Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Користите верзија на прелистувач со ограничена CSS поддршка. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Дополнително, за да обезбедиме континуирана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Прикажува вртелешка од три слајдови одеднаш. Користете ги копчињата „Претходно“ и „Следно“ за да се движите низ три слајдови одеднаш или користете ги лизгачките копчиња на крајот за да се движите низ три слајдови одеднаш.
Самосклопувачките невронски органели претставуваат ветувачка платформа in vitro за моделирање на човечкиот развој и болести. Сепак, на органоидите им недостасува поврзаноста што постои in vivo, што го ограничува созревањето и спречува интеграција со други кола што го контролираат однесувањето. Овде покажуваме дека кортикалните органоиди добиени од човечки матични клетки трансплантирани во соматосензорниот кортекс на новородени голи стаорци развиваат зрели типови на клетки кои се интегрираат во сензорни и мотивациски поврзани кола. МРИ откри раст на органоиди по трансплантацијата кај неколку линии на матични клетки и животни, додека анализата на едно јадро откри прогресија на кортикогенезата и појава на програма за транскрипција зависна од активноста. Всушност, трансплантираните кортикални неврони покажуваат посложени морфолошки, синаптички и внатрешни мембрански својства од нивните in vitro еквиваленти, овозможувајќи откривање на невронски дефекти кај пациенти со Тимотиов синдром. Анатомското и функционалното следење покажа дека трансплантираните органели примаат таламокортикални и кортикокортикални влезни сигнали, а in vivo снимките на невронската активност сугерираат дека овие влезни сигнали можат да генерираат сензорни одговори во човечките клетки. Конечно, кортикалните органоиди ги прошируваат аксони низ целиот мозок на стаорец, а нивното оптогенетско активирање води кон однесување кое бара награда. Така, трансплантираните неврони од човечкиот кортекс созреваат и учествуваат во колата на домаќинот кои го контролираат однесувањето. Очекуваме овој пристап да го олесни откривањето на фенотипови на ниво на нишки во клетки добиени од пациентот кои не можат да се детектираат со други средства.
Развојот на човечкиот мозок е извонреден процес на самоорганизирање во кој клетките се размножуваат, се диференцираат, мигрираат и се поврзуваат за да формираат функционални невронски кола кои понатаму се усовршуваат преку сензорно искуство. Клучен проблем во разбирањето на развојот на човечкиот мозок, особено во контекст на болести, е недостатокот на пристап до мозочното ткиво. Самоорганизираните органели, вклучувајќи ги органоидите на човечкиот кортекс (hCO; исто така познати како сфера на човечкиот кортекс), можат да генерираат 2,3,4,5,6. Сепак, неколку ограничувања ја ограничуваат нивната поширока примена во разбирањето на развојот и функционирањето на невронските кола. Особено, не е јасно дали созревањето на hCO е ограничено од отсуството на одредени микросредини и сензорни влезни информации присутни in vivo. Покрај тоа, бидејќи hCO не се интегрирани во кола што можат да генерираат резултати во однесувањето, нивната корисност во моделирањето на генетски сложени и бихевиорални невропсихијатриски нарушувања е моментално ограничена.
Трансплантацијата на hCO во интактен жив мозок може да ги надмине овие ограничувања. Претходните студии покажаа дека човечките неврони трансплантирани во кортексот на глодарите се способни да преживеат, да проектираат и да комуницираат со клетките на глодарите7,8,9,10,11,12. Сепак, овие експерименти обично се изведуваат на возрасни животни, што може да ја ограничи синаптичката и аксоналната интеграција. Овде, ние опишуваме парадигма за трансплантација во која трансплантиравме 3D hCO добиен од hiPS клетки во примарниот соматосензорен кортекс (S1) на имунодефициентни стаорци во рана фаза на пластичен развој. Трансплантираните hCO (t-hCO) неврони претрпуваат значително созревање, примаат таламокортикални и кортикално-кортикални влезни сигнали кои предизвикуваат сензорни реакции и ги прошируваат аксоналните проекции во мозокот на стаорецот за да поттикнат однесување за барање награда. Продолженото созревање на t-hCO откри невронски дефекти кај пациенти со Тимотиов синдром (TS), тешко генетско нарушување предизвикано од мутации во калциумовиот канал L-тип CaV1.2 чувствителен на напон (кодиран од CACNA1C).
За да ги проучиме човечките кортикални неврони во кола in vivo, стереотактички трансплантиравме интактен 3D hCO3 во S1 на ранопородални атимични стаорци (денови 3-7 постнатално) (Сл. 1a и проширени податоци од Сл. 1a-c). Во овој момент, таламокортикалните и кортикокортикалните аксонални проекции сè уште не ја завршиле својата S1 инервација (реф. 13). Така, овој пристап е дизајниран да ја максимизира интеграцијата на t-hCO3, а воедно да го минимизира влијанието врз ендогените кола. За да ја визуелизираме локацијата на t-hCO3 кај живи животни, извршивме реконструкции на мозокот со Т2-пондерирана МРИ на стаорци 2-3 месеци по трансплантацијата (Сл. 1b и проширени податоци, Сл. 1d). t-hCO3 беа лесно забележани, а мерењата на волуменот на t-hCO3 беа слични на оние пресметани од фиксни парчиња (Проширени податоци Сл. 1d, e; P > 0,05). t-hCO3 беа лесно забележани, а мерењата на волуменот на t-hCO3 беа слични на оние пресметани од фиксни парчиња (Проширени податоци Сл. 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным за фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 беа лесно забележани, а волуметриските мерења на t-hCO3 беа слични на оние пресметани за фиксни пресеци (проширени податоци, Сл. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05＼很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным за фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 беше лесно забележан, а волуметриските мерења на t-hCO3 беа слични на оние пресметани за фиксни пресеци (проширени податоци, Сл. 1d, e; P > 0,05).Го определивме t-hCO3 кај 81% од трансплантирани животни приближно 2 месеци по трансплантацијата (n = 72 животни; hCO3 од 10 hiPS клеточни линии; hiPS клеточни линии во Дополнителна табела 1). Од нив, 87% беа лоцирани во церебралниот кортекс (Сл. 1c). Со извршување на сериски МРИ скенирања во повеќе временски точки кај истиот трансплантиран стаорец, откривме деветкратно зголемување на волуменот на t-hCO3 во рок од 3 месеци (Сл. 1d и проширени податоци, Сл. 1f). Трансплантирани животни имаа висока стапка на преживување (74%) 12 месеци по трансплантацијата (проширени податоци, Сл. 1g и Дополнителна табела 2), и не беа пронајдени очигледни моторни или мемориски нарушувања, глиоза или електроенцефалограм (ЕЕГ). Податоци Сл. 1g и дополнителна табела 2). 1h–m и 3e).
a, Шема на експерименталниот дизајн. hCO добиен од hiPS клетки беше трансплантиран во S1 од новородени голи стаорци на 30-тиот до 60-тиот ден од диференцијацијата. b, T2-пондерирани коронални и хоризонтални MRI слики кои покажуваат t-hCO во S1 2 месеци по трансплантацијата. Скала, 2 mm. c, Квантификација на стапките на успех на енграфтирање прикажани за секоја hiPS клеточна линија (n = 108, броевите во рамките на лентите означуваат количина на t-hCO по hIPS клеточна линија) и кортикална или субкортикална локација (n = 88). d, MRI слика на коронарна артерија (лево; скала, 3 mm) и соодветна 3D волуметриска реконструкција (скала, 3 mm) која покажува зголемување на t-hCO во текот на 3 месеци. e, Преглед на моделите на t-hCO во церебралниот кортекс кај стаорци. Скала, 1 mm. f, Репрезентативни имуноцитохемиски слики на t-hCO прикажани од горе лево кон десно (за време на диференцијација): PPP1R17 (4 месеци), NeuN (8 месеци), SOX9 и GFAP (8 месеци), PDGFRα; (8 месеци), MAP2 (8 месеци) и IBA1 (8 месеци). Скала, 20 µm. Ко-експресија на HNA укажува на клетки од човечко потекло. g, snRNA-seq: Сликање со намалување на димензионалноста на унифицираниот многуобразен и проекциски (UMAP) систем на сите висококвалитетни t-hCO јадра по интеграцијата со Seurat (n = 3 t-hCO примероци, n = 2 hiPS клеточни линии). Астроцити, клетки од линијата на астроцити; cyc prog, циркулирачки прогенитори; GluN DL, длабоки глутаматергични неврони; GluN DL/SP, длабоки и субламеларни глутаматергични неврони; GluN UL, глутаматергични неврони од горниот слој; олигодендроцити, олигодендроцити; OPC, олигодендроцитни прогениторни клетки; RELN, реелински неврони. h, анализа на збогатување на терминот со генска онтологија (GO) на гени значително зголемена (прилагоден P < 0,05, промена на превиткувањето > 2, изразена во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергичните неврони во споредба со hCO глутаматергичните неврони. h, анализа на збогатување на терминот со генска онтологија (GO) на гени значително зголемена (прилагоден P < 0,05, промена на превиткувањето > 2, изразена во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергичните неврони во споредба со hCO глутаматергичните неврони. h, Анализ обогащения терминов Генска онтологија (GO) за гените со значителен активацией (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, експресия по крайней мере во 10% не язровна почести) со глутаматергическими нейронами hCO. h, анализа на збогатување на терминот со генска онтологија (GO) за гени со значајна активација (прилагоден P <0,05, промена на превиткувањето >2, експресија во најмалку 10% јадра) кај t-hCO глутаматергични неврони во споредба со hCO глутаматергични неврони. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调P 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上调 p变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скоректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере во 10% ядер) во глутаматергических неиронах t-hCO по сравмайCOcheniyu Онтологический (GO) анализа термина обогащения. h, гените беа значително зголемени (прилагоден P < 0,05, промена на превиткувањето > 2, експресирани во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергичните неврони во споредба со hCO глутаматергичните неврони. Онтолошка (GO) анализа на збогатувачкиот термин.Испрекинатата линија означува aq вредност од 0,05. i, UMAP снимање на типовите на GluN клетки во t-hCO користејќи пренос на ознаки од референтен сет на податоци за моторен кортекс кај возрасни од 22 snRNA-seq. CT — кортикоталамични клетки, ET — екстрацеребрални клетки, IT — внатрешни теленцефалични клетки, NP — блиска проекција.
Потоа ја проценивме цитоархитектурата и целокупниот клеточен состав на t-hCO. Боењето со антитела на ендотелните клетки на стаорци откри васкуларизација со t-hCO, додека боењето со IBA1 откри присуство на микроглија на стаорци низ целиот графт (Сл. 1f и проширени податоци, Сл. 3c, d). Имунобоењето откри клетки позитивни на човечки нуклеарен антиген (HNA) кои коекспресираат PPP1R17 (кортикални прогенитори), NeuN (неврони), SOX9 и GFAP (клетки добиени од глија) или PDGFRα (прогенитори на олигодендроцити) (Слика 1f). За да го проучиме клеточниот состав на t-hCO при резолуција на единечна клетка, извршивме секвенционирање на РНК со едно јадро (snRNA-seq) по приближно 8 месеци диференцијација. Масовната филтрација и отстранувањето на јадрата на стаорци дадоа 21.500 висококвалитетни човечки мононуклеарни мапи (Сл. 1g и проширени податоци, Сл. 4a, b). Моделите на експресија на типичните маркери од клеточен тип идентификуваа кластери од главни кортикални класи на клетки, вклучувајќи длабоки и површни глутаматергични неврони, циркулирачки прогенитори, олигодендроцити и астроцитна лоза (Сл. 1g, проширени податоци, Сл. 4c и Дополнителна табела 3). Имунобоењето за SATB2 и CTIP2 покажа дека и покрај присуството на кортикални подтипови, t-hCO не покажа јасна анатомска стратификација (проширени податоци, Сл. 3a). snRNA-seq hCO со совпаѓање на фазата произведе во голема мера слични класи на клетки, со неколку исклучоци, вклучувајќи го отсуството на олигодендроцити и присуството на GABAергични неврони, што може да ги одразува претходно објавените поволни in vitro услови за латералните прогениторни клетки15 (проширени податоци, Сл. 4f – i и Дополнителна табела 4). Анализата на диференцијалната генска експресија откри значајни разлики кај глутаматергичните неврони помеѓу t-hCO3 и hCO3 (Дополнителна табела 5), вклучувајќи активирање на групи гени поврзани со невронално созревање, како што се синаптичко сигнализирање, дендритична локализација и активност на каналот зависен од напон (Слика 1h и Дополнителна табела 5). табела 6). Според тоа, кортикалните глутаматергични t-hCO3 неврони покажаа забрзано транскрипциско созревање.
За да разјасниме дали овие транскрипциски промени во t-hCO се поврзани со морфолошки разлики помеѓу hCO in vitro и t-hCO in vivo, реконструиравме hCO и hCO исполнети со биоцитин во акутните делови по 7-8 месеци диференцијација. hCO неврони (Сл. 2a). t-hCO невроните беа значително поголеми, имаа 1,5 пати поголем дијаметар на сомата, двојно повеќе дендрити и вкупно шесткратно зголемување на вкупната должина на дендритите во споредба со hCO in vitro (Сл. 2b). Покрај тоа, забележавме значително поголема густина на дендритични боцки кај t-hCO невроните отколку кај hCO невроните (Сл. 2c). Ова сугерира дека t-hCO невроните претрпуваат екстензивно издолжување и разгранување на дендритите, што, во комбинација со континуирана клеточна пролиферација, може да придонесе за интензивниот раст на t-hCO по трансплантацијата (Сл. 1d и Проширени податоци Сл. 1f). Ова нè поттикна да ги испитаме електрофизиолошките својства. Капацитетот на мембраната беше осум пати поголем (проширени податоци, Сл. 8d), мембранскиот потенцијал во состојба на мирување беше повеќе хиперполаризиран (приближно 20 mV), а инјектирањето на струја предизвика поголема максимална стапка на возбудување кај t-hCO невроните отколку кај hCO невроните. in vitro (Сл. 2d), e), што е во согласност со поголемите и посложените морфолошки карактеристики на t-hCO. Покрај тоа, фреквенцијата на спонтани возбудувачки постсинаптички тековни настани (EPSC) беше значително поголема кај t-hCO невроните (Сл. 2f), што укажува дека зголемената густина на дендритичните боцки забележана кај t-hCO невроните е поврзана со функционална возбуденост. сексуална синапса. Незрелиот карактер на hCO невроните го потврдивме in vitro со снимање на обележани глутаматергични неврони (проширени податоци, Сл. 6a-c).
а, 3Д реконструкција на неврони исполнети со биоцитин од hCO и t-hCO по 8 месеци диференцијација. б, Квантификација на морфолошките карактеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, Квантификација на морфолошките карактеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нејронов hCO, n = 6 нејронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, квантификација на морфолошките карактеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нејронов hCO, n = 6 нејронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). б, квантификација на морфолошките карактеристики (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001).в, 3Д реконструкција на дендритичните гранки на hCO и t-hCO по 8 месеци диференцијација. Црвените ѕвездички означуваат претпоставени дендритични боцки. Квантификација на густината на дендритичните боцки (n = 8 hCO неврони, n = 6 t-hCO неврони; **P = 0,0092). d, Квантификација на мембранскиот потенцијал во мирување (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). d, Квантификација на мембранскиот потенцијал во мирување (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). г. d, квантификација на мембранскиот потенцијал во мирување (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 г. d, квантификација на мембранскиот потенцијал во мирување (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). e, Повторувачко активирање на акциониот потенцијал кај hCO3 и t-hCO3 предизвикано од зголемување на инјекциите на струја и квантификација на максималната брзина на активирање (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). e, Повторувачко активирање на акциониот потенцијал кај hCO3 и t-hCO3 предизвикано од зголемување на инјекциите на струја и квантификација на максималната брзина на активирање (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; ***P < 0,0001). e, повторно возбудување потенциала действия во hCO и t-hCO, вызванное увеличением тоа, и количественная оценка максималной скорости возбудения (n = 25 нејронов hCO, n = 16 нејронов hCO, n = 16 нејронов hCO, n = 16 нејронов hCO, n = 16 нејронов 01,000 *** 0, 00000 *** 0,00 *** 0,00 *** 0,00 *** 0,00 *** 0,00 *** <0, CO). e, повторно активирање на акциониот потенцијал кај hCO3 и t-hCO3 предизвикано од зголемување на струјата и квантификација на максималната брзина на активирање (n = 25 hCO3 неврони, n = 16 t-hCO3 неврони; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO; n 6-000 = 1 <0.0001). e, повторувачко активирање на акционите потенцијали на hCO и t-hCO предизвикано од зголемено снабдување со струја и квантификација на максималната брзина на активирање (n = 25 hCO неврони, n = 16 t-hCO неврони; *** P < 0,0001). f, Спонтани EPSC (sEPSC) во hCO и t-hCO неврони на 8 месеци диференцијација и квантификација на фреквенцијата на синаптичките настани (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). f, Спонтани EPSC (sEPSC) кај hCO и t-hCO неврони по 8 месеци диференцијација и квантификација на фреквенцијата на синаптичките настани (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) во нејронах hCO и t-hCO через 8 месечни диференцировки и количествен оценка частоты синаптических событий (n = 25 нејронов hCO, n = 17 hCO, n = 17 hCO,0 ***) f, Спонтани EPSC (sEPSC) во hCO и t-hCO неврони по 8 месеци диференцијација и квантификација на стапките на синаптички настани (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; ***P <0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率猖性EPSCs神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缄频率缄频神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) во нејронах hCO и t-hCO через 8 месечни диференцировки и количествен оценка частоты синаптических событий (n = 25 нејронов hCO, n = 17 PhCO;0 ***). f, Спонтани EPSC (sEPSC) во hCO и t-hCO неврони по 8 месеци диференцијација и квантификација на стапките на синаптички настани (n = 25 hCO неврони, n = 17 t-hCO неврони; *** P <0,0001).За bf, hCO3 и t-hCO3 во линијата 1208-2 беа земени од истата серија за диференцијација одржувана паралелно. g, Анализа на збогатување на генскиот сет (едностран Фишеров точен тест) на гени значително зголемени (прилагоден P < 0,05, промена на превиткувањето > 2, изразени во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергичните неврони во споредба со hCO глутаматергичните неврони со генски сетови на гени зависни од активноста и за ран одговор (ERG) и за доцнежен одговор (LRG) идентификувани од студија на глувци in vivo16 и човечки специфични LRG од неврони in vitro17. g, Анализа на збогатување на генскиот сет (едностран Фишеров точен тест) на гени значително зголемени (прилагоден P < 0,05, промена на превиткувањето > 2, изразени во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергичните неврони во споредба со hCO глутаматергичните неврони со генски сетови на гени зависни од активноста и за ран одговор (ERG) и за доцнежен одговор (LRG) идентификувани од студија на глувци in vivo16 и човечки специфични LRG од неврони in vitro17. g, анализа на обогащения набора генови (односноронний точный критерий Фишера) генерации со значителен активацией (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, експресия по мень10% мерења) нејронах t-hCO по сравнению со глутаматергическими неиронами hCO наборы генови како раннего (ERG), так и позднего (LRG) генови, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нејронов in vitro17. g, анализа на збогатување на генскиот сет (едностран Фишеров точен тест) на гени со значајна активација (прилагодено P <0,05, промена на превиткувањето >2, експресија во најмалку 10% од јадрата) кај t-hCO глутаматергични неврони во споредба со hCO глутаматергични невронски групи и на рани (ERG) и на доцни (LRG) гени зависни од активноста идентификувани кај in vivo глувци16 и човечки специфични LRG од неврони in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特R г. <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значителен активизам по сравнению со глутаматергическими нейронами hCO (скоректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не ми е 10% анализа на бореноста точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. специфичные для человека. g, t-hCO глутаматергичните неврони беа значително зголемени во споредба со hCO глутаматергичните неврони (прилагоден P <0,05, промена на превиткувањето >2, најмалку 10% Анализа на збогатување на гени за ран одговор (ERG) и доцнежен одговор (едностран точен Фишеров тест) гени зависни од активноста на одговор (LRG) идентификувани кај глувци in vivo16 и неврони in vitro.17 Човечки специфични LRG.Испрекинатата линија означува вредност на P корегирана со Бонферони од 0,05. h, експресијата на генот GluN (псевдо-пакување и скалирање на секој ген) беше значително зголемена во snRNA-seq репликите на LRG гените во t-hCO глутаматергичните неврони. i, имунобоење што ја покажува експресијата на SCG2 во t-hCO (горни) и hCO (долни) неврони. Белите стрелки покажуваат кон SCG2+ клетки. Скала, 25 µm. Податоците се изразени како средна вредност ± стандардна девијација.
Врз основа на зголемената активност на t-hCO забележана во ex vivo парчиња, snRNA-seq откри зголемена регулација на генските транскрипти зависна од активноста во t-hCO во споредба со hCO in vitro. Глутаматергичните t-hCO неврони експресираа повисоки нивоа на гени кои ја регулираат активноста на доцниот одговор (Сл. 2g,h), кои беа пронајдени во претходни студии кај глувчешки и човечки неврони16,17. На пример, BDNF18, SCG2 и OSTN, ген за регулирање на активноста специфичен за примати, покажаа зголемена експресија кај t-hCO невроните во споредба со hCO невроните (Сл. 2g-i). Така, t-hCO невроните покажаа подобрени карактеристики на созревање во споредба со hCO невроните со транскрипциски, морфолошки и функционални анализи.
За понатамошна евалуација на поврзаноста на созревањето на t-hCO со развојот на човечкиот мозок, извршивме транскриптомски споредби на типовите на фетални и возрасни кортикални клетки19,20 и возрасни21,22, како и обемни податоци за експресијата на кортикалните гени23 за време на развојот (проширени податоци, Сл. 5). Со претходна работа24, глобалниот статус на созревање на hCO и t-hCO транскриптомите на 7-8 месеци диференцијација е во голема мера конзистентен со времето на развој in vivo и е најеквивалентен на доцниот фетален живот (Проширени податоци Сл. 5а). Имено, забележавме зголемена зрелост на транскриптомите кај t-hCO во споредба со hCO соодветствувачки на возраста, како и активирање на транскриптомите поврзани со синаптогенеза, астрогенеза и миелинизација (проширени податоци, Сл. 5б-г). На клеточно ниво, пронајдовме докази за потенок подтип на кортексот кај t-hCO, со кластери на глутаматергични неврони кои се преклопуваат со подтиповите на возрасни неврони L2/3, L5 и L6 (Слика 1i). Спротивно на тоа, преклопувањето на кластерите помеѓу глутаматергичните t-hCO неврони и феталните кортикални неврони беше поограничено во средината на бременоста (проширени податоци, Слика 5e-j). За да утврдиме дали t-hCO невроните се функционално слични на човечките постнатални неокортикални неврони, извршивме електрофизиолошки снимања и анатомски реконструкции на човечки L2/3 пирамидални неврони во остри делови од човечкиот постнатален кортекс (проширени податоци, Сл. 7a). Електрофизиолошките својства на L2/3 пирамидалните неврони беа слични на оние на t-hCO пирамидалните неврони (проширени податоци, Сл. 7e). Морфолошки, L2/3 невроните од постнаталните човечки примероци беа послични на t-hCO отколку на hCO, иако L2/3 клетките беа подолги, содржеа повеќе гранки вкупно и имаа поголема густина на 'рбетот (Слика 3g и проширени податоци, Сл. 7b-). G).
а, трансплантација на hCO произведен од контролни и TS hiPS клеточни линии кај неонатални стаорци. б, 3D реконструкција на t-hCO неврони исполнети со биоцитин по 8 месеци диференцијација. в, квантификација на средната должина на дендритите (n = 19 контролни неврони, n = 21 TS неврони; **P = 0,0041). d, 3D-реконструирани дендритични гранки од контрола и TS t-hCO3 по 8 месеци диференцијација и квантификација на густината на дендритичниот 'рбет (n = 16 контролни неврони, n = 21 TS неврони, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструирани дендритични гранки од контрола и TS t-hCO3 по 8 месеци диференцијација и квантификација на густината на дендритичниот 'рбет (n = 16 контролни неврони, n = 21 TS неврони, ***P < 0,0001). г. d, 3D реконструкција на дендритични гранки од контролна и t-hCO TS по 8 месеци диференцијација и квантификација на густината на дендритичниот 'рбет (n = 16 контролни неврони, n = 21 TS неврони, ***P <0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =16（个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）. d ，分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. г. d, 3D реконструкција на контролните дендритични гранки и TS t-hCO3 по 8 месеци диференцијација и квантификација на густината на дендритичниот 'рбет (n = 16 контролни неврони, n = 21 TS неврони, ***P <0,0001).Црвените ѕвездички означуваат претпоставени дендритични боцки. e, спонтани EPSC кај контролни и TS t-hCO неврони по 8 месеци диференцијација. f, кумулативен фреквентен графикон и квантификација на фреквенцијата и амплитудата на синаптичките настани (n = 32 контролни неврони, n = 26 TS неврони; **P = 0,0076 и P = 0,8102). g, Шолова анализа на TS и контролни неврони кај hCO и t-hCO. Испрекинатите линии ги покажуваат човечките L2/3 постнатални пирамидални неврони за споредба (n = 24 контролни t-hCO неврони, n = 21 TS t-hCO неврони, n = 8 контролни hCO неврони и n = 7 TS hCO неврони). Податоците се изразени како средна вредност ± стандардна девијација.
Способноста на t-hCO3 да ги реплицира морфолошките и функционалните карактеристики на невроните во човечкиот кортекс на високо ниво нè поттикна да истражиме дали t-hCO3 може да се користи за откривање на фенотипови на болести. Се фокусиравме на TS, тешко невроразвојно нарушување предизвикано од мутации на добивање функција во генот што го кодира CaV1.2, кој иницира транскрипција на гени зависна од активноста кај невроните. Добивме hCO3 од три пациенти со TS кои ја носеа најчестата супституција (p.G406R) и три контролни (Сл. 3a). По трансплантацијата, откривме дека дендритичната морфологија е изменета кај TS невроните во споредба со контролните (Сл. 3b и проширени податоци, Сл. 8a,b), со двојно зголемување на бројот на примарни дендрити и вкупно зголемување на средната и целокупната намалување на должината на дендритите (Сл. 3c и проширени податоци, Сл. 8c). Ова беше поврзано со зголемена густина на боцки и зголемена фреквенција на спонтани EPSC кај TS во споредба со контролните неврони (Сл. 3d–f и проширени податоци, Сл. 8g). Понатамошната анализа откри модели на абнормално дендритско разгранување кај t-hCO3 TS во споредба со контролните групи, но не и кај in vitro TS hCO3 во слична фаза на диференцијација (Сл. 3g). Ова е во согласност со нашите претходни извештаи за намалување на дендритите зависно од активноста кај TS и ја истакнува способноста на оваа платформа за трансплантација да детектира фенотипови на болести in vivo.
Потоа прашавме до кој степен t-hCO клетките се функционално интегрирани во S1 кај стаорци. S1 кај глодари прима силни синаптички влезни сигнали од ипсилатералните вентрални базални и задни таламични јадра, како и од ипсилатералните моторни и секундарни соматосензорни кортекси, и контралатералниот S1 (Сл. 4а). За да го вратиме моделот на инервација, го инфициравме hCO со вирус на беснило-dG-GFP/AAV-G и трансплантиравме hCO кај стаорец S1 3 дена подоцна. Забележавме густа GFP експресија во невроните на ипсилатералниот S1 и вентралните базални ганглии 7-14 дена по трансплантацијата (Сл. 4б, в). Покрај тоа, боењето со антитела на таламичниот маркер нетрин G1 откри присуство на таламични завршетоци во t-hCO (Сл. 4д, д). За да процениме дали овие аферентни проекции можат да предизвикаат синаптички одговори во t-hCO клетките, извршивме снимање на цели клетки од човечки клетки во остри делови од таламокортикалниот слој. Електрична стимулација на стаорец S1, внатрешна капсула, бела маса, влакна во близина на t-hCO или оптогенетска активација на таламусните завршетоци кои експресираат опсин во t-hCO индуцирани EPSC со кратка латенција во t-hCO неврони изложени на AMPA рецепторскиот антагонист NBQX. (Сл. 4f, g и проширени податоци, Сл. 9a–g). Овие податоци покажуваат дека t-hCO е анатомски интегриран во мозокот на стаорец и е способен да се активира од ткивото на домаќинот на стаорец.
a, Шематски дијаграм на експеримент за следење на беснило. b, GFP и човечка специфична експресија на STEM121 помеѓу t-hCO и церебрален кортекс на стаорец (горен панел). Исто така, прикажана е експресијата на GFP во ипсилатералното вентрално базално јадро (VB) кај стаорец (долу лево) и ипсилатералното S1 (долу десно). Скала, 50 µm. Црвените квадрати ги претставуваат областите на мозокот каде што се направени сликите. c, квантификација на клетките што експресираат GFP (n = 4 стаорци). d, e — Netrin G1+ таламусни терминали во t-hCO. d покажува коронален пресек што содржи t-hCO и VB јадра. Скала, 2 mm. e покажува експресија на Netrin G1 и STEM121 во t-hCO (лево) и VB (десно) неврони. Скала, 50 µm. Портокаловата испрекината линија ја означува границата на t-hCO. f, g, Моментални траги на t-hCO неврони по електрична стимулација кај S1 стаорец (f) или внатрешна капсула (g), со (виолетова) или без (црна) NBQX (лево). EPSC амплитуди со и без NBQX (n = 6 S1 неврони, *P = 0,0119; и n = 6 внатрешни капсулни неврони, **P = 0,0022) (центар). Процент на t-hCO неврони кои покажуваат EPSC како одговор на електрична стимулација на стаорец S1 (f) или внатрешна капсула (g) (десно). aCSF, вештачка цереброспинална течност. h, шематски дијаграм на експериментот за снимање со 2P (лево). Експресија на GCaMP6s во t-hCO (средина). Скала, 100 µm. Временски прекин на флуоресценција на GCaMP6s (десно). i, Z-резултат на спонтана флуоресценција на активност. j, шематска илустрација на стимулација на мустаќи. k, z-оценети 2P флуоресцентни траектории во еден обид, усогласени со отстапувањето на мустаќите во време нула (испрекината линија) во примерните клетки. l, просечни z-оценки на одговорите на сите клетки усогласени со отстапувањето на мустаќите во време нула (испрекината линија) (црвена) или случајно генерирани временски ознаки (сива). m. Шематски дијаграм на експериментот на оптичко обележување. n, Необработени криви на напон од примерна t-hCO клетка за време на сина ласерска стимулација или отстапување на мустаќите. Црвените стрелки ги означуваат првите шилци предизвикани од светлина (горе) или предизвикани од отстапување на мустаќите (долу). Сивото засенчување означува периоди на отстапување на мустаќите. o, Врвни светлосни бранови форми и одговори на отстапување на мустаќите. p, шилци од еден обид, усогласени со отстапувањето на мустаќите во клетките од примерот. 0 означува отстапување на мустаќите (испрекината линија). q, просечна z-оценка на стапката на палење за сите фотосензитивни клетки, усогласени со отстапувањето на мустаќите во време нула (испрекината линија) (црвена) или случајно генерирани временски ознаки (сива). r, Пропорција на фотосензитивни единици значително модулирани со девијација на мустаќите (n = 3 стаорци) (лево). Врвна латенција на z-оценката (n = 3 стаорци; n = 5 (светло зелена), n = 4 (темно зелена) и n = 4 (цијан) модулациски единици за девијација на мустаќите по стаорец) (десно). Податоците се изразени како средна вредност ± стандардна девијација
Потоа прашавме дали t-hCO3 може да се активира со сензорни стимули in vivo. Трансплантиравме hCO3 што ги експресира генетски кодираните индикатори за калциум GCaMP6 кај S1 стаорци. По 150 дена, извршивме фибер фотометрија или снимање на калциум со два фотона (Слика 4h и проширени податоци, Сл. 10a). Откривме дека t-hCO3 клетките покажуваат синхронизирана ритмичка активност (Слика 4i, Проширени податоци, Слика 10b и Дополнително видео 1). За да ја карактеризираме врвната активност на t-hCO3, извршивме екстрацелуларни електрофизиолошки снимања кај анестезирани трансплантирани стаорци (проширени податоци, Сл. 10c-f). Генериравме стереотактични координати од МРИ слики; така, овие снимени единици претставуваат претпоставени човечки неврони, иако електрофизиологијата сама по себе не дозволува да се утврди видот на потекло. Набљудувавме синхронизирани налети на активност (проширени податоци, Сл. 10d). Експлозиите траеја околу 460 ms и беа одделени со периоди на тишина од околу 2 s (проширени податоци, Сл. 10d, e). Поединечните единици испукаа во просек околу три куршуми по експлозија, што е приближно 73% од регистрираните единици по експлозија. Активностите на поединечните единици беа високо корелирани, а овие корелации беа повисоки од оние на единиците идентификувани кај невакцинирани животни снимени под истите услови (проширени податоци, Сл. 10f). За понатамошно карактеризирање на врвните одговори на идентификуваните неврони добиени од луѓе, извршивме експерименти со означување со светлина на анестезирани стаорци трансплантирани со hCO3 кои го експресираат светлосензитивниот катјонски канал родопсин 2 (hChR2), преку кој t-hCO3 невроните препознаваат кратко латентност (помалку од 10 ms) како одговор на стимули со сина светлина (Сл. 4m–o). Невроните на t-hCO покажаа напливи на спонтана активност на фреквенции слични на оние забележани при снимање со калциум, како и електрофизиолошки снимки извршени во t-hCO во отсуство на светлосно обележување (проширени податоци, Сл. 10c-g). Не е забележана спонтана активност во соодветните фази на hCO снимени in vitro. За да процениме дали t-hCO може да се активира со сензорни стимули, накратко ги отклонивме мустаќите на стаорецот подалеку од t-hCO (Сл. 4j,m и проширени податоци, Сл. 10h,k). Според претходни студии8,10, подмножество на t-hCO клетки покажа зголемена активност како одговор на отклонувањето на мустаќите, што не беше забележано кога податоците беа споредени со случајни временски ознаки (Сл. 4k–q и проширени податоци, Сл. 10h–q). Всушност, околу 54% од опто-обележаните единечни единици покажаа значително зголемена стапка на возбудување по стимулација на мустаќите, достигнувајќи врв на околу 650 ms (Сл. 4r). Земени заедно, овие податоци сугерираат дека t-hCO3 прима соодветни функционални влезни сигнали и може да се активира од стимули од околината.
Потоа истражувавме дали t-hCO може да активира кола кај стаорци за да го контролира однесувањето. Прво истражувавме дали аксоните на t-hCO невроните се проектираат во околните ткива на стаорецот. Го инфициравме hCO со лентивирус кој кодира hChR2 споен со EYFP (hChR2-EYFP). По 110 дена, ја набљудувавме експресијата на EYFP во ипсилатералните кортикални региони, вклучувајќи ги аудитивните, моторните и соматосензорните кортекси, како и во субкортикалните региони, вклучувајќи го стриатумот, хипокампусот и таламусот (Сл. 5а). За да процениме дали овие еферентни проекции можат да предизвикаат синаптички одговори во клетките на стаорците, оптички активиравме t-hCO клетки кои го експресираат hChR2-EYFP со снимање на клетки од церебралниот кортекс на стаорци во остри пресеци на мозокот. Активирањето на t-hCO аксоните со сина светлина предизвика кратка латенција на EPSC кај пирамидални неврони на стаорци, кои беа блокирани од NBQX (Сл. 5b–g). Покрај тоа, овие одговори би можеле да бидат блокирани од тетродотоксин (TTX) и обновени од 4-аминопиридин (4-AP), што укажува дека тие се предизвикани од моносинаптички врски (Сл. 5e).
a, Шематски дијаграм на следење на аксонот (лево). t-hCO експресија на EYFP (десно). Скала, 100 µm. A1, аудитивен кортекс, ACC, преден цингуларен кортекс, d. стриатум, дорзален стриатум, HPC, хипокампус; Дијафрагма, латерален септум, mPFC, медијален префронтален кортекс, пири, пириформен кортекс, v. стриатум, вентрален стриатум, VPM, вентропостомедијално јадро на таламусот, VTA, вентрален тегментален регион. Црвените квадрати ги претставуваат областите на мозокот каде што се направени сликите. b, Шематски дијаграм на експериментот со стимулација. c, d, Примери за одговор на фотоструја индуцирана од сина светлина (горе) и напон (долу) кај човечки (c) EYFP+ t-hCO или стаорец (d) EYFP- клетки. e, f, Моментални траги од неврони на стаорци по стимулација со сина светлина на t-hCO аксони со TTX и 4-AR (зелена), TTX (сива) или aCSF (црна) (e), со (виолетова) или без (црна) ) ) NBQX (e). g, латенција на одговори предизвикани од сина светлина во клетки на стаорци (n = 16 клетки); хоризонталните ленти означуваат просечна латенција (7,13 ms) (лево). Амплитуда на светло-евотирани EPSC снимени со или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (средина). Амплитуда на светло-евотирани EPSC снимени со или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (средина). Амплитуда вызванных светом EPSC, регистриран со или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (во центарот). Амплитуда на светло-индуцирани EPSC снимени со или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (центар).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, регистриран со или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (во центарот). Амплитуда на светло-индуцирани EPSC снимени со или без NBQX (n = 7 клетки; ***P < 0,0001) (центар).Процент на клетки на стаорци кои покажуваат EPSC кои реагираат на сина светлина (десно). h, Шематски дијаграм на задача за однесување. d0, ден 0. i. Перформанси на примерни животни на ден 1 (лево) или ден 15 (десно) од обуката. Просечен број на лижења извршени на 1-ви ден (лево) или 15-ти ден (десно во центарот) (n = 150 испитувања со сина светлина, n = 150 испитувања со црвена светлина; ***P < 0,0001). Просечен број на лижења извршени на 1-ви ден (лево) или 15-ти ден (десно во центарот) (n = 150 испитувања со сина светлина, n = 150 испитувања со црвена светлина; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных во день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со синим светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Просечен број на лижења извршени на 1-ви ден (лево) или 15-ти ден (десно во центарот) (n = 150 испитувања со сина светлина, n = 150 испитувања со црвена светлина; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,001 Среднее количество облизываний, выполненных во день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со синим светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Просечен број на лижења извршени на 1-ви ден (лево) или 15-ти ден (десно во центарот) (n = 150 испитувања со сина светлина, n = 150 испитувања со црвена светлина; ***P < 0,0001).Кумулативни лижења за испитувања со црвена и сина светлина на ден 1 (лево во центарот) или ден 15 (десно). NS, не е значајно. j,k, Карактеристики на однесувањето на сите животни трансплантирани со t-hCO кои експресираат hChR2-EYFP (j) или контролен флуорофор (k) на ден 1 или 15 (hChR2-EYFP: n = 9 стаорци, ** P = 0,0049; контрола: n = 9, P = 0,1497). l, Еволуција на скорот на преференции (n = 9 hChR2, n = 9 контрола; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Еволуција на скорот на преференции (n = 9 hChR2, n = 9 контрола; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволуција на скорот на преференции (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001,***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001,***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Еволуција на резултатите за преференции (n = 9 hChR2, n = 9 контроли; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, експресија на FOS како одговор на оптогенетската активација на t-hCO во S1. Прикажани се слики од експресијата на FOS (лево) и квантификација (n = 3 по група; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (десно). Прикажани се слики од експресијата на FOS (лево) и квантификација (n = 3 по група; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (десно). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количествена определба (n = 3 на група; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Прикажани се слики од експресијата на FOS (лево) и квантификација (n = 3 по група; *P <0,05, **P <0,01 и ***P <0,001) (десно).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количествена определба (n = 3 на група; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Прикажани се слики од експресијата на FOS (лево) и квантификација (n = 3 по група; *P <0,05, **P <0,01 и ***P <0,001) (десно).Скала, 100 µm. Податоците се изразени како средна вредност ± стандардна грешка на BLA, базолатерален тонзил, MDT, дорзомедијално таламично јадро, PAG, периакведуктално сиво.
Конечно, прашавме дали t-hCO3 може да го модулира однесувањето на стаорците. За да го тестираме ова, трансплантиравме hCO3 што експресира hChR2-EYFP во S1, а 90 дена подоцна, имплантиравме оптички влакна во t-hCO3 за испорака на светлина. Потоа ги трениравме стаорците со модифицирана парадигма на оперативно условување (Сл. 5h). Ги сместивме животните во комора за тестирање на однесувањето и случајно применивме 5-секундни сини (473 nm) и црвени (635 nm) ласерски стимули. Животните добија награда за вода ако лижеа за време на стимулација со сина светлина, но не лижеа за време на стимулација со црвена светлина. На првиот ден од обуката, животните не покажаа разлика во лижењето кога беа стимулирани со сина или црвена светлина. Сепак, на 15-тиот ден, животните трансплантирани со hCO3 што експресираат hChR2-EYFP покажаа поактивно лижење кога беа стимулирани со сина светлина во споредба со стимулацијата со црвена светлина. Овие промени во однесувањето при лижење не беа забележани кај контролни животни трансплантирани со hCO3 што го експресира контролниот флуорофор (стапка на успех во учењето: hChR2 89%, EYFP 0%, Слика 5i-1 и Дополнително видео 2). Овие податоци сугерираат дека t-hCO клетките можат да активираат неврони на стаорци за да стимулираат однесување кое бара награда. За да откриеме кои невронски кола на t-hCO3 кај стаорци би можеле да бидат вклучени во овие промени во однесувањето, оптогенетски активиравме t-hCO3 кај обучени животни и собрани ткива 90 минути подоцна. Имунохистохемијата откри експресија на протеинот FOS зависен од активноста во неколку региони на мозокот вклучени во мотивираното однесување, вклучувајќи го медијалниот префронтален кортекс, медијалниот таламус и периакведукталната сива материја, која беше експресирана или кај нестимулирани контролни животни или кај животни. ориз. 5m). Земени заедно, овие податоци сугерираат дека t-hCO3 може да ја модулира невронската активност кај стаорци за да го поттикне однесувањето.
Нервните органоиди претставуваат ветувачки систем за проучување на човечкиот развој и болестите in vitro, но тие се ограничени од недостатокот на врски помеѓу кола што постојат in vivo. Развивме нова платформа во која трансплантиравме hCO во S1 на имунокомпромитирани рани постнатални стаорци за да го проучуваме развојот и функцијата на човечките клетки in vivo. Покажавме дека t-hCO развива зрели типови на клетки кои не се забележани in vitro28 и дека t-hCO е анатомски и функционално интегриран во мозокот на глодарите. Интеграцијата на t-hCO во невронските кола на глодарите ни овозможи да воспоставиме врска помеѓу човечката клеточна активност и проучуваното однесување на животните, покажувајќи дека t-hCO невроните можат да ја модулираат невронската активност на стаорците за да ги поттикнат реакциите на однесувањето.
Платформата што ја опишуваме има неколку предности во однос на претходните истражувања за трансплантација на човечки клетки во мозоци на глодари. Прво, трансплантиравме hCO3 во кортексот во развој на раните постнатални стаорци, што може да ја олесни анатомската и функционалната интеграција. Второ, мониторингот со t-hCO3 MRI ни овозможи да ја проучиме позицијата и растот на графтот кај живи животни, овозможувајќи ни да спроведеме долгорочни студии на повеќе животни и да ја утврдиме веродостојноста на неколку hiPS клеточни линии. Конечно, трансплантиравме интактни органоиди, наместо изолирани суспензии на единечни клетки, кои се помалку деструктивни за човечките клетки и можат да ја промовираат интеграцијата и генерирањето на неврони од човечкиот кортекс во мозокот на стаорци.
Признаваме дека и покрај напредокот во оваа платформа, временските, просторните и меѓувидовите ограничувања го спречуваат формирањето на човечки невронски кола со висока точност, дури и по трансплантацијата во рана фаза на развој. На пример, не е јасно дали спонтаната активност забележана кај t-hCO претставува развоен фенотип сличен на ритмичката активност забележана за време на кортикалниот развој, или дали се должи на отсуството на супресивни типови на клетки присутни кај t-hCO. Слично на тоа, не е јасно до кој степен отсуството на ламинација кај t-hCO влијае на поврзаноста на синџирот30. Идната работа ќе се фокусира на интегрирање на други типови на клетки како што се човечката микроглија, човечките ендотелни клетки и различни пропорции на GABAергични интернеурони како што е прикажано со користење на склопување 6 in vitro, како и разбирање како невронската интеграција и обработка може да се појават кај изменети транскрипциски, синаптички и бихевиорални нивоа на t-hCO во клетките добиени од пациенти.
Генерално, оваа in vivo платформа претставува моќен ресурс што може да го надополни развојот на човечкиот мозок и истражувањето на болести in vitro. Очекуваме дека оваа платформа ќе ни овозможи да откриеме нови фенотипови на ниво на нишки во инаку недостижни клетки добиени од пациенти и да тестираме нови терапевтски стратегии.
Генериравме hCO2.5 од HiPS клетки како што е претходно опишано. За да се иницира производство на hCO од hiPS клетки култивирани на хранителни слоеви, интактни колонии на hiPS клетки беа отстранети од садовите за култура со употреба на диспаза (0,35 mg/mL) и префрлени во пластични култури со ултра-ниско прицврстување што содржат садови со медиум за култура на клетки од hiPS. (Corning) дополнет со два SMAD инхибитори дорзоморфин (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) и ROCK инхибитор Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Во текот на првите 5 дена, медиумот на клетките од hiPS се менуваше секојдневно и се додаваа дорзоморфин и SB-431542. На шестиот ден во суспензија, невронските сфероиди беа префрлени во невронска средина што содржи невробазал-А (10888, Life Technologies), додаток Б-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнети со фактор на епидермален раст (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) и фактор на раст на фибробласти 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) до 24-тиот ден. Од 25-тиот до 42-риот ден, средината беше дополнета со невротрофичен фактор добиен од мозокот (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) со промени на средината секој втор ден. На шестиот ден во суспензија, невронските сфероиди беа префрлени во невронска средина што содржи невробазал-А (10888, Life Technologies), додаток Б-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнети со фактор на епидермален раст (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) и фактор на раст на фибробласти 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) до 24-тиот ден. Од 25-тиот до 42-риот ден, средината беше дополнета со невротрофичен фактор добиен од мозокот (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) со промени на средината секој втор ден.На шестиот ден во суспензија, невронските сфероиди беа префрлени во невронска средина што содржи Neurobasal-A (10888, Life Technologies), додаток во исхраната Б-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнителен епидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-. и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнети со епидермален фактор на раст (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактор на раст на фибробласти 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) до 24-тиот ден.Од 25-тиот до 42-риот ден, во медиумот беа додадени невротрофичен фактор добиен од мозокот (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) и невротрофин 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), менувајќи го медиумот секој втор ден.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7生补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10Life Технологии）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1; R&D системи）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D системи）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， 画 画 Technologies） b-27 补充剂 (12587 ， Life Technologies） Glutamax 1: 100 ， Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 神经 培养 基 中 10 ， Животни технологии） 表皮 生长 因子 (((20 ng ml-1) системи за истражување и развој) На 6-й день суспензии неиросферы были переведены на добавку, содержащую неиробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100), стрептомицин (1:100, Life Technologies) со добавлением епидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Системи за истражување и развој) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; На 6-тиот ден, суспензиите на невросферите беа заменети со додаток кој содржи невробазал-А (10888, Life Technologies), додаток Б-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрептомицин неутрализиран со пеницилин (1:100, Life Technologies) дополнет со фактор на епидермален раст (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактор на раст на фибробласти 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Системи за истражување и развој) до 24-дня. Системи за истражување и развој) до 24-тиот ден.Од 25-тиот до 42-риот ден, невротрофичен фактор добиен од мозокот (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) и невротрофичен фактор 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) беа додавани во хранливата подлога секој втор ден. Медијалната подлога се менуваше еднаш.Почнувајќи од 43-тиот ден, hCO3 се одржуваше во недополнет невробазален-А медиум (NM; 1088022, Thermo Fisher) со промена на медиумот на секои 4-6 дена. За да се добие hCO3 од hiPS клетки култивирани во услови без хранење, hiPS клетките беа инкубирани со Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) на 37°C во тек на 7 минути, дисоцирани на единечни клетки и положени на AggreWell 800 плочи (34815, STEMCELL Technologies) со густина од 3 × 106 единечни клетки по бунар во Essential 8 медиум дополнет со ROCK инхибиторот Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). По 24 часа, медиумите во бунарите беа пипетирани нагоре-надолу во медиуми што содржат Essential 6 медиуми (A1516401, Life Technologies) дополнети со дорзоморфин (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Од 2-ри до 6-ти ден, Essential 6 медиумот се заменуваше секојдневно со дорзоморфин и додаток SB-431542. Од шестиот ден, суспензиите на невросферите беа префрлени во невробазалната средина и одржувани како што е опишано погоре.
Сите процедури кај животните беа извршени во согласност со упатствата за нега на животните одобрени од Административниот комитет за нега на животни при Лабораторијата за нега на животни при Универзитетот Стенфорд (APLAC). Бремени еутимични RNU (rnu/+) стаорци беа купени (Лаборатории на Чарлс Ривер) или сместени. Животните беа чувани на 12-часовен циклус светлина-темнина со храна и вода ad libitum. Голи (FOXN1–/–) стаорци на возраст од три до седум дена беа идентификувани преку растот на незрелите мустаќи пред уништувањето. Кученцата (машки и женски) беа анестезирани со 2-3% изофлуран и поставени на стереотаксична рамка. Извршена е трепанација на черепот со дијаметар од приближно 2-3 mm над S1, додека се одржуваше интегритетот на дура матер. Потоа користете игла од 30-G (приближно 0,3 mm) веднаш надвор од краниотомијата за да ја прободете дурата. Потоа нанесете HCO3 на тенок парафилм од 3×3 cm и отстранете го вишокот медиум. Користејќи шприц Хамилтон прикачен на игла од 23 G, агол од 45°, нежно повлечете hCO3 во најдисталниот крај на иглата. Потоа инсталирајте го шприцот на пумпата за шприц поврзана со стереотаксичниот уред. Потоа ставете го врвот на иглата над претходно направена дупка за пункција широка 0,3 mm во дурата (z = 0 mm) и стеснете го шприцот 1-2 mm (z = приближно -1,5 mm) додека иглата не се најде помеѓу дурата матер А. Се формира густ заптивка. Потоа подигнете го шприцот до центарот на кортикалната површина на z = -0,5 mm и инјектирајте hCO3 со брзина од 1-2 µl во минута. По завршувањето на инјектирањето на hCO3, иглата се повлекува со брзина од 0,2-0,5 mm во минута, кожата се шие и кученцето веднаш се става на топла грејна подлога до целосно закрепнување. Некои животни беа трансплантирани билатерално.
Сите процедури кај животните беа извршени во согласност со упатствата за нега на животни одобрени од APLAC на Универзитетот Стенфорд. Стаорците (повеќе од 60 дена по трансплантацијата) беа индуцирани со 5% изофлуранска анестезија и анестезирани со 1-3% изофлуран за време на снимањето. За визуелизација, беше користен активно заштитен хоризонтален скенер за бушотини Bruker (Bruker Corp.) од 7 Tesla со градиентен погон на International Electric Company (IECO), заштитен градиентен влошок со внатрешен дијаметар од 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) со употреба на AVANCE.III, осумканални повеќенамотки RF и повеќејадрени можности, како и придружната платформа Paravision 6.0.1. Снимањето беше извршено со употреба на активно одвоена волуметриска RF намотка со внатрешен дијаметар од 86 mm и четириканална криоладена RF намотка само за прием. Аксијален 2D Turbo-RARE (време на повторување = 2500 ms, време на ехо = 33 ms, 2 просеци) со 16 снимања на пресеци, дебелина на пресекот 0,6–0,8 mm, содржејќи 256 × 256 примероци. Сигналите беа примени со помош на квадратурен примопредавател-волуметриски RF намот со внатрешен дијаметар од 2 cm (Rapid MR International, LLC). Конечно, користете ги вградените функции за проценка на површината Imaris (BitPlane) за 3D рендерирање и анализа на волуменот. Успешна трансплантација беше дефинирана како онаа во која области на континуиран Т2-пондериран МРИ сигнал беа формирани во трансплантирана хемисфера. Отфрлањето на графтот беше дефинирано како графт кој не произведе области на континуиран Т2-пондериран МРИ сигнал во трансплантираната хемисфера. Субкортикалниот t-hCO3 беше исклучен од последователната анализа.
За стабилно изразување на GCaMP6s во hCO3 за снимање на калциум со два фотони, hiPS клетките беа инфицирани со pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, проследено со избор на антибиотици. Накратко, клетките беа дисоцирани со EDTA и суспендирани во 1 ml Essential 8 медиум со густина од приближно 300.000 клетки во присуство на полибрен (5 μg/ml) и 15 μl вирус. Клетките потоа беа инкубирани во суспензија 60 минути и засеани со густина од 50.000 клетки по бунар. По конфлуенцијата, клетките беа третирани со 5-10 μg ml-1 пуромицин во текот на 5-10 дена или додека не се појават стабилни колонии. Акутната hCO инфекција беше извршена како што е претходно опишано5 со некои модификации. Накратко, пренесете hCO3 на ден 30-45 во микроцентрифугални епрувети од 1,5 ml Епендорф кои содржат 100 µl нервен медиум. Потоа се отстрануваат приближно 90 µl од медиумот, во епруветата се додаваат 3-6 µl лентивирус со висок титар (од 0,5 x 108 до 1,2 x 109), а hCO3 се пренесува во инкубаторот 30 минути. Потоа додадете 90-100 µl медиум во секоја епрувета и вратете ги епруветите во инкубаторот преку ноќ. Следниот ден, пренесете го hCO3 во свеж нервен медиум во плочи со ниска приврзаност. По 7 дена, hCO3 беше пренесен во плочи со стаклено дно со 24 бунари за визуелизација и евалуација на квалитетот на инфекцијата. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE и pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE беа генерирани од VectorBuilder. Лентивирусот се користи во повеќето експерименти бидејќи е интегриран во геномот на домаќинот, овозможувајќи експресија на репортерскиот ген во инфицираните клеточни линии. За следење на беснило, на ден 30-45 hCO беше коинфициран со rabies-ΔG-eGFP и AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид #67528, Addgene), темелно измиен 3 дена и трансплантиран кај стаорци во S1 и одржуван in vivo 7-14 дена.
За имуноцитохемија, животните беа анестезирани и транскардијално перфузирани со PBS, проследено со 4% параформалдехид (PFA во PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозоците беа фиксирани во 4% PFA 2 часа или преку ноќ на 4°C, криоконзервирани во 30% сахароза во PBS 48-72 часа и вградени во 1:1, 30% сахароза: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) и короналните пресеци беа направени на 30 µm со помош на криостат (Leica). За имунохистохемија на дебели пресеци, животните беа перфузирани со PBS, а мозокот беше дисециран и пресечен коронално на 300-400 µm со помош на вибратом (Leica), а пресеците беа фиксирани со 4% PFA 30 минути. Потоа криосекциите или дебелите делови беа измиени со PBS, блокирани 1 час на собна температура (10% нормален серум од магаре (NDS) и 0,3% Triton X-100 разреден во PBS) и блокирани со раствор за блокирање на 4°C. – Инкубација Криосекциите беа инкубирани преку ноќ, а дебелите делови беа инкубирани 5 дена. Примарните антитела што беа употребени беа: анти-NeuN (глушец, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (стаорец, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зајак, 1:1,000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (глушец, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зајак, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зајак, 1:200; sc-338, Санта Круз), анти-PPP1R17 (зајак, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (глушец, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (зајак, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (глушец, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (глушец, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зајак, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam). Примарните антитела што беа употребени беа: анти-NeuN (глушец, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (стаорец, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зајак, 1:1.000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (глушец, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зајак, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зајак, 1:200; sc-338, Санта Круз), анти-PPP1R17 (зајак, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (глушец, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (зајак 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (глушец 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (глушец 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зајак 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (1:03, Z4) -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик20;-1: Анти-ПРП1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Атлас антитела), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-технолошки, SO-AP, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:5; анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Примарните антитела што беа користени беа: анти-NeuN (глушец, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (стаорец, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зајак, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (глушец, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зајак, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зајак, 1:200; sc-338, Санта Круз), анти-PPP1R17 (зајак, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (глушец, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (зајак, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (глушец, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (глушец, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зајак, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P (鸡), 1: 1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠), 1:200; ab1911 81,абкамера),抗NeuN（兔,1:500;ABN78,Милипор），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774,abcam），抗SCG2（兔）, 1:100;20357-1-AP;Proteintech;，抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D системи），Netrin G1a（山羊（山羊（山羊，6D，1: Системи，抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 : 300, ab18465, abcam,, 抗GFAP, 兔, 1: 1,000, Z0334, Дако, 抗-GFP (鸡), 1: 1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠), 1:200, ab 191181, abcam), 抗NeuN（兔, 1:500, ABN78, Millipore, 弔, 抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100;20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D системи），Netrin G1a（山羊（山羊，1:1100（山羊，1:100（山羊， Системи) 1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (глушец, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зајак, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam).Примарните антитела што беа користени беа: анти-NeuN (глушец, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (стаорец, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зајак, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (пилешко, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (глушец, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зајак, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зајак, 1:200; sc-338, Санта Круз), анти-PPP1R17 (зајак, 1:200; HPA047819, антитело Atlas), анти-RECA-1 (глушец, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (зајак), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:2010,Takara, 1:2010, YARA; (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (глушец, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (глушец, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зајак, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).Потоа, пресеците беа измиени со PBS и инкубирани со секундарно антитело 1 час на собна температура (замрзнати пресеци) или преку ноќ на 4°C (дебели пресеци). Беше користено секундарно антитело Alexa Fluor (Life Technologies) разредено 1:1000 во раствор за блокирање. По миењето со PBS, јадрата беа визуелизирани со Hoechst 33258 (Life Technologies). Конечно, слајдовите беа поставени на микроскоп со покривни стакла (Fisher Scientific) со помош на Aquamount (Polysciences) и анализирани на флуоресцентен микроскоп Keyence (анализатор BZ-X) или конфокален микроскоп Leica TCS SP8 (Las-X) на сликата. Сликите беа обработени со помош на програмата ImageJ (Фиџи). За да се квантифицира пропорцијата на човечки неврони во t-hCO3 и кортексот на стаорец, беа направени правоаголни слики со ширина од 387,5 μm во центарот на t-hCO3, на или близу до работ на кортексот на стаорец. Маргините на графтот беа одредени со проценка на промените во транспарентноста на ткивото, HNA+ јадрата и/или присуството на автофлуоресценција на ткивото. На секоја слика, вкупниот број на NeuN+ и HNA+ клетки беше поделен со вкупниот број на NeuN+ клетки во истата област. За да се осигури дека се бројат само клетките со јадра во рамнината на сликата, во пресметката се вклучени само клетките кои се исто така Hoechst+. Две слики одделени со најмалку 1 mm беа пресметани во просек за да се намали статистичката грешка.
Една недела пред собирањето примероци, животните за трансплантација со hCO3 (приближно 8 месеци диференцијација) ставете ги во темна просторија со скратени мустаќи за да се минимизира сензорната стимулација. Изолацијата на јадрата беше извршена како што е опишано претходно, со некои модификации. Накратко, t-hCO3 и hCO3 беа уништени со употреба на детергент-механичка лиза на клетките и мелница за стаклени ткива од 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Суровите јадра потоа беа филтрирани со употреба на филтер од 40 µm и центрифугирани на 320 g 10 минути на 4 °C пред да се изврши градиент на густина на сахароза. По чекорот на центрифугирање (320 g 20 минути на 4 °C), примероците беа ресуспендирани во 0,04% BSA/PBS со додавање на 0,2 единици инхибитор на µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) и поминаа низ филтер за проток од 40 µm. Дисоцираните јадра потоа беа ресуспендирани во PBS што содржи 0,02% BSA и натоварени на Chromium Single Cell 3′ чип (проценето обновување од 8.000 клетки по лента). snRNA-seq библиотеките беа подготвени со Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq библиотеките беа подготвени со Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq се приготвуваат со помош на Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеките со snRNA-seq беа подготвени со користење на Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium единечни ќелии 3' GEM、Библиотека и гел зрна со комплет v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium единечни ќелии 3' GEM、Библиотека и гел зрна со комплет v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq се подготвува со користење на Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеката snRNA-seq беше подготвена со користење на Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Библиотеките од различни примероци беа собрани и секвенционирани од Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Нивоата на генска експресија за секој претпоставен нуклеарен баркод беа квантифицирани со користење на софтверскиот пакет за анализа 10x Genomics CellRanger (верзија 6.1.2). Поточно, отчитувањата беа споредени со комбинација од референтни геноми на луѓе (GRCh38, Ensemble, верзија 98) и стаорци (Rnor_6.0, Ensemble, верзија 100) креирани со командата mkref и користејќи count со командата –include-introns=TRUE за квантификација на отчитувања со вклучено мапирање на интронските региони. За примероците од t-hCO3, човечките јадра беа идентификувани врз основа на конзервативниот услов најмалку 95% од сите мапирани отчитувања да се совпаѓаат со човечкиот геном. Сите последователни анализи беа извршени на филтриран низ од баркодови излез од CellRanger со користење на пакетот R (верзија 4.1.2) Seurat (верзија 4.1.1)32.
За да се осигури дека во последователната анализа се вклучени само јадра со висок квалитет, за секој примерок беше имплементиран итеративен процес на филтрирање. Прво, се идентификуваат и отстрануваат јадрата со низок квалитет со помалку од 1000 пронајдени уникатни гени и повеќе од 20% од вкупните митохондрии. Последователно, суровата матрица на генскиот број беше нормализирана со регуларизирана негативна биномна регресија користејќи ја функцијата sctransform(vst.flavor=”v2″), која исто така ги идентификуваше 3000-те најпроменливи гени користејќи ги стандардните параметри. Намалувањето на димензиите беше извршено на горните варијабилни гени користејќи ја анализата на главни компоненти (PCA) со стандардни параметри користејќи димензија на множество податоци од 30 (dims = 30 беше избрана врз основа на визуелна инспекција на местата на коленото и се користеше за сите примероци и анализи на ансамбли). Потоа извршивме неколку рунди на итеративно групирање (резолуција = 1) за да ги класифицираме гените врз основа на абнормално низок број на гени (медијана под 10-ти перцентил), абнормално висок број на митохондријални гени (медијана над 95-ти перцентил) за да ги идентификуваме и отстраниме претпоставените клетки со низок квалитет. Кластери и/или висок процент на сомнителни близнаци идентификувани користејќи го пакетот DoubletFinder33 (просечен резултат на DoubletFinder над 95-тиот перцентил). Примероците од t-hCO3 (n = 3) и примероците од hCO3 (n = 3) беа интегрирани одделно користејќи ја функцијата IntegrateData со горенаведеното. параметри. Потоа беше извршена уште една рунда на квалитативно филтрирање на интегрираниот сет на податоци како што е опишано погоре.
По отстранувањето на јадрата со низок квалитет, интегрираниот збир на податоци беше групиран (резолуција = 0,5) и вграден за цели на визуелизација на UMAP34. Маркерските гени за секој кластер беа одредени со помош на функцијата FindMarkers со стандардни параметри пресметани од нормализираните податоци за генска експресија. Ги идентификуваме и класифицираме главните класи на клетки со комбинирање на референтни збирови на податоци за фетални и возрасни кортикални клетки со експресија на маркерски гени 19,20,21,35 и анотација. Особено, циркулирачките прекурсори беа идентификувани со експресијата на MKI67 и TOP2A. Прогениторните кластери беа дефинирани со отсуство на митотични транскрипти, високо преклопување со мултипотентни глијални прогениторни кластери опишани во доцниот метафазен фетален кортекс и експресија на EGFR и OLIG1. Терминот астроцит го користиме за да опфатиме неколку состојби на диференцијација на астроцитите, од доцна радијална глија до созревање на астроцитите. Астроцитните кластери експресираат високи нивоа на SLC1A3 и AQP4 и е покажано дека се мапираат со подтипови на фетална радијална глија и/или возрасни астроцити. OPC експресираат PDGFRA и SOX10, додека олигодендроцитите експресираат миелинизирачки маркери (MOG и MYRF). Глутаматергичните неврони беа идентификувани преку присуството на невронски транскрипти (SYT1 и SNAP25), отсуството на GABAергични маркери (GAD2) и експресијата на NEUROD6, SLC17A7, BCL11B или SATB2. GluN невроните беа понатаму поделени на горни (екпресија на SATB2 и губење на BCL11B) и длабоки (екпресија на BCL11B) поткласи. Претпоставените неврони на подплочата (SP) експресираат познати SP18 маркери како што се ST18 и SORCS1, покрај длабоките GluN маркери. Клетките слични на хороиден плексус беа идентификувани преку експресија на TTR, а менингеалните клетки експресираа гени поврзани со фибробласти и мапираа пијални/васкуларни клетки од референтниот збир на податоци.
Диференцијална анализа на генската експресија помеѓу t-hCO3 и hCO подкласите беше извршена со користење на новоразвиен псевдо-сериски метод репродуциран во примероци имплементиран со користење на пакетот Libra R (верзија 1.0.0). Поточно, тестовите за логаритамска веројатност на edgeR (верзија 3.36.0, пакет R) беа извршени за групи со собирање на бројот на гени во клетките за дадена класа на клетки за секоја репликација на примерокот. За визуелизација на топлинската мапа, нормализираните вредности на милион (CPM) се пресметуваат со користење на edgeR (cpm() функција) и се скалираат (за да се постигне средна вредност = 0, стандардна девијација = 1). Извршена е анализа на збогатување со генска онтологија (GO) на значително зголемени t-hCO3 GluN гени (вредност на P корегирана од Benjamini-Hochberg помала од 0,05 изразена во најмалку 10% од t-hCO3 GluN клетките и зголемување на промената од најмалку 2 пати). Извршена со користење на ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ја користиме апликацијата ToppFun со стандардни параметри и ги прикажуваме P-вредностите корегирани од Бенџамини-Хохберг пресметани од GO-анотирани хипергеометриски тестови.
За да ги споиме нашите кластери snRNA-seq со анотирани кластери на клетки од референтни студии за примарна RNA-seq од единечни клетки или snRNA-seq за возрасни19,20,21,22, применивме пристап на интеграција на парни множества податоци. Го користевме работниот тек за нормализација на SCTransform (v2) во Seurat за да интегрираме и споредиме преклопувања на кластери помеѓу множествата податоци (користејќи ги истите параметри како погоре). Поединечните множества податоци беа случајно подгрупирани до 500 клетки или јадра по оригинален кластер за пресметковна ефикасност. Користејќи сличен пристап како што е опишано претходно, преклопувањето на кластерот беше дефинирано како пропорција на клетки или јадра во секој здружен кластер што се преклопуваа со ознаката на референтниот кластер. За понатамошно класифицирање на GluN, го користевме работниот тек TransferData на Seurat за податоци од подмножествата GluN за да доделиме етикети на референтни множества податоци на нашите GluN клетки.
За да ја процениме состојбата на созревање на глобалниот транскриптом на t-hCO3 и hCO3 примероците, ги споредивме нашите псевдо-булк примероци со BrainSpan/psychENCODE23, кој се состои од голема РНК секвенца што го опфаќа развојот на човечкиот мозок. Извршивме PCA на комбинирана матрица на генска експресија со нормализиран модел од кортикални примероци 10 недели по зачнувањето и подоцна, во 5567 гени (заедно со нашите податоци) кои претходно беа идентификувани како активни во кортикалните примероци на BrainSpan (дефинирани како поголема од 50% во развојната варијанса објаснета со возраста со користење на кубен модел)38. Покрај тоа, изведовме гени поврзани со главните транскриптомски потписи на невроразвојот користејќи ненегативна матрична факторизација како што е претходно опишано. Тежините на примероците пресметани со користење на постапката за ненегативна матрична факторизација се прикажани на Сл. 5б со проширени податоци за секој од петте потписи опишани од Жу и сор.38. Повторно, транскрипциските маркери зависни од активноста беа изведени од претходно објавени студии. Особено, ERG и LRG беа значително зголемени кај глутаматергичните неврони идентификувани со собирање на snRNA-seq од визуелниот кортекс на глувци по визуелна стимулација од Дополнителната табела 3 Hrvatin et al.16. Човечки збогатени LRG беа добиени од KCl-активирани човечки фетални мозочни култури и собрани 6 часа по стимулацијата, а филтрираните гени беа значително зголемени кај луѓето, но не и кај глодарите (Дополнителна табела 4). Анализата на збогатувањето на генскиот сет со користење на овие генски сетови беше извршена со користење на еднонасочен Фишеров точен тест.
Стаорците се анестезираат со изофлуран, се отстрануваат мозоците и се ставаат во ладен (приближно 4°C) раствор на сахароза заситен со кислород (95% O2 и 5% CO2) за пресеци што содржат: 234 mM сахароза, 11 mM гликоза, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 и 0,5 mM CaCl2 (околу 310 mOsm). Короналните пресеци на мозок на стаорец (300–400 µm) што содржат t-hCO3 се направени со помош на вибратом Leica VT1200 како што е претходно опишано39. Потоа, пресеците беа префрлени во комора за сечење со континуирана оксигенација на собна температура што содржи aCSF подготвен од: 10 mM гликоза, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 и 126 mM NaCl (298 mOsm). најмалку 45 минути пред снимањето. Пресеците беа снимени во потопена комора каде што континуирано перфузирани со aCSF (шишенце со 95% O2 и 5% CO2). Сите податоци беа снимени на собна температура. Невроните од t-hCO3 беа прекинати со пипета од боросиликатно стакло исполнета со раствор што содржи 127 mM калиум глуконат, 8 mM NaCl, 4 mM магнезиум ATP, 0,3 mM натриум GTP, 10 mM HEPES и 0,6 mM EGTA, pH 7,2, внатрешен раствор прилагоден со KOH (290 mOsm). За да се опорави, во растворот за снимање беше додаден биоцитин (0,2%).
Податоците се добиени со помош на засилувач MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитализатор Digidata 1550B (Molecular Devices), филтрирани со низок премин на 2 kHz, дигитализирани на 20 kHz и анализирани со помош на Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). и прилагодени MATLAB функции (Mathworks). Потенцијалот на спојување е пресметан со помош на JPCalc, а записите се прилагодени на пресметаната вредност од -14 mV. Операцијата IV се состои од серија струјни чекори во чекори од 10-25 pA, од -250 до 750 pA.
Таламусот, белата маса и S1 аферентните клетки беа електрично стимулирани во таламокортикални парчиња за време на снимање со печ-клемп на hCO3 неврони, како што беше претходно опишано. Накратко, мозокот беше поставен на маса за 3D печатење навалена под агол од 10°, а предниот дел од мозокот беше исечен под агол од 35°. Потоа мозокот беше залепен на површината за сечење и пресечен, зачувувајќи ги таламокортикалните испакнати аксони. Биполарни волфрамски електроди (0,5 MΩ) беа монтирани на втор микроманипулатор и стратешки позиционирани за да стимулираат четири региони по клетка (внатрешна капсула, бела маса, S1 и hCO3). Снимете ги синаптичките одговори по фазна стимулација од 300 µA на 0,03–0,1 Hz.
Невроните hCO3 кои експресираат hChR2 беа активирани на 480 nm и светлосни импулси генерирани од LED (Prizmatix) беа применети преку објектив ×40 (0,9 NA; Olympus) за да се регистрира експресијата на hChR2 во близина на клетките. Дијаметарот на осветленото поле е приближно 0,5 mm, а вкупната моќност е 10-20 mW. Ширината на импулсот беше поставена на 10 ms, што одговара на импулсот даден за време на експериментот за учење на однесувањето. Беа користени различни фреквенции на стимулација, од 1 до 20 Hz, но само првиот импулс од серијата беше користен за квантификација. Интервалите помеѓу низите се обично подолги од 30 секунди за да се минимизира ефектот врз синаптичките инхибиторни или олеснителни патишта. За да тестираме дали одговорот на hChR2 беше моносинаптичен, применивме TTX (1 μM) во бањата додека не исчезна EPSC реакцијата, а потоа применивме 4-аминопиридин (4-AP; 100 μM). Типично, одговорот се враќа во рок од неколку минути, со малку подолго задоцнување помеѓу палењето на LED диодата и генерирањето на EPSC. NBQX (10 μM) беше користен за да се тестира дали одговорот е управуван од AMPA рецепторите.
Остри hCO пресеци беа создадени како што е претходно опишано. Накратко, hCO пресеците беа вградени во 4% агароза и префрлени во клетки што содржат 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 и 10 mM d-(+)-глукоза во пресеци. Пресеците беа исечени на 200-300 µm на собна температура со помош на вибратор Leica VT1200 и складирани во ASF на собна температура. Потоа, на hCO пресеците беше извршено patch-camp снимање на цели клетки под директен SliceScope микроскоп (Scientifica). Пресеците беа перфузирани со aCSF (95% O2 и 5% CO2) и клеточните сигнали беа снимени на собна температура. Невроните од hCO беа аплицирани со помош на пипета од боросиликатно стакло исполнета со раствор што содржи 127 mM калиум глуконат, 8 mM NaCl, 4 mM магнезиум ATP, 0,3 mM натриум GTP, 10 mM HEPES и 0,6 mM EGTA, внатрешна pH вредност 7, 2, прилагодена со KOH (осмоларност 290). За целите на обновување, додадете 0,2% биоцитин во внатрешниот раствор.
Податоците беа добиени од Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) со помош на засилувач MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитализатор Digidata 1550B (Molecular Devices), филтрирани со низок премин на 2 kHz, дигитализирани на 20 kHz и анализирани со помош на Clampfit (верзија 10.6) за анализа, молекуларни уреди) и прилагодени MATLAB функции (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенцијалот на спојување беше пресметан со помош на JPCalc, а записите беа прилагодени на пресметаниот потенцијал на спојување од -14 mV. Операцијата IV се состои од серија струјни чекори во чекори од 5-10 pA од -50 до 250 pA.
За морфолошка реконструкција на штипнати неврони, во внатрешниот раствор беше додаден 0,2% биоцитин (Sigma-Aldrich). Клетките се подготвуваат најмалку 15 минути по хакирањето. Пипетата потоа полека се влева 1-2 минути додека регистрираната мембрана не се запечати целосно. Следејќи ја физиолошката процедура на секцијата, деловите беа фиксирани преку ноќ на 4°C во 4% PFA, измиени со PBS X3 и разредени 1:1000 со стрептавидин-конјугиран DyLight 549 или DyLight 405 (Vector Labs). Клетките исполнети со биоцитин (2%; Sigma-Aldrich) беа обележани за време на снимањето со сплетка на собна температура во текот на 2 часа. Деловите потоа беа монтирани на микроскопски плочки со помош на Aquamount (Thermo Scientific) и визуелизирани следниот ден на конфокален микроскоп Leica TCS SP8 со помош на објектив со потопување во масло со нумерички отвор ×40 1,3, зголемување ×0,9–1,0, xy. Стапката на земање примероци е приближно 7 пиксели на микрон. Z-стекови во интервали од 1 µm беа добиени сериски, а z-стекови мозаици и Leica-базирани автоматски спојувања беа извршени за да се покрие целото дендритско дрво на секој неврон. Потоа невроните беа следени полурачно со помош на интерфејсот neuTube 40 и беа генерирани SWC датотеки. Датотеките потоа беа прикачени на приклучокот SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, верзија 2.1.0; NIH).
Човечко кортикално ткиво е добиено со информирана согласност според протокол одобрен од Одборот за институционален преглед на Универзитетот Стенфорд. Два примерока од човечко постпартално ткиво (3 и 18 години) се добиени со ресекција на фронталниот кортекс (среден фронтален гирус) како дел од операција за рефракторна епилепсија. По ресекцијата, ткивото е собрано во ледено ладен NMDG-aCSF што содржи: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM гликоза, 2 mM тиоуреа, 5 mM натриум аскорбат, 3 mM натриум пируват, 0,5 mM CaCl2 4H2O и 10 mM MgSO4 7H2O. Титрирајте до pH 7,3-7,4 со концентрирана хлороводородна киселина. Ткивата се доставени во лабораторијата во рок од 30 минути, а короналните пресеци се направени според постапката опишана погоре.
Сите процедури кај животните беа извршени во согласност со упатствата за нега на животни одобрени од APLAC на Универзитетот Стенфорд. Стаорците (повеќе од 140 дена по трансплантацијата) беа индуцирани со 5% изофлуранска анестезија и анестезирани со 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните беа поставени во стереотаксична рамка (Kopf) и поткожно беше инјектиран бупренорфин (SR) со продолжено ослободување. Черепот е изложен, исчистен и се вметнуваат 3-5 коскени завртки. За да се таргетира t-hCO3, генериравме стереотактични координати од МРИ слики. На местото од интерес беше дупчена дупка за брусење и влакната (дијаметар од 400 µm, NA 0,48, дорична) беа спуштени 100 µm под површината на hCO3 и прицврстени на черепот со забен цемент што може да се стврдне со УВ зрачење (Relyx).
Фотометриските снимања со влакна беа извршени како што беше претходно опишано42. За да се забележи спонтаната активност, стаорците беа сместени во чист кафез и оптички кабел со дијаметар од 400 µm (Doric) поврзан со систем за собирање податоци со оптички фотометриски влакна беше поврзан со имплантираниот кабел со оптички влакна. За време на 10-минутното снимање на моторната активност, животните беа слободни да го истражуваат кафезот. За да се забележи предизвиканата активност, стаорците (повеќе од 140 дена по трансплантацијата) беа анестезирани со 5% изофлуран за индукција и 1-3% изофлуран за одржување. Ставете го животното во стереотактичка рамка (Kopf) и мустаќите на спротивната страна од t-hCO3 се скратуваат на околу 2 cm и се пропуштаат низ мрежа поврзана со пиезоелектричен актуатор (PI). Оптички кабел со дијаметар од 400 µm (Doric) беше поврзан со имплантираното влакно и поврзан со системот за собирање податоци. Мустаќите на спротивната страна од t-hCO3 потоа беа отклонети 50 пати (2 mm на 20 Hz, 2 s по презентација) во случајни времиња со пиезоелектричен погон во период на снимање од 20 минути. Користете го пакетот за поддршка Arduino MATLAB за да го контролирате времето на отклонување со прилагоден MATLAB код. Настаните се синхронизираат со софтверот за собирање податоци користејќи импулси со логика на транзистор-транзистор (TTL).
Стаорците (повеќе од 140 дена по трансплантацијата) беа индуцирани со 5% изофлуранска анестезија и анестезирани со 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните беа поставени во стереотаксична рамка (Kopf) и поткожно им беа инјектирани бупренорфин SR и дексаметазон. Черепот се експонира, се чисти и се вметнуваат 3-5 коскени завртки. За да се таргетира t-hCO3, генериравме стереотаксични координати од МРИ слики. Извршена е кружна краниотомија (со дијаметар од приближно 1 cm) со дупчалка со голема брзина директно над трансплантираниот hCO3. Откако коската ќе се тенкира што е можно повеќе, но пред да се дупчи целата коска, се користи форцепс за отстранување на преостанатиот недопрен карличен диск за да се открие основниот t-hCO3. Краниотомијата беше исполнета со стерилен физиолошки раствор, а покривно стакленце и специјална игла за глава беа прикачени на черепот со UV-стврднат дентален цемент (Relyx).
Снимањето со два фотона беше извршено со помош на мултифотонски микроскоп Bruker со објектив Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Снимањето со GCaMP6 беше извршено на 920 nm со 1,4x зголемување во единечна z-рамнина и 8x просек од 7,5 fps. Стаорците беа индуцирани со анестезија со 5% изофлуран и одржувани со 1-3% изофлуран. Стаорците беа поставени во специјално изработена фиксна глава и позиционирани под леќата. Беше добиено 3-минутно снимање на моторната активност во позадина. Во текот на 20 минути снимање, 50 вдишувања (секоја презентација долга 100 ms) беа случајно доставени до перничето спроти t-hCO3 користејќи picospricer. Користете го пакетот за поддршка Arduino MATLAB за да го контролирате времето на пукање со прилагоден MATLAB код. Синхронизирајте ги настаните со софтвер за собирање податоци (PrairieView 5.5) користејќи TTL импулси. За анализа, сликите беа корегирани за xy движење користејќи афина корекција во програмата MoCo лансирана на Фиџи. Екстракција на флуоресцентни траги од поединечни клетки со употреба на CNMF-E43. Флуоресценцијата беше екстрахирана за секој регион од интерес, конвертирана во dF/F криви, а потоа конвертирана во z-оценки.
Стаорците (повеќе од 140 дена по трансплантацијата) беа индуцирани со 5% изофлуранска анестезија и анестезирани со 1-3% изофлуран интраоперативно. Животните беа поставени во стереотаксична рамка (Kopf) и поткожно им беа инјектирани бупренорфин SR и дексаметазон. Мустаќите на спротивната страна од t-hCO3 беа исечени на околу 2 cm и протнати низ мрежа поврзана со пиезоелектричен актуатор. Черепот е изложен и исчистен. Завртка за заземјување од не'рѓосувачки челик е прикачена на черепот. За да го таргетираме t-hCO3, генериравме стереотаксични координати од МРИ слики. Извршете кружна краниотомија (со дијаметар од приближно 1 cm) со дупчалка со голема брзина веднаш над t-hCO3. Откако коската ќе биде што е можно потенка, но пред да ја дупчите целата коска, користете форцепс за да го отстраните преостанатиот недопрен карличен диск за да го откриете основниот t-hCO3. Поединечните клетки беа снимени со помош на 32-канални или 64-канални силиконски сонди со висока густина (Cambridge Neurotech) заземјени на завртки за заземјување и претходно засилени со RHD ​​засилувачи (Intan). Користете го манипулаторот за да ги спуштите електродите до целната локација преку краниотомијата, која е исполнета со стерилен физиолошки раствор. Собирањето податоци беше извршено на фреквенција од 30 kHz со помош на системот за собирање податоци Open Ephys. Снимањето продолжи само кога детектиравме високо корелирана ритмичка спонтана активност во повеќе од 10 канали, што сугерира дека електродите се наоѓаат во графтот (врз основа на податоци за снимање со калциум со два фотони). Добиено е 10-минутно снимање на моторната активност во позадина. Мустаќите на спротивната страна од t-hCO3 потоа беа отклонети 50 пати (2 mm на 20 Hz, 2 s по презентација) во случајни времиња со пиезоелектричен погон во период на снимање од 20 минути. Користејќи го пакетот за поддршка на MATLAB за Arduino (MATLAB 2019b), контролирајте го времето на отклонување со прилагоден MATLAB код. Користете TTL импулси за синхронизирање на настаните со софтвер за собирање податоци.
За експерименти со оптичко обележување, оптички кабел за поврзување од 200 µm (Doric) поврзан со ласер од 473 nm (Omicron) беше поврзан со оптичко влакно од 200 µm поставено над краниотомијата. Непосредно пред ова, прилагодете ја моќноста на џамперот на 20 mW. Користете го манипулаторот за да ги спуштите електродите до целната локација преку краниотомијата, која е исполнета со стерилен физиолошки раствор. На почетокот на снимањето, беа емитирани десет светлосни импулси од 473 nm (фреквенција 2 Hz, времетраење на импулсот 10 ms). Фотосензитивните клетки беа дефинирани како клетки кои покажаа врвен одговор во рок од 10 ms светлина во 70% или повеќе од испитувањата.