) بىلەن باش سۆڭىكىگە كاپالەتلىك قىلىندى.
تالا فوتومېتىرلىق خاتىرىلەر ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەندەك 42. ئۆزلۈكىدىن پائالىيەتنى خاتىرىلەش ئۈچۈن ، چاشقانلار پاكىز قەپەسكە قويۇلدى ۋە دىئامېتىرى 400 مىللىمېتىر كېلىدىغان تالالىق ئوپتىك كابېل (Doric) ئوپتىك تالالىق ئوپتىك كابېلغا ئۇلاندى. ماتورلۇق پائالىيەتنى 10 مىنۇت خاتىرىلەش جەريانىدا ، ھايۋانلار قەپەسنى ئەركىن تەكشۈرگەن. قوزغالغان پائالىيەتنى خاتىرىلەش ئۈچۈن ، چاشقانلار (كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 140 كۈندىن كۆپرەك ۋاقىت) ناركوز قىلىنغان بولۇپ ، ئوكۇلغا% 5 ئىزوفلوران ۋە% 1-3 ئىزوفلوران رېمونت قىلىنغان. ھايۋاننى ستېرېئاكتىپلىق رامكىغا (Kopf) قويۇڭ ، t-hCO نىڭ قارشى تەرىپىدىكى ۋىۋىسكىلار تەخمىنەن 2 سانتىمېتىر ئەتراپىدا بېزىلىپ ، ئېلېكتر ئېنېرگىيىسى ھەرىكەتلەندۈرگۈچ كۈچى (PI) غا ئۇلانغان توردىن ئۆتىدۇ. 400 µm ئوپتىك تالالىق كابېل (Doric) كۆچۈرۈلگەن تالاغا ئۇلىنىپ سانلىق مەلۇمات ئېلىش سىستېمىسىغا ئۇلانغان. ئاندىن t-hCO نىڭ قارشى تەرىپىدىكى ۋىۋىسكىلار 20 مىنۇتلۇق خاتىرىلەش مەزگىلىدە پيېزو ئېلېكتر قوزغاتقۇچ ئارقىلىق ئىختىيارى ۋاقىتتا 50 قېتىم (20 Hz لىك 2 مىللىمېتىر ، ھەر قېتىمدا 2 سېكۇنت) توغرىلانغان. Arduino MATLAB ياردەم بوغچىسىدىن پايدىلىنىپ ، MATLAB كودى بىلەن بۇرۇلۇش ۋاقتىنى كونترول قىلىڭ. ۋەقەلەر ترانس ist ور ترانس ist ورست لوگىكىسى (TTL) تومۇرى ئارقىلىق سانلىق مەلۇمات سېتىۋېلىش يۇمشاق دېتالىغا ماس قەدەمدە ئېلىپ بېرىلىدۇ.
چاشقانلار (كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 140 كۈندىن چوڭ)% 5 ئىزوفلوران ناركوز دورىلىرى بىلەن قوزغىلىپ ، ئوپېراتسىيىدە% 1-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىنغان. ھايۋانلار ئىستېرېئولۇق رامكىغا (Kopf) قويۇلدى ، بۇپرېنورفىن SR ۋە دېكامېتاسون تېرە ئاستىغا ئوكۇل قىلىندى. باش سۆڭىكى ئوچۇق ، تازىلانغان ۋە 3-5 سۆڭەك نەيچىسى قىستۇرۇلغان. T-hCO نى نىشانلاش ئۈچۈن ، بىز MRI ​​رەسىملىرىدىن ئىستېرېئولۇق كوئوردېنات ھاسىل قىلدۇق. كۆچۈرۈلگەن HCO ئۈستىدىن تېز سۈرئەتلىك مانېۋىر بىلەن ئايلانما كرانىئوموم (دىئامېتىرى تەخمىنەن 1 سانتىمېتىر) ئېلىپ بېرىلدى. سۆڭەك ئىمكانقەدەر نېپىز بولغاندىن كېيىن ، ئەمما پۈتۈن سۆڭەكنى تېشىپ چىقىشتىن بۇرۇن ، كۈچ ئىشلىتىپ ، قالغان مۇكەممەل داس سۆڭىكىنى ئېلىۋېتىپ ، ئاستىدىكى T-hCO نى ئاشكارىلاڭ. دانىخورەك ستېرېلىنلىق تۇز بىلەن تولدۇرۇلدى ، باش سۆڭەك ۋە ئۇلترا بىنەپشە نۇردىن ياسالغان چىش سېمونت (Relyx) بىلەن باش سۆڭىكى چاپلاندى.
ئىككى فوتون تەسۋىر ھاسىل قىلىش Nikon LWD (× 16 ، 0.8 NA) ئوبيېكتى بولغان Bruker كۆپ ئىقتىدارلىق مىكروسكوپ ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. GCaMP6 تەسۋىر ھاسىل قىلىش 920 nm بولۇپ ، 1.4x يەككە z- ئايروپىلان چوڭايتىلغان ، 8x ئوتتۇرىچە 7.5 fps. چاشقانلار% 5 ئىزوفلوران ناركوز دورىلىرى بىلەن قوزغالغان ۋە% 1-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ساقلانغان. بۇ چاشقانلار مەخسۇس ياسالغان باش قۇرۇلمىغا قويۇلغان ۋە لىنزا ئاستىغا قويۇلغان. ماتورلۇق پائالىيەتنىڭ 3 مىنۇتلۇق ئارقا كۆرۈنۈشى خاتىرىلەندى. 20 مىنۇتلۇق خاتىرىلەش جەريانىدا ، 50 دانە پۈۋەك (ھەر بىر تونۇشتۇرۇشنىڭ ئۇزۇنلۇقى 100 ms) ئىختىيارىي رەسىم ئارقىلىق T-hCO نىڭ ئۇدۇلىدىكى پىچىرلاش تاختىسىغا ئىختىيارىي يەتكۈزۈلدى. Arduino MATLAB قوللاش بولىقىنى ئىشلىتىپ ، MATLAB كودى بىلەن پارتىلاش ۋاقتىنى كونترول قىلىڭ. TTL تومۇرى ئارقىلىق سانلىق مەلۇماتلارنى سېتىۋېلىش يۇمشاق دېتالى (PrairieView 5.5) بىلەن ماسقەدەملەڭ. تەھلىل قىلىش ئۈچۈن ، رەسىملەر فىجىدا يولغا قويۇلغان MoCo پروگراممىسىدا ئافرىن تۈزىتىش ئارقىلىق xy ھەرىكىتى ئۈچۈن تۈزىتىلدى. CNMF-E43 ئارقىلىق يەككە ھۈجەيرىلەردىن فلۇئورېسسېنسىيە ئىزلىرىنى ئېلىش. فلۇئورېسسېنسىيە قىزىقىدىغان ھەر بىر رايون ئۈچۈن چىقىرىلىپ ، dF / F ئەگرى سىزىقىغا ئايلاندۇرۇلدى ، ئاندىن z نومۇرىغا ئۆزگەرتىلدى.
چاشقانلار (كۆچۈرۈلگەندىن كېيىنكى 140 كۈندىن چوڭ)% 5 ئىزوفلوران ناركوز دورىلىرى بىلەن قوزغىلىپ ، ئوپېراتسىيىدە% 1-3 لىك ئىزوفلوران بىلەن ناركوز قىلىنغان. ھايۋانلار ئىستېرېئولۇق رامكىغا (Kopf) قويۇلدى ، بۇپرېنورفىن SR ۋە دېكامېتاسون تېرە ئاستىغا ئوكۇل قىلىندى. T-hCO نىڭ قارشى تەرىپىدىكى ۋىۋىسكىلار تەخمىنەن 2 سانتىمېتىر ئەتراپىدا كېسىلىپ ، ئېلېكتر ئېنېرگىيىسى ھەرىكەتلەندۈرگۈچ كۈچىگە ئۇلانغان تور ئارقىلىق يىپلانغان. باش سۆڭىكى ئوچۇق ۋە پاكىزلىنىدۇ. باش سۆڭىكىگە داتلاشماس پولات چىۋىق ئورنىتىلغان. T-hCO نى نىشانلاش ئۈچۈن ، بىز MRI ​​رەسىملىرىدىن ئىستېرېئولۇق كوئوردېنات ھاسىل قىلدۇق. T-hCO نىڭ ئۈستىدە يۇقىرى سۈرئەتلىك مانېۋىر بىلەن ئايلانما كرانىئوتىك (دىئامېتىرى تەخمىنەن 1 سانتىمېتىر) ئىجرا قىلىڭ. سۆڭەك ئىمكانقەدەر نېپىز بولغاندىن كېيىن ، ئەمما پۈتۈن سۆڭەكنى تېشىپ چىقىشتىن بۇرۇن ، كۈچ ئىشلىتىپ ، قالغان مۇكەممەل داس سۆڭىكىنى ئېلىۋېتىپ ، ئاستىدىكى T-hCO نى ئاشكارىلاڭ. يەككە ھۈجەيرىلەر 32 قانال ياكى 64 قاناللىق يۇقىرى زىچلىقتىكى كرېمنىيلىق تەكشۈرۈش ئەسۋابى (Cambridge Neurotech) ئارقىلىق يەر يۈزىگە ئۇلانغان ۋە RHD كۈچەيتكۈچ (Intan) ئارقىلىق ئالدىن كۈچەيتىلگەن. كونتروللىغۇچنى ئىشلىتىپ ، ئېلېكترودنى ستېرېن تۇز سۈيى بىلەن تولغان كرانىئوتوم ئارقىلىق نىشان ئورۇنغا چۈشۈرۈڭ. سانلىق مەلۇمات توپلاش ئوچۇق Ephys سانلىق مەلۇمات سېتىۋېلىش سىستېمىسى ئارقىلىق 30 kHz چاستوتادا ئېلىپ بېرىلدى. خاتىرىلەش پەقەت 10 نەچچە قانالدا ئۆز-ئارا مۇناسىۋەتلىك رېتىملىق ئۆزلۈكىدىن ھەرىكەتنى بايقىغاندىن كېيىنلا داۋاملاشتى ، بۇ ئېلېكترودنىڭ كۆچۈرۈلگەن ئورۇنغا جايلاشقانلىقىنى (ئىككى فوتون كالتسىي تەسۋىر ھاسىل قىلىش سانلىق مەلۇماتلىرىغا ئاساسەن). ماتورلۇق پائالىيەتنىڭ 10 مىنۇتلۇق ئارقا كۆرۈنۈشى خاتىرىلەندى. ئاندىن t-hCO نىڭ قارشى تەرىپىدىكى ۋىۋىسكىلار 20 مىنۇتلۇق خاتىرىلەش مەزگىلىدە پيېزو ئېلېكتر قوزغاتقۇچ ئارقىلىق ئىختىيارى ۋاقىتتا 50 قېتىم (20 Hz لىك 2 مىللىمېتىر ، ھەر قېتىمدا 2 سېكۇنت) توغرىلانغان. Arduino (MATLAB 2019b) ئۈچۈن MATLAB قوللاش بولىقىنى ئىشلىتىپ ، ئىختىيارى MATLAB كودى بىلەن بۇرۇلۇش ۋاقتىنى كونترول قىلىڭ. TTL تومۇرىنى ئىشلىتىپ سانلىق مەلۇماتلارنى سېتىۋېلىش يۇمشاق دېتالى بىلەن ماسقەدەملەڭ.
ئوپتىكىلىق بەلگە تەجرىبىسى ئۈچۈن ، 473 nm لىق لازېر (Omicron) غا ئۇلانغان 200 µm ئوپتىكىلىق ياماق سىمى (Doric) 200 µm ئوپتىكىلىق تالاغا ئۇلانغان. بۇنىڭدىن بۇرۇنلا سەكرەش كۈچىنى 20 مېگاۋاتقا تەڭشەڭ. كونتروللىغۇچنى ئىشلىتىپ ، ئېلېكترودنى ستېرېن تۇز سۈيى بىلەن تولغان كرانىئوتوم ئارقىلىق نىشان ئورۇنغا چۈشۈرۈڭ. خاتىرىلەشنىڭ بېشىدا ئون تومۇر 473 nm (چاستوتىسى 2 Hz ، تومۇرنىڭ ئۇزۇنلۇقى 10 ms) قويۇپ بېرىلدى. سەزگۈر ھۈجەيرىلەر% 70 ياكى ئۇنىڭدىنمۇ كۆپ سىناقلاردا 10 ms نۇر ئىچىدە تاياقچە ئىنكاس قايتۇرىدىغان ھۈجەيرە دەپ ئېنىقلىما بېرىلگەن.