Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவுடன் கூடிய உலாவி பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள். சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). கூடுதலாக, தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காட்டுகிறோம்.
ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் கேரோசலைக் காட்டுகிறது. ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் வழியாக நகர்த்த முந்தைய மற்றும் அடுத்த பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும் அல்லது ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளின் வழியாக நகர்த்த இறுதியில் உள்ள ஸ்லைடர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும்.
சுய-அசெம்பிள் நியூரல் ஆர்கனெல்ஸ் மனித வளர்ச்சி மற்றும் நோய்களை மாதிரியாக்குவதற்கான ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய இன் விட்ரோ தளத்தை பிரதிநிதித்துவப்படுத்துகின்றன. இருப்பினும், ஆர்கனாய்டுகள் விவோவில் இருக்கும் இணைப்பைக் கொண்டிருக்கவில்லை, இது முதிர்ச்சியைக் கட்டுப்படுத்துகிறது மற்றும் நடத்தையைக் கட்டுப்படுத்தும் பிற சுற்றுகளுடன் ஒருங்கிணைப்பதைத் தடுக்கிறது. புதிதாகப் பிறந்த குழந்தை நிர்வாண எலிகளின் சோமாடோசென்சரி கார்டெக்ஸில் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட மனித ஸ்டெம் செல்-பெறப்பட்ட கார்டிகல் ஆர்கனாய்டுகள் உணர்ச்சி மற்றும் உந்துதல் தொடர்பான சுற்றுகளில் ஒருங்கிணைக்கும் முதிர்ந்த செல் வகைகளை உருவாக்குகின்றன என்பதை இங்கே காட்டுகிறோம். எம்ஆர்ஐ பல ஸ்டெம் செல் கோடுகள் மற்றும் விலங்குகளில் மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய ஆர்கனாய்டு வளர்ச்சியை வெளிப்படுத்தியது, அதே நேரத்தில் ஒற்றை-மைய பகுப்பாய்வு கார்டிகோஜெனீசிஸின் முன்னேற்றத்தையும் செயல்பாடு சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் திட்டத்தின் தோற்றத்தையும் வெளிப்படுத்தியது. உண்மையில், இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட கார்டிகல் நியூரான்கள் அவற்றின் இன் விட்ரோ சகாக்களை விட மிகவும் சிக்கலான உருவவியல், சினாப்டிக் மற்றும் உள் சவ்வு பண்புகளை வெளிப்படுத்துகின்றன, இது டிமோதிஸ் நோய்க்குறி உள்ள நோயாளிகளில் நரம்பியல் குறைபாடுகளைக் கண்டறிய அனுமதிக்கிறது. இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட ஆர்கனெல்ஸ்கள் தாலமோகார்டிகல் மற்றும் கார்டிகோகார்டிகல் உள்ளீடுகளைப் பெறுகின்றன என்பதை உடற்கூறியல் மற்றும் செயல்பாட்டுத் தடமறிதல் காட்டுகிறது, மேலும் நரம்பியல் செயல்பாட்டின் இன் விவோ பதிவுகள் இந்த உள்ளீடுகள் மனித செல்களில் உணர்ச்சி பதில்களை உருவாக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன. இறுதியாக, கார்டிகல் ஆர்கனாய்டுகள் எலி மூளை முழுவதும் ஆக்சான்களை நீட்டிக்கின்றன, மேலும் அவற்றின் ஆப்டோஜெனடிக் செயல்படுத்தல் வெகுமதி தேடும் நடத்தைக்கு வழிவகுக்கிறது. இவ்வாறு, இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட மனித புறணி நியூரான்கள் முதிர்ச்சியடைந்து நடத்தையைக் கட்டுப்படுத்தும் ஹோஸ்டின் சுற்றுகளில் பங்கேற்கின்றன. இந்த அணுகுமுறை நோயாளி-பெறப்பட்ட செல்களில் உள்ள இழை-நிலை பினோடைப்களைக் கண்டறிவதை எளிதாக்கும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம், அவை பிற வழிகளில் கண்டறிய முடியாது.
வளரும் மனித மூளை என்பது ஒரு குறிப்பிடத்தக்க சுய-ஒழுங்கமைக்கும் செயல்முறையாகும், இதில் செல்கள் பெருகி, வேறுபடுத்தி, இடம்பெயர்ந்து, இணைக்கப்பட்டு செயல்பாட்டு நரம்பியல் சுற்றுகளை உருவாக்குகின்றன, அவை உணர்ச்சி அனுபவத்தின் மூலம் மேலும் சுத்திகரிக்கப்படுகின்றன. மனித மூளை வளர்ச்சியைப் புரிந்துகொள்வதில் ஒரு முக்கிய சிக்கல், குறிப்பாக நோயின் சூழலில், மூளை திசுக்களை அணுக முடியாதது. மனித புறணி ஆர்கனாய்டுகள் (hCO; மனித புறணி கோளம் என்றும் அழைக்கப்படுகிறது) உட்பட சுய-ஒழுங்கமைக்கும் உறுப்புகள் 2,3,4,5,6 ஐ உருவாக்க முடியும். இருப்பினும், பல வரம்புகள் நரம்பியல் சுற்றுகளின் வளர்ச்சி மற்றும் செயல்பாட்டைப் புரிந்துகொள்வதற்கு அவற்றின் பரந்த பயன்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துகின்றன. குறிப்பாக, உயிரியல் சூழலில் சில நுண்ணிய சுற்றுச்சூழல் மற்றும் உணர்ச்சி உள்ளீடுகள் இல்லாததால் hCO முதிர்ச்சி மட்டுப்படுத்தப்படுகிறதா என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை. கூடுதலாக, நடத்தை விளைவுகளை உருவாக்கக்கூடிய சுற்றுகளில் hCOக்கள் ஒருங்கிணைக்கப்படாததால், மரபணு ரீதியாக சிக்கலான மற்றும் நடத்தை சார்ந்த நரம்பியல் மனநல கோளாறுகளை மாதிரியாக்குவதில் அவற்றின் பயன்பாடு தற்போது குறைவாகவே உள்ளது.
hCO-வை அப்படியே வாழும் மூளைக்குள் இடமாற்றம் செய்வது இந்த வரம்புகளை சமாளிக்கும். முந்தைய ஆய்வுகள், கொறிக்கும் புறணிக்குள் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட மனித நியூரான்கள் கொறிக்கும் செல்களுடன் உயிர்வாழவும், திட்டமிடவும், தொடர்பு கொள்ளவும் முடியும் என்பதைக் காட்டுகின்றன7,8,9,10,11,12. இருப்பினும், இந்த சோதனைகள் பொதுவாக வயது வந்த விலங்குகளில் செய்யப்படுகின்றன, இது சினாப்டிக் மற்றும் ஆக்சோனல் ஒருங்கிணைப்பைக் கட்டுப்படுத்தலாம். இங்கே, hiPS செல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட 3D hCO-வை பிளாஸ்டிக் வளர்ச்சியின் ஆரம்ப கட்டத்தில் நோயெதிர்ப்பு குறைபாடுள்ள எலிகளின் முதன்மை சோமாடோசென்சரி கார்டெக்ஸில் (S1) இடமாற்றம் செய்த ஒரு மாற்று முன்னுதாரணத்தை நாங்கள் விவரிக்கிறோம். இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட hCO (t-hCO) நியூரான்கள் கணிசமான முதிர்ச்சிக்கு உட்படுகின்றன, உணர்ச்சி பதில்களைத் தூண்டும் தாலமோகார்டிகல் மற்றும் கார்டிகல்-கார்டிகல் உள்ளீடுகளைப் பெறுகின்றன, மேலும் வெகுமதி தேடும் நடத்தையை இயக்க எலி மூளையில் அச்சு கணிப்புகளை நீட்டிக்கின்றன. t-hCO-வின் நீட்டிக்கப்பட்ட முதிர்ச்சி, மின்னழுத்த-உணர்திறன் L-வகை CaV1.2 கால்சியம் சேனலில் (CACNA1C ஆல் குறியிடப்பட்டது) ஏற்படும் கடுமையான மரபணு கோளாறான டிமோதிஸ் நோய்க்குறி (TS) நோயாளிகளில் நரம்பியல் குறைபாடுகளை வெளிப்படுத்தியுள்ளது.
மனித கார்டிகல் நியூரான்களை சுற்றுகளில் ஆய்வு செய்ய, நாங்கள் ஸ்டீரியோடாக்டிக்காக அப்படியே 3D hCO ஐ ஆரம்பகால பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய அதிமிக் எலிகளின் S1 இல் (பிறப்புக்குப் பிந்தைய 3-7 நாட்கள்) இடமாற்றம் செய்தோம் (படம் 1a மற்றும் படம் 1a-c இன் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு). இந்த கட்டத்தில், தாலமோகார்டிகல் மற்றும் கார்டிகோகார்டிகல் ஆக்சோனல் கணிப்புகள் இன்னும் அவற்றின் S1 கண்டுபிடிப்பை முடிக்கவில்லை (குறிப்பு 13). எனவே, இந்த அணுகுமுறை t-hCO ஒருங்கிணைப்பை அதிகரிக்க வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது, அதே நேரத்தில் எண்டோஜெனஸ் சுற்றுகளில் தாக்கத்தைக் குறைக்கிறது. உயிருள்ள விலங்குகளில் t-hCO இன் இருப்பிடத்தைக் காட்சிப்படுத்த, மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 2-3 மாதங்களுக்குப் பிறகு எலிகளின் T2-எடையுள்ள MRI மூளை மறுகட்டமைப்புகளைச் செய்தோம் (படம் 1b மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு, படம் 1d). t-hCO உடனடியாகக் கவனிக்கப்பட்டது மற்றும் t-hCO இன் கன அளவு அளவீடுகள் நிலையான துண்டுகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டதைப் போலவே இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1d,e; P > 0.05). t-hCO உடனடியாகக் கவனிக்கப்பட்டது மற்றும் t-hCO இன் கன அளவு அளவீடுகள் நிலையான துண்டுகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்டதைப் போலவே இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1d,e; P > 0.05). டி-எச்.சி.ஓ. данные, рис 1d, e> 0,05). t-hCO எளிதாகக் காணப்பட்டது, மேலும் அளவீட்டு t-hCO அளவீடுகள் நிலையான பிரிவுகளுக்கு கணக்கிடப்பட்டதைப் போலவே இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似很容易观察到t-hCO，并且t-hCO டி-எச்.சி.ஓ. данные, рис 1d, e> 0,05). t-hCO எளிதாகக் காணப்பட்டது, மேலும் அளவீட்டு t-hCO அளவீடுகள் நிலையான பிரிவுகளுக்கு கணக்கிடப்பட்டதைப் போலவே இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 1d, e; P > 0.05).மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு சுமார் 2 மாதங்களுக்குப் பிறகு 81% இடமாற்றப்பட்ட விலங்குகளில் t-hCO ஐ நாங்கள் தீர்மானித்தோம் (n = 72 விலங்குகள்; 10 hiPS செல் கோடுகளிலிருந்து hCO; துணை அட்டவணை 1 இல் hiPS செல் கோடுகள்). இவற்றில், 87% பெருமூளைப் புறணியில் அமைந்திருந்தன (படம் 1c). ஒரே இடமாற்றப்பட்ட எலியில் பல நேரப் புள்ளிகளில் தொடர் MRI ஸ்கேன்களைச் செய்வதன் மூலம், 3 மாதங்களுக்குள் t-hCO அளவில் ஒன்பது மடங்கு அதிகரிப்பைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1d மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 1f). இடமாற்றப்பட்ட விலங்குகள் மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 12 மாதங்களில் அதிக உயிர்வாழும் விகிதத்தை (74%) கொண்டிருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 1g மற்றும் துணை அட்டவணை 2), மேலும் வெளிப்படையான மோட்டார் அல்லது நினைவகக் குறைபாடுகள், கிளியோசிஸ் அல்லது எலக்ட்ரோஎன்செபலோகிராம் (EEG) எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை. தரவு படம் 1g மற்றும் துணை அட்டவணை 2). 1h–m மற்றும் 3e).
a, சோதனை வடிவமைப்பின் திட்ட வரைபடம். hiPS செல்களிலிருந்து பெறப்பட்ட hCO, வேறுபாட்டின் 30-60 நாட்களில் புதிதாகப் பிறந்த நிர்வாண எலிகளின் S1 இல் இடமாற்றம் செய்யப்பட்டது. b, மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 2 மாதங்களுக்குப் பிறகு S1 இல் t-hCO ஐக் காட்டும் T2-எடையுள்ள கொரோனல் மற்றும் கிடைமட்ட MRI படங்கள். அளவுகோல் பட்டை, 2 மிமீ. c, ஒவ்வொரு hiPS செல் கோட்டிற்கும் காட்டப்படும் செதுக்கல் வெற்றி விகிதங்களின் அளவு (n = 108, பட்டைகளுக்குள் உள்ள எண்கள் hIPS செல் கோட்டிற்கு t-hCO அளவைக் குறிக்கின்றன) மற்றும் கார்டிகல் அல்லது சப்கார்டிகல் இருப்பிடம் (n = 88). d, கரோனரி தமனியின் MRI படம் (இடது; அளவுகோல் பட்டை, 3 மிமீ) மற்றும் தொடர்புடைய 3D வால்யூமெட்ரிக் மறுகட்டமைப்பு (அளகோல் பட்டை, 3 மிமீ) 3 மாதங்களில் t-hCO இன் அதிகரிப்பைக் காட்டுகிறது. e, எலி பெருமூளைப் புறணியில் t-hCO வடிவங்களின் மதிப்பாய்வு. அளவுகோல் பட்டை, 1 மிமீ. f, t-hCO இன் பிரதிநிதித்துவ இம்யூனோசைட்டோகெமிக்கல் படங்கள் மேலிருந்து இடமிருந்து வலமாக காட்டப்பட்டுள்ளன (வேறுபாட்டின் போது): PPP1R17 (4 மாதங்கள் பழமையானது), NeuN (8 மாதங்கள் பழமையானது), SOX9 மற்றும் GFAP (8 மாதங்கள் பழமையானது), PDGFRα; (8 மாதங்கள்), MAP2 (8 மாதங்கள்) மற்றும் IBA1 (8 மாதங்கள்). அளவுகோல், 20 µm. HNA இன் இணை வெளிப்பாடு மனித தோற்றத்தின் செல்களைக் குறிக்கிறது. g, snRNA-seq: Seurat ஒருங்கிணைப்புக்குப் பிறகு அனைத்து உயர்தர t-hCO கருக்களின் ஒருங்கிணைந்த பன்மடங்கு மற்றும் ப்ரொஜெக்ஷன் (UMAP) பரிமாணக் குறைப்பு இமேஜிங் (n=3 t-hCO மாதிரிகள், n=2 hiPS செல் கோடுகள்). ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகள், ஆஸ்ட்ரோசைட் கோட்டின் செல்கள்; cyc prog, சுற்றும் முன்னோடிகள்; GluN DL, ஆழமான குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள்; GluN DL/SP, ஆழமான மற்றும் சப்லேமெல்லர் குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள்; GluN UL, மேல் அடுக்கு குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள்; ஒலிகோடென்ட்ரோசைட்டுகள், ஒலிகோடென்ட்ரோசைட்டுகள்; OPC, ஒலிகோடென்ட்ரோசைட் முன்னோடி செல்கள்; RELN, ரீலின் நியூரான்கள். h, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட மரபணுக்களின் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) கால செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு (சரிசெய்யப்பட்ட P < 0.05, மடிப்பு மாற்றம் > 2, குறைந்தது 10% கருக்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது). h, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட மரபணுக்களின் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) கால செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு (சரிசெய்யப்பட்ட P < 0.05, மடிப்பு மாற்றம் > 2, குறைந்தது 10% கருக்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது). h, அனாலிஸ் ஓபோகாஷெனியா டெர்மினோவ் ஜீன் ஆன்டாலஜி (GO) க்கு ஜெனோவ் மூலம் பிரபல்யமான ஆக்டிவசி (ஸ்கார்டர், பக், 0,005) இஸ்மெனியா > 2, எக்ஸ்பிரஸ்ஸியா போ க்ரைனி மேரே வி 10% நாடர்) குறிப்பு h, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது குறிப்பிடத்தக்க செயல்படுத்தல் (சரிசெய்யப்பட்ட P<0.05, மடிப்பு மாற்றம் >2, குறைந்தது 10% கருக்களில் வெளிப்பாடு) கொண்ட மரபணுக்களுக்கான மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) கால செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整喕后P，嘍后P 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （ 后 . மேலும்的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, genы значительно ACTIVIZIROvalisь (ஸ்கோர்ரெக்டிரோவன்னி பி <0,05, கிராட்னோஸ்ட் இஸ்மேனிய> 2, எக்ஸ்பிரஸ்கள் 10% yader) ல் Glutamatergicheskih NEIRONAH t-hCO PO ஸ்ராவ்னெனியூ ஸ் க்ளூடமேட்டர்கிசெஸ்கிமி நெய்ரோனமி ஹெச்கோ ஆன்டோ) டெர்மினா கருத்து. h, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது மரபணுக்கள் கணிசமாக மேல்நோக்கி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்டன (சரிசெய்யப்பட்ட P < 0.05, மடிப்பு மாற்றம் > 2, குறைந்தபட்சம் 10% கருக்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்டது). செறிவூட்டல் காலத்தின் ஆன்டாலஜிக்கல் (GO) பகுப்பாய்வு.புள்ளியிடப்பட்ட கோடு 0.05 என்ற aq மதிப்பைக் குறிக்கிறது. i, t-hCO இல் உள்ள GluN செல் வகைகளின் UMAP இமேஜிங், 22 snRNA-seq வயதுவந்த மோட்டார் கார்டெக்ஸ் தரவுத்தொகுப்பிலிருந்து லேபிள் பரிமாற்றத்தைப் பயன்படுத்துகிறது. CT - கார்டிகோதாலமிக் செல்கள், ET - எக்ஸ்ட்ராசெரிபிரல் செல்கள், IT - உள் டெலென்செபாலிக் செல்கள், NP - அருகில் ப்ரொஜெக்ஷன்.
பின்னர் நாங்கள் t-hCO இன் சைட்டோஆர்கிடெக்சர் மற்றும் ஒட்டுமொத்த செல்லுலார் கலவையை மதிப்பிட்டோம். எலி எண்டோடெலியல் செல்களின் ஆன்டிபாடி கறை t-hCO உடன் வாஸ்குலரைசேஷனை வெளிப்படுத்தியது, அதே நேரத்தில் IBA1 கறை படிதல் ஒட்டு முழுவதும் எலி மைக்ரோக்லியா இருப்பதை வெளிப்படுத்தியது (படம் 1f மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 3c,d). இம்யூனோஸ்டைனிங் மனித அணு ஆன்டிஜென் (HNA) நேர்மறை செல்கள் PPP1R17 (கார்டிகல் முன்னோடிகள்), NeuN (நியூரான்கள்), SOX9 மற்றும் GFAP (கிளியல்-பெறப்பட்ட செல்கள்) அல்லது PDGFRα (ஆலிகோடென்ட்ரோசைட் முன்னோடிகள்) ஆகியவற்றை இணைந்து வெளிப்படுத்துவதை வெளிப்படுத்தியது (படம் 1f). ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனில் t-hCO இன் செல்லுலார் கலவையை ஆய்வு செய்ய, தோராயமாக 8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு ஒற்றை-மைய RNA வரிசைமுறையை (snRNA-seq) செய்தோம். எலி கருக்களை மொத்தமாக வடிகட்டுதல் மற்றும் அகற்றுதல் 21,500 உயர்தர மனித மோனோநியூக்ளியர் வரைபடங்களை அளித்தன (படம் 1g மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 4a,b). வழக்கமான செல்-வகை குறிப்பான்களின் வெளிப்பாடு வடிவங்கள், ஆழமான மற்றும் மேலோட்டமான குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள், சுற்றும் முன்னோடிகள், ஒலிகோடென்ட்ரோசைட்டுகள் மற்றும் ஆஸ்ட்ரோசைட் பரம்பரை (படம் 1g, விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 4c, மற்றும் துணை அட்டவணை 3) உள்ளிட்ட முக்கிய கார்டிகல் செல் வகுப்புகளின் கொத்துக்களை அடையாளம் கண்டன. SATB2 மற்றும் CTIP2 க்கான இம்யூனோஸ்டைனிங், கார்டிகல் துணை வகைகள் இருந்தபோதிலும், t-hCO தெளிவான உடற்கூறியல் அடுக்குப்படுத்தலைக் காட்டவில்லை என்பதைக் காட்டியது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 3a). நிலை-பொருந்திய snRNA-seq hCO, ஒலிகோடென்ட்ரோசைட்டுகள் இல்லாதது மற்றும் GABAergic நியூரான்களின் இருப்பு உள்ளிட்ட சில விதிவிலக்குகளுடன், பரந்த அளவில் ஒத்த செல் வகுப்புகளை உருவாக்கியது, இது பக்கவாட்டு முன்னோடி செல்களுக்கு முன்னர் அறிவிக்கப்பட்ட சாதகமான இன் விட்ரோ நிலைமைகளை பிரதிபலிக்கக்கூடும்15 (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 4f - i மற்றும் துணை அட்டவணை 4). வேறுபட்ட மரபணு வெளிப்பாடு பகுப்பாய்வு t-hCO மற்றும் hCO க்கு இடையிலான குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடுகளை வெளிப்படுத்தியது (துணை அட்டவணை 5), இதில் சினாப்டிக் சிக்னலிங், டென்ட்ரிடிக் உள்ளூர்மயமாக்கல் மற்றும் மின்னழுத்த-கேட்டட் சேனல் செயல்பாடு போன்ற நரம்பியல் முதிர்ச்சியுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களின் தொகுப்புகளை செயல்படுத்துதல் அடங்கும் (படம் 1h மற்றும் துணை அட்டவணை 5). அட்டவணை 6). அதன்படி, கார்டிகல் குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் t-hCO நியூரான்கள் துரிதப்படுத்தப்பட்ட டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் முதிர்ச்சியைக் காட்டின.
t-hCO இல் உள்ள இந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் மாற்றங்கள், hCO in vitro மற்றும் t-hCO in vivo இடையேயான உருவவியல் வேறுபாடுகளுடன் தொடர்புடையதா என்பதை தெளிவுபடுத்த, 7-8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு, கடுமையான பிரிவுகளில் நிலை-பொருத்தப்பட்ட பயோசைட்டின் நிரப்பப்பட்ட hCO மற்றும் hCO ஐ மறுகட்டமைத்தோம். hCO நியூரான்கள் (படம் 2a). t-hCO நியூரான்கள் கணிசமாக பெரியதாக இருந்தன, சோமா விட்டத்தை விட 1.5 மடங்கு விட்டம், இரண்டு மடங்கு டென்ட்ரைட்டுகள் மற்றும் இன் விட்ரோ hCO உடன் ஒப்பிடும்போது மொத்த டென்ட்ரைட் நீளத்தில் ஒட்டுமொத்தமாக ஆறு மடங்கு அதிகரிப்பு (படம் 2b). கூடுதலாக, hCO நியூரான்களை விட t-hCO நியூரான்களில் டென்ட்ரைட் முதுகெலும்புகளின் அடர்த்தி கணிசமாக அதிகமாக இருப்பதைக் கண்டோம் (படம் 2c). இது t-hCO நியூரான்கள் விரிவான டென்ட்ரைட் நீட்சி மற்றும் கிளைகளுக்கு உட்படுகின்றன என்பதைக் குறிக்கிறது, இது தொடர்ச்சியான செல் பெருக்கத்துடன் இணைந்து, மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு t-hCO இன் தீவிர வளர்ச்சிக்கு பங்களிக்கக்கூடும் (படம் 1d மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு படம் 1f). இது மின் இயற்பியல் பண்புகளை ஆராய எங்களைத் தூண்டியது. சவ்வு கொள்ளளவு எட்டு மடங்கு அதிகமாக இருந்தது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 8d), ஓய்வு-நிலை சவ்வு திறன் அதிக ஹைப்பர்போலரைஸ் செய்யப்பட்டது (தோராயமாக 20 mV), மற்றும் மின்னோட்ட ஊசி hCO நியூரான்களை விட t-hCO நியூரான்களில் அதிக அதிகபட்ச தூண்டுதல் விகிதத்தைத் தூண்டியது. இன் விட்ரோ (படம் 2d), e), இது t-hCO இன் பெரிய மற்றும் மிகவும் சிக்கலான உருவவியல் அம்சங்களுடன் ஒத்துப்போகிறது. கூடுதலாக, தன்னிச்சையான தூண்டுதல் போஸ்ட்சினாப்டிக் நடப்பு நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண் (EPSC) t-hCO நியூரான்களில் கணிசமாக அதிகமாக இருந்தது (படம் 2f), இது t-hCO நியூரான்களில் காணப்பட்ட டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்புகளின் அதிகரித்த அடர்த்தி செயல்பாட்டு உற்சாகத்துடன் தொடர்புடையது என்பதைக் குறிக்கிறது. பாலியல் ஒத்திசைவு. குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களை (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 6a-c) பதிவு செய்வதன் மூலம் hCO நியூரான்களின் முதிர்ச்சியற்ற தன்மையை விட்ரோவில் உறுதிப்படுத்தினோம்.
a, 8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு பயோசைட்டின் நிரப்பப்பட்ட hCO மற்றும் t-hCO நியூரான்களின் 3D மறுகட்டமைப்பு. b, உருவவியல் அம்சங்களின் அளவு (n = 8 hCO நியூரான்கள், n = 6 t-hCO நியூரான்கள்; **P = 0.0084, *P = 0.0179 மற்றும் ***P < 0.0001). b, உருவவியல் அம்சங்களின் அளவு (n = 8 hCO நியூரான்கள், n = 6 t-hCO நியூரான்கள்; **P = 0.0084, *P = 0.0179 மற்றும் ***P < 0.0001). б, கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஒஷெங்கா மாரிஃபோலோஜிக் ப்ரிஸ்னகோவ் (n = 8 நியூரோனோவ் hCO, n = 6 நியூரோனோவ் t-hCO; ** P = 0, 90 = 80, 0,0 <0,0001). b, உருவவியல் அம்சங்களின் அளவீடு (n=8 hCO நியூரான்கள், n=6 t-hCO நியூரான்கள்; **P=0.0084, *P=0.0179, மற்றும் ***P<0.0001). b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.00179,*P = 0.0179 b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.00179,*P = 0.0179 б, கோலிசெஸ்ட்வென்னாயா ஒஷெங்கா மாரிஃபோலோஜிக் ப்ரிஸ்னகோவ் (n = 8 நியூரோனோவ் hCO, n = 6 நியூரோனோவ் t-hCO; ** P = 0, 90 = 80, 0,0 <0,0001). b, உருவவியல் அம்சங்களின் அளவீடு (n=8 hCO நியூரான்கள், n=6 t-hCO நியூரான்கள்; **P=0.0084, *P=0.0179, மற்றும் ***P<0.0001).c, 8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு hCO மற்றும் t-hCO டென்ட்ரிடிக் கிளைகளின் 3D மறுகட்டமைப்பு. சிவப்பு நட்சத்திரங்கள் உத்தேச டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்புகளைக் குறிக்கின்றன. டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தி அளவீடு (n = 8 hCO நியூரான்கள், n = 6 t-hCO நியூரான்கள்; **P = 0.0092). d, ஓய்வு சவ்வு ஆற்றலின் அளவு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). d, ஓய்வு சவ்வு ஆற்றலின் அளவு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). d, கோலிசெஸ்ட்வென்னயா ஒஷென்கா மெம்ப்ரான்னோகோ பொடென்ஷியலா போகோயா (n = 25 नेयरोनाव hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10). d, ஓய்வு சவ்வு திறன் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, கோலிசெஸ்ட்வென்னயா ஒஷென்கா மெம்ப்ரான்னோகோ பொடென்ஷியலா போகோயா (n = 25 नेयरोनाव hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10). d, ஓய்வு சவ்வு திறன் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). e, hCO மற்றும் t-hCO இல் மின்னோட்ட ஊசிகளை அதிகரிப்பதன் மூலம் தூண்டப்படும் மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் செயல் திறன் துப்பாக்கிச் சூடு, மற்றும் அதிகபட்ச துப்பாக்கிச் சூடு விகிதத்தின் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). e, hCO மற்றும் t-hCO இல் மின்னோட்ட ஊசிகளை அதிகரிப்பதன் மூலம் தூண்டப்படும் மீண்டும் மீண்டும் நிகழும் செயல் திறன் துப்பாக்கிச் சூடு, மற்றும் அதிகபட்ச துப்பாக்கிச் சூடு விகிதத்தின் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). e, POVTORNOE возбуждение потенциала действия в hCO மற்றும் t-hCO, வைஸ்வான்னோ யூவெலிசெனிம் டோகா, மற்றும் கொலிசெஸ் மாக்சிமால்னோய் ஸ்கொரோஸ்டி வோஸ்புட்டெனியா (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, அதிகபட்ச துப்பாக்கிச் சூடு வீதத்தின் மின்னோட்ட அதிகரிப்பு மற்றும் அளவீட்டால் தூண்டப்பட்ட hCO மற்றும் t-hCO இல் செயல் திறன் மறு-சுடுதல் (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; *** P < 0.0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的最大放电率的神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 皖 =2 量神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, POVTORYUSHEESIA வோஸ்புக்டெனி பொட்டென்ஷியாலா டெய்ஸ்ட்வியா hCO மற்றும் t-hCO, வைஸ்வான்னோ யூவெலிசெனிம் போடாக், மற்றும் டோக் оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, அதிகரித்த மின்னோட்ட வழங்கல் மற்றும் அதிகபட்ச துப்பாக்கிச் சூடு வீதத்தின் அளவீடு ஆகியவற்றால் தூண்டப்பட்ட hCO மற்றும் t-hCO செயல் திறன்களின் தொடர்ச்சியான துப்பாக்கிச் சூடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 16 t-hCO நியூரான்கள்; *** P < 0.0001). f, 8 மாத வேறுபாட்டில் hCO மற்றும் t-hCO நியூரான்களில் தன்னிச்சையான EPSCகள் (sEPSCகள்), மற்றும் சினாப்டிக் நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண்ணின் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 17 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). f, 8 மாத வேறுபாட்டில் hCO மற்றும் t-hCO நியூரான்களில் தன்னிச்சையான EPSCகள் (sEPSCகள்), மற்றும் சினாப்டிக் நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண்ணின் அளவீடு (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 17 t-hCO நியூரான்கள்; ***P < 0.0001). f, ஸ்பான்டான்னி இபிஎஸ்சி (எஸ்இபிஎஸ்சி) மற்றும் நெய்ரோனாஹெச்சிஓ மற்றும் டி-எச்சிஓ செரஸ் 8 மேசியாஸ் டிஃபிரேஷன் மற்றும் கொலிசெஸ்ட்வென்ட் ஆப்ஸ் синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, சினாப்டிக் நிகழ்வு விகிதங்களின் வேறுபாடு மற்றும் அளவீட்டின் 8 மாதங்களில் hCO மற்றும் t-hCO நியூரான்களில் தன்னிச்சையான EPSCகள் (sEPSCகள்) (n=25 hCO நியூரான்கள், n=17 t-hCO நியூரான்கள்; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的事件频率的量神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的事件频率的量神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, ஸ்பான்டான்னி இபிஎஸ்சி (எஸ்இபிஎஸ்சி) மற்றும் நெய்ரோனாஹெச்சிஓ மற்றும் டி-எச்சிஓ செரஸ் 8 மேசியாஸ் டிஃபிரேஷன் மற்றும் கொலிசெஸ்ட்வென்ட் ஆப்ஸ் синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, hCO மற்றும் t-hCO நியூரான்களில் தன்னிச்சையான EPSCகள் (sEPSCகள்) 8 மாத சினாப்டிக் நிகழ்வு விகிதங்களின் வேறுபாடு மற்றும் அளவீட்டில் (n = 25 hCO நியூரான்கள், n = 17 t-hCO நியூரான்கள்; *** P<0.0001).bf-க்கு, 1208-2 வரியில் உள்ள hCO மற்றும் t-hCO ஆகியவை இணையாகப் பராமரிக்கப்படும் அதே வேறுபாடு தொகுப்பிலிருந்து எடுக்கப்பட்டன. g, t-hCO இல் கணிசமாக அதிகமாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட (சரிசெய்யப்பட்ட P < 0.05, மடிப்பு மாற்றம் > 2, குறைந்தபட்சம் 10% கருக்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட) மரபணுக்களின் மரபணு தொகுப்பு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு (ஒரு பக்க ஃபிஷரின் சரியான சோதனை) hCO உடன் ஒப்பிடும்போது குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள் ஒரு இன் விவோ மவுஸ் ஆய்வில் இருந்து அடையாளம் காணப்பட்ட ஆரம்ப-பதில் (ERG) மற்றும் தாமத-பதில் (LRG) செயல்பாடு சார்ந்த மரபணுக்களின் மரபணு தொகுப்புகளுடன் மற்றும் இன் விட்ரோ நியூரான்களில் இருந்து மனித-குறிப்பிட்ட LRGகள்17. g, t-hCO இல் கணிசமாக அதிகமாக ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட (சரிசெய்யப்பட்ட P < 0.05, மடிப்பு மாற்றம் > 2, குறைந்தபட்சம் 10% கருக்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட) மரபணுக்களின் மரபணு தொகுப்பு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு (ஒரு பக்க ஃபிஷரின் சரியான சோதனை) hCO உடன் ஒப்பிடும்போது குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள் ஒரு இன் விவோ மவுஸ் ஆய்வில் இருந்து அடையாளம் காணப்பட்ட ஆரம்ப-பதில் (ERG) மற்றும் தாமத-பதில் (LRG) செயல்பாடு சார்ந்த மரபணுக்களின் மரபணு தொகுப்புகளுடன் மற்றும் இன் விட்ரோ நியூரான்களில் இருந்து மனித-குறிப்பிட்ட LRGகள்17. g, அனாலிஸ் ஓபோகாஷெனியா நாபோரா கெனோவ் (ஒட்னோஸ்டோரோன்னி டோச்னி கிரைட்டரி ஃபிஷெரா) ஜெனோவ் சோ சான்சிடெலினோய் ஆக்டோவ் (ஸ்கோர்ரெக்டிரோவன்னி பி <0,05, கிராட்னோஸ்ட் இஸ்மெனியா > 2, எக்ஸ்பிரஸ் போ மெனிஷே மே மாதம் 10% தேதி) t-hCO по сравнению எஸ் க்ளூடமேட்டர்கிசெஸ்கிமி நெய்ரோனமி ஹெச்சிஓ நாபோர்டி ஜெனோவ் காக் ரானெகோ (ஈஆர்ஜி), டாக் மற்றும் போஸ்ட்னெகோ (எல்ஆர்ஜி) ஜெனோவ், சாவிசஸ்கள் Vivo16 இல் மைஷாக் மற்றும் இஸ்லேடோவனியில் உள்ள வழிமுறைகள் g, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் குறிப்பிடத்தக்க செயல்படுத்தல் (சரிசெய்யப்பட்ட P<0.05, மடிப்பு மாற்றம் >2, குறைந்தபட்சம் 10% கருக்களில் வெளிப்பாடு) கொண்ட மரபணுக்களின் மரபணு தொகுப்பு செறிவூட்டல் (ஒரு வால் ஃபிஷரின் சரியான சோதனை) பகுப்பாய்வு. இன் விவோ எலிகள்16 மற்றும் விட்ரோவில் நியூரான்களிலிருந்து மனித-குறிப்பிட்ட LRGகள் ஆகியவற்றில் அடையாளம் காணப்பட்ட ஆரம்ப (ERG) மற்றும் பிந்தைய (LRG) செயல்பாடு சார்ந்த மரபணுக்களின் குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள் தொகுப்புகள் hCO உடன் ஒப்பிடும்போது17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) 和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人RGG g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上2小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 皠 基神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 ஜி. (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, இல்லை மேனி 10% அனாலிஸ் ஓபோகாஷெனிய நாபோரா ஜென்டோவ் டெஸ்ட் ஃபிஷெரா) ரன்னெகோ ஆட்வெட்டா (ஈஆர்ஜி) மற்றும் போஸ்ட்னெகோ ஜெனி, ஆக்டிவ்னோஸ்டி ஒட்வெட்டா (எல்ஆர்ஜி), நடைமுறையில் உள்ள பல்வேறு நடைமுறைகள் மற்றும் நைரோனாக் இன் விட்ரோ17. எல்.ஆர்.ஜி., தொழில்நுட்பம் g, t-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்கள் hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது கணிசமாக உயர்ந்தன (சரிசெய்யப்பட்ட P<0.05, மடிப்பு மாற்றம் >2, குறைந்தது 10% ஆரம்பகால பதில் (ERG) மற்றும் தாமதமான பதில் மரபணு செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு (ஒரு வால் ஃபிஷரின் சரியான சோதனை) பதில் செயல்பாடு சார்ந்த மரபணுக்கள் (LRGs) in vivo mice16 மற்றும் in vitro நியூரான்களில் அடையாளம் காணப்பட்டன.17 மனித குறிப்பிட்ட LRGs.புள்ளியிடப்பட்ட கோடு 0.05 h என்ற போன்ஃபெரோனி-சரிசெய்யப்பட்ட P மதிப்பைக் குறிக்கிறது, T-hCO குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் LRG மரபணுக்களின் snRNA-seq பிரதிகளில் GluN மரபணு வெளிப்பாடு (ஒவ்வொரு மரபணுவின் போலி-தொகுப்பு மற்றும் அளவிடுதல்) கணிசமாக உயர்ந்தது. i, t-hCO (மேல்) மற்றும் hCO (கீழ்) நியூரான்களில் SCG2 வெளிப்பாட்டைக் காட்டும் இம்யூனோஸ்டைனிங். வெள்ளை அம்புகள் SCG2+ செல்களைக் குறிக்கின்றன. அளவுகோல் பட்டை, 25 µm. தரவு சராசரி ± நிலையான விலகலாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.
எக்ஸ் விவோ துண்டுகளில் காணப்பட்ட t-hCO இன் அதிகரித்த செயல்பாட்டின் அடிப்படையில், snRNA-seq, hCO இன் விட்ரோவுடன் ஒப்பிடும்போது t-hCO இல் மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்டுகளின் செயல்பாடு சார்ந்த மேல்நோக்கிய ஒழுங்குமுறையை வெளிப்படுத்தியது. குளுட்டமேட்டர்ஜிக் t-hCO நியூரான்கள் தாமதமான மறுமொழி செயல்பாட்டை ஒழுங்குபடுத்தும் அதிக அளவிலான மரபணுக்களை வெளிப்படுத்தின (படம். 2g,h), அவை எலி மற்றும் மனித நியூரான்களில் முந்தைய ஆய்வுகளில் காணப்பட்டன16,17. எடுத்துக்காட்டாக, BDNF18, SCG2, மற்றும் OSTN, ஒரு பிரைமேட்-குறிப்பிட்ட செயல்பாடு-ஒழுங்குபடுத்தும் மரபணு, hCO நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது t-hCO நியூரான்களில் அதிகரித்த வெளிப்பாட்டைக் காட்டியது (படம். 2g-i). இதனால், t-hCO நியூரான்கள் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல், உருவவியல் மற்றும் செயல்பாட்டு பகுப்பாய்வுகள் மூலம் hCO நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது மேம்பட்ட முதிர்வு பண்புகளை வெளிப்படுத்தின.
மனித மூளை வளர்ச்சியுடன் t-hCO முதிர்ச்சியின் தொடர்பை மேலும் மதிப்பிடுவதற்கு, கரு மற்றும் வயதுவந்த புறணி செல் வகைகள் 19,20 மற்றும் வயதுவந்தோர் 21,22 ஆகியவற்றின் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் ஒப்பீடுகளையும், வளர்ச்சியின் போது புறணி மரபணு வெளிப்பாடு 23 பற்றிய விரிவான தரவுகளையும் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 5) செய்தோம். முந்தைய பணி 24 உடன், 7-8 மாத வேறுபாட்டில் உலகளாவிய hCO மற்றும் t-hCO டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் முதிர்வு நிலை, இன் விவோ வளர்ச்சி நேரத்துடன் பரவலாக ஒத்துப்போகிறது மற்றும் தாமதமான கரு வாழ்க்கைக்கு மிகவும் சமமானது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 5a). குறிப்பாக, வயதுக்கு ஏற்ற hCO உடன் ஒப்பிடும்போது t-hCO இல் அதிகரித்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் முதிர்ச்சியையும், சினாப்டோஜெனீசிஸ், ஆஸ்ட்ரோஜெனீசிஸ் மற்றும் மைலினேஷன் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 5b-d) உடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் செயல்படுத்தலையும் நாங்கள் கவனித்தோம். செல்லுலார் மட்டத்தில், t-hCO இல் மெல்லிய புறணி துணை வகையின் ஆதாரங்களைக் கண்டறிந்தோம், குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களின் கொத்துகள் வயதுவந்த L2/3, L5 மற்றும் L6 நியூரான் துணை வகைகளுடன் ஒன்றுடன் ஒன்று சேர்கின்றன (படம் 1i). இதற்கு நேர்மாறாக, கர்ப்பத்தின் நடுப்பகுதியில் குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் t-hCO நியூரான்களுக்கும் கரு கார்டிகல் நியூரான்களுக்கும் இடையிலான கொத்து ஒன்றுடன் ஒன்று மிகவும் குறைவாகவே இருந்தது (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 5e-j). t-hCO நியூரான்கள் மனித பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய நியோகார்டிகல் நியூரான்களுடன் செயல்பாட்டு ரீதியாக ஒத்திருக்கிறதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, மனித பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய புறணியின் கூர்மையான பிரிவுகளில் மனித L2/3 பிரமிடு நியூரான்களின் மின் இயற்பியல் பதிவுகள் மற்றும் உடற்கூறியல் மறுகட்டமைப்புகளைச் செய்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 7a). L2/3 பிரமிடு நியூரான்களின் மின் இயற்பியல் பண்புகள் t-hCO பிரமிடு நியூரான்களைப் போலவே இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 7e). உருவவியல் ரீதியாக, பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய மனித மாதிரிகளிலிருந்து L2/3 நியூரான்கள் hCO ஐ விட t-hCO உடன் ஒத்திருந்தன, இருப்பினும் L2/3 செல்கள் நீளமாக இருந்தன, ஒட்டுமொத்தமாக அதிக கிளைகளைக் கொண்டிருந்தன, மேலும் அதிக முதுகெலும்பு அடர்த்தியைக் கொண்டிருந்தன (படம் 3g மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 7b-). G).
a, கட்டுப்பாடு மற்றும் TS hiPS செல் கோடுகளால் உற்பத்தி செய்யப்படும் hCO ஐ புதிதாகப் பிறந்த எலிகளுக்குள் இடமாற்றம் செய்தல். b, 8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு பயோசைட்டின் நிரப்பப்பட்ட t-hCO நியூரான்களின் 3D மறுகட்டமைப்பு. c, சராசரி டென்ட்ரிடிக் நீளத்தின் அளவீடு (n = 19 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n = 21 TS நியூரான்கள்; **P = 0.0041). d, 8 மாத வேறுபாட்டில் கட்டுப்பாடு மற்றும் TS t-hCO இலிருந்து 3D- மறுகட்டமைக்கப்பட்ட டென்ட்ரிடிக் கிளைகள், மற்றும் டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தியின் அளவீடு (n = 16 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n = 21 TS நியூரான்கள், ***P < 0.0001). d, 8 மாத வேறுபாட்டில் கட்டுப்பாடு மற்றும் TS t-hCO இலிருந்து 3D- மறுகட்டமைக்கப்பட்ட டென்ட்ரிடிக் கிளைகள், மற்றும் டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தியின் அளவீடு (n = 16 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n = 21 TS நியூரான்கள், ***P < 0.0001). d, 3D-ரெகான்ஸ்ட்ரூக்ஷியா டெண்ட்ரிட்னிக்ஸ் வெட்வேய்ஸ் காண்ட்ரோலியா மற்றும் டிஎஸ் டி-எச்சிஓ செரஸ் 8 மேசியாஸ் டிஃபிரென்சிரோவ்கிங் ஓசென்கா ப்ளோட்னோஸ்டி டெண்ட்ரிட்னிக் ஷிபோவ் (n = 16 CONTROLINYH NEIRONOV, n = 21 TS நியூரோனோவ், *** P <0,0001). d, 8 மாத வேறுபாடு மற்றும் டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தி அளவீட்டில் (n=16 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n=21 TS நியூரான்கள், ***P<0.0001) கட்டுப்பாடு மற்றும் t-hCO TS இலிருந்து டென்ட்ரிடிக் கிளைகளின் 3D மறுகட்டமைப்பு. d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n =个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密匦 = 16 量神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）。 d, 3D-ரெகான்ஸ்ட்ரூக்ஷியா டெண்ட்ரிட்னிக் வெட்வே கான்ட்ரோலியா மற்றும் டிஎஸ் டி-எச்சிஓ செரஸ் 8 மேசியாஸ்வேவ் டிஃப்ஃபெரென்சிரோவ்கி மற்றும் плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 மாத வேறுபாடு மற்றும் டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்பு அடர்த்தி அளவீட்டில் கட்டுப்பாட்டு டென்ட்ரிடிக் கிளைகள் மற்றும் TS t-hCO இன் 3D மறுகட்டமைப்பு (n=16 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n=21 TS நியூரான்கள், ***P<0.0001).சிவப்பு நட்சத்திரக் குறிகள் தோராயமான டென்ட்ரிடிக் முதுகெலும்புகளைக் குறிக்கின்றன. e, கட்டுப்பாட்டில் உள்ள தன்னிச்சையான EPSCகள் மற்றும் 8 மாத வேறுபாட்டிற்குப் பிறகு TS t-hCO நியூரான்கள். f, சினாப்டிக் நிகழ்வுகளின் அதிர்வெண் மற்றும் வீச்சின் ஒட்டுமொத்த அதிர்வெண் வரைபடம் மற்றும் அளவீடு (n=32 கட்டுப்பாட்டு நியூரான்கள், n=26 TS நியூரான்கள்; **P=0.0076 மற்றும் P=0.8102). g, hCO மற்றும் t-hCO இல் TS மற்றும் கட்டுப்பாட்டு நியூரான்களின் Scholl பகுப்பாய்வு. கோடு கோடுகள் ஒப்பிடுவதற்கு மனித L2/3 பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய பிரமிடு நியூரான்களைக் காட்டுகின்றன (n = 24 கட்டுப்பாட்டு t-hCO நியூரான்கள், n = 21 TS t-hCO நியூரான்கள், n = 8 கட்டுப்பாட்டு hCO நியூரான்கள் மற்றும் n = 7 TS hCO நியூரான்கள்). தரவு சராசரி ± நிலையான விலகலாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.
மனித புறணி நியூரான்களின் உருவவியல் மற்றும் செயல்பாட்டு அம்சங்களை உயர் மட்டத்தில் பிரதிபலிக்கும் t-hCO இன் திறன், நோய் பினோடைப்களைக் கண்டறிய t-hCO ஐப் பயன்படுத்த முடியுமா என்பதை ஆராய எங்களைத் தூண்டியது. CaV1.2 ஐ குறியாக்கம் செய்யும் மரபணுவில் செயல்பாட்டின் ஆதாய பிறழ்வுகளால் ஏற்படும் கடுமையான நரம்பியல் வளர்ச்சிக் கோளாறான TS இல் நாங்கள் கவனம் செலுத்தினோம், இது நியூரான்களில் செயல்பாடு சார்ந்த மரபணு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைத் தொடங்குகிறது. மிகவும் பொதுவான மாற்று (p.G406R) மற்றும் மூன்று கட்டுப்பாடுகளைக் கொண்ட மூன்று TS நோயாளிகளிடமிருந்து hCO ஐப் பெற்றோம் (படம் 3a). மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு, கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது TS நியூரான்களில் டென்ட்ரிடிக் உருவவியல் மாற்றப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3b மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 8a,b), முதன்மை டென்ட்ரிடிக் நீளத்தில் இரு மடங்கு அதிகரிப்பு மற்றும் சராசரி மற்றும் ஒட்டுமொத்த குறைவு (படம் 3c மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு, படம் 8c). இது கட்டுப்பாட்டு நியூரான்களுடன் ஒப்பிடும்போது TS இல் முதுகெலும்புகளின் அதிகரித்த அடர்த்தி மற்றும் தன்னிச்சையான EPSC களின் அதிகரித்த அதிர்வெண் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையது (படம். 3d–f மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம். 8g). மேலும் பகுப்பாய்வு, கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது t-hCO TS இல் அசாதாரண டென்ட்ரிடிக் கிளைகளின் வடிவங்களை வெளிப்படுத்தியது, ஆனால் இதேபோன்ற வேறுபாட்டின் கட்டத்தில் TS hCO இல் அல்ல (படம். 3g). இது TS இல் செயல்பாடு சார்ந்த டென்ட்ரிடிக் சுருக்கம் பற்றிய எங்கள் முந்தைய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போகிறது மற்றும் இந்த மாற்று தளத்தின் உயிருள்ள நோய் பினோடைப்களைக் கண்டறியும் திறனை எடுத்துக்காட்டுகிறது.
பின்னர் t-hCO செல்கள் எலி S1 இல் எந்த அளவிற்கு செயல்பாட்டு ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டுள்ளன என்று கேட்டோம். கொறித்துண்ணிகளில் உள்ள S1, ஐப்சிலேட்டரல் வென்ட்ரல் பாசல் மற்றும் போஸ்டீரியர் தாலமிக் கருக்கள், அதே போல் ஐப்சிலேட்டரல் மோட்டார் மற்றும் செகண்டரி சோமாடோசென்சரி கார்டிசஸ் மற்றும் கான்ட்ராலேட்டரல் S1 (படம் 4a) ஆகியவற்றிலிருந்து வலுவான சினாப்டிக் உள்ளீடுகளைப் பெறுகிறது. இன்னர்வேஷன் பேட்டர்னை மீட்டெடுக்க, hCO ஐ ரேபிஸ் வைரஸ்-dG-GFP/AAV-G மூலம் பாதித்து, 3 நாட்களுக்குப் பிறகு S1 எலியில் hCO ஐ இடமாற்றம் செய்தோம். மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 7-14 நாட்களுக்குப் பிறகு ஐப்சிலேட்டரல் S1 மற்றும் வென்ட்ரல் பாசல் கேங்க்லியாவின் நியூரான்களில் அடர்த்தியான GFP வெளிப்பாட்டைக் கவனித்தோம் (படம் 4b, c). கூடுதலாக, தாலமிக் மார்க்கர் நெட்ரின் G1 இன் ஆன்டிபாடி கறை t-hCO இல் தாலமிக் முடிவுகளின் இருப்பை வெளிப்படுத்தியது (படம் 4d, e). இந்த இணைப்புத் திட்டங்கள் t-hCO செல்களில் சினாப்டிக் பதில்களைத் தூண்ட முடியுமா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, தாலமோகார்டிகல் அடுக்கின் கூர்மையான பிரிவுகளில் மனித செல்களிலிருந்து முழு செல் பதிவுகளையும் செய்தோம். AMPA ஏற்பி எதிரியான NBQX க்கு வெளிப்படும் t-hCO நியூரான்களில் t-hCO தூண்டப்பட்ட குறுகிய-தாமத EPSC களில் எலி S1, உள் காப்ஸ்யூல், வெள்ளைப் பொருள், t-hCO அருகிலுள்ள இழைகள் அல்லது ஆப்சின்-வெளிப்படுத்தும் தாலமிக் முடிவுகளின் ஆப்டோஜெனடிக் செயல்படுத்தல் ஆகியவற்றின் மின் தூண்டுதல். (படம் 4f, g மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு, படம் 9a-g). இந்தத் தரவுகள் t-hCO எலி மூளையில் உடற்கூறியல் ரீதியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டுள்ளது மற்றும் எலி ஹோஸ்ட் திசுக்களால் செயல்படுத்தப்பட முடியும் என்பதை நிரூபிக்கின்றன.
a, ரேபிஸ் கண்காணிப்பு பரிசோதனையின் திட்ட வரைபடம். b, t-hCO மற்றும் எலி பெருமூளைப் புறணிக்கு இடையேயான GFP மற்றும் மனித-குறிப்பிட்ட STEM121 வெளிப்பாடு (மேல் குழு). எலியின் இருபக்க வென்ட்ரல் அடித்தள கரு (VB) (கீழ் இடது) மற்றும் இருபக்க S1 (கீழ் வலது) ஆகியவற்றில் GFP வெளிப்பாடும் காட்டப்பட்டுள்ளது. அளவுகோல் பட்டை, 50 µm. சிவப்பு சதுரங்கள் படங்கள் எடுக்கப்பட்ட மூளையின் பகுதிகளைக் குறிக்கின்றன. c, GFP (n = 4 எலிகள்) வெளிப்படுத்தும் செல்களின் அளவு. d, e - t-hCO இல் நெட்ரின் G1+ தாலமிக் முனையங்கள். d என்பது t-hCO மற்றும் VB கருக்களைக் கொண்ட ஒரு கொரோனல் பகுதியைக் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை, 2 மிமீ. e என்பது t-hCO (இடது) மற்றும் VB (வலது) நியூரான்களில் நெட்ரின் G1 மற்றும் STEM121 வெளிப்பாட்டைக் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை, 50 µm. ஆரஞ்சு புள்ளியிடப்பட்ட கோடு t-hCO எல்லையைக் குறிக்கிறது. f, g, S1 எலி (f) அல்லது உள் காப்ஸ்யூல் (g) இல் மின் தூண்டுதலுக்குப் பிறகு t-hCO நியூரான்களின் தற்போதைய தடயங்கள், (ஊதா) அல்லது இல்லாமல் (கருப்பு) NBQX (இடது). NBQX உடன் மற்றும் இல்லாமல் EPSC வீச்சுகள் (n = 6 S1 நியூரான்கள், *P = 0.0119; மற்றும் n = 6 உள் காப்ஸ்யூல் நியூரான்கள், **P = 0.0022) (மையம்). எலி S1 (f) அல்லது உள் காப்ஸ்யூல் (g) (வலது) மின் தூண்டுதலுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக EPSC ஐக் காட்டும் t-hCO நியூரான்களின் சதவீதம். aCSF, செயற்கை செரிப்ரோஸ்பைனல் திரவம். h, 2P இமேஜிங் பரிசோதனையின் திட்ட வரைபடம் (இடது). t-hCO (நடுத்தரம்) இல் GCaMP6 களின் வெளிப்பாடு. அளவுகோல் பட்டை, 100 µm. GCaMP6 களின் ஃப்ளோரசன்ஸ் நேர இழப்பு (வலது). i, தன்னிச்சையான செயல்பாட்டு ஃப்ளோரசன்ஸின் Z-ஸ்கோர். j, மீசை தூண்டுதலின் திட்ட விளக்கப்படம். k, ஒரு சோதனையில் z-மதிப்பெண் பெற்ற 2P ஒளிர்வுப் பாதைகள், எடுத்துக்காட்டு செல்களில் நேர பூஜ்ஜியத்தில் (கோடு கோடு) மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது. l, அனைத்து செல்களின் மக்கள்தொகை-சராசரி z-மதிப்பெண் பதில்கள், நேர பூஜ்ஜியத்தில் (கோடு கோடு) மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது (சிவப்பு) அல்லது சீரற்ற முறையில் உருவாக்கப்பட்ட நேர முத்திரைகள் (சாம்பல்). m. ஆப்டிகல் மார்க்கிங் குறித்த பரிசோதனையின் திட்ட வரைபடம். n, நீல லேசர் தூண்டுதல் அல்லது மீசை விலகலின் போது ஒரு எடுத்துக்காட்டு t-hCO கலத்திலிருந்து மூல மின்னழுத்த வளைவுகள். சிவப்பு அம்புகள் ஒளியால் (மேல்) அல்லது மீசை விலகலால் (கீழே) ஏற்படும் முதல் கூர்முனைகளைக் குறிக்கின்றன. சாம்பல் நிற நிழல் மீசை விலகலின் காலங்களைக் குறிக்கிறது. o, உச்ச ஒளி அலைவடிவங்கள் மற்றும் மீசை விலகல் பதில்கள். p, ஒற்றை முயற்சியின் கூர்முனைகள், எடுத்துக்காட்டின் செல்களில் மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது. 0 மீசை விலகலைக் குறிக்கிறது (கோடு கோடு) மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது (சிவப்பு) மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது (சிவப்பு) மீசை விலகலுடன் சீரமைக்கப்பட்டது அல்லது சீரற்ற முறையில் உருவாக்கப்பட்ட நேர முத்திரைகள் (சாம்பல்). r, மீசை விலகலால் கணிசமாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஒளி உணர்திறன் அலகுகளின் விகிதம் (n = 3 எலிகள்) (இடது). உச்ச z-ஸ்கோர் தாமதம் (n = 3 எலிகள்; n = 5 (வெளிர் பச்சை), n = 4 (அடர் பச்சை), மற்றும் n = 4 (சியான்) மீசை விலகல் பண்பேற்றம் அலகுகள் ஒரு எலிக்கு) (வலது). தரவு சராசரி ± நிலையான விலகலாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.
பின்னர் t-hCO ஐ இன் விவோவில் உணர்ச்சி தூண்டுதல்களால் செயல்படுத்த முடியுமா என்று கேட்டோம். மரபணு ரீதியாக குறியிடப்பட்ட கால்சியம் குறிகாட்டிகளான GCaMP6 ஐ வெளிப்படுத்தும் hCO ஐ S1 எலிகளுக்கு இடமாற்றம் செய்தோம். 150 நாட்களுக்குப் பிறகு, ஃபைபர் ஃபோட்டோமெட்ரி அல்லது இரண்டு-ஃபோட்டான் கால்சியம் இமேஜிங் செய்தோம் (படம் 4h மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10a). t-hCO செல்கள் ஒத்திசைக்கப்பட்ட தாள செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்தியதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 4i, விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10b மற்றும் துணை வீடியோ 1). உச்ச t-hCO செயல்பாட்டை வகைப்படுத்த, மயக்க மருந்து செய்யப்பட்ட மாற்று எலிகளில் புற-செல்லுலார் மின் இயற்பியல் பதிவுகளைச் செய்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10c-f). MRI படங்களிலிருந்து ஸ்டீரியோடாக்சிக் ஆயத்தொலைவுகளை நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம்; எனவே, இந்த பதிவு செய்யப்பட்ட அலகுகள் மனித நியூரான்களைக் குறிக்கின்றன, இருப்பினும் மின் இயற்பியல் மட்டும் ஒரு இனத்தின் தோற்றத்தை தீர்மானிக்க அனுமதிக்காது. ஒத்திசைக்கப்பட்ட செயல்பாட்டின் வெடிப்புகளை நாங்கள் கவனித்தோம் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10d). வெடிப்புகள் சுமார் 460 எம்எஸ் வரை நீடித்தன, மேலும் சுமார் 2 வினாடிகள் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10d, e) அமைதி காலங்களால் பிரிக்கப்பட்டன. தனிப்பட்ட அலகுகள் ஒரு வெடிப்புக்கு சராசரியாக மூன்று சுற்றுகள் சுட்டன, இது ஒரு வெடிப்புக்கு பதிவுசெய்யப்பட்ட அலகுகளில் தோராயமாக 73% ஆகும். தனிப்பட்ட அலகுகளின் செயல்பாடுகள் மிகவும் தொடர்புடையவை, மேலும் இந்த தொடர்புகள் அதே நிலைமைகளின் கீழ் பதிவுசெய்யப்பட்ட தடுப்பூசி போடப்படாத விலங்குகளில் அடையாளம் காணப்பட்ட அலகுகளை விட அதிகமாக இருந்தன (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10f). அடையாளம் காணப்பட்ட மனித-பெறப்பட்ட நியூரான்களின் ஸ்பைக் பதில்களை மேலும் வகைப்படுத்த, hCO உடன் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட மயக்க மருந்து செய்யப்பட்ட எலிகள் மீது ஒளி-குறியிடும் சோதனைகளை மேற்கொண்டோம், இது ஒளி-உணர்திறன் கொண்ட கேஷன் சேனல் ரோடாப்சின் 2 (hChR2) ஐ வெளிப்படுத்துகிறது, இதன் மூலம் t-hCO நியூரான்கள் நீல ஒளி தூண்டுதல்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக குறுகிய-தாமத அங்கீகாரம் (10 எம்எஸ்-க்கும் குறைவாக) (படம் 4m–o). t-hCO நியூரான்கள் கால்சியம் இமேஜிங்கில் காணப்பட்டதைப் போன்ற அதிர்வெண்களில் தன்னிச்சையான செயல்பாட்டின் வெடிப்புகளைக் காட்டின, அதே போல் ஒளி குறியிடல் இல்லாத நிலையில் t-hCO இல் நிகழ்த்தப்பட்ட மின் இயற்பியல் பதிவுகளும் (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10c-g). இன் விட்ரோவில் பதிவுசெய்யப்பட்ட hCO இன் தொடர்புடைய நிலைகளில் எந்த தன்னிச்சையான செயல்பாடும் காணப்படவில்லை. உணர்ச்சி தூண்டுதல்களால் t-hCO ஐ செயல்படுத்த முடியுமா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, எலி மீசைகளை t-hCO இலிருந்து சுருக்கமாகத் திருப்பிவிட்டோம் (படம் 4j,m மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10h,k). முந்தைய ஆய்வுகளின்படி 8,10, t-hCO செல்களின் துணைக்குழு விஸ்கர் விலகலுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக அதிகரித்த செயல்பாட்டைக் காட்டியது, இது தரவை சீரற்ற நேர முத்திரைகளுடன் ஒப்பிடும்போது கவனிக்கப்படவில்லை (படம் 4k-q மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு, படம் 10h-q). உண்மையில், ஆப்டோ-லேபிளிடப்பட்ட ஒற்றை அலகுகளில் சுமார் 54% விஸ்கர் தூண்டுதலுக்குப் பிறகு கணிசமாக அதிகரித்த தூண்டுதல் விகிதத்தைக் காட்டியது, சுமார் 650 ms இல் உச்சத்தை எட்டியது (படம் 4r). ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்தத் தரவுகள் t-hCO பொருத்தமான செயல்பாட்டு உள்ளீடுகளைப் பெறுகிறது மற்றும் சுற்றுச்சூழல் தூண்டுதல்களால் செயல்படுத்தப்படலாம் என்பதைக் குறிக்கிறது.
பின்னர் t-hCO எலிகளின் நடத்தையைக் கட்டுப்படுத்த சுற்றுகளைச் செயல்படுத்த முடியுமா என்பதை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம். t-hCO நியூரான்களின் அச்சுகள் எலியின் சுற்றியுள்ள திசுக்களில் புகுத்தப்படுகிறதா என்பதை நாங்கள் முதலில் ஆராய்ந்தோம். EYFP (hChR2-EYFP) உடன் இணைக்கப்பட்ட hChR2 ஐ குறியாக்கம் செய்யும் லென்டிவைரஸ் மூலம் hCO ஐப் பாதித்தோம். 110 நாட்களுக்குப் பிறகு, செவிப்புலன், மோட்டார் மற்றும் சோமாடோசென்சரி கோர்டிசஸ் உள்ளிட்ட ஐபிசிலேட்டரல் கார்டிகல் பகுதிகளிலும், ஸ்ட்ரைட்டம், ஹிப்போகாம்பஸ் மற்றும் தாலமஸ் உள்ளிட்ட துணைப் பகுதிகளிலும் EYFP வெளிப்பாட்டைக் கவனித்தோம் (படம் 5a). இந்த எஃபெரென்ட் ப்ரொஜெக்ஷன்கள் எலி செல்களில் சினாப்டிக் பதில்களைத் தூண்ட முடியுமா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, கூர்மையான மூளைப் பிரிவுகளில் எலி பெருமூளைப் புறணி செல்களைப் பதிவு செய்வதன் மூலம் hChR2-EYFP ஐ வெளிப்படுத்தும் t-hCO செல்களை ஒளியியல் ரீதியாக செயல்படுத்தினோம். NBQX ஆல் தடுக்கப்பட்ட எலி பிரமிடு கோர்டெக்ஸ் நியூரான்களில் நீல ஒளியால் தூண்டப்பட்ட குறுகிய-தாமத EPSC களுடன் t-hCO ஆக்சான்களை செயல்படுத்துதல் (படங்கள் 5b-g). கூடுதலாக, இந்த பதில்களை டெட்ரோடோடாக்சின் (TTX) தடுக்கலாம் மற்றும் 4-அமினோபிரிடின் (4-AP) மூலம் மீட்டெடுக்கலாம், அவை மோனோசினாப்டிக் இணைப்புகளால் ஏற்பட்டதாகக் கூறுகின்றன (படம் 5e).
a, ஆக்சன் கண்காணிப்பின் திட்ட வரைபடம் (இடது). t-hCO EYFP வெளிப்பாடு (வலது). அளவுகோல் பட்டை, 100 µm. A1, செவிப்புலப் புறணி, ACC, முன்புற சிங்குலேட் புறணி, d. ஸ்ட்ரைட்டம், டார்சல் ஸ்ட்ரைட்டம், HPC, ஹிப்போகாம்பஸ்; டயாபிராம், பக்கவாட்டு செப்டம், mPFC, மீடியல் ப்ரீஃப்ரன்டல் கோர்டெக்ஸ், பிரி, பைரிஃபார்ம் கார்டெக்ஸ், v. ஸ்ட்ரைட்டம், வென்ட்ரல் ஸ்ட்ரைட்டம், VPM, தாலமஸின் வென்ட்ரோபோஸ்டோமீடியல் நியூக்ளியஸ், VTA, வென்ட்ரல் டெக்மென்டல் பகுதி. சிவப்பு சதுரங்கள் படங்கள் எடுக்கப்பட்ட மூளையின் பகுதிகளைக் குறிக்கின்றன. b, தூண்டுதல் பரிசோதனையின் திட்ட வரைபடம். c, d, மனித (c) EYFP+ t-hCO அல்லது எலி (d) EYFP- செல்களில் நீல ஒளியால் தூண்டப்பட்ட ஒளி மின்னோட்டம் (மேல்) மற்றும் மின்னழுத்தம் (கீழ்) ஆகியவற்றின் பதிலின் எடுத்துக்காட்டுகள். e, f, TTX மற்றும் 4-AR (பச்சை), TTX (சாம்பல்) அல்லது aCSF (கருப்பு) (e), (ஊதா) அல்லது இல்லாமல் (கருப்பு) ) ) NBQX (e) உடன் t-hCO ஆக்சான்களின் நீல ஒளி தூண்டுதலுக்குப் பிறகு எலி நியூரான்களின் தற்போதைய தடயங்கள். g, எலி செல்களில் நீல ஒளியால் தூண்டப்படும் பதில்களின் தாமதம் (n = 16 செல்கள்); கிடைமட்ட பார்கள் சராசரி தாமதத்தைக் குறிக்கின்றன (7.13 ms) (இடது). NBQX (n = 7 செல்கள்; ***P < 0.0001) (நடுவில்) உடன் அல்லது இல்லாமல் பதிவுசெய்யப்பட்ட ஒளி-தூண்டப்பட்ட EPSCகளின் வீச்சு. NBQX (n = 7 செல்கள்; ***P < 0.0001) (நடுவில்) உடன் அல்லது இல்லாமல் பதிவுசெய்யப்பட்ட ஒளி-தூண்டப்பட்ட EPSCகளின் வீச்சு. அம்ப்ளிடுடா வைஸ்வான்ஸ் ஸ்வெடோம் இபிஎஸ்சி, ஜாரேகிஸ்ட்ரிரோவண்னிஹஸ் அல்லது பெஸ் என்பிகியூஎக்ஸ் (n = 7 கிளெடோக்; ***பி <0,0001) (வ.). NBQX உடன் அல்லது இல்லாமல் பதிவுசெய்யப்பட்ட ஒளி தூண்டப்பட்ட EPSCகளின் வீச்சு (n = 7 செல்கள்; ***P < 0.0001) (மையம்).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中 அம்ப்ளிடுடா வைஸ்வான்ஸ் ஸ்வெடோம் இபிஎஸ்சி, ஜாரேகிஸ்ட்ரிரோவண்னிஹஸ் அல்லது பெஸ் என்பிகியூஎக்ஸ் (n = 7 கிளெடோக்; ***பி <0,0001) (வ.). NBQX உடன் அல்லது இல்லாமல் பதிவுசெய்யப்பட்ட ஒளி தூண்டப்பட்ட EPSCகளின் வீச்சு (n = 7 செல்கள்; ***P < 0.0001) (மையம்).நீல ஒளிக்கு பதிலளிக்கும் EPSC களைக் காட்டும் எலி செல்களின் சதவீதம் (வலது). h, ஒரு நடத்தைப் பணியின் திட்ட வரைபடம். d0, நாள் 0. i. பயிற்சியின் 1 ஆம் நாள் (இடது) அல்லது 15 ஆம் நாள் (வலது) முன்மாதிரியான விலங்குகளின் செயல்திறன். நாள் 1 (இடது) அல்லது நாள் 15 (வலது மையம்) இல் நிகழ்த்தப்பட்ட நக்குகளின் சராசரி எண்ணிக்கை (n = 150 நீல ஒளி சோதனைகள், n = 150 சிவப்பு ஒளி சோதனைகள்; ***P < 0.0001). நாள் 1 (இடது) அல்லது நாள் 15 (வலது மையம்) இல் நிகழ்த்தப்பட்ட நக்குகளின் சராசரி எண்ணிக்கை (n = 150 நீல ஒளி சோதனைகள், n = 150 சிவப்பு ஒளி சோதனைகள்; ***P < 0.0001). தேதி 1 (ஸ்லேவா) அல்லது தேதி 15 (அரசாங்கத்தில் விளக்கம்) (ந = 150 светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). நாள் 1 (இடது) அல்லது நாள் 15 (மைய வலது) அன்று நிகழ்த்தப்பட்ட சராசரி நக்குகளின் எண்ணிக்கை (n = 150 நீல ஒளி சோதனைகள், n = 150 சிவப்பு விளக்கு சோதனைகள்; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 தேதி 1 (ஸ்லேவா) அல்லது தேதி 15 (அரசாங்கத்தில் விளக்கம்) (ந = 150 светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). நாள் 1 (இடது) அல்லது நாள் 15 (மைய வலது) அன்று நிகழ்த்தப்பட்ட சராசரி நக்குகளின் எண்ணிக்கை (n = 150 நீல ஒளி சோதனைகள், n = 150 சிவப்பு விளக்கு சோதனைகள்; ***P < 0.0001).நாள் 1 (மைய இடது) அல்லது நாள் 15 (வலது) அன்று சிவப்பு மற்றும் நீல ஒளி சோதனைகளுக்கான ஒட்டுமொத்த நக்குகள். NS, குறிப்பிடத்தக்கதாக இல்லை. j,k, 1 அல்லது 15 ஆம் நாளில் hChR2-EYFP (j) அல்லது கட்டுப்பாட்டு ஃப்ளோரோஃபோர் (k) ஐ வெளிப்படுத்தும் t-hCO உடன் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட அனைத்து விலங்குகளின் நடத்தை பண்புகள் (hChR2-EYFP: n = 9 எலிகள், ** P = 0.0049; கட்டுப்பாடு: n = 9, P = 0.1497). l, விருப்ப மதிப்பெண்ணின் பரிணாமம் (n = 9 hChR2, n = 9 கட்டுப்பாடு; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, விருப்ப மதிப்பெண்ணின் பரிணாமம் (n = 9 hChR2, n = 9 கட்டுப்பாடு; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, விருப்ப மதிப்பெண்ணின் பரிணாமம் (n = 9 hChR2, n = 9 கட்டுப்பாடுகள்; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, விருப்ப மதிப்பெண்களின் பரிணாமம் (n = 9 hChR2, n = 9 கட்டுப்பாடுகள்; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 இல் t-hCO இன் ஆப்டோஜெனடிக் செயல்படுத்தலுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக FOS வெளிப்பாடு. FOS வெளிப்பாடு (இடது), மற்றும் அளவுப்படுத்தல் (ஒரு குழுவிற்கு n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 மற்றும் ***P < 0.001) (வலது) ஆகியவற்றின் படங்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. FOS வெளிப்பாடு (இடது), மற்றும் அளவுப்படுத்தல் (ஒரு குழுவிற்கு n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 மற்றும் ***P < 0.001) (வலது) ஆகியவற்றின் படங்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. Показаны изображения Кспресии FOS (ஸ்லேவா) மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னோகோ ஆப்ரேடெலனியா (n = 3 на группу; * P <0,005, **1 (ஸ்பராவா). FOS வெளிப்பாடு (இடது) மற்றும் அளவீடு (ஒரு குழுவிற்கு n = 3; *P<0.05, **P<0.01, மற்றும் ***P<0.001) ஆகியவற்றின் படங்கள் (வலது) காட்டப்பட்டுள்ளன.显 示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3显 示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3 Показаны изображения Кспресии FOS (ஸ்லேவா) மற்றும் கோலிசெஸ்ட்வென்னோகோ ஆப்ரேடெலனியா (n = 3 на группу; * P <0,005, **1 (ஸ்பராவா). FOS வெளிப்பாடு (இடது) மற்றும் அளவீடு (ஒரு குழுவிற்கு n = 3; *P<0.05, **P<0.01, மற்றும் ***P<0.001) ஆகியவற்றின் படங்கள் (வலது) காட்டப்பட்டுள்ளன.அளவுகோல், 100 µm. தரவு BLA, பாசோலேட்டரல் டான்சில், MDT, டார்சோமெடியல் தாலமிக் நியூக்ளியஸ், PAG, பெரியாக்வெடக்டல் கிரே ஆகியவற்றின் சராசரி ± நிலையான பிழையாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது.
இறுதியாக, t-hCO எலி நடத்தையை மாற்றியமைக்க முடியுமா என்று கேட்டோம். இதைச் சோதிக்க, hChR2-EYFP-வெளிப்படுத்தும் hCO ஐ S1 இல் இடமாற்றம் செய்தோம், மேலும் 90 நாட்களுக்குப் பிறகு, ஒளி விநியோகத்திற்காக t-hCO இல் ஆப்டிகல் ஃபைபர்களைப் பொருத்தினோம். பின்னர் எலிகளுக்கு மாற்றியமைக்கப்பட்ட செயல்பாட்டு கண்டிஷனிங் முன்னுதாரணத்துடன் பயிற்சி அளித்தோம் (படம் 5h). நாங்கள் விலங்குகளை ஒரு நடத்தை சோதனை அறையில் வைத்து, தோராயமாக 5 வினாடி நீலம் (473 nm) மற்றும் சிவப்பு (635 nm) லேசர் தூண்டுதல்களைப் பயன்படுத்தினோம். நீல ஒளி தூண்டுதலின் போது நக்கினாலும், சிவப்பு ஒளி தூண்டுதலின் போது நக்கவில்லை என்றால் விலங்குகளுக்கு நீர் வெகுமதி கிடைத்தது. பயிற்சியின் முதல் நாளில், விலங்குகள் நீலம் அல்லது சிவப்பு ஒளியால் தூண்டப்படும்போது நக்குவதில் எந்த வித்தியாசத்தையும் காட்டவில்லை. இருப்பினும், 15 ஆம் நாளில், hCO ஐ வெளிப்படுத்தும் hChR2-EYFP உடன் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட விலங்குகள் சிவப்பு ஒளி தூண்டுதலுடன் ஒப்பிடும்போது நீல ஒளியால் தூண்டப்படும்போது அதிக சுறுசுறுப்பான நக்கலைக் காட்டின. கட்டுப்பாட்டு ஃப்ளோரோஃபோரை வெளிப்படுத்தும் hCO உடன் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட கட்டுப்பாட்டு விலங்குகளில் நக்கும் நடத்தையில் இந்த மாற்றங்கள் காணப்படவில்லை (கற்றல் வெற்றி விகிதம்: hChR2 89%, EYFP 0%, படம் 5i-1 மற்றும் துணை வீடியோ 2). வெகுமதி தேடும் நடத்தையைத் தூண்டுவதற்கு t-hCO செல்கள் எலி நியூரான்களை செயல்படுத்த முடியும் என்பதை இந்தத் தரவுகள் தெரிவிக்கின்றன. இந்த நடத்தை மாற்றங்களில் எந்த எலி t-hCO நரம்பியல் சுற்றுகள் ஈடுபடக்கூடும் என்பதைக் கண்டறிய, 90 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு பயிற்சி பெற்ற விலங்குகள் மற்றும் அறுவடை செய்யப்பட்ட திசுக்களில் t-hCO ஐ ஆப்டோஜெனடிக் முறையில் செயல்படுத்தினோம். இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரி, மீடியல் ப்ரீஃப்ரன்டல் கோர்டெக்ஸ், மீடியல் தாலமஸ் மற்றும் பெரியாக்வெடக்டல் கிரே மேட்டர் உள்ளிட்ட உந்துதல் நடத்தையில் ஈடுபட்டுள்ள பல மூளைப் பகுதிகளில் செயல்பாடு சார்ந்த FOS புரதத்தின் வெளிப்பாட்டை வெளிப்படுத்தியது, இது தூண்டப்படாத கட்டுப்பாட்டு விலங்குகளிலோ அல்லது விலங்குகளிலோ வெளிப்படுத்தப்பட்டது. அரிசி. 5 மீ). ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த தரவுகள் t-hCO நடத்தையை இயக்க எலி நியூரான் செயல்பாட்டை மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.
மனித வளர்ச்சி மற்றும் நோய்களை ஆய்வு செய்வதற்கான ஒரு நம்பிக்கைக்குரிய அமைப்பை நியூரல் ஆர்கனாய்டுகள் பிரதிநிதித்துவப்படுத்துகின்றன, ஆனால் அவை இன் விவோவில் இருக்கும் சுற்றுகளுக்கு இடையேயான இணைப்புகள் இல்லாததால் வரையறுக்கப்பட்டுள்ளன. இன் விவோவில் மனித உயிரணு வளர்ச்சி மற்றும் செயல்பாட்டை ஆய்வு செய்வதற்காக, நோயெதிர்ப்பு குறைபாடுள்ள ஆரம்பகால பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய எலிகளின் S1 இல் hCO ஐ இடமாற்றம் செய்யும் ஒரு புதிய தளத்தை நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம். இன் விவோவில் காணப்படாத முதிர்ந்த உயிரணு வகைகளை t-hCO உருவாக்குகிறது என்பதையும், t-hCO கொறிக்கும் மூளையில் உடற்கூறியல் ரீதியாகவும் செயல்பாட்டு ரீதியாகவும் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டுள்ளது என்பதையும் நாங்கள் காட்டியுள்ளோம். கொறிக்கும் நரம்பியல் சுற்றுகளில் t-hCO ஐ ஒருங்கிணைப்பது மனித செல்லுலார் செயல்பாடு மற்றும் ஆய்வு செய்யப்பட்ட விலங்கு நடத்தைக்கு இடையே ஒரு இணைப்பை நிறுவ எங்களுக்கு அனுமதித்தது, t-hCO நியூரான்கள் நடத்தை பதில்களை இயக்க எலி நரம்பியல் செயல்பாட்டை மாற்றியமைக்க முடியும் என்பதைக் காட்டுகிறது.
மனித செல்களை கொறிக்கும் மூளையில் இடமாற்றம் செய்வது குறித்த முந்தைய ஆராய்ச்சிகளை விட நாங்கள் விவரிக்கும் தளம் பல நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது. முதலாவதாக, ஆரம்பகால பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய எலிகளின் வளரும் புறணிப் பகுதியில் hCO ஐ இடமாற்றம் செய்தோம், இது உடற்கூறியல் மற்றும் செயல்பாட்டு ஒருங்கிணைப்பை எளிதாக்கக்கூடும். இரண்டாவதாக, t-hCO MRI கண்காணிப்பு, உயிருள்ள விலங்குகளில் ஒட்டு நிலை மற்றும் வளர்ச்சியைப் படிக்க எங்களுக்கு அனுமதித்தது, இது நீண்டகால பல-விலங்கு ஆய்வுகளை நடத்தவும் பல hiPS செல் கோடுகளின் நம்பகத்தன்மையை நிறுவவும் எங்களுக்கு அனுமதித்தது. இறுதியாக, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஒற்றை செல் இடைநீக்கங்களுக்குப் பதிலாக, அப்படியே ஆர்கனாய்டுகளை இடமாற்றம் செய்தோம், அவை மனித செல்களுக்கு குறைவான அழிவுகரமானவை மற்றும் எலி மூளையில் மனித புறணி நியூரான்களின் ஒருங்கிணைப்பு மற்றும் தலைமுறையை ஊக்குவிக்கும்.
இந்த தளத்தில் முன்னேற்றங்கள் இருந்தபோதிலும், தற்காலிக, இடஞ்சார்ந்த மற்றும் குறுக்கு-இனக் கட்டுப்பாடுகள், வளர்ச்சியின் ஆரம்ப கட்டத்தில் மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகும் கூட, அதிக நம்பகத்தன்மையுடன் மனித நரம்பியல் சுற்றுகள் உருவாவதைத் தடுக்கின்றன என்பதை நாங்கள் ஒப்புக்கொள்கிறோம். எடுத்துக்காட்டாக, t-hCO இல் காணப்படும் தன்னிச்சையான செயல்பாடு, புறணி வளர்ச்சியின் போது காணப்பட்ட தாள செயல்பாட்டைப் போன்ற ஒரு வளர்ச்சி பினோடைப்பைக் குறிக்கிறதா, அல்லது t-hCO இல் உள்ள அடக்கும் செல் வகைகள் இல்லாததால் ஏற்படுகிறதா என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை. இதேபோல், t-hCO இல் லேமினேஷன் இல்லாதது சங்கிலி இணைப்பை எந்த அளவிற்கு பாதிக்கிறது என்பது தெளிவாகத் தெரியவில்லை. எதிர்கால வேலை மனித மைக்ரோக்லியா, மனித எண்டோடெலியல் செல்கள் மற்றும் GABAergic இன்டர்னூரன்களின் மாறுபட்ட விகிதங்கள் போன்ற பிற செல் வகைகளை ஒருங்கிணைப்பதில் கவனம் செலுத்தும், அத்துடன் மாற்றப்பட்ட t-hCO இல் நரம்பியல் ஒருங்கிணைப்பு மற்றும் செயலாக்கம் எவ்வாறு நிகழலாம் என்பதைப் புரிந்துகொள்வதில் கவனம் செலுத்தும். நோயாளிகளிடமிருந்து பெறப்பட்ட செல்களில் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல், சினாப்டிக் மற்றும் நடத்தை நிலைகள்.
ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த இன் விவோ தளம், இன் விவோ மனித மூளை வளர்ச்சி மற்றும் நோய் ஆராய்ச்சியை நிறைவு செய்யக்கூடிய ஒரு சக்திவாய்ந்த வளத்தைக் குறிக்கிறது. இந்த தளம், மற்றபடி எளிதில் கண்டுபிடிக்க முடியாத நோயாளி-பெறப்பட்ட செல்களில் புதிய இழை-நிலை பினோடைப்களைக் கண்டறியவும், புதிய சிகிச்சை உத்திகளைச் சோதிக்கவும் அனுமதிக்கும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி HiPS செல்களிலிருந்து hCO2.5 ஐ உருவாக்கினோம். ஊட்டி அடுக்குகளில் வளர்க்கப்பட்ட hiPS செல்களிலிருந்து hCO உற்பத்தியைத் தொடங்க, டிஸ்பேஸ் (0.35 mg/mL) ஐப் பயன்படுத்தி வளர்ப்பு உணவுகளிலிருந்து hiPS செல்களின் அப்படியே காலனிகள் அகற்றப்பட்டு, hiPS செல் வளர்ப்பு ஊடகம் கொண்ட உணவுகளைக் கொண்ட மிகக் குறைந்த இணைப்பு பிளாஸ்டிக் கலாச்சாரங்களுக்கு மாற்றப்பட்டன. (கார்னிங்) இரண்டு SMAD தடுப்பான்கள் டோர்சோமார்ஃபின் (5 μM; P5499, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) மற்றும் SB-431542 (10 μM; 1614, டோக்ரிஸ்) மற்றும் ROCK தடுப்பான் Y-27632 (10 μM; S1049, செல்லெக்கெம்) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது. முதல் 5 நாட்களில், hiPS செல் ஊடகம் தினமும் மாற்றப்பட்டது மற்றும் டோர்சோமார்ஃபின் மற்றும் SB-431542 ஆகியவை சேர்க்கப்பட்டன. இடைநீக்கத்தின் ஆறாவது நாளில், நியூரல் ஸ்பீராய்டுகள் நியூரோபாசல்-ஏ (10888, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), வைட்டமின் ஏ இல்லாமல் பி-27 சப்ளிமெண்ட் (12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), குளுட்டாமேக்ஸ் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), பென்சிலின் மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) ஆகியவற்றைக் கொண்ட நியூரல் மீடியத்திற்கு மாற்றப்பட்டன, மேலும் எபிடெர்மல் வளர்ச்சி காரணி (EGF; 20 ng ml−1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் வளர்ச்சி காரணி 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) ஆகியவற்றுடன் 24 ஆம் நாள் வரை கூடுதலாக வழங்கப்பட்டன. 25 ஆம் நாள் முதல் 42 ஆம் நாள் வரை, மீடியம் மூளையிலிருந்து பெறப்பட்ட நியூரோட்ரோபிக் காரணி (BDNF; 20 ng ml−1, பெப்ரோடெக்) மற்றும் நியூரோட்ரோபின் 3 (NT3; 20 ng ml−1; பெப்ரோடெக்) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது, ஒவ்வொரு நாளும் நடுத்தர மாற்றங்கள் செய்யப்பட்டன. இடைநீக்கத்தின் ஆறாவது நாளில், நியூரல் ஸ்பீராய்டுகள் நியூரோபாசல்-ஏ (10888, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), வைட்டமின் ஏ இல்லாமல் பி-27 சப்ளிமெண்ட் (12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), குளுட்டாமேக்ஸ் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), பென்சிலின் மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) ஆகியவற்றைக் கொண்ட நியூரல் மீடியத்திற்கு மாற்றப்பட்டன, மேலும் எபிடெர்மல் வளர்ச்சி காரணி (EGF; 20 ng ml−1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் வளர்ச்சி காரணி 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) ஆகியவற்றுடன் 24 ஆம் நாள் வரை கூடுதலாக வழங்கப்பட்டன. 25 ஆம் நாள் முதல் 42 ஆம் நாள் வரை, மீடியம் மூளையிலிருந்து பெறப்பட்ட நியூரோட்ரோபிக் காரணி (BDNF; 20 ng ml−1, பெப்ரோடெக்) மற்றும் நியூரோட்ரோபின் 3 (NT3; 20 ng ml−1; பெப்ரோடெக்) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டது, ஒவ்வொரு நாளும் நடுத்தர மாற்றங்கள் செய்யப்பட்டன.இடைநீக்கத்தின் ஆறாவது நாளில், நியூரல் ஸ்பீராய்டுகள் நியூரோபாசல்-ஏ (10888, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), வைட்டமின் ஏ இல்லாமல் பி-27 சப்ளிமெண்ட் (12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), குளுட்டாமேக்ஸ் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), பென்சிலின் ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு நியூரல் மீடியத்திற்கு மாற்றப்பட்டன.மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமிஷன் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) மற்றும் டோபோல்னென் எபிடெர்மால்னிம் ஃபேக்டோரம் ரோஸ்டா (EGF; 20 ng/ml; ஆர்&டி சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபிப்ரோப்ளாஸ்டோவ் 2 (FGF2; 20 ng/mil; R&D அமைப்புகள்) முதல் 24-ந்தேதி வரை. மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) மற்றும் எபிடெர்மல் வளர்ச்சி காரணி (EGF; 20 ng/ml; R&D சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் வளர்ச்சி காரணி 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D சிஸ்டம்ஸ்) ஆகியவற்றுடன் 24 ஆம் நாள் வரை கூடுதலாக வழங்கப்படுகிறது.25 முதல் 42 நாட்கள் வரை, மூளையிலிருந்து பெறப்பட்ட நியூரோட்ரோபிக் காரணி (BDNF; 20 ng ml-1, பெப்ரோடெக்) மற்றும் நியூரோட்ரோபின் 3 (NT3; 20 ng ml-1, பெப்ரோடெக்) ஆகியவை ஊடகத்தில் சேர்க்கப்பட்டு, ஒவ்வொரு நாளும் ஊடகத்தை மாற்றின.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்补充剂（12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்）、GlutaMax（1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ் தொழில்நுட்பங்கள்）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1;R&D அமைப்புகள்）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D அமைப்புகள்மேலும் 6的 b-27 补充剂 （12587 , லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்） குளுடாமேக்ஸ் （1: 100 , லைஃப் டெக்னோஜிஸ் 100 , லைஃப் டெக்னாலஜிஸ் 表皮 生长 因子 （（20 ng ml-1 ； r & d சிஸ்டம்ஸ்） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 அமைப்புகள் 直至第24天. இன்று 6-ஆம் தேதி சஸ்பென்சி நெய்ரோஸ்பெர்டி பைலி பெரெவெடென்ஸ் ஆஃப் டோபாவ்கு, சோடர்ஷாசூயு நெய்ரோபசல்-ஏ (10888), லைஃப் டெக்னாலஜிஸ் В-27 без витамина А (12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), குளுட்டாமேக்ஸ் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), பெனிசிலின்- நியூட்ரலிசோவனிஸ் ஸ்டிரெப்டோம்ஸ், லைஃப் டெக்னாலஜிஸ் டோபவ்லேனியம் எபிடெர்மால்னோகோ ஃபேக்டோரா ரோஸ்டா (EGF; 20 ng mil-1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபேக்டோரா ரோஸ்டா ஃபிப்ரோப்ளாஸ்டோவ் 2 (FGF2; 20 ng mil-1) 1; 6 ஆம் நாளில், நியூரோஸ்பியர் சஸ்பென்ஷன்கள் நியூரோபாசல்-ஏ (10888, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), வைட்டமின் ஏ இல்லாத பி-27 சப்ளிமெண்ட் (12587, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), குளுட்டாமேக்ஸ் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்), பென்சிலின்-நியூட்ரலைஸ் செய்யப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (1:100, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு சப்ளிமெண்டிற்கு மாற்றப்பட்டன. எபிடெர்மல் வளர்ச்சி காரணி (EGF; 20 ng ml-1; R&D சிஸ்டம்ஸ்) மற்றும் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் வளர்ச்சி காரணி 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D அமைப்புகள்) 24-ம் தேதி வரை. (ஆர்&டி சிஸ்டம்ஸ்) நாள் 24 வரை.25 முதல் 42 நாட்கள் வரை, மூளையிலிருந்து பெறப்பட்ட நியூரோட்ரோபிக் காரணி (BDNF; 20 ng ml-1, பெப்ரோடெக்) மற்றும் நியூரோட்ரோபிக் காரணி 3 (NT3; 20 ng ml-1, பெப்ரோடெக்) ஆகியவை கலாச்சார ஊடகத்தில் ஒரு நாள் விட்டு ஒரு நாள் சேர்க்கப்பட்டன. நடுத்தர மாற்றம்.43 ஆம் நாளிலிருந்து தொடங்கி, hCO நிரப்பப்படாத நியூரோபாசல்-A ஊடகத்தில் (NM; 1088022, தெர்மோ ஃபிஷர்) பராமரிக்கப்பட்டு, ஒவ்வொரு 4–6 நாட்களுக்கும் நடுத்தர மாற்றத்துடன் பராமரிக்கப்பட்டது. ஊட்டமில்லாத நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்ட hiPS செல்களிலிருந்து hCO ஐப் பெற, hiPS செல்கள் 37°C வெப்பநிலையில் 7 நிமிடங்களுக்கு Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) உடன் அடைகாக்கப்பட்டு, ஒற்றை செல்களாகப் பிரிக்கப்பட்டு, ROCK தடுப்பான Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) உடன் கூடுதலாக வழங்கப்பட்ட Essential 8 ஊடகத்தில் ஒரு கிணற்றுக்கு 3 × 106 ஒற்றை செல்கள் அடர்த்தியில் AggreWell 800 தட்டுகளில் (34815, STEMCELL Technologies) பூசப்பட்டன. 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, கிணறுகளில் உள்ள ஊடகங்கள் டோர்சோமார்ஃபின் (2.5 μM; P5499, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) மற்றும் SB-431542 (10 μM; 1614) ஆகியவற்றுடன் கூடுதலாக எசென்ஷியல் 6 மீடியா (A1516401, லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) கொண்ட ஊடகங்களாக மேலும் கீழும் குழாய் பதிக்கப்பட்டன. , டோக்ரிடா). 2 முதல் 6 நாட்கள் வரை, எசென்ஷியல் 6 ஊடகம் டோர்சோமார்ஃபின் மற்றும் துணை SB-431542 உடன் தினமும் மாற்றப்பட்டது. ஆறாவது நாளிலிருந்து, நியூரோஸ்பியர் இடைநீக்கங்கள் நியூரோபாசல் ஊடகத்திற்கு மாற்றப்பட்டு மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி பராமரிக்கப்பட்டன.
ஸ்டான்போர்ட் பல்கலைக்கழக ஆய்வக விலங்கு பராமரிப்பு நிர்வாகக் குழு (APLAC) அங்கீகரித்த விலங்கு பராமரிப்பு வழிகாட்டுதல்களின்படி அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் செய்யப்பட்டன. கர்ப்பிணி யூதிமிக் RNU (rnu/+) எலிகள் வாங்கப்பட்டன (சார்லஸ் ரிவர் ஆய்வகங்கள்) அல்லது தங்க வைக்கப்பட்டன. விலங்குகள் 12 மணிநேர ஒளி-இருண்ட சுழற்சியில் உணவு மற்றும் நீர் விளம்பர விருப்பத்துடன் வைக்கப்பட்டன. மூன்று முதல் ஏழு நாட்கள் வயதுடைய நிர்வாண (FOXN1–/–) எலி குட்டிகள் வெட்டப்படுவதற்கு முன்பு முதிர்ச்சியடையாத மீசையின் வளர்ச்சியால் அடையாளம் காணப்பட்டன. நாய்க்குட்டிகள் (ஆண் மற்றும் பெண்) 2-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் மயக்க மருந்து செய்யப்பட்டு ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் சட்டகத்தில் வைக்கப்பட்டன. டூரா மேட்டரின் ஒருமைப்பாட்டைப் பராமரிக்கும் போது S1 ஐ விட தோராயமாக 2-3 மிமீ விட்டம் கொண்ட மண்டை ஓட்டின் ட்ரெபனேஷன் செய்யப்பட்டது. பின்னர் டூராவைத் துளைக்க 30-G ஊசியை (தோராயமாக 0.3 மிமீ) பயன்படுத்தவும். பின்னர் HCO ஐ ஒரு மெல்லிய 3×3 செ.மீ பாராஃபிலிமில் தடவி அதிகப்படியான ஊடகத்தை அகற்றவும். 23 G, 45° ஊசியுடன் இணைக்கப்பட்ட ஹாமில்டன் சிரிஞ்சைப் பயன்படுத்தி, ஊசியின் மிகத் தொலைதூர முனையில் hCO ஐ மெதுவாக இழுக்கவும். பின்னர் ஸ்டீரியோடாக்சிக் சாதனத்துடன் இணைக்கப்பட்ட சிரிஞ்ச் பம்பில் சிரிஞ்சை நிறுவவும். பின்னர் ஊசியின் நுனியை டியூராவில் (z = 0 மிமீ) முன்பு செய்யப்பட்ட 0.3 மிமீ அகலமுள்ள பஞ்சர் துளையின் மீது வைத்து, ஊசி டியூரா மேட்டர் A க்கு இடையில் இருக்கும் வரை சிரிஞ்சை 1–2 மிமீ (z = தோராயமாக –1.5 மிமீ) சுருக்கவும். ஒரு அடர்த்தியான முத்திரை உருவாகிறது. பின்னர் சிரிஞ்சை கார்டிகல் மேற்பரப்பின் மையத்திற்கு z = -0.5 மிமீ என்ற விகிதத்தில் உயர்த்தி, நிமிடத்திற்கு 1-2 µl என்ற விகிதத்தில் hCO ஐ செலுத்தவும். hCO ஊசி முடிந்த பிறகு, ஊசி நிமிடத்திற்கு 0.2-0.5 மிமீ என்ற விகிதத்தில் பின்வாங்கப்படுகிறது, தோல் தைக்கப்படுகிறது, மேலும் நாய்க்குட்டி உடனடியாக முழுமையான குணமடையும் வரை ஒரு சூடான வெப்பமூட்டும் திண்டில் வைக்கப்படுகிறது. சில விலங்குகள் இருதரப்பு ரீதியாக இடமாற்றம் செய்யப்பட்டன.
அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் ஸ்டான்போர்ட் பல்கலைக்கழக APLAC-அங்கீகரிக்கப்பட்ட விலங்கு பராமரிப்பு வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன. எலிகள் (மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 60 நாட்களுக்கு மேல்) 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்தால் தூண்டப்பட்டு, இமேஜிங் போது 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டன. காட்சிப்படுத்தலுக்கு, சர்வதேச மின்சார நிறுவனம் (IECO) சாய்வு இயக்கியுடன் கூடிய 7 டெஸ்லா ஆக்டிவ்லி ஷீல்டு கிடைமட்ட போர்ஹோல் ஸ்கேனர் ப்ரூக்கர் (ப்ரூக்கர் கார்ப்.), 120 மிமீ (600 mT/m, 1000 T/m/s) உள் விட்டம் கொண்ட ஒரு கவச சாய்வு செருகல் AVANCE ஐப் பயன்படுத்தி பயன்படுத்தப்பட்டது. III, எட்டு-சேனல் மல்டி-சுருள் RF மற்றும் மல்டி-கோர் திறன்கள், மற்றும் அதனுடன் இணைந்த பாராவிஷன் 6.0.1 தளம். 86 மிமீ உள் விட்டம் கொண்ட ஆக்டிவ்லி டிகப்பிள்டு வால்யூமெட்ரிக் RF சுருளையும், ரிசீவ் மட்டும் நான்கு-சேனல் கிரையோ-கூல்டு RF சுருளையும் பயன்படுத்தி பதிவு செய்யப்பட்டது. 16 ஸ்லைஸ் பிடிப்புகளுடன் கூடிய ஆக்சியல் 2D டர்போ-ரேர் (மீண்டும் நிகழும் நேரம் = 2500 எம்எஸ், எதிரொலி நேரம் = 33 எம்எஸ், 2 சராசரிகள்), ஸ்லைஸ் தடிமன் 0.6–0.8 மிமீ, 256 × 256 மாதிரிகள் கொண்டது. 2 செ.மீ உள் விட்டம் கொண்ட குவாட்ரேச்சர் டிரான்ஸ்ஸீவர் வால்யூமெட்ரிக் ஆர்எஃப் சுருளைப் பயன்படுத்தி சிக்னல்கள் பெறப்பட்டன (ரேபிட் எம்ஆர் இன்டர்நேஷனல், எல்எல்சி). இறுதியாக, 3D ரெண்டரிங் மற்றும் தொகுதி பகுப்பாய்விற்கு உள்ளமைக்கப்பட்ட இமாரிஸ் (பிட்பிளேன்) மேற்பரப்பு மதிப்பீட்டு செயல்பாடுகளைப் பயன்படுத்தவும். வெற்றிகரமான மாற்று அறுவை சிகிச்சை என்பது, இடமாற்றப்பட்ட அரைக்கோளத்தில் தொடர்ச்சியான T2-எடையுள்ள எம்ஆர்ஐ சிக்னலின் பகுதிகள் உருவாகும் ஒன்றாக வரையறுக்கப்பட்டது. ஒட்டு நிராகரிப்பு என்பது இடமாற்றப்பட்ட அரைக்கோளத்தில் தொடர்ச்சியான T2-எடையுள்ள எம்ஆர்ஐ சிக்னலின் பகுதிகளை உருவாக்காத ஒட்டு என வரையறுக்கப்பட்டது. துணைக் கார்டிகல் t-hCO அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்விலிருந்து விலக்கப்பட்டது.
இரண்டு-ஃபோட்டான் கால்சியம் இமேஜிங்கிற்காக hCO இல் GCaMP6 களை நிலையான முறையில் வெளிப்படுத்த, hiPS செல்கள் pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro உடன் பாதிக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பிகள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, செல்கள் EDTA உடன் பிரிக்கப்பட்டு, பாலிபிரீன் (5 μg/ml) மற்றும் 15 μl வைரஸ் முன்னிலையில் தோராயமாக 300,000 செல்கள் அடர்த்தியில் 1 மில்லி எசென்ஷியல் 8 ஊடகத்தில் இடைநீக்கம் செய்யப்பட்டன. பின்னர் செல்கள் 60 நிமிடங்கள் இடைநீக்கத்தில் அடைக்கப்பட்டு, ஒரு கிணற்றில் 50,000 செல்கள் அடர்த்தியில் விதைக்கப்பட்டன. சங்கமத்திற்குப் பிறகு, செல்கள் 5-10 நாட்களுக்கு அல்லது நிலையான காலனிகள் தோன்றும் வரை 5-10 μg ml-1 புரோமைசினுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி கடுமையான hCO தொற்று சில மாற்றங்களுடன் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, நாள் 30-45 hCO ஐ 100 µl நரம்பு ஊடகம் கொண்ட 1.5 மில்லி எப்பென்டார்ஃப் மைக்ரோசென்ட்ரிஃபியூஜ் குழாய்களாக மாற்றவும். பின்னர் தோராயமாக 90 µl ஊடகம் அகற்றப்பட்டு, 3-6 µl உயர் டைட்டர் லென்டிவைரஸ் (0.5 x 108 முதல் 1.2 x 109 வரை) குழாயில் சேர்க்கப்படுகிறது, மேலும் hCO 30 நிமிடங்களுக்கு இன்குபேட்டருக்கு மாற்றப்படுகிறது. பின்னர் ஒவ்வொரு குழாயிலும் 90–100 µl ஊடகத்தைச் சேர்த்து, குழாய்களை ஒரே இரவில் இன்குபேட்டருக்குத் திருப்பி அனுப்பவும். அடுத்த நாள், குறைந்த இணைப்புத் தகடுகளில் புதிய நரம்பு ஊடகத்திற்கு hCO ஐ மாற்றவும். 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, காட்சிப்படுத்தல் மற்றும் தொற்று தரத்தை மதிப்பிடுவதற்காக hCO 24-கிணறு கண்ணாடி அடி தகடுகளுக்கு மாற்றப்பட்டது. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE மற்றும் pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ஆகியவை VectorBuilder ஆல் உருவாக்கப்பட்டன. லென்டிவைரஸ் பெரும்பாலான சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்படுகிறது, ஏனெனில் இது ஹோஸ்ட் மரபணுவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டுள்ளது, இது பாதிக்கப்பட்ட செல் கோடுகளில் நிருபர் மரபணு வெளிப்பாட்டை அனுமதிக்கிறது. ரேபிஸ் பின்தொடர்தலுக்கு, நாள் 30-45 hCO ரேபிஸ்-ΔG-eGFP மற்றும் AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (பிளாஸ்மிட் #67528, Addgene) ஆகியவற்றுடன் இணைந்து பாதிக்கப்பட்டு, 3 நாட்களுக்கு நன்கு கழுவி, S1 இல் உள்ள எலிகளுக்கு இடமாற்றம் செய்யப்பட்டு 7-14 நாட்கள் உயிருள்ள நிலையில் பராமரிக்கப்பட்டது.
இம்யூனோசைட்டோ கெமிஸ்ட்ரிக்கு, விலங்குகளுக்கு மயக்க மருந்து கொடுத்து, 4% பாராஃபோர்மால்டிஹைடு (PBS இல் PFA; எலக்ட்ரான் மைக்ரோஸ்கோபி சயின்சஸ்) மூலம் PBS மூலம் டிரான்ஸ்கார்டியல் முறையில் பெர்ஃப்யூஸ் செய்யப்பட்டது. மூளைகள் 4% PFA இல் 2 மணிநேரம் அல்லது ஒரே இரவில் 4°C வெப்பநிலையில் சரி செய்யப்பட்டன, PBS இல் 30% சுக்ரோஸில் 48-72 மணிநேரம் கிரையோப்ரிசர்வ் செய்யப்பட்டன, மேலும் 1:1, 30% சுக்ரோஸில் பதிக்கப்பட்டன: OCT (திசு-டெக் OCT கலவை 4583, சகுரா ஃபினெடெக்) மற்றும் கொரோனல் பிரிவுகள் 30 µm இல் ஒரு கிரையோஸ்டாட்டைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன (லைகா). தடிமனான பிரிவுகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோ கெமிஸ்ட்ரிக்கு, விலங்குகள் PBS உடன் பெர்ஃப்யூஸ் செய்யப்பட்டன, மேலும் மூளை துண்டிக்கப்பட்டு 300–400 µm இல் ஒரு வைப்ராடோமைப் (லைகா) பயன்படுத்தி கொரோனலாகப் பிரிக்கப்பட்டது, மேலும் பிரிவுகள் 30 நிமிடங்களுக்கு 4% PFA உடன் சரி செய்யப்பட்டன. பின்னர் கிரையோசெக்ஷன்கள் அல்லது தடிமனான பகுதிகள் PBS மூலம் கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் அடைக்கப்பட்டு (10% சாதாரண டான்கி சீரம் (NDS) மற்றும் 0.3% ட்ரைட்டான் X-100 PBS இல் நீர்த்தப்பட்டது) மற்றும் 4°C இல் தடுப்பு கரைசலுடன் அடைக்கப்பட்டது. – அடைகாத்தல் கிரையோசெக்ஷன்கள் ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டு, தடிமனான பகுதிகள் 5 நாட்களுக்கு அடைகாக்கப்பட்டன. பயன்படுத்தப்படும் முதன்மை ஆன்டிபாடிகள்: ஆன்டி-நியூஎன் (எலி, 1:500; ab104224, abcam) ஆன்டி-CTIP2 (எலி, 1:300; ab18465, abcam), ஆன்டி-GFAP (முயல், 1:1,000; Z0334, டகோ), ஆன்டி-ஜிஎஃப்பி (கோழி, 1:1,000; GTX13970, ஜீன்டெக்ஸ்), ஆன்டி-எலி (எலி, 1:200; ab191181, abcam), ஆன்டி-நியூஎன் (முயல், 1:500; ABN78, மில்லிபோர்), ஆன்டி-பிடிஜிஎஃப்ஆர்ஏ (முயல், 1:200; sc-338, சாண்டா குரூஸ்), ஆன்டி-பிபிபி1ஆர்17 (முயல், 1:200; HPA047819, அட்லஸ் ஆன்டிபாடிகள்), ஆன்டி-RECA-1 (எலி, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 எதிர்ப்பு (முயல், 1:100; 20357-1-AP, புரத தொழில்நுட்பம்), SOX9 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:500; AF3075, R&D அமைப்புகள்), நெட்ரின் G1a (ஆடு, 1:100; AF1166, R&D அமைப்புகள்), STEM121 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:200; Y40410, டகாரா பயோ), SATB2 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 எதிர்ப்பு (முயல், 1:400; ABN904, மில்லிபோர்) மற்றும் IBA1 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:100; ab5076, abcam). பயன்படுத்தப்படும் முதன்மை ஆன்டிபாடிகள்: நியூஎன் எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:500; ab104224, abcam) CTIP2 எதிர்ப்பு (எலி, 1:300; ab18465, abcam), ஜிஎஃப்ஏபி எதிர்ப்பு (முயல், 1:1,000; Z0334, டகோ), -ஜிஎஃப்பி எதிர்ப்பு (கோழி, 1:1,000; GTX13970, ஜீன்டெக்ஸ்), எச்என்ஏ எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:200; ab191181, abcam), நியூஎன் எதிர்ப்பு (முயல், 1:500; ABN78, மில்லிபோர்), பிடிஜிஎஃப்ஆர்ஏ எதிர்ப்பு (முயல், 1:200; sc-338, சாண்டா குரூஸ்), பிபிபி1ஆர்17 எதிர்ப்பு (முயல், 1:200; HPA047819, அட்லஸ் ஆன்டிபாடிகள்), ரெக்கா-1 (சுட்டி, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 எதிர்ப்பு (முயல், 1:100; 20357-1-AP, புரத தொழில்நுட்பம்), SOX9 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:500; AF3075, R&D அமைப்புகள்), நெட்ரின் G1a (ஆடு, 1:100; AF1166, R&D அமைப்புகள்), STEM121 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:200; Y40410, டகாரா பயோ), SATB2 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 எதிர்ப்பு (முயல், 1:400; ABN904, மில்லிபோர்) மற்றும் IBA1 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:100; ab5076, abcam). இஸ்போல்சோவலிஸ் ஸ்லேடுயூஷியே பர்விச்னி அன்டிடெலா: ஆன்டி-நியூன் (மிஷினி, 1:500; ab104224, abcam), ANTI,0CT11 ab18465, abcam), ஆன்டி-GFAP (க்ரோலிச், 1:1000; Z0334, Dako), Anti- -GFP (குரிசா, 1:1000; GTX13970, GeneTex), (அன்டி:2000; ab191181, abcam), அன்டி-நியூன் (க்ரோலிக், 1:500; ஏபிஎன்78, மில்லிப்பூர்), அன்டி-பிடிஜிஎஃப்ஆர்ஏ (க்ரோலிக், 1:200; எஸ்சி-338, சான்டா-க்ரூஸ்), அன்டி-பிபிபி1ஆர்17, அன்டி-பிபிபி1ஆர்17; HPA047819, அட்லஸ் ஆன்டிபாடிகள்), ஆன்டி-RECA-1 (மைஷ், 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (க்ரோலிக் , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти RECA-1 AF3075, R&D அமைப்புகள்), NETRIN G1a (கோஸி, 1:100; AF1166, R&D சிஸ்டம்ஸ்), ஆன்டி-STEM121 (மிஷினி , 1:200; Y40410, டகரா பயோ), ஆன்டி-SATB2 (மைஷ், 1:50; ab51502, abcam), AD65ти-G 1:400; ABN904, மில்லிபூர்) மற்றும் ஆன்டி-IBA1 (கோச, 1:100; AB5076, ABKAM). பயன்படுத்தப்பட்ட முதன்மை ஆன்டிபாடிகள்: ஆன்டி-நியூஎன் (எலி, 1:500; ab104224, abcam), ஆன்டி-CTIP2 (எலி, 1:300; ab18465, abcam), ஆன்டி-GFAP (முயல், 1:1000; Z0334, டகோ), ஆன்டி-ஜிஎஃப்பி (கோழி, 1:1000; GTX13970, ஜீன்டெக்ஸ்), ஆன்டி-எலி (எலி, 1:200; ab191181, abcam), ஆன்டி-நியூஎன் (முயல், 1:500; ABN78, மில்லிபோர்), ஆன்டி-பிடிஜிஎஃப்ஆர்ஏ (முயல், 1:200; sc-338, சாண்டா குரூஸ்), ஆன்டி-பிபிபி1ஆர்17 (முயல், 1:200; HPA047819, அட்லஸ் ஆன்டிபாடிகள்), ஆன்டி-RECA-1 (எலி, 1:50; ab9774, abcam), scg2 எதிர்ப்பு (முயல், 1:100; 20357-1-AP, புரத தொழில்நுட்பம்), SOX9 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:500; AF3075, R&D அமைப்புகள்), netrin G1a (ஆடு, 1:100; AF1166, R&D அமைப்புகள்), STEM121 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:200; Y40410, டகாரா பயோ), SATB2 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 எதிர்ப்பு (முயல், 1:400; ABN904, மில்லிபோர்) மற்றும் IBA1 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2 00;ab18465,abcam）,抗GFAP P（鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex）,抗HNA 81, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, Millipore, 抗PDGFRA 1:200；sc-338, சாண்டா குரூஸ், 抗PPP1R17（兔, 1:200;HPA047819, அட்லஸ்抗体）, 抗RECA-1 1:100;20357-1-AP,புரோட்டீன்டெக்），抗SOX9 அமைப்புகள்), 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2 :300;ab18465,abcam），抗GFAP -GFP (鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200 191181, abcam），抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore％弔,抗1: 200；sc-338,Santa Cruz）,抗PPP1R17 100;20357-1-AP,புரோட்டீன்டெக்），抗SOX9Y40410, டகாரா பயோ), SATB2 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 எதிர்ப்பு (முயல், 1:400; ABN904, மில்லிபோர்) மற்றும் IBA1 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:100; ab5076, abcam).பயன்படுத்தப்பட்ட முதன்மை ஆன்டிபாடிகள்: நியூன் எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:500; ab104224, abcam), CTIP2 எதிர்ப்பு (எலி, 1:300; ab18465, abcam), GFAP எதிர்ப்பு (முயல், 1:1000; Z0334, டகோ). , GFP எதிர்ப்பு (கோழி, 1:1000; GTX13970, ஜீன்டெக்ஸ்), HNA எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:200; ab191181, abcam), NeuN எதிர்ப்பு (முயல், 1:500; ABN78, மில்லிபோர்), PDGFRA எதிர்ப்பு (முயல், 1:200; sc-338, சாண்டா குரூஸ்), PPP1R17 எதிர்ப்பு (முயல், 1:200; HPA047819, அட்லஸ் ஆன்டிபாடி), RECA-1 எதிர்ப்பு (சுட்டி, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 எதிர்ப்பு (முயல்), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), ஆன்டி-SOX9 (கோச, 1:500; AF3075, R&D சிஸ்டம்ஸ்), NETRIN G1a (கோசா, 1:100; AF1166, R&D அமைப்புகள்), அன்டி, 120;STEM120; Y40410, Takara Bio), ஆன்டி-SATB2 (மிஷ், 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (க்ரோலிக், 1:400; ABN904, மில்லிபூர்) மற்றும் 1:IBA10; ab5076, abkam). 20357-1-AP, புரோட்டீன்டெக்), SOX9 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:500; AF3075, R&D அமைப்புகள்), நெட்ரின் G1a (ஆடு, 1:100; AF1166, R&D அமைப்புகள்), STEM121 எதிர்ப்பு (எலி, 1:200; Y40410, டகாரா பயோ), SATB2 எதிர்ப்பு (எலி, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 எதிர்ப்பு (முயல், 1:400; ABN904, மில்லிபோர்), மற்றும் IBA1 எதிர்ப்பு (ஆடு, 1:100; ab5076, abkam).பின்னர் பிரிவுகள் PBS மூலம் கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் (உறைந்த பிரிவுகள்) அல்லது இரவு முழுவதும் 4°C (தடிமனான பிரிவுகள்) வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடியுடன் அடைகாக்கப்பட்டன. தடுப்பு கரைசலில் 1:1000 நீர்த்த அலெக்சா ஃப்ளூர் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடி (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) பயன்படுத்தப்பட்டது. PBS மூலம் கழுவிய பிறகு, கருக்கள் ஹோச்ஸ்ட் 33258 (லைஃப் டெக்னாலஜிஸ்) மூலம் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. இறுதியாக, ஸ்லைடுகள் ஒரு அக்வாமவுண்ட் (பாலிசயின்சஸ்) ஐப் பயன்படுத்தி கவர்ஸ்லிப்களுடன் (ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) ஒரு நுண்ணோக்கியில் வைக்கப்பட்டு, படத்தில் உள்ள கீயன்ஸ் ஃப்ளோரசன்ட் மைக்ரோஸ்கோப் (BZ-X பகுப்பாய்வி) அல்லது லைக்கா TCS SP8 கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப் (லாஸ்-எக்ஸ்) இல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. படங்கள் ImageJ நிரலைப் (ஃபிஜி) பயன்படுத்தி செயலாக்கப்பட்டன. t-hCO மற்றும் எலி கார்டெக்ஸில் உள்ள மனித நியூரான்களின் விகிதத்தை அளவிட, 387.5 μm அகலமுள்ள செவ்வக படங்கள் t-hCO இன் மையத்தில், எலி கார்டெக்ஸின் விளிம்பில் அல்லது அதற்கு அருகில் எடுக்கப்பட்டன. திசுக்களின் வெளிப்படைத்தன்மை, HNA+ கருக்கள் மற்றும்/அல்லது திசுக்களின் தன்னியக்க ஒளிர்வு இருப்பு ஆகியவற்றில் ஏற்படும் மாற்றங்களை மதிப்பிடுவதன் மூலம் ஒட்டு விளிம்புகள் தீர்மானிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு படத்திலும், NeuN+ மற்றும் HNA+ செல்களின் மொத்த எண்ணிக்கை, அதே பகுதியில் உள்ள NeuN+ செல்களின் மொத்த எண்ணிக்கையால் வகுக்கப்பட்டது. படத் தளத்தில் கருக்கள் உள்ள செல்கள் மட்டுமே கணக்கிடப்படுவதை உறுதிசெய்ய, Hoechst+ செல்களும் கணக்கீட்டில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன. புள்ளிவிவரப் பிழையைக் குறைக்க, குறைந்தது 1 மிமீ பிரிக்கப்பட்ட இரண்டு படங்கள் சராசரியாகக் கணக்கிடப்பட்டன.
மாதிரி சேகரிப்புக்கு ஒரு வாரத்திற்கு முன்பு, hCO மாற்று விலங்குகளை (தோராயமாக 8 மாத வேறுபாடு) ஒரு இருண்ட அறையில் வைத்து, உணர்ச்சி தூண்டுதலைக் குறைக்க மீசைகளை வெட்டவும். முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, சில மாற்றங்களுடன், கருக்களின் தனிமைப்படுத்தல் செய்யப்பட்டது. சுருக்கமாக, t-hCO மற்றும் hCO ஆகியவை சோப்பு-இயந்திர செல் சிதைவு மற்றும் 2 மில்லி கண்ணாடி திசு சாணை (D8938, சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்/KIMBLE) பயன்படுத்தி அழிக்கப்பட்டன. பின்னர் கச்சா கருக்கள் 40 µm வடிகட்டியைப் பயன்படுத்தி வடிகட்டப்பட்டு, சுக்ரோஸ் அடர்த்தி சாய்வைச் செய்வதற்கு முன்பு 4 °C இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 320 கிராம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன. மையவிலக்கு படிக்குப் பிறகு (4°C இல் 20 நிமிடங்களுக்கு 320 கிராம்), மாதிரிகள் 0.04% BSA/PBS இல் 0.2 அலகுகள் µl-1 RNase தடுப்பானைச் சேர்த்து (40 u µl-1, AM2682, Ambion) மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு 40 µm ஓட்ட வடிகட்டி வழியாக அனுப்பப்பட்டன. பின்னர் பிரிக்கப்பட்ட கருக்கள் 0.02% BSA கொண்ட PBS இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டு ஒரு குரோமியம் ஒற்றை செல் 3′ சிப்பில் ஏற்றப்பட்டன (ஒரு பாதைக்கு 8,000 செல்கள் மீட்டெடுப்பு மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது). snRNA-seq நூலகங்கள் Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) உடன் தயாரிக்கப்பட்டன. snRNA-seq நூலகங்கள் Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) உடன் தயாரிக்கப்பட்டன. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium ஒற்றை செல் 3′ GEM, நூலகம் & ஜெல் பீட் கிட் v3 (10x ஜெனோமிக்ஸ்). snRNA-seq நூலகங்கள் Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ஐப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்பட்டன. snRNA-seq 文库是使用Chromium ஒற்றை செல் 3′ GEM、லைப்ரரி & ஜெல் பீட் கிட் v3 (10x ஜெனோமிக்ஸ்) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium ஒற்றை செல் 3′ GEM、லைப்ரரி & ஜெல் பீட் கிட் v3 (10x ஜெனோமிக்ஸ்) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium ஒற்றை செல் 3′ GEM, நூலகம் & ஜெல் பீட் கிட் v3 (10x ஜெனோமிக்ஸ்). snRNA-seq நூலகம் Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ஐப் பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்பட்டது.வெவ்வேறு மாதிரிகளிலிருந்து நூலகங்கள் அட்மெரா ஹெல்த் நிறுவனத்தால் NovaSeq S4 (இல்லுமினா) இல் தொகுக்கப்பட்டு வரிசைப்படுத்தப்பட்டன.
ஒவ்வொரு உத்தேச அணுக்கரு பார்கோடுக்கான மரபணு வெளிப்பாடு அளவுகள் 10x ஜெனோமிக்ஸ் செல்ரேஞ்சர் பகுப்பாய்வு மென்பொருள் தொகுப்பு (பதிப்பு 6.1.2) ஐப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன. குறிப்பாக, mkref கட்டளையுடன் உருவாக்கப்பட்ட மனித (GRCh38, குழுமம், பதிப்பு 98) மற்றும் எலி (Rnor_6.0, குழுமம், பதிப்பு 100) குறிப்பு மரபணுக்களின் கலவையுடன் வாசிப்புகள் பொருத்தப்பட்டன, மேலும் -include-introns=TRUE கட்டளையுடன் எண்ணிக்கையைப் பயன்படுத்தி அளவீட்டில் இன்ட்ரான் பகுதிகளுக்கு மேப் செய்யப்பட்ட அளவீடுகள் அடங்கும். t-hCO மாதிரிகளுக்கு, அனைத்து வரைபட வாசிப்புகளிலும் குறைந்தது 95% மனித மரபணுவுடன் பொருந்த வேண்டும் என்ற பழமைவாத தேவையின் அடிப்படையில் மனித கருக்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. அனைத்து அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்வுகளும் R தொகுப்பு (பதிப்பு 4.1.2) Seurat (பதிப்பு 4.1.1)32 ஐப் பயன்படுத்தி CellRanger இலிருந்து வடிகட்டப்பட்ட பார்கோடு வரிசை வெளியீட்டில் செய்யப்பட்டன.
அடுத்தடுத்த பகுப்பாய்வில் உயர்தர கருக்கள் மட்டுமே சேர்க்கப்படுவதை உறுதி செய்வதற்காக, ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் ஒரு தொடர்ச்சியான வடிகட்டுதல் செயல்முறை செயல்படுத்தப்பட்டது. முதலாவதாக, 1000 க்கும் குறைவான தனித்துவமான மரபணுக்கள் கண்டறியப்பட்டு மொத்த மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் 20% க்கும் அதிகமானவை கொண்ட குறைந்த தரம் வாய்ந்த கருக்கள் அடையாளம் காணப்பட்டு அகற்றப்படுகின்றன. பின்னர், மூல மரபணு எண் அணி, sctransform(vst.flavor=”v2″) செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்தி ஒழுங்குபடுத்தப்பட்ட எதிர்மறை இருசொற் பின்னடைவு மூலம் இயல்பாக்கப்பட்டது, இது இயல்புநிலை அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி 3000 மிகவும் மாறி மரபணுக்களையும் அடையாளம் கண்டது. 30 என்ற தரவுத் தொகுப்பு பரிமாணத்தைப் பயன்படுத்தி இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (PCA) ஐப் பயன்படுத்தி மேல் மாறி மரபணுக்களில் பரிமாணக் குறைப்பு செய்யப்பட்டது (dims = 30 முழங்கால் தளங்களின் காட்சி ஆய்வின் அடிப்படையில் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது மற்றும் அனைத்து மாதிரிகள் மற்றும் குழும பகுப்பாய்வுகளுக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டது). பின்னர் அசாதாரணமாக குறைந்த மரபணு எண்ணிக்கை (10வது சதவீதத்திற்குக் கீழே சராசரி), அசாதாரணமாக அதிக மைட்டோகாண்ட்ரியல் மரபணு எண்ணிக்கை (95வது சதவீதத்திற்கு மேல் சராசரி) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் மரபணுக்களை வகைப்படுத்த பல சுற்றுகள் மீண்டும் மீண்டும் கிளஸ்டரிங் (தெளிவுத்திறன் = 1) செய்தோம். குறைந்த தரத்தின் உத்தேச செல்களை அடையாளம் கண்டு அகற்ற. கொத்துகள் மற்றும்/அல்லது DoubletFinder33 தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி அடையாளம் காணப்பட்ட சந்தேகிக்கப்படும் இரட்டையர்களின் அதிக விகிதம் (95வது சதவீதத்திற்கு மேல் சராசரி DoubletFinder மதிப்பெண்). t-hCO மாதிரிகள் (n=3) மற்றும் hCO மாதிரிகள் (n=3) தனித்தனியாக ஒருங்கிணைக்கப்பட்டன. மேலே உள்ள அளவுருக்களுடன் IntegrateData செயல்பாடு. பின்னர் மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி ஒருங்கிணைந்த தரவு தொகுப்பின் மற்றொரு சுற்று தரமான வடிகட்டுதல் செய்யப்பட்டது.
குறைந்த தரமான கர்னல்களை அகற்றிய பிறகு, ஒருங்கிணைந்த தரவுத்தொகுப்பு தொகுக்கப்பட்டு (தெளிவுத்திறன் = 0.5) UMAP34 காட்சிப்படுத்தல் நோக்கங்களுக்காக உட்பொதிக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு கிளஸ்டருக்கான மார்க்கர் மரபணுக்கள், இயல்பாக்கப்பட்ட மரபணு வெளிப்பாடு தரவுகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்ட இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் FindMarkers செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்தி தீர்மானிக்கப்பட்டன. கரு மற்றும் வயதுவந்த கார்டிகல் குறிப்பு தரவுத்தொகுப்புகளை மார்க்கர் மரபணு வெளிப்பாடு 19,20,21,35 மற்றும் குறிப்புடன் இணைப்பதன் மூலம் முக்கிய செல் வகுப்புகளை நாங்கள் அடையாளம் கண்டு வகைப்படுத்துகிறோம். குறிப்பாக, MKI67 மற்றும் TOP2A இன் வெளிப்பாட்டால் சுற்றும் முன்னோடிகள் அடையாளம் காணப்பட்டன. மைட்டோடிக் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் இல்லாதது, தாமதமான மெட்டாஃபேஸ் ஃபெடல் கார்டெக்ஸில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள மல்டிபோடென்ட் கிளைல் புரோஜெனிட்டர் கிளஸ்டர்களுடன் அதிக மேலெழுதல் மற்றும் EGFR மற்றும் OLIG1 வெளிப்பாடு ஆகியவற்றால் முன்னோடி கிளஸ்டர்கள் வரையறுக்கப்பட்டன. தாமதமான ரேடியல் க்ளியா முதல் ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளின் முதிர்ச்சி வரை ஆஸ்ட்ரோசைட் வேறுபாட்டின் பல நிலைகளை உள்ளடக்கியதாக ஆஸ்ட்ரோசைட் என்ற வார்த்தையைப் பயன்படுத்துகிறோம். ஆஸ்ட்ரோசைட் கிளஸ்டர்கள் SLC1A3 மற்றும் AQP4 இன் உயர் நிலைகளை வெளிப்படுத்துகின்றன, மேலும் அவை கரு ரேடியல் க்ளியா மற்றும்/அல்லது வயதுவந்த ஆஸ்ட்ரோசைட்டுகளின் துணை வகைகளுடன் வரைபடமாக்கப்படுவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது. OPCகள் PDGFRA மற்றும் SOX10 ஐ வெளிப்படுத்துகின்றன, அதே நேரத்தில் ஒலிகோடென்ட்ரோசைட்டுகள் மயிலினேஷன் குறிப்பான்களை (MOG மற்றும் MYRF) வெளிப்படுத்துகின்றன. குளுட்டமேட்டர்ஜிக் நியூரான்கள் நியூரானல் டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் (SYT1 மற்றும் SNAP25), GABAergic குறிப்பான்கள் இல்லாதது (GAD2) மற்றும் NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, அல்லது SATB2 ஆகியவற்றின் வெளிப்பாடு மூலம் அடையாளம் காணப்பட்டன. GluN நியூரான்கள் மேல் (SATB2 வெளிப்பாடு மற்றும் BCL11B இழப்பு) மற்றும் ஆழமான (BCL11B வெளிப்பாடு) துணைப்பிரிவுகளாக மேலும் பிரிக்கப்பட்டன. புட்டேட்டிவ் சப்பிளேட் (SP) நியூரான்கள் ஆழமான GluN குறிப்பான்களுடன் கூடுதலாக ST18 மற்றும் SORCS1 போன்ற அறியப்பட்ட SP18 குறிப்பான்களை வெளிப்படுத்துகின்றன. கோராய்டு பிளெக்ஸஸ் போன்ற செல்கள் TTR வெளிப்பாட்டால் அடையாளம் காணப்பட்டன, மேலும் மெனிங்கீல் போன்ற செல்கள் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்-தொடர்புடைய மரபணுக்களை வெளிப்படுத்தின மற்றும் குறிப்பு தரவு தொகுப்பின் பியல்/வாஸ்குலர் செல்களை மேப் செய்தன.
லிப்ரா ஆர் தொகுப்பைப் பயன்படுத்தி செயல்படுத்தப்பட்ட மாதிரிகளில் (பதிப்பு 1.0.0) மீண்டும் உருவாக்கப்பட்ட புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட போலி-தொகுதி முறையைப் பயன்படுத்தி t-hCO மற்றும் hCO துணைப்பிரிவுகளுக்கு இடையிலான மரபணு வெளிப்பாட்டின் வேறுபட்ட பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. குறிப்பாக, ஒவ்வொரு மாதிரி நகலெடுப்பிற்கும் கொடுக்கப்பட்ட செல் வகுப்பிற்கான செல்களில் உள்ள மரபணுக்களின் எண்ணிக்கையைச் சுருக்கி குழுக்களுக்கு edgeR பதிவு-நிகழ்தகவு சோதனைகள் (பதிப்பு 3.36.0, தொகுப்பு R) செய்யப்பட்டன. வெப்ப வரைபடக் காட்சிப்படுத்தலுக்கு, மில்லியனுக்கு இயல்பாக்கப்பட்ட (CPM) மதிப்புகள் edgeR (cpm() செயல்பாடு) ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டு அளவிடப்படுகின்றன (சராசரி = 0 ஐ அடைய, நிலையான விலகல் = 1). கணிசமாக மேம்படுத்தப்பட்ட t-hCO GluN மரபணுக்களின் மரபணு ஆன்டாலஜி (GO) செறிவூட்டல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க் குறைந்தது 10% t-hCO GluN செல்களில் வெளிப்படுத்தப்பட்ட 0.05 க்கும் குறைவான P மதிப்பை சரிசெய்தது மற்றும் குறைந்தது 2 மடங்கு மாற்றத்தில் அதிகரிப்பு). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. நாங்கள் இயல்புநிலை அளவுருக்களுடன் ToppFun பயன்பாட்டைப் பயன்படுத்துகிறோம் மற்றும் GO-குறிப்பு ஹைப்பர்ஜியோமெட்ரிக் சோதனைகளிலிருந்து கணக்கிடப்பட்ட பெஞ்சமினி-ஹோச்பெர்க்-சரிசெய்யப்பட்ட P-மதிப்புகளைப் புகாரளிக்கிறோம்.
முதன்மை ஒற்றை செல் RNA-seq அல்லது வயதுவந்த snRNA-seq19,20,21,22 இன் குறிப்பு ஆய்வுகளிலிருந்து குறிப்பு செல் கிளஸ்டர்களுடன் எங்கள் snRNA-seq கிளஸ்டர்களைப் பொருத்த, நாங்கள் ஒரு ஜோடி தரவுத்தொகுப்பு ஒருங்கிணைப்பு அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தினோம். தரவுத்தொகுப்புகளுக்கு இடையில் கிளஸ்டர் மேலெழுதல்களை ஒருங்கிணைத்து ஒப்பிடுவதற்கு Seurat இல் SCTransform (v2) இயல்பாக்குதல் பணிப்பாய்வு பயன்படுத்தினோம் (மேலே உள்ள அதே அளவுருக்களைப் பயன்படுத்தி). கணக்கீட்டு செயல்திறனுக்காக தனிப்பட்ட தரவுத்தொகுப்புகள் அசல் கிளஸ்டருக்கு 500 செல்கள் அல்லது கோர்கள் வரை தோராயமாக துணைக்குழு செய்யப்பட்டன. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டதைப் போன்ற அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தி, கிளஸ்டர் மேலெழுதல் என்பது குறிப்பு கிளஸ்டரின் லேபிளுடன் மேலெழுதப்பட்ட ஒவ்வொரு பூல் செய்யப்பட்ட கிளஸ்டரிலும் உள்ள செல்கள் அல்லது கருக்களின் விகிதமாக வரையறுக்கப்பட்டது. GluNகளை மேலும் வகைப்படுத்த, எங்கள் GluN செல்களுக்கு குறிப்பு தரவுத்தொகுப்பு லேபிள்களை ஒதுக்க, GluN துணைக்குழு தரவுக்கான Seurat இன் TransferData பணிப்பாய்வுகளைப் பயன்படுத்தினோம்.
t-hCO மற்றும் hCO மாதிரிகளின் உலகளாவிய டிரான்ஸ்கிரிப்டோமின் முதிர்வு நிலையை மதிப்பிடுவதற்கு, எங்கள் போலி-மொத்த மாதிரிகளை BrainSpan/psychENCODE23 உடன் ஒப்பிட்டோம், இது மனித மூளை வளர்ச்சியை உள்ளடக்கிய ஒரு பெரிய RNA வரிசையைக் கொண்டுள்ளது. கருத்தரித்த 10 வாரங்களுக்குப் பிறகு கார்டிகல் மாதிரிகளிலிருந்து ஒருங்கிணைந்த முறை-இயல்பாக்கப்பட்ட மரபணு வெளிப்பாடு மேட்ரிக்ஸில் நாங்கள் PCA ஐச் செய்தோம், பின்னர், BrainSpan கார்டிகல் மாதிரிகளில் (ஒரு கன மாதிரியைப் பயன்படுத்தி வயதினால் விளக்கப்பட்ட வளர்ச்சி மாறுபாட்டில் 50% க்கும் அதிகமாக வரையறுக்கப்பட்டது) முன்னர் அடையாளம் காணப்பட்ட 5567 மரபணுக்களில் (எங்கள் தரவுகளுடன் சேர்ந்து) 38. கூடுதலாக, முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி எதிர்மறை அல்லாத மேட்ரிக்ஸ் காரணிமயமாக்கலைப் பயன்படுத்தி நரம்பியல் வளர்ச்சியின் முக்கிய டிரான்ஸ்கிரிப்டோம் கையொப்பங்களுடன் தொடர்புடைய மரபணுக்களைப் பெற்றோம். எதிர்மறை அல்லாத மேட்ரிக்ஸ் காரணிமயமாக்கல் நடைமுறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்ட மாதிரி எடைகள் படம் 5b இல் Zhu et al.38 விவரித்த ஐந்து கையொப்பங்களில் ஒவ்வொன்றிற்கும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவுகளுடன் திட்டமிடப்பட்டுள்ளன. மீண்டும், செயல்பாடு சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் குறிப்பான்கள் முன்னர் வெளியிடப்பட்ட ஆய்வுகளிலிருந்து பெறப்பட்டன. குறிப்பாக, துணை அட்டவணை 3 Hrvatin et al.16 இலிருந்து காட்சி தூண்டுதலுக்குப் பிறகு, எலி காட்சி புறணி snRNA-seq சேகரிப்பால் அடையாளம் காணப்பட்ட குளுட்டமாட்டெர்ஜிக் நியூரான்களில் ERG மற்றும் LRG கணிசமாக உயர்ந்தன. மனித-செறிவூட்டப்பட்ட LRGகள் KCl-செயல்படுத்தப்பட்ட மனித கரு மூளை கலாச்சாரங்களிலிருந்து பெறப்பட்டன மற்றும் தூண்டுதலுக்குப் பிறகு 6 மணிநேரம் அறுவடை செய்யப்பட்டன, மேலும் வடிகட்டப்பட்ட மரபணுக்கள் மனிதர்களில் கணிசமாக உயர்ந்தன, ஆனால் கொறித்துண்ணிகளில் அல்ல (துணை அட்டவணை 4). இந்த மரபணு தொகுப்புகளைப் பயன்படுத்தி மரபணு தொகுப்பு செறிவூட்டலின் பகுப்பாய்வு ஒரு வழி ஃபிஷரின் சரியான சோதனையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.
எலிகளுக்கு ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் மயக்க மருந்து கொடுத்து, மூளையை அகற்றி, குளிர்ந்த (தோராயமாக 4°C) ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட (95% O2 மற்றும் 5% CO2) சுக்ரோஸ் கரைசலில் 234 mM சுக்ரோஸ், 11 mM குளுக்கோஸ், 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ஆகியவற்றைக் கொண்ட பகுதிகளுக்கு வைக்கவும். NaH2PO4, 10 mM MgSO4 மற்றும் 0.5 mM CaCl2 (சுமார் 310 mOsm). முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி t-hCO கொண்ட எலி மூளை கொரோனல் பிரிவுகள் (300–400 µm) லைக்கா VT1200 வைப்ரேடோமைப் பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டன39. பின்னர் பிரிவுகள் தொடர்ச்சியான அறை வெப்பநிலை ஆக்ஸிஜனேற்றத்துடன் கூடிய aCSF கொண்ட ஒரு பிரிவு அறைக்கு மாற்றப்பட்டன, இதில் இருந்து தயாரிக்கப்பட்டவை: 10 mM குளுக்கோஸ், 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 மற்றும் 126 mM NaCl (298 mOsm). பதிவு செய்வதற்கு குறைந்தது 45 நிமிடங்களுக்கு முன்பு. பிரிவுகள் மூழ்கிய அறையில் பதிவு செய்யப்பட்டன, அங்கு அவை தொடர்ந்து aCSF (95% O2 மற்றும் 5% CO2 குப்பி) மூலம் துளையிடப்பட்டன. அனைத்து தரவுகளும் அறை வெப்பநிலையில் பதிவு செய்யப்பட்டன. t-hCO நியூரான்கள் 127 mM பொட்டாசியம் குளுக்கோனேட், 8 mM NaCl, 4 mM மெக்னீசியம் ATP, 0.3 mM சோடியம் GTP, 10 mM HEPES, மற்றும் 0.6 mM EGTA, pH 7.2 ஆகியவற்றைக் கொண்ட ஒரு கரைசலில் நிரப்பப்பட்ட ஒரு போரோசிலிகேட் கண்ணாடி பைப்பெட்டுடன் நிறுத்தப்பட்டன, உள் கரைசல் KOH (290 mOsm) உடன் சரிசெய்யப்பட்டது. மீட்க, பயோசைட்டின் (0.2%) பதிவு கரைசலில் சேர்க்கப்பட்டது.
மல்டிகிளாம்ப் 700B பெருக்கி (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மற்றும் டிஜிடேட்டா 1550B டிஜிட்டலைசர் (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி தரவு பெறப்பட்டது, 2 kHz இல் குறைந்த-பாஸ் வடிகட்டப்பட்டது, 20 kHz இல் டிஜிட்டல் மயமாக்கப்பட்டது, மேலும் Clampfit (மூலக்கூறு சாதனங்கள்), Origin (OriginPro) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது. 2021b, OriginLab). மற்றும் தனிப்பயன் MATLAB செயல்பாடுகள் (Mathworks). JPCalc ஐப் பயன்படுத்தி சந்திப்பு திறன் கணக்கிடப்பட்டது மற்றும் உள்ளீடுகள் -14 mV இன் கணக்கிடப்பட்ட மதிப்புக்கு சரிசெய்யப்பட்டன. செயல்பாடு IV, -250 முதல் 750 pA வரை 10-25 pA படிகளில் தொடர்ச்சியான தற்போதைய படிகளைக் கொண்டுள்ளது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, hCO நியூரான்களின் பேட்ச்-கிளாம்ப் பதிவின் போது தாலமஸ், வெள்ளைப் பொருள் மற்றும் S1 இணைப்புகள் தாலமஸ், வெள்ளைப் பொருள் மற்றும் S1 இணைப்புகள் தாலமஸ்கார்டிகல் துண்டுகளில் மின்சாரம் மூலம் தூண்டப்பட்டன. சுருக்கமாக, மூளை 10° கோணத்தில் சாய்ந்த ஒரு 3D அச்சிடும் மேசையில் வைக்கப்பட்டது, மேலும் மூளையின் முன்பகுதி 35° கோணத்தில் வெட்டப்பட்டது. பின்னர் மூளை வெட்டப்பட்ட மேற்பரப்பில் ஒட்டப்பட்டு பிரிக்கப்பட்டு, தாலமஸ்கார்டிகல் நீண்டு செல்லும் அச்சுகளைப் பாதுகாத்தது. இருமுனை டங்ஸ்டன் மின்முனைகள் (0.5 MΩ) இரண்டாவது மைக்ரோமேனிபுலேட்டரில் பொருத்தப்பட்டு, ஒரு செல்லுக்கு நான்கு பகுதிகளைத் தூண்டுவதற்கு மூலோபாய ரீதியாக நிலைநிறுத்தப்பட்டன (உள் காப்ஸ்யூல், வெள்ளைப் பொருள், S1 மற்றும் hCO). 0.03–0.1 Hz இல் 300 µA கட்ட தூண்டுதலுக்குப் பிறகு சினாப்டிக் பதில்களைப் பதிவு செய்யவும்.
hChR2-வெளிப்படுத்தும் hCO நியூரான்கள் 480 nm இல் செயல்படுத்தப்பட்டு, LED (Prizmatix) மூலம் உருவாக்கப்பட்ட ஒளி துடிப்புகள் ×40 புறநிலை (0.9 NA; ஒலிம்பஸ்) மூலம் செல்களுக்கு அருகில் hChR2 வெளிப்பாட்டைப் பதிவு செய்யப் பயன்படுத்தப்பட்டன. ஒளிரும் புல விட்டம் தோராயமாக 0.5 மிமீ மற்றும் மொத்த சக்தி 10-20 மெகாவாட் ஆகும். துடிப்பு அகலம் 10 எம்எஸ் ஆக அமைக்கப்பட்டது, இது நடத்தை கற்றல் பரிசோதனையின் போது கொடுக்கப்பட்ட துடிப்புக்கு ஒத்திருக்கிறது. 1 முதல் 20 ஹெர்ட்ஸ் வரை பல்வேறு தூண்டுதல் அதிர்வெண்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன, ஆனால் தொடரின் முதல் துடிப்பு மட்டுமே அளவீட்டுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டது. சினாப்டிக் தடுப்பு அல்லது எளிதாக்கும் பாதைகளில் விளைவைக் குறைக்க ரயில்களுக்கு இடையிலான இடைவெளிகள் பொதுவாக 30 வினாடிகளுக்கு மேல் இருக்கும். hChR2 பதில் மோனோசினாப்டிக்தா என்பதை சோதிக்க, EPSC எதிர்வினை மறைந்து போகும் வரை குளியலறையில் TTX (1 μM) ஐப் பயன்படுத்தினோம், பின்னர் 4-அமினோபிரிடைன் (4-AP; 100 μM) ஐப் பயன்படுத்தினோம். பொதுவாக, LED எரிப்புக்கும் EPSC உருவாக்கத்திற்கும் இடையில் சற்று நீண்ட தாமதத்துடன், சில நிமிடங்களுக்குள் பதில் திரும்பப் பெறப்படும். பதில் AMPA ஏற்பிகளால் இயக்கப்படுகிறதா என்பதை சோதிக்க NBQX (10 μM) பயன்படுத்தப்பட்டது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி கூர்மையான hCO பிரிவுகள் உருவாக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, hCO பிரிவுகள் 4% அகரோஸில் பதிக்கப்பட்டு 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 மற்றும் 10 mM d-(+) -குளுக்கோஸ் கொண்ட கலங்களுக்கு மாற்றப்பட்டன. பிரிவுகள் லைக்கா VT1200 அதிர்வைப் பயன்படுத்தி அறை வெப்பநிலையில் 200–300 µm இல் வெட்டப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் ASF இல் சேமிக்கப்பட்டன. பின்னர், முழு செல்களின் பேட்ச்-கேம்ப் பதிவு hCO பிரிவுகளில் நேரடி ஸ்லைஸ்ஸ்கோப் நுண்ணோக்கியின் (சயின்டிஃபிகா) கீழ் செய்யப்பட்டது. பிரிவுகள் aCSF (95% O2 மற்றும் 5% CO2) மூலம் துளையிடப்பட்டன, மேலும் அறை வெப்பநிலையில் செல் சமிக்ஞைகள் பதிவு செய்யப்பட்டன. 127 mM பொட்டாசியம் குளுக்கோனேட், 8 mM NaCl, 4 mM மெக்னீசியம் ATP, 0.3 mM சோடியம் GTP, 10 mM HEPES, மற்றும் 0.6 mM EGTA, உள் pH 7, 2 ஆகியவற்றைக் கொண்ட கரைசலால் நிரப்பப்பட்ட போரோசிலிகேட் கண்ணாடி பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி hCO நியூரான்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன, இது KOH (ஆஸ்மோலாரிட்டி 290) உடன் சரிசெய்யப்பட்டது. மீட்பு நோக்கங்களுக்காக, உள் கரைசலில் 0.2% பயோசைட்டினைச் சேர்க்கவும்.
மல்டிகிளாம்ப் 700B பெருக்கி (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மற்றும் டிஜிடேட்டா 1550B டிஜிட்டலைசர் (மூலக்கூறு சாதனங்கள்) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி கிளாம்பெக்ஸ் (கிளாம்பெக்ஸ் 11.1, மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மூலம் தரவு பெறப்பட்டது, 2 kHz இல் குறைந்த-பாஸ் வடிகட்டப்பட்டு, 20 kHz இல் டிஜிட்டல் மயமாக்கப்பட்டு, பகுப்பாய்வு, மூலக்கூறு சாதனங்கள்) மற்றும் தனிப்பயன் MATLAB செயல்பாடுகளுக்காக கிளாம்ப்ஃபிட் (பதிப்பு 10.6) ஐப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (MATLAB 2019b, Mathworks). சந்திப்பு திறன் JPCalc ஐப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டது மற்றும் உள்ளீடுகள் -14 mV இன் கணக்கிடப்பட்ட சந்திப்பு திறனுக்கு சரிசெய்யப்பட்டன. செயல்பாடு IV -50 முதல் 250 pA வரை 5-10 pA படிகளில் தொடர்ச்சியான தற்போதைய படிகளைக் கொண்டுள்ளது.
கிள்ளப்பட்ட நியூரான்களின் உருவவியல் மறுகட்டமைப்பிற்கு, 0.2% பயோசைட்டின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) உள் கரைசலில் சேர்க்கப்பட்டது. செல்கள் ஹேக்கிங் செய்த பிறகு குறைந்தது 15 நிமிடங்களுக்கு முதன்மைப்படுத்தப்படுகின்றன. பதிவுசெய்யப்பட்ட சவ்வு முழுமையாக சீல் செய்யப்படும் வரை பைப்பெட் மெதுவாக 1-2 நிமிடங்கள் உள்ளே இழுக்கப்படுகிறது. பிரிவு உடலியல் நடைமுறையைப் பின்பற்றி, பிரிவுகள் ஒரே இரவில் 4° C இல் 4% PFA இல் சரி செய்யப்பட்டன, PBS X3 உடன் கழுவப்பட்டு, ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-இணைந்த DyLight 549 அல்லது DyLight 405 (வெக்டர் லேப்ஸ்) உடன் 1:1000 என்ற விகிதத்தில் நீர்த்தப்பட்டன. பயோசைட்டின் (2%; சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) நிரப்பப்பட்ட செல்கள் 2 மணி நேரம் அறை வெப்பநிலையில் பேட்ச் கிளாம்ப் பதிவின் போது லேபிளிடப்பட்டன. பின்னர் பிரிவுகள் அக்வாமவுண்ட் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) ஐப் பயன்படுத்தி நுண்ணோக்கி ஸ்லைடுகளில் பொருத்தப்பட்டன, மேலும் அடுத்த நாள் லைக்கா TCS SP8 கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியில் ஒரு எண் துளை ×40 1.3, உருப்பெருக்கம் ×0.9–1.0, xy உடன் எண்ணெய் மூழ்கும் நோக்கத்தைப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன. மாதிரி விகிதம் ஒரு மைக்ரானுக்கு தோராயமாக 7 பிக்சல்கள் ஆகும். 1 µm இடைவெளியில் Z-அடுக்குகள் தொடர்ச்சியாகப் பெறப்பட்டன, மேலும் ஒவ்வொரு நியூரானின் முழு டென்ட்ரிடிக் மரத்தையும் உள்ளடக்கும் வகையில் z-அடுக்கு மொசைக்குகள் மற்றும் லைக்கா அடிப்படையிலான தானியங்கி-தையல் ஆகியவை செய்யப்பட்டன. பின்னர் நியூட்ராப் 40 இடைமுகத்தைப் பயன்படுத்தி நியூரான்கள் அரை-கைமுறையாகக் கண்காணிக்கப்பட்டு SWC கோப்புகள் உருவாக்கப்பட்டன. பின்னர் கோப்புகள் SimpleNeuriteTracer41 Fiji செருகுநிரலில் பதிவேற்றப்பட்டன (ImageJ, பதிப்பு 2.1.0; NIH).
ஸ்டான்போர்ட் பல்கலைக்கழகத்தின் நிறுவன மதிப்பாய்வு வாரியத்தால் அங்கீகரிக்கப்பட்ட ஒரு நெறிமுறையின்படி, தகவலறிந்த ஒப்புதலுடன் மனித புறணி திசுக்கள் பெறப்பட்டன. பின்னடைவு வலிப்பு நோய்க்கான அறுவை சிகிச்சையின் ஒரு பகுதியாக முன் புறணி (நடுத்தர முன் கைரஸ்) பிரித்தெடுப்பதன் மூலம் மனித பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய திசுக்களின் இரண்டு மாதிரிகள் (3 மற்றும் 18 வயது) பெறப்பட்டன. பிரித்தெடுத்த பிறகு, பனி-குளிர் NMDG-aCSF இல் உள்ள திசுக்களை அறுவடை செய்யுங்கள், இதில் பின்வருவன அடங்கும்: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM குளுக்கோஸ், 2 mM தியோரியா, 5 mM சோடியம் அஸ்கார்பேட், 3 mM சோடியம் பைருவேட், 0.5 mM CaCl2 4H2O மற்றும் 10 mM MgSO4 7H2O. செறிவூட்டப்பட்ட ஹைட்ரோகுளோரிக் அமிலத்துடன் pH 7.3-7.4 க்கு டைட்ரேட் செய்யவும். திசுக்கள் 30 நிமிடங்களுக்குள் ஆய்வகத்திற்கு வழங்கப்பட்டன, மேலும் மேலே விவரிக்கப்பட்ட நடைமுறையின்படி கொரோனல் பிரிவுகள் எடுக்கப்பட்டன.
அனைத்து விலங்கு நடைமுறைகளும் ஸ்டான்போர்ட் பல்கலைக்கழக APLAC-அங்கீகரிக்கப்பட்ட விலங்கு பராமரிப்பு வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன. எலிகள் (மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 140 நாட்களுக்கு மேல்) 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்துடன் தூண்டப்பட்டு, அறுவை சிகிச்சையின் போது 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டன. விலங்குகள் ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் சட்டகத்தில் (Kopf) வைக்கப்பட்டு, நீடித்த வெளியீட்டு புப்ரெனோர்பைன் (SR) தோலடி ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டது. மண்டை ஓடு வெளிப்பட்டு, சுத்தம் செய்யப்பட்டு, 3-5 எலும்பு திருகுகள் செருகப்படுகின்றன. t-hCO ஐ இலக்காகக் கொள்ள, MRI படங்களிலிருந்து ஸ்டீரியோடாக்சிக் ஆயத்தொலைவுகளை உருவாக்கினோம். ஆர்வமுள்ள இடத்தில் ஒரு பர் துளை துளையிடப்பட்டு, இழைகள் (400 µm விட்டம், NA 0.48, டோரிக்) hCO மேற்பரப்பிலிருந்து 100 µm கீழே குறைக்கப்பட்டு, UV-குணப்படுத்தக்கூடிய பல் சிமென்ட் (Relyx) மூலம் மண்டை ஓட்டில் பாதுகாக்கப்பட்டன.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி ஃபைபர் ஃபோட்டோமெட்ரிக் பதிவுகள் செய்யப்பட்டன42. தன்னிச்சையான செயல்பாட்டைப் பதிவு செய்ய, எலிகள் ஒரு சுத்தமான கூண்டில் வைக்கப்பட்டன, மேலும் ஃபைபர் ஆப்டிக் ஃபோட்டோமெட்ரிக் தரவு கையகப்படுத்தல் அமைப்புடன் இணைக்கப்பட்ட 400 µm விட்டம் கொண்ட ஃபைபர் ஆப்டிக் பேட்ச் கேபிள் (டோரிக்) பொருத்தப்பட்ட ஃபைபர் ஆப்டிக் கேபிளுடன் இணைக்கப்பட்டது. மோட்டார் செயல்பாட்டின் 10 நிமிட பதிவின் போது, ​​விலங்குகள் கூண்டை ஆராய சுதந்திரமாக இருந்தன. தூண்டப்பட்ட செயல்பாட்டைப் பதிவு செய்ய, எலிகள் (மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 140 நாட்களுக்கு மேல்) தூண்டலுக்காக 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மற்றும் பராமரிப்புக்காக 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் மயக்க மருந்து செய்யப்பட்டன. விலங்கை ஒரு ஸ்டீரியோடாக்டிக் சட்டத்தில் (Kopf) வைக்கவும், t-hCO இன் எதிர் பக்கத்தில் உள்ள விஸ்கர்கள் சுமார் 2 செ.மீ வரை வெட்டப்பட்டு பைசோ எலக்ட்ரிக் ஆக்சுவேட்டருடன் (PI) இணைக்கப்பட்ட ஒரு கண்ணி வழியாக அனுப்பப்படுகின்றன. 400 µm ஃபைபர் ஆப்டிக் பேட்ச் கேபிள் (டோரிக்) பொருத்தப்பட்ட ஃபைபருடன் இணைக்கப்பட்டு தரவு கையகப்படுத்தல் அமைப்புடன் இணைக்கப்பட்டது. t-hCO இன் எதிர் பக்கத்தில் உள்ள விஸ்கர்கள் பின்னர் 20 நிமிட பதிவு காலத்தில் ஒரு பைசோ எலக்ட்ரிக் டிரைவ் மூலம் சீரற்ற நேரங்களில் 50 முறை (20 Hz இல் 2 மிமீ, விளக்கக்காட்சிக்கு 2 வினாடிகள்) திசைதிருப்பப்பட்டன. தனிப்பயன் MATLAB குறியீட்டைக் கொண்டு விலகல் நேரத்தைக் கட்டுப்படுத்த Arduino MATLAB ஆதரவு தொகுப்பைப் பயன்படுத்தவும். டிரான்சிஸ்டர்-டிரான்சிஸ்டர் லாஜிக் (TTL) துடிப்புகளைப் பயன்படுத்தி நிகழ்வுகள் தரவு கையகப்படுத்தல் மென்பொருளுடன் ஒத்திசைக்கப்படுகின்றன.
மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 140 நாட்களுக்கு மேல் ஆன எலிகளுக்கு 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டு, அறுவை சிகிச்சையின் போது 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது. விலங்குகள் ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் பிரேமில் (Kopf) வைக்கப்பட்டு, புப்ரெனோர்பைன் SR மற்றும் டெக்ஸாமெதாசோன் தோலடி முறையில் செலுத்தப்பட்டன. மண்டை ஓடு வெளிப்பட்டு, சுத்தம் செய்யப்பட்டு, 3-5 எலும்பு திருகுகள் செருகப்படுகின்றன. t-hCO ஐ இலக்காகக் கொள்ள, MRI படங்களிலிருந்து ஸ்டீரியோடாக்சிக் ஆயத்தொலைவுகளை உருவாக்கினோம். இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட hCO மீது நேரடியாக ஒரு அதிவேக துரப்பணம் மூலம் ஒரு வட்ட வடிவ கிரானியோட்டமி (தோராயமாக 1 செ.மீ விட்டம்) செய்யப்பட்டது. எலும்பு முடிந்தவரை மெல்லியதாக மாறியதும், ஆனால் முழு எலும்பையும் துளையிடுவதற்கு முன், மீதமுள்ள அப்படியே இடுப்பு வட்டை அகற்ற ஃபோர்செப்ஸைப் பயன்படுத்தி அடிப்படை t-hCO ஐ வெளிப்படுத்துங்கள். கிரானியோட்டமி மலட்டு உப்புநீரால் நிரப்பப்பட்டது, மேலும் ஒரு கவர்ஸ்லிப் மற்றும் ஒரு சிறப்பு ஹெட் பின் ஆகியவை UV-குணப்படுத்தப்பட்ட பல் சிமெண்டால் (Relyx) மண்டை ஓட்டில் இணைக்கப்பட்டன.
நிகான் LWD (×16, 0.8 NA) நோக்கத்துடன் ப்ரூக்கர் மல்டிஃபோட்டான் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி இரண்டு-ஃபோட்டான் இமேஜிங் செய்யப்பட்டது. GCaMP6 இமேஜிங் 920 nm இல் 1.4x ஒற்றை z-தள உருப்பெருக்கம் மற்றும் 8x சராசரி 7.5 fps உடன் செய்யப்பட்டது. எலிகள் 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்தால் தூண்டப்பட்டு 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் பராமரிக்கப்பட்டன. எலிகள் தனிப்பயனாக்கப்பட்ட தலை பொருத்துதலில் வைக்கப்பட்டு லென்ஸின் கீழ் நிலைநிறுத்தப்பட்டன. மோட்டார் செயல்பாட்டின் 3 நிமிட பின்னணி பதிவு பெறப்பட்டது. 20 நிமிட பதிவின் போது, ​​50 பஃப்ஸ் (ஒவ்வொரு விளக்கக்காட்சியும் 100 ms நீளம்) ஒரு பைக்கோஸ்பிரைசரைப் பயன்படுத்தி t-hCO க்கு எதிரே உள்ள விஸ்கர் பேடிற்கு சீரற்ற முறையில் வழங்கப்பட்டன. தனிப்பயன் MATLAB குறியீட்டைக் கொண்டு வெடிப்பு நேரத்தைக் கட்டுப்படுத்த Arduino MATLAB ஆதரவு தொகுப்பைப் பயன்படுத்தவும். TTL பல்ஸ்களைப் பயன்படுத்தி தரவு கையகப்படுத்தல் மென்பொருளுடன் (PrairieView 5.5) நிகழ்வுகளை ஒத்திசைக்கவும். பகுப்பாய்விற்காக, பிஜியில் தொடங்கப்பட்ட MoCo திட்டத்தில் அஃபைன் திருத்தத்தைப் பயன்படுத்தி xy இயக்கத்திற்காக படங்கள் சரி செய்யப்பட்டன. CNMF-E43 ஐப் பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட செல்களிலிருந்து ஃப்ளோரசன்ட் தடயங்களைப் பிரித்தெடுத்தல். ஆர்வமுள்ள ஒவ்வொரு பகுதிக்கும் ஃப்ளோரசன்ஸ் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, dF/F வளைவுகளாக மாற்றப்பட்டு, பின்னர் z-மதிப்பெண்களாக மாற்றப்பட்டது.
எலிகள் (மாற்று அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிறகு 140 நாட்களுக்கு மேல்) 5% ஐசோஃப்ளூரேன் மயக்க மருந்து மூலம் தூண்டப்பட்டு, அறுவை சிகிச்சையின் போது 1-3% ஐசோஃப்ளூரேன் மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டன. விலங்குகள் ஒரு ஸ்டீரியோடாக்சிக் சட்டகத்தில் (Kopf) வைக்கப்பட்டன, மேலும் புப்ரெனோர்பைன் SR மற்றும் டெக்ஸாமெதாசோன் தோலடி ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டன. t-hCO இன் எதிர் பக்கத்தில் உள்ள மீசைகள் சுமார் 2 செ.மீ. வெட்டப்பட்டு, பைசோ எலக்ட்ரிக் ஆக்சுவேட்டருடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு வலை வழியாக திரிக்கப்பட்டன. மண்டை ஓடு வெளிப்பட்டு சுத்தம் செய்யப்படுகிறது. ஒரு துருப்பிடிக்காத எஃகு தரை திருகு மண்டை ஓட்டில் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. t-hCO ஐ இலக்காகக் கொள்ள, MRI படங்களிலிருந்து ஸ்டீரியோடாக்சிக் ஆயத்தொலைவுகளை உருவாக்கினோம். t-hCO க்கு சற்று மேலே ஒரு அதிவேக துரப்பணம் மூலம் ஒரு வட்ட கிரானியோட்டமியை (தோராயமாக 1 செ.மீ விட்டம்) செய்யவும். எலும்பு முடிந்தவரை மெல்லியதாக மாறியதும், ஆனால் முழு எலும்பையும் துளையிடுவதற்கு முன், அடிப்படை t-hCO ஐ வெளிப்படுத்த மீதமுள்ள அப்படியே இடுப்பு வட்டை அகற்ற ஃபோர்செப்ஸைப் பயன்படுத்தவும். 32-சேனல் அல்லது 64-சேனல் உயர்-அடர்த்தி சிலிக்கான் ஆய்வுகள் (கேம்பிரிட்ஜ் நியூரோடெக்) பயன்படுத்தி தரையிலிருந்து தரையில் திருகுகள் வரை தரையிறக்கப்பட்டு, RHD பெருக்கிகள் (இன்டான்) மூலம் முன்கூட்டியே பெருக்கப்பட்டன. ஸ்டெரிலைட் உப்புநீரால் நிரப்பப்பட்ட கிரானியோட்டமி மூலம் மின்முனைகளை இலக்கு தளத்திற்குக் குறைக்க கையாளுபவரைப் பயன்படுத்தவும். ஓபன் எஃபிஸ் தரவு கையகப்படுத்தல் அமைப்பைப் பயன்படுத்தி 30 kHz அதிர்வெண்ணில் தரவு சேகரிப்பு செய்யப்பட்டது. 10 க்கும் மேற்பட்ட சேனல்களில் மிகவும் தொடர்புடைய தாள தன்னிச்சையான செயல்பாட்டைக் கண்டறிந்தபோது மட்டுமே பதிவு தொடர்ந்தது, இது மின்முனைகள் ஒட்டுண்ணியில் அமைந்துள்ளன என்பதைக் குறிக்கிறது (இரண்டு-ஃபோட்டான் கால்சியம் இமேஜிங் தரவை அடிப்படையாகக் கொண்டது). மோட்டார் செயல்பாட்டின் 10 நிமிட பின்னணி பதிவு பெறப்பட்டது. t-hCO இன் எதிர் பக்கத்தில் உள்ள விஸ்கர்கள் பின்னர் 20 நிமிட பதிவு காலத்தில் ஒரு பைசோ எலக்ட்ரிக் டிரைவ் மூலம் சீரற்ற நேரங்களில் 50 முறை (20 Hz இல் 2 மிமீ, விளக்கக்காட்சிக்கு 2 வினாடிகள்) திசைதிருப்பப்பட்டன. Arduino க்கான MATLAB ஆதரவு தொகுப்பைப் (MATLAB 2019b) பயன்படுத்தி, தனிப்பயன் MATLAB குறியீட்டைக் கொண்டு விலகல் நேரத்தைக் கட்டுப்படுத்தவும். தரவு கையகப்படுத்தல் மென்பொருளுடன் நிகழ்வுகளை ஒத்திசைக்க TTL பல்ஸ்களைப் பயன்படுத்தவும்.
ஆப்டிகல் மார்க்கிங் பரிசோதனைகளுக்கு, 473 nm லேசருடன் (Omicron) இணைக்கப்பட்ட 200 µm ஆப்டிகல் பேட்ச் கார்டு (Doric) கிரானியோட்டமியின் மேல் வைக்கப்பட்ட 200 µm ஆப்டிகல் ஃபைபருடன் இணைக்கப்பட்டது. இதற்கு உடனடியாக முன், ஜம்பர் பவரை 20 மெகாவாட்டாக சரிசெய்யவும். ஸ்டெரைல் உப்புநீரால் நிரப்பப்பட்ட கிரானியோட்டமி மூலம் மின்முனைகளை இலக்கு தளத்திற்குக் குறைக்க கையாளுபவரைப் பயன்படுத்தவும். பதிவின் தொடக்கத்தில், 473 nm (அதிர்வெண் 2 Hz, துடிப்பு கால அளவு 10 ms) கொண்ட பத்து துடிப்புகள் வெளியேற்றப்பட்டன. 70% அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட சோதனைகளில் ஒளியின் 10 ms க்குள் ஸ்பைக் பதிலை வெளிப்படுத்தும் செல்கள் என ஒளிச்சேர்க்கை செல்கள் வரையறுக்கப்பட்டன.