ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่รองรับ CSS ได้จำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าจะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่ใช้รูปแบบและ JavaScript
แสดงสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน ใช้ปุ่ม Previous และ Next เพื่อเลื่อนดูสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน หรือใช้ปุ่ม Slider ที่ท้ายสไลด์เพื่อเลื่อนดูสไลด์ 3 สไลด์พร้อมกัน
ออร์แกเนลล์ของเซลล์ประสาทที่ประกอบตัวเองได้เป็นแพลตฟอร์มในหลอดทดลองที่มีแนวโน้มดีสำหรับการสร้างแบบจำลองการพัฒนาและโรคของมนุษย์ อย่างไรก็ตาม ออร์แกเนลล์ขาดการเชื่อมต่อที่มีอยู่ในร่างกาย ซึ่งจำกัดการเจริญเติบโตและป้องกันการรวมเข้ากับวงจรอื่นๆ ที่ควบคุมพฤติกรรม ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าออร์แกเนลล์คอร์เทกซ์ที่ได้มาจากเซลล์ต้นกำเนิดของมนุษย์ที่ปลูกถ่ายเข้าไปในคอร์เทกซ์รับความรู้สึกทางกายของหนูเปลือยแรกเกิดพัฒนาเซลล์ประเภทที่โตเต็มที่ซึ่งรวมเข้ากับวงจรรับความรู้สึกและแรงจูงใจ MRI เผยให้เห็นการเจริญเติบโตของออร์แกเนลล์หลังการปลูกถ่ายในสายเซลล์ต้นกำเนิดหลายสายและสัตว์ ในขณะที่การวิเคราะห์คอร์เดี่ยวเผยให้เห็นความก้าวหน้าของการสร้างคอร์เทกซ์และการเกิดขึ้นของโปรแกรมการถอดรหัสที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรม แท้จริงแล้ว เซลล์ประสาทคอร์เทกซ์ที่ปลูกถ่ายมีคุณสมบัติทางสัณฐานวิทยา ไซแนปส์ และเยื่อหุ้มภายในที่ซับซ้อนกว่าเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจจับข้อบกพร่องของเซลล์ประสาทในผู้ป่วยที่เป็นโรคทิโมธีได้ การติดตามทางกายวิภาคและการทำงานแสดงให้เห็นว่าออร์แกเนลล์ที่ปลูกถ่ายได้รับข้อมูลอินพุตจากทาลามิคอร์ติคัลและคอร์ติโคคอร์ติคัล และการบันทึกกิจกรรมของระบบประสาทในร่างกายแสดงให้เห็นว่าข้อมูลอินพุตเหล่านี้สามารถสร้างการตอบสนองทางประสาทสัมผัสในเซลล์ของมนุษย์ได้ ในที่สุด ออร์แกเนลล์ในคอร์ติคัลจะขยายแอกซอนไปทั่วสมองหนู และการกระตุ้นทางออปโตเจเนติกของแอกซอนจะนำไปสู่พฤติกรรมการแสวงหาผลตอบแทน ดังนั้น เซลล์ประสาทในคอร์เทกซ์ของมนุษย์ที่ปลูกถ่ายจึงเจริญเติบโตและมีส่วนร่วมในวงจรของโฮสต์ที่ควบคุมพฤติกรรม เราคาดว่าแนวทางนี้จะช่วยให้ตรวจจับฟีโนไทป์ระดับสายในเซลล์ที่ได้จากผู้ป่วยได้ ซึ่งไม่สามารถตรวจจับได้ด้วยวิธีการอื่น
สมองของมนุษย์ที่กำลังพัฒนานั้นเป็นกระบวนการจัดระเบียบตัวเองที่น่าทึ่ง ซึ่งเซลล์จะขยายพันธุ์ แบ่งแยก อพยพ และเชื่อมต่อกันเพื่อสร้างวงจรประสาทที่ทำงานได้ ซึ่งจะถูกปรับปรุงให้ดีขึ้นอีกผ่านประสบการณ์ทางประสาทสัมผัส ปัญหาสำคัญในการทำความเข้าใจพัฒนาการของสมองของมนุษย์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริบทของโรค คือ การขาดการเข้าถึงเนื้อเยื่อสมอง ออร์แกเนลล์ที่จัดระเบียบตัวเอง ซึ่งรวมถึงออร์แกเนลล์คอร์เทกซ์ของมนุษย์ (hCO; หรือเรียกอีกอย่างว่าทรงกลมคอร์เทกซ์ของมนุษย์) สามารถสร้าง 2,3,4,5,6 ได้ อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดหลายประการจำกัดการประยุกต์ใช้ในวงกว้างเพื่อทำความเข้าใจการพัฒนาและการทำงานของวงจรประสาท โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ยังไม่ชัดเจนว่าการทำให้ hCO สุกนั้นถูกจำกัดโดยการขาดอินพุตไมโครเอ็นไวรอนเมนทัลและประสาทสัมผัสบางอย่างในร่างกายหรือไม่ นอกจากนี้ เนื่องจาก hCO ไม่ได้รวมเข้ากับวงจรที่สามารถสร้างผลลัพธ์ทางพฤติกรรมได้ ประโยชน์ของ hCO ในการสร้างแบบจำลองความผิดปกติทางระบบประสาทและพฤติกรรมที่ซับซ้อนทางพันธุกรรมจึงจำกัดอยู่เพียงเท่านั้น
การปลูกถ่าย hCO3 เข้าไปในสมองที่ยังมีชีวิตที่สมบูรณ์สามารถเอาชนะข้อจำกัดเหล่านี้ได้ จากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าเซลล์ประสาทของมนุษย์ที่ปลูกถ่ายเข้าไปในคอร์เทกซ์ของสัตว์ฟันแทะสามารถอยู่รอด ฉายภาพ และสื่อสารกับเซลล์ของสัตว์ฟันแทะได้7,8,9,10,11,12 อย่างไรก็ตาม การทดลองเหล่านี้มักดำเนินการกับสัตว์ที่โตเต็มวัย ซึ่งอาจจำกัดการบูรณาการของไซแนปส์และแอกซอน ในที่นี้ เราจะอธิบายรูปแบบการปลูกถ่ายซึ่งเราได้ปลูกถ่าย 3D hCO3 ที่ได้จากเซลล์ hiPS เข้าไปในคอร์เทกซ์รับความรู้สึกทางกายหลัก (S1) ของหนูที่ขาดภูมิคุ้มกันในระยะเริ่มต้นของการพัฒนาพลาสติก เซลล์ประสาท hCO3 ที่ปลูกถ่าย (t-hCO) จะเติบโตเต็มที่ รับอินพุตจากทาลามิคอร์ติคัลและคอร์เทกซ์-คอร์เทกซ์ที่กระตุ้นการตอบสนองทางประสาทสัมผัส และขยายการฉายภาพของแอกซอนเข้าไปในสมองหนูเพื่อขับเคลื่อนพฤติกรรมการแสวงหาผลตอบแทน การเจริญเติบโตที่ขยายเวลาของ t-hCO เผยให้เห็นข้อบกพร่องของเซลล์ประสาทในผู้ป่วยที่มีกลุ่มอาการทิโมธี (TS) ซึ่งเป็นความผิดปกติทางพันธุกรรมที่ร้ายแรงที่เกิดจากการกลายพันธุ์ในช่องแคลเซียม CaV1.2 ชนิด L ที่ไวต่อแรงดันไฟฟ้า (เข้ารหัสโดย CACNA1C)
เพื่อศึกษาเซลล์ประสาทในเปลือกสมองของมนุษย์ในวงจรในร่างกาย เราได้ทำการปลูกถ่าย 3D hCO3 ที่ไม่บุบสลายลงใน S1 ของหนูที่เป็นโรคไทมัสในระยะหลังคลอด (วันที่ 3-7 หลังคลอด) ในลักษณะ stereotactical (รูปที่ 1a และข้อมูลเพิ่มเติมจากรูปที่ 1a-c) ณ จุดนี้ โปรเจกชันของแอกซอนในทาลามิคอร์ติคัลและคอร์ติโคคอร์ติคัลยังไม่เสร็จสมบูรณ์ในการสร้างเส้นประสาทที่ S1 (อ้างอิง 13) ดังนั้น แนวทางนี้จึงได้รับการออกแบบมาเพื่อเพิ่มการรวมตัวของ t-hCO สูงสุดในขณะที่ลดผลกระทบต่อวงจรภายในร่างกายให้เหลือน้อยที่สุด เพื่อแสดงภาพตำแหน่งของ t-hCO ในสัตว์มีชีวิต เราได้ทำการสร้างภาพสมองด้วย MRI แบบถ่วงน้ำหนัก T2 ของหนู 2-3 เดือนหลังจากการปลูกถ่าย (รูปที่ 1b และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1d) สามารถสังเกต t-hCO ได้อย่างง่ายดาย และการวัดปริมาตรของ t-hCO ก็คล้ายคลึงกับที่คำนวณจากชิ้นคงที่ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1d,e; P > 0.05) สามารถสังเกต t-hCO ได้อย่างง่ายดาย และการวัดปริมาตรของ t-hCO ก็คล้ายคลึงกับที่คำนวณจากชิ้นคงที่ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1d,e; P > 0.05) t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). สามารถสังเกต t-hCO ได้อย่างง่ายดาย และการวัด t-hCO แบบปริมาตรก็คล้ายคลึงกับการวัดที่คำนวณสำหรับส่วนคงที่ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1d, e; P > 0.05)很容易观察到t-hCO，并且t-hCO 的体积测量值与从固定切上计算的测量值相似（扩ส่วนขยาย数据上1d、e、P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). สามารถสังเกต t-hCO ได้อย่างง่ายดาย และการวัด t-hCO แบบปริมาตรก็คล้ายคลึงกับการวัดที่คำนวณสำหรับส่วนคงที่ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1d, e; P > 0.05)เราตรวจพบ t-hCO ในสัตว์ที่ได้รับการปลูกถ่าย 81% ประมาณ 2 เดือนหลังจากการปลูกถ่าย (n = 72 สัตว์; hCO จากเซลล์ hiPS 10 สายพันธุ์; เซลล์ hiPS ในตารางเสริม 1) ในจำนวนนี้ 87% อยู่ในเปลือกสมอง (รูปที่ 1c) จากการทำ MRI แบบต่อเนื่องที่จุดเวลาหลายจุดในหนูที่ปลูกถ่ายตัวเดียวกัน เราพบว่าปริมาตร t-hCO เพิ่มขึ้นเก้าเท่าภายใน 3 เดือน (รูปที่ 1d และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1f) สัตว์ที่ได้รับการปลูกถ่ายมีอัตราการรอดชีวิตสูง (74%) ที่ 12 เดือนหลังจากการปลูกถ่าย (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1g และตารางเสริม 2) และไม่พบความบกพร่องของการเคลื่อนไหวหรือความจำที่ชัดเจน กีโอซิส หรือคลื่นไฟฟ้าสมอง (EEG) ข้อมูล รูปที่ 1g และตารางเสริม 2) 1h–m และ 3e)
ก. แผนผังของการออกแบบการทดลอง hCO3 ที่ได้จากเซลล์ hiPS ถูกปลูกถ่ายเข้าไปใน S1 ของหนูเปลือยแรกเกิดในวันที่ 30-60 ของการแยกตัว ข. ภาพ MRI แบบมีน้ำหนัก T2 ในแนวระนาบและแนวโคโรนัลที่แสดง t-hCO3 ใน S1 2 เดือนหลังการปลูกถ่าย มาตราส่วน 2 มม. ค. การวัดปริมาณอัตราความสำเร็จในการฝังที่แสดงสำหรับเซลล์ hiPS แต่ละสายพันธุ์ (n = 108 ตัวเลขภายในมาตราส่วนระบุปริมาณ t-hCO ต่อเซลล์สายพันธุ์ hIPS) และตำแหน่งของคอร์เทกซ์หรือใต้คอร์เทกซ์ (n = 88) ง. ภาพ MRI ของหลอดเลือดหัวใจ (ซ้าย มาตราส่วน 3 มม.) และการสร้างภาพสามมิติเชิงปริมาตรที่สอดคล้องกัน (มาตราส่วน 3 มม.) แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของ t-hCO ในช่วงเวลา 3 เดือน จ. การทบทวนรูปแบบ t-hCO ในคอร์เทกซ์สมองของหนู มาตราส่วน 1 มม. f, ภาพตัวแทนของ t-hCO จากซ้ายบนไปขวา (ระหว่างการแยกตัว): PPP1R17 (อายุ 4 เดือน), NeuN (อายุ 8 เดือน), SOX9 และ GFAP (อายุ 8 เดือน), PDGFRα; (8 เดือน), MAP2 (8 เดือน) และ IBA1 (8 เดือน) มาตราส่วน 20 µm การแสดงออกร่วมกันของ HNA บ่งชี้เซลล์จากมนุษย์ g, snRNA-seq: การถ่ายภาพการลดมิติของท่อร่วมและการฉายภาพแบบรวม (UMAP) ของนิวเคลียส t-hCO คุณภาพสูงทั้งหมดหลังจากการรวมตัวของ Seurat (ตัวอย่าง t-hCO n=3, เซลล์สายพันธุ์ hiPS n=2) แอสโตรไซต์ เซลล์ของสายพันธุ์แอสโตรไซต์; ไซคโปรก เซลล์ต้นกำเนิดที่ไหลเวียน; GluN DL เซลล์ประสาทกลูตาเมตในระดับลึก; GluN DL/SP เซลล์ประสาทกลูตาเมตในระดับลึกและใต้แผ่นเยื่อบุผิว; GluN UL, เซลล์ประสาทชั้นบนที่ทำงานด้วยกลูตาเมต, เซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์, OPC, เซลล์ต้นกำเนิดโอลิโกเดนโดรไซต์, RELN, เซลล์ประสาทรีลิน h การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของคำศัพท์ Gene Ontology (GO) ของยีนที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P ที่ปรับแล้ว < 0.05, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว > 2, แสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO3 h การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของคำศัพท์ Gene Ontology (GO) ของยีนที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P ที่ปรับแล้ว < 0.05, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว > 2, แสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO3 h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность รูปภาพ > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими ไนโรบี hCO3 h การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของคำศัพท์ Gene Ontology (GO) สำหรับยีนที่มีการกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05 ที่ปรับแล้ว, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่า >2, การแสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO3 h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 , 变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 ของ 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней มี в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) วิเคราะห์ обогащения. h ยีนมีการแสดงออกมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P ที่ปรับแล้ว < 0.05, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว > 2, แสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO การวิเคราะห์เชิงออนโทโลยี (GO) ของเงื่อนไขการเสริมสมรรถนะเส้นประแสดงค่า aq ที่ 0.05 i การถ่ายภาพ UMAP ของเซลล์ GluN ใน t-hCO โดยใช้การถ่ายโอนฉลากจากชุดข้อมูลอ้างอิง 22 snRNA-seq ของคอร์เทกซ์มอเตอร์ของผู้ใหญ่ CT — เซลล์คอร์ติโคทาลามัส, ET — เซลล์นอกสมอง, IT — เซลล์โทรสมองภายใน, NP — โปรเจกชันระยะใกล้
จากนั้นเราจึงประเมินโครงสร้างเซลล์และองค์ประกอบโดยรวมของเซลล์ของ t-hCO การย้อมแอนติบอดีของเซลล์เยื่อบุผิวของหนูเผยให้เห็นการสร้างหลอดเลือดด้วย t-hCO ในขณะที่การย้อม IBA1 เผยให้เห็นการมีอยู่ของไมโครเกลียของหนูทั่วทั้งกราฟต์ (รูปที่ 1f และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 3c,d) การย้อมภูมิคุ้มกันเผยให้เห็นเซลล์ที่มีแอนติเจนนิวเคลียร์ของมนุษย์ (HNA) ในเชิงบวกซึ่งแสดงออกร่วมกันของ PPP1R17 (เซลล์ต้นกำเนิดของเปลือกสมอง) NeuN (เซลล์ประสาท) SOX9 และ GFAP (เซลล์ที่ได้จากเซลล์เกลีย) หรือ PDGFRα (เซลล์ต้นกำเนิดของโอลิโกเดนโดรไซต์) (รูปที่ 1f) เพื่อศึกษาองค์ประกอบเซลล์ของ t-hCO ในความละเอียดของเซลล์เดียว เราได้ดำเนินการจัดลำดับอาร์เอ็นเอคอร์เดียว (snRNA-seq) หลังจากการแยกตัวประมาณ 8 เดือน การกรองแบบเป็นกลุ่มและการกำจัดนิวเคลียสของหนูทำให้ได้แผนที่โมโนนิวเคลียร์ของมนุษย์ที่มีคุณภาพสูง 21,500 แผนที่ (รูปที่ 1g และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 4a,b) รูปแบบการแสดงออกของเครื่องหมายประเภทเซลล์ทั่วไประบุกลุ่มของเซลล์คอร์เทกซ์ประเภทหลัก ได้แก่ เซลล์ประสาทกลูตาเมตที่อยู่ลึกและผิวเผิน เซลล์ต้นกำเนิดที่ไหลเวียน เซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์ และกลุ่มเซลล์แอสโตรไซต์ (รูปที่ 1g ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 4c และตารางเสริม 3) การย้อมภูมิคุ้มกันสำหรับ SATB2 และ CTIP2 แสดงให้เห็นว่าแม้จะมีเซลล์คอร์เทกซ์ประเภทย่อยอยู่ t-hCO3 ก็ไม่แสดงการแบ่งชั้นทางกายวิภาคที่ชัดเจน (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 3a) การจับคู่ snRNA-seq hCO บนเวทีทำให้เกิดกลุ่มเซลล์ที่คล้ายคลึงกันในวงกว้าง โดยมีข้อยกเว้นบางประการ เช่น การไม่มีโอลิโกเดนโดรไซต์และการมีอยู่ของเซลล์ประสาท GABAergic ซึ่งอาจสะท้อนถึงสภาวะที่เอื้ออำนวยต่อเซลล์ต้นกำเนิดด้านข้างในหลอดทดลองที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้15 (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 4f – i และตารางเสริม 4) การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันเผยให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ประสาทกลูตาเมตระหว่าง t-hCO และ hCO (ตารางเสริม 5) รวมถึงการเปิดใช้งานชุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการทำให้เซลล์ประสาทสุก เช่น การส่งสัญญาณซินแนปส์ ตำแหน่งของเดนไดรต์ และกิจกรรมของช่องที่ควบคุมด้วยแรงดันไฟฟ้า (รูปที่ 1h และตารางเสริม 5) ตาราง 6) ดังนั้น เซลล์ประสาท t-hCO กลูตาเมตในเปลือกสมองจึงแสดงการทำให้การถอดรหัสสุกเร็วขึ้น
เพื่อชี้แจงว่าการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสใน t-hCO เหล่านี้เกี่ยวข้องกับความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาระหว่าง hCO ในหลอดทดลองและ t-hCO ในร่างกายหรือไม่ เราจึงสร้างเซลล์ hCO และ hCO ที่เต็มไปด้วยไบโอไซตินที่จับคู่กันในระยะที่ตัดตอนเฉียบพลันหลังจากการแบ่งเซลล์เป็นเวลา 7–8 เดือน (รูปที่ 2a) เซลล์ t-hCO มีขนาดใหญ่กว่าอย่างมีนัยสำคัญ มีเส้นผ่านศูนย์กลางของโซมา 1.5 เท่า มีเดนไดรต์มากกว่าสองเท่า และความยาวเดนไดรต์โดยรวมเพิ่มขึ้นหกเท่าเมื่อเทียบกับ hCO ในหลอดทดลอง (รูปที่ 2b) นอกจากนี้ เรายังสังเกตเห็นความหนาแน่นของเดนไดรต์ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ t-hCO เมื่อเทียบกับในเซลล์ hCO (รูปที่ 2c) ข้อมูลนี้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาท t-hCO3 จะมีการยืดออกและแตกแขนงอย่างกว้างขวาง ซึ่งเมื่อรวมกับการแพร่กระจายของเซลล์อย่างต่อเนื่อง อาจมีส่วนทำให้ t-hCO3 เติบโตอย่างเข้มข้นหลังการปลูกถ่าย (รูปที่ 1d และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 1f) ข้อมูลนี้กระตุ้นให้เราตรวจสอบคุณสมบัติทางไฟฟ้าเคมี ความจุของเยื่อหุ้มเซลล์สูงกว่าแปดเท่า (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 8d) ศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ในสภาวะพักตัวมีโพลาไรซ์มากขึ้น (ประมาณ 20 mV) และการฉีดกระแสไฟฟ้าทำให้มีอัตราการกระตุ้นสูงสุดที่สูงกว่าในเซลล์ประสาท t-hCO เมื่อเทียบกับในเซลล์ประสาท hCO (ในหลอดทดลอง (รูปที่ 2d) e) ซึ่งสอดคล้องกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ใหญ่กว่าและซับซ้อนกว่าของ t-hCO นอกจากนี้ ความถี่ของเหตุการณ์กระแสโพสต์ซินแนปส์ที่กระตุ้นโดยธรรมชาติ (EPSC) ยังสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในนิวรอน t-hCO3 (รูปที่ 2f) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าความหนาแน่นที่เพิ่มขึ้นของเดนไดรต์สไปน์ที่สังเกตได้ในนิวรอน t-hCO3 เกี่ยวข้องกับความสามารถในการกระตุ้นการทำงาน เราได้ยืนยันลักษณะที่ยังไม่โตเต็มที่ของนิวรอน hCO3 ในหลอดทดลองโดยการบันทึกนิวรอนกลูตาเมตที่ติดฉลาก (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 6a-c)
การสร้างภาพสามมิติของเซลล์ประสาท hCO และ t-hCO ที่เต็มไปด้วยไบโอไซตินหลังจากการแบ่งเซลล์เป็นเวลา 8 เดือน ข. การหาปริมาณลักษณะทางสัณฐานวิทยา (n = 8 เซลล์ประสาท hCO, n = 6 เซลล์ประสาท t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 และ ***P < 0.0001) ข. การหาปริมาณลักษณะทางสัณฐานวิทยา (n = 8 เซลล์ประสาท hCO, n = 6 เซลล์ประสาท t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 และ ***P < 0.0001) б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001) ข. การหาปริมาณลักษณะทางสัณฐานวิทยา (เซลล์ประสาท hCO n=8 เซลล์, เซลล์ประสาท t-hCO n=6 เซลล์; **P=0.0084, *P=0.0179 และ ***P<0.0001) b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元;**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元;**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001) ข. การหาปริมาณลักษณะทางสัณฐานวิทยา (เซลล์ประสาท hCO n=8 เซลล์, เซลล์ประสาท t-hCO n=6 เซลล์; **P=0.0084, *P=0.0179 และ ***P<0.0001)c การสร้างภาพ 3 มิติของกิ่งก้านเดนไดรต์ hCO และ t-hCO หลังจากการแบ่งเซลล์เป็นเวลา 8 เดือน เครื่องหมายดอกจันสีแดงแสดงถึงสไปน์เดนไดรต์ที่คาดว่าจะมีอยู่ การวัดปริมาณความหนาแน่นของสไปน์เดนไดรต์ (n = เซลล์ประสาท hCO 8 เซลล์, n = เซลล์ประสาท t-hCO 6 เซลล์; **P = 0.0092) d, การวัดปริมาณศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพัก (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) d, การวัดปริมาณศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพัก (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) d, การวัดปริมาณศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพัก (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元;***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元;***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) d, การวัดปริมาณศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพัก (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) e การยิงศักยภาพการทำงานซ้ำๆ ใน hCO และ t-hCO ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยการเพิ่มการฉีดกระแสไฟ และการหาปริมาณอัตราการยิงสูงสุด (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) e การยิงศักยภาพการทำงานซ้ำๆ ใน hCO และ t-hCO ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยการเพิ่มการฉีดกระแสไฟ และการหาปริมาณอัตราการยิงสูงสุด (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) e การยิงซ้ำศักยภาพการกระทำใน hCO และ t-hCO ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยการเพิ่มขึ้นในปัจจุบันและการวัดปริมาณอัตราการยิงสูงสุด (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; *** P < 0.0001) e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元;***P < 0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco 神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ; *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) e การยิงซ้ำๆ ของศักยะงานของ hCO และ t-hCO ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยการเพิ่มปริมาณกระแสไฟฟ้าและการวัดปริมาณอัตราการยิงสูงสุด (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 16 เซลล์ประสาท t-hCO; *** P < 0.0001) f, EPSC ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ (sEPSC) ในเซลล์ประสาท hCO และ t-hCO ในช่วง 8 เดือนของการแบ่งตัว และการวัดปริมาณความถี่ของเหตุการณ์ซินแนปส์ (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 17 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) f, EPSC ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ (sEPSC) ในเซลล์ประสาท hCO และ t-hCO ในช่วง 8 เดือนของการแบ่งตัว และการวัดปริมาณความถี่ของเหตุการณ์ซินแนปส์ (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 17 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P < 0.0001) f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ (sEPSC) ในเซลล์ประสาท hCO และ t-hCO ในช่วง 8 เดือนของการแบ่งตัวและการวัดปริมาณอัตราเหตุการณ์ซินแนปส์ (n=25 เซลล์ประสาท hCO, n=17 เซลล์ประสาท t-hCO; ***P<0.0001) f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 17 t-hCO 神经元;***P < 0.0001） f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25 hCO คาร์บอนไดออกไซด์ (n = 25hCO P < 0.0001) f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) f, EPSC ที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ (sEPSC) ในเซลล์ประสาท hCO และ t-hCO ในช่วง 8 เดือนของการแบ่งตัวและการวัดปริมาณอัตราเหตุการณ์ซินแนปส์ (n = 25 เซลล์ประสาท hCO, n = 17 เซลล์ประสาท t-hCO; *** P<0.0001)สำหรับ bf, hCO และ t-hCO ในสาย 1208-2 นำมาจากชุดการแยกความแตกต่างชุดเดียวกันที่รักษาไว้แบบคู่ขนาน g, การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของชุดยีน (การทดสอบ Fisher's exact แบบด้านเดียว) ของยีนที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P < 0.05 ที่ปรับแล้ว, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว > 2, แสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO3 โดยมีชุดยีนของทั้งยีนที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมการตอบสนองเร็ว (ERG) และตอบสนองช้า (LRG) ที่ระบุได้จากการศึกษาในหนูในร่างกาย16 และ LRG ที่จำเพาะต่อมนุษย์จากเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง17 g, การวิเคราะห์การเพิ่มความเข้มข้นของชุดยีน (การทดสอบ Fisher's exact แบบด้านเดียว) ของยีนที่มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P < 0.05 ที่ปรับแล้ว, การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว > 2, แสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาทกลูตาเมต t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ประสาทกลูตาเมต hCO3 โดยมีชุดยีนของทั้งยีนที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมการตอบสนองเร็ว (ERG) และตอบสนองช้า (LRG) ที่ระบุได้จากการศึกษาในหนูในร่างกาย16 และ LRG ที่จำเพาะต่อมนุษย์จากเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง17 g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий FIшера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO โป сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от การกระทำ, идентифицированных в исследовании на мышах ใน vivo16, และ специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, การวิเคราะห์การเพิ่มจำนวนของชุดยีน (การทดสอบ Fisher's exact แบบหางเดียว) ของยีนที่มีการกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P<0.05 ที่ปรับแล้ว, การเปลี่ยนแปลงของเท่า >2, การแสดงออกในนิวเคลียสอย่างน้อย 10%) ในเซลล์ประสาท glutamatergic t-hCO3 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเซลล์ประสาท glutamatergic hCO3 ของยีนที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมทั้งในระยะเริ่มต้น (ERG) และระยะหลัง (LRG) ที่ระบุได้ในหนู in vivo16 และ LRG ที่จำเพาะต่อมนุษย์จากเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง17 g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 ,倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和 神经元 神经元 17 中中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный) เทส ช่างภาพ) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах ใน vivo16 และ нейронах ใน vitro17 LRG, специфичные для человека. g เซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องกับกลูตาเมต t-hCO3 ถูกควบคุมขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องกับกลูตาเมต hCO3 (ค่า P<0.05 ที่ปรับแล้ว, การเปลี่ยนแปลง >2 เท่า, ยีนที่ขึ้นกับกิจกรรมการตอบสนองในระยะเริ่มต้น (ERG) และการตอบสนองในระยะหลังอย่างน้อย 10% (การทดสอบ Fisher's exact แบบหางเดียว) ระบุได้ในหนู in vivo16 และเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง17 LRG เฉพาะของมนุษย์เส้นประแสดงค่า P ที่แก้ไขโดย Bonferroni ที่ 0.05 h การแสดงออกของยีน GluN (แพ็คเกจหลอกและการปรับขนาดของแต่ละยีน) ถูกควบคุมขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในแบบจำลอง snRNA-seq ของยีน LRG ในเซลล์ประสาท glutamatergic t-hCO i การย้อมภูมิคุ้มกันแสดงการแสดงออกของ SCG2 ในเซลล์ประสาท t-hCO (ด้านบน) และ hCO (ด้านล่าง) ลูกศรสีขาวชี้ไปที่เซลล์ SCG2+ แถบมาตราส่วน 25 µm ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
จากกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของ t-hCO ที่สังเกตได้ในชิ้นเนื้อ ex vivo พบว่า snRNA-seq แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของยีนทรานสคริปต์ที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมใน t-hCO เมื่อเทียบกับ hCO ในหลอดทดลอง เซลล์ประสาท t-hCO ที่เกี่ยวข้องกับกลูตาเมตแสดงยีนที่ควบคุมกิจกรรมการตอบสนองล่าช้าในระดับที่สูงขึ้น (รูปที่ 2g,h) ซึ่งพบในการศึกษาก่อนหน้านี้ในเซลล์ประสาทของหนูและมนุษย์16,17 ตัวอย่างเช่น BDNF18, SCG2 และ OSTN ซึ่งเป็นยีนที่ควบคุมกิจกรรมเฉพาะไพรเมต แสดงให้เห็นการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ประสาท t-hCO เมื่อเทียบกับเซลล์ประสาท hCO (รูปที่ 2g-i) ดังนั้น เซลล์ประสาท t-hCO จึงแสดงลักษณะการเจริญเติบโตที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์ประสาท hCO โดยการวิเคราะห์การถอดรหัส สัณฐานวิทยา และการทำงาน
เพื่อประเมินความสัมพันธ์ระหว่างการเจริญเติบโตของ t-hCO3 กับพัฒนาการของสมองมนุษย์เพิ่มเติม เราได้ทำการเปรียบเทียบทรานสคริปโตมิกส์ของเซลล์คอร์เทกซ์ในทารกและผู้ใหญ่19,20 และผู้ใหญ่21,22 ตลอดจนข้อมูลที่ครอบคลุมเกี่ยวกับการแสดงออกของยีนคอร์เทกซ์23 ในระหว่างการพัฒนา (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 5) ) จากงานก่อนหน้านี้24 สถานะการเจริญเติบโตของทรานสคริปโตมของ hCO3 และ t-hCO3 โดยรวมในช่วง 7–8 เดือนของการแยกตัวนั้นสอดคล้องกันโดยกว้างๆ กับเวลาการพัฒนาในร่างกาย และเทียบเท่ากับช่วงปลายชีวิตของทารกในครรภ์มากที่สุด (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 5a) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราสังเกตเห็นการเจริญเติบโตของทรานสคริปโตมที่เพิ่มขึ้นใน t-hCO เมื่อเทียบกับ hCO3 ที่อายุเท่ากัน รวมถึงการเปิดใช้งานทรานสคริปโตมที่เกี่ยวข้องกับการสร้างไซแนปส์ การสร้างแอสโตรเจเนซิส และการสร้างไมอีลิน (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 5b-d) ในระดับเซลล์ เราพบหลักฐานของซับไทป์คอร์เทกซ์ที่บางกว่าใน t-hCO โดยมีกลุ่มนิวรอนกลูตาเมตซ้อนทับกับซับไทป์นิวรอน L2/3, L5 และ L6 ของผู้ใหญ่ (รูปที่ 1i) ในทางตรงกันข้าม การทับซ้อนของกลุ่มนิวรอน t-hCO กลูตาเมตและนิวรอนคอร์เทกซ์ของทารกในครรภ์นั้นมีจำกัดมากขึ้นในช่วงกลางการตั้งครรภ์ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 5e-j) เพื่อตรวจสอบว่านิวรอน t-hCO มีหน้าที่คล้ายคลึงกับนิวรอนนีโอคอร์เทกซ์หลังคลอดของมนุษย์หรือไม่ เราจึงได้ทำการบันทึกไฟฟ้าและการสร้างภาพทางกายวิภาคใหม่ของเซลล์ประสาทปิรามิด L2/3 ของมนุษย์ในส่วนที่แหลมคมของคอร์เทกซ์หลังคลอดของมนุษย์ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 7a) คุณสมบัติทางไฟฟ้าของนิวรอนปิรามิด L2/3 นั้นคล้ายคลึงกับคุณสมบัติของนิวรอนปิรามิด t-hCO (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 7e) เมื่อพิจารณาทางสัณฐานวิทยา เซลล์ประสาท L2/3 จากตัวอย่างมนุษย์หลังคลอดมีความคล้ายคลึงกับ t-hCO มากกว่า hCO ถึงแม้ว่าเซลล์ L2/3 จะยาวกว่า มีกิ่งก้านโดยรวมมากกว่า และมีความหนาแน่นของสันหลังมากกว่า (รูปที่ 3g และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 7b-) G)
ก. การปลูกถ่าย hCO ที่ผลิตโดยเซลล์ควบคุมและเซลล์ hiPS ของ TS เข้าไปในหนูแรกเกิด ข. การสร้างภาพ 3 มิติของเซลล์ประสาท t-hCO ที่เต็มไปด้วยไบโอไซตินหลังจากการแบ่งเซลล์เป็นเวลา 8 เดือน ค. การวัดปริมาณความยาวเดนไดรต์เฉลี่ย (n = 19 เซลล์ประสาทควบคุม, n = 21 เซลล์ประสาท TS; **P = 0.0041) d, กิ่งเดนไดรต์ที่สร้างขึ้นใหม่แบบ 3 มิติจากกลุ่มควบคุมและ TS t-hCO ที่เวลา 8 เดือนของการแยกความแตกต่าง และการวัดปริมาณความหนาแน่นของเดนไดรต์สไปน์ (n = 16 เซลล์ประสาทควบคุม, n = 21 เซลล์ประสาท TS, ***P < 0.0001) d, กิ่งเดนไดรต์ที่สร้างขึ้นใหม่แบบ 3 มิติจากกลุ่มควบคุมและ TS t-hCO ที่เวลา 8 เดือนของการแยกความแตกต่าง และการวัดปริมาณความหนาแน่นของเดนไดรต์สไปน์ (n = 16 เซลล์ประสาทควบคุม, n = 21 เซลล์ประสาท TS, ***P < 0.0001) d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001) ง. การสร้างภาพสามมิติของกิ่งก้านเดนไดรต์จากเซลล์ควบคุมและ t-hCO TS ที่เวลา 8 เดือนของการแยกตัวและการวัดปริมาณความหนาแน่นของเดนไดรต์สไปน์ (n=16 เซลล์ประสาทควบคุม, n=21 เซลล์ประสาท TS, ***P<0.0001) D， 分化 8 个月时对照和 t-hco 的 3d 重建树突分支， 以及树突棘密度的量化（ n = 16 个对照神经元， n = 21 ที่ TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经 元, n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001) ง. การสร้างภาพสามมิติของกิ่งเดนไดรต์ควบคุมและ TS t-hCO ที่ 8 เดือนของการแยกความแตกต่างและการวัดปริมาณความหนาแน่นของเดนไดรต์สไปน์ (n=16 เซลล์ประสาทควบคุม, n=21 เซลล์ประสาท TS, ***P<0.0001)เครื่องหมายดอกจันสีแดงแสดงถึงเดนไดรต์สไปน์ที่คาดว่าจะเป็น e, EPSC ที่เกิดขึ้นเองในเซลล์ประสาท t-hCO ของ TS และ TS หลังจากการแยกตัวเป็นเวลา 8 เดือน f, กราฟความถี่สะสมและการวัดปริมาณความถี่และแอมพลิจูดของเหตุการณ์ซินแนปส์ (n=32 เซลล์ประสาทควบคุม, n=26 เซลล์ประสาท TS; **P=0.0076 และ P=0.8102) g, การวิเคราะห์ Scholl ของ TS และเซลล์ประสาทควบคุมใน hCO และ t-hCO เส้นประแสดงเซลล์ประสาทพีระมิดหลังคลอด L2/3 ของมนุษย์เพื่อการเปรียบเทียบ (n = 24 เซลล์ประสาท t-hCO ควบคุม, n = 21 เซลล์ประสาท TS t-hCO, n = 8 เซลล์ประสาท hCO ควบคุม และ n = 7 เซลล์ประสาท TS hCO) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ความสามารถของ t-hCO ในการจำลองลักษณะทางสัณฐานวิทยาและการทำงานของเซลล์ประสาทคอร์เทกซ์ของมนุษย์ในระดับสูงกระตุ้นให้เราสำรวจว่า t-hCO สามารถใช้ตรวจจับลักษณะทางฟีโนไทป์ของโรคได้หรือไม่ เราเน้นที่ TS ซึ่งเป็นความผิดปกติทางพัฒนาการทางระบบประสาทที่รุนแรงซึ่งเกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนที่เข้ารหัส CaV1.2 ที่ทำให้การถอดรหัสยีนขึ้นอยู่กับกิจกรรมในเซลล์ประสาท เราได้รับ hCO จากผู้ป่วย TS 3 รายที่มีการแทนที่ที่พบได้บ่อยที่สุด (p.G406R) และกลุ่มควบคุม 3 ราย (รูปที่ 3a) หลังจากการปลูกถ่าย เราพบว่าสัณฐานวิทยาของเดนไดรต์เปลี่ยนแปลงไปในเซลล์ประสาท TS เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3b และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 8a,b) โดยมีจำนวนเดนไดรต์หลักเพิ่มขึ้นสองเท่าและความยาวเดนไดรต์โดยรวมเพิ่มขึ้นโดยเฉลี่ยและลดลงโดยรวม (รูปที่ 3c และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 8c) สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับความหนาแน่นของสไปน์ที่เพิ่มขึ้นและความถี่ที่เพิ่มขึ้นของ EPSC ที่เกิดขึ้นเองใน TS เมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทควบคุม (รูปที่ 3d–f และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 8g) การวิเคราะห์เพิ่มเติมเผยให้เห็นรูปแบบของการแตกแขนงของเดนไดรต์ที่ผิดปกติใน TS ของ t-hCO เมื่อเทียบกับเซลล์ประสาทควบคุม แต่ไม่ปรากฏใน TS hCO ในหลอดทดลองในระยะการแยกตัวที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 3g) ซึ่งสอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ของเราเกี่ยวกับการหดตัวของเดนไดรต์ที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมใน TS และเน้นย้ำถึงความสามารถของแพลตฟอร์มการปลูกถ่ายนี้ในการตรวจจับลักษณะทางฟีโนไทป์ของโรคในร่างกาย
จากนั้นเราถามว่าเซลล์ t-hCO ผสานการทำงานเข้ากับ S1 ของหนูในระดับใด S1 ในสัตว์ฟันแทะได้รับอินพุตซินแนปส์ที่แข็งแกร่งจากนิวเคลียสทาลามัสด้านท้องและด้านหลังแบบ ipsilateral ตลอดจนคอร์เทกซ์มอเตอร์และโซมาโตเซนเซอรีรองแบบ ipsilateral และ S1 ด้านตรงข้าม (รูปที่ 4a) เพื่อฟื้นฟูรูปแบบการส่งสัญญาณประสาท เราจึงติดเชื้อ hCO ด้วยไวรัสเรบีส์-dG-GFP/AAV-G และปลูกถ่าย hCO เข้าไปในหนู S1 3 วันต่อมา เราสังเกตเห็นการแสดงออกของ GFP อย่างหนาแน่นในเซลล์ประสาทของ S1 ด้านท้องและปมประสาทด้านท้อง 7–14 วันหลังการปลูกถ่าย (รูปที่ 4b, c) นอกจากนี้ การย้อมแอนติบอดีของเครื่องหมายทาลามัส netrin G1 เผยให้เห็นการมีอยู่ของปลายทาลามัสใน t-hCO (รูปที่ 4d, e) เพื่อประเมินว่าการฉายภาพเหล่านี้สามารถกระตุ้นการตอบสนองแบบซินแนปส์ในเซลล์ t-hCO ได้หรือไม่ เราได้บันทึกเซลล์ทั้งหมดจากเซลล์มนุษย์ในส่วนที่แหลมคมของชั้นทาลามิคอร์ติคัล การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของ S1 ของหนู แคปซูลภายใน สารสีขาว เส้นใยใกล้กับ t-hCO หรือการกระตุ้นทางออปโตเจเนติกของปลายทาลามิคที่แสดงออกถึงออปซินใน EPSC แฝงสั้นที่เหนี่ยวนำโดย t-hCO ในเซลล์ประสาท t-hCO ที่สัมผัสกับ NBQX ซึ่งเป็นตัวต่อต้านตัวรับ AMPA (รูปที่ 4f, g และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 9a–g) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า t-hCO ถูกผสานเข้ากับสมองหนูในทางกายวิภาคและสามารถถูกกระตุ้นได้โดยเนื้อเยื่อของหนู
ก. แผนผังของการทดลองติดตามโรคพิษสุนัขบ้า ข. การแสดงออกของ GFP และ STEM121 เฉพาะของมนุษย์ระหว่าง t-hCO และเปลือกสมองของหนู (แผงบน) นอกจากนี้ ยังแสดงการแสดงออกของ GFP ในนิวเคลียสฐานด้านท้อง (VB) ของหนู (ซ้ายล่าง) และ S1 ด้านเดียวกัน (ขวาล่าง) แถบมาตราส่วน 50 µm สี่เหลี่ยมสีแดงแสดงพื้นที่ของสมองที่ถ่ายภาพ ค. การวัดปริมาณเซลล์ที่แสดง GFP (n = 4 หนู) ง. e — ปลายธาลามัสของ Netrin G1+ ใน t-hCO ง. แสดงส่วนโคโรนัลที่มีนิวเคลียส t-hCO และ VB แถบมาตราส่วน 2 มม. e แสดงการแสดงออกของ Netrin G1 และ STEM121 ในนิวรอน t-hCO (ซ้าย) และ VB (ขวา) แถบมาตราส่วน 50 µm เส้นประสีส้มแสดงขอบเขตของ t-hCO f, g, ร่องรอยปัจจุบันของนิวรอน t-hCO หลังจากการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าในหนู S1 (f) หรือแคปซูลภายใน (g) ที่มี (สีม่วง) หรือไม่มี (สีดำ) NBQX (ซ้าย) แอมพลิจูดของ EPSC ที่มีและไม่มี NBQX (n = 6 นิวรอน S1, *P = 0.0119; และ n = 6 นิวรอนแคปซูลภายใน, **P = 0.0022) (ตรงกลาง) เปอร์เซ็นต์ของนิวรอน t-hCO ที่แสดง EPSC ในการตอบสนองต่อการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของหนู S1 (f) หรือแคปซูลภายใน (g) (ขวา) aCSF น้ำไขสันหลังเทียม h แผนผังของการทดลองสร้างภาพ 2P (ซ้าย) การแสดงออกของ GCaMP6 ใน t-hCO (กลาง) แถบมาตราส่วน 100 µm ไทม์แลปส์การเรืองแสงของ GCaMP6 (ขวา) i, คะแนน Z ของการเรืองแสงของกิจกรรมที่เกิดขึ้นเอง j, ภาพประกอบแผนผังของการกระตุ้นหนวด k, เส้นทางการเรืองแสง 2P ที่มีคะแนน z ในการทดลองหนึ่งครั้ง ซึ่งจัดตำแหน่งให้ตรงกับการเบี่ยงเบนของหนวดในเวลาศูนย์ (เส้นประ) ในเซลล์ตัวอย่าง l, การตอบสนองคะแนน z เฉลี่ยของประชากรของเซลล์ทั้งหมดที่จัดตำแหน่งให้ตรงกับการเบี่ยงเบนของหนวดในเวลาศูนย์ (เส้นประ) (สีแดง) หรือไทม์สแตมป์ที่สร้างแบบสุ่ม (สีเทา) m. แผนผังของการทดลองเกี่ยวกับการทำเครื่องหมายด้วยแสง n, เส้นโค้งแรงดันไฟฟ้าดิบจากเซลล์ t-hCO ตัวอย่างในระหว่างการกระตุ้นด้วยเลเซอร์สีน้ำเงินหรือการเบี่ยงเบนของหนวด ลูกศรสีแดงแสดงถึงการพุ่งครั้งแรกที่เกิดจากแสง (ด้านบน) หรือเกิดจากการเบี่ยงเบนของหนวด (ด้านล่าง) การแรเงาสีเทาแสดงถึงช่วงเวลาของการเบี่ยงเบนของหนวด o, รูปคลื่นแสงสูงสุดและการตอบสนองต่อการเบี่ยงเบนของหนวด p, การพุ่งของความพยายามครั้งเดียว ซึ่งจัดตำแหน่งให้ตรงกับการเบี่ยงเบนของหนวดในเซลล์ของตัวอย่าง 0 หมายถึงค่าเบี่ยงเบนของหนวด (เส้นประ) q คืออัตราการยิงคะแนน z เฉลี่ยของประชากรสำหรับเซลล์ไวต่อแสงทั้งหมด ซึ่งจัดตำแหน่งตามค่าเบี่ยงเบนของหนวดที่เวลาศูนย์ (เส้นประ) (สีแดง) หรือค่าประทับเวลาที่สร้างแบบสุ่ม (สีเทา) r คือสัดส่วนของหน่วยไวต่อแสงที่ปรับเปลี่ยนอย่างมีนัยสำคัญโดยค่าเบี่ยงเบนของหนวด (n = 3 หนู) (ซ้าย) ค่าแฝงของคะแนน z สูงสุด (n = 3 หนู; n = 5 (เขียวอ่อน), n = 4 (เขียวเข้ม) และ n = 4 (น้ำเงินอมเขียว) หน่วยปรับเปลี่ยนการเบี่ยงเบนของหนวดต่อหนู) (ขวา) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
จากนั้นเราถามว่าสามารถกระตุ้น t-hCO ได้หรือไม่โดยการกระตุ้นทางประสาทสัมผัสในร่างกาย เราปลูกถ่าย hCO ที่แสดงตัวบ่งชี้แคลเซียมที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม GCaMP6 เข้าไปในหนู S1 หลังจากผ่านไป 150 วัน เราได้ทำการโฟโตเมทรีด้วยไฟเบอร์หรือการถ่ายภาพแคลเซียมด้วยโฟตอนสองตัว (รูปที่ 4h และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10a) เราพบว่าเซลล์ t-hCO แสดงกิจกรรมจังหวะที่ซิงโครไนซ์กัน (รูปที่ 4i ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10b และวิดีโอเสริม 1) เพื่อระบุลักษณะกิจกรรมสูงสุดของ t-hCO เราได้ทำการบันทึกไฟฟ้าเคมีนอกเซลล์ในหนูที่ได้รับการวางยาสลบ (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10c-f) เราได้สร้างพิกัดสเตอริโอแท็กซิกจากภาพ MRI ดังนั้น หน่วยที่บันทึกเหล่านี้จึงแสดงถึงเซลล์ประสาทของมนุษย์ที่คาดว่าจะเป็นเซลล์ประสาท แม้ว่าไฟฟ้าเคมีเพียงอย่างเดียวจะไม่สามารถระบุสายพันธุ์ต้นกำเนิดได้ เราสังเกตเห็นกิจกรรมที่ซิงโครไนซ์กัน (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10d) การระเบิดกินเวลานานประมาณ 460 มิลลิวินาที และมีช่วงความเงียบห่างกันประมาณ 2 วินาที (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10d, e) หน่วยแต่ละหน่วยยิงเฉลี่ยประมาณสามนัดต่อการระเบิด ซึ่งคิดเป็นประมาณ 73% ของหน่วยที่ลงทะเบียนต่อการระเบิด กิจกรรมของหน่วยแต่ละหน่วยมีความสัมพันธ์กันอย่างมาก และความสัมพันธ์เหล่านี้สูงกว่าหน่วยที่ระบุในสัตว์ที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนซึ่งบันทึกไว้ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10f) เพื่อระบุลักษณะการตอบสนองของสไปก์ของเซลล์ประสาทที่มาจากมนุษย์ที่ระบุเพิ่มเติม เราได้ทำการทดลองการติดแท็กแสงกับหนูที่ได้รับยาสลบซึ่งได้รับการปลูกถ่าย hCO3 ซึ่งแสดงช่องไอออนที่ไวต่อแสงที่เรียกว่าโรดอปซิน 2 (hChR2) ซึ่งทำให้เซลล์ประสาท t-hCO3 สามารถจดจำการแฝงระยะสั้น (น้อยกว่า 10 มิลลิวินาที) เมื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าที่เป็นแสงสีน้ำเงิน (รูปที่ 4m–o) เซลล์ประสาท t-hCO แสดงกิจกรรมที่เกิดขึ้นเองอย่างรวดเร็วในความถี่ที่คล้ายกับที่สังเกตได้ในภาพแคลเซียม เช่นเดียวกับการบันทึกไฟฟ้าเคมีที่ดำเนินการใน t-hCO โดยไม่มีเครื่องหมายแสง (ข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10c-g) ไม่พบกิจกรรมที่เกิดขึ้นเองในระยะที่สอดคล้องกันของ hCO ที่บันทึกในหลอดทดลอง เพื่อประเมินว่า t-hCO สามารถถูกกระตุ้นโดยสิ่งเร้าทางประสาทสัมผัสได้หรือไม่ เราจึงเบี่ยงเบนหนวดของหนูออกจาก t-hCO ชั่วครู่ (รูปที่ 4j,m และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10h,k) ตามการศึกษาก่อนหน้านี้8,10 เซลล์ t-hCO กลุ่มย่อยแสดงกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นในการตอบสนองต่อการเบี่ยงเบนหนวด ซึ่งไม่สังเกตเห็นเมื่อเปรียบเทียบข้อมูลกับแสตมป์เวลาแบบสุ่ม (รูปที่ 4k–q และข้อมูลเพิ่มเติม รูปที่ 10h–q) อันที่จริงแล้ว ประมาณ 54% ของหน่วยเดี่ยวที่ติดฉลากด้วยออปโตแสดงให้เห็นอัตราการตื่นตัวที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการกระตุ้นหนวดเครา โดยสูงสุดที่ประมาณ 650 มิลลิวินาที (รูปที่ 4r) เมื่อนำข้อมูลทั้งหมดเหล่านี้มารวมกัน แสดงให้เห็นว่า t-hCO ได้รับอินพุตการทำงานที่เหมาะสมและสามารถเปิดใช้งานได้โดยการกระตุ้นจากสิ่งแวดล้อม
จากนั้น เราจึงศึกษาว่า t-hCO สามารถกระตุ้นวงจรในหนูเพื่อควบคุมพฤติกรรมได้หรือไม่ ขั้นแรก เราศึกษาว่าแอกซอนของเซลล์ประสาท t-hCO ฉายเข้าไปในเนื้อเยื่อโดยรอบของหนูหรือไม่ เราติดเชื้อ hCO ด้วยเลนติไวรัสที่เข้ารหัส hChR2 ที่หลอมรวมกับ EYFP (hChR2-EYFP) หลังจาก 110 วัน เราสังเกตการแสดงออกของ EYFP ในบริเวณคอร์เทกซ์ข้างเดียวกัน รวมถึงคอร์เทกซ์การได้ยิน คอร์เทกซ์สั่งการ และคอร์เทกซ์รับความรู้สึกทางกาย รวมถึงในบริเวณใต้คอร์เทกซ์ เช่น สไตรเอตัม ฮิปโปแคมปัส และทาลามัส (รูปที่ 5a) เพื่อประเมินว่าการฉายภาพออกเหล่านี้สามารถกระตุ้นการตอบสนองแบบซินแนปส์ในเซลล์หนูได้หรือไม่ เราจึงกระตุ้นเซลล์ t-hCO ที่แสดงออก hChR2-EYFP ด้วยแสงโดยการบันทึกเซลล์คอร์เทกซ์สมองของหนูในส่วนที่แหลมคมของสมอง การกระตุ้นแอกซอน t-hCO ด้วยแสงสีน้ำเงินทำให้เกิด EPSC แฝงสั้นในนิวรอนคอร์เทกซ์พีระมิดของหนู ซึ่งถูกบล็อกโดย NBQX (รูปที่ 5b–g) นอกจากนี้ การตอบสนองเหล่านี้อาจถูกบล็อกโดยเทโทรโดทอกซิน (TTX) และฟื้นฟูโดย 4-อะมิโนไพริดีน (4-AP) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการตอบสนองเหล่านี้เกิดจากการเชื่อมต่อแบบโมโนซินแนปส์ (รูปที่ 5e)
ก. แผนผังของการติดตามแอกซอน (ซ้าย) การแสดงออกของ t-hCO EYFP (ขวา) มาตราส่วน 100 µm A1, คอร์เทกซ์การได้ยิน, ACC, คอร์เทกซ์ cingulate ด้านหน้า, d. สไตรเอตัม, สไตรเอตัมด้านหลัง, HPC, ฮิปโปแคมปัส; กะบังลม, เซปตัมด้านข้าง, mPFC, คอร์เทกซ์พรีฟรอนทัลด้านใน, พีริ, คอร์เทกซ์พีริฟอร์ม, วี. สไตรเอตัม, สไตรเอตัมด้านท้อง, VPM, นิวเคลียสเวนโทรโพสโตมีเดียลของทาลามัส, VTA, ภูมิภาคเทกเมนทัลด้านท้อง สี่เหลี่ยมสีแดงแสดงถึงบริเวณของสมองที่ถ่ายภาพ ข. แผนผังของการทดลองกระตุ้น ค. ง. ตัวอย่างการตอบสนองของโฟโตเคอร์เรนต์ที่เหนี่ยวนำด้วยแสงสีน้ำเงิน (ด้านบน) และแรงดันไฟฟ้า (ด้านล่าง) ในเซลล์ EYFP+ t-hCO ของมนุษย์ (ค.) หรือหนู (ง.) EYFP e, f, ร่องรอยปัจจุบันของเซลล์ประสาทของหนูหลังจากการกระตุ้นด้วยแสงสีน้ำเงินของแอกซอน t-hCO ด้วย TTX และ 4-AR (สีเขียว), TTX (สีเทา) หรือ aCSF (สีดำ) (e), โดยมี (สีม่วง) หรือไม่มี (สีดำ) ) ) NBQX (e) g, ความแฝงของการตอบสนองที่เหนี่ยวนำโดยแสงสีน้ำเงินในเซลล์ของหนู (n = 16 เซลล์) แถบแนวนอนระบุความแฝงเฉลี่ย (7.13 มิลลิวินาที) (ซ้าย) แอมพลิจูดของ EPSC ที่ได้รับแสงที่บันทึกโดยมีหรือไม่มี NBQX (n = 7 เซลล์; ***P < 0.0001) (ตรงกลาง) แอมพลิจูดของ EPSC ที่ได้รับแสงที่บันทึกโดยมีหรือไม่มี NBQX (n = 7 เซลล์; ***P < 0.0001) (ตรงกลาง) Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). แอมพลิจูดของ EPSC ที่เกิดจากแสงที่บันทึกโดยมีหรือไม่มี NBQX (n = 7 เซลล์; ***P < 0.0001) (ตรงกลาง)使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞;***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞;***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). แอมพลิจูดของ EPSC ที่เกิดจากแสงที่บันทึกโดยมีหรือไม่มี NBQX (n = 7 เซลล์; ***P < 0.0001) (ตรงกลาง)เปอร์เซ็นต์ของเซลล์หนูที่แสดง EPSC ที่ตอบสนองต่อแสงสีน้ำเงิน (ขวา) h แผนผังของงานพฤติกรรม d0 วันที่ 0 i ประสิทธิภาพของสัตว์ตัวอย่างในวันที่ 1 (ซ้าย) หรือวันที่ 15 (ขวา) ของการฝึกอบรม จำนวนเฉลี่ยของการเลียที่ดำเนินการในวันที่ 1 (ซ้าย) หรือวันที่ 15 (กลางขวา) (n = การทดลองไฟสีน้ำเงิน 150 ครั้ง, n = การทดลองไฟสีแดง 150 ครั้ง; ***P < 0.0001) จำนวนเฉลี่ยของการเลียที่ดำเนินการในวันที่ 1 (ซ้าย) หรือวันที่ 15 (กลางขวา) (n = การทดลองไฟสีน้ำเงิน 150 ครั้ง, n = การทดลองไฟสีแดง 150 ครั้ง; ***P < 0.0001) Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001) จำนวนเฉลี่ยของการเลียที่ดำเนินการในวันที่ 1 (ซ้าย) หรือวันที่ 15 (กลางขวา) (n = การทดลองไฟสีน้ำเงิน 150 ครั้ง, n = การทดลองไฟสีแดง 150 ครั้ง; ***P < 0.0001)第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 次红光试验;***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 次红光试验;***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001) จำนวนเฉลี่ยของการเลียที่ดำเนินการในวันที่ 1 (ซ้าย) หรือวันที่ 15 (กลางขวา) (n = การทดลองไฟสีน้ำเงิน 150 ครั้ง, n = การทดลองไฟสีแดง 150 ครั้ง; ***P < 0.0001)จำนวนเลียสะสมสำหรับการทดลองแสงสีแดงและสีน้ำเงินในวันที่ 1 (ตรงกลางซ้าย) หรือวันที่ 15 (ขวา) NS ไม่สำคัญ j,k ลักษณะทางพฤติกรรมของสัตว์ทั้งหมดที่ได้รับการปลูกถ่ายด้วย t-hCO ที่แสดง hChR2-EYFP (j) หรือฟลูออโรโฟร์ควบคุม (k) ในวันที่ 1 หรือ 15 (hChR2-EYFP: n = 9 หนู ** P = 0.0049; หนูควบคุม: n = 9, P = 0.1497) l, วิวัฒนาการของคะแนนการตั้งค่า (n = 9 hChR2, n = 9 ควบคุม; **P < 0.001, ***P < 0.0001) l, วิวัฒนาการของคะแนนการตั้งค่า (n = 9 hChR2, n = 9 ควบคุม; **P < 0.001, ***P < 0.0001) l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001) l, วิวัฒนาการของคะแนนการตั้งค่า (n = 9 hChR2, n = 9 ตัวควบคุม; **P < 0.001, ***P < 0.0001) l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 รูปภาพ;**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 รูปภาพ;**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001) l, วิวัฒนาการของคะแนนการตั้งค่า (n = 9 hChR2, n = 9 ตัวควบคุม; **P < 0.001, ***P < 0.0001)m, การแสดงออกของ FOS ในการตอบสนองต่อการกระตุ้นทางออปโตเจเนติกของ t-hCO ใน S1 แสดงภาพการแสดงออกของ FOS (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (n = 3 ต่อกลุ่ม; *P < 0.05, **P < 0.01 และ ***P < 0.001) (ขวา) แสดงภาพการแสดงออกของ FOS (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (n = 3 ต่อกลุ่ม; *P < 0.05, **P < 0.01 และ ***P < 0.001) (ขวา) POказаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (สปราวา). แสดงภาพการแสดงออกของ FOS (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (n = 3 ต่อกลุ่ม; *P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001) (ขวา)显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3;*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）รูปภาพ。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3;*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）รูปภาพ。 POказаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (สปราวา). แสดงภาพการแสดงออกของ FOS (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (n = 3 ต่อกลุ่ม; *P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001) (ขวา)มาตราส่วน 100 µm ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ข้อผิดพลาดมาตรฐานของ BLA, ทอนซิลข้างฐาน, MDT, นิวเคลียสทาลามัสที่อยู่หลังส่วนกลาง, PAG, เกรย์เพเรียควีดักทัล
ในที่สุด เราถามว่า t-hCO สามารถปรับเปลี่ยนพฤติกรรมของหนูได้หรือไม่ เพื่อทดสอบสิ่งนี้ เราจึงปลูกถ่าย hCO ที่แสดง hChR2-EYFP ลงใน S1 และ 90 วันต่อมา เราจึงปลูกถ่ายเส้นใยแก้วนำแสงลงใน t-hCO เพื่อส่งแสง จากนั้น เราจึงฝึกหนูด้วยกรอบแนวคิดการปรับพฤติกรรมที่ดัดแปลง (รูปที่ 5 ชม.) เราวางสัตว์ไว้ในห้องทดสอบพฤติกรรม และฉายแสงเลเซอร์สีน้ำเงิน (473 นาโนเมตร) และสีแดง (635 นาโนเมตร) แบบสุ่มเป็นเวลา 5 วินาที สัตว์จะได้รับรางวัลเป็นน้ำหากเลียในระหว่างการกระตุ้นด้วยแสงสีน้ำเงิน แต่ไม่ได้เลียในระหว่างการกระตุ้นด้วยแสงสีแดง ในวันที่แรกของการฝึก สัตว์ไม่แสดงความแตกต่างในการเลียเมื่อได้รับการกระตุ้นด้วยแสงสีน้ำเงินหรือแสงสีแดง อย่างไรก็ตาม ในวันที่ 15 สัตว์ที่ได้รับการปลูกถ่าย hCO ที่แสดง hChR2-EYFP แสดงให้เห็นการเลียที่กระตือรือร้นมากขึ้นเมื่อได้รับการกระตุ้นด้วยแสงสีน้ำเงินเมื่อเทียบกับการกระตุ้นด้วยแสงสีแดง การเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมการเลียเหล่านี้ไม่ได้สังเกตพบในสัตว์ควบคุมที่ได้รับการปลูกถ่าย hCO3 ที่แสดงฟลูออโรโฟร์ควบคุม (อัตราความสำเร็จในการเรียนรู้: hChR2 89%, EYFP 0%, รูปที่ 5i-1 และวิดีโอเสริม 2) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าเซลล์ t-hCO3 สามารถกระตุ้นเซลล์ประสาทของหนูเพื่อกระตุ้นพฤติกรรมการแสวงหาผลตอบแทน เพื่อค้นหาว่าวงจรประสาท t-hCO3 ของหนูตัวใดที่อาจเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมเหล่านี้ เราจึงกระตุ้น t-hCO3 ด้วยออปโตเจเนติกในสัตว์ที่ได้รับการฝึกและเก็บเนื้อเยื่อ 90 นาทีต่อมา อิมมูโนฮิสโตเคมีเผยให้เห็นการแสดงออกของโปรตีน FOS ที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมในบริเวณสมองหลายแห่งที่เกี่ยวข้องกับพฤติกรรมที่มีแรงจูงใจ รวมถึงคอร์เทกซ์พรีฟรอนทัลส่วนกลาง ทาลามัสส่วนกลาง และเนื้อเทาเพอริอาควีดักทัล ซึ่งแสดงออกในสัตว์ควบคุมที่ไม่ได้รับการกระตุ้นหรือในสัตว์ (ข้าว 5 นาที) เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า t-hCO3 สามารถปรับเปลี่ยนกิจกรรมของเซลล์ประสาทของหนูเพื่อขับเคลื่อนพฤติกรรมได้
ออร์แกนอยด์ของระบบประสาทเป็นระบบที่มีแนวโน้มดีในการศึกษาพัฒนาการและโรคของมนุษย์ในหลอดทดลอง แต่ออร์แกนอยด์เหล่านี้มีข้อจำกัดเนื่องจากไม่มีการเชื่อมต่อระหว่างวงจรต่างๆ ที่มีอยู่ในร่างกาย เราได้พัฒนาแพลตฟอร์มใหม่ซึ่งเราได้ปลูกถ่าย hCO3 เข้าไปใน S1 ของหนูหลังคลอดที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง เพื่อศึกษาพัฒนาการและการทำงานของเซลล์มนุษย์ในร่างกาย เราได้แสดงให้เห็นว่า t-hCO3 พัฒนาเซลล์ประเภทโตเต็มที่ซึ่งไม่พบในหลอดทดลอง28 และ t-hCO3 ถูกผสานเข้ากับสมองของสัตว์ฟันแทะทั้งทางกายวิภาคและการทำงาน การผสาน t-hCO3 เข้ากับวงจรประสาทของสัตว์ฟันแทะทำให้เราสามารถสร้างความเชื่อมโยงระหว่างกิจกรรมของเซลล์มนุษย์และพฤติกรรมของสัตว์ที่ศึกษาได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาท t-hCO3 สามารถปรับเปลี่ยนกิจกรรมของเซลล์ประสาทของหนูเพื่อขับเคลื่อนการตอบสนองทางพฤติกรรมได้
แพลตฟอร์มที่เราอธิบายนี้มีข้อดีหลายประการเมื่อเทียบกับงานวิจัยก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการปลูกถ่ายเซลล์ของมนุษย์เข้าไปในสมองของสัตว์ฟันแทะ ประการแรก เราปลูกถ่าย hCO3 เข้าไปในคอร์เทกซ์ที่กำลังพัฒนาของหนูหลังคลอดในระยะแรก ซึ่งอาจช่วยอำนวยความสะดวกในการบูรณาการทางกายวิภาคและการทำงาน ประการที่สอง การตรวจติดตามด้วย MRI ของ t-hCO3 ทำให้เราสามารถศึกษาตำแหน่งและการเจริญเติบโตของกราฟต์ในสัตว์มีชีวิต ทำให้เราสามารถทำการศึกษากับสัตว์หลายตัวในระยะยาวและพิสูจน์ความน่าเชื่อถือของเซลล์ hiPS หลายสายพันธุ์ได้ ในที่สุด เราปลูกถ่ายออร์แกนอยด์ที่สมบูรณ์ แทนที่จะเป็นเซลล์แขวนลอยเดี่ยวที่แยกจากกัน ซึ่งทำลายเซลล์ของมนุษย์น้อยกว่าและสามารถส่งเสริมการบูรณาการและการสร้างเซลล์ประสาทคอร์เทกซ์ของมนุษย์ในสมองหนูได้
เราทราบดีว่าแม้จะมีความก้าวหน้าในแพลตฟอร์มนี้ แต่ข้อจำกัดด้านเวลา เชิงพื้นที่ และข้ามสายพันธุ์ก็ขัดขวางการสร้างวงจรประสาทของมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ แม้หลังจากการปลูกถ่ายในระยะเริ่มต้นของการพัฒนา ตัวอย่างเช่น ไม่ชัดเจนว่ากิจกรรมที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติที่สังเกตได้ใน t-hCO แสดงถึงลักษณะทางพัฒนาการที่คล้ายกับกิจกรรมจังหวะที่สังเกตได้ในระหว่างการพัฒนาของเปลือกสมองหรือไม่ หรือเป็นเพราะไม่มีเซลล์ประเภทกดประสาทใน t-hCO ในทำนองเดียวกัน ไม่ชัดเจนว่าการไม่มีการแบ่งชั้นใน t-hCO ส่งผลต่อการเชื่อมต่อของห่วงโซ่ในระดับใด30 งานในอนาคตจะเน้นที่การผสานรวมเซลล์ประเภทอื่นๆ เช่น ไมโครเกลียของมนุษย์ เซลล์เยื่อบุผนังหลอดเลือดของมนุษย์ และอินเตอร์นิวรอน GABAergic ในสัดส่วนที่แตกต่างกัน ตามที่แสดงโดยใช้ชุดประกอบ 6 ในหลอดทดลอง รวมถึงการทำความเข้าใจว่าการผสานรวมและการประมวลผลของระบบประสาทสามารถเกิดขึ้นได้อย่างไรใน t-hCO ที่เปลี่ยนแปลงไป ระดับการถอดรหัส ไซแนปส์ และพฤติกรรมในเซลล์ที่ได้รับจากผู้ป่วย
โดยรวมแล้ว แพลตฟอร์ม in vivo นี้เป็นแหล่งข้อมูลอันทรงพลังที่สามารถเสริมการพัฒนาสมองของมนุษย์ในหลอดทดลองและการวิจัยโรคได้ เราคาดหวังว่าแพลตฟอร์มนี้จะช่วยให้เราค้นพบฟีโนไทป์ระดับสายเซลล์ใหม่ๆ ในเซลล์ที่ได้จากผู้ป่วยซึ่งหาได้ยาก และทดสอบกลยุทธ์การรักษาใหม่ๆ
เราสร้าง hCO2.5 จากเซลล์ HiPS ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ เพื่อเริ่มต้นการผลิต hCO จากเซลล์ HiPS ที่เพาะเลี้ยงบนชั้นอาหาร เซลล์ HiPS ที่สมบูรณ์จะถูกนำออกจากจานเพาะเลี้ยงโดยใช้ดิสเพส (0.35 มก./มล.) และถ่ายโอนไปยังวัฒนธรรมพลาสติกที่มีการยึดเกาะต่ำพิเศษที่มีจานเพาะเลี้ยงเซลล์ HiPS (Corning) เสริมด้วยสารยับยั้ง SMAD สองชนิด ได้แก่ ดอร์โซมอร์ฟีน (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) และ SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) และสารยับยั้ง ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ในช่วง 5 วันแรก จะเปลี่ยนอาหารเซลล์ HiPS ทุกวัน และเติมดอร์โซมอร์ฟีนและ SB-431542 ลงไป ในวันที่หกของการพักการทดลอง สเฟียรอยด์ประสาทถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเลี้ยงเซลล์ประสาทที่มีนิวโรเบซัลเอ (10888, Life Technologies), อาหารเสริม B-27 ที่ไม่มีวิตามินเอ (12587, Life Technologies), กลูตาแม็กซ์ (1:100, Life Technologies), เพนิซิลลิน และสเตรปโตมัยซิน (1:100, Life Technologies) และเสริมด้วยเอพิเดอร์มัล โกรท แฟกเตอร์ (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) และไฟโบรบลาสต์ โกรท แฟกเตอร์ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) จนถึงวันที่ 24 ตั้งแต่วันที่ 25 ถึงวันที่ 42 อาหารเลี้ยงเซลล์ได้รับการเสริมด้วยเอพิเดอร์มัล โกรท แฟกเตอร์ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) และนิวโรโทรฟิน 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) โดยเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ทุก ๆ วันเว้นวัน ในวันที่หกของการพักการทดลอง สเฟียรอยด์ประสาทถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเลี้ยงเซลล์ประสาทที่มีนิวโรเบซัลเอ (10888, Life Technologies), อาหารเสริม B-27 ที่ไม่มีวิตามินเอ (12587, Life Technologies), กลูตาแม็กซ์ (1:100, Life Technologies), เพนิซิลลิน และสเตรปโตมัยซิน (1:100, Life Technologies) และเสริมด้วยเอพิเดอร์มัล โกรท แฟกเตอร์ (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) และไฟโบรบลาสต์ โกรท แฟกเตอร์ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) จนถึงวันที่ 24 ตั้งแต่วันที่ 25 ถึงวันที่ 42 อาหารเลี้ยงเซลล์ได้รับการเสริมด้วยเอพิเดอร์มัล โกรท แฟกเตอร์ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) และนิวโรโทรฟิน 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) โดยเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ทุก ๆ วันเว้นวันในวันที่หกของการพักการทดลอง สเฟียรอยด์ของระบบประสาทถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเลี้ยงเซลล์ประสาทที่มี Neurobasal-A (10888, Life Technologies), อาหารเสริม B-27 ที่ไม่มีวิตามินเอ (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), เพนิซิลลินи стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ปี/มิลลิลิตร; ระบบ R&D) ถึง 24 มีนาคม. และสเตรปโตมัยซิน (1:100, Life Technologies) และเสริมด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตของหนังกำพร้า (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) และปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) จนถึงวันที่ 24ตั้งแต่วันที่ 25 ถึงวันที่ 42 ให้เติมปัจจัยบำรุงประสาทที่ได้จากสมอง (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) และนิวโรโทรฟิน 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อทุกๆ วันเว้นวันในปัจจุบัน เทคโนโลยี）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF：20 ng ml-1，R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2;20 ng ml-1;R&D Systems）直至第24 วัน。ใน 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 , Life Technologies） 不 含 维生素 a 的 b-27 补充剂 （12587 , Life Technologies） กลูตาแม็กซ์ （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ; r & d Systems) 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ; 20 ng ml- 1; R&D Systems）直至第24วัน。 ที่ 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) และ фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; ในวันที่ 6 สารแขวนลอยของนิวโรสเฟียร์ถูกเปลี่ยนเป็นอาหารเสริมที่ประกอบด้วยนิวโรเบซัลเอ (10888, Life Technologies), อาหารเสริมบี-27 ที่ไม่มีวิตามินเอ (12587, Life Technologies), กลูตาแม็กซ์ (1:100, Life Technologies), สเตรปโตมัยซินที่ทำให้เพนิซิลลินเป็นกลาง (1:100, Life Technologies) เสริมด้วยเอพิเดอร์มัลโกรทแฟกเตอร์ (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) และไฟโบรบลาสต์โกรทแฟกเตอร์ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; ระบบ R&D) ภายในวันที่ 24 กันยายน ระบบ R&D) จนถึงวันที่ 24ตั้งแต่วันที่ 25 ถึงวันที่ 42 ให้เติมปัจจัยบำรุงประสาทที่ได้จากสมอง (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) และปัจจัยบำรุงประสาท 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อทุกๆ 2 วัน เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อหนึ่งครั้งเริ่มตั้งแต่วันที่ 43 hCO จะถูกเก็บรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ neurobasal-A ที่ไม่เสริมด้วย (NM; 1088022, Thermo Fisher) โดยเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อทุก 4–6 วัน เพื่อให้ได้ hCO จากเซลล์ hiPS ที่เพาะเลี้ยงในสภาวะที่ไม่ต้องป้อนอาหาร เซลล์ hiPS จะถูกฟักกับ Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 7 นาที แยกตัวออกเป็นเซลล์เดี่ยว และเพาะในจาน AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) ที่ความหนาแน่น 3 × 106 เซลล์เดี่ยวต่อหลุมในอาหารเลี้ยงเชื้อ Essential 8 ที่เสริมด้วยสารยับยั้ง ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ให้ปิเปตตัวกลางในหลุมขึ้นลงในตัวกลางที่มีตัวกลาง Essential 6 (A1516401, Life Technologies) เสริมด้วยดอร์โซมอร์ฟีน (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) และ SB-431542 (10 μM; 1614) , Tocrida) ตั้งแต่วันที่ 2 ถึงวันที่ 6 ให้เปลี่ยนตัวกลาง Essential 6 ด้วยดอร์โซมอร์ฟีนและเสริมด้วย SB-431542 ทุกวัน ตั้งแต่วันที่ 6 ให้ย้ายสารแขวนลอยในนิวโรสเฟียร์ไปยังตัวกลางนิวโรเบซัล และคงสภาพไว้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
ขั้นตอนการดูแลสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการดูแลสัตว์ที่ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการบริหารการดูแลสัตว์ของห้องปฏิบัติการมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด (APLAC) หนู RNU (rnu/+) ที่ตั้งครรภ์และอยู่ในวัยเจริญพันธุ์ถูกซื้อ (Charles River Laboratories) หรือเลี้ยงไว้ สัตว์ถูกเลี้ยงไว้โดยให้อยู่ในรอบสว่าง-มืด 12 ชั่วโมง พร้อมอาหารและน้ำตามต้องการ ลูกสุนัขหนูเปลือย (FOXN1–/–) อายุ 3 ถึง 7 วันได้รับการระบุโดยดูจากการเจริญเติบโตของหนวดที่ยังไม่โตเต็มที่ก่อนจะคัดออก ลูกสุนัข (ตัวผู้และตัวเมีย) จะถูกวางยาสลบด้วยไอโซฟลูแรน 2-3% และวางไว้บนโครงสเตอริโอแท็กซิก การเจาะกะโหลกที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 2-3 มม. เหนือ S1 ดำเนินการในขณะที่รักษาความสมบูรณ์ของเยื่อดูราไว้ จากนั้นใช้เข็มขนาด 30-G (ประมาณ 0.3 มม.) ด้านนอกของช่องเปิดกระโหลกศีรษะเพื่อเจาะเยื่อดูรา จากนั้นทา HCO3 บนพาราฟิล์มบางๆ ขนาด 3×3 ซม. แล้วเอาตัวกลางส่วนเกินออก ใช้ไซริงค์แฮมิลตันที่ต่อกับเข็ม 23 G มุม 45° ค่อยๆ ดึง hCO3 เข้าไปในปลายสุดของเข็ม จากนั้นติดตั้งไซริงค์บนปั๊มไซริงค์ที่เชื่อมต่อกับอุปกรณ์สเตอริโอแท็กซิก จากนั้นวางปลายเข็มไว้เหนือรูเจาะกว้าง 0.3 มม. ที่ทำไว้ก่อนหน้านี้ในดูรา (z = 0 มม.) และบีบไซริงค์ให้แคบลง 1–2 มม. (z = ประมาณ –1.5 มม.) จนกระทั่งเข็มอยู่ระหว่างดูรามาเตอร์ A ทำให้เกิดซีลหนาแน่น จากนั้นยกไซริงค์ขึ้นไปที่กึ่งกลางของพื้นผิวคอร์เทกซ์ที่ z = -0.5 มม. และฉีด hCO3 ด้วยอัตรา 1–2 µl ต่อหนึ่งนาที หลังจากฉีด hCO3 เสร็จเรียบร้อยแล้ว เข็มจะหดกลับด้วยอัตรา 0.2-0.5 มม. ต่อหนึ่งนาที เย็บผิวหนังและวางลูกสุนัขบนแผ่นทำความร้อนทันทีจนกว่าจะฟื้นตัวสมบูรณ์ สัตว์บางตัวได้รับการปลูกถ่ายทั้งสองข้าง
ขั้นตอนทั้งหมดสำหรับสัตว์ดำเนินการตามแนวทางการดูแลสัตว์ที่ได้รับการอนุมัติจาก APLAC ของมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด หนู (มากกว่า 60 วันหลังการปลูกถ่าย) ถูกเหนี่ยวนำด้วยยาสลบไอโซฟลูเรน 5% และให้ยาสลบไอโซฟลูเรน 1-3% ระหว่างการถ่ายภาพ สำหรับการสร้างภาพนั้น จะใช้เครื่องสแกนหลุมเจาะแนวนอนแบบป้องกันด้วยไฟฟ้า 7 เทสลาของ Bruker (Bruker Corp.) พร้อมไดรฟ์แบบไล่ระดับของ International Electric Company (IECO) แทรกแบบไล่ระดับที่มีการป้องกันด้วยไฟฟ้าที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 120 มม. (600 mT/m, 1000 T/m/s) โดยใช้ AVANCE III ความสามารถ RF แบบมัลติคอยล์ 8 ช่อง และมัลติคอร์ และแพลตฟอร์ม Paravision 6.0.1 ที่มาพร้อมกัน การบันทึกดำเนินการโดยใช้คอยล์ RF แบบปริมาตรที่แยกส่วนแบบป้องกันด้วยไฟฟ้าที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 86 มม. และคอยล์ RF แบบทำความเย็นด้วยความเย็น 4 ช่องสำหรับรับเท่านั้น Axial 2D Turbo-RARE (เวลาทำซ้ำ = 2500 มิลลิวินาที เวลาสะท้อน = 33 มิลลิวินาที ค่าเฉลี่ย 2 ค่า) พร้อมการจับภาพสไลซ์ 16 ชิ้น ความหนาของสไลซ์ 0.6–0.8 มิลลิเมตร มีตัวอย่าง 256 × 256 ตัวอย่าง สัญญาณได้รับโดยใช้คอยล์ RF แบบปริมาตรของทรานซีฟเวอร์กำลังสองที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 2 ซม. (Rapid MR International, LLC) สุดท้าย ใช้ฟังก์ชันการประมาณค่าพื้นผิว Imaris (BitPlane) ในตัวสำหรับการเรนเดอร์ 3 มิติและการวิเคราะห์ปริมาตร การปลูกถ่ายที่ประสบความสำเร็จถูกกำหนดให้เป็นการปลูกถ่ายที่มีการสร้างพื้นที่ของสัญญาณ MRI แบบถ่วงน้ำหนัก T2 อย่างต่อเนื่องในซีกสมองที่ปลูกถ่าย การปฏิเสธการปลูกถ่ายถูกกำหนดให้เป็นการปลูกถ่ายที่ไม่สร้างพื้นที่ของสัญญาณ MRI แบบถ่วงน้ำหนัก T2 อย่างต่อเนื่องในซีกสมองที่ปลูกถ่าย t-hCO ใต้เปลือกสมองถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ในภายหลัง
เพื่อแสดง GCaMP6s อย่างเสถียรใน hCO สำหรับการถ่ายภาพแคลเซียมด้วยโฟตอนสองตัว เซลล์ hiPS จะถูกติดเชื้อด้วย pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ตามด้วยการคัดเลือกยาปฏิชีวนะ โดยสรุป เซลล์จะถูกแยกตัวด้วย EDTA และแขวนลอยในอาหารเลี้ยงเชื้อ Essential 8 1 มล. ที่ความหนาแน่นประมาณ 300,000 เซลล์โดยมีโพลีเบรน (5 μg/ml) และไวรัส 15 μl จากนั้นฟักเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 60 นาทีและเพาะในความหนาแน่น 50,000 เซลล์ต่อหลุม หลังจากบรรจบกันแล้ว เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วย puromycin 5-10 μg ml-1 เป็นเวลา 5-10 วันหรือจนกว่าจะพบกลุ่มโคโลนีที่เสถียร การติดเชื้อ hCO เฉียบพลันดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้5 โดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน โดยย่อ ให้ย้าย hCO3 30-45 วันลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ Eppendorf 1.5 มล. ที่บรรจุตัวกลางสำหรับเซลล์ประสาท 100 µl จากนั้นนำตัวกลางออกประมาณ 90 µl เติมเลนติไวรัสไทเตอร์สูง 3-6 µl (ตั้งแต่ 0.5 x 108 ถึง 1.2 x 109) ลงในหลอด แล้วย้าย hCO3 ลงในตู้ฟักเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นจึงเพิ่มตัวกลาง 90–100 µl ในแต่ละหลอด แล้วนำหลอดกลับเข้าไปในตู้ฟักข้ามคืน วันรุ่งขึ้น ให้ย้าย hCO3 ไปยังตัวกลางสำหรับเซลล์ประสาทใหม่ในเพลตที่ติดต่ำ หลังจากผ่านไป 7 วัน ให้ย้าย hCO3 ไปยังเพลตแก้วก้น 24 หลุมเพื่อให้มองเห็นและประเมินคุณภาพของการติดเชื้อ pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE และ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE สร้างขึ้นโดย VectorBuilder เลนติไวรัสถูกใช้ในการทดลองส่วนใหญ่เนื่องจากถูกผสานเข้ากับจีโนมของโฮสต์ ทำให้ยีนรายงานแสดงออกในสายเซลล์ที่ติดเชื้อได้ สำหรับการติดตามโรคพิษสุนัขบ้า เชื้อเรบีส์-ΔG-eGFP และ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (พลาสมิด #67528, Addgene) ในวันที่ 30-45 ติดเชื้อร่วมกัน ล้างให้สะอาดเป็นเวลา 3 วัน จากนั้นจึงปลูกถ่ายเข้าไปในหนูใน S1 และเลี้ยงไว้ในร่างกายเป็นเวลา 7-14 วัน
สำหรับอิมมูโนไซโตเคมี สัตว์ได้รับการวางยาสลบและฉีด PBS เข้าทางหัวใจตามด้วยพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% (PFA ใน PBS; Electron Microscopy Sciences) สมองได้รับการตรึงใน PFA 4% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงหรือข้ามคืนที่ 4°C แช่แข็งในซูโครส 30% ใน PBS เป็นเวลา 48-72 ชั่วโมง และฝังในซูโครส 30% 1:1: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) และทำการตัดส่วนโคโรนัลที่ 30 µm โดยใช้ cryostat (Leica) สำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมีของส่วนหนา สัตว์ได้รับการฉีด PBS และผ่าสมองและตัดส่วนโคโรนัลที่ 300–400 µm โดยใช้ vibratome (Leica) และตรึงส่วนต่างๆ ด้วย PFA 4% เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นล้าง cryosection หรือส่วนหนาด้วย PBS ปิดกั้นไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง (normal donkey serum (NDS) 10% และ Triton X-100 0.3% เจือจางใน PBS) แล้วปิดกั้นด้วยสารละลายปิดกั้นที่อุณหภูมิ 4°C – การบ่มเพาะ cryosections ฟักค้างคืนและฟักส่วนหนาเป็นเวลา 5 วัน แอนติบอดีหลักที่ใช้ ได้แก่ แอนตี้บอดี NeuN (เมาส์ 1:500; ab104224, abcam) แอนตี้บอดี CTIP2 (หนู 1:300; ab18465, abcam) แอนตี้บอดี GFAP (กระต่าย 1:1,000; Z0334, Dako) แอนตี้บอดี GFP (ไก่ 1:1,000; GTX13970, GeneTex) แอนตี้บอดี HNA (เมาส์ 1:200; ab191181, abcam) แอนตี้บอดี NeuN (กระต่าย 1:500; ABN78, Millipore) แอนตี้บอดี PDGFRA (กระต่าย 1:200; sc-338, Santa Cruz) แอนตี้บอดี PPP1R17 (กระต่าย 1:200; HPA047819, แอนติบอดี Atlas) แอนตี้บอดี RECA-1 (เมาส์ 1:50; ab9774, abcam), ป้องกัน SCG2 (กระต่าย 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ป้องกัน SOX9 (แพะ 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (แพะ 1:100; AF1166, R&D Systems), ป้องกัน STEM121 (หนู 1:200; Y40410, Takara Bio), ป้องกัน SATB2 (หนู 1:50; ab51502, abcam), ป้องกัน GAD65/67 (กระต่าย 1:400; ABN904, Millipore) และป้องกัน IBA1 (แพะ 1:100; ab5076, abcam) แอนติบอดีหลักที่ใช้ ได้แก่ แอนตี้บอดี NeuN (เมาส์ 1:500; ab104224, abcam) แอนตี้บอดี CTIP2 (หนู 1:300; ab18465, abcam) แอนตี้บอดี GFAP (กระต่าย 1:1,000; Z0334, Dako) แอนตี้บอดี GFP (ไก่ 1:1,000; GTX13970, GeneTex) แอนตี้บอดี HNA (เมาส์ 1:200; ab191181, abcam) แอนตี้บอดี NeuN (กระต่าย 1:500; ABN78, Millipore) แอนตี้บอดี PDGFRA (กระต่าย 1:200; sc-338, Santa Cruz) แอนตี้บอดี PPP1R17 (กระต่าย 1:200; HPA047819, แอนติบอดี Atlas) แอนตี้บอดี RECA-1 (เมาส์ 1:50; ab9774, abcam), ป้องกัน SCG2 (กระต่าย 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ป้องกัน SOX9 (แพะ 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (แพะ 1:100; AF1166, R&D Systems), ป้องกัน STEM121 (หนู 1:200; Y40410, Takara Bio), ป้องกัน SATB2 (หนู 1:50; ab51502, abcam), ป้องกัน GAD65/67 (กระต่าย 1:400; ABN904, Millipore) และป้องกัน IBA1 (แพะ 1 :100; ab5076, abcam) Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), ANTи-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, มิลลิพอร์), antи-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (โคซี่, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, มิลลิพอร์) и анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). ไทย แอนติบอดีหลักที่ใช้ ได้แก่ แอนติ-NeuN (เมาส์ 1:500; ab104224, abcam), แอนติ-CTIP2 (หนู 1:300; ab18465, abcam), แอนติ-GFAP (กระต่าย 1:1000; Z0334, Dako), แอนติ-GFP (ไก่ 1:1000; GTX13970, GeneTex), แอนติ-HNA (เมาส์ 1:200; ab191181, abcam), แอนติ-NeuN (กระต่าย 1:500; ABN78, Millipore), แอนติ-PDGFRA (กระต่าย 1:200; sc-338, Santa Cruz), แอนติ-PPP1R17 (กระต่าย 1:200; HPA047819, แอนติบอดี Atlas), แอนติ-RECA-1 (เมาส์ 1:50; ab9774, abcam), แอนตี้- SCG2 (กระต่าย 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), แอนตี้- SOX9 (แพะ 1:500; AF3075, R&D Systems), เนทริน G1a (แพะ 1:100; AF1166, R&D Systems), แอนตี้- STEM121 (หนู 1:200; Y40410, Takara Bio), แอนตี้- SATB2 (หนู 1:50; ab51502, abcam), แอนตี้- GAD65/67 (กระต่าย 1:400; ABN904, Millipore) และแอนตี้- IBA1 (แพะ 1:100; ab5076, abkam)เครดิต：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300）ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000，Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000，GTX13970，GeneTex），抗HNA（鼠，1:200，ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500，ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200;sc-338，ซานต้า Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200，HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（鼠，1:50，ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100;20357-1-AP，Proteintech），SOX9（yama羊，1:500，AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（yama羊，1:100：AF1166，R&D Systems），STEM121（鼠, 1:200;เครดิต：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300）ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000，Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000，GTX13970，GeneTex），抗HNA（鼠，1:200，ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500：ABN78，Millipore％弔，抗1: 200;sc-338，ซานต้า Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200，HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（鼠，1:50，ab9774，abcam），抗SCG2 100;20357-1-AP，Proteintech），SOX9（yama羊，1:500）AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（yama羊，1:100：AF1166，R&D Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), ต่อต้าน-SATB2 (หนู 1:50; ab51502, abcam), ต่อต้าน-GAD65/67 (กระต่าย 1:400; ABN904, Millipore) และต่อต้าน-IBA1 (แพะ 1:100; ab5076, abcam)แอนติบอดีหลักที่ใช้ ได้แก่ แอนติ-NeuN (หนู 1:500; ab104224, abcam), แอนติ-CTIP2 (หนู 1:300; ab18465, abcam), แอนติ-GFAP (กระต่าย 1:1000; Z0334, Dako) , แอนตี้-GFP (ไก่ 1:1000; GTX13970, GeneTex), แอนตี้-HNA (หนู 1:200; ab191181, abcam), แอนตี้-NeuN (กระต่าย 1:500; ABN78, Millipore), แอนตี้-PDGFRA (กระต่าย 1:200; sc-338, Santa Cruz), แอนตี้-PPP1R17 (กระต่าย 1:200; HPA047819, แอนติบอดี Atlas), แอนตี้-RECA-1 (หนู 1:50; ab9774, abcam), แอนตี้-SCG2 (กระต่าย) 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, มิลลิพอร์) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (แพะ 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (แพะ 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (หนู 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (หนู 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (กระต่าย 1:400; ABN904, Millipore) และ anti-IBA1 (แพะ 1:100; ab5076, abkam)จากนั้นล้างส่วนต่างๆ ด้วย PBS และฟักกับแอนติบอดีรองเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (ส่วนที่แช่แข็ง) หรือข้ามคืนที่ 4°C (ส่วนที่หนา) ใช้แอนติบอดีรอง Alexa Fluor (Life Technologies) เจือจาง 1:1000 ในสารละลายบล็อก หลังจากล้างด้วย PBS แล้ว จะทำการมองเห็นนิวเคลียสด้วย Hoechst 33258 (Life Technologies) ในที่สุด ให้วางสไลด์บนกล้องจุลทรรศน์ที่มีแผ่นปิด (Fisher Scientific) โดยใช้ Aquamount (Polysciences) และวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ Keyence (เครื่องวิเคราะห์ BZ-X) หรือกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Leica TCS SP8 (Las-X) บนภาพ ภาพถูกประมวลผลโดยใช้โปรแกรม ImageJ (Fiji) เพื่อวัดสัดส่วนของเซลล์ประสาทของมนุษย์ใน t-hCO และคอร์เทกซ์ของหนู ได้มีการถ่ายภาพสี่เหลี่ยมผืนผ้ากว้าง 387.5 μm ที่บริเวณกึ่งกลางของ t-hCO ที่หรือใกล้กับขอบคอร์เทกซ์ของหนู ขอบกราฟต์ถูกกำหนดโดยการประเมินการเปลี่ยนแปลงในความโปร่งใสของเนื้อเยื่อ นิวเคลียส HNA+ และ/หรือการมีอยู่ของออโตฟลูออเรสเซนซ์ของเนื้อเยื่อ ในแต่ละภาพ จำนวนเซลล์ NeuN+ และ HNA+ ทั้งหมดจะถูกหารด้วยจำนวนเซลล์ NeuN+ ทั้งหมดในบริเวณเดียวกัน เพื่อให้แน่ใจว่าจะนับเฉพาะเซลล์ที่มีนิวเคลียสในระนาบของภาพเท่านั้น จึงจะรวมเฉพาะเซลล์ที่เป็น Hoechst+ ด้วยเช่นกันในการคำนวณ ภาพสองภาพที่ห่างกันอย่างน้อย 1 มม. ถูกหาค่าเฉลี่ยเพื่อลดข้อผิดพลาดทางสถิติ
หนึ่งสัปดาห์ก่อนการเก็บตัวอย่าง ให้นำสัตว์ที่ได้รับการปลูกถ่าย hCO3 (ประมาณ 8 เดือนของการแยกตัว) ไปไว้ในห้องมืด โดยตัดหนวดออกเพื่อลดการกระตุ้นทางประสาทสัมผัสให้น้อยที่สุด การแยกนิวเคลียสดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน กล่าวโดยย่อ t-hCO3 และ hCO3 ถูกทำลายโดยใช้การสลายเซลล์ด้วยกลไกผงซักฟอกและเครื่องบดเนื้อเยื่อแก้วขนาด 2 มล. (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) จากนั้นกรองนิวเคลียสดิบออกโดยใช้ตัวกรองขนาด 40 ไมโครเมตร และปั่นเหวี่ยงที่ 320 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 °C ก่อนจะทำการไล่ระดับความหนาแน่นของซูโครส หลังจากขั้นตอนการปั่นเหวี่ยง (320 กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4°C) ตัวอย่างจะถูกทำให้แขวนลอยอีกครั้งใน BSA/PBS 0.04% พร้อมกับสารยับยั้ง RNase µl-1 จำนวน 0.2 หน่วย (40 ไมโครลิตร-1, AM2682, Ambion) และผ่านตัวกรองการไหล 40 ไมโครเมตร จากนั้นนิวเคลียสที่แยกตัวออกจะถูกทำให้แขวนลอยอีกครั้งใน PBS ที่มี BSA 0.02% และโหลดลงในชิป Chromium Single Cell 3′ (กู้คืนได้ประมาณ 8,000 เซลล์ต่อเลน) ห้องสมุด snRNA-seq ได้รับการเตรียมโดยใช้ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ห้องสมุด snRNA-seq ได้รับการเตรียมโดยใช้ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ไบเบิ้ล snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ห้องสมุด snRNA-seq ได้รับการเตรียมโดยใช้ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 ไบเบิ้ล snRNA-seq готовили спользованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ห้องสมุด snRNA-seq ได้รับการเตรียมโดยใช้ Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)ไลบรารีจากตัวอย่างต่างๆ จะถูกจัดกลุ่มและจัดลำดับโดย Admera Health บน NovaSeq S4 (Illumina)
ระดับการแสดงออกของยีนสำหรับบาร์โค้ดนิวเคลียร์ที่คาดว่าจะมีอยู่แต่ละอันถูกวัดปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์แพ็คเกจการวิเคราะห์ 10x Genomics CellRanger (เวอร์ชัน 6.1.2) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การอ่านนั้นถูกจับคู่กับจีโนมอ้างอิงของมนุษย์ (GRCh38, Ensemble, เวอร์ชัน 98) และหนู (Rnor_6.0, Ensemble, เวอร์ชัน 100) ที่สร้างด้วยคำสั่ง mkref และใช้ count กับคำสั่ง –include-introns=TRUE เพื่อวัดปริมาณการอ่านแบบรวมที่แมปกับบริเวณอินทรอน สำหรับตัวอย่าง t-hCO นิวเคลียสของมนุษย์จะถูกระบุตามข้อกำหนดที่เข้มงวดซึ่งระบุว่าการอ่านที่แมปอย่างน้อย 95% ทั้งหมดนั้นตรงกับจีโนมของมนุษย์ การวิเคราะห์ที่ตามมาทั้งหมดดำเนินการบนเอาต์พุตของอาร์เรย์บาร์โค้ดที่กรองแล้วจาก CellRanger โดยใช้แพ็คเกจ R (เวอร์ชัน 4.1.2) Seurat (เวอร์ชัน 4.1.1)32
เพื่อให้แน่ใจว่ามีการรวมเฉพาะนิวเคลียสที่มีคุณภาพสูงเท่านั้นในการวิเคราะห์ที่ตามมา จึงได้นำกระบวนการกรองแบบวนซ้ำมาใช้สำหรับแต่ละตัวอย่าง ขั้นแรก จะระบุและกำจัดนิวเคลียสคุณภาพต่ำที่มียีนเฉพาะตัวน้อยกว่า 1,000 ยีนและไมโตคอนเดรียทั้งหมดมากกว่า 20% จากนั้น เมทริกซ์จำนวนยีนดิบจะถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยการถดถอยทวินามเชิงลบแบบปรับมาตรฐานโดยใช้ฟังก์ชัน sctransform(vst.flavor=”v2″) ซึ่งยังระบุยีนที่แปรผันมากที่สุด 3,000 ยีนโดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นอีกด้วย การลดมิติจะดำเนินการกับยีนที่แปรผันสูงสุดโดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) โดยใช้พารามิเตอร์เริ่มต้นโดยใช้มิติชุดข้อมูล 30 (dims = 30 ถูกเลือกโดยอิงจากการตรวจสอบด้วยสายตาของตำแหน่งหัวเข่า และใช้สำหรับตัวอย่างทั้งหมดและการวิเคราะห์กลุ่ม) จากนั้น เราจึงดำเนินการจัดกลุ่มซ้ำหลายรอบ (ความละเอียด = 1) เพื่อจำแนกยีนตามจำนวนยีนที่ต่ำผิดปกติ (ค่ามัธยฐานต่ำกว่าร้อยละที่ 10) จำนวนยีนไมโตคอนเดรียที่สูงผิดปกติ (ค่ามัธยฐานสูงกว่าร้อยละที่ 95) เพื่อระบุและลบเซลล์ที่คาดว่าจะมีคุณภาพต่ำ คลัสเตอร์และ/หรือสัดส่วนสูงของฝาแฝดที่สงสัยว่าระบุโดยใช้แพ็คเกจ DoubletFinder33 (คะแนน DoubletFinder เฉลี่ยสูงกว่าร้อยละที่ 95) ตัวอย่าง t-hCO ตัวอย่าง (n=3) และ hCO (n=3) ถูกผสานแยกกันโดยใช้ฟังก์ชัน IntegrateData ที่มีพารามิเตอร์ข้างต้น จากนั้นดำเนินการกรองเชิงคุณภาพของชุดข้อมูลที่ผสานกันอีกครั้งตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
หลังจากลบเคอร์เนลคุณภาพต่ำออกแล้ว ชุดข้อมูลที่รวมเข้าด้วยกันจะถูกจัดกลุ่ม (ความละเอียด = 0.5) และฝังไว้เพื่อวัตถุประสงค์ในการแสดงภาพ UMAP34 ยีนมาร์กเกอร์สำหรับแต่ละคลัสเตอร์ถูกกำหนดโดยใช้ฟังก์ชัน FindMarkers โดยมีพารามิเตอร์เริ่มต้นที่คำนวณจากข้อมูลการแสดงออกของยีนที่ปรับมาตรฐานแล้ว เราระบุและจัดประเภทคลาสเซลล์หลักโดยรวมชุดข้อมูลอ้างอิงของคอร์เทกซ์ของทารกในครรภ์และผู้ใหญ่เข้ากับการแสดงออกของยีนมาร์กเกอร์ 19,20,21,35 และคำอธิบายประกอบ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เซลล์ตั้งต้นที่หมุนเวียนจะถูกระบุโดยการแสดงออกของ MKI67 และ TOP2A คลัสเตอร์เซลล์ตั้งต้นถูกกำหนดโดยการไม่มีทรานสคริปต์ไมโทซิส การทับซ้อนสูงกับคลัสเตอร์เซลล์ตั้งต้นของกลีอาที่มีศักยภาพหลายประการที่อธิบายไว้ในคอร์เทกซ์ของทารกในครรภ์ในระยะเมตาเฟสตอนปลาย และการแสดงออกของ EGFR และ OLIG1 เราใช้คำว่าแอสโตรไซต์เพื่อครอบคลุมสถานะต่างๆ ของการแบ่งตัวของแอสโตรไซต์ ตั้งแต่เซลล์เรเดียลในระยะปลายไปจนถึงการเจริญเติบโตของแอสโตรไซต์ กลุ่มเซลล์แอสโตรไซต์แสดงระดับ SLC1A3 และ AQP4 สูง และได้รับการแสดงให้เห็นว่าสามารถจับคู่กับเซลล์เรเดียลกลีอาของทารกในครรภ์และ/หรือเซลล์แอสโตรไซต์ของผู้ใหญ่ได้ OPC แสดง PDGFRA และ SOX10 ในขณะที่เซลล์โอลิโกเดนโดรไซต์แสดงเครื่องหมายไมอีลิเนชัน (MOG และ MYRF) เซลล์ประสาทกลูตาเมตสามารถระบุได้จากการมีอยู่ของทรานสคริปต์ของเซลล์ประสาท (SYT1 และ SNAP25) การไม่มีเครื่องหมาย GABAergic (GAD2) และการแสดงออกของ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B หรือ SATB2 เซลล์ประสาท GluN แบ่งย่อยออกไปอีกเป็นชั้นย่อยบน (การแสดงออกของ SATB2 และการสูญเสีย BCL11B) และชั้นลึก (การแสดงออกของ BCL11B) เซลล์ประสาทซับเพลต (SP) ที่คาดว่าจะแสดงเครื่องหมาย SP18 ที่รู้จัก เช่น ST18 และ SORCS1 นอกเหนือจากเครื่องหมาย GluN ชั้นลึก เซลล์ที่คล้ายกับช่องท้องของคอรอยด์ได้รับการระบุโดยการแสดงออกของ TTR และเซลล์ที่คล้ายกับเยื่อหุ้มสมองแสดงยีนที่เกี่ยวข้องกับไฟโบรบลาสต์และเซลล์เยื่อหุ้มสมอง/หลอดเลือดที่แมปไว้ของชุดข้อมูลอ้างอิง
การวิเคราะห์เชิงอนุพันธ์ของการแสดงออกของยีนระหว่างซับคลาส t-hCO และ hCO ดำเนินการโดยใช้เมธอด pseudo-batch ที่พัฒนาขึ้นใหม่ซึ่งทำซ้ำในตัวอย่างที่ใช้งานโดยใช้แพ็คเกจ Libra R (เวอร์ชัน 1.0.0) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การทดสอบ log-likelihood ของ edgeR (เวอร์ชัน 3.36.0 แพ็คเกจ R) ดำเนินการสำหรับกลุ่มโดยการรวมจำนวนยีนในเซลล์สำหรับคลาสเซลล์ที่กำหนดสำหรับการจำลองตัวอย่างแต่ละครั้ง สำหรับการแสดงภาพแผนที่ความร้อน ค่าต่อล้านที่ปรับมาตรฐานแล้ว (CPM) จะถูกคำนวณโดยใช้ edgeR (ฟังก์ชัน cpm()) และปรับมาตราส่วน (เพื่อให้ได้ค่าเฉลี่ย = 0, ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน = 1) ดำเนินการวิเคราะห์การเพิ่มค่า Gene Ontology (GO) ของยีน GluN ของ t-hCO ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P ที่แก้ไขโดย Benjamini-Hochberg น้อยกว่า 0.05 ซึ่งแสดงออกในเซลล์ GluN ของ t-hCO อย่างน้อย 10% และการเปลี่ยนแปลงเพิ่มขึ้นเป็นเท่าตัวอย่างน้อย 2 เท่า) ดำเนินการโดยใช้ ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 เราใช้แอป ToppFun พร้อมพารามิเตอร์เริ่มต้นและรายงานค่า P ที่แก้ไขโดย Benjamini-Hochberg ซึ่งคำนวณจากการทดสอบไฮเปอร์จีโอเมตริกที่มีคำอธิบายประกอบแบบ GO
เพื่อจับคู่คลัสเตอร์ snRNA-seq ของเรากับคลัสเตอร์เซลล์ที่มีคำอธิบายประกอบจากการศึกษาอ้างอิงของ RNA-seq เซลล์เดี่ยวหลักหรือ snRNA-seq19,20,21,22 ของผู้ใหญ่ เราได้ใช้แนวทางการรวมชุดข้อมูลแบบจับคู่ เราใช้เวิร์กโฟลว์การทำให้เป็นมาตรฐาน SCTransform (v2) ใน Seurat เพื่อรวมและเปรียบเทียบการทับซ้อนของคลัสเตอร์ระหว่างชุดข้อมูล (โดยใช้พารามิเตอร์เดียวกันกับข้างต้น) ชุดข้อมูลแต่ละชุดจะถูกแบ่งย่อยแบบสุ่มสูงสุด 500 เซลล์หรือคอร์ต่อคลัสเตอร์เดิมเพื่อประสิทธิภาพในการคำนวณ โดยใช้แนวทางที่คล้ายกันดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ การทับซ้อนของคลัสเตอร์ถูกกำหนดให้เป็นสัดส่วนของเซลล์หรือนิวเคลียสในแต่ละคลัสเตอร์รวมที่ทับซ้อนกับป้ายกำกับของคลัสเตอร์อ้างอิง เพื่อจำแนก GluN เพิ่มเติม เราใช้เวิร์กโฟลว์ TransferData ของ Seurat สำหรับข้อมูลชุดย่อย GluN เพื่อกำหนดป้ายกำกับของชุดข้อมูลอ้างอิงให้กับเซลล์ GluN ของเรา
เพื่อประเมินสถานะการเจริญเติบโตของทรานสคริปโตมทั่วโลกของตัวอย่าง t-hCO และ hCO เราได้เปรียบเทียบตัวอย่างจำนวนมากเทียมของเรากับ BrainSpan/psychENCODE23 ซึ่งประกอบด้วยลำดับ RNA ขนาดใหญ่ที่ครอบคลุมการพัฒนาสมองของมนุษย์ เราได้ทำ PCA บนเมทริกซ์การแสดงออกของยีนที่ปรับรูปแบบแบบผสมจากตัวอย่างคอร์เทกซ์ 10 สัปดาห์หลังการปฏิสนธิและหลังจากนั้นในยีน 5,567 ยีน (ร่วมกับข้อมูลของเรา) ที่เคยระบุว่าทำงานในตัวอย่างคอร์เทกซ์ของ BrainSpan (กำหนดเป็นมากกว่า 50% ในความแปรปรวนของการพัฒนาที่อธิบายโดยอายุโดยใช้แบบจำลองลูกบาศก์)38 นอกจากนี้ เราได้อนุมานยีนที่เกี่ยวข้องกับลายเซ็นทรานสคริปโตมหลักของการพัฒนาระบบประสาทโดยใช้การแยกตัวประกอบเมทริกซ์ที่ไม่เป็นลบตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ น้ำหนักตัวอย่างที่คำนวณโดยใช้ขั้นตอนการแยกตัวประกอบเมทริกซ์ที่ไม่เป็นลบนั้นจะแสดงไว้ในรูปที่ 5b พร้อมด้วยข้อมูลขยายสำหรับลายเซ็นทั้งห้าลายเซ็นที่อธิบายโดย Zhu et al.38 อีกครั้ง เครื่องหมายการถอดรหัสที่ขึ้นอยู่กับกิจกรรมนั้นได้มาจากการศึกษาที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ERG และ LRG ถูกควบคุมให้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ประสาทกลูตาเมตที่ระบุโดยการรวบรวม snRNA-seq ของคอร์เทกซ์การมองเห็นของหนูหลังจากการกระตุ้นด้วยสายตาจากตารางเสริม 3 Hrvatin et al.16 LRG ที่เสริมด้วยมนุษย์ได้รับมาจากการเพาะเลี้ยงสมองของทารกในครรภ์มนุษย์ที่กระตุ้นด้วย KCl และเก็บเกี่ยว 6 ชั่วโมงหลังการกระตุ้น และยีนที่กรองถูกควบคุมให้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในมนุษย์แต่ไม่ใช่ในสัตว์ฟันแทะ (ตารางเสริม 4) การวิเคราะห์การเพิ่มระดับของชุดยีนโดยใช้ชุดยีนเหล่านี้ดำเนินการโดยใช้การทดสอบฟิชเชอร์แบบทางเดียว
วางยาสลบหนูด้วยไอโซฟลูแรน นำสมองออกแล้วนำไปใส่ในสารละลายซูโครสที่มีออกซิเจน (95% O2 และ 5%) ที่เย็น (ประมาณ 4°C) สำหรับส่วนที่มีซูโครส 234 มิลลิโมลาร์ กลูโคส 11 มิลลิโมลาร์ NaHCO3 26 มิลลิโมลาร์ KCl 2.5 มิลลิโมลาร์ NaH2PO4 1.25 มิลลิโมลาร์ MgSO4 10 มิลลิโมลาร์ และ CaCl2 0.5 มิลลิโมลาร์ (ประมาณ 310 มิลลิออสโมลาร์) ส่วนตัดขวางของสมองหนู (300–400 ไมโครเมตร) ที่มี t-hCO จะทำโดยใช้เครื่องไวเบรโทม Leica VT1200 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้39 จากนั้นย้ายส่วนต่างๆ ไปยังห้องแบ่งส่วนที่มีออกซิเจนต่อเนื่องที่อุณหภูมิห้อง โดยมี aCSF ที่เตรียมจากกลูโคส 10 มิลลิโมลาร์ NaHCO3 26 มิลลิโมลาร์ KCl 2.5 มิลลิโมลาร์ NaHPO4 1.25 มิลลิโมลาร์ MgSO4 1 มิลลิโมลาร์ CaCl2 2 มิลลิโมลาร์ และ NaCl 126 มิลลิโมลาร์ (298 มิลลิออสโมซิส) อย่างน้อย 45 นาทีก่อนการบันทึก ส่วนต่างๆ จะถูกบันทึกในห้องแช่ซึ่งจะถูกฉีด aCSF อย่างต่อเนื่อง (ขวดที่มี O2 95% และ CO2 5%) ข้อมูลทั้งหมดจะถูกบันทึกที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ประสาท t-hCO ถูกยุติด้วยปิเปตแก้วโบโรซิลิเกตที่เติมสารละลายที่มีโพแทสเซียมกลูโคเนต 127 มิลลิโมลาร์ NaCl 8 มิลลิโมลาร์ ATP แมกนีเซียม 4 มิลลิโมลาร์ โซเดียม GTP 0.3 มิลลิโมลาร์ HEPES 10 มิลลิโมลาร์ และ EGTA 0.6 มิลลิโมลาร์ ค่า pH 7.2 สารละลายภายในที่ปรับด้วย KOH (290 มิลลิออสโมซิส) เพื่อที่จะกู้คืนได้ จะเติมไบโอไซติน (0.2%) ลงในสารละลายบันทึก
ข้อมูลได้รับโดยใช้เครื่องขยายสัญญาณ MultiClamp 700B (Molecular Devices) และเครื่องแปลงสัญญาณ Digidata 1550B (Molecular Devices) กรองความถี่ต่ำที่ 2 kHz แปลงเป็นดิจิทัลที่ 20 kHz และวิเคราะห์โดยใช้ Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro) 2021b, OriginLab) และฟังก์ชัน MATLAB ที่กำหนดเอง (Mathworks) ศักย์ไฟฟ้าของจุดเชื่อมต่อคำนวณโดยใช้ JPCalc และปรับรายการให้เป็นค่าที่คำนวณได้คือ -14 mV การดำเนินการ IV ประกอบด้วยขั้นตอนกระแสไฟฟ้าชุดหนึ่งในขั้นตอน 10-25 pA ตั้งแต่ -250 ถึง 750 pA
ทาลามัส เนื้อขาว และเส้นประสาทรับความรู้สึก S1 ได้รับการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าในชิ้นของทาลามัสคอร์ติกัลระหว่างการบันทึกเซลล์ประสาท hCO3 แบบแพตช์แคลมป์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยย่อ สมองถูกวางไว้บนโต๊ะพิมพ์ 3 มิติที่เอียงเป็นมุม 10° และตัดส่วนหน้าของสมองเป็นมุม 35° จากนั้นจึงติดสมองกับพื้นผิวที่ตัดและตัดเป็นชิ้นๆ โดยรักษาแอกซอนของทาลามัสคอร์ติกัลที่ยื่นออกมาไว้ อิเล็กโทรดทังสเตนแบบไบโพลาร์ (0.5 MΩ) ถูกติดไว้บนไมโครแมนิพูเลเตอร์ตัวที่สองและวางในตำแหน่งที่เหมาะสมเพื่อกระตุ้นบริเวณสี่แห่งต่อเซลล์ (แคปซูลด้านใน เนื้อขาว S1 และ hCO3) บันทึกการตอบสนองของซินแนปส์หลังจากการกระตุ้นแบบเฟส 300 µA ที่ความถี่ 0.03–0.1 Hz
เซลล์ประสาท hCO3 ที่แสดง hChR2 ถูกกระตุ้นที่ความยาวคลื่น 480 นาโนเมตร และพัลส์แสงที่สร้างโดย LED (Prizmatix) จะถูกนำไปใช้ผ่านเลนส์ออบเจกทีฟ ×40 (0.9 NA; โอลิมปัส) เพื่อบันทึกการแสดงออกของ hChR2 ใกล้กับเซลล์ เส้นผ่านศูนย์กลางของสนามที่ส่องสว่างอยู่ที่ประมาณ 0.5 มิลลิเมตร และกำลังรวมอยู่ที่ 10-20 มิลลิวัตต์ ความกว้างของพัลส์ถูกตั้งไว้ที่ 10 มิลลิวินาที ซึ่งสอดคล้องกับพัลส์ที่ให้ไว้ในระหว่างการทดลองการเรียนรู้พฤติกรรม ความถี่การกระตุ้นต่างๆ ถูกใช้ตั้งแต่ 1 ถึง 20 เฮิรตซ์ แต่ใช้เฉพาะพัลส์แรกของซีรีส์เท่านั้นสำหรับการวัดปริมาณ ช่วงเวลาระหว่างชุดสัญญาณมักจะยาวนานกว่า 30 วินาที เพื่อลดผลกระทบต่อเส้นทางการยับยั้งหรืออำนวยความสะดวกของซินแนปส์ให้น้อยที่สุด เพื่อทดสอบว่าการตอบสนองของ hChR2 เป็นโมโนซินแนปส์หรือไม่ เราจึงใช้ TTX (1 ไมโครโมลาร์) ในอ่างจนกระทั่งปฏิกิริยา EPSC หายไป จากนั้นจึงใช้ 4-อะมิโนไพริดีน (4-AP; 100 ไมโครโมลาร์) โดยทั่วไป การตอบสนองจะเกิดขึ้นภายในไม่กี่นาที โดยมีความล่าช้าเล็กน้อยระหว่างการจุดไฟ LED และการสร้าง EPSC NBQX (10 μM) ถูกใช้เพื่อทดสอบว่าการตอบสนองนั้นถูกขับเคลื่อนโดยตัวรับ AMPA หรือไม่
ส่วนตัด hCO ที่มีคมถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยย่อ ส่วนตัด hCO ถูกฝังในอะกาโรส 4% และถ่ายโอนไปยังเซลล์ที่มี NaCl 126 mM, KCl 2.5 mM, NaH2PO4 1.25 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 26 mM และ d-(+) -glucose 10 mM ตัดส่วนที่ 200–300 µm ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้เครื่องสั่น Leica VT1200 และเก็บไว้ใน ASF ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นทำการบันทึกเซลล์ทั้งหมดแบบแพตช์แคมป์บนส่วนตัด hCO ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ SliceScope โดยตรง (Scientifica) ส่วนตัดถูกชะล้างด้วย aCSF (95% O2 และ 5% CO2) และบันทึกสัญญาณเซลล์ที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ประสาท hCO ถูกนำมาใช้โดยใช้ปิเปตแก้วโบโรซิลิเกตที่บรรจุสารละลายที่มีโพแทสเซียมกลูโคเนต 127 มิลลิโมลาร์ NaCl 8 มิลลิโมลาร์ ATP แมกนีเซียม 4 มิลลิโมลาร์ โซเดียม GTP 0.3 มิลลิโมลาร์ HEPES 10 มิลลิโมลาร์ และ EGTA 0.6 มิลลิโมลาร์ ค่า pH ภายใน 7.2 ปรับด้วย KOH (ออสโมลาริตี้ 290) สำหรับวัตถุประสงค์ในการกู้คืน ให้เติมไบโอไซติน 0.2% ลงในสารละลายภายใน
ข้อมูลได้รับโดย Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) โดยใช้เครื่องขยายสัญญาณ MultiClamp 700B (Molecular Devices) และเครื่องแปลงสัญญาณ Digidata 1550B (Molecular Devices) กรองความถี่ต่ำที่ 2 kHz แปลงเป็นดิจิทัลที่ 20 kHz และวิเคราะห์โดยใช้ Clampfit (เวอร์ชัน 10.6) สำหรับการวิเคราะห์ อุปกรณ์โมเลกุล) และฟังก์ชัน MATLAB ที่กำหนดเอง (MATLAB 2019b, Mathworks) ศักย์ไฟฟ้าของจุดเชื่อมต่อคำนวณโดยใช้ JPCalc และปรับรายการให้เข้ากับศักย์ไฟฟ้าของจุดเชื่อมต่อที่คำนวณได้คือ -14 mV การดำเนินการ IV ประกอบด้วยขั้นตอนกระแสไฟฟ้าชุดหนึ่งในขั้นตอน 5-10 pA ตั้งแต่ -50 ถึง 250 pA
เพื่อสร้างโครงสร้างใหม่ของเซลล์ประสาทที่ถูกบีบ ให้เติมไบโอไซติน 0.2% (Sigma-Aldrich) ลงในสารละลายภายใน เซลล์จะถูกเตรียมไว้เป็นเวลาอย่างน้อย 15 นาทีหลังจากการแฮ็ก จากนั้นจึงค่อยๆ ดึงปิเปตเข้าไปเป็นเวลา 1–2 นาที จนกระทั่งเยื่อหุ้มที่ลงทะเบียนไว้ถูกปิดสนิท หลังจากขั้นตอนสรีรวิทยาของส่วนต่างๆ แล้ว ให้ตรึงส่วนต่างๆ ไว้ข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4°C ใน PFA 4% ล้างด้วย PBS X3 และเจือจาง 1:1000 ด้วย DyLight 549 หรือ DyLight 405 ที่จับกับสเตรปตาวิดิน (Vector Labs) เซลล์ที่เต็มไปด้วยไบโอไซติน (2%; Sigma-Aldrich) จะถูกติดฉลากในระหว่างการบันทึกการหนีบแพตช์ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง จากนั้นส่วนต่างๆ จะถูกติดบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์โดยใช้ Aquamount (Thermo Scientific) และมองเห็นได้ในวันถัดไปบนกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Leica TCS SP8 โดยใช้เลนส์จุ่มน้ำมันที่มีรูรับแสงตัวเลข ×40 x 1.3 กำลังขยาย ×0.9–1.0 xy อัตราการสุ่มตัวอย่างอยู่ที่ประมาณ 7 พิกเซลต่อไมครอน จะมีการสุ่มตัวอย่างแบบ Z-stack ที่ระยะห่าง 1 µm ตามลำดับ และทำการสุ่มตัวอย่างแบบ Z-stack และการเย็บอัตโนมัติตาม Leica เพื่อครอบคลุมต้นไม้เดนไดรต์ทั้งหมดของนิวรอนแต่ละตัว จากนั้นติดตามนิวรอนแบบกึ่งแมนนวลโดยใช้อินเทอร์เฟซ neuTube 40 และสร้างไฟล์ SWC จากนั้นอัปโหลดไฟล์ไปยังปลั๊กอิน SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ เวอร์ชัน 2.1.0; NIH)
เนื้อเยื่อคอร์เทกซ์ของมนุษย์ได้รับมาโดยได้รับความยินยอมตามโปรโตคอลที่ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบสถาบันของมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด เนื้อเยื่อหลังคลอดของมนุษย์ 2 ตัวอย่าง (อายุ 3 และ 18 ปี) ได้รับมาโดยการตัดคอร์เทกซ์หน้าผาก (middle frontal gyrus) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการผ่าตัดโรคลมบ้าหมูที่ดื้อยา หลังจากการตัดออกแล้ว ให้เก็บเนื้อเยื่อใน NMDG-aCSF ที่เย็นจัดซึ่งประกอบด้วย: NMDG 92 mM, KCl 2.5 mM, NaH2PO4 1.25 mM, NaHCO3 30 mM, HEPES 20 mM, กลูโคส 25 mM, ไทโอยูเรีย 2 mM, โซเดียมแอสคอร์เบต 5 mM, โซเดียมไพรูเวต 3 mM, CaCl2 4H2O 0.5 mM และ MgSO4 7H2O 10 mM ไทเทรตให้ได้ pH 7.3-7.4 ด้วยกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น เนื้อเยื่อจะถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการภายใน 30 นาที และทำการตัดส่วนโคโรนัลตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ข้างต้น
ขั้นตอนการรักษาสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางการดูแลสัตว์ที่ได้รับการอนุมัติจาก APLAC ของมหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด หนู (อายุมากกว่า 140 วันหลังการปลูกถ่าย) ได้รับการเหนี่ยวนำด้วยยาสลบไอโซฟลูเรน 5% และให้ยาสลบไอโซฟลูเรน 1-3% ระหว่างการผ่าตัด สัตว์จะถูกวางในกรอบสเตอริโอแท็กซิก (Kopf) และฉีดบูพรีนอร์ฟีนออกฤทธิ์ต่อเนื่อง (SR) ใต้ผิวหนัง กะโหลกศีรษะจะถูกเปิดออก ทำความสะอาด และใส่สกรูยึดกระดูก 3-5 ตัว เพื่อกำหนดเป้าหมาย t-hCO เราสร้างพิกัดสเตอริโอแท็กซิกจากภาพ MRI เจาะรูที่ตำแหน่งที่สนใจ และปล่อยเส้นใย (เส้นผ่านศูนย์กลาง 400 µm, NA 0.48, Doric) ลงไป 100 µm ใต้พื้นผิว hCO และยึดกับกะโหลกศีรษะด้วยซีเมนต์ทันตกรรมที่รักษาด้วยแสงยูวี (Relyx)
การบันทึกโฟโตเมตริกด้วยไฟเบอร์ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้42 เพื่อบันทึกกิจกรรมที่เกิดขึ้นเอง หนูถูกวางไว้ในกรงที่สะอาด และสายแพทช์ไฟเบอร์ออปติกเส้นผ่านศูนย์กลาง 400 µm (Doric) ที่เชื่อมต่อกับระบบรับข้อมูลโฟโตเมตริกด้วยไฟเบอร์ออปติกถูกเชื่อมต่อกับสายไฟเบอร์ออปติกที่ฝังไว้ ระหว่างการบันทึกกิจกรรมการเคลื่อนไหวเป็นเวลา 10 นาที สัตว์จะได้รับอิสระในการสำรวจกรง เพื่อบันทึกกิจกรรมที่เกิดขึ้น หนู (มากกว่า 140 วันหลังการปลูกถ่าย) จะถูกวางยาสลบด้วยไอโซฟลูเรน 5% เพื่อเหนี่ยวนำ และไอโซฟลูเรน 1-3% เพื่อการบำรุงรักษา วางสัตว์ไว้ในกรอบสเตอริโอแทกติก (Kopf) และหนวดที่ด้านตรงข้ามของ t-hCO จะถูกตัดให้เหลือประมาณ 2 ซม. และผ่านตาข่ายที่เชื่อมต่อกับตัวกระตุ้นเพียโซอิเล็กทริก (PI) สายแพทช์ไฟเบอร์ออปติก 400 µm (Doric) ถูกเชื่อมต่อกับไฟเบอร์ที่ฝังไว้และเชื่อมต่อกับระบบรับข้อมูล จากนั้นหนวดที่อยู่ฝั่งตรงข้ามของ t-hCO จะถูกเบี่ยงเบน 50 ครั้ง (2 มม. ที่ 20 เฮิรตซ์ 2 วินาทีต่อการนำเสนอ) ในเวลาสุ่มโดยไดรฟ์เพียโซอิเล็กทริกตลอดระยะเวลาการบันทึก 20 นาที ใช้แพ็คเกจสนับสนุน Arduino MATLAB เพื่อควบคุมเวลาการเบี่ยงเบนด้วยโค้ด MATLAB ที่กำหนดเอง เหตุการณ์จะซิงโครไนซ์กับซอฟต์แวร์การรวบรวมข้อมูลโดยใช้พัลส์ทรานซิสเตอร์-ทรานซิสเตอร์ลอจิก (TTL)
หนู (อายุมากกว่า 140 วันหลังการปลูกถ่าย) ถูกเหนี่ยวนำด้วยยาสลบไอโซฟลูเรน 5% และให้ยาสลบไอโซฟลูเรน 1-3% ระหว่างผ่าตัด สัตว์ถูกวางไว้ในกรอบสเตอริโอแท็กซิก (Kopf) และฉีดบูพรีนอร์ฟีน SR และเดกซาเมทาโซนใต้ผิวหนัง กะโหลกศีรษะถูกเปิดออก ทำความสะอาด และใส่สกรูยึดกระดูก 3-5 ตัว เพื่อกำหนดเป้าหมาย t-hCO เราสร้างพิกัดสเตอริโอแท็กซิกจากภาพ MRI การเปิดกระโหลกศีรษะแบบวงกลม (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 ซม.) ดำเนินการโดยใช้สว่านความเร็วสูงโดยตรงเหนือ hCO ที่ปลูกถ่าย เมื่อกระดูกบางที่สุดเท่าที่จะทำได้ แต่ก่อนจะเจาะทะลุกระดูกทั้งหมด ให้ใช้คีมคีบเพื่อเอาหมอนรองกระดูกเชิงกรานที่ยังสมบูรณ์ที่เหลือออกเพื่อเผยให้เห็น t-hCO ที่อยู่ด้านล่าง โพรงกะโหลกศีรษะถูกเติมด้วยน้ำเกลือปราศจากเชื้อ จากนั้นจึงติดแผ่นปิดและหมุดหัวพิเศษเข้ากับกะโหลกศีรษะด้วยซีเมนต์ทางทันตกรรมที่บ่มด้วยแสง UV (Relyx)
การถ่ายภาพสองโฟตอนดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์หลายโฟตอนของ Bruker พร้อมเลนส์วัตถุประสงค์ Nikon LWD (×16, 0.8 NA) การถ่ายภาพ GCaMP6 ดำเนินการที่ 920 นาโนเมตรด้วยกำลังขยายระนาบ z เดี่ยว 1.4 เท่าและค่าเฉลี่ย 8 เท่าของ 7.5 fps หนูถูกเหนี่ยวนำด้วยยาสลบไอโซฟลูเรน 5% และรักษาด้วยไอโซฟลูเรน 1-3% หนูถูกวางไว้ในอุปกรณ์หัวที่ทำขึ้นเป็นพิเศษและวางไว้ใต้เลนส์ บันทึกกิจกรรมการเคลื่อนไหวพื้นหลังเป็นเวลา 3 นาที ตลอดระยะเวลาการบันทึก 20 นาที พัฟ 50 อัน (แต่ละพัฟยาว 100 มิลลิวินาที) ถูกส่งแบบสุ่มไปยังแผ่นหนวดที่อยู่ตรงข้ามกับ t-hCO โดยใช้เครื่องสแกนแบบพิโคสไพรเซอร์ ใช้แพ็คเกจสนับสนุน Arduino MATLAB เพื่อควบคุมเวลาการถ่ายแบบด้วยโค้ด MATLAB ที่กำหนดเอง ซิงโครไนซ์เหตุการณ์ด้วยซอฟต์แวร์รวบรวมข้อมูล (PrairieView 5.5) โดยใช้พัลส์ TTL สำหรับการวิเคราะห์ ภาพได้รับการแก้ไขสำหรับการเคลื่อนที่ xy โดยใช้การแก้ไขแบบ affine ในโปรแกรม MoCo ที่เปิดตัวในฟิจิ การสกัดร่องรอยเรืองแสงจากเซลล์แต่ละเซลล์โดยใช้ CNMF-E43 การสกัดฟลูออเรสเซนต์สำหรับแต่ละภูมิภาคที่สนใจ แปลงเป็นเส้นโค้ง dF/F จากนั้นแปลงเป็นคะแนน z
หนู (อายุมากกว่า 140 วันหลังการปลูกถ่าย) ถูกเหนี่ยวนำด้วยยาสลบไอโซฟลูเรน 5% และให้ยาสลบไอโซฟลูเรน 1-3% ระหว่างผ่าตัด วางสัตว์ในกรอบสเตอริโอแท็กซิก (Kopf) แล้วฉีดบูพรีนอร์ฟีน SR และเดกซาเมทาโซนใต้ผิวหนัง หนวดที่อยู่ด้านตรงข้ามของ t-hCO ถูกตัดให้เหลือประมาณ 2 ซม. แล้วสอดผ่านตาข่ายที่เชื่อมต่อกับตัวกระตุ้นเพียโซอิเล็กทริก กะโหลกศีรษะถูกเปิดออกและทำความสะอาด สกรูกราวด์สเตนเลสสตีลติดอยู่กับกะโหลกศีรษะ เพื่อกำหนดเป้าหมาย t-hCO เราสร้างพิกัดสเตอริโอแท็กซิกจากภาพ MRI ทำการเปิดกระโหลกศีรษะแบบวงกลม (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1 ซม.) โดยใช้สว่านความเร็วสูงเหนือ t-hCO เล็กน้อย เมื่อกระดูกบางที่สุดเท่าที่จะทำได้ แต่ก่อนจะเจาะทะลุกระดูกทั้งหมด ให้ใช้คีมคีบเพื่อเอาหมอนรองกระดูกเชิงกรานที่ยังสมบูรณ์ที่เหลือออกเพื่อเผยให้เห็น t-hCO ที่อยู่ด้านล่าง บันทึกเซลล์แต่ละเซลล์โดยใช้โพรบซิลิกอนความหนาแน่นสูง 32 ช่องหรือ 64 ช่อง (Cambridge Neurotech) ที่ต่อสายดินเข้ากับสกรู และขยายสัญญาณล่วงหน้าด้วยเครื่องขยายสัญญาณ RHD (Intan) ใช้เครื่องควบคุมเพื่อลดอิเล็กโทรดลงสู่ตำแหน่งเป้าหมายผ่านการเปิดกระโหลกศีรษะ ซึ่งเติมน้ำเกลือปราศจากเชื้อ การรวบรวมข้อมูลดำเนินการที่ความถี่ 30 kHz โดยใช้ระบบรับข้อมูล Open Ephys การบันทึกจะดำเนินต่อไปเมื่อเราตรวจพบกิจกรรมที่เกิดขึ้นเองตามจังหวะที่มีความสัมพันธ์กันอย่างมากในช่องมากกว่า 10 ช่อง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอิเล็กโทรดตั้งอยู่ในกราฟต์ (โดยอิงจากข้อมูลการถ่ายภาพแคลเซียมสองโฟตอน) ได้มีการบันทึกกิจกรรมการเคลื่อนไหวพื้นหลังเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นหนวดที่ด้านตรงข้ามของ t-hCO จะถูกเบี่ยงเบน 50 ครั้ง (2 มม. ที่ 20 เฮิรตซ์ 2 วินาทีต่อการนำเสนอ) ในเวลาสุ่มโดยใช้ไดรฟ์เพียโซอิเล็กทริกตลอดระยะเวลาการบันทึก 20 นาที การใช้แพ็คเกจสนับสนุน MATLAB สำหรับ Arduino (MATLAB 2019b) ควบคุมเวลาการเบี่ยงเบนด้วยโค้ด MATLAB ที่กำหนดเอง ใช้พัลส์ TTL เพื่อซิงโครไนซ์เหตุการณ์กับซอฟต์แวร์รวบรวมข้อมูล
สำหรับการทดลองทำเครื่องหมายด้วยแสง สายแพทช์ออปติกขนาด 200 µm (Doric) ที่เชื่อมต่อกับเลเซอร์ 473 นาโนเมตร (Omicron) ถูกเชื่อมต่อกับใยแก้วนำแสงขนาด 200 µm ที่วางอยู่เหนือกระโหลกศีรษะ ก่อนหน้านั้น ให้ปรับกำลังจัมเปอร์เป็น 20 mW ใช้ตัวควบคุมเพื่อลดอิเล็กโทรดลงสู่ตำแหน่งเป้าหมายผ่านกระโหลกศีรษะซึ่งเติมน้ำเกลือปราศจากเชื้อไว้ ในช่วงเริ่มต้นของการบันทึก จะมีการปล่อยพัลส์แสง 10 พัลส์ขนาด 473 นาโนเมตร (ความถี่ 2 เฮิรตซ์ ระยะเวลาของพัลส์ 10 มิลลิวินาที) เซลล์ที่ไวต่อแสงจะถูกกำหนดให้เป็นเซลล์ที่แสดงการตอบสนองแบบสไปก์ภายใน 10 มิลลิวินาทีของแสงใน 70% หรือมากกว่าของการทดลอง