Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు పరిమిత CSS మద్దతు ఉన్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌ను ఉపయోగిస్తున్నారు. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను నిలిపివేయండి). అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను చూపుతాము.
ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల కారౌసెల్‌ను ప్రదర్శిస్తుంది. ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా కదలడానికి మునుపటి మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా కదలడానికి చివర ఉన్న స్లయిడర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.
స్వీయ-సమీకరణ నాడీ అవయవాలు మానవ అభివృద్ధి మరియు వ్యాధిని మోడలింగ్ చేయడానికి ఒక ఆశాజనకమైన ఇన్ విట్రో ప్లాట్‌ఫామ్‌ను సూచిస్తాయి. అయితే, ఆర్గానాయిడ్‌లకు వివోలో ఉన్న కనెక్టివిటీ లేదు, ఇది పరిపక్వతను పరిమితం చేస్తుంది మరియు ప్రవర్తనను నియంత్రించే ఇతర సర్క్యూట్‌లతో ఏకీకరణను నిరోధిస్తుంది. నియోనాటల్ న్యూడ్ ఎలుకల సోమాటోసెన్సరీ కార్టెక్స్‌లోకి మార్పిడి చేయబడిన మానవ స్టెమ్ సెల్-ఉత్పన్న కార్టికల్ ఆర్గానాయిడ్‌లు ఇంద్రియ మరియు ప్రేరణ-సంబంధిత సర్క్యూట్‌లలో కలిసిపోయే పరిణతి చెందిన కణ రకాలను అభివృద్ధి చేస్తాయని ఇక్కడ మేము చూపిస్తున్నాము. MRI అనేక స్టెమ్ సెల్ లైన్లు మరియు జంతువులలో పోస్ట్-ట్రాన్స్‌ప్లాంట్ ఆర్గానాయిడ్ పెరుగుదలను వెల్లడించింది, అయితే సింగిల్-కోర్ విశ్లేషణ కార్టికోజెనిసిస్ యొక్క పురోగతిని మరియు కార్యాచరణ-ఆధారిత ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రోగ్రామ్ యొక్క ఆవిర్భావాన్ని వెల్లడించింది. నిజానికి, మార్పిడి చేయబడిన కార్టికల్ న్యూరాన్లు వాటి ఇన్ విట్రో ప్రతిరూపాల కంటే సంక్లిష్టమైన పదనిర్మాణ, సినాప్టిక్ మరియు అంతర్గత పొర లక్షణాలను ప్రదర్శిస్తాయి, ఇది తిమోతి సిండ్రోమ్ ఉన్న రోగులలో న్యూరోనల్ లోపాలను గుర్తించడానికి అనుమతిస్తుంది. మార్పిడి చేయబడిన ఆర్గానెల్లు థాలమోకార్టికల్ మరియు కార్టికోకార్టికల్ ఇన్‌పుట్‌లను స్వీకరిస్తాయని శరీర నిర్మాణ సంబంధమైన మరియు క్రియాత్మక ట్రేసింగ్ చూపించింది మరియు నాడీ కార్యకలాపాల యొక్క వివో రికార్డింగ్‌లు ఈ ఇన్‌పుట్‌లు మానవ కణాలలో ఇంద్రియ ప్రతిస్పందనలను ఉత్పత్తి చేయగలవని సూచిస్తున్నాయి. చివరగా, కార్టికల్ ఆర్గానాయిడ్‌లు ఎలుక మెదడు అంతటా ఆక్సాన్‌లను విస్తరిస్తాయి మరియు వాటి ఆప్టోజెనెటిక్ క్రియాశీలత బహుమతి-కోరే ప్రవర్తనకు దారితీస్తుంది. అందువల్ల, మార్పిడి చేయబడిన మానవ కార్టెక్స్ న్యూరాన్లు పరిపక్వం చెందుతాయి మరియు ప్రవర్తనను నియంత్రించే హోస్ట్ యొక్క సర్క్యూట్లలో పాల్గొంటాయి. ఈ విధానం రోగి-ఉత్పన్న కణాలలో ఇతర మార్గాల ద్వారా గుర్తించలేని స్ట్రాండ్-స్థాయి ఫినోటైప్‌లను గుర్తించడం సులభతరం చేస్తుందని మేము ఆశిస్తున్నాము.
అభివృద్ధి చెందుతున్న మానవ మెదడు అనేది ఒక అద్భుతమైన స్వీయ-వ్యవస్థీకరణ ప్రక్రియ, దీనిలో కణాలు విస్తరించడం, భేదం, వలసపోవడం మరియు అనుసంధానించడం ద్వారా క్రియాత్మక న్యూరానల్ సర్క్యూట్‌లను ఏర్పరుస్తాయి, ఇవి ఇంద్రియ అనుభవం ద్వారా మరింత మెరుగుపరచబడతాయి. మానవ మెదడు అభివృద్ధిని అర్థం చేసుకోవడంలో, ముఖ్యంగా వ్యాధి సందర్భంలో, ఒక ముఖ్యమైన సమస్య ఏమిటంటే, మెదడు కణజాలానికి ప్రాప్యత లేకపోవడం. మానవ కార్టెక్స్ ఆర్గానోయిడ్స్ (hCO; హ్యూమన్ కార్టెక్స్ స్పియర్ అని కూడా పిలుస్తారు)తో సహా స్వీయ-వ్యవస్థీకరణ అవయవాలు 2,3,4,5,6 ఉత్పత్తి చేయగలవు. అయితే, అనేక పరిమితులు నాడీ సర్క్యూట్‌ల అభివృద్ధి మరియు పనితీరును అర్థం చేసుకోవడానికి వాటి విస్తృత అనువర్తనాన్ని పరిమితం చేస్తాయి. ముఖ్యంగా, వివోలో కొన్ని సూక్ష్మ పర్యావరణ మరియు ఇంద్రియ ఇన్‌పుట్‌లు లేకపోవడం వల్ల hCO పరిపక్వత పరిమితం చేయబడిందా అనేది అస్పష్టంగా ఉంది. అదనంగా, ప్రవర్తనా ఫలితాలను ఉత్పత్తి చేయగల సర్క్యూట్‌లలో hCOలు విలీనం చేయబడనందున, జన్యుపరంగా సంక్లిష్టమైన మరియు ప్రవర్తనా న్యూరోసైకియాట్రిక్ రుగ్మతలను మోడలింగ్ చేయడంలో వాటి ప్రయోజనం ప్రస్తుతం పరిమితం.
hCO ను చెక్కుచెదరకుండా జీవించే మెదడులోకి మార్పిడి చేయడం ద్వారా ఈ పరిమితులను అధిగమించవచ్చు. ఎలుకల కార్టెక్స్‌లోకి మార్పిడి చేయబడిన మానవ న్యూరాన్లు ఎలుకల కణాలతో మనుగడ సాగించగలవని, ప్రొజెక్ట్ చేయగలవని మరియు సంభాషించగలవని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి7,8,9,10,11,12. అయితే, ఈ ప్రయోగాలు సాధారణంగా వయోజన జంతువులపై నిర్వహించబడతాయి, ఇవి సినాప్టిక్ మరియు అక్షసంబంధ ఏకీకరణను పరిమితం చేయవచ్చు. ఇక్కడ, మేము hiPS కణాల నుండి తీసుకోబడిన 3D hCO ను ప్లాస్టిక్ అభివృద్ధి ప్రారంభ దశలో రోగనిరోధక శక్తి లేని ఎలుకల ప్రాథమిక సోమాటోసెన్సరీ కార్టెక్స్ (S1) లోకి మార్పిడి చేసిన మార్పిడి నమూనాను వివరిస్తాము. మార్పిడి చేయబడిన hCO (t-hCO) న్యూరాన్లు గణనీయమైన పరిపక్వతకు లోనవుతాయి, ఇంద్రియ ప్రతిస్పందనలను పొందే థాలమోకార్టికల్ మరియు కార్టికల్-కార్టికల్ ఇన్‌పుట్‌లను అందుకుంటాయి మరియు బహుమతిని కోరుకునే ప్రవర్తనను నడపడానికి ఎలుక మెదడులోకి అక్షసంబంధ అంచనాలను విస్తరిస్తాయి. t-hCO యొక్క విస్తరించిన పరిపక్వత తిమోతీ సిండ్రోమ్ (TS) ఉన్న రోగులలో న్యూరోనల్ లోపాలను వెల్లడించింది, ఇది వోల్టేజ్-సెన్సిటివ్ L-రకం CaV1.2 కాల్షియం ఛానల్ (CACNA1C ద్వారా ఎన్కోడ్ చేయబడింది)లో ఉత్పరివర్తనాల వల్ల కలిగే తీవ్రమైన జన్యు రుగ్మత.
ఇన్ వివో సర్క్యూట్లలో మానవ కార్టికల్ న్యూరాన్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి, మేము స్టీరియోటాక్టికల్‌గా చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న 3D hCO ని ప్రారంభ ప్రసవానంతర అథైమిక్ ఎలుకల S1 లోకి (ప్రసవానంతర 3-7 రోజులు) మార్పిడి చేసాము (Fig. 1a మరియు Fig. 1a-c యొక్క విస్తరించిన డేటా). ఈ సమయంలో, థాలమోకార్టికల్ మరియు కార్టికోకార్టికల్ అక్షసంబంధ అంచనాలు ఇంకా వాటి S1 ఆవిష్కరణను పూర్తి చేయలేదు (ref. 13). అందువల్ల, ఈ విధానం ఎండోజెనస్ సర్క్యూట్‌లపై ప్రభావాన్ని తగ్గించేటప్పుడు t-hCO ఏకీకరణను పెంచడానికి రూపొందించబడింది. ప్రత్యక్ష జంతువులలో t-hCO స్థానాన్ని దృశ్యమానం చేయడానికి, మార్పిడి తర్వాత 2-3 నెలల తర్వాత ఎలుకల T2-బరువు గల MRI మెదడు పునర్నిర్మాణాలను మేము నిర్వహించాము (Fig. 1b మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 1d). t-hCO ని సులభంగా గమనించారు మరియు t-hCO యొక్క వాల్యూమ్ కొలతలు స్థిర ముక్కల నుండి లెక్కించిన వాటికి సమానంగా ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO ని సులభంగా గమనించారు మరియు t-hCO యొక్క వాల్యూమ్ కొలతలు స్థిర ముక్కల నుండి లెక్కించిన వాటికి సమానంగా ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO లెగ్కో నాబ్ల్యూడాలిస్, ఒక అద్భుతమైన t-hCO బైలీ అనాలాగైచ్న్ రస్చిటానిమ్ డిల్య ఫ్రాన్సెన్స్ (సాంకేతిక విజ్ఞానం данные, 1d, e; 0,05). t-hCO సులభంగా గమనించబడ్డాయి మరియు వాల్యూమెట్రిక్ t-hCO కొలతలు స్థిర విభాగాల కోసం లెక్కించిన వాటికి సమానంగా ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO లెగ్కో నాబ్ల్యూడల్సియా, ఎ ఒబెడ్యుమేన్ ఇజ్మెరేనియ t-hCO బైలీ అనలాగ్‌ని రస్చిటానిమ్ డ్లియా ఫ్రిక్సిరోవానియమ్ данные, 1d, e; 0,05). t-hCO సులభంగా గమనించబడింది మరియు వాల్యూమెట్రిక్ t-hCO కొలతలు స్థిర విభాగాల కోసం లెక్కించిన వాటికి సమానంగా ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 1d, e; P > 0.05).మార్పిడి తర్వాత దాదాపు 2 నెలల తర్వాత మార్పిడి చేయబడిన 81% జంతువులలో మేము t-hCO ని నిర్ణయించాము (n = 72 జంతువులు; 10 hiPS సెల్ లైన్ల నుండి hCO; అనుబంధ పట్టిక 1 లోని hiPS సెల్ లైన్లు). వీటిలో, 87% సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లో ఉన్నాయి (Fig. 1c). ఒకే మార్పిడి చేయబడిన ఎలుకలో బహుళ సమయ బిందువులలో సీరియల్ MRI స్కాన్‌లను నిర్వహించడం ద్వారా, 3 నెలల్లోపు t-hCO వాల్యూమ్‌లో తొమ్మిది రెట్లు పెరుగుదలను మేము కనుగొన్నాము (Fig. 1d మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 1f). మార్పిడి చేయబడిన జంతువులు మార్పిడి తర్వాత 12 నెలల్లో అధిక మనుగడ రేటు (74%) కలిగి ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 1g మరియు అనుబంధ పట్టిక 2), మరియు స్పష్టమైన మోటారు లేదా జ్ఞాపకశక్తి లోపాలు, గ్లియోసిస్ లేదా ఎలక్ట్రోఎన్సెఫలోగ్రామ్ (EEG) కనుగొనబడలేదు. డేటా Fig. 1g మరియు అనుబంధ పట్టిక 2). 1h–m మరియు 3e).
a, ప్రయోగాత్మక రూపకల్పన యొక్క స్కీమాటిక్. hiPS కణాల నుండి తీసుకోబడిన hCO ను భేదం యొక్క 30-60 రోజులలో నవజాత నగ్న ఎలుకల S1 లోకి మార్పిడి చేశారు. b, మార్పిడి తర్వాత 2 నెలల తర్వాత S1 లో t-hCO ను చూపించే T2-వెయిటెడ్ కరోనల్ మరియు క్షితిజ సమాంతర MRI చిత్రాలు. స్కేల్ బార్, 2 mm. c, ప్రతి hiPS సెల్ లైన్ కోసం చూపబడిన ఎన్‌గ్రాఫ్ట్‌మెంట్ విజయ రేట్ల పరిమాణీకరణ (n = 108, బార్‌లలోని సంఖ్యలు hIPS సెల్ లైన్‌కు t-hCO మొత్తాన్ని సూచిస్తాయి) మరియు కార్టికల్ లేదా సబ్‌కార్టికల్ స్థానం (n = 88). d, కొరోనరీ ఆర్టరీ యొక్క MRI చిత్రం (ఎడమ; స్కేల్ బార్, 3 mm) మరియు సంబంధిత 3D వాల్యూమెట్రిక్ పునర్నిర్మాణం (స్కేల్ బార్, 3 mm) 3 నెలల్లో t-hCO పెరుగుదలను చూపుతుంది. e, ఎలుక సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లో t-hCO నమూనాల సమీక్ష. స్కేల్ బార్, 1 mm. f, t-hCO యొక్క ప్రతినిధి ఇమ్యునోసైటోకెమికల్ చిత్రాలు పై నుండి ఎడమకు కుడికి చూపబడ్డాయి (భేదం సమయంలో): PPP1R17 (4 నెలల వయస్సు), NeuN (8 నెలల వయస్సు), SOX9 మరియు GFAP (8 నెలల వయస్సు), PDGFRα; (8 నెలలు), MAP2 (8 నెలలు) మరియు IBA1 (8 నెలలు). స్కేల్ బార్, 20 µm. HNA యొక్క సహ-వ్యక్తీకరణ మానవ మూలం యొక్క కణాలను సూచిస్తుంది. g, snRNA-seq: సీరాట్ ఇంటిగ్రేషన్ తర్వాత అన్ని అధిక-నాణ్యత t-hCO న్యూక్లియీల యొక్క యూనిఫైడ్ మానిఫోల్డ్ మరియు ప్రొజెక్షన్ (UMAP) డైమెన్షియాలిటీ తగ్గింపు ఇమేజింగ్ (n=3 t-hCO నమూనాలు, n=2 hiPS సెల్ లైన్లు). ఆస్ట్రోసైట్లు, ఆస్ట్రోసైట్ లైన్ యొక్క కణాలు; సైక్ ప్రోగ్, సర్క్యులేటింగ్ ప్రొజెనిటర్లు; గ్లూఎన్ డిఎల్, డీప్ గ్లుటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు; గ్లూఎన్ డిఎల్/ఎస్పి, డీప్ మరియు సబ్‌లామెల్లార్ గ్లుటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు; గ్లూఎన్ యుఎల్, పై పొర గ్లుటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు; ఒలిగోడెండ్రోసైట్లు, ఒలిగోడెండ్రోసైట్లు; OPC, ఒలిగోడెండ్రోసైట్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు; RELN, రీలిన్ న్యూరాన్లు. h, hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో గణనీయంగా అప్‌గ్రూటెడ్ (సర్దుబాటు చేయబడిన P < 0.05, రెట్లు మార్పు > 2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరించబడిన) జన్యువుల జీన్ ఆంటాలజీ (GO) టర్మ్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ. h, hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో గణనీయంగా అప్‌గ్రూటెడ్ (సర్దుబాటు చేయబడిన P < 0.05, రెట్లు మార్పు > 2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరించబడిన) జన్యువుల జీన్ ఆంటాలజీ (GO) టర్మ్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ. h, అనాలిజ్ ఒబోగాషెనియ టెర్మినోవ్ జీన్ ఒంటాలజీ (GO) నుండి గెనోవ్ నుండి ప్రముఖ ఆక్టివియేట్ (స్కోర్‌క్ట్రిక్, పోస్ట్ <0, ఇజ్మేనియ > 2, 10% కంటే ఎక్కువ సమయం) glutamatergicheskimy NEIRONAMI hCO. h, hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో గణనీయమైన క్రియాశీలత (సర్దుబాటు చేయబడిన P<0.05, మడత మార్పు >2, కనీసం 10% కేంద్రకాలలో వ్యక్తీకరణ) కలిగిన జన్యువులకు జీన్ ఆంటాలజీ (GO) టర్మ్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整喕, 嘍后P 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （ 后 . 2的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geny genitechelno aktivizirovalisь (స్కోర్రెక్టిరోవాన్ P <0,05, kratnostь изменения> 2, Мекспресировет 10% యాడర్) గ్లుటామాటెర్గిచెస్కిక్ నైరోనాహ్ టి-హెచ్‌సిఓ పో స్రావ్‌నెనియు నుండి గ్లుటామాటెర్గిచెస్కిమి నైరోనామి హెచ్‌సిఓ (గోన్టో) టెర్మినా ఒబోగాషెనియా. h, hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో జన్యువులు గణనీయంగా నియంత్రించబడ్డాయి (సర్దుబాటు చేయబడిన P < 0.05, రెట్లు మార్పు > 2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరించబడింది). సుసంపన్నత పదం యొక్క ఒంటాలజికల్ (GO) విశ్లేషణ.చుక్కల రేఖ 0.05 యొక్క aq విలువను సూచిస్తుంది. i, రిఫరెన్స్ 22 snRNA-seq అడల్ట్ మోటార్ కార్టెక్స్ డేటాసెట్ నుండి లేబుల్ బదిలీని ఉపయోగించి t-hCO లోని GluN సెల్ రకాల UMAP ఇమేజింగ్. CT — కార్టికోథాలమిక్ కణాలు, ET — ఎక్స్‌ట్రాసెరెబ్రల్ కణాలు, IT — అంతర్గత టెలెన్సెఫాలిక్ కణాలు, NP — ప్రొజెక్షన్ దగ్గర.
తరువాత మేము t-hCO యొక్క సైటోఆర్కిటెక్చర్ మరియు మొత్తం సెల్యులార్ కూర్పును అంచనా వేసాము. ఎలుక ఎండోథెలియల్ కణాల యాంటీబాడీ స్టెయినింగ్ t-hCO తో వాస్కులరైజేషన్‌ను వెల్లడించింది, అయితే IBA1 స్టెయినింగ్ గ్రాఫ్ట్ అంతటా ఎలుక మైక్రోగ్లియా ఉనికిని వెల్లడించింది (Fig. 1f మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 3c,d). ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ మానవ న్యూక్లియర్ యాంటిజెన్ (HNA) పాజిటివ్ కణాలను PPP1R17 (కార్టికల్ ప్రొజెనిటర్లు), NeuN (న్యూరాన్లు), SOX9 మరియు GFAP (గ్లియల్-ఉత్పన్న కణాలు) లేదా PDGFRα (ఒలిగోడెండ్రోసైట్ ప్రొజెనిటర్లు) సహ-వ్యక్తీకరించడాన్ని వెల్లడించింది (Fig. 1f). సింగిల్ సెల్ రిజల్యూషన్ వద్ద t-hCO యొక్క సెల్యులార్ కూర్పును అధ్యయనం చేయడానికి, మేము సుమారు 8 నెలల భేదం తర్వాత సింగిల్-కోర్ RNA సీక్వెన్సింగ్ (snRNA-seq)ని నిర్వహించాము. ఎలుక కేంద్రకాల యొక్క బల్క్ వడపోత మరియు తొలగింపు 21,500 అధిక-నాణ్యత మానవ మోనోన్యూక్లియర్ మ్యాప్‌లను అందించింది (Fig. 1g మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 4a,b). సాధారణ కణ-రకం మార్కర్ల యొక్క వ్యక్తీకరణ నమూనాలు ప్రధాన కార్టికల్ కణ తరగతుల సమూహాలను గుర్తించాయి, వీటిలో లోతైన మరియు ఉపరితల గ్లుటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు, ప్రసరణ పూర్వీకులు, ఒలిగోడెండ్రోసైట్లు మరియు ఆస్ట్రోసైట్ వంశం (Fig. 1g, విస్తరించిన డేటా, Fig. 4c, మరియు అనుబంధ పట్టిక 3) ఉన్నాయి. SATB2 మరియు CTIP2 కోసం ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కార్టికల్ ఉప రకాలు ఉన్నప్పటికీ, t-hCO స్పష్టమైన శరీర నిర్మాణ సంబంధమైన స్తరీకరణను చూపించలేదని చూపించింది (విస్తరించిన డేటా, Fig. 3a). దశ-సరిపోలిన snRNA-seq hCO ఒలిగోడెండ్రోసైట్లు లేకపోవడం మరియు GABAergic న్యూరాన్ల ఉనికితో సహా కొన్ని మినహాయింపులతో విస్తృతంగా సారూప్య కణ తరగతులను ఉత్పత్తి చేసింది, ఇది పార్శ్వ పూర్వీకుల కణాలకు గతంలో నివేదించబడిన అనుకూలమైన ఇన్ విట్రో పరిస్థితులను ప్రతిబింబిస్తుంది15 (విస్తరించిన డేటా, Fig. 4f - i మరియు అనుబంధ పట్టిక 4). సినాప్టిక్ సిగ్నలింగ్, డెన్డ్రిటిక్ లోకలైజేషన్ మరియు వోల్టేజ్-గేటెడ్ ఛానల్ యాక్టివిటీ వంటి న్యూరాన్ పరిపక్వతతో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల సెట్‌ల క్రియాశీలతతో సహా t-hCO మరియు hCO మధ్య గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో డిఫరెన్షియల్ జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ గణనీయమైన తేడాలను వెల్లడించింది (అనుబంధ పట్టిక 5). పట్టిక 6). దీని ప్రకారం, కార్టికల్ గ్లూటామాటర్జిక్ t-hCO న్యూరాన్లు వేగవంతమైన ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ పరిపక్వతను ప్రదర్శించాయి.
t-hCO లోని ఈ ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మార్పులు hCO ఇన్ విట్రో మరియు t-hCO ఇన్ వివో మధ్య పదనిర్మాణ వ్యత్యాసాలకు సంబంధించినవో కాదో వివరించడానికి, 7-8 నెలల భేదం తర్వాత తీవ్రమైన విభాగాలలో దశ-సరిపోలిన బయోసైటిన్-నిండిన hCO మరియు hCO లను పునర్నిర్మించాము. hCO న్యూరాన్లు (Fig. 2a). t-hCO న్యూరాన్లు గణనీయంగా పెద్దవిగా ఉన్నాయి, సోమా వ్యాసం కంటే 1.5 రెట్లు, డెండ్రైట్‌లు రెండింతలు మరియు ఇన్ విట్రో hCO (Fig. 2b) తో పోలిస్తే మొత్తం డెన్డ్రిటిక్ పొడవులో మొత్తం ఆరు రెట్లు పెరుగుదలను కలిగి ఉన్నాయి. అదనంగా, hCO న్యూరాన్‌ల కంటే t-hCO న్యూరాన్‌లలో డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్‌ల సాంద్రత గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని మేము గమనించాము (Fig. 2c). ఇది t-hCO న్యూరాన్‌లు విస్తృతమైన డెన్డ్రిటిక్ పొడుగు మరియు శాఖలకు లోనవుతాయని సూచిస్తుంది, ఇది నిరంతర కణ విస్తరణతో కలిపి, మార్పిడి తర్వాత t-hCO యొక్క ఇంటెన్సివ్ పెరుగుదలకు దోహదం చేస్తుంది (Fig. 1d మరియు విస్తరించిన డేటా Fig. 1f). ఇది ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ లక్షణాలను పరిశోధించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది. మెంబ్రేన్ కెపాసిటెన్స్ ఎనిమిది రెట్లు ఎక్కువగా ఉంది (విస్తరించిన డేటా, Fig. 8d), విశ్రాంతి-స్థితి పొర సంభావ్యత మరింత హైపర్‌పోలరైజ్ చేయబడింది (సుమారు 20 mV), మరియు కరెంట్ ఇంజెక్షన్ hCO న్యూరాన్‌ల కంటే t-hCO న్యూరాన్‌లలో అధిక గరిష్ట ఉత్తేజిత రేటును ప్రేరేపించింది. ఇన్ విట్రో (Fig. 2d), e), ఇది t-hCO యొక్క పెద్ద మరియు సంక్లిష్టమైన పదనిర్మాణ లక్షణాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. అదనంగా, t-hCO న్యూరాన్‌లలో స్పాంటేనియస్ ఎక్సైటేటరీ పోస్ట్‌నాప్టిక్ కరెంట్ ఈవెంట్స్ (EPSC) యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంది (Fig. 2f), t-hCO న్యూరాన్‌లలో గమనించిన డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్‌ల పెరిగిన సాంద్రత ఫంక్షనల్ ఎక్సైటిబిలిటీతో సంబంధం కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది. లైంగిక సినాప్స్. లేబుల్ చేయబడిన గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లను రికార్డ్ చేయడం ద్వారా మేము hCO న్యూరాన్‌ల అపరిపక్వ లక్షణాన్ని ఇన్ విట్రోలో నిర్ధారించాము (విస్తరించిన డేటా, Fig. 6a-c).
a, 8 నెలల భేదం తర్వాత బయోసైటిన్ నిండిన hCO మరియు t-hCO న్యూరాన్‌ల 3D పునర్నిర్మాణం. b, పదనిర్మాణ లక్షణాల పరిమాణీకరణ (n = 8 hCO న్యూరాన్లు, n = 6 t-hCO న్యూరాన్లు; **P = 0.0084, *P = 0.0179 మరియు ***P < 0.0001). b, పదనిర్మాణ లక్షణాల పరిమాణీకరణ (n = 8 hCO న్యూరాన్లు, n = 6 t-hCO న్యూరాన్లు; **P = 0.0084, *P = 0.0179 మరియు ***P < 0.0001). బి, కోలిచెస్ట్‌వెన్నాయ ఒషెంకా మార్ఫోలాగ్ ప్రిజ్నాకోవ్ (n = 8 నైరోనోవ్ హెచ్‌సిఓ, n = 6 న్యూరోనోవ్ టి-హెచ్‌సిఓ; ** పి = 0, 90 = 80, * 0,0 <0,0001). b, పదనిర్మాణ లక్షణాల పరిమాణీకరణ (n=8 hCO న్యూరాన్లు, n=6 t-hCO న్యూరాన్లు; **P=0.0084, *P=0.0179, మరియు ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 బి, కోలిచెస్ట్‌వెన్నాయ ఒషెంకా మార్ఫోలాగ్ ప్రిజ్నాకోవ్ (n = 8 నైరోనోవ్ హెచ్‌సిఓ, n = 6 న్యూరోనోవ్ టి-హెచ్‌సిఓ; ** పి = 0, 90 = 80, * 0,0 <0,0001). b, పదనిర్మాణ లక్షణాల పరిమాణీకరణ (n=8 hCO న్యూరాన్లు, n=6 t-hCO న్యూరాన్లు; **P=0.0084, *P=0.0179, మరియు ***P<0.0001).c, 8 నెలల భేదం తర్వాత hCO మరియు t-hCO డెన్డ్రిటిక్ శాఖల 3D పునర్నిర్మాణం. ఎరుపు నక్షత్రాలు పుటేటివ్ డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్‌లను సూచిస్తాయి. డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్ డెన్సిటీ క్వాంటిఫికేషన్ (n = 8 hCO న్యూరాన్లు, n = 6 t-hCO న్యూరాన్లు; **P = 0.0092). d, విశ్రాంతి పొర సంభావ్యత యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). d, విశ్రాంతి పొర సంభావ్యత యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). d, కోలిచెస్ట్‌వెన్నయా ఒషెంకా మెంబ్రానోగో పోటెన్షియల్ పోకోయా (n = 25 नेयरोनाव hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10) d, విశ్రాంతి పొర సంభావ్య పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, కోలిచెస్ట్‌వెన్నయా ఒషెంకా మెంబ్రానోగో పోటెన్షియల్ పోకోయా (n = 25 नेयरोनाव hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10) d, విశ్రాంతి పొర సంభావ్య పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). e, hCO మరియు t-hCO లలో పునరావృత చర్య సంభావ్య కాల్పులు, పెరుగుతున్న కరెంట్ ఇంజెక్షన్ల ద్వారా ప్రేరేపించబడతాయి మరియు గరిష్ట కాల్పుల రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). e, hCO మరియు t-hCO లలో పునరావృత చర్య సంభావ్య కాల్పులు, పెరుగుతున్న కరెంట్ ఇంజెక్షన్ల ద్వారా ప్రేరేపించబడతాయి మరియు గరిష్ట కాల్పుల రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P < 0.0001). ఇ, హెచ్‌సిఓ మరియు టి-హెచ్‌సిఓ, వైజ్వాన్నో యూవెలిచెనియమ్ టోకా, మరియు కొలిచెస్ మాక్సిమాల్ స్కోరోస్టి వోజ్‌బుడ్‌డెనియ (n = 25 NEIRONOV hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, గరిష్ట ఫైరింగ్ రేటు యొక్క కరెంట్ పెరుగుదల మరియు పరిమాణీకరణ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన hCO మరియు t-hCO లలో చర్య సంభావ్య పునః-ఫైరింగ్ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; *** P < 0.0001). ఇ, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的最大放电率的神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 皖 =2 量神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, POVTORYUSHESIA వోజ్బుగ్డేనియస్ పోటెన్షియాల డెయిస్ట్వియ hCO మరియు t-hCO, వైజ్వాన్నో యూవెలిచెనియమ్ పోడాచ్, మరియు టోకస్ ఒషెంకా మాక్సిమాల్నోయ్ స్కోరోస్టి వోజ్బుడ్డెనియ (n = 25 NEIRONOV hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, పెరిగిన కరెంట్ సరఫరా మరియు గరిష్ట ఫైరింగ్ రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన hCO మరియు t-hCO యాక్షన్ పొటెన్షియల్స్ యొక్క పునరావృత ఫైరింగ్ (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 16 t-hCO న్యూరాన్లు; *** P < 0.0001). f, 8 నెలల భేదం వద్ద hCO మరియు t-hCO న్యూరాన్‌లలో స్పాంటేనియస్ EPSCలు (sEPSCలు), మరియు సినాప్టిక్ సంఘటనల ఫ్రీక్వెన్సీ యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్‌లు, n = 17 t-hCO న్యూరాన్‌లు; ***P < 0.0001). f, 8 నెలల భేదం వద్ద hCO మరియు t-hCO న్యూరాన్‌లలో స్పాంటేనియస్ EPSCలు (sEPSCలు), మరియు సినాప్టిక్ సంఘటనల ఫ్రీక్వెన్సీ యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 25 hCO న్యూరాన్‌లు, n = 17 t-hCO న్యూరాన్‌లు; ***P < 0.0001). f, SPONTANYE EPSC (sEPSC) నైరోనాహ్ హెచ్‌సిఓ మరియు టి-హెచ్‌సిఓ చెరెజ్ 8 మెసియాషెవ్ డిఫెరెన్స్ మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్షన్ ఆఫ్ синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, సినాప్టిక్ ఈవెంట్ రేట్ల భేదం మరియు పరిమాణీకరణ యొక్క 8 నెలల సమయంలో hCO మరియు t-hCO న్యూరాన్లలో స్పాంటేనియస్ EPSCలు (sEPSCలు) (n=25 hCO న్యూరాన్లు, n=17 t-hCO న్యూరాన్లు; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCలు (sEPSCలు), 以及突触事件频率的量神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCలు (sEPSCలు), 以及突触事件频率的量神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, SPONTANYE EPSC (sEPSC) నైరోనాహ్ హెచ్‌సిఓ మరియు టి-హెచ్‌సిఓ చెరెజ్ 8 మెసియాషెవ్ డిఫెరెన్స్ మరియు కోలిచెస్ట్‌వెన్షన్ ఆఫ్ синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, సినాప్టిక్ ఈవెంట్ రేట్ల భేదం మరియు పరిమాణీకరణ యొక్క 8 నెలల సమయంలో hCO మరియు t-hCO న్యూరాన్లలో స్పాంటేనియస్ EPSCలు (sEPSCలు) (n = 25 hCO న్యూరాన్లు, n = 17 t-hCO న్యూరాన్లు; *** P<0.0001).bf కొరకు, 1208-2 లైన్‌లోని hCO మరియు t-hCO లు సమాంతరంగా నిర్వహించబడే అదే భేదాత్మక బ్యాచ్ నుండి తీసుకోబడ్డాయి. g, t-hCO లో గణనీయంగా నియంత్రించబడిన (సర్దుబాటు చేయబడిన P < 0.05, రెట్లు మార్పు > 2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరించబడిన) జన్యువుల జన్యు సమితి సుసంపన్న విశ్లేషణ (ఒక-వైపు ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష) hCO తో పోలిస్తే t-hCO లో గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు ఇన్ వివో మౌస్ అధ్యయనం నుండి గుర్తించబడిన ప్రారంభ-ప్రతిస్పందన (ERG) మరియు ఆలస్య-ప్రతిస్పందన (LRG) కార్యాచరణ-ఆధారిత జన్యువుల జన్యు సెట్‌లతో గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు16 మరియు ఇన్ విట్రో న్యూరాన్‌ల నుండి మానవ-నిర్దిష్ట LRGలు17. g, t-hCO లో గణనీయంగా నియంత్రించబడిన (సర్దుబాటు చేయబడిన P < 0.05, రెట్లు మార్పు > 2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరించబడిన) జన్యువుల జన్యు సమితి సుసంపన్న విశ్లేషణ (ఒక-వైపు ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష) hCO తో పోలిస్తే t-hCO లో గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు ఇన్ వివో మౌస్ అధ్యయనం నుండి గుర్తించబడిన ప్రారంభ-ప్రతిస్పందన (ERG) మరియు ఆలస్య-ప్రతిస్పందన (LRG) కార్యాచరణ-ఆధారిత జన్యువుల జన్యు సెట్‌లతో గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు16 మరియు ఇన్ విట్రో న్యూరాన్‌ల నుండి మానవ-నిర్దిష్ట LRGలు17. g, అనాలిజ్ ఒబోగాషెనియా నబోరా గెనోవ్ (ఒడ్నోస్టోరోనియస్ టోచ్నీ క్రైటర్ ఫిషెరా) గెనోవ్ సో ప్రఖ్యాతి గాంచిన (స్కోరు P <0,05, క్రియేషన్స్ > 2, ఈ నెల 10% కంటే ఎక్కువ) t-hCO по сравнению с గ్లుటామాటెర్గిచెస్కిమి నైరోనామి హెచ్‌సిఓ నాబోర్రి గెనోవ్ కాక్ రాన్నెగో (ఇఆర్జి), టాక్ మరియు పోజ్డ్నెగో (ఎల్‌ఆర్‌జి) గెనోవ్, జావిష్‌లు vivo16లో మైషాహ్‌లో ఇడింటిఫికేషన్‌లు, మరియు స్పెషలిస్ట్ కెలోవెకా LRG లేదా వైరస్ 17లో. g, t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలో గణనీయమైన క్రియాశీలత (సర్దుబాటు చేయబడిన P<0.05, మడత మార్పు >2, కనీసం 10% న్యూక్లియైలలో వ్యక్తీకరణ) కలిగిన జన్యువుల జన్యు సమితి సుసంపన్నత (ఒక తోక ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష) విశ్లేషణ hCO తో పోలిస్తే ప్రారంభ (ERG) మరియు చివరి (LRG) కార్యకలాపాల ఆధారిత జన్యువుల సెట్‌లు ఇన్ వివో మైస్16 మరియు విట్రో17లోని న్యూరాన్‌ల నుండి మానవ-నిర్దిష్ట LRGలలో గుర్తించబడ్డాయి. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) 和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人RGG g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上 谷氨酸2小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 皠 建神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, గ్లుటామటర్గిచెస్కీ నైరోని t-hCO బైలీ ప్రఖ్యాతి గాంచిన క్రియాశీలత (скорректированный P<0,05, క్రాట్నొస్ట్ ఇజ్మేనియ> 2, నేను కాదు 10% అనాలీజ్ ఒబోగాషెనియా నాబోర్న్ గెనోవొట్ టెస్ట్ ఫిషెరా) రన్నెగో ఔట్వేటా (ERG) మరియు పోజ్డ్నెగో గేన్, ఆక్టివ్నొస్టి ఒట్వెటా (LRG), ఐడెంటిఫికేషన్ ఇన్ వాల్వ్ ఇన్ వాల్వ్ 6 మరియు నైరోనాహ్ ఇన్ విట్రో17. LRG, స్పెసిఫికేషన్ నుండి చెలోవెకా. g, t-hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు hCO గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లతో పోలిస్తే గణనీయంగా నియంత్రించబడ్డాయి (సర్దుబాటు చేయబడిన P<0.05, రెట్లు మార్పు >2, కనీసం 10% ప్రారంభ ప్రతిస్పందన (ERG) మరియు ఆలస్య ప్రతిస్పందన జన్యు సుసంపన్న విశ్లేషణ (ఒక తోక ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష) ప్రతిస్పందన కార్యాచరణ ఆధారిత జన్యువులు (LRGలు) ఇన్ వివో మైస్16 మరియు ఇన్ విట్రో న్యూరాన్‌లలో గుర్తించబడ్డాయి.17 మానవ నిర్దిష్ట LRGలు.చుక్కల రేఖ 0.05. h యొక్క బోన్‌ఫెరోని-సరిచేసిన P విలువను సూచిస్తుంది, t-hCO గ్లుటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌లలోని LRG జన్యువుల snRNA-seq ప్రతిరూపాలలో GluN జన్యు వ్యక్తీకరణ (ప్రతి జన్యువు యొక్క సూడో-ప్యాకేజీ మరియు స్కేలింగ్) గణనీయంగా నియంత్రించబడింది. i, t-hCO (ఎగువ) మరియు hCO (దిగువ) న్యూరాన్‌లలో SCG2 వ్యక్తీకరణను చూపించే ఇమ్యునోస్టెయినింగ్. తెల్ల బాణాలు SCG2+ కణాలను సూచిస్తాయి. స్కేల్ బార్, 25 µm. డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం వలె వ్యక్తీకరించబడింది.
ఎక్స్ వివో స్లైస్‌లలో గమనించిన t-hCO యొక్క పెరిగిన కార్యాచరణ ఆధారంగా, snRNA-seq hCO ఇన్ విట్రోతో పోలిస్తే t-hCO లో జన్యు ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల యొక్క కార్యాచరణ-ఆధారిత అప్‌రెగ్యులేషన్‌ను వెల్లడించింది. గ్లూటామాటర్జిక్ t-hCO న్యూరాన్లు ఆలస్య ప్రతిస్పందన కార్యకలాపాలను నియంత్రించే అధిక స్థాయి జన్యువులను వ్యక్తపరిచాయి (Fig. 2g,h), ఇవి మౌస్ మరియు మానవ న్యూరాన్‌లలో మునుపటి అధ్యయనాలలో కనుగొనబడ్డాయి16,17. ఉదాహరణకు, BDNF18, SCG2, మరియు OSTN, ప్రైమేట్-నిర్దిష్ట కార్యాచరణ-నియంత్రణ జన్యువు, hCO న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే t-hCO న్యూరాన్‌లలో పెరిగిన వ్యక్తీకరణను చూపించాయి (Fig. 2g-i). అందువల్ల, t-hCO న్యూరాన్‌లు ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్, పదనిర్మాణ మరియు క్రియాత్మక విశ్లేషణల ద్వారా hCO న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే మెరుగైన పరిపక్వ లక్షణాలను ప్రదర్శించాయి.
మానవ మెదడు అభివృద్ధితో t-hCO పరిపక్వత యొక్క అనుబంధాన్ని మరింతగా అంచనా వేయడానికి, మేము పిండం మరియు వయోజన కార్టికల్ సెల్ రకాలు 19,20 మరియు వయోజన 21,22 యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ పోలికలను అలాగే అభివృద్ధి సమయంలో కార్టికల్ జన్యు వ్యక్తీకరణ 23 పై విస్తృతమైన డేటాను (విస్తరించిన డేటా, Fig. 5) ప్రదర్శించాము. మునుపటి పని 24 తో, 7-8 నెలల భేదం వద్ద గ్లోబల్ hCO మరియు t-hCO ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ పరిపక్వత స్థితి వివో అభివృద్ధి సమయానికి విస్తృతంగా అనుగుణంగా ఉంటుంది మరియు చివరి పిండం జీవితానికి సమానంగా ఉంటుంది (విస్తరించిన డేటా Fig. 5a). ముఖ్యంగా, వయస్సు-సరిపోలిన hCO తో పోలిస్తే t-hCO లో పెరిగిన ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ పరిపక్వతను, అలాగే సినాప్టోజెనిసిస్, ఆస్ట్రోజెనిసిస్ మరియు మైలినేషన్ (విస్తరించిన డేటా, Fig. 5b-d) తో సంబంధం ఉన్న ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ క్రియాశీలతను మేము గమనించాము. సెల్యులార్ స్థాయిలో, t-hCO లో సన్నని కార్టెక్స్ సబ్టైప్ యొక్క ఆధారాలను మేము కనుగొన్నాము, వయోజన L2/3, L5 మరియు L6 న్యూరాన్ సబ్టైప్‌లతో అతివ్యాప్తి చెందుతున్న గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్‌ల సమూహాలు (మూర్తి 1i). దీనికి విరుద్ధంగా, గర్భధారణ మధ్యలో గ్లూటామాటర్జిక్ t-hCO న్యూరాన్లు మరియు పిండం కార్టికల్ న్యూరాన్ల మధ్య క్లస్టర్ అతివ్యాప్తి చాలా పరిమితంగా ఉంది (విస్తరించిన డేటా, Figure 5e-j). t-hCO న్యూరాన్లు మానవ ప్రసవానంతర నియోకార్టికల్ న్యూరాన్లతో క్రియాత్మకంగా సారూప్యంగా ఉన్నాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి, మేము మానవ ప్రసవానంతర కార్టెక్స్ యొక్క పదునైన విభాగాలలో మానవ L2/3 పిరమిడల్ న్యూరాన్ల యొక్క ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ రికార్డింగ్‌లు మరియు శరీర నిర్మాణ పునర్నిర్మాణాలను నిర్వహించాము (విస్తరించిన డేటా, Fig. 7a). L2/3 పిరమిడల్ న్యూరాన్‌ల యొక్క ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ లక్షణాలు t-hCO పిరమిడల్ న్యూరాన్‌ల మాదిరిగానే ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 7e). పదనిర్మాణపరంగా, ప్రసవానంతర మానవ నమూనాల నుండి L2/3 న్యూరాన్లు hCO కంటే t-hCO కి సమానంగా ఉంటాయి, అయినప్పటికీ L2/3 కణాలు పొడవుగా ఉన్నాయి, మొత్తం మీద ఎక్కువ శాఖలను కలిగి ఉన్నాయి మరియు అధిక వెన్నెముక సాంద్రతను కలిగి ఉన్నాయి (Fig. 3g మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 7b-). G).
a, నియంత్రణ మరియు TS hiPS కణ తంతువుల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన hCO ని నియోనాటల్ ఎలుకలలోకి మార్పిడి చేయడం. b, 8 నెలల భేదం తర్వాత బయోసైటిన్ నిండిన t-hCO న్యూరాన్‌ల 3D పునర్నిర్మాణం. c, సగటు డెన్డ్రిటిక్ పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 19 నియంత్రణ న్యూరాన్‌లు, n = 21 TS న్యూరాన్‌లు; **P = 0.0041). d, 8 నెలల భేదం వద్ద నియంత్రణ మరియు TS t-hCO నుండి 3D-పునర్నిర్మించిన డెన్డ్రిటిక్ శాఖలు, మరియు డెన్డ్రిటిక్ వెన్నెముక సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 16 నియంత్రణ న్యూరాన్లు, n = 21 TS న్యూరాన్లు, ***P < 0.0001). d, 8 నెలల భేదం వద్ద నియంత్రణ మరియు TS t-hCO నుండి 3D-పునర్నిర్మించిన డెన్డ్రిటిక్ శాఖలు, మరియు డెన్డ్రిటిక్ వెన్నెముక సాంద్రత యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 16 నియంత్రణ న్యూరాన్లు, n = 21 TS న్యూరాన్లు, ***P < 0.0001). d, 3D-రీకాన్‌స్ట్రుక్సియ డెన్డ్రిట్ వెట్వెయ్ ఇజ్ కాంట్రాల్య మరియు TS t-hCO చెరెజ్ 8 మేస్యాషెవ్ డిఫెరెన్స్‌వైరస్ оцenka plotnosti dendritnыh shipov (n = 16 CONTROLINYH NEIRONOV, n = 21 TS NEIRONov, *** P <0,0001). d, 8 నెలల భేదం మరియు డెన్డ్రిటిక్ వెన్నెముక సాంద్రత పరిమాణీకరణ (n=16 నియంత్రణ న్యూరాన్లు, n=21 TS న్యూరాన్లు, ***P<0.0001) వద్ద నియంత్రణ మరియు t-hCO TS నుండి డెన్డ్రిటిక్ శాఖల 3D పునర్నిర్మాణం. d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n =个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密化 = 16 量神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）。 d, 3D-రీకోన్‌స్ట్రూక్‌లు వెట్‌వే కాంట్రాల్య మరియు TS t-hCO చెరెజ్ 8 మేస్యాషెవ్ డిఫెరెన్స్‌కోవిక్‌లు మరియు плотности дендритных шипов (n = 16 CONTROLINых нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 నెలల భేదం మరియు డెన్డ్రిటిక్ వెన్నెముక సాంద్రత పరిమాణీకరణలో నియంత్రణ డెన్డ్రిటిక్ శాఖలు మరియు TS t-hCO యొక్క 3D పునర్నిర్మాణం (n=16 నియంత్రణ న్యూరాన్లు, n=21 TS న్యూరాన్లు, ***P<0.0001).ఎరుపు నక్షత్రాలు పుటేటివ్ డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్‌లను సూచిస్తాయి. e, నియంత్రణలో స్పాంటేనియస్ EPSCలు మరియు 8 నెలల భేదం తర్వాత TS t-hCO న్యూరాన్‌లు. f, సంచిత ఫ్రీక్వెన్సీ ప్లాట్ మరియు సినాప్టిక్ ఈవెంట్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు వ్యాప్తి యొక్క పరిమాణీకరణ (n=32 కంట్రోల్ న్యూరాన్‌లు, n=26 TS న్యూరాన్‌లు; **P=0.0076 మరియు P=0.8102). g, hCO మరియు t-hCOలలో TS మరియు కంట్రోల్ న్యూరాన్‌ల యొక్క స్కోల్ విశ్లేషణ. డాష్ చేసిన పంక్తులు పోలిక కోసం మానవ L2/3 ప్రసవానంతర పిరమిడల్ న్యూరాన్‌లను చూపుతాయి (n = 24 కంట్రోల్ t-hCO న్యూరాన్‌లు, n = 21 TS t-hCO న్యూరాన్‌లు, n = 8 కంట్రోల్ hCO న్యూరాన్‌లు మరియు n = 7 TS hCO న్యూరాన్‌లు). డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం వలె వ్యక్తీకరించబడింది.
t-hCO మానవ కార్టెక్స్ న్యూరాన్‌ల యొక్క పదనిర్మాణ మరియు క్రియాత్మక లక్షణాలను అధిక స్థాయిలో ప్రతిబింబించే సామర్థ్యం, ​​వ్యాధి సమలక్షణాలను గుర్తించడానికి t-hCOను ఉపయోగించవచ్చో లేదో అన్వేషించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది. CaV1.2 జన్యువు ఎన్‌కోడింగ్‌లో గెయిన్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ మ్యుటేషన్‌ల వల్ల కలిగే తీవ్రమైన న్యూరో డెవలప్‌మెంటల్ డిజార్డర్ అయిన TS పై మేము దృష్టి సారించాము, ఇది న్యూరాన్‌లలో కార్యాచరణ-ఆధారిత జన్యు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రారంభిస్తుంది. అత్యంత సాధారణ ప్రత్యామ్నాయం (p.G406R) మరియు మూడు నియంత్రణలను కలిగి ఉన్న ముగ్గురు TS రోగుల నుండి మేము hCO పొందాము (Fig. 3a). మార్పిడి తర్వాత, నియంత్రణలతో పోలిస్తే TS న్యూరాన్‌లలో డెన్డ్రిటిక్ పదనిర్మాణం మారిందని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 3b మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 8a,b), ప్రాథమిక డెండ్రైట్‌ల సంఖ్యలో రెండు రెట్లు పెరుగుదల మరియు డెన్డ్రిటిక్ పొడవులో సగటు మరియు మొత్తం తగ్గుదల (Fig. 3c మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 8c). ఇది నియంత్రణ న్యూరాన్‌లతో పోలిస్తే TSలో వెన్నుముకల సాంద్రత పెరుగుదల మరియు ఆకస్మిక EPSCల ఫ్రీక్వెన్సీ పెరుగుదలతో సంబంధం కలిగి ఉంది (Fig. 3d–f మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 8g). మరింత విశ్లేషణలో నియంత్రణలతో పోలిస్తే t-hCO TSలో అసాధారణ డెన్డ్రిటిక్ బ్రాంచింగ్ నమూనాలు వెల్లడయ్యాయి, కానీ ఇన్ విట్రో TS hCOలో భేదం యొక్క సారూప్య దశలో కాదు (Fig. 3g). ఇది TSలో కార్యాచరణ-ఆధారిత డెన్డ్రిటిక్ సంకోచం యొక్క మా మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉంది మరియు ఈ మార్పిడి వేదిక యొక్క వివోలో వ్యాధి సమలక్షణాలను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది.
తరువాత మేము t-hCO కణాలు ఎలుక S1 లో ఎంతవరకు క్రియాత్మకంగా విలీనం చేయబడ్డాయో అడిగాము. ఎలుకలలోని S1 ఇప్సిలేటరల్ వెంట్రల్ బేసల్ మరియు పోస్టీరియర్ థాలమిక్ న్యూక్లియైల నుండి, అలాగే ఇప్సిలేటరల్ మోటార్ మరియు సెకండరీ సోమాటోసెన్సరీ కార్టిసెస్ మరియు కాంట్రాలెటరల్ S1 (Fig. 4a) నుండి బలమైన సినాప్టిక్ ఇన్‌పుట్‌లను పొందుతుంది. ఆవిష్కరణ నమూనాను పునరుద్ధరించడానికి, మేము hCO ని రాబిస్ వైరస్-dG-GFP/AAV-G తో సంక్రమించాము మరియు 3 రోజుల తరువాత S1 ఎలుకలోకి hCO ని మార్పిడి చేసాము. మార్పిడి తర్వాత 7-14 రోజుల తర్వాత ఇప్సిలేటరల్ S1 మరియు వెంట్రల్ బేసల్ గాంగ్లియా యొక్క న్యూరాన్‌లలో దట్టమైన GFP వ్యక్తీకరణను మేము గమనించాము (Fig. 4b, c). అదనంగా, థాలమిక్ మార్కర్ నెట్రిన్ G1 యొక్క యాంటీబాడీ స్టెయినింగ్ t-hCO లో థాలమిక్ ఎండింగ్‌ల ఉనికిని వెల్లడించింది (Fig. 4d, e). ఈ అనుబంధ ప్రొజెక్షన్‌లు t-hCO కణాలలో సినాప్టిక్ ప్రతిస్పందనలను పొందగలవా అని అంచనా వేయడానికి, మేము థాలమోకార్టికల్ పొర యొక్క పదునైన విభాగాలలో మానవ కణాల నుండి మొత్తం సెల్ రికార్డింగ్‌లను ప్రదర్శించాము. AMPA రిసెప్టర్ విరోధి NBQX కి గురైన t-hCO న్యూరాన్లలో t-hCO ప్రేరిత షార్ట్-లేటెన్సీ EPSC లలో ఎలుక S1, అంతర్గత గుళిక, తెల్ల పదార్థం, t-hCO దగ్గర ఫైబర్స్ లేదా ఆప్సిన్-వ్యక్తీకరించే థాలమిక్ ఎండింగ్స్ యొక్క ఆప్టోజెనెటిక్ యాక్టివేషన్ యొక్క విద్యుత్ ప్రేరణ. (Fig. 4f, g మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 9a-g). ఈ డేటా t-hCO ఎలుక మెదడులో శరీర నిర్మాణపరంగా విలీనం చేయబడిందని మరియు ఎలుక హోస్ట్ కణజాలం ద్వారా సక్రియం చేయగలదని నిరూపిస్తుంది.
a, రాబిస్ ట్రాకింగ్ ప్రయోగం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. b, t-hCO మరియు ఎలుక సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్ (ఎగువ ప్యానెల్) మధ్య GFP మరియు మానవ-నిర్దిష్ట STEM121 వ్యక్తీకరణ. ఎలుక ఇప్సిలేటరల్ వెంట్రల్ బేసల్ న్యూక్లియస్ (VB) (దిగువ ఎడమ) మరియు ఇప్సిలేటరల్ S1 (దిగువ కుడి)లో GFP వ్యక్తీకరణ కూడా చూపబడింది. స్కేల్ బార్, 50 µm. ఎరుపు చతురస్రాలు చిత్రాలు తీసిన మెదడులోని ప్రాంతాలను సూచిస్తాయి. c, GFP (n = 4 ఎలుకలు)ని వ్యక్తీకరించే కణాల పరిమాణీకరణ. d, e - t-hCOలో నెట్రిన్ G1+ థాలమిక్ టెర్మినల్స్. d t-hCO మరియు VB న్యూక్లియైలను కలిగి ఉన్న కరోనల్ విభాగాన్ని చూపిస్తుంది. స్కేల్ బార్, 2 mm. e t-hCO (ఎడమ) మరియు VB (కుడి) న్యూరాన్‌లలో నెట్రిన్ G1 మరియు STEM121 వ్యక్తీకరణను చూపిస్తుంది. స్కేల్ బార్, 50 µm. నారింజ చుక్కల రేఖ t-hCO సరిహద్దును సూచిస్తుంది. f, g, S1 రాట్ (f) లేదా అంతర్గత క్యాప్సూల్ (g) లో విద్యుత్ ప్రేరణ తర్వాత t-hCO న్యూరాన్ల ప్రస్తుత జాడలు, (ఊదా) లేదా లేకుండా (నలుపు) NBQX (ఎడమ). NBQX తో మరియు లేకుండా EPSC యాంప్లిట్యూడ్‌లు (n = 6 S1 న్యూరాన్లు, *P = 0.0119; మరియు n = 6 అంతర్గత క్యాప్సూల్ న్యూరాన్లు, **P = 0.0022) (మధ్యలో). ఎలుక S1 (f) లేదా అంతర్గత క్యాప్సూల్ (g) (కుడి) యొక్క విద్యుత్ ప్రేరణకు ప్రతిస్పందనగా EPSCని చూపించే t-hCO న్యూరాన్‌ల శాతం. aCSF, కృత్రిమ సెరెబ్రోస్పానియల్ ద్రవం. h, 2P ఇమేజింగ్ ప్రయోగం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (ఎడమ). t-hCO (మధ్యలో) లో GCaMP6ల వ్యక్తీకరణ. స్కేల్ బార్, 100 µm. GCaMP6ల ఫ్లోరోసెన్స్ టైమ్ లాప్స్ (కుడి). i, స్పాంటేనియస్ యాక్టివిటీ ఫ్లోరోసెన్స్ యొక్క Z-స్కోర్. j, మీసాల ఉద్దీపన యొక్క స్కీమాటిక్ ఇలస్ట్రేషన్. k, ఒక ట్రయల్‌లో z-స్కోర్ చేయబడిన 2P ఫ్లోరోసెన్స్ పథాలు, ఉదాహరణ కణాలలో సమయం సున్నా (డాష్డ్ లైన్) వద్ద విస్కర్ విచలనంతో సమలేఖనం చేయబడ్డాయి. l, సమయం సున్నా (డాష్డ్ లైన్) (ఎరుపు) వద్ద విస్కర్ విచలనంతో సమలేఖనం చేయబడిన అన్ని కణాల జనాభా-సగటు z-స్కోర్ ప్రతిస్పందనలు లేదా యాదృచ్ఛికంగా ఉత్పత్తి చేయబడిన టైమ్‌స్టాంప్‌లు (బూడిద). m. ఆప్టికల్ మార్కింగ్‌పై ప్రయోగం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. n, బ్లూ లేజర్ స్టిమ్యులేషన్ లేదా విస్కర్ విచలనం సమయంలో ఉదాహరణ t-hCO సెల్ నుండి ముడి వోల్టేజ్ వక్రతలు. ఎరుపు బాణాలు కాంతి (పైభాగం) లేదా విస్కర్ విచలనం (దిగువ) వల్ల కలిగే మొదటి స్పైక్‌లను సూచిస్తాయి. బూడిద రంగు షేడింగ్ మీస విచలనం యొక్క కాలాలను సూచిస్తుంది. o, పీక్ లైట్ వేవ్‌ఫారమ్‌లు మరియు విస్కర్ విచలనం ప్రతిస్పందనలు. p, ఒకే ప్రయత్నం యొక్క స్పైక్‌లు, ఉదాహరణ కణాలలో మీసము యొక్క విచలనంతో సమలేఖనం చేయబడ్డాయి. 0 మీస విచలనం (డాష్డ్ లైన్) సూచిస్తుంది. q, అన్ని ఫోటోసెన్సిటివ్ కణాల కోసం జనాభా-సగటు z-స్కోర్ ఫైరింగ్ రేటు, సమయం సున్నా (డాష్డ్ లైన్) (ఎరుపు) వద్ద విస్కర్ విచలనంతో సమలేఖనం చేయబడింది లేదా యాదృచ్ఛికంగా ఉత్పత్తి చేయబడిన టైమ్‌స్టాంప్‌లు (బూడిద). r, విస్కర్ విచలనం (n = 3 ఎలుకలు) ద్వారా గణనీయంగా మాడ్యులేట్ చేయబడిన ఫోటోసెన్సిటివ్ యూనిట్ల నిష్పత్తి (ఎడమ). పీక్ z-స్కోర్ జాప్యం (n = 3 ఎలుకలు; n = 5 (లేత ఆకుపచ్చ), n = 4 (ముదురు ఆకుపచ్చ), మరియు n = 4 (సియాన్) విస్కర్ విచలనం మాడ్యులేషన్ యూనిట్లు ఒక ఎలుకకు) (కుడి). డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం వలె వ్యక్తీకరించబడింది.
తరువాత మేము t-hCO ను ఇన్ వివోలో ఇంద్రియ ఉద్దీపనల ద్వారా సక్రియం చేయవచ్చా అని అడిగాము. జన్యుపరంగా ఎన్కోడ్ చేయబడిన కాల్షియం సూచికలు GCaMP6 ను వ్యక్తీకరించే hCO ను S1 ఎలుకలలోకి మార్పిడి చేసాము. 150 రోజుల తర్వాత, మేము ఫైబర్ ఫోటోమెట్రీ లేదా టూ-ఫోటాన్ కాల్షియం ఇమేజింగ్ (Fig. 4h మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 10a) ను నిర్వహించాము. t-hCO కణాలు సమకాలీకరించబడిన లయబద్ధమైన కార్యాచరణను ప్రదర్శించాయని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 4i, విస్తరించిన డేటా, Fig. 10b మరియు అనుబంధ వీడియో 1). గరిష్ట t-hCO కార్యాచరణను వర్గీకరించడానికి, మేము అనస్థీషియా చేయబడిన మార్పిడి ఎలుకలలో ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ రికార్డింగ్‌లను ప్రదర్శించాము (విస్తరించిన డేటా, Fig. 10c-f). మేము MRI చిత్రాల నుండి స్టీరియోటాక్సిక్ కోఆర్డినేట్‌లను ఉత్పత్తి చేసాము; అందువల్ల, ఈ రికార్డ్ చేయబడిన యూనిట్లు పుటేటివ్ మానవ న్యూరాన్‌లను సూచిస్తాయి, అయినప్పటికీ ఎలక్ట్రోఫిజియాలజీ మాత్రమే మూల జాతిని నిర్ణయించడానికి అనుమతించదు. మేము సమకాలీకరించబడిన కార్యాచరణ యొక్క విస్ఫోటనాలను గమనించాము (విస్తరించిన డేటా, Fig. 10d). ఈ పేలుళ్లు దాదాపు 460 ms పాటు కొనసాగాయి మరియు దాదాపు 2 సెకన్ల నిశ్శబ్ద కాలాల ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 10d, e). వ్యక్తిగత యూనిట్లు ప్రతి పేలుళ్లకు సగటున మూడు రౌండ్లు కాల్చాయి, ఇది ప్రతి పేలుళ్లకు నమోదైన యూనిట్లలో దాదాపు 73%. వ్యక్తిగత యూనిట్ల కార్యకలాపాలు చాలా పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి మరియు ఈ సహసంబంధాలు అదే పరిస్థితులలో నమోదు చేయబడిన టీకాలు వేయని జంతువులలో గుర్తించబడిన యూనిట్ల కంటే ఎక్కువగా ఉన్నాయి (విస్తరించిన డేటా, Fig. 10f). గుర్తించబడిన మానవ-ఉత్పన్న న్యూరాన్ల స్పైక్ ప్రతిస్పందనలను మరింత వర్గీకరించడానికి, మేము hCO తో మార్పిడి చేయబడిన మత్తుమందు పొందిన ఎలుకలపై కాంతి-ట్యాగింగ్ ప్రయోగాలు చేసాము, ఇది కాంతి-సున్నితమైన కేషన్ ఛానల్ రోడాప్సిన్ 2 (hChR2) ను వ్యక్తపరుస్తుంది, దీని ద్వారా t-hCO న్యూరాన్లు నీలి కాంతి ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందనగా స్వల్ప-జాప్య గుర్తింపు (10 ms కంటే తక్కువ) (Fig. 4m–o). t-hCO న్యూరాన్లు కాల్షియం ఇమేజింగ్‌లో గమనించిన వాటికి సమానమైన పౌనఃపున్యాల వద్ద ఆకస్మిక కార్యకలాపాల బరస్ట్‌లను ప్రదర్శించాయి, అలాగే లైట్ మార్కింగ్ లేనప్పుడు t-hCOలో నిర్వహించిన ఎలక్ట్రోఫిజియోలాజికల్ రికార్డింగ్‌లు (విస్తరించిన డేటా, Fig. 10c-g). ఇన్ విట్రోలో నమోదు చేయబడిన hCO యొక్క సంబంధిత దశలలో ఎటువంటి ఆకస్మిక కార్యాచరణ గమనించబడలేదు. ఇంద్రియ ఉద్దీపనల ద్వారా t-hCOని సక్రియం చేయవచ్చో లేదో అంచనా వేయడానికి, మేము ఎలుక మీసాలను t-hCO నుండి దూరంగా క్లుప్తంగా విక్షేపం చేసాము (Fig. 4j,m మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 10h,k). మునుపటి అధ్యయనాల ప్రకారం 8,10, t-hCO కణాల ఉపసమితి మీసాల విక్షేపణకు ప్రతిస్పందనగా పెరిగిన కార్యాచరణను చూపించింది, డేటాను యాదృచ్ఛిక సమయ స్టాంపులతో పోల్చినప్పుడు ఇది గమనించబడలేదు (Fig. 4k-q మరియు విస్తరించిన డేటా, Fig. 10h-q). నిజానికి, ఆప్టో-లేబుల్ చేయబడిన సింగిల్ యూనిట్లలో దాదాపు 54% మీసాల ఉద్దీపన తర్వాత గణనీయంగా పెరిగిన ఉద్రేక రేటును చూపించాయి, దాదాపు 650 ms (Fig. 4r) వద్ద గరిష్ట స్థాయికి చేరుకున్నాయి. కలిసి చూస్తే, ఈ డేటా t-hCO తగిన క్రియాత్మక ఇన్‌పుట్‌లను అందుకుంటుందని మరియు పర్యావరణ ఉద్దీపనల ద్వారా సక్రియం చేయవచ్చని సూచిస్తుంది.
తరువాత మేము t-hCO ఎలుకలలో ప్రవర్తనను నియంత్రించడానికి సర్క్యూట్‌లను సక్రియం చేయగలదా అని పరిశోధించాము. t-hCO న్యూరాన్‌ల ఆక్సాన్‌లు ఎలుక చుట్టుపక్కల కణజాలాలలోకి ప్రవేశిస్తాయా అని మేము మొదట పరిశోధించాము. EYFP (hChR2-EYFP)కి అనుసంధానించబడిన hChR2 ఎన్‌కోడింగ్ లెంటివైరస్‌తో మేము hCOకి సోకింది. 110 రోజుల తర్వాత, శ్రవణ, మోటారు మరియు సోమాటోసెన్సరీ కార్టిసెస్‌తో సహా ఇప్సిలేటరల్ కార్టికల్ ప్రాంతాలలో, అలాగే స్ట్రియాటం, హిప్పోకాంపస్ మరియు థాలమస్‌తో సహా సబ్‌కార్టికల్ ప్రాంతాలలో EYFP వ్యక్తీకరణను గమనించాము (Fig. 5a). ఈ ఎఫెరెంట్ ప్రొజెక్షన్‌లు ఎలుక కణాలలో సినాప్టిక్ ప్రతిస్పందనలను పొందగలవో లేదో అంచనా వేయడానికి, మేము పదునైన మెదడు విభాగాలలో ఎలుక సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్ కణాలను రికార్డ్ చేయడం ద్వారా hChR2-EYFPని వ్యక్తపరిచే t-hCO కణాలను ఆప్టికల్‌గా సక్రియం చేసాము. NBQX ద్వారా నిరోధించబడిన ఎలుక పిరమిడల్ కార్టెక్స్ న్యూరాన్‌లలో నీలి కాంతి ప్రేరిత షార్ట్-లేటెన్సీ EPSCలతో t-hCO ఆక్సాన్‌ల క్రియాశీలత (Figs. 5b-g). అదనంగా, ఈ ప్రతిస్పందనలను టెట్రోడోటాక్సిన్ (TTX) నిరోధించవచ్చు మరియు 4-అమినోపైరిడిన్ (4-AP) ద్వారా పునరుద్ధరించవచ్చు, ఇవి మోనోసినాప్టిక్ కనెక్షన్ల వల్ల సంభవించాయని సూచిస్తున్నాయి (Fig. 5e).
a, ఆక్సాన్ ట్రాకింగ్ యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (ఎడమ). t-hCO EYFP వ్యక్తీకరణ (కుడి). స్కేల్ బార్, 100 µm. A1, శ్రవణ కార్టెక్స్, ACC, పూర్వ సింగ్యులేట్ కార్టెక్స్, d. స్ట్రియాటం, డోర్సల్ స్ట్రియాటం, HPC, హిప్పోకాంపస్; డయాఫ్రాగమ్, లాటరల్ సెప్టం, mPFC, మెడియల్ ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్, పిరి, పిరిఫార్మ్ కార్టెక్స్, v. స్ట్రియాటం, వెంట్రల్ స్ట్రియాటం, VPM, థాలమస్ యొక్క వెంట్రోపోస్టోమెడియల్ న్యూక్లియస్, VTA, వెంట్రల్ టెగ్మెంటల్ ప్రాంతం. ఎరుపు చతురస్రాలు మెదడులోని చిత్రాలను తీసిన ప్రాంతాలను సూచిస్తాయి. b, స్టిమ్యులేషన్ ప్రయోగం యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. c, d, మానవ (c) EYFP+ t-hCO లేదా ఎలుక (d) EYFP- కణాలలో నీలి కాంతి-ప్రేరిత ఫోటోకరెంట్ (పైభాగం) మరియు వోల్టేజ్ (దిగువ) ప్రతిస్పందన యొక్క ఉదాహరణలు. e, f, TTX మరియు 4-AR (ఆకుపచ్చ), TTX (బూడిద) లేదా aCSF (నలుపు) (e), (వైలెట్) లేదా లేకుండా (నలుపు) ) ) NBQX (e) తో t-hCO ఆక్సాన్ల నీలి కాంతి ప్రేరణ తర్వాత ఎలుక న్యూరాన్ల ప్రస్తుత జాడలు. g, ఎలుక కణాలలో నీలి కాంతి ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ప్రతిస్పందనల జాప్యం (n = 16 కణాలు); క్షితిజ సమాంతర బార్లు సగటు జాప్యాన్ని సూచిస్తాయి (7.13 ms) (ఎడమ). NBQX (n = 7 కణాలు; ***P < 0.0001) (మధ్యలో) తో లేదా లేకుండా నమోదు చేయబడిన కాంతి-ప్రేరేపిత EPSC ల వ్యాప్తి. NBQX (n = 7 కణాలు; ***P < 0.0001) (మధ్యలో) తో లేదా లేకుండా నమోదు చేయబడిన కాంతి-ప్రేరేపిత EPSC ల వ్యాప్తి. అమ్ప్లిట్యూడా వైజ్వానియస్ స్వెటమ్ EPSC, జార్జిస్ట్రీరోవాన్స్ లేదా బేజ్ NBQX (n = 7 క్లేటోక్; ***P <0,0001) (వది). NBQX తో లేదా లేకుండా నమోదు చేయబడిన కాంతి-ప్రేరిత EPSC ల వ్యాప్తి (n = 7 కణాలు; ***P < 0.0001) (మధ్యలో).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中 అమ్ప్లిట్యూడా వైజ్వానియస్ స్వెటమ్ EPSC, జార్జిస్ట్రీరోవాన్స్ లేదా బేజ్ NBQX (n = 7 క్లేటోక్; ***P <0,0001) (వది). NBQX తో లేదా లేకుండా నమోదు చేయబడిన కాంతి-ప్రేరిత EPSC ల వ్యాప్తి (n = 7 కణాలు; ***P < 0.0001) (మధ్యలో).నీలి కాంతికి ప్రతిస్పందించే EPSC లను చూపించే ఎలుక కణాల శాతం (కుడి). h, ప్రవర్తనా పని యొక్క స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం. d0, రోజు 0. i. శిక్షణ యొక్క 1వ రోజు (ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (కుడి) ఆదర్శప్రాయమైన జంతువుల పనితీరు. 1వ రోజు (ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (కుడి మధ్యలో) (n = 150 బ్లూ లైట్ ట్రయల్స్, n = 150 రెడ్ లైట్ ట్రయల్స్; ***P < 0.0001) ప్రదర్శించిన లిక్స్‌ల సగటు సంఖ్య. 1వ రోజు (ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (కుడి మధ్యలో) (n = 150 బ్లూ లైట్ ట్రయల్స్, n = 150 రెడ్ లైట్ ట్రయల్స్; ***P < 0.0001) ప్రదర్శించిన లిక్స్‌ల సగటు సంఖ్య. ఈ రోజు 1 (స్లేవా) లేదా ఈ రోజు 15 (విధానం ప్రకారం) (n = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1వ రోజు (ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (మధ్యలో కుడి) (n = 150 బ్లూ లైట్ ట్రయల్స్, n = 150 రెడ్ లైట్ ట్రయల్స్; ***P < 0.0001) న చేసిన సగటు లిక్స్ సంఖ్య.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 ఈ రోజు 1 (స్లేవా) లేదా ఈ రోజు 15 (విధానం ప్రకారం) (n = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1వ రోజు (ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (మధ్యలో కుడి) (n = 150 బ్లూ లైట్ ట్రయల్స్, n = 150 రెడ్ లైట్ ట్రయల్స్; ***P < 0.0001) న చేసిన సగటు లిక్స్ సంఖ్య.1వ రోజు (మధ్య ఎడమ) లేదా 15వ రోజు (కుడి) ఎరుపు మరియు నీలం కాంతి పరీక్షల కోసం సంచిత లిక్స్. NS, ముఖ్యమైనది కాదు. j,k, 1 లేదా 15వ రోజు hChR2-EYFP (j) లేదా నియంత్రణ ఫ్లోరోఫోర్ (k)ను వ్యక్తీకరించే t-hCOతో మార్పిడి చేయబడిన అన్ని జంతువుల ప్రవర్తనా లక్షణాలు (hChR2-EYFP: n = 9 ఎలుకలు, ** P = 0.0049; నియంత్రణ: n = 9, P = 0.1497). l, ప్రాధాన్యత స్కోరు పరిణామం (n = 9 hChR2, n = 9 నియంత్రణ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, ప్రాధాన్యత స్కోరు పరిణామం (n = 9 hChR2, n = 9 నియంత్రణ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, ఎవోలిషియా పోకసాటెల్య ప్రేడ్పోచ్టేనియ (n = 9 hChR2, n = 9 CONTROльных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, ప్రాధాన్యత స్కోరు పరిణామం (n = 9 hChR2, n = 9 నియంత్రణలు; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l, Эvolyusia показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, ప్రాధాన్యత స్కోర్‌ల పరిణామం (n = 9 hChR2, n = 9 నియంత్రణలు; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 లో t-hCO యొక్క ఆప్టోజెనెటిక్ క్రియాశీలతకు ప్రతిస్పందనగా FOS వ్యక్తీకరణ. FOS వ్యక్తీకరణ (ఎడమ), మరియు పరిమాణీకరణ (సమూహానికి n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 మరియు ***P < 0.001) (కుడి) యొక్క చిత్రాలు చూపబడ్డాయి. FOS వ్యక్తీకరణ (ఎడమ), మరియు పరిమాణీకరణ (సమూహానికి n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 మరియు ***P < 0.001) (కుడి) యొక్క చిత్రాలు చూపబడ్డాయి. Показаны изображения эkspressi FOS (слева) మరియు కోలిచెస్ట్వెన్నోగో ఆప్రెడెలెనియ (n = 3 న గ్రుప్పు; * P <0,005, ** 1 p <0,005, ** 1 (స్పృహ). FOS వ్యక్తీకరణ (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (సమూహానికి n = 3; *P<0.05, **P<0.01, మరియు ***P<0.001) యొక్క చిత్రాలు (కుడి) చూపించబడ్డాయి.显示了FOS 表达（左）和量化（ 每组n = 3显示了FOS 表达（左）和量化（ 每组n = 3 Показаны изображения эkspressi FOS (слева) మరియు కోలిచెస్ట్వెన్నోగో ఆప్రెడెలెనియ (n = 3 న గ్రుప్పు; * P <0,005, ** 1 p <0,005, ** 1 (స్పృహ). FOS వ్యక్తీకరణ (ఎడమ) మరియు పరిమాణీకరణ (సమూహానికి n = 3; *P<0.05, **P<0.01, మరియు ***P<0.001) యొక్క చిత్రాలు (కుడి) చూపించబడ్డాయి.స్కేల్ బార్, 100 µm. డేటా BLA, బాసోలేటరల్ టాన్సిల్, MDT, డోర్సోమెడియల్ థాలమిక్ న్యూక్లియస్, PAG, పెరియాక్వెడక్టల్ గ్రే యొక్క సగటు ± ప్రామాణిక లోపంగా వ్యక్తీకరించబడింది.
చివరగా, t-hCO ఎలుక ప్రవర్తనను మాడ్యులేట్ చేయగలదా అని మేము అడిగాము. దీనిని పరీక్షించడానికి, మేము hChR2-EYFP-వ్యక్తీకరించే hCO ను S1 లోకి మార్పిడి చేసాము మరియు 90 రోజుల తరువాత, కాంతి డెలివరీ కోసం మేము ఆప్టికల్ ఫైబర్‌లను t-hCO లోకి అమర్చాము. తరువాత మేము ఎలుకలకు సవరించిన ఆపరేట్ కండిషనింగ్ నమూనాతో శిక్షణ ఇచ్చాము (Fig. 5h). మేము జంతువులను ఒక ప్రవర్తనా పరీక్ష గదిలో ఉంచాము మరియు యాదృచ్ఛికంగా 5 సెకన్ల నీలం (473 nm) మరియు ఎరుపు (635 nm) లేజర్ ఉద్దీపనలను వర్తింపజేసాము. నీలి కాంతి ఉద్దీపన సమయంలో జంతువులు నవ్వితే కానీ ఎరుపు కాంతి ఉద్దీపన సమయంలో నవ్వకపోతే నీటి బహుమతిని పొందాయి. శిక్షణ యొక్క మొదటి రోజున, జంతువులు నీలం లేదా ఎరుపు కాంతితో ప్రేరేపించబడినప్పుడు నవ్వడంలో ఎటువంటి తేడాను చూపించలేదు. అయితే, 15వ రోజున, hCO వ్యక్తీకరించే hChR2-EYFP తో మార్పిడి చేయబడిన జంతువులు ఎరుపు కాంతి ఉద్దీపనతో పోలిస్తే నీలి కాంతితో ప్రేరేపించబడినప్పుడు మరింత చురుకైన నవ్వును చూపించాయి. నియంత్రణ ఫ్లోరోఫోర్‌ను వ్యక్తీకరించే hCO తో మార్పిడి చేయబడిన నియంత్రణ జంతువులలో లికింగ్ ప్రవర్తనలో ఈ మార్పులు గమనించబడలేదు (అభ్యాస విజయ రేటు: hChR2 89%, EYFP 0%, చిత్రం 5i-1 మరియు అనుబంధ వీడియో 2). ఈ డేటా t-hCO కణాలు బహుమతి కోరుకునే ప్రవర్తనను ప్రేరేపించడానికి ఎలుక న్యూరాన్‌లను సక్రియం చేయగలవని సూచిస్తున్నాయి. ఈ ప్రవర్తనా మార్పులలో ఏ ఎలుక t-hCO న్యూరల్ సర్క్యూట్‌లు పాల్గొనవచ్చో తెలుసుకోవడానికి, 90 నిమిషాల తర్వాత శిక్షణ పొందిన జంతువులు మరియు సేకరించిన కణజాలాలలో మేము t-hCO ను ఆప్టోజెనెటికల్‌గా యాక్టివేట్ చేసాము. ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ ప్రేరేపిత ప్రవర్తనలో పాల్గొన్న అనేక మెదడు ప్రాంతాలలో కార్యాచరణ-ఆధారిత FOS ప్రోటీన్ యొక్క వ్యక్తీకరణను వెల్లడించింది, వీటిలో మధ్యస్థ ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్, మధ్యస్థ థాలమస్ మరియు పెరియాక్వెడక్టల్ గ్రే మ్యాటర్ ఉన్నాయి, ఇది ప్రేరేపించబడని నియంత్రణ జంతువులలో లేదా జంతువులలో వ్యక్తీకరించబడింది. బియ్యం. 5m). కలిసి తీసుకుంటే, ఈ డేటా t-hCO ప్రవర్తనను నడపడానికి ఎలుక న్యూరాన్ కార్యకలాపాలను మాడ్యులేట్ చేయగలదని సూచిస్తుంది.
న్యూరల్ ఆర్గానాయిడ్లు ఇన్ విట్రోలో మానవ అభివృద్ధి మరియు వ్యాధిని అధ్యయనం చేయడానికి ఒక ఆశాజనక వ్యవస్థను సూచిస్తాయి, కానీ ఇన్ వివోలో ఉన్న సర్క్యూట్ల మధ్య కనెక్షన్లు లేకపోవడం వల్ల అవి పరిమితం చేయబడ్డాయి. ఇన్ వివోలో మానవ కణాల అభివృద్ధి మరియు పనితీరును అధ్యయనం చేయడానికి రోగనిరోధక శక్తి లేని ప్రారంభ ప్రసవానంతర ఎలుకల S1లోకి hCO ను మార్పిడి చేసే ఒక నవల వేదికను మేము అభివృద్ధి చేసాము. ఇన్ విట్రో28లో గమనించని పరిణతి చెందిన కణ రకాలను t-hCO అభివృద్ధి చేస్తుందని మరియు t-hCO ఎలుకల మెదడులో శరీర నిర్మాణపరంగా మరియు క్రియాత్మకంగా విలీనం చేయబడిందని మేము చూపించాము. ఎలుకల నాడీ సర్క్యూట్లలో t-hCO యొక్క ఏకీకరణ మానవ సెల్యులార్ కార్యకలాపాలు మరియు అధ్యయనం చేసిన జంతువుల ప్రవర్తన మధ్య సంబంధాన్ని ఏర్పరచడానికి మాకు వీలు కల్పించింది, t-hCO న్యూరాన్లు ప్రవర్తనా ప్రతిస్పందనలను నడపడానికి ఎలుక నాడీ కార్యకలాపాలను మాడ్యులేట్ చేయగలవని చూపిస్తుంది.
ఎలుకల మెదడుల్లోకి మానవ కణాలను మార్పిడి చేయడంపై మునుపటి పరిశోధనల కంటే మేము వివరించిన ప్లాట్‌ఫామ్‌కు అనేక ప్రయోజనాలు ఉన్నాయి. మొదట, మేము hCO ను ప్రసవానంతర ఎలుకల అభివృద్ధి చెందుతున్న కార్టెక్స్‌లోకి మార్పిడి చేసాము, ఇది శరీర నిర్మాణ సంబంధమైన మరియు క్రియాత్మక ఏకీకరణను సులభతరం చేస్తుంది. రెండవది, t-hCO MRI పర్యవేక్షణ ప్రత్యక్ష జంతువులలో అంటుకట్టుట స్థానం మరియు పెరుగుదలను అధ్యయనం చేయడానికి మాకు వీలు కల్పించింది, ఇది దీర్ఘకాలిక బహుళ-జంతు అధ్యయనాలను నిర్వహించడానికి మరియు అనేక hiPS కణ తంతువుల విశ్వసనీయతను స్థాపించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. చివరగా, మానవ కణాలకు తక్కువ విధ్వంసకరం మరియు ఎలుక మెదడుల్లో మానవ కార్టెక్స్ న్యూరాన్‌ల ఏకీకరణ మరియు ఉత్పత్తిని ప్రోత్సహించగల వివిక్త సింగిల్ సెల్ సస్పెన్షన్‌లను కాకుండా, చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న ఆర్గానాయిడ్‌లను మార్పిడి చేసాము.
ఈ ప్లాట్‌ఫామ్‌లో పురోగతి ఉన్నప్పటికీ, టెంపోరల్, స్పేషియల్ మరియు క్రాస్-స్పీసీస్ పరిమితులు అభివృద్ధి ప్రారంభ దశలో మార్పిడి తర్వాత కూడా అధిక విశ్వసనీయతతో మానవ నాడీ సర్క్యూట్‌లు ఏర్పడకుండా నిరోధిస్తాయని మేము అంగీకరిస్తున్నాము. ఉదాహరణకు, t-hCO లో గమనించిన ఆకస్మిక కార్యాచరణ కార్టికల్ అభివృద్ధి సమయంలో గమనించిన లయబద్ధమైన కార్యాచరణకు సమానమైన అభివృద్ధి సమలక్షణాన్ని సూచిస్తుందా లేదా t-hCO లో ఉన్న అణచివేసే కణ రకాలు లేకపోవడం వల్ల జరిగిందా అనేది స్పష్టంగా లేదు. అదేవిధంగా, t-hCO లో లామినేషన్ లేకపోవడం గొలుసు కనెక్టివిటీని ఎంతవరకు ప్రభావితం చేస్తుందో స్పష్టంగా లేదు. భవిష్యత్ పని మానవ మైక్రోగ్లియా, మానవ ఎండోథెలియల్ కణాలు మరియు అసెంబ్లీ 6 ఇన్ విట్రోను ఉపయోగించి చూపిన విధంగా GABAergic ఇంటర్న్‌యూరాన్‌ల యొక్క వివిధ నిష్పత్తులు వంటి ఇతర కణ రకాలను ఏకీకృతం చేయడంపై దృష్టి పెడుతుంది, అలాగే మార్చబడిన t-hCO లో నాడీ ఏకీకరణ మరియు ప్రాసెసింగ్ ఎలా జరుగుతుందో అర్థం చేసుకోవడంపై దృష్టి పెడుతుంది. రోగుల నుండి పొందిన కణాలలో ట్రాన్స్క్రిప్షనల్, సినాప్టిక్ మరియు ప్రవర్తనా స్థాయిలు.
మొత్తంమీద, ఈ ఇన్ వివో ప్లాట్‌ఫామ్ ఇన్ విట్రో మానవ మెదడు అభివృద్ధి మరియు వ్యాధి పరిశోధనలను పూర్తి చేయగల శక్తివంతమైన వనరును సూచిస్తుంది. ఈ ప్లాట్‌ఫామ్ ఇతరత్రా అస్పష్టంగా ఉన్న రోగి-ఉత్పన్న కణాలలో నవల స్ట్రాండ్-స్థాయి ఫినోటైప్‌లను కనుగొనడానికి మరియు కొత్త చికిత్సా వ్యూహాలను పరీక్షించడానికి మాకు వీలు కల్పిస్తుందని మేము అంచనా వేస్తున్నాము.
గతంలో వివరించిన విధంగా మేము HiPS కణాల నుండి hCO2.5 ను ఉత్పత్తి చేసాము. ఫీడర్ పొరలపై కల్చర్ చేయబడిన hiPS కణాల నుండి hCO ఉత్పత్తిని ప్రారంభించడానికి, డిస్పేస్ (0.35 mg/mL) ఉపయోగించి కల్చర్ డిష్‌ల నుండి hiPS కణాల చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న కాలనీలను తొలగించి, hiPS సెల్ కల్చర్ మాధ్యమంతో వంటకాలను కలిగి ఉన్న అల్ట్రా-తక్కువ అటాచ్‌మెంట్ ప్లాస్టిక్ కల్చర్‌లకు బదిలీ చేసాము. (కార్నింగ్) రెండు SMAD ఇన్హిబిటర్లు డోర్సోమోర్ఫిన్ (5 μM; P5499, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) మరియు SB-431542 (10 μM; 1614, టోక్రిస్) మరియు ROCK ఇన్హిబిటర్ Y-27632 (10 μM; S1049, సెల్లెక్‌కెమ్) తో అనుబంధంగా ఉంది. మొదటి 5 రోజుల్లో, hiPS సెల్ మాధ్యమం ప్రతిరోజూ మార్చబడింది మరియు డోర్సోమోర్ఫిన్ మరియు SB-431542 జోడించబడ్డాయి. సస్పెన్షన్‌లో ఆరవ రోజున, న్యూరల్ స్పిరాయిడ్‌లను న్యూరోబాసల్-A (10888, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), విటమిన్ A లేకుండా B-27 సప్లిమెంట్ (12587, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), గ్లూటామాక్స్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), పెన్సిలిన్ మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) కలిగిన న్యూరల్ మాధ్యమానికి బదిలీ చేశారు మరియు 24వ రోజు వరకు ఎపిడెర్మల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (EGF; 20 ng ml−1; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D సిస్టమ్స్)తో భర్తీ చేశారు. 25వ రోజు నుండి 42వ రోజు వరకు, మీడియం మెదడు-ఉత్పన్నమైన న్యూరోట్రోఫిక్ ఫ్యాక్టర్ (BDNF; 20 ng ml−1, పెప్రోటెక్) మరియు న్యూరోట్రోఫిన్ 3 (NT3; 20 ng ml−1; పెప్రోటెక్)తో భర్తీ చేయబడింది, ప్రతి రెండు రోజులకు మీడియం మార్పులు చేయబడ్డాయి. సస్పెన్షన్‌లో ఆరవ రోజున, న్యూరల్ స్పిరాయిడ్‌లను న్యూరోబాసల్-A (10888, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), విటమిన్ A లేకుండా B-27 సప్లిమెంట్ (12587, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), గ్లూటామాక్స్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), పెన్సిలిన్ మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) కలిగిన న్యూరల్ మాధ్యమానికి బదిలీ చేశారు మరియు 24వ రోజు వరకు ఎపిడెర్మల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (EGF; 20 ng ml−1; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D సిస్టమ్స్)తో భర్తీ చేశారు. 25వ రోజు నుండి 42వ రోజు వరకు, మీడియం మెదడు-ఉత్పన్నమైన న్యూరోట్రోఫిక్ ఫ్యాక్టర్ (BDNF; 20 ng ml−1, పెప్రోటెక్) మరియు న్యూరోట్రోఫిన్ 3 (NT3; 20 ng ml−1; పెప్రోటెక్)తో భర్తీ చేయబడింది, ప్రతి రెండు రోజులకు మీడియం మార్పులు చేయబడ్డాయి.సస్పెన్షన్‌లో ఆరవ రోజున, న్యూరల్ స్పిరాయిడ్‌లను న్యూరోబాసల్-ఎ (10888, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), విటమిన్ ఎ లేకుండా బి-27 సప్లిమెంట్ (12587, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), గ్లూటామాక్స్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), పెన్సిలిన్ కలిగిన న్యూరల్ మాధ్యమానికి బదిలీ చేశారు.మరియు స్ట్రెప్టోమిషన్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) మరియు డోపోల్నెన్ ఎపిడెర్మల్ ఫ్యాక్టోరమ్ రోస్టా (EGF; 20 ng/ml; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫిబ్రవరి 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D సిస్టమ్స్) నుండి 24-వ తేదీ వరకు. మరియు స్ట్రెప్టోమైసిన్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) మరియు ఎపిడెర్మల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (EGF; 20 ng/ml; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D సిస్టమ్స్) తో 24వ రోజు వరకు అనుబంధంగా ఇవ్వబడుతుంది.25 నుండి 42 రోజుల వరకు, మెదడు-ఉత్పన్నమైన న్యూరోట్రోఫిక్ కారకం (BDNF; 20 ng ml-1, పెప్రోటెక్) మరియు న్యూరోట్రోఫిన్ 3 (NT3; 20 ng ml-1, పెప్రోటెక్) మాధ్యమానికి జోడించబడ్డాయి, ప్రతి రోజు మాధ్యమాన్ని మారుస్తున్నాయి.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，లైఫ్ టెక్నాలజీస్）、不含维生紉补充剂（12587,లైఫ్ టెక్నాలజీస్）、గ్లుటామాక్స్（1:100,లైఫ్ టెక్నాలజీస్ సాంకేతికతలు）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D సిస్టమ్స్）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D సిస్టమ్స్）直至第24在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 న్యూరోబాసల్-ఎ （10888 ， లైఫ్ టెక్నాలజీస్ 紉的 b-27 补充剂 （12587 , లైఫ్ టెక్నాలజీస్） గ్లుటామాక్స్ （1: 100 , లైఫ్ టెక్నోజిస్ 100 , లైఫ్ టెక్నాలజీస్ 表皮 生长 因子 （（20 ng ml-1 r & d సిస్టమ్స్） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng R&D సిస్టమ్స్ 直至第24天. ఈ రోజు 6-వ తేదీ సుస్పెంజి నైరోస్ఫెర్రీ బైలీ పెరెవెడెన్స్ న డోబావ్కు, సోడర్‌జాష్యు నైరోబాజల్-ఎ (10888, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), В-27 без витамина А (12587, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), గ్లుటామాక్స్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), పెనిషిలిన్- నైట్రాలిజోవానియస్ స్ట్రెప్‌టొమ్‌లు (లైఫ్1010) డోబావ్లెనియం ఎపిడెర్మల్నోగో ఫ్యాక్టోరా రోస్టా (EGF; 20 ng ml-1; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫ్యాక్టోరా రోస్టా ఫోబ్లాస్టోవ్ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; 6వ రోజున, న్యూరోస్పియర్ సస్పెన్షన్‌లను న్యూరోబేసల్-A (10888, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), విటమిన్ A లేని B-27 సప్లిమెంట్ (12587, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), గ్లూటామాక్స్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్), పెన్సిలిన్-న్యూట్రలైజ్డ్ స్ట్రెప్టోమైసిన్ (1:100, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) కలిగిన సప్లిమెంట్‌కు మార్చారు, వీటిని ఎపిడెర్మల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (EGF; 20 ng ml-1; R&D సిస్టమ్స్) మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1తో అనుబంధించారు; R&D సిస్టమ్స్) 24-వ తేదీ వరకు. (R&D సిస్టమ్స్) 24వ రోజు వరకు.25 నుండి 42 రోజుల వరకు, మెదడు-ఉత్పన్నమైన న్యూరోట్రోఫిక్ కారకం (BDNF; 20 ng ml-1, పెప్రోటెక్) మరియు న్యూరోట్రోఫిక్ కారకం 3 (NT3; 20 ng ml-1, పెప్రోటెక్) లను ప్రతి రెండు రోజులకు ఒకసారి కల్చర్ మాధ్యమానికి జోడించారు. మీడియం మార్పు ఒకసారి.43వ రోజు నుండి, hCO ప్రతి 4–6 రోజులకు మీడియం మార్పుతో అనుబంధించబడని న్యూరోబాసల్-A మాధ్యమంలో (NM; 1088022, థర్మో ఫిషర్) నిర్వహించబడింది. ఫీడర్‌లెస్ పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన hiPS కణాల నుండి hCO పొందడానికి, hiPS కణాలను 37°C వద్ద 7 నిమిషాల పాటు అక్యుటేజ్ (AT-104, ఇన్నోవేట్ సెల్ టెక్నాలజీస్) తో పొదిగించి, సింగిల్ సెల్స్‌గా విడదీసి, ROCK ఇన్హిబిటర్ Y-27632 (10 μM; S1049, సెల్లెక్‌కెమ్) తో అనుబంధించబడిన ఎసెన్షియల్ 8 మాధ్యమంలో బావికి 3 × 106 సింగిల్ సెల్స్ సాంద్రతతో అగ్రివెల్ 800 ప్లేట్లపై (34815, STEMCELL టెక్నాలజీస్) పూత పూయబడింది. 24 గంటల తర్వాత, బావులలోని మీడియాను డోర్సోమోర్ఫిన్ (2.5 μM; P5499, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) మరియు SB-431542 (10 μM; 1614) తో అనుబంధంగా ఉన్న ఎసెన్షియల్ 6 మీడియా (A1516401, లైఫ్ టెక్నాలజీస్) కలిగిన మీడియాలోకి పైకి క్రిందికి పైప్ చేయబడ్డాయి. , టోక్రిడా). 2 నుండి 6 రోజుల వరకు, ఎసెన్షియల్ 6 మీడియంను ప్రతిరోజూ డోర్సోమోర్ఫిన్ మరియు సప్లిమెంట్ SB-431542 తో భర్తీ చేశారు. ఆరవ రోజు నుండి, న్యూరోస్పియర్ సస్పెన్షన్లు న్యూరోబాసల్ మాధ్యమానికి బదిలీ చేయబడ్డాయి మరియు పైన వివరించిన విధంగా నిర్వహించబడ్డాయి.
స్టాన్‌ఫోర్డ్ యూనివర్సిటీ లాబొరేటరీ యానిమల్ కేర్ అడ్మినిస్ట్రేటివ్ కమిటీ (APLAC) ఆమోదించిన జంతు సంరక్షణ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా అన్ని జంతు ప్రక్రియలు జరిగాయి. గర్భిణీ యూథైమిక్ RNU (rnu/+) ఎలుకలను కొనుగోలు చేశారు (చార్లెస్ రివర్ లాబొరేటరీస్) లేదా ఇంట్లో ఉంచారు. జంతువులను ఆహారం మరియు నీటి యాడ్ లిబిటమ్‌తో 12 గంటల కాంతి-చీకటి చక్రంలో ఉంచారు. మూడు నుండి ఏడు రోజుల వయస్సు గల నగ్న (FOXN1–/–) ఎలుక పిల్లలను ఏరివేతకు ముందు అపరిపక్వ మీసాల పెరుగుదల ద్వారా గుర్తించారు. కుక్కపిల్లలకు (మగ మరియు ఆడ) 2-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో మత్తుమందు ఇచ్చి స్టీరియోటాక్సిక్ ఫ్రేమ్‌పై ఉంచారు. డ్యూరా మేటర్ యొక్క సమగ్రతను కొనసాగిస్తూ S1 కంటే దాదాపు 2-3 మిమీ వ్యాసం కలిగిన పుర్రె యొక్క ట్రెపనేషన్ నిర్వహించబడింది. తరువాత క్రానియోటమీ వెలుపల 30-G సూదిని (సుమారు 0.3 మిమీ) ఉపయోగించి డ్యూరాను కుట్టండి. తర్వాత HCO ను సన్నని 3×3 సెం.మీ పారాఫిల్మ్‌కు అప్లై చేసి అదనపు మాధ్యమాన్ని తొలగించండి. 23 G, 45° సూదికి జతచేయబడిన హామిల్టన్ సిరంజిని ఉపయోగించి, సూది యొక్క అత్యంత దూరపు చివరలోకి hCO ను సున్నితంగా లాగండి. తరువాత స్టీరియోటాక్సిక్ పరికరానికి అనుసంధానించబడిన సిరంజి పంపుపై సిరంజిని అమర్చండి. తరువాత సూది కొనను డ్యూరాలో (z = 0 మిమీ) గతంలో తయారు చేసిన 0.3 మిమీ వెడల్పు గల పంక్చర్ రంధ్రంపై ఉంచండి మరియు సూది డ్యూరా మేటర్ A మధ్య ఉండే వరకు సిరంజిని 1–2 మిమీ (z = సుమారు –1.5 మిమీ) కుదించండి. దట్టమైన సీల్ ఏర్పడుతుంది. తరువాత సిరంజిని కార్టికల్ ఉపరితలం మధ్యలో z = -0.5 మిమీ వద్ద పెంచండి మరియు నిమిషానికి 1-2 µl చొప్పున hCO ని ఇంజెక్ట్ చేయండి. hCO ఇంజెక్షన్ పూర్తయిన తర్వాత, సూదిని నిమిషానికి 0.2-0.5 మిమీ చొప్పున ఉపసంహరించుకుంటారు, చర్మాన్ని కుట్టిస్తారు మరియు కుక్కపిల్లని వెంటనే వెచ్చని తాపన ప్యాడ్ మీద పూర్తిగా కోలుకునే వరకు ఉంచుతారు. కొన్ని జంతువులను ద్వైపాక్షికంగా మార్పిడి చేస్తారు.
అన్ని జంతు ప్రక్రియలు స్టాన్‌ఫోర్డ్ విశ్వవిద్యాలయం APLAC ఆమోదించిన జంతు సంరక్షణ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి. ఎలుకలను (మార్పిడి తర్వాత 60 రోజుల కంటే ఎక్కువ) 5% ఐసోఫ్లోరేన్ అనస్థీషియాతో ప్రేరేపించారు మరియు ఇమేజింగ్ సమయంలో 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో మత్తుమందు ఇచ్చారు. విజువలైజేషన్ కోసం, ఇంటర్నేషనల్ ఎలక్ట్రిక్ కంపెనీ (IECO) గ్రేడియంట్ డ్రైవ్‌తో 7 టెస్లా యాక్టివ్‌గా షీల్డ్ చేయబడిన క్షితిజ సమాంతర బోర్‌హోల్ స్కానర్ బ్రూకర్ (బ్రూకర్ కార్ప్.), 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) అంతర్గత వ్యాసం కలిగిన షీల్డ్ గ్రేడియంట్ ఇన్సర్ట్‌ను AVANCE ఉపయోగించి ఉపయోగించారు. III, ఎనిమిది-ఛానల్ మల్టీ-కాయిల్ RF మరియు మల్టీ-కోర్ సామర్థ్యాలు మరియు దానితో పాటు పారావిజన్ 6.0.1 ప్లాట్‌ఫారమ్. 86 mm అంతర్గత వ్యాసం కలిగిన యాక్టివ్‌గా డికపుల్డ్ వాల్యూమెట్రిక్ RF కాయిల్ మరియు రిసీవ్ కోసం మాత్రమే నాలుగు-ఛానల్ క్రయో-కూల్డ్ RF కాయిల్‌ని ఉపయోగించి రికార్డింగ్ నిర్వహించబడింది. 16 స్లైస్ క్యాప్చర్‌లతో యాక్సియల్ 2D టర్బో-రేర్ (పునరావృత సమయం = 2500 ms, ఎకో సమయం = 33 ms, 2 సగటులు), స్లైస్ మందం 0.6–0.8 mm, 256 × 256 నమూనాలను కలిగి ఉంటుంది. 2 సెం.మీ అంతర్గత వ్యాసం కలిగిన క్వాడ్రేచర్ ట్రాన్స్‌సీవర్ వాల్యూమెట్రిక్ RF కాయిల్ (రాపిడ్ MR ఇంటర్నేషనల్, LLC) ఉపయోగించి సిగ్నల్స్ స్వీకరించబడ్డాయి. చివరగా, 3D రెండరింగ్ మరియు వాల్యూమ్ విశ్లేషణ కోసం అంతర్నిర్మిత ఇమారిస్ (బిట్‌ప్లేన్) ఉపరితల అంచనా ఫంక్షన్‌లను ఉపయోగించండి. విజయవంతమైన మార్పిడిని మార్పిడి చేసిన అర్ధగోళంలో నిరంతర T2-వెయిటెడ్ MRI సిగ్నల్ యొక్క ప్రాంతాలు ఏర్పడటంగా నిర్వచించారు. మార్పిడి చేసిన అర్ధగోళంలో నిరంతర T2-వెయిటెడ్ MRI సిగ్నల్ యొక్క ప్రాంతాలను ఉత్పత్తి చేయని అంటుకట్టుటగా గ్రాఫ్ట్ తిరస్కరణ నిర్వచించబడింది. సబ్‌కార్టికల్ t-hCO తదుపరి విశ్లేషణ నుండి మినహాయించబడింది.
రెండు-ఫోటాన్ కాల్షియం ఇమేజింగ్ కోసం hCO లో GCaMP6 లను స్థిరంగా వ్యక్తీకరించడానికి, hiPS కణాలను pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro తో సోకింది, తరువాత యాంటీబయాటిక్స్ ఎంపిక చేయబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, కణాలను EDTA తో విడదీసి, పాలీబ్రీన్ (5 μg/ml) మరియు 15 μl వైరస్ సమక్షంలో సుమారు 300,000 కణాల సాంద్రత వద్ద 1 ml ఎసెన్షియల్ 8 మాధ్యమంలో సస్పెండ్ చేశారు. ఆ తరువాత కణాలను 60 నిమిషాలు సస్పెన్షన్‌లో పొదిగించి, బావికి 50,000 కణాల సాంద్రత వద్ద సీడ్ చేశారు. సంగమం తర్వాత, కణాలను 5-10 రోజులు లేదా స్థిరమైన కాలనీలు కనిపించే వరకు 5-10 μg ml-1 ప్యూరోమైసిన్‌తో చికిత్స చేశారు. గతంలో వివరించిన విధంగా తీవ్రమైన hCO సంక్రమణను కొన్ని మార్పులతో నిర్వహించారు. క్లుప్తంగా, 30-45 రోజు hCO ను 100 µl నరాల మాధ్యమం కలిగిన 1.5 ml ఎప్పెండోర్ఫ్ మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్ గొట్టాలలోకి బదిలీ చేశారు. తరువాత దాదాపు 90 µl మాధ్యమం తొలగించబడుతుంది, 3-6 µl హై టైటర్ లెంటివైరస్ (0.5 x 108 నుండి 1.2 x 109 వరకు) ట్యూబ్‌కు జోడించబడుతుంది మరియు hCO 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేటర్‌కు బదిలీ చేయబడుతుంది. తర్వాత ప్రతి ట్యూబ్‌కు 90–100 µl మాధ్యమాన్ని జోడించి, రాత్రిపూట ట్యూబ్‌లను ఇంక్యుబేటర్‌కు తిరిగి ఇవ్వండి. మరుసటి రోజు, తక్కువ అటాచ్‌మెంట్ ప్లేట్‌లలో hCO ను తాజా నరాల మాధ్యమానికి బదిలీ చేయండి. 7 రోజుల తర్వాత, hCO ను విజువలైజేషన్ మరియు ఇన్ఫెక్షన్ నాణ్యతను అంచనా వేయడానికి 24-బావి గాజు దిగువ ప్లేట్‌లకు బదిలీ చేశారు. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE మరియు pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE లను వెక్టర్‌బిల్డర్ ఉత్పత్తి చేస్తుంది. లెంటివైరస్ చాలా ప్రయోగాలలో ఉపయోగించబడుతుంది ఎందుకంటే ఇది హోస్ట్ జన్యువులో విలీనం చేయబడింది, ఇది సోకిన కణ తంతువులలో రిపోర్టర్ జన్యు వ్యక్తీకరణను అనుమతిస్తుంది. రేబిస్ ఫాలో-అప్ కోసం, 30-45 రోజు hCO ను రేబిస్-ΔG-eGFP మరియు AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (ప్లాస్మిడ్ #67528, యాడ్‌జీన్) తో సహ-సోకినట్లు చేసి, 3 రోజులు బాగా కడిగి, S1 లోని ఎలుకలలోకి మార్పిడి చేసి, 7-14 రోజులు వివోలో నిర్వహించారు.
ఇమ్యునోసైటోకెమిస్ట్రీ కోసం, జంతువులకు మత్తుమందు ఇచ్చి, ట్రాన్స్‌కార్డియల్‌గా PBSతో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు, తరువాత 4% పారాఫార్మల్డిహైడ్ (PBSలో PFA; ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ సైన్సెస్). మెదడులను 4% PFAలో 2 గంటలు లేదా రాత్రిపూట 4°C వద్ద స్థిరపరిచారు, PBSలో 30% సుక్రోజ్‌లో 48-72 గంటలు క్రయోప్రెజర్వ్ చేశారు మరియు 1:1, 30% సుక్రోజ్‌లో పొందుపరిచారు: OCT (టిష్యూ-టెక్ OCT కాంపౌండ్ 4583, సాకురా ఫినెటెక్) మరియు కరోనల్ విభాగాలను క్రయోస్టాట్ (లైకా) ఉపయోగించి 30 µm వద్ద తయారు చేశారు. మందపాటి విభాగాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ కోసం, జంతువులను PBSతో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు మరియు మెదడును విచ్ఛేదనం చేసి 300–400 µm వద్ద కరోనల్‌గా విభజించారు మరియు విభాగాలను 30 నిమిషాల పాటు 4% PFAతో స్థిరపరిచారు. తరువాత క్రయోసెక్షన్లు లేదా మందపాటి విభాగాలను PBSతో కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు నిరోధించారు (10% సాధారణ డాంకెన్ సీరం (NDS) మరియు 0.3% ట్రైటాన్ X-100 PBSలో కరిగించబడింది) మరియు 4°C వద్ద బ్లాకింగ్ ద్రావణంతో నిరోధించారు. – ఇంక్యుబేషన్ క్రయోసెక్షన్లను రాత్రిపూట ఇంక్యుబేట్ చేశారు మరియు మందపాటి విభాగాలను 5 రోజులు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఉపయోగించిన ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలు: యాంటీ-న్యూయుఎన్ (మౌస్, 1:500; ab104224, abcam) యాంటీ-CTIP2 (ఎలుక, 1:300; ab18465, abcam), యాంటీ-GFAP (కుందేలు, 1:1,000; Z0334, డాకో), యాంటీ-GFP (చికెన్, 1:1,000; GTX13970, జీన్‌టెక్స్), యాంటీ-HNA (మౌస్, 1:200; ab191181, abcam), యాంటీ-న్యూయుఎన్ (కుందేలు, 1:500; ABN78, మిల్లిపోర్), యాంటీ-PDGFRA (కుందేలు, 1:200; sc-338, శాంటా క్రూజ్), యాంటీ-PPP1R17 (కుందేలు, 1:200; HPA047819, అట్లాస్ యాంటీబాడీస్), యాంటీ-RECA-1 (మౌస్, 1:50; ab9774, abcam), యాంటీ-SCG2 (కుందేలు, 1:100; 20357-1-AP, ప్రోటీన్‌టెక్), యాంటీ-SOX9 (మేక, 1:500; AF3075, R&D సిస్టమ్స్), నెట్రిన్ G1a (మేక, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), యాంటీ-STEM121 (మౌస్, 1:200; Y40410, టకారా బయో), యాంటీ-SATB2 (మౌస్, 1:50; ab51502, abcam), యాంటీ-GAD65/67 (కుందేలు, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు యాంటీ-IBA1 (మేక, 1:100; ab5076, abcam). ఉపయోగించిన ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలు: యాంటీ-న్యూయుఎన్ (మౌస్, 1:500; ab104224, abcam) యాంటీ-CTIP2 (ఎలుక, 1:300; ab18465, abcam), యాంటీ-GFAP (కుందేలు, 1:1,000; Z0334, డాకో), యాంటీ-GFP (చికెన్, 1:1,000; GTX13970, జీన్‌టెక్స్), యాంటీ-HNA (మౌస్, 1:200; ab191181, abcam), యాంటీ-న్యూయుఎన్ (కుందేలు, 1:500; ABN78, మిల్లిపోర్), యాంటీ-PDGFRA (కుందేలు, 1:200; sc-338, శాంటా క్రజ్), యాంటీ-PPP1R17 (కుందేలు, 1:200; HPA047819, అట్లాస్ యాంటీబాడీస్), యాంటీ-RECA-1 (మౌస్, 1:50; ab9774, abcam), యాంటీ-SCG2 (కుందేలు, 1:100; 20357-1-AP, ప్రోటీన్‌టెక్), యాంటీ-SOX9 (మేక, 1:500; AF3075, R&D సిస్టమ్స్), నెట్రిన్ G1a (మేక, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), యాంటీ-STEM121 (మౌస్, 1:200; Y40410, టకారా బయో), యాంటీ-SATB2 (మౌస్, 1:50; ab51502, abcam), యాంటీ-GAD65/67 (కుందేలు, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు యాంటీ-IBA1 (మేక, 1:100; ab5076, abcam). ఆస్పోల్జోవాలిస్ స్లేడ్యూషియె పర్విచ్న్ యాంటిటెలా: ఆంటీ-న్యూన్ (మిషిన్, 1:500; ab104224, abcam), ANTI,0CT11 ab18465, abcam), Anti-GFAP (క్రోలిచ్, 1:1000; Z0334, డాకో), ఆంటీ- -GFP (కూరిసా, 1:1000; GTX13970, GeneTex), (అంటీ:20, ab191181, abcam), Anti-NeuN (క్రోలిక్, 1:500; ABN78, మిల్లిపోర్), ఆంటీ-PDGFRA (క్రోలిక్, 1:200; sc-338, శాంటా-క్రూస్), అంటీ-PPP1R17, ANTI-PPP1R17; HPA047819, అట్లాస్ యాంటీబాడీస్), Anti-RECA-1 (Mыsh, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (క్రోలిక్ , 1:100; 20357-1-AP, ప్రొటీన్‌టెక్), ANT, 5 AF3075, R&D సిస్టమ్స్), NETRIN G1a (కొసై, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), Anti-STEM121 (మిషిన్ , 1:200; Y40410, తకారా బయో), anti-SATB2 (మీ, 1:50; ab51502, abcam), AD65ти-7 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు అంటీ-IBA1 (కోసా, 1:100; AB5076, ABKAM). ఉపయోగించిన ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలు: యాంటీ-న్యూయుఎన్ (మౌస్, 1:500; ab104224, అబ్‌క్యామ్), యాంటీ-సిటిఐపి2 (ఎలుక, 1:300; ab18465, అబ్‌క్యామ్), యాంటీ-జిఎఫ్‌ఎపి (కుందేలు, 1:1000; Z0334, డాకో), యాంటీ-జిఎఫ్‌పి (చికెన్, 1:1000; GTX13970, జీన్‌టెక్స్), యాంటీ-హెచ్‌ఎన్‌ఎ (మౌస్, 1:200; ab191181, అబ్‌క్యామ్), యాంటీ-న్యూయుఎన్ (కుందేలు, 1:500; ABN78, మిల్లిపోర్), యాంటీ-పిడిజిఎఫ్‌ఆర్‌ఎ (కుందేలు, 1:200; sc-338, శాంటా క్రూజ్), యాంటీ-పిపిపి1ఆర్17 (కుందేలు, 1:200; HPA047819, అట్లాస్ యాంటీబాడీస్), యాంటీ-రెకా-1 (మౌస్, 1:50; ab9774, abcam), యాంటీ- SCG2 (కుందేలు, 1:100; 20357-1-AP, ప్రోటీన్‌టెక్), యాంటీ-SOX9 (మేక, 1:500; AF3075, R&D సిస్టమ్స్), నెట్రిన్ G1a (మేక, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), యాంటీ- STEM121 (మౌస్, 1:200; Y40410, టకారా బయో), యాంటీ- SATB2 (మౌస్, 1:50; ab51502, abcam), యాంటీ- GAD65/67 (కుందేలు, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు యాంటీ- IBA1 (మేక, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2 00;ab18465, abcam）,抗GFAP P（鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex），抗HNA（小鼠, 1:200;ab1911 81, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, మిల్లిపోర్）,抗PDGFRA 1:200；sc-338, శాంటా క్రూజ్, 抗PPP1R17（兔, 1:200;HPA047819, అట్లాస్抗体）, 抗RECA-1 1:100; 20357-1-AP, ప్రొటీన్‌టెక్）, SOX9 సిస్టమ్స్), 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2 :300;ab18465,abcam），抗GFAP -GFP (鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181, abcam），抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, మిల్లిపోర్％弔,抗1: 200;sc-338, శాంటా క్రూజ్, 抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, అట్లాస్ 抗体）,抗RECA-1 100;20357-1-AP, ప్రొటీన్‌టెక్），抗SOX9Y40410, టకారా బయో), యాంటీ-SATB2 (మౌస్, 1:50; ab51502, abcam), యాంటీ-GAD65/67 (కుందేలు, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు యాంటీ-IBA1 (మేక, 1:100; ab5076, abcam).ఉపయోగించిన ప్రాథమిక ప్రతిరోధకాలు: యాంటీ-న్యూఎన్ (మౌస్, 1:500; ab104224, abcam), యాంటీ-CTIP2 (ఎలుక, 1:300; ab18465, abcam), యాంటీ-GFAP (కుందేలు, 1:1000; Z0334, డాకో). , యాంటీ-GFP (చికెన్, 1:1000; GTX13970, జీన్‌టెక్స్), యాంటీ-HNA (మౌస్, 1:200; ab191181, abcam), యాంటీ-NeuN (కుందేలు, 1:500; ABN78, మిల్లిపోర్), యాంటీ-PDGFRA (కుందేలు, 1:200; sc-338, శాంటా క్రూజ్), యాంటీ-PPP1R17 (కుందేలు, 1:200; HPA047819, అట్లాస్ యాంటీబాడీ), యాంటీ-RECA-1 (మౌస్, 1:50; ab9774, abcam), యాంటీ-SCG2 (కుందేలు), 1:100;20357-1-AP, ప్రొటీన్‌టెక్), ఆంటీ-SOX9 (కోసా, 1:500; AF3075, R&D సిస్టమ్స్), NETRIN G1a (కోసా, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), ఆంటీ, 120; STEM10; Y40410, తకారా బయో), ఆంటీ-SATB2 (మీ, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (క్రోలిక్, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్) మరియు 1:10; AB5076, అబ్కామ్). 20357-1-AP, ప్రోటీన్‌టెక్), యాంటీ-SOX9 (మేక, 1:500; AF3075, R&D సిస్టమ్స్), నెట్రిన్ G1a (మేక, 1:100; AF1166, R&D సిస్టమ్స్), యాంటీ-STEM121 (మౌస్, 1:200; Y40410, టకారా బయో), యాంటీ-SATB2 (మౌస్, 1:50; ab51502, abcam), యాంటీ-GAD65/67 (కుందేలు, 1:400; ABN904, మిల్లిపోర్), మరియు యాంటీ-IBA1 (మేక, 1:100; ab5076, abkam).ఆ తరువాత విభాగాలను PBS తో కడిగి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (ఘనీభవించిన విభాగాలు) లేదా రాత్రిపూట 4°C (మందపాటి విభాగాలు) వద్ద 1 గంట పాటు సెకండరీ యాంటీబాడీతో పొదిగించారు. బ్లాకింగ్ ద్రావణంలో 1:1000 కరిగించిన అలెక్సా ఫ్లోర్ సెకండరీ యాంటీబాడీ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) ఉపయోగించబడింది. PBS తో కడిగిన తర్వాత, న్యూక్లియైలను హోచ్స్ట్ 33258 (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) తో దృశ్యమానం చేశారు. చివరగా, స్లయిడ్‌లను కవర్‌లిప్‌లతో (ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మైక్రోస్కోప్‌పై ఆక్వామౌంట్ (పాలీసైన్సెస్) ఉపయోగించి ఉంచారు మరియు చిత్రంపై కీయెన్స్ ఫ్లోరోసెంట్ మైక్రోస్కోప్ (BZ-X ఎనలైజర్) లేదా లైకా TCS SP8 కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (లాస్-ఎక్స్) పై విశ్లేషించారు. చిత్రాలను ImageJ ప్రోగ్రామ్ (ఫిజి) ఉపయోగించి ప్రాసెస్ చేశారు. t-hCO మరియు ఎలుక కార్టెక్స్‌లో మానవ న్యూరాన్‌ల నిష్పత్తిని లెక్కించడానికి, 387.5 μm వెడల్పు గల దీర్ఘచతురస్రాకార చిత్రాలను t-hCO మధ్యలో, ఎలుక కార్టెక్స్ అంచు వద్ద లేదా సమీపంలో తీసుకున్నారు. కణజాల పారదర్శకత, HNA+ కేంద్రకాలు మరియు/లేదా కణజాల ఆటోఫ్లోరోసెన్స్ ఉనికిలో మార్పులను అంచనా వేయడం ద్వారా అంటుకట్టుట అంచులను నిర్ణయించారు. ప్రతి చిత్రంలో, NeuN+ మరియు HNA+ కణాల మొత్తం సంఖ్యను ఒకే ప్రాంతంలోని మొత్తం NeuN+ కణాల సంఖ్యతో విభజించారు. ఇమేజ్ ప్లేన్‌లో కేంద్రకాలు ఉన్న కణాలు మాత్రమే లెక్కించబడుతున్నాయని నిర్ధారించుకోవడానికి, Hoechst+ కూడా ఉన్న కణాలు మాత్రమే గణనలో చేర్చబడ్డాయి. గణాంక లోపాన్ని తగ్గించడానికి కనీసం 1 మిమీతో వేరు చేయబడిన రెండు చిత్రాలను సగటున తీసుకున్నారు.
నమూనా సేకరణకు ఒక వారం ముందు, hCO మార్పిడి జంతువులను (సుమారు 8 నెలల భేదం) చీకటి గదిలో ఉంచి, ఇంద్రియ ఉద్దీపనను తగ్గించడానికి మీసాలను కత్తిరించండి. గతంలో వివరించిన విధంగా, కొన్ని మార్పులతో, కేంద్రకాల ఐసోలేషన్ జరిగింది. క్లుప్తంగా, t-hCO మరియు hCO లను డిటర్జెంట్-మెకానికల్ సెల్ లైసిస్ మరియు 2 ml గ్లాస్ టిష్యూ గ్రైండర్ (D8938, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్/KIMBLE) ఉపయోగించి నాశనం చేశారు. అప్పుడు ముడి కేంద్రకాలను 40 µm ఫిల్టర్ ఉపయోగించి ఫిల్టర్ చేసి, సుక్రోజ్ డెన్సిటీ గ్రేడియంట్ చేయడానికి ముందు 4 °C వద్ద 10 నిమిషాలు 320 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు. సెంట్రిఫ్యూగేషన్ దశ తర్వాత (4°C వద్ద 20 నిమిషాలకు 320 గ్రా), నమూనాలను 0.2 యూనిట్ల µl-1 RNase ఇన్హిబిటర్ (40 u µl-1, AM2682, అంబియన్) జోడించి 0.04% BSA/PBSలో తిరిగి అమర్చారు మరియు 40 µm ఫ్లో ఫిల్టర్ ద్వారా పంపారు. తరువాత విడదీయబడిన కేంద్రకాలను 0.02% BSA కలిగిన PBSలో తిరిగి అమర్చి, క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ చిప్‌లోకి లోడ్ చేశారు (ఒక లేన్‌కు 8,000 కణాల రికవరీ అంచనా వేయబడింది). snRNA-seq లైబ్రరీలను క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) తో తయారు చేశారు. snRNA-seq లైబ్రరీలను క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) తో తయారు చేశారు. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్). snRNA-seq లైబ్రరీలను క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) ఉపయోగించి తయారు చేశారు. snRNA-seq 文库是使用Chromium సింగిల్ సెల్ 3′ GEM、లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium సింగిల్ సెల్ 3′ GEM、లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్). snRNA-seq లైబ్రరీని క్రోమియం సింగిల్ సెల్ 3′ GEM, లైబ్రరీ & జెల్ బీడ్ కిట్ v3 (10x జెనోమిక్స్) ఉపయోగించి తయారు చేశారు.వివిధ నమూనాల నుండి లైబ్రరీలను అడ్మెరా హెల్త్ నోవాసెక్ ఎస్ 4 (ఇల్యూమినా) లో పూల్ చేసి క్రమం చేసింది.
ప్రతి పుటేటివ్ న్యూక్లియర్ బార్‌కోడ్ కోసం జన్యు వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు 10x జెనోమిక్స్ సెల్‌రేంజర్ విశ్లేషణ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 6.1.2) ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి. ప్రత్యేకంగా, రీడ్‌లు mkref కమాండ్‌తో సృష్టించబడిన మానవ (GRCh38, ఎన్సెంబుల్, వెర్షన్ 98) మరియు ఎలుక (Rnor_6.0, ఎన్సెంబుల్, వెర్షన్ 100) రిఫరెన్స్ జన్యువుల కలయికతో సరిపోల్చబడ్డాయి మరియు –include-introns=TRUE కమాండ్‌తో కౌంట్ ఉపయోగించి క్వాంటిటేషన్‌లో ఇంట్రాన్ ప్రాంతాలకు మ్యాప్ చేయబడిన రీడింగ్‌లు ఉంటాయి. t-hCO నమూనాల కోసం, మ్యాప్ చేయబడిన అన్ని రీడ్‌లలో కనీసం 95% మానవ జన్యువుతో సరిపోలాలనే సంప్రదాయవాద అవసరం ఆధారంగా మానవ కేంద్రకాలను గుర్తించారు. అన్ని తదుపరి విశ్లేషణలు R ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 4.1.2) సీరాట్ (వెర్షన్ 4.1.1)32 ఉపయోగించి సెల్‌రేంజర్ నుండి ఫిల్టర్ చేయబడిన బార్‌కోడ్ శ్రేణి అవుట్‌పుట్‌పై నిర్వహించబడ్డాయి.
తదుపరి విశ్లేషణలో అధిక నాణ్యత గల కేంద్రకాలు మాత్రమే చేర్చబడ్డాయని నిర్ధారించుకోవడానికి, ప్రతి నమూనాకు పునరావృత వడపోత ప్రక్రియ అమలు చేయబడింది. మొదట, 1000 కంటే తక్కువ ప్రత్యేక జన్యువులు కనుగొనబడిన మరియు మొత్తం మైటోకాండ్రియాలో 20% కంటే ఎక్కువ ఉన్న తక్కువ-నాణ్యత గల కేంద్రకాలను గుర్తించి తొలగిస్తారు. తదనంతరం, sctransform(vst.flavor=”v2″) ఫంక్షన్‌ను ఉపయోగించి రెగ్యులరైజ్డ్ నెగటివ్ బైనామియల్ రిగ్రెషన్ ద్వారా ముడి జన్యు సంఖ్య మాతృకను సాధారణీకరించారు, ఇది డిఫాల్ట్ పారామితులను ఉపయోగించి 3000 అత్యంత వేరియబుల్ జన్యువులను కూడా గుర్తించింది. ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ఉపయోగించి ఎగువ వేరియబుల్ జన్యువులపై డైమెన్షన్ తగ్గింపు 30 యొక్క డేటా సెట్ డైమెన్షన్‌ను ఉపయోగించి డిఫాల్ట్ పారామితులతో నిర్వహించబడింది (డిమ్స్ = 30 మోకాలి సైట్‌ల దృశ్య తనిఖీ ఆధారంగా ఎంపిక చేయబడింది మరియు అన్ని నమూనాలు మరియు సమిష్టి విశ్లేషణలకు ఉపయోగించబడింది). అప్పుడు అసాధారణంగా తక్కువ జన్యు గణన (10వ శాతం కంటే తక్కువ మధ్యస్థం), అసాధారణంగా అధిక మైటోకాన్డ్రియల్ జన్యు గణన (95వ శాతం కంటే ఎక్కువ మధ్యస్థం) ఆధారంగా జన్యువులను వర్గీకరించడానికి మేము అనేక రౌండ్ల పునరావృత క్లస్టరింగ్ (రిజల్యూషన్ = 1) నిర్వహించాము. తక్కువ నాణ్యత గల పుటేటివ్ కణాలను గుర్తించడానికి మరియు తొలగించడానికి. క్లస్టర్‌లు మరియు/లేదా డబుల్‌ఫైండర్33 ప్యాకేజీని ఉపయోగించి గుర్తించబడిన అనుమానిత కవలల అధిక నిష్పత్తి (సగటున 95వ శాతం కంటే ఎక్కువ డబుల్‌ఫైండర్ స్కోర్). t-hCO నమూనాలు (n=3) మరియు hCO నమూనాలను (n=3) విడిగా విలీనం చేయబడ్డాయి. పైన పేర్కొన్న పారామితులతో ఇంటిగ్రేట్‌డేటా ఫంక్షన్. తరువాత పైన వివరించిన విధంగా ఇంటిగ్రేటెడ్ డేటా సెట్ యొక్క గుణాత్మక వడపోత యొక్క మరొక రౌండ్ నిర్వహించబడింది.
తక్కువ నాణ్యత గల కెర్నల్‌లను తీసివేసిన తర్వాత, ఇంటిగ్రేటెడ్ డేటాసెట్‌ను సమూహం చేశారు (రిజల్యూషన్ = 0.5) మరియు UMAP34 విజువలైజేషన్ ప్రయోజనాల కోసం పొందుపరచారు. ప్రతి క్లస్టర్‌కు మార్కర్ జన్యువులను సాధారణీకరించిన జన్యు వ్యక్తీకరణ డేటా నుండి లెక్కించిన డిఫాల్ట్ పారామితులతో FindMarkers ఫంక్షన్‌ను ఉపయోగించి నిర్ణయించారు. పిండం మరియు వయోజన కార్టికల్ రిఫరెన్స్ డేటాసెట్‌లను మార్కర్ జన్యు వ్యక్తీకరణ 19,20,21,35 మరియు ఉల్లేఖనంతో కలపడం ద్వారా మేము ప్రధాన కణ తరగతులను గుర్తించి వర్గీకరిస్తాము. ముఖ్యంగా, MKI67 మరియు TOP2A యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా ప్రసరణ పూర్వగాములు గుర్తించబడ్డాయి. మైటోటిక్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేకపోవడం, లేట్ మెటాఫేస్ ఫీటల్ కార్టెక్స్‌లో వివరించిన మల్టీపోటెంట్ గ్లియల్ ప్రొజెనిటర్ క్లస్టర్‌లతో అధిక అతివ్యాప్తి మరియు EGFR మరియు OLIG1 వ్యక్తీకరణ ద్వారా ప్రొజెనిటర్ క్లస్టర్‌లు నిర్వచించబడ్డాయి. లేట్ రేడియల్ గ్లియా నుండి ఆస్ట్రోసైట్‌ల పరిపక్వత వరకు ఆస్ట్రోసైట్ భేదం యొక్క అనేక స్థితులను కలిగి ఉండటానికి మేము ఆస్ట్రోసైట్ అనే పదాన్ని ఉపయోగిస్తాము. ఆస్ట్రోసైట్ క్లస్టర్‌లు SLC1A3 మరియు AQP4 యొక్క అధిక స్థాయిలను వ్యక్తపరుస్తాయి మరియు పిండం రేడియల్ గ్లియా మరియు/లేదా వయోజన ఆస్ట్రోసైట్‌ల ఉప రకాలతో మ్యాప్ చేస్తున్నట్లు చూపబడింది. OPCలు PDGFRA మరియు SOX10 లను వ్యక్తపరుస్తుండగా, ఒలిగోడెండ్రోసైట్లు మైలీనేషన్ మార్కర్లను (MOG మరియు MYRF) వ్యక్తపరుస్తాయి. గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లు న్యూరోనల్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ (SYT1 మరియు SNAP25) ఉనికి, GABAergic మార్కర్లు లేకపోవడం (GAD2) మరియు NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, లేదా SATB2 యొక్క వ్యక్తీకరణ ద్వారా గుర్తించబడ్డాయి. GluN న్యూరాన్లు ఎగువ (SATB2 వ్యక్తీకరణ మరియు BCL11B నష్టం) మరియు లోతైన (BCL11B వ్యక్తీకరణ) ఉపవర్గాలుగా విభజించబడ్డాయి. పుటేటివ్ సబ్‌ప్లేట్ (SP) న్యూరాన్లు లోతైన GluN మార్కర్లతో పాటు ST18 మరియు SORCS1 వంటి తెలిసిన SP18 మార్కర్లను వ్యక్తపరుస్తాయి. కోరోయిడ్ ప్లెక్సస్ లాంటి కణాలు TTR వ్యక్తీకరణ ద్వారా గుర్తించబడ్డాయి మరియు మెనింజియల్ లాంటి కణాలు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్-సంబంధిత జన్యువులను వ్యక్తీకరించాయి మరియు రిఫరెన్స్ డేటా సెట్ యొక్క పియల్/వాస్కులర్ కణాలను మ్యాప్ చేశాయి.
లిబ్రా R ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.0.0) ఉపయోగించి అమలు చేయబడిన నమూనాలలో పునరుత్పత్తి చేయబడిన కొత్తగా అభివృద్ధి చేయబడిన సూడో-బ్యాచ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి t-hCO మరియు hCO ఉపవర్గాల మధ్య జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క అవకలన విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. ప్రత్యేకంగా, ప్రతి నమూనా ప్రతిరూపణ కోసం ఇచ్చిన సెల్ తరగతికి కణాలలోని జన్యువుల సంఖ్యను సంగ్రహించడం ద్వారా సమూహాల కోసం edgeR లాగ్-సంభావ్యత పరీక్షలు (వెర్షన్ 3.36.0, ప్యాకేజీ R) నిర్వహించబడ్డాయి. హీట్‌మ్యాప్ విజువలైజేషన్ కోసం, ప్రతి మిలియన్‌కు సాధారణీకరించబడిన (CPM) విలువలు edgeR (cpm() ఫంక్షన్) ఉపయోగించి లెక్కించబడతాయి మరియు స్కేల్ చేయబడతాయి (సగటు = 0 సాధించడానికి, ప్రామాణిక విచలనం = 1). గణనీయంగా అప్‌గ్రూటెడ్ చేయబడిన t-hCO GluN జన్యువుల జీన్ ఒంటాలజీ (GO) సుసంపన్న విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది (బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ కనీసం 10% t-hCO GluN కణాలలో వ్యక్తీకరించబడిన 0.05 కంటే తక్కువ P విలువను సరిదిద్దారు మరియు కనీసం 2 సార్లు మార్పులో రెట్లు పెరుగుదల). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ఉపయోగించి ప్రదర్శించబడింది. మేము డిఫాల్ట్ పారామితులతో ToppFun యాప్‌ను ఉపయోగిస్తాము మరియు GO-ఉల్లేఖన హైపర్‌జియోమెట్రిక్ పరీక్షల నుండి లెక్కించిన బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్-సరిచేసిన P-విలువలను నివేదిస్తాము.
మా snRNA-seq క్లస్టర్‌లను ప్రాథమిక సింగిల్-సెల్ RNA-seq లేదా వయోజన snRNA-seq19,20,21,22 యొక్క రిఫరెన్స్ అధ్యయనాల నుండి ఉల్లేఖన సెల్ క్లస్టర్‌లతో సరిపోల్చడానికి, మేము జత చేసిన డేటాసెట్ ఇంటిగ్రేషన్ విధానాన్ని వర్తింపజేసాము. డేటాసెట్‌ల మధ్య క్లస్టర్ అతివ్యాప్తులను ఏకీకృతం చేయడానికి మరియు పోల్చడానికి మేము Seuratలో SCTransform (v2) సాధారణీకరణ వర్క్‌ఫ్లోను ఉపయోగించాము (పైన పేర్కొన్న పారామితులను ఉపయోగించి). గణన సామర్థ్యం కోసం వ్యక్తిగత డేటాసెట్‌లు యాదృచ్ఛికంగా అసలు క్లస్టర్‌కు 500 కణాలు లేదా కోర్‌ల వరకు ఉపసమితి చేయబడ్డాయి. గతంలో వివరించిన విధంగా ఇలాంటి విధానాన్ని ఉపయోగించి, క్లస్టర్ అతివ్యాప్తి అనేది రిఫరెన్స్ క్లస్టర్ యొక్క లేబుల్‌తో అతివ్యాప్తి చెందిన ప్రతి పూల్డ్ క్లస్టర్‌లోని కణాలు లేదా కేంద్రకాల నిష్పత్తిగా నిర్వచించబడింది. GluNలను మరింత వర్గీకరించడానికి, మా GluN కణాలకు రిఫరెన్స్ డేటాసెట్ లేబుల్‌లను కేటాయించడానికి మేము Seurat యొక్క TransferData వర్క్‌ఫ్లోను GluN సబ్‌సెట్ డేటా కోసం ఉపయోగించాము.
t-hCO మరియు hCO నమూనాల గ్లోబల్ ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ యొక్క పరిపక్వ స్థితిని అంచనా వేయడానికి, మేము మా సూడో-బల్క్ నమూనాలను బ్రెయిన్‌స్పాన్/సైక్‌ఎన్‌కోడ్23తో పోల్చాము, ఇది మానవ మెదడు అభివృద్ధిని విస్తరించి ఉన్న పెద్ద RNA శ్రేణిని కలిగి ఉంటుంది. గర్భధారణ తర్వాత 10 వారాల తర్వాత కార్టికల్ నమూనాల నుండి మిశ్రమ నమూనా-సాధారణీకరించిన జన్యు వ్యక్తీకరణ మాతృకపై మేము PCAని ప్రదర్శించాము మరియు తరువాత, బ్రెయిన్‌స్పాన్ కార్టికల్ నమూనాలలో (క్యూబిక్ మోడల్‌ను ఉపయోగించి వయస్సు ద్వారా వివరించబడిన అభివృద్ధి వైవిధ్యంలో 50% కంటే ఎక్కువ అని నిర్వచించబడింది) గతంలో గుర్తించబడిన 5567 జన్యువులలో (మా డేటాతో కలిపి) 38. అదనంగా, గతంలో వివరించిన విధంగా నాన్-నెగటివ్ మ్యాట్రిక్స్ ఫ్యాక్టరైజేషన్‌ను ఉపయోగించి న్యూరో డెవలప్‌మెంట్ యొక్క ప్రధాన ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ సంతకాలతో అనుబంధించబడిన జన్యువులను మేము పొందాము. నాన్-నెగటివ్ మ్యాట్రిక్స్ ఫ్యాక్టరైజేషన్ విధానాన్ని ఉపయోగించి లెక్కించిన నమూనా బరువులు జు మరియు ఇతరులు వివరించిన ఐదు సంతకాలలో ప్రతిదానికి విస్తరించిన డేటాతో అంజీర్ 5bలో ప్లాట్ చేయబడ్డాయి. మళ్ళీ, కార్యాచరణ ఆధారిత ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మార్కర్లు గతంలో ప్రచురించబడిన అధ్యయనాల నుండి తీసుకోబడ్డాయి. ముఖ్యంగా, సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3 హర్వాటిన్ మరియు ఇతరుల నుండి దృశ్య ఉద్దీపన తర్వాత మౌస్ విజువల్ కార్టెక్స్ snRNA-seq సేకరణ ద్వారా గుర్తించబడిన గ్లూటామాటర్జిక్ న్యూరాన్లలో ERG మరియు LRG గణనీయంగా నియంత్రించబడ్డాయి. 16. మానవ-సుసంపన్నమైన LRG లను KCl- ఉత్తేజిత మానవ పిండం మెదడు సంస్కృతుల నుండి పొందారు మరియు ఉద్దీపన తర్వాత 6 గంటల తర్వాత సేకరించారు, మరియు ఫిల్టర్ చేయబడిన జన్యువులు మానవులలో గణనీయంగా నియంత్రించబడ్డాయి కానీ ఎలుకలలో కాదు (అనుబంధ పట్టిక 4). ఈ జన్యు సెట్‌లను ఉపయోగించి జన్యు సెట్ సుసంపన్నత యొక్క విశ్లేషణ వన్-వే ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.
ఎలుకలకు ఐసోఫ్లోరేన్‌తో మత్తుమందు ఇచ్చి, మెదడులను తొలగించి చల్లని (సుమారు 4°C) ఆక్సిజన్‌తో కూడిన (95% O2 మరియు 5% CO2) సుక్రోజ్ ద్రావణంలో ఉంచి, 234 mM సుక్రోజ్, 11 mM గ్లూకోజ్, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 మరియు 0.5 mM CaCl2 (సుమారు 310 mOsm) కలిగిన విభాగాలను తయారు చేయాలి. గతంలో వివరించిన విధంగా t-hCO కలిగిన ఎలుక మెదడు కరోనల్ విభాగాలు (300–400 µm) లైకా VT1200 వైబ్రాటోమ్‌ను ఉపయోగించి తయారు చేయబడ్డాయి39. తరువాత విభాగాలను నిరంతర గది ఉష్ణోగ్రత ఆక్సిజనేషన్‌తో కూడిన సెక్షనింగ్ చాంబర్‌కు బదిలీ చేశారు, వీటిలో ACSF ఉంటుంది, వీటిని తయారు చేశారు: 10 mM గ్లూకోజ్, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 మరియు 126 mM NaCl (298 mOsm). రికార్డింగ్‌కు కనీసం 45 నిమిషాల ముందు. విభాగాలను ముంచిన గదిలో రికార్డ్ చేశారు, అక్కడ వాటిని నిరంతరం ACSF (95% O2 మరియు 5% CO2 వైయల్) తో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు. అన్ని డేటా గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నమోదు చేయబడింది. t-hCO న్యూరాన్‌లను 127 mM పొటాషియం గ్లూకోనేట్, 8 mM NaCl, 4 mM మెగ్నీషియం ATP, 0.3 mM సోడియం GTP, 10 mM HEPES, మరియు 0.6 mM EGTA, pH 7.2 కలిగిన ద్రావణంతో నింపిన బోరోసిలికేట్ గ్లాస్ పైపెట్‌తో ముగించారు, అంతర్గత ద్రావణం KOH (290 mOsm)తో సర్దుబాటు చేయబడింది. కోలుకోవడానికి, బయోసైటిన్ (0.2%) రికార్డింగ్ ద్రావణానికి జోడించబడింది.
మల్టీక్లాంప్ 700B యాంప్లిఫైయర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) మరియు డిజిడేటా 1550B డిజిటైజర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ఉపయోగించి డేటాను పొందారు, తక్కువ-పాస్ 2 kHz వద్ద ఫిల్టర్ చేయబడింది, 20 kHz వద్ద డిజిటైజ్ చేయబడింది మరియు క్లాంప్‌ఫిట్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్), ఆరిజిన్ (ఆరిజిన్ ప్రో) ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది. 2021b, ఆరిజిన్‌ల్యాబ్). మరియు కస్టమ్ MATLAB ఫంక్షన్‌లు (మ్యాథ్‌వర్క్స్). JPCalc ఉపయోగించి జంక్షన్ పొటెన్షియల్ లెక్కించబడింది మరియు ఎంట్రీలు -14 mV యొక్క లెక్కించిన విలువకు సర్దుబాటు చేయబడ్డాయి. ఆపరేషన్ IV -250 నుండి 750 pA వరకు 10-25 pA దశల్లో ప్రస్తుత దశల శ్రేణిని కలిగి ఉంటుంది.
గతంలో వివరించిన విధంగా, hCO న్యూరాన్‌ల ప్యాచ్-క్లాంప్ రికార్డింగ్ సమయంలో థాలమోకార్టికల్ ముక్కలలో థాలమస్, తెల్ల పదార్థం మరియు S1 అఫెరెంట్‌లు విద్యుత్తుగా ప్రేరేపించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, మెదడును 10° కోణంలో వంచి ఉన్న 3D ప్రింటింగ్ టేబుల్‌పై ఉంచారు మరియు మెదడు ముందు భాగాన్ని 35° కోణంలో కత్తిరించారు. తరువాత మెదడును కట్ చేసిన ఉపరితలానికి అతికించి విభజించారు, థాలమోకార్టికల్ పొడుచుకు వచ్చిన ఆక్సాన్‌లను సంరక్షించారు. బైపోలార్ టంగ్‌స్టన్ ఎలక్ట్రోడ్‌లు (0.5 MΩ) రెండవ మైక్రోమానిప్యులేటర్‌పై అమర్చబడ్డాయి మరియు ప్రతి కణానికి నాలుగు ప్రాంతాలను (లోపలి గుళిక, తెల్ల పదార్థం, S1 మరియు hCO) ఉత్తేజపరిచేందుకు వ్యూహాత్మకంగా ఉంచబడ్డాయి. 0.03–0.1 Hz వద్ద 300 µA ఫాసిక్ స్టిమ్యులేషన్ తర్వాత సినాప్టిక్ ప్రతిస్పందనలను రికార్డ్ చేయండి.
hChR2-వ్యక్తీకరించే hCO న్యూరాన్‌లను 480 nm వద్ద సక్రియం చేశారు మరియు LED (ప్రిజ్‌మాటిక్స్) ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన కాంతి పల్స్‌లను ×40 ఆబ్జెక్టివ్ (0.9 NA; ఒలింపస్) ద్వారా కణాల దగ్గర hChR2 వ్యక్తీకరణను రికార్డ్ చేయడానికి ప్రయోగించారు. ప్రకాశించే క్షేత్ర వ్యాసం సుమారు 0.5 మిమీ మరియు మొత్తం శక్తి 10-20 mW. పల్స్ వెడల్పు 10 msకి సెట్ చేయబడింది, ఇది ప్రవర్తనా అభ్యాస ప్రయోగం సమయంలో ఇచ్చిన పల్స్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. 1 నుండి 20 Hz వరకు వివిధ స్టిమ్యులేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీలను ఉపయోగించారు, కానీ సిరీస్‌లోని మొదటి పల్స్ మాత్రమే పరిమాణీకరణ కోసం ఉపయోగించబడింది. సినాప్టిక్ నిరోధక లేదా సులభతరం చేసే మార్గాలపై ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి రైళ్ల మధ్య విరామాలు సాధారణంగా 30 సెకన్ల కంటే ఎక్కువగా ఉంటాయి. hChR2 ప్రతిస్పందన మోనోసినాప్టిక్‌గా ఉందో లేదో పరీక్షించడానికి, EPSC ప్రతిచర్య అదృశ్యమయ్యే వరకు మేము స్నానానికి TTX (1 μM)ని వర్తింపజేసాము, ఆపై 4-అమినోపైరిడిన్ (4-AP; 100 μM)ని వర్తింపజేసాము. సాధారణంగా, LED ఫైరింగ్ మరియు EPSC జనరేషన్ మధ్య కొంచెం ఎక్కువ ఆలస్యంతో, కొన్ని నిమిషాల్లోనే ప్రతిస్పందన తిరిగి వస్తుంది. ప్రతిస్పందన AMPA గ్రాహకాలచే నడపబడుతుందో లేదో పరీక్షించడానికి NBQX (10 μM) ఉపయోగించబడింది.
గతంలో వివరించిన విధంగా పదునైన hCO విభాగాలు సృష్టించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, hCO విభాగాలు 4% అగరోజ్‌లో పొందుపరచబడ్డాయి మరియు 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 మరియు 10 mM d-(+) -గ్లూకోజ్ కలిగిన కణాలకు బదిలీ చేయబడ్డాయి. లైకా VT1200 వైబ్రేటర్‌ని ఉపయోగించి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 200–300 µm వద్ద విభాగాలను కత్తిరించి గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ASFలో నిల్వ చేశారు. తర్వాత, మొత్తం కణాల ప్యాచ్-క్యాంప్ రికార్డింగ్‌ను ప్రత్యక్ష స్లైస్‌స్కోప్ మైక్రోస్కోప్ (సైంటిఫికా) కింద hCO విభాగాలపై నిర్వహించారు. విభాగాలను aCSF (95% O2 మరియు 5% CO2)తో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద సెల్ సిగ్నల్‌లను రికార్డ్ చేశారు. 127 mM పొటాషియం గ్లూకోనేట్, 8 mM NaCl, 4 mM మెగ్నీషియం ATP, 0.3 mM సోడియం GTP, 10 mM HEPES, మరియు 0.6 mM EGTA, అంతర్గత pH 7, 2 కలిగిన ద్రావణంతో నిండిన బోరోసిలికేట్ గాజు పైపెట్‌ను ఉపయోగించి hCO న్యూరాన్‌లను పూయడం జరిగింది, వీటిని KOH (ఓస్మోలారిటీ 290) తో సర్దుబాటు చేశారు. రికవరీ ప్రయోజనాల కోసం, అంతర్గత ద్రావణానికి 0.2% బయోసైటిన్‌ను జోడించండి.
మల్టీక్లాంప్ 700B యాంప్లిఫైయర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) మరియు డిజిడేటా 1550B డిజిటైజర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ఉపయోగించి క్లాంపెక్స్ (క్లాంపెక్స్ 11.1, మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ద్వారా డేటా పొందబడింది, 2 kHz వద్ద తక్కువ-పాస్ ఫిల్టర్ చేయబడింది, 20 kHz వద్ద డిజిటైజ్ చేయబడింది మరియు విశ్లేషణ, మాలిక్యులర్ పరికరాలు) మరియు కస్టమ్ MATLAB ఫంక్షన్ల కోసం క్లాంపెక్ (వెర్షన్ 10.6) ఉపయోగించి విశ్లేషించబడింది (MATLAB 2019b, మ్యాథ్‌వర్క్స్). JPCalc ఉపయోగించి జంక్షన్ పొటెన్షియల్‌ను లెక్కించారు మరియు ఎంట్రీలను -14 mV యొక్క లెక్కించిన జంక్షన్ పొటెన్షియల్‌కు సర్దుబాటు చేశారు. ఆపరేషన్ IV -50 నుండి 250 pA వరకు 5-10 pA దశల్లో ప్రస్తుత దశల శ్రేణిని కలిగి ఉంటుంది.
పించ్డ్ న్యూరాన్ల పదనిర్మాణ పునర్నిర్మాణం కోసం, అంతర్గత ద్రావణంలో 0.2% బయోసైటిన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) జోడించబడింది. హ్యాకింగ్ తర్వాత కణాలను కనీసం 15 నిమిషాలు ప్రైమ్ చేస్తారు. రిజిస్టర్డ్ పొర పూర్తిగా మూసివేయబడే వరకు పైపెట్‌ను 1-2 నిమిషాలు నెమ్మదిగా లోపలికి లాగుతారు. సెక్షన్ ఫిజియాలజీ విధానాన్ని అనుసరించి, విభాగాలను రాత్రిపూట 4° C వద్ద 4% PFAలో స్థిరపరిచారు, PBS X3తో కడిగి, స్ట్రెప్టావిడిన్-కంజుగేటెడ్ డైలైట్ 549 లేదా డైలైట్ 405 (వెక్టర్ ల్యాబ్స్)తో 1:1000తో కరిగించారు. బయోసైటిన్ (2%; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్)తో నిండిన కణాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు ప్యాచ్ క్లాంప్ రికార్డింగ్ సమయంలో లేబుల్ చేశారు. ఆ తర్వాత విభాగాలను అక్వామౌంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి మైక్రోస్కోపీ స్లయిడ్‌లపై అమర్చారు మరియు మరుసటి రోజు లైకా TCS SP8 కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌లో నూనె ఇమ్మర్షన్ ఆబ్జెక్టివ్‌ను ఉపయోగించి సంఖ్యా ఎపర్చరు ×40 1.3, మాగ్నిఫికేషన్ ×0.9–1.0, xyతో దృశ్యమానం చేశారు. నమూనా రేటు మైక్రాన్‌కు దాదాపు 7 పిక్సెల్‌లు. 1 µm విరామాలలో Z-స్టాక్‌లను సీరియల్‌గా పొందారు మరియు ప్రతి న్యూరాన్ యొక్క మొత్తం డెన్డ్రిటిక్ ట్రీని కవర్ చేయడానికి z-స్టాక్ మొజాయిక్‌లు మరియు లైకా-ఆధారిత ఆటో-స్టిచింగ్‌ను ప్రదర్శించారు. తర్వాత న్యూట్రాన్‌లను న్యూట్యూబ్ 40 ఇంటర్‌ఫేస్‌ని ఉపయోగించి సెమీ-మాన్యువల్‌గా ట్రాక్ చేశారు మరియు SWC ఫైల్‌లు రూపొందించబడ్డాయి. ఆ తర్వాత ఫైల్‌లను SimpleNeuriteTracer41 Fiji ప్లగిన్‌కు అప్‌లోడ్ చేశారు (ImageJ, వెర్షన్ 2.1.0; NIH).
స్టాన్‌ఫోర్డ్ విశ్వవిద్యాలయం యొక్క ఇన్‌స్టిట్యూషనల్ రివ్యూ బోర్డ్ ఆమోదించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం సమాచారం ఇచ్చిన సమ్మతితో మానవ కార్టికల్ కణజాలం పొందబడింది. వక్రీభవన మూర్ఛ కోసం శస్త్రచికిత్సలో భాగంగా ఫ్రంటల్ కార్టెక్స్ (మిడిల్ ఫ్రంటల్ గైరస్) విచ్ఛేదనం ద్వారా మానవ ప్రసవానంతర కణజాలం యొక్క రెండు నమూనాలను (3 మరియు 18 సంవత్సరాల వయస్సు) పొందారు. విచ్ఛేదనం తర్వాత, మంచు-చల్లటి NMDG-aCSFలో కణజాలాన్ని సేకరించి, వీటిలో ఇవి ఉన్నాయి: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM గ్లూకోజ్, 2 mM థియోరియా, 5 mM సోడియం ఆస్కార్బేట్, 3 mM సోడియం పైరువేట్, 0.5 mM CaCl2 4H2O మరియు 10 mM MgSO4 7H2O. సాంద్రీకృత హైడ్రోక్లోరిక్ ఆమ్లంతో pH 7.3-7.4 కు టైట్రేట్ చేయండి. పైన వివరించిన విధానం ప్రకారం కణజాలాలను 30 నిమిషాల్లో ప్రయోగశాలకు పంపించారు మరియు కరోనల్ విభాగాలను తీసుకున్నారు.
అన్ని జంతు ప్రక్రియలు స్టాన్‌ఫోర్డ్ విశ్వవిద్యాలయం APLAC ఆమోదించిన జంతు సంరక్షణ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి. ఎలుకలను (మార్పిడి తర్వాత 140 రోజుల కంటే ఎక్కువ) 5% ఐసోఫ్లోరేన్ అనస్థీషియాతో ప్రేరేపించి, 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో ఇంట్రాఆపరేటివ్‌గా మత్తుమందు ఇచ్చారు. జంతువులను స్టీరియోటాక్సిక్ ఫ్రేమ్ (కోప్ఫ్)లో ఉంచారు మరియు నిరంతర విడుదల బుప్రెనార్ఫిన్ (SR) ను చర్మాంతరంగా ఇంజెక్ట్ చేశారు. పుర్రె బహిర్గతమై, శుభ్రం చేయబడి, 3-5 ఎముక స్క్రూలను చొప్పించారు. t-hCO లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి, మేము MRI చిత్రాల నుండి స్టీరియోటాక్సిక్ కోఆర్డినేట్‌లను రూపొందించాము. ఆసక్తి ఉన్న ప్రదేశంలో ఒక బర్ హోల్ వేయబడింది మరియు ఫైబర్‌లను (400 µm వ్యాసం, NA 0.48, డోరిక్) hCO ఉపరితలం క్రింద 100 µm తగ్గించి, UV-నయం చేయగల దంత సిమెంట్ (రిలైక్స్)తో పుర్రెకు భద్రపరిచారు.
గతంలో వివరించిన విధంగా ఫైబర్ ఫోటోమెట్రిక్ రికార్డింగ్‌లు జరిగాయి42. ఆకస్మిక కార్యకలాపాలను రికార్డ్ చేయడానికి, ఎలుకలను శుభ్రమైన బోనులో ఉంచారు మరియు ఫైబర్ ఆప్టిక్ ఫోటోమెట్రిక్ డేటా అక్విజిషన్ సిస్టమ్‌కు అనుసంధానించబడిన 400 µm వ్యాసం కలిగిన ఫైబర్ ఆప్టిక్ ప్యాచ్ కేబుల్ (డోరిక్) ఇంప్లాంట్ చేయబడిన ఫైబర్ ఆప్టిక్ కేబుల్‌కు అనుసంధానించబడింది. మోటారు కార్యకలాపాల 10 నిమిషాల రికార్డింగ్ సమయంలో, జంతువులు బోనును అన్వేషించడానికి స్వేచ్ఛగా ఉన్నాయి. ప్రేరేపించబడిన కార్యాచరణను రికార్డ్ చేయడానికి, ఎలుకలను (మార్పిడి తర్వాత 140 రోజుల కంటే ఎక్కువ) ఇండక్షన్ కోసం 5% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో మరియు నిర్వహణ కోసం 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో మత్తుమందు చేశారు. జంతువును స్టీరియోటాక్టిక్ ఫ్రేమ్‌లో (Kopf) ఉంచండి మరియు t-hCO కి ఎదురుగా ఉన్న మీసాలను సుమారు 2 సెం.మీ.కు కత్తిరించి పైజోఎలెక్ట్రిక్ యాక్యుయేటర్ (PI)కి అనుసంధానించబడిన మెష్ ద్వారా పంపబడతాయి. 400 µm ఫైబర్ ఆప్టిక్ ప్యాచ్ కేబుల్ (డోరిక్) ఇంప్లాంట్ చేయబడిన ఫైబర్‌కు అనుసంధానించబడి డేటా అక్విజిషన్ సిస్టమ్‌కు అనుసంధానించబడింది. t-hCO కి ఎదురుగా ఉన్న మీసాలు 20 నిమిషాల రికార్డింగ్ వ్యవధిలో పైజోఎలెక్ట్రిక్ డ్రైవ్ ద్వారా యాదృచ్ఛిక సమయాల్లో 50 సార్లు (20 Hz వద్ద 2 mm, ప్రెజెంటేషన్‌కు 2 సెకన్లు) విక్షేపం చేయబడ్డాయి. కస్టమ్ MATLAB కోడ్‌తో విక్షేపణ సమయాన్ని నియంత్రించడానికి Arduino MATLAB సపోర్ట్ ప్యాకేజీని ఉపయోగించండి. ట్రాన్సిస్టర్-ట్రాన్సిస్టర్ లాజిక్ (TTL) పల్స్‌లను ఉపయోగించి ఈవెంట్‌లు డేటా సముపార్జన సాఫ్ట్‌వేర్‌కు సమకాలీకరించబడతాయి.
మార్పిడి తర్వాత 140 రోజుల కంటే ఎక్కువ కాలం ఉన్న ఎలుకలను 5% ఐసోఫ్లోరేన్ అనస్థీషియాతో ప్రేరేపించి, 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో ఇంట్రాఆపరేటివ్‌గా అనస్థీషియా చేశారు. జంతువులను స్టీరియోటాక్సిక్ ఫ్రేమ్ (కోప్ఫ్)లో ఉంచారు మరియు బుప్రెనార్ఫిన్ SR మరియు డెక్సామెథాసోన్‌లను సబ్కటానియస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు. పుర్రెను బహిర్గతం చేసి, శుభ్రం చేసి, 3-5 ఎముక స్క్రూలను చొప్పించారు. t-hCO ను లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి, మేము MRI చిత్రాల నుండి స్టీరియోటాక్సిక్ కోఆర్డినేట్‌లను రూపొందించాము. మార్పిడి చేయబడిన hCO పై నేరుగా హై స్పీడ్ డ్రిల్‌తో వృత్తాకార క్రానియోటమీ (సుమారు 1 సెం.మీ. వ్యాసం) నిర్వహించబడింది. ఎముక సాధ్యమైనంత సన్నగా మారిన తర్వాత, కానీ మొత్తం ఎముక గుండా డ్రిల్లింగ్ చేయడానికి ముందు, అంతర్లీన t-hCO ను బహిర్గతం చేయడానికి మిగిలిన చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న పెల్విక్ డిస్క్‌ను తొలగించడానికి ఫోర్సెప్స్‌ను ఉపయోగించండి. క్రానియోటమీని స్టెరైల్ సెలైన్‌తో నింపారు మరియు UV-క్యూర్డ్ డెంటల్ సిమెంట్ (రిలైక్స్) తో పుర్రెకు కవర్‌స్లిప్ మరియు ప్రత్యేక హెడ్ పిన్‌ను జత చేశారు.
నికాన్ LWD (×16, 0.8 NA) లక్ష్యంతో బ్రూకర్ మల్టీఫోటాన్ మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి టూ-ఫోటాన్ ఇమేజింగ్ నిర్వహించబడింది. GCaMP6 ఇమేజింగ్ 920 nm వద్ద 1.4x సింగిల్ z-ప్లేన్ మాగ్నిఫికేషన్ మరియు 8x సగటు 7.5 fps తో ప్రదర్శించబడింది. ఎలుకలను 5% ఐసోఫ్లోరేన్ అనస్థీషియాతో ప్రేరేపించారు మరియు 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో నిర్వహించారు. ఎలుకలను కస్టమ్ మేడ్ హెడ్ ఫిక్చర్‌లో ఉంచారు మరియు లెన్స్ కింద ఉంచారు. మోటారు కార్యకలాపాల యొక్క 3 నిమిషాల నేపథ్య రికార్డింగ్ పొందబడింది. 20 నిమిషాల రికార్డింగ్ సమయంలో, 50 పఫ్‌లు (ప్రతి ప్రెజెంటేషన్ 100 ms పొడవు) పికోస్‌ప్రైసర్‌ను ఉపయోగించి t-hCO ఎదురుగా ఉన్న విస్కర్ ప్యాడ్‌కు యాదృచ్ఛికంగా డెలివరీ చేయబడ్డాయి. కస్టమ్ MATLAB కోడ్‌తో బరస్ట్ సమయాన్ని నియంత్రించడానికి Arduino MATLAB సపోర్ట్ ప్యాకేజీని ఉపయోగించండి. TTL పల్స్‌లను ఉపయోగించి డేటా అక్విజిషన్ సాఫ్ట్‌వేర్ (PrairieView 5.5)తో ఈవెంట్‌లను సమకాలీకరించండి. విశ్లేషణ కోసం, ఫిజీలో ప్రారంభించబడిన MoCo ప్రోగ్రామ్‌లో అఫైన్ కరెక్షన్ ఉపయోగించి చిత్రాలను xy మోషన్ కోసం సరిదిద్దారు. CNMF-E43 ఉపయోగించి వ్యక్తిగత కణాల నుండి ఫ్లోరోసెంట్ జాడలను సంగ్రహించడం. ఆసక్తి ఉన్న ప్రతి ప్రాంతానికి ఫ్లోరోసెన్స్‌ను సంగ్రహించి, dF/F వక్రతలుగా మార్చి, ఆపై z-స్కోర్‌లుగా మార్చారు.
ఎలుకలను (మార్పిడి తర్వాత 140 రోజుల కంటే ఎక్కువ) 5% ఐసోఫ్లోరేన్ అనస్థీషియాతో ప్రేరేపించి, 1-3% ఐసోఫ్లోరేన్‌తో ఇంట్రాఆపరేటివ్‌గా మత్తుమందు ఇచ్చారు. జంతువులను స్టీరియోటాక్సిక్ ఫ్రేమ్ (కోప్ఫ్)లో ఉంచారు మరియు బుప్రెనార్ఫిన్ SR మరియు డెక్సామెథాసోన్‌ను సబ్కటానియస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు. t-hCOకి ఎదురుగా ఉన్న మీసాలను సుమారు 2 సెం.మీ. వరకు కత్తిరించి పైజోఎలెక్ట్రిక్ యాక్యుయేటర్‌కు అనుసంధానించబడిన మెష్ ద్వారా థ్రెడ్ చేశారు. పుర్రె బహిర్గతమై శుభ్రం చేయబడుతుంది. పుర్రెకు స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ గ్రౌండ్ స్క్రూ జతచేయబడుతుంది. t-hCOని లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి, మేము MRI చిత్రాల నుండి స్టీరియోటాక్సిక్ కోఆర్డినేట్‌లను రూపొందించాము. t-hCO పైన హై స్పీడ్ డ్రిల్‌తో వృత్తాకార క్రానియోటమీ (సుమారు 1 సెం.మీ. వ్యాసం) చేయండి. ఎముక వీలైనంత సన్నగా అయిన తర్వాత, కానీ మొత్తం ఎముక ద్వారా డ్రిల్లింగ్ చేసే ముందు, అంతర్లీన t-hCOని బహిర్గతం చేయడానికి మిగిలిన చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న పెల్విక్ డిస్క్‌ను తొలగించడానికి ఫోర్సెప్స్‌ను ఉపయోగించండి. 32-ఛానల్ లేదా 64-ఛానల్ హై-డెన్సిటీ సిలికాన్ ప్రోబ్స్ (కేంబ్రిడ్జ్ న్యూరోటెక్) ఉపయోగించి గ్రౌండ్డ్ టు గ్రౌండ్ స్క్రూలు మరియు RHD యాంప్లిఫైయర్స్ (ఇంటాన్) తో ప్రీ-యాంప్లిఫైడ్ చేయబడిన వ్యక్తిగత కణాలు రికార్డ్ చేయబడ్డాయి. స్టెరైల్ సెలైన్‌తో నిండిన క్రానియోటమీ ద్వారా ఎలక్ట్రోడ్‌లను లక్ష్య సైట్‌కు తగ్గించడానికి మానిప్యులేటర్‌ను ఉపయోగించండి. ఓపెన్ ఎఫిస్ డేటా అక్విజిషన్ సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి 30 kHz ఫ్రీక్వెన్సీలో డేటా సేకరణ జరిగింది. 10 కంటే ఎక్కువ ఛానెల్‌లలో అధిక సహసంబంధమైన రిథమిక్ స్పాంటేనియస్ యాక్టివిటీని మేము గుర్తించినప్పుడు మాత్రమే రికార్డింగ్ కొనసాగింది, ఎలక్ట్రోడ్‌లు గ్రాఫ్ట్‌లో ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి (రెండు-ఫోటాన్ కాల్షియం ఇమేజింగ్ డేటా ఆధారంగా). మోటారు కార్యకలాపాల యొక్క 10 నిమిషాల నేపథ్య రికార్డింగ్ పొందబడింది. t-hCO యొక్క ఎదురుగా ఉన్న మీసాలను 20 నిమిషాల రికార్డింగ్ వ్యవధిలో పైజోఎలెక్ట్రిక్ డ్రైవ్ ద్వారా యాదృచ్ఛిక సమయాల్లో 50 సార్లు (20 Hz వద్ద 2 మిమీ, ప్రెజెంటేషన్‌కు 2 సెకన్లు) విక్షేపం చేశారు. Arduino కోసం MATLAB సపోర్ట్ ప్యాకేజీని (MATLAB 2019b) ఉపయోగించి, కస్టమ్ MATLAB కోడ్‌తో విక్షేపణ సమయాన్ని నియంత్రించండి. డేటా సముపార్జన సాఫ్ట్‌వేర్‌తో ఈవెంట్‌లను సమకాలీకరించడానికి TTL పల్స్‌లను ఉపయోగించండి.
ఆప్టికల్ మార్కింగ్ ప్రయోగాల కోసం, 473 nm లేజర్ (ఓమిక్రాన్) కు అనుసంధానించబడిన 200 µm ఆప్టికల్ ప్యాచ్ కార్డ్ (డోరిక్) ను క్రానియోటమీపై ఉంచిన 200 µm ఆప్టికల్ ఫైబర్ కు అనుసంధానించారు. దీనికి వెంటనే ముందు, జంపర్ పవర్ ను 20 mW కు సర్దుబాటు చేయండి. స్టెరైల్ సెలైన్ తో నిండిన క్రానియోటమీ ద్వారా ఎలక్ట్రోడ్ లను లక్ష్య ప్రదేశానికి తగ్గించడానికి మానిప్యులేటర్ ను ఉపయోగించండి. రికార్డింగ్ ప్రారంభంలో, 473 nm (ఫ్రీక్వెన్సీ 2 Hz, పల్స్ వ్యవధి 10 ms) యొక్క పది పల్స్ లు విడుదలయ్యాయి. 70% లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ట్రయల్స్ లో 10 ms కాంతి లోపల స్పైక్ ప్రతిస్పందనను ప్రదర్శించే కణాలుగా ఫోటోసెన్సిటివ్ కణాలు నిర్వచించబడ్డాయి.