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자가조립 신경 소기관은 인간 발달 및 질병 모델링을 위한 유망한 시험관 내 플랫폼입니다. 그러나 오가노이드는 생체 내와 같은 연결성이 부족하여 성숙을 제한하고 행동을 제어하는 ​​다른 회로와의 통합을 방해합니다. 본 연구에서는 인간 줄기세포 유래 피질 오가노이드를 신생아 누드 랫드의 체성감각 피질에 이식하여 감각 및 동기 관련 회로에 통합되는 성숙한 세포 유형을 발달시키는 것을 보여줍니다. MRI는 여러 줄기세포주와 동물에서 이식 후 오가노이드 성장을 확인했으며, 단일 코어 분석은 피질 형성의 진행과 활동 의존적 전사 프로그램의 출현을 보여주었습니다. 실제로 이식된 피질 뉴런은 시험관 내 뉴런보다 더 복잡한 형태적, 시냅스적, 그리고 내막적 특성을 나타내어 티모시 증후군 환자의 신경 결함을 검출할 수 있습니다. 해부학적 및 기능적 추적을 통해 이식된 소기관이 시상피질 및 피질피질로부터 입력을 받는다는 것이 밝혀졌으며, 생체 내 신경 활동 기록은 이러한 입력이 인간 세포에서 감각 반응을 생성할 수 있음을 시사합니다. 마지막으로, 대뇌피질 오가노이드는 쥐 뇌 전체로 축삭을 확장하고, 광유전학적 활성화는 보상 추구 행동으로 이어집니다. 따라서 이식된 인간 대뇌피질 뉴런은 성숙하고 숙주의 행동을 제어하는 ​​회로에 참여합니다. 이러한 접근법을 통해 다른 방법으로는 검출할 수 없는 환자 유래 세포에서 가닥 수준의 표현형 검출이 가능해질 것으로 기대합니다.
발달 중인 인간의 뇌는 세포가 증식, 분화, 이동, 그리고 연결되어 기능적인 신경 회로를 형성하는 놀라운 자기 조직화 과정입니다. 이 회로는 감각 경험을 통해 더욱 정교해집니다. 특히 질병과 관련하여 인간의 뇌 발달을 이해하는 데 있어 핵심적인 문제는 뇌 조직에 대한 접근성 부족입니다. 인간 피질 오가노이드(hCO, 인간 피질구라고도 함)를 포함한 자기 조직화 세포소기관은 2, 3, 4, 5, 6을 생성할 수 있습니다. 그러나 몇 가지 한계점으로 인해 신경 회로의 발달 및 기능을 이해하는 데 있어 hCO의 광범위한 적용이 제한됩니다. 특히, 생체 내에 존재하는 특정 미세환경 및 감각 입력의 부재가 hCO 성숙을 제한하는지 여부는 불분명합니다. 또한, hCO는 행동 결과를 생성할 수 있는 회로에 통합되지 않기 때문에 유전적으로 복잡하고 행동적인 신경정신 질환을 모델링하는 데 있어 현재로서는 그 유용성이 제한적입니다.
온전한 살아있는 뇌에 hCO를 이식하면 이러한 한계를 극복할 수 있습니다. 이전 연구에서는 설치류 피질에 이식된 인간 뉴런이 생존하고, 투사하며, 설치류 세포와 소통할 수 있음을 보여주었습니다7,8,9,10,11,12. 그러나 이러한 실험은 일반적으로 성체 동물을 대상으로 수행되므로 시냅스 및 축삭 통합이 제한될 수 있습니다. 본 연구에서는 hiPS 세포에서 유래한 3D hCO를 가소성 발달 초기 단계의 면역결핍 쥐의 일차 체성감각 피질(S1)에 이식하는 이식 패러다임을 제시합니다. 이식된 hCO(t-hCO) 뉴런은 상당한 성숙 과정을 거치고, 시상피질 및 피질-피질 입력을 받아 감각 반응을 유도하며, 축삭 돌기를 쥐 뇌로 확장하여 보상 추구 행동을 유도합니다. 티모시 증후군(TS)을 앓는 환자에게 t-hCO의 장기간 성숙은 신경 결함을 드러냈습니다. 티모시 증후군은 전압 민감성 L형 CaV1.2 칼슘 채널(CACNA1C에 의해 인코딩됨)의 돌연변이로 인해 발생하는 심각한 유전적 질환입니다.
생체 내 회로에서 인간 피질 뉴런을 연구하기 위해, 출생 초기 무흉선 랫드(출생 후 3~7일)의 S1에 온전한 3D hCO를 입체적으로 이식했습니다(그림 1a 및 그림 1a-c의 확장 데이터). 이 시점에서 시상피질 및 피질피질 축삭 돌기는 아직 S1 신경 지배를 완료하지 않았습니다(참고 문헌 13). 따라서 이 접근법은 내인성 회로에 미치는 영향을 최소화하면서 t-hCO 통합을 극대화하도록 설계되었습니다. 생체 동물에서 t-hCO의 위치를 ​​시각화하기 위해, 이식 2~3개월 후 랫드의 T2 강조 MRI 뇌 재구성을 수행했습니다(그림 1b 및 확장 데이터, 그림 1d). t-hCO는 쉽게 관찰되었으며 t-hCO의 부피 측정은 고정 슬라이스에서 계산된 것과 유사했습니다(확장 데이터 그림 1d,e; P > 0.05). t-hCO는 쉽게 관찰되었으며 t-hCO의 부피 측정은 고정 슬라이스에서 계산된 것과 유사했습니다(확장 데이터 그림 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблудались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов(расширенные данные, рис.1d, e; t-hCO는 쉽게 관찰되었으며, 체적 t-hCO 측정값은 고정 단면에 대해 계산된 값과 유사했습니다(확장 데이터, 그림 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO 량은 体积测weight值与从固determined切 Pictures 计算的测值切似（扩计数据图1d、e;P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблудался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов(расширенные данные, рис.1d, e; t-hCO는 쉽게 관찰되었으며, 체적 t-hCO 측정값은 고정 단면에 대해 계산된 값과 유사했습니다(확장 데이터, 그림 1d, e; P > 0.05).영어: 우리는 이식된 동물의 81%에서 이식 후 약 2개월 후에 t-hCO를 측정했습니다(n = 72마리 동물; 10개의 hiPS 세포주에서 얻은 hCO; 보충 표 1의 hiPS 세포주). 이 중 87%는 대뇌 피질에 위치했습니다(그림 1c). 동일한 이식 쥐에서 여러 시점에서 연속 MRI 스캔을 수행하여 3개월 이내에 t-hCO 부피가 9배 증가한 것을 발견했습니다(그림 1d 및 확장 데이터, 그림 1f). 이식된 동물은 이식 후 12개월에 높은 생존율(74%)을 보였습니다(확장 데이터, 그림 1g 및 보충 표 2). 명백한 운동 또는 기억 장애, 신경교증 또는 뇌파(EEG)는 발견되지 않았습니다. 데이터 그림 1g 및 보충 표 2). 1h–m 및 3e).
a, 실험 설계의 개략도. hiPS 세포에서 유래한 hCO를 분화 30-60일째에 신생 누드 래트의 S1에 이식하였다. b, 이식 2개월 후 S1에서 t-hCO를 보여주는 T2 강조 관상면 및 수평 MRI 이미지. 스케일 바, 2mm. c, 각 hiPS 세포주(n = 108, 막대 안의 숫자는 hIPS 세포주당 t-hCO 양을 나타냄) 및 피질 또는 피질하 위치(n = 88)에 대한 생착 성공률의 정량화. d, 관상 동맥의 MRI 이미지(왼쪽; 스케일 바, 3mm) 및 3개월 동안 t-hCO의 증가를 보여주는 해당 3D 체적 재구성(스케일 바, 3mm). e, 래트 대뇌 피질의 t-hCO 패턴 검토. 스케일 바, 1mm. f, 왼쪽 위에서 오른쪽으로 표시된 t-hCO의 대표적인 면역세포화학적 이미지(분화 중): PPP1R17(4개월령), NeuN(8개월령), SOX9 및 GFAP(8개월령), PDGFRα(8개월령), MAP2(8개월령) 및 IBA1(8개월령). 스케일 바, 20µm. HNA의 공발현은 인간 유래 세포를 나타냅니다. g, snRNA-seq: Seurat 통합 후 모든 고품질 t-hCO 핵의 통합 다양체 및 투영(UMAP) 차원 감소 이미징(n=3 t-hCO 샘플, n=2 hiPS 세포주). 성상세포, 성상세포 계통의 세포; cyc prog, 순환 전구세포; GluN DL, 심부 글루타메르그성 뉴런; GluN DL/SP, 심부 및 층상하부 글루타메르그성 뉴런; GluN UL, 상층 글루타메르그성 뉴런; 과소돌기세포, 과소돌기세포; OPC, 과소돌기세포 전구 세포; RELN, 릴린 뉴런. h, 유전자 온톨로지(GO) 용어 풍부 분석은 t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 hCO 글루타메르그성 뉴런과 비교하여 상당히 상향 조절된(조정된 P < 0.05, 변화 배수 > 2, 핵의 최소 10%에서 발현) 유전자를 분석합니다. h, 유전자 온톨로지(GO) 용어 풍부 분석은 t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 hCO 글루타메르그성 뉴런과 비교하여 상당히 상향 조절된(조정된 P < 0.05, 변화 배수 > 2, 핵의 최소 10%에서 발현) 유전자를 분석합니다. h, Анализ обогачительной активацией (скоректированный P <0,05, кратность) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравненив с Gлутаматергическими нейронами hCO. h, t-hCO 글루타메르그성 뉴런과 hCO 글루타메르그성 뉴런을 비교했을 때 활성화가 유의미한 유전자에 대한 유전자 온톨로지(GO) 용어 풍부 분석(조정된 P<0.05, 변화 배수 >2, 최소 10% 핵에서의 발현). h，与hCO 谷氨酸能神经元比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变ization> 2，至少10%的细胞核中表达) 的基因本体论(GO) 术语富集分析. h , 与 hco 谷氨酸 能 元 엇比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 , 变化 变化> 2 , 至少10% 적 核中 表达) 基因 基因 基因 적 적 적 적 적 적 적 적 적 적 적 적 적 적 본본체(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравненик с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический(GO) 분석 터미널을 살펴보세요. h, 유전자는 t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 hCO 글루타메르그성 뉴런에 비해 상당히 상향 조절되었습니다(조정된 P < 0.05, 변화 배수 > 2, 핵의 최소 10%에서 발현). 풍부화 항목의 온톨로지(GO) 분석.점선은 0.05의 aq 값을 나타냅니다. i, 성인 운동 피질 22 snRNA-seq 참조 데이터세트에서 라벨 전이를 이용하여 t-hCO에서 GluN 세포 유형의 UMAP 영상화. CT — 피질시상세포, ET — 대뇌외 세포, IT — 내측대뇌세포, NP — 투사 근처.
그런 다음 t-hCO의 세포 구조와 전반적인 세포 구성을 평가했습니다. 쥐 내피세포의 항체 염색은 t-hCO에 의한 혈관 형성을 확인했고, IBA1 염색은 이식편 전체에 걸쳐 쥐 미세아교세포의 존재를 확인했습니다(그림 1f 및 확대 데이터, 그림 3c, d). 면역염색은 PPP1R17(피질 전구세포), NeuN(뉴런), SOX9 및 GFAP(신경교세포 유래 세포) 또는 PDGFRα(희소돌기아교세포 전구세포)를 공동 발현하는 인간 핵 항원(HNA) 양성 세포를 확인했습니다(그림 1f). 단일 세포 분해능에서 t-hCO의 세포 구성을 연구하기 위해, 분화 약 8개월 후 단일 코어 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 수행했습니다. 쥐의 핵을 대량 여과 및 제거하여 21,500개의 고품질 인간 단핵구 지도를 얻었다(그림 1g 및 확대 데이터, 그림 4a, b). 전형적인 세포 유형 마커의 발현 양상은 심부 및 표층 글루탐산성 뉴런, 순환 전구세포, 희소돌기아교세포, 그리고 성상세포 계통을 포함한 주요 피질 세포 군집을 확인했다(그림 1g, 확대 데이터, 그림 4c 및 보충 표 3). SATB2와 CTIP2에 대한 면역염색 결과, 피질 아형이 존재함에도 불구하고 t-hCO는 명확한 해부학적 층화를 보이지 않았다(확장 데이터, 그림 3a). 단계적으로 일치하는 snRNA-seq hCO는 희소돌기아교세포의 부재와 GABA성 뉴런의 존재를 포함한 몇 가지 예외를 제외하고는 전반적으로 유사한 세포군을 생성했는데, 이는 이전에 보고된 측면 전구세포에 유리한 시험관 내 조건을 반영하는 것으로 보인다15 (확장 데이터, 그림 4f-i 및 보충 표 4). 차등 유전자 발현 분석 결과, t-hCO와 hCO 간의 글루타메르트성 뉴런에서 유의미한 차이가 나타났으며(보충 표 5), 여기에는 시냅스 신호전달, 수상돌기 위치, 전압 개폐성 채널 활성 등 뉴런 성숙과 관련된 유전자 세트의 활성화가 포함되었다(그림 1h 및 보충 표 5). 따라서, 피질 글루타메르트성 t-hCO 뉴런은 전사 성숙이 가속화되었다.
t-hCO의 이러한 전사 변화가 시험관 내 hCO와 생체 내 t-hCO 간의 형태학적 차이와 관련이 있는지 확인하기 위해, 분화 7~8개월 후 급성 절편에서 단계적으로 바이오시틴으로 채워진 hCO와 hCO를 재구성했습니다. hCO 뉴런(그림 2a). t-hCO 뉴런은 시험관 내 hCO에 비해 유의하게 크고, 세포체 직경이 1.5배, 수상돌기 수가 2배 더 많았으며, 전체 수상돌기 길이가 6배 증가했습니다(그림 2b). 또한, t-hCO 뉴런에서 hCO 뉴런보다 수상돌기가 유의하게 더 높은 밀도를 보였습니다(그림 2c). 이는 t-hCO 뉴런이 광범위한 수상돌기 신장 및 분지를 겪으며, 지속적인 세포 증식과 함께 이식 후 t-hCO의 급격한 성장에 기여할 수 있음을 시사합니다(그림 1d 및 확장 데이터 그림 1f). 이를 통해 전기생리학적 특성을 조사하게 되었습니다. 막 용량은 8배 더 높았고(확장된 데이터, 그림 8d), 휴식 상태 막 전위는 더욱 과분극되었고(약 20mV), 전류 주입은 hCO 뉴런보다 t-hCO 뉴런에서 더 높은 최대 여기 속도를 유도했습니다. 시험관 내(그림 2d), e), 이는 t-hCO의 더 크고 더 복잡한 형태학적 특징과 일치합니다. 또한 자발적인 흥분성 시냅스 후 전류 사건(EPSC)의 빈도는 t-hCO 뉴런에서 상당히 더 높았습니다(그림 2f). 이는 t-hCO 뉴런에서 관찰된 수상돌기 가시의 밀도 증가가 기능적 흥분성과 관련이 있음을 시사합니다. 성적 시냅스. 우리는 표지된 글루타메르트성 뉴런을 기록하여 시험관 내 hCO 뉴런의 미성숙 특성을 확인했습니다(확장된 데이터, 그림 6a-c).
a, 8개월간 분화한 후 바이오시틴으로 채워진 hCO 및 t-hCO 뉴런의 3D 재구성. b, 형태학적 특징의 정량화(n = 8 hCO 뉴런, n = 6 t-hCO 뉴런; **P = 0.0084, *P = 0.0179 및 ***P < 0.0001). b, 형태학적 특징의 정량화(n = 8 hCO 뉴런, n = 6 t-hCO 뉴런; **P = 0.0084, *P = 0.0179 및 ***P < 0.0001). б, количественная оценка morfoлогических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, 형태학적 특징의 정량화(n=8 hCO 뉴런, n=6 t-hCO 뉴런; **P=0.0084, *P=0.0179, 및 ***P<0.0001). b, 형태학적 특성의 질량화(n = 8 个hCO 에너지원, n = 6 t-hCO 에너지원; **P = 0.0084, *P = 0.0179 및 ***P < 0.0001). b, 형태학적 특성의 질량화(n = 8 个hCO 에너지원, n = 6 t-hCO 에너지원; **P = 0.0084, *P = 0.0179 및 ***P < 0.0001). б, количественная оценка morfoлогических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, 형태학적 특징의 정량화(n=8 hCO 뉴런, n=6 t-hCO 뉴런; **P=0.0084, *P=0.0179, 및 ***P<0.0001).c, 8개월 분화 후 hCO 및 t-hCO 수상돌기 가지의 3D 재구성. 빨간색 별표는 추정 수상돌기 가시를 나타냄. 수상돌기 가시 밀도 정량화(n = hCO 뉴런 8개, n = t-hCO 뉴런 6개; **P = 0.0092). d, 정지막 전위의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). d, 정지막 전위의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, 정지막 전위 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位량화(n = 25 hCO 신에너지원, n = 16 t-hCO 신에너지원;***P < 0.0001). d, 静息膜电位량화(n = 25 hCO 신에너지원, n = 16 t-hCO 신에너지원;***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, 정지막 전위 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). e, 전류 주입 증가에 의해 유도된 hCO 및 t-hCO에서의 반복적인 동작 전위 발사 및 최대 발사율의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). e, 전류 주입 증가에 의해 유도된 hCO 및 t-hCO에서의 반복적인 동작 전위 발사 및 최대 발사율의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO 및 t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, 전류 증가에 의해 유도된 hCO 및 t-hCO에서의 액션 전위 재발화 및 최대 발사율 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; *** P < 0.0001). e, 일반적으로 hCO 와 t-hCO 多放电, 以及最大放电率 량화 (n = 25 个hCO 神经注, n = 16 t-hCO神经원;***P < 0.0001)。 E , 以及 最 大 량화 （(n = 25 个 hco , n = 16 个 t-hco)神经 ; *** p<0.0001) 。 e, повторявение потенциала действия hCO 및 t-hCO, вызванное увеличением подачи toка, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, 전류 공급 증가에 의해 유도된 hCO 및 t-hCO 작용 전위의 반복 발사와 최대 발사 속도의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 16 t-hCO 뉴런; *** P < 0.0001). f, 분화 8개월 후의 hCO 및 t-hCO 뉴런의 자발적 EPSC(sEPSC) 및 시냅스 사건 빈도의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 17 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). f, 분화 8개월 후의 hCO 및 t-hCO 뉴런의 자발적 EPSC(sEPSC) 및 시냅스 사건 빈도의 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 17 t-hCO 뉴런; ***P < 0.0001). f, нейронах hCO 및 t-hCO через 8 месяцев диференцировки 및 количественная оценка частоты에서 EPSC(sEPSC) 지원 синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, 8개월 분화 후 hCO 및 t-hCO 뉴런의 자발적 EPSC(sEPSC) 및 시냅스 사건 비율 정량화(n=25 hCO 뉴런, n=17 t-hCO 뉴런; ***P<0.0001). f,분화8 个月时hCO 및 t-hCO 신원원중 자체 자체성EPSC(sEPSC), 以及突触事件频率량화(n = 25 hCO 신원, n = 17 t-hCO 신원;***P < 0.0001) . f,분화8 个月时hCO 및 t-hCO 神经元中的自发性EPSCs(sEPSCs), 以及突触事件频率량량匼（n = 25hCO 神率량량匼（n = 25hCO 神率량량匼（n = 25hCO P < 0.0001) . f, нейронах hCO 및 t-hCO через 8 месяцев диференцировки 및 количественная оценка частоты에서 EPSC(sEPSC) 지원 синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, 8개월 분화 후 hCO 및 t-hCO 뉴런의 자발적 EPSC(sEPSC) 및 시냅스 사건 비율 정량화(n = 25 hCO 뉴런, n = 17 t-hCO 뉴런; *** P<0.0001).bf의 경우, 1208-2번 줄의 hCO와 t-hCO는 병렬로 유지되는 동일한 분화 배치에서 가져왔습니다. g, 유전자 세트 풍부 분석(단측 Fisher 정확 검정)은 생체 내 마우스 연구16에서 확인된 조기 반응(ERG)과 후기 반응(LRG) 활동 의존 유전자 세트와 시험관 내 뉴런17에서 확인된 인간 특이적 LRG를 갖는 hCO 글루타메르그성 뉴런과 비교하여 t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 유의하게 상향 조절된(조정된 P < 0.05, 변화 배수 > 2, 핵의 최소 10%에서 발현) 유전자의 유전자 세트입니다. g, 유전자 세트 풍부 분석(단측 Fisher 정확 검정)은 생체 내 마우스 연구16에서 확인된 조기 반응(ERG)과 후기 반응(LRG) 활동 의존 유전자 세트와 시험관 내 뉴런17에서 확인된 인간 특이적 LRG를 갖는 hCO 글루타메르그성 뉴런과 비교하여 t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 유의하게 상향 조절된(조정된 P < 0.05, 변화 배수 > 2, 핵의 최소 10%에서 발현) 유전자의 유전자 세트입니다. g, анализ обогачительнобора genов (односtorонний точный критерий Фишера) genов со значительной activацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравненик с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего(ERG), так и позднего(LRG) генов, зависяЂх от aktивности, идентифицированных в исследовании на мышах на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, t-hCO 글루타메르그성 뉴런에서 유의미한 활성화(조정된 P<0.05, 변화 배수 >2, 핵의 최소 10%에서 발현)를 보이는 유전자의 유전자 세트 풍부도 분석(단측 Fisher 정확 검정)을 생체 내 마우스16에서 확인된 초기(ERG) 및 후기(LRG) 활동 의존 유전자의 hCO 글루타메르그성 뉴런 세트와 시험관 내 뉴런의 인간 특이적 LRG17와 비교한 결과입니다. g,t-hCO谷氨酸能신经원与hCO谷氨酸能神经원상比,t-hCO谷氨酸能신经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2,10%의 细胞核中表达)에서 基因集富集分析（单侧Fisher精确检验）从体内小鼠研究中에서 고정 早期反应 (ERG) 화晚期반작용(LRG) 活性依赖性基因性基因组16 과 체외신经元17 中的人类特异性LRG. g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 , 倍数> 2 ,至少 至少 10% 적 细胞 核中 表达) 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应反应 와 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 과 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно activizированы по сравненик с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогаЂения набора генов (односторонний точный 테스트 Фишера) ранего ответа (ERG) 및 позднего гены, зависячие от ACTивности ответа(LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах на мышах16 및 нейронах in vitro17. LRG, 전문 기술. g, t-hCO 글루타메르그성 뉴런은 hCO 글루타메르그성 뉴런과 비교하여 상당히 상향 조절되었습니다(조정된 P<0.05, 변화 배수 >2, 최소 10% 조기 반응(ERG) 및 후기 반응 유전자 풍부 분석(단측 Fisher 정확 검정) 생체 내 마우스16 및 시험관 내 뉴런17에서 확인된 반응 활동 의존 유전자(LRG). 인간 특이적 LRG.점선은 본페로니 보정 P 값 0.05를 나타냅니다. h, GluN 유전자 발현(각 유전자의 유사 패키지 및 스케일링)은 t-hCO 글루탐산성 뉴런의 LRG 유전자의 snRNA-seq 복제본에서 유의미하게 상향조절되었습니다. i, t-hCO(위) 및 hCO(아래) 뉴런에서 SCG2 발현을 보여주는 면역염색. 흰색 화살표는 SCG2+ 세포를 가리킵니다. 스케일 바, 25 µm. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현됩니다.
ex vivo 슬라이스에서 관찰된 t-hCO의 활성 증가를 바탕으로, snRNA-seq 분석 결과 시험관 내 hCO에 비해 t-hCO에서 유전자 전사체의 활성 의존적 상향조절이 확인되었습니다. 글루탐산염성 t-hCO 뉴런은 후기 반응 활성을 조절하는 유전자를 더 높은 수준으로 발현했습니다(그림 2g, h). 이는 마우스와 인간 뉴런을 대상으로 한 이전 연구에서도 확인되었습니다.16,17 예를 들어, 영장류 특이적 활성 조절 유전자인 BDNF18, SCG2, 그리고 OSTN은 hCO 뉴런에 비해 t-hCO 뉴런에서 발현이 증가했습니다(그림 2g-i). 따라서 전사, 형태 및 기능 분석 결과, t-hCO 뉴런은 hCO 뉴런에 비해 향상된 성숙 특성을 보였습니다.
t-hCO 성숙과 인간 뇌 발달의 연관성을 더욱 자세히 평가하기 위해, 태아 및 성체 대뇌 피질 세포 유형19,20과 성체21,22의 전사체 비교를 수행했으며, 발달 중 대뇌 피질 유전자 발현23에 대한 광범위한 데이터도 분석했습니다(확장 데이터, 그림 5). 이전 연구24와 비교했을 때, 분화 7~8개월 시점의 전반적인 hCO 및 t-hCO 전사체 성숙 상태는 생체 내 발달 시점과 대체로 일치하며, 태아 후기와 가장 유사한 것으로 나타났습니다(확장 데이터, 그림 5a). 특히, t-hCO에서 동일 연령의 hCO에 비해 전사체 성숙도가 증가했으며, 시냅스 형성, 성상세포 형성, 그리고 수초 형성과 관련된 전사체 활성화도 관찰되었습니다(확장 데이터, 그림 5b-d). 세포 수준에서, t-hCO에서 더 얇은 피질 아형을 발견했으며, 글루타메르그성 뉴런 군집이 성인 L2/3, L5, L6 뉴런 아형과 겹치는 것을 확인했습니다(그림 1i). 반면, 글루타메르그성 t-hCO 뉴런과 태아 피질 뉴런 간의 군집 겹침은 임신 중반에 더 제한적이었습니다(확대 데이터, 그림 5e-j). t-hCO 뉴런이 인간의 출생 후 신피질 뉴런과 기능적으로 유사한지 확인하기 위해, 인간 출생 후 피질의 날카로운 단면에서 인간 L2/3 피라미드 뉴런의 전기생리학적 기록과 해부학적 재구성을 수행했습니다(확대 데이터, 그림 7a). L2/3 피라미드 뉴런의 전기생리학적 특성은 t-hCO 피라미드 뉴런의 전기생리학적 특성과 유사했습니다(확대 데이터, 그림 7e). 형태학적으로, 출생 후 인간 샘플의 L2/3 뉴런은 hCO보다 t-hCO와 더 유사했지만, L2/3 세포는 더 길었고, 전체적으로 더 많은 가지를 포함하고 있었고, 가시 밀도가 더 높았습니다(그림 3g 및 확장된 데이터, 그림 7b-). G).
a, 대조군과 TS hiPS 세포주에서 생성된 hCO를 신생 쥐에 이식한 결과. b, 분화 8개월 후 바이오시틴으로 채워진 t-hCO 뉴런의 3D 재구성 결과. c, 평균 수상돌기 길이 정량화 결과(대조군 뉴런 n = 19개, TS 뉴런 n = 21개; **P = 0.0041). d, 8개월 분화 후 대조군과 TS t-hCO에서 3D로 재구성된 수상돌기 가지와 수상돌기 가시 밀도 정량화(n = 16개 대조군 뉴런, n = 21개 TS 뉴런, ***P < 0.0001). d, 8개월 분화 후 대조군과 TS t-hCO에서 3D로 재구성된 수상돌기 가지와 수상돌기 가시 밀도 정량화(n = 16개 대조군 뉴런, n = 21개 TS 뉴런, ***P < 0.0001). d, 3D-reконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8개월 분화 후 대조군과 t-hCO TS의 수상돌기 가지의 3D 재구성 및 수상돌기 가시 밀도 정량화(대조군 뉴런 n=16개, TS 뉴런 n=21개, ***P<0.0001). d,분화8 个对时对光 및 TS t-hCO 의 3D 建树突分支,以及树突棘密密密密密密密密資化(n = 16个对光经支，n = 21个TS 神经支，***P < 0.0001). d , 분할 8 个 对 사진 과 ts t-hco 의 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密島 량화 （n = 16 个 个 个 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001)。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8개월 분화 후 대조군 수상돌기 가지와 TS t-hCO의 3D 재구성 및 수상돌기 가시 밀도 정량화(대조군 뉴런 n=16개, TS 뉴런 n=21개, ***P<0.0001).빨간색 별표는 추정 수상돌기 가시를 나타냅니다. e, 8개월 분화 후 대조군과 TS t-hCO 뉴런에서 자발적으로 형성된 EPSC. f, 누적 빈도 그래프 및 시냅스 사건의 빈도와 진폭 정량화 (대조군 뉴런 n=32개, TS 뉴런 n=26개; **P=0.0076 및 P=0.8102). g, hCO 및 t-hCO에서 TS 뉴런과 대조군 뉴런에 대한 Scholl 분석. 점선은 비교를 위한 인간 L2/3 출생 후 피라미드 뉴런을 나타냅니다 (대조군 t-hCO 뉴런 n=24개, TS t-hCO 뉴런 n=21개, 대조군 hCO 뉴런 n=8개, TS hCO 뉴런 n=7개). 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현됩니다.
t-hCO가 인간 대뇌 피질 뉴런의 형태적 및 기능적 특징을 높은 수준으로 재현하는 능력은 t-hCO를 질병 표현형 검출에 사용할 수 있는지 여부를 탐구하도록 이끌었습니다. 본 연구에서는 뉴런에서 활성 의존적 유전자 전사를 시작하는 CaV1.2를 암호화하는 유전자의 기능 획득 돌연변이로 인해 발생하는 심각한 신경발달 장애인 TS에 초점을 맞추었습니다. 가장 흔한 치환(p.G406R)을 가진 TS 환자 3명과 대조군 3명(그림 3a)으로부터 hCO를 채취했습니다. 이식 후, 대조군과 비교하여 TS 뉴런에서 수상돌기 형태가 변화된 것을 확인했습니다(그림 3b 및 확장 데이터, 그림 8a, b). 1차 수상돌기 수는 2배 증가했고, 수상돌기 길이는 평균적으로 증가했으며 전반적으로 감소했습니다(그림 3c 및 확장 데이터, 그림 8c). 이는 대조군 뉴런에 비해 TS 뉴런에서 가시의 밀도 증가 및 자발적 EPSC의 빈도 증가와 관련이 있었습니다(그림 3d-f 및 확장 데이터, 그림 8g). 추가 분석 결과, 대조군과 비교하여 t-hCO TS에서 비정상적인 수상돌기 분지 패턴이 나타났지만, 유사한 분화 단계의 시험관내 TS hCO에서는 그렇지 않았습니다(그림 3g). 이는 TS에서 활성 의존성 수상돌기 수축에 대한 기존 보고와 일치하며, 이 이식 플랫폼이 생체 내 질병 표현형을 검출할 수 있음을 보여줍니다.
다음으로, t-hCO 세포가 쥐 S1에 기능적으로 어느 정도 통합되는지 알아보았습니다. 설치류의 S1은 동측 복측 기저핵과 후시상핵, 동측 운동피질, 이차 체성감각피질, 그리고 대측 S1으로부터 강력한 시냅스 입력을 받습니다(그림 4a). 신경 지배 패턴을 복원하기 위해, hCO에 광견병 바이러스-dG-GFP/AAV-G를 감염시키고 3일 후 hCO를 S1 쥐에 이식했습니다. 이식 7~14일 후 동측 S1과 복측 기저핵의 신경세포에서 GFP 발현이 고농도로 관찰되었습니다(그림 4b, c). 또한, 시상 표지자인 네트린 G1에 대한 항체 염색을 통해 t-hCO에 시상 말단이 존재함을 확인했습니다(그림 4d, e). 이러한 구심성 돌기가 t-hCO 세포에서 시냅스 반응을 유발할 수 있는지 평가하기 위해, 시상피질층의 날카로운 단면에서 인간 세포의 전세포 기록을 수행했습니다. 쥐 S1, 내포막, 백질, t-hCO 근처 섬유에 대한 전기 자극 또는 t-hCO에서 옵신을 발현하는 시상 종말의 광유전학적 활성화는 AMPA 수용체 길항제 NBQX에 노출된 t-hCO 뉴런에서 짧은 잠복기 EPSC를 유도했습니다. (그림 4f, g 및 확장 데이터, 그림 9a–g). 이러한 데이터는 t-hCO가 쥐 뇌에 해부학적으로 통합되어 있으며 쥐 숙주 조직에 의해 활성화될 수 있음을 보여줍니다.
a, 광견병 추적 실험의 개략도. b, t-hCO와 쥐 대뇌 피질 사이의 GFP 및 인간 특이적 STEM121 발현(위 패널). 또한 쥐 동측 배쪽 기저핵(VB)(좌하)과 동측 S1(우하)에서의 GFP 발현을 나타냄. 스케일 바, 50 µm. 빨간색 사각형은 이미지가 촬영된 뇌 영역을 나타냄. c, GFP를 발현하는 세포의 정량화(n = 4마리 쥐). d, e — t-hCO에서 네트린 G1+ 시상 말단. d는 t-hCO와 VB 핵을 포함하는 관상 단면을 나타냄. 스케일 바, 2 mm. e는 t-hCO(좌하)와 VB(우하) 뉴런에서의 네트린 G1 및 STEM121 발현을 나타냄. 스케일 바, 50 µm. 주황색 ​​점선은 t-hCO 경계를 나타냄. f, g, S1 쥐(f) 또는 내낭(g)에서 전기 자극 후 t-hCO 뉴런의 전류 흔적, NBQX 유무(보라색)(왼쪽). NBQX 유무에 따른 EPSC 진폭(n = 6 S1 뉴런, *P = 0.0119; 및 n = 6 내낭 뉴런, **P = 0.0022)(중앙). 쥐 S1(f) 또는 내낭(g)의 전기 자극에 반응하여 EPSC를 보이는 t-hCO 뉴런의 백분율(오른쪽). aCSF, 인공 뇌척수액. h, 2P 영상 실험의 모식도(왼쪽). t-hCO에서 GCaMP6의 발현(중간). 스케일 바, 100µm. GCaMP6의 형광 시간 경과(오른쪽). i, 자발적 활동 형광의 Z-점수. j, 콧수염 자극의 모식도. k, 예시 세포에서 시간 0에서의 수염 편향(점선)에 맞춰 정렬된 한 번의 시행에서 z-점수를 매긴 2P 형광 궤적. l, 시간 0에서의 수염 편향(점선)에 맞춰 정렬된 모든 세포의 집단 평균 z-점수 반응(빨간색) 또는 무작위로 생성된 타임스탬프(회색). m. 광학 마킹 실험의 개략도. n, 청색 레이저 자극 또는 수염 편향 동안 예시 t-hCO 세포의 원시 전압 곡선. 빨간색 화살표는 빛(위) 또는 수염 편향(아래)에 의해 발생한 첫 번째 스파이크를 나타냅니다. 회색 음영은 수염 편향 기간을 나타냅니다. o, 피크 광 파형 및 수염 편향 반응. p, 예시 세포에서 수염 편향에 맞춰 정렬된 단일 시도의 스파이크. 0은 수염 편향(점선)을 나타냅니다. q, 모든 광감수성 세포의 개체 평균 z-점수 발화율. 시간 0에서의 수염 편향(점선)(빨간색) 또는 무작위로 생성된 타임스탬프(회색)를 기준으로 정렬. r, 수염 편향에 의해 유의미하게 조절된 광감수성 단위의 비율(쥐 n = 3마리)(왼쪽). 최대 z-점수 잠복기(쥐 n = 3마리; 쥐당 수염 편향 조절 단위 n = 5(연한 녹색), n = 4(진한 녹색), n = 4(청록색))(오른쪽). 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현됨
그런 다음, t-hCO가 생체 내 감각 자극에 의해 활성화될 수 있는지 알아보았습니다. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표인 GCaMP6를 발현하는 hCO를 S1 쥐에 이식했습니다. 150일 후, 섬유 광도 측정 또는 이광자 칼슘 영상(그림 4h 및 확대 데이터, 그림 10a)을 수행했습니다. 그 결과, t-hCO 세포가 동기화된 리듬 활동을 나타냄을 확인했습니다(그림 4i, 확대 데이터, 그림 10b 및 보충 영상 1). 최대 t-hCO 활동의 특성을 파악하기 위해 마취된 이식 쥐에서 세포외 전기생리학적 기록을 수행했습니다(확장 데이터, 그림 10c-f). MRI 영상에서 입체 좌표를 생성했습니다. 따라서 이렇게 기록된 단위는 추정 인간 뉴런을 나타내지만, 전기생리학적 특성만으로는 기원을 특정할 수 없습니다. 동기화된 활동 폭발을 관찰했습니다(확장 데이터, 그림 10d). 버스트는 약 460ms 동안 지속되었고 약 2초의 침묵 기간이 간격을 두었습니다(확장된 데이터, 그림 10d, e). 개별 유닛은 버스트당 평균 약 3발을 발사했는데, 이는 버스트당 등록된 유닛의 약 73%입니다. 개별 유닛의 활동은 높은 상관관계를 보였으며, 이러한 상관관계는 동일한 조건에서 기록된 백신 미접종 동물에서 확인된 유닛의 상관관계보다 높았습니다(확장된 데이터, 그림 10f). 확인된 인간 유래 뉴런의 스파이크 반응을 더욱 특성화하기 위해, 마취된 쥐에 광 민감 양이온 채널인 로돕신 2(hChR2)를 발현하는 hCO를 이식하여 광 태그 실험을 수행했습니다. 이를 통해 t-hCO 뉴런은 청색광 자극에 대한 반응으로 짧은 지연 시간(10ms 미만)을 인식했습니다(그림 4m–o). t-hCO 뉴런은 칼슘 영상에서 관찰된 것과 유사한 주파수에서 자발적인 활동의 폭발을 보였고, 빛 표시가 없는 t-hCO에서 수행된 전기생리학적 기록도 관찰되었습니다(확장 데이터, 그림 10c-g). 시험관 내에서 기록된 hCO의 해당 단계에서는 자발적인 활동이 관찰되지 않았습니다. t-hCO가 감각 자극에 의해 활성화되는지 평가하기 위해, 쥐의 수염을 t-hCO에서 잠시 편향시켰습니다(그림 4j,m 및 확장 데이터, 그림 10h,k). 이전 연구8,10에 따르면, t-hCO 세포의 일부는 수염 편향에 반응하여 활동이 증가했지만, 무작위 시간 스탬프와 비교했을 때는 이러한 현상이 관찰되지 않았습니다(그림 4k-q 및 확장 데이터, 그림 10h-q). 실제로, 광 표지된 단일 단위의 약 54%는 수염 자극 후 각성률이 유의미하게 증가했으며, 약 650ms에서 정점을 이루었습니다(그림 4r). 이러한 데이터를 종합해 보면 t-hCO가 적절한 기능적 입력을 받고 환경 자극에 의해 활성화될 수 있음을 알 수 있습니다.
그 후, t-hCO가 쥐의 행동 조절 회로를 활성화할 수 있는지 조사했습니다. 먼저 t-hCO 뉴런의 축삭이 쥐 주변 조직으로 투사되는지 조사했습니다. EYFP와 융합된 hChR2를 암호화하는 렌티바이러스(hChR2-EYFP)를 hCO에 감염시켰습니다. 110일 후, 청각, 운동, 체성감각 피질을 포함한 동측 피질 영역과 선조체, 해마, 시상을 포함한 피질하 영역에서 EYFP 발현을 관찰했습니다(그림 5a). 이러한 원심성 투사가 쥐 세포에서 시냅스 반응을 유발할 수 있는지 평가하기 위해, 뇌의 날카로운 절편에서 쥐 대뇌 피질 세포를 기록하여 hChR2-EYFP를 발현하는 t-hCO 세포를 광학적으로 활성화했습니다. 청색광에 의한 t-hCO 축삭의 활성화는 쥐의 피라미드 피질 뉴런에서 짧은 잠복기 EPSC를 유도하였으며, 이는 NBQX에 의해 차단되었다(그림 5b–g). 또한, 이러한 반응은 테트로도톡신(TTX)에 의해 차단되고 4-아미노피리딘(4-AP)에 의해 회복될 수 있었는데, 이는 단일 시냅스 연결에 의한 것임을 시사한다(그림 5e).
a, 축삭 추적의 개략도(좌). t-hCO EYFP 발현(우). 스케일 바, 100 µm. A1, 청각 피질, ACC, 전대상 피질, d. 선조체, 등쪽 선조체, HPC, 해마; 횡격막, 외측 중격, mPFC, 내측 전전두엽 피질, 배측 피질, 배측 선조체, 배측 선조체, VPM, 시상의 복측후내측핵, VTA, 복측 피개 영역. 빨간색 사각형은 이미지가 촬영된 뇌 영역을 나타냅니다. b, 자극 실험의 개략도. c, d, 인간(c) EYFP+ t-hCO 또는 쥐(d) EYFP- 세포에서 청색광 유도 광전류(상단) 및 전압(하단) 반응의 예. e, f, TTX 및 4-AR(녹색), TTX(회색) 또는 aCSF(검정색)를 사용하여 t-hCO 축삭을 청색광으로 자극한 후 쥐 신경 세포의 전류 흔적(e), TTX를 사용하거나 사용하지 않을 경우(보라색) 또는 사용하지 않을 경우(검정색) ) ) NBQX(e). g, 쥐 세포(n = 16개 세포)에서 청색광에 의해 유도된 반응의 대기 시간; 수평 막대는 평균 대기 시간(7.13ms)을 나타냅니다(왼쪽). NBQX 유무에 따라 기록된 빛에 의해 유발된 EPSC의 진폭(n = 7개 세포; ***P < 0.0001)(중간). NBQX 유무에 따라 기록된 빛에 의해 유발된 EPSC의 진폭(n = 7개 세포; ***P < 0.0001)(중간). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX 유무에 따라 기록된 광 유도 EPSC의 진폭(n = 7개 세포; ***P < 0.0001)(중앙).NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅(n = 7 个细胞;***P < 0.0001)(中).NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅(n = 7 个细胞;***P < 0.0001)(中). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX 유무에 따라 기록된 광 유도 EPSC의 진폭(n = 7개 세포; ***P < 0.0001)(중앙).청색광에 반응하는 EPSC를 보이는 쥐 세포의 비율(오른쪽). h, 행동 과제의 개략도. d0, 0일차. i. 훈련 1일차(왼쪽) 또는 15일차(오른쪽)에 모범적인 동물들의 성과. 1일차(왼쪽) 또는 15일차(오른쪽 중앙)에 수행된 핥기 횟수의 평균(n = 150회 파란 빛 시도, n = 150회 빨간 빛 시도; ***P < 0.0001). 1일차(왼쪽) 또는 15일차(오른쪽 중앙)에 수행된 핥기 횟수의 평균(n = 150회 파란 빛 시도, n = 150회 빨간 빛 시도; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1(слева) 및 ли ​​день 15(в центре справа) (n = 150 испытаний с иним светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). 1일차(왼쪽) 또는 15일차(오른쪽 중앙)에 수행된 핥기 횟수의 평균(n = 150회 파란 빛 시도, n = 150회 빨간 빛 시도; ***P < 0.0001).제1절 天(左)或第15 天(右中)执行的平均舔次数(n = 150 次蓝光试验，n = 150 次红光试验;***P < 0.0001).제1절 天(左)或第15 天(右中)执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 次红光试验;***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1(слева) 및 ли ​​день 15(в центре справа) (n = 150 испытаний с иним светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). 1일차(왼쪽) 또는 15일차(오른쪽 중앙)에 수행된 핥기 횟수의 평균(n = 150회 파란 빛 시도, n = 150회 빨간 빛 시도; ***P < 0.0001).1일차(중앙 좌측) 또는 15일차(오른쪽) 적색광 및 청색광 조사에 대한 누적 핥기. NS, 유의하지 않음. j,k, 1일차 또는 15일차에 hChR2-EYFP(j) 또는 대조군 형광단(k)을 발현하는 t-hCO를 이식받은 모든 동물의 행동 특성(hChR2-EYFP: 쥐 n = 9마리, ** P = 0.0049; 대조군: 쥐 n = 9마리, P = 0.1497). l, 선호도 점수의 변화(n = 9 hChR2, n = 9 대조군; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, 선호도 점수의 변화(n = 9 hChR2, n = 9 대조군; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволуция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, 선호도 점수의 변화(n = 9 hChR2, n = 9 대조군; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, 偏好评分的演变 (n = 9 hChR2, n = 9 사진; **P < 0.001, *** P < 0.0001). l, 偏好评分的演变 (n = 9 hChR2, n = 9 사진; **P < 0.001, *** P < 0.0001). l, Эволуция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, 선호도 점수의 진화(n = 9 hChR2, n = 9 대조군; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1에서 t-hCO의 광유전학적 활성화에 대한 반응으로 FOS 발현. FOS 발현(왼쪽)과 정량화(그룹당 n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001)(오른쪽) 이미지가 표시됩니다. FOS 발현(왼쪽)과 정량화(그룹당 n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001)(오른쪽) 이미지가 표시됩니다. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (스페인). FOS 발현(왼쪽)과 정량화(그룹당 n = 3; *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001)의 이미지가 표시됩니다(오른쪽).显示了FOS는 表达(左)과 량화(每组n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001)(右)의 이미지입니다.显示了FOS는 表达(左)과 량화(每组n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001)(右)의 이미지입니다. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (스페인). FOS 발현(왼쪽)과 정량화(그룹당 n = 3; *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001)의 이미지가 표시됩니다(오른쪽).척도 막대, 100µm. 데이터는 BLA, 기저외측 편도, MDT, 등내측 시상핵, PAG, 수도관주위회백질의 평균 ± 표준오차로 표현되었습니다.
마지막으로, t-hCO가 쥐의 행동을 조절할 수 있는지 알아보았습니다. 이를 검증하기 위해, hChR2-EYFP를 발현하는 hCO를 S1에 이식하고, 90일 후 t-hCO에 광섬유를 이식하여 빛을 전달했습니다. 그런 다음, 수정된 조작적 조건화 패러다임으로 쥐를 훈련시켰습니다(그림 5h). 쥐를 행동 테스트 챔버에 넣고 무작위로 5초간 청색(473 nm)과 적색(635 nm) 레이저 자극을 가했습니다. 청색광 자극 시에는 핥았지만, 적색광 자극 시에는 핥지 않은 쥐는 물을 보상으로 받았습니다. 훈련 첫날, 쥐들은 청색광이나 적색광 자극 시 핥는 행동에 차이를 보이지 않았습니다. 그러나 15일째, hChR2-EYFP를 발현하는 hCO를 이식한 쥐들은 적색광 자극에 비해 청색광 자극 시 핥는 행동이 더 활발했습니다. 이러한 핥기 행동의 변화는 대조군 형광단을 발현하는 hCO를 이식한 대조군 동물에서는 관찰되지 않았다(학습 성공률: hChR2 89%, EYFP 0%, 그림 5i-1 및 보충 영상 2). 이러한 데이터는 t-hCO 세포가 쥐의 뉴런을 활성화하여 보상 추구 행동을 자극할 수 있음을 시사한다. 이러한 행동 변화에 어떤 쥐의 t-hCO 신경 회로가 관여하는지 알아보기 위해, 훈련된 동물에서 t-hCO를 광유전학적으로 활성화하고 90분 후 조직을 채취했다. 면역조직화학염색 결과, 내측 전전두엽 피질, 내측 시상, 그리고 뇌수도관주위 회백질을 포함하여 동기 부여된 행동에 관여하는 여러 뇌 영역에서 활동 의존성 FOS 단백질이 발현되었으며, 이는 자극을 받지 않은 대조군 동물이나 실험용 쥐 모두에서 발현되었다(쌀. 5m). 종합적으로, 이러한 데이터는 t-hCO가 쥐의 뉴런 활동을 조절하여 행동을 유도할 수 있음을 시사한다.
신경 오가노이드는 시험관 내에서 인간 발달 및 질병을 연구하는 데 유망한 시스템이지만, 생체 내에 존재하는 회로 간의 연결이 부족하다는 한계가 있습니다. 본 연구에서는 면역 저하된 출생 후 초기 쥐의 S1에 hCO를 이식하여 생체 내에서 인간 세포 발달 및 기능을 연구하는 새로운 플랫폼을 개발했습니다. t-hCO가 시험관 내에서는 관찰되지 않는 성숙한 세포 유형을 발달시키고,28 t-hCO가 설치류 뇌에 해부학적, 기능적으로 통합됨을 확인했습니다. t-hCO를 설치류 신경 회로에 통합함으로써 인간 세포 활동과 연구 대상 동물 행동 사이의 연관성을 규명할 수 있었으며, t-hCO 뉴런이 쥐의 뉴런 활동을 조절하여 행동 반응을 유도할 수 있음을 보여주었습니다.
본 플랫폼은 설치류 뇌에 인간 세포를 이식하는 기존 연구와 비교하여 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, hCO를 생후 초기 쥐의 발달 중인 피질에 이식하여 해부학적 및 기능적 통합을 촉진할 수 있었습니다. 둘째, t-hCO MRI 모니터링을 통해 생체 동물에서 이식편의 위치와 성장을 연구할 수 있었으며, 이를 통해 장기간의 다중 동물 연구를 수행하고 여러 hiPS 세포주의 신뢰성을 확립할 수 있었습니다. 마지막으로, 분리된 단일 세포 현탁액 대신 온전한 오가노이드를 이식했는데, 이는 인간 세포에 대한 파괴력이 적고 쥐 뇌에서 인간 피질 뉴런의 통합 및 생성을 촉진할 수 있습니다.
이 플랫폼의 발전에도 불구하고, 시간적, 공간적, 그리고 종간 제약으로 인해 초기 발달 단계에 이식한 후에도 인간 신경 회로가 높은 충실도로 형성되지 못한다는 점을 인지합니다. 예를 들어, t-hCO에서 관찰되는 자발적 활동이 피질 발달 중 관찰되는 리듬 활동과 유사한 발달적 표현형을 나타내는지, 아니면 t-hCO에 존재하는 억제 세포 유형의 부재 때문인지는 명확하지 않습니다. 마찬가지로, t-hCO의 층상 구조 부재가 사슬 연결성에 어느 정도 영향을 미치는지도 명확하지 않습니다.30 향후 연구는 인간 미세아교세포, 인간 내피세포, 그리고 다양한 비율의 GABA성 인터뉴런과 같은 다른 세포 유형을 통합하는 데 중점을 둘 것입니다. 이는 시험관 내에서 어셈블리 6을 사용하여 확인되었으며, 환자로부터 얻은 세포에서 변형된 t-hCO에서 신경 통합 및 처리가 어떻게 일어나는지 이해하는 데에도 도움이 될 것입니다.
전반적으로, 이 생체 내 플랫폼은 시험관 내 인간 뇌 발달 및 질병 연구를 보완할 수 있는 강력한 자원입니다. 이 플랫폼을 통해 기존에는 파악하기 어려웠던 환자 유래 세포에서 새로운 가닥 수준의 표현형을 발견하고 새로운 치료 전략을 시험할 수 있을 것으로 기대합니다.
이전에 설명한 바와 같이 HiPS 세포에서 hCO2.5를 생성했습니다. 영양세포층에서 배양된 hiPS 세포에서 hCO 생성을 시작하기 위해, 디스파제(0.35 mg/mL)를 사용하여 배양 접시에서 온전한 hiPS 세포 콜로니를 분리하고, hiPS 세포 배양 배지(Corning)가 담긴 접시가 있는 초저부착 플라스틱 배양 접시로 옮겼습니다. 이 배양 배지에는 두 가지 SMAD 억제제인 ​​도르소모르핀(5 μM; P5499, Sigma-Aldrich)과 SB-431542(10 μM; I614, Tocris) 및 ROCK 억제제인 ​​Y-27632(10 μM; S1049, Selleckchem)가 보충되었습니다. 처음 5일 동안 hiPS 세포 배지를 매일 교체하고 도르소모르핀과 SB-431542를 첨가했습니다. 현탁 상태에서 여섯째 날, 신경 구형체를 neurobasal-A(10888, Life Technologies), 비타민 A가 없는 B-27 보충제(12587, Life Technologies), GlutaMax(1:100, Life Technologies), 페니실린 및 스트렙토마이신(1:100, Life Technologies)이 함유된 신경 배지로 옮겼고, 24일까지 상피 성장 인자(EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems)와 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems)를 보충했습니다. 25일부터 42일까지 배지에 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech)와 신경 영양 인자 3(NT3; 20 ng ml−1; Peprotech)을 보충했고, 배지는 이틀에 한 번씩 교체했습니다. 현탁 상태에서 여섯째 날, 신경 구형체를 neurobasal-A(10888, Life Technologies), 비타민 A가 없는 B-27 보충제(12587, Life Technologies), GlutaMax(1:100, Life Technologies), 페니실린 및 스트렙토마이신(1:100, Life Technologies)이 함유된 신경 배지로 옮겼고, 24일까지 상피 성장 인자(EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems)와 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems)를 보충했습니다. 25일부터 42일까지 배지에 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech)와 신경 영양 인자 3(NT3; 20 ng ml−1; Peprotech)을 보충했고, 배지는 이틀에 한 번씩 교체했습니다.현탁 6일째에 신경 구형체를 Neurobasal-A(10888, Life Technologies), 비타민 A가 없는 B-27 보충제(12587, Life Technologies), GlutaMax(1:100, Life Technologies), 페니실린이 함유된 신경 배지로 옮겼습니다.и стрептомицин(1:100, Life Technologies) 및 дополнены эпидермальным фактором rosta(EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) 및 фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/ml; R&D Systems) 24일 째. 스트렙토마이신(1:100, Life Technologies)을 투여하고 24일째까지 상피 성장 인자(EGF; 20 ng/ml; R&D Systems)와 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems)를 보충했습니다.25일부터 42일까지는 뇌유래 신경영양인자(BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech)와 신경영양인자 3(NT3; 20 ng ml-1, Peprotech)을 배지에 첨가하고, 배지를 이틀에 한 번씩 교체했습니다.에서 将神经球体转移到含有neurobasal-A(10888，Life Technologies)、不含维生素A 的B-27 补充剂（12587，Life Technologies)、GlutaMax(1:100，Life Technologies), 青霉素의 神经培养基中 및 链霉素(1:100, Life Technologies) 并辅以表皮生长因子(EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) 및 成纤维细胞生长因子2(FGF2;20 ng ml-1; 연구개발 시스템)直至第24 天。悬浮 적 제 6 장에서 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 Neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a 적 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies) Glutamax （1: 100 , Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （(1: 100 , Life Technologies) 表皮 生长 因子 （((20 ng ml-1 ; r & d Systems) 成 纤维细胞 生长 2 (fgf2 ; 20 ng ml- 1; R&D Systems) 直至第24天. 6-й день суспензии нейросferы были переведены на добавку, содержаЂ нейробазал-A (10888, Life Technologies), добавку В-27 без 비타민 A(12587, Life Technologies), GlutaMax(1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин(1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального 팩토라 로스타(EGF; 20 нг мл-1; R&D 시스템) 및 factor роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6일째에, 신경구 현탁액을 neurobasal-A(10888, Life Technologies), 비타민 A가 없는 B-27 보충제(12587, Life Technologies), GlutaMax(1:100, Life Technologies), 페니실린 중화 스트렙토마이신(1:100, Life Technologies)과 상피 성장 인자(EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; 20 ng ml-1) 1을 보충한 보충제로 전환했습니다. R&D Systems) до 24-го дня. R&D 시스템) 24일까지.25일부터 42일까지는 뇌유래 신경영양인자(BDNF; 20 ng/ml, 페프로텍)와 신경영양인자 3(NT3; 20 ng/ml, 페프로텍)을 격일로 배양 배지에 첨가했습니다. 배지는 한 번만 교체했습니다.43일차부터 hCO를 무보충 neurobasal-A 배지(NM; 1088022, Thermo Fisher)에 유지하였고, 배지는 4~6일마다 교체하였다. 영양세포가 없는 조건에서 배양된 hiPS 세포에서 hCO를 얻기 위해, hiPS 세포를 Accutase(AT-104, Innovate Cell Technologies)와 함께 37°C에서 7분간 배양하고, 단일 세포로 분리한 후, ROCK 억제제 Y-27632(10 μM; S1049, Selleckchem)가 보충된 Essential 8 배지에 웰당 3 × 106개의 단일 세포가 배양되도록 AggreWell 800 플레이트(34815, STEMCELL Technologies)에 도말하였다. 24시간 후, 웰의 배지를 도르소모르핀(2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich)과 SB-431542(10 μM; 1614, Tocrida)가 보충된 Essential 6 배지(A1516401, Life Technologies)가 포함된 배지에 위아래로 피펫팅했습니다. 2일부터 6일까지는 Essential 6 배지를 도르소모르핀과 SB-431542 보충제로 매일 교체했습니다. 6일째부터는 신경구 현탁액을 신경기저 배지로 옮겨 위에서 설명한 대로 유지했습니다.
모든 동물 실험은 스탠포드 대학교 실험동물관리행정위원회(APLAC)에서 승인한 동물 관리 지침에 따라 수행했습니다. 임신한 정상 RNU(rnu/+) 쥐를 구입하거나(Charles River Laboratories) 우리에 두었습니다. 동물들은 12시간 낮-어둠 주기를 유지했고 음식과 물은 자유롭게 먹였습니다. 생후 3~7일 된 알몸(FOXN1–/–) 쥐 새끼는 도태하기 전에 미성숙한 수염이 자라는 것을 통해 확인했습니다. 새끼(수컷과 암컷)는 2~3% 이소플루란으로 마취하고 입체 좌표 프레임에 놓았습니다. 경막의 온전성을 유지하면서 S1 위 약 2~3mm 직경의 두개골 천공술을 수행했습니다. 그런 다음 두개골 절개부 바로 바깥쪽에 30G 바늘(약 0.3mm)을 사용하여 경막을 뚫었습니다. 그런 다음 얇은 3×3cm 파라필름에 HCO를 바르고 여분의 배지를 제거했습니다. 23 G, 45° 바늘에 부착된 해밀턴 주사기를 사용하여 바늘의 가장 먼쪽 끝으로 hCO를 조심스럽게 뽑습니다.그런 다음 입체 좌표 장치에 연결된 주사기 펌프에 주사기를 설치합니다.그런 다음 바늘 끝을 경막에 미리 만든 0.3mm 너비의 천자 구멍(z = 0mm) 위에 놓고 주사기를 1~2mm(z = 약 -1.5mm) 좁혀 바늘이 경막 A 사이에 오도록 합니다.밀폐가 형성됩니다.그런 다음 주사기를 z = -0.5mm의 피질 표면 중앙으로 올리고 분당 1~2µl의 속도로 hCO를 주입합니다.hCO 주입이 완료되면 바늘을 분당 0.2~0.5mm의 속도로 빼고 피부를 봉합한 다음 강아지를 완전히 회복될 때까지 따뜻한 가열 패드에 즉시 눕힙니다.일부 동물은 양쪽으로 이식되었습니다.
모든 동물 실험은 스탠포드 대학교 APLAC 승인 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이식 후 60일 이상 된 쥐는 5% 이소플루란 마취로 유도하고, 영상 촬영 중에는 1~3% 이소플루란으로 마취했습니다. 영상 촬영을 위해 IECO(International Electric Company) 경사 구동 장치가 장착된 7 테슬라 능동 차폐 수평 시추공 스캐너 Bruker(Bruker Corp.)를 사용했습니다. 이 스캐너는 AVANCE III, 8채널 다중 코일 RF 및 다중 코어 기능을 갖춘 120mm(600mT/m, 1000T/m/s) 내경의 차폐 경사 삽입물과 함께 Paravision 6.0.1 플랫폼을 사용했습니다. 기록은 내경 86mm의 능동 분리형 체적 RF 코일과 수신 전용 4채널 극저온 냉각 RF 코일을 사용하여 수행했습니다. 축상 2D Turbo-RARE(반복 시간 = 2500ms, 에코 시간 = 33ms, 평균 2회)는 16개 슬라이스 캡처, 슬라이스 두께 0.6–0.8mm, 256 x 256개 샘플을 포함합니다. 신호는 내경 2cm의 직교 트랜시버 체적 RF 코일(Rapid MR International, LLC)을 사용하여 수신했습니다. 마지막으로, 내장된 Imaris(BitPlane) 표면 추정 함수를 사용하여 3D 렌더링 및 체적 분석을 수행했습니다. 성공적인 이식은 이식된 반구에서 연속적인 T2 강조 MRI 신호 영역이 형성된 것으로 정의했습니다. 이식편 거부는 이식된 반구에서 연속적인 T2 강조 MRI 신호 영역을 생성하지 않은 이식편으로 정의했습니다. 피질하 t-hCO는 후속 분석에서 제외했습니다.
2광자 칼슘 이미징을 위해 hCO에서 GCaMP6s를 안정적으로 발현시키기 위해, hiPS 세포를 pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro로 감염시킨 후 항생제를 선택했습니다. 간략하게 설명하면, 세포를 EDTA로 분리한 후 폴리브렌(5 μg/ml)과 바이러스 15 μl를 첨가한 Essential 8 배지 1 ml에 약 300,000개의 세포가 포함되도록 현탁했습니다. 그런 다음, 세포를 현탁액에서 60분 동안 배양하고 웰당 50,000개의 세포가 포함되도록 분주했습니다. 세포가 합류한 후, 5-10 μg/ml의 퓨로마이신으로 5-10일 동안 또는 안정적인 콜로니가 나타날 때까지 처리했습니다. 급성 hCO 감염은 이전에 설명된 방법5에 약간의 수정을 가하여 수행했습니다. 간략하게 설명하면, 30-45일째에 hCO를 신경 배지 100 μl가 담긴 1.5 ml Eppendorf 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 약 90 µl의 배지를 제거하고 3-6 µl의 고역가 렌티바이러스(0.5 x 108에서 1.2 x 109)를 튜브에 첨가하고 hCO를 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다. 그런 다음 각 튜브에 90-100 µl의 배지를 넣고 튜브를 밤새 인큐베이터에 다시 넣습니다. 다음 날, hCO를 낮은 부착 플레이트의 신선한 신경 배지로 옮깁니다. 7일 후, hCO를 24웰 유리 바닥 플레이트로 옮겨 감염 품질을 시각화하고 평가합니다. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE 및 pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE는 VectorBuilder로 생성했습니다. 렌티바이러스는 숙주 유전체에 통합되어 감염된 세포주에서 리포터 유전자 발현을 허용하기 때문에 대부분의 실험에 사용됩니다. 광견병 추적 조사를 위해 30~45일차에 hCO를 광견병-ΔG-eGFP와 AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA(플라스미드 #67528, Addgene)와 공동 감염시키고, 3일 동안 철저히 세척한 다음, S1 쥐에 이식하고 7~14일 동안 생체 내에서 유지했습니다.
면역세포화학염색을 위해 동물을 마취시키고 PBS로 심장을 통해 관류한 후 4% 파라포름알데히드(PBS 중 PFA; Electron Microscopy Sciences)를 첨가했습니다.뇌는 4% PFA에 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 고정하고, PBS 중 30% 수크로스에 48~72시간 동안 냉동보관한 후 1:1, 30% 수크로스:OCT(Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek)에 포매하고, 냉동장치(Leica)를 사용하여 30µm에서 관상 절편을 만들었습니다.두꺼운 절편의 면역조직화학염색을 위해 동물을 PBS로 관류하고, 뇌를 해부하고, 진동절편기(Leica)를 사용하여 300~400µm에서 관상 절편을 만들고, 절편을 4% PFA로 30분 동안 고정했습니다. 그런 다음 냉동 절편이나 두꺼운 절편을 PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안 차단(PBS에 희석한 10% 정상 당나귀 혈청(NDS) 및 0.3% Triton X-100)하고 4°C에서 차단 용액으로 차단했습니다. – 배양 냉동 절편을 하룻밤 동안 배양하고 두꺼운 절편을 5일 동안 배양했습니다. 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다. anti-NeuN(마우스, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2(랫, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP(토끼, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP(닭, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA(마우스, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN(토끼, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA(토끼, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17(토끼, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1(마우스, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2(토끼, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9(염소, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a(염소, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121(마우스, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2(마우스, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67(토끼, 1:400; ABN904, Millipore) 및 anti-IBA1(염소, 1:100; ab5076, abcam). 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다. anti-NeuN(마우스, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2(랫, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP(토끼, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP(닭, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA(마우스, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN(토끼, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA(토끼, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17(토끼, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1(마우스, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2(토끼, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9(염소, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a(염소, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121(마우스, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2(마우스, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67(토끼, 1:400; ABN904, Millipore) 및 anti-IBA1(염소, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следуучие первичные 안티텔라: anti-NeuN(мышиные, 1:500; ab104224, abcam), 안티-CTIP2(крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP(кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), anti--GFP(курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA(мышь, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA(кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), anti-PPP1R17(кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1(мышь, 1:50; ab9774, abcam), 안티-SCG2(크롤, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), 안티-SOX9(코지, 1:500; AF3075, R&D 시스템), 네트 G1a(코지, 1:100; AF1166, R&D 시스템), 안티-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2(мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67(кролик, 1:400; ABN904, Millipore) 및 анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다. anti-NeuN(마우스, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2(쥐, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP(토끼, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP(닭, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA(마우스, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN(토끼, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA(토끼, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17(토끼, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1(마우스, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2(토끼, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9(염소, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a(염소, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121(마우스, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2(마우스, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67(토끼, 1:400; ABN904, Millipore) 및 anti-IBA1(염소, 1:100; ab5076, abkam).사용 가능한 일抗是: 抗NeuN(小鼠,1:500;ab104224，abcam)抗CTIP2(大鼠，1:300;ab18465，abcam)，抗GFAP（兔，1:1,000;Z0334，Dako)，抗-GF P(鸡，1:1,000;GTX13970，GeneTex),抗HNA(小鼠，1:200;ab191181，abcam)，抗NeuN(兔，1:500;ABN78，Millipore)，抗PDGFRA(兔， 1:200;sc-338;산타 Cruz), 抗PPP1R17(兔,1:200;HPA047819,Atlas 抗体),抗RECA-1(小鼠,1:50;ab9774,abcam),抗SCG2(兔) , 1:100;20357-1-AP,Proteintech),抗SOX9(山羊,1:500;AF3075,R&D Systems),Netrin G1a(山羊,1:100;AF1166,R&D Systems),抗STEM121(小鼠, 1:200;사용 가능한 일抗是: 抗NeuN(小鼠，1:500;ab104224，abcam)抗CTIP2(大鼠，1:300;ab18465，abcam)，抗GFAP（兔，1:1,000;Z0334，Dako)，抗-GFP(鸡，1:1,000;GTX13970，GeneTex)，抗HNA（小鼠，1:200;ab191181，abcam)，抗NeuN（兔，1:500;ABN78，Millipore%弔，抗1: 200;sc-338;산타 Cruz), 抗PPP1R17(兔,1:200;HPA047819,Atlas 抗体),抗RECA-1(小鼠,1:50;ab9774,abcam),抗SCG2 100;20357-1-AP，Proteintech)，抗SOX9(山羊，1:500; AF3075，R&D Systems)，Netrin G1a(山羊，1:100; AF1166，R&D Systems)頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2(마우스, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67(토끼, 1:400; ABN904, Millipore) 및 anti-IBA1(염소, 1:100; ab5076, abcam).사용된 1차 항체는 다음과 같습니다: anti-NeuN(마우스, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2(랫드, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP(토끼, 1:1000; Z0334, Dako). , 항-GFP(닭, 1:1000; GTX13970, GeneTex), 항-HNA(마우스, 1:200; ab191181, abcam), 항-NeuN(토끼, 1:500; ABN78, Millipore), 항-PDGFRA(토끼, 1:200; sc-338, Santa Cruz), 항-PPP1R17(토끼, 1:200; HPA047819, Atlas 항체), 항-RECA-1(마우스, 1:50; ab9774, abcam), 항-SCG2(토끼), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), ANTи-SOX9(항목, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a(항목, 1:100; AF1166, R&D Systems), 항목 -STEM121(항목, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2(мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67(кролик, 1:400; ABN904, Millipore) 및 анти-IBA1(коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9(염소, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a(염소, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121(마우스, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2(마우스, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67(토끼, 1:400; ABN904, Millipore), 및 anti-IBA1(염소, 1:100; ab5076, abkam).그런 다음 절편을 PBS로 세척하고 실온에서 1시간 동안(냉동 절편) 또는 4°C에서 하룻밤 동안(두꺼운 절편) 2차 항체와 함께 배양했습니다.차단 용액에 1:1000으로 희석한 Alexa Fluor 2차 항체(Life Technologies)를 사용했습니다.PBS로 세척한 후 핵을 Hoechst 33258(Life Technologies)로 시각화했습니다.마지막으로 슬라이드를 Aquamount(Polysciences)를 사용하여 커버슬립이 있는 현미경(Fisher Scientific)에 놓고 Keyence 형광 현미경(BZ-X 분석기) 또는 Leica TCS SP8 공초점 현미경(Las-X)으로 이미지를 분석했습니다.이미지는 ImageJ 프로그램(Fiji)을 사용하여 처리했습니다.t-hCO와 쥐 피질에서 인간 뉴런의 비율을 정량화하기 위해 t-hCO의 중앙, 쥐 피질의 가장자리 또는 근처에서 387.5μm 너비의 직사각형 이미지를 촬영했습니다. 이식편의 경계는 조직 투명도, HNA+ 핵, 그리고/또는 조직 자가형광의 변화를 평가하여 결정되었습니다. 각 이미지에서 NeuN+ 및 HNA+ 세포의 총 수를 동일 영역의 NeuN+ 세포 총 수로 나누었습니다. 이미지 평면에 핵이 있는 세포만 계산하기 위해 Hoechst+ 세포도 계산에 포함시켰습니다. 통계적 오차를 줄이기 위해 최소 1mm 간격으로 분리된 두 이미지의 평균을 구했습니다.
샘플 채취 1주일 전, hCO 이식 동물(분화 후 약 8개월)을 감각 자극을 최소화하기 위해 수염을 다듬은 암실에 두었습니다. 핵 분리는 이전에 설명한 바와 같이 수행하되, 몇 가지 수정을 가했습니다. 간략하게 설명하면, t-hCO와 hCO는 세제-기계적 세포 용해와 2ml 유리 조직 분쇄기(D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE)를 사용하여 파괴했습니다. 조핵은 40µm 필터를 사용하여 여과하고, 4°C에서 320g로 10분간 원심분리한 후, 수크로오스 밀도 구배를 수행했습니다. 원심분리 단계(4°C에서 320g, 20분) 후, 샘플을 0.04% BSA/PBS에 0.2 단위의 RNase 억제제(40 uL-1, AM2682, Ambion)를 첨가하여 재현탁하고 40 µm 유동 필터를 통과시켰습니다. 분리된 핵은 0.02% BSA가 포함된 PBS에 재현탁하고 Chromium Single Cell 3' 칩에 로딩했습니다(레인당 약 8,000개 세포 회수). snRNA-seq 라이브러리는 Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3(10x Genomics)를 사용하여 준비되었습니다. snRNA-seq 라이브러리는 Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3(10x Genomics)를 사용하여 준비되었습니다. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помочье 크롬 단일 세포 3' GEM, 라이브러리 및 젤 비드 키트 v3(10x Genomics). snRNA-seq 라이브러리는 Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3(10x Genomics)를 사용하여 준비되었습니다. snRNA-seq 문서는 Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 제조에 사용됩니다. snRNA-seq 문서는 Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 제조에 사용됩니다. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием 크롬 단일 세포 3' GEM, 라이브러리 및 젤 비드 키트 v3(10x Genomics). snRNA-seq 라이브러리는 Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3(10x Genomics)를 사용하여 준비되었습니다.다양한 샘플의 라이브러리를 모아 Admera Health의 NovaSeq S4(Illumina)에서 시퀀싱했습니다.
각 추정 핵 바코드에 대한 유전자 발현 수준은 10x Genomics CellRanger 분석 소프트웨어 패키지(버전 6.1.2)를 사용하여 정량화했습니다. 구체적으로, 리드는 mkref 명령으로 생성한 인간(GRCh38, Ensemble, 버전 98) 및 쥐(Rnor_6.0, Ensemble, 버전 100) 참조 유전체의 조합과 매칭되었으며, count 명령과 –include-introns=TRUE 명령을 함께 사용하여 인트론 영역에 매핑된 include 리드를 정량화했습니다. t-hCO 샘플의 경우, 매핑된 모든 리드의 최소 95%가 인간 유전체와 일치해야 한다는 보수적인 요건을 기반으로 인간 핵을 식별했습니다. 이후 모든 분석은 R 패키지(버전 4.1.2)와 Seurat(버전 4.1.1)32를 사용하여 CellRanger에서 필터링된 바코드 어레이 출력에 대해 수행했습니다.
이후 분석에 고품질 핵만 포함되도록 각 샘플에 대해 반복적 필터링 과정을 구현했습니다. 먼저, 고유 유전자가 1,000개 미만이고 전체 미토콘드리아의 20% 이상을 차지하는 저품질 핵을 식별하여 제거했습니다. 이후, 원시 유전자 수 행렬은 sctransform(vst.flavor="v2") 함수를 사용하여 정규화된 음이항 회귀 분석을 통해 정규화되었으며, 이 함수는 기본 매개변수를 사용하여 가장 가변적인 3000개의 유전자를 식별했습니다. 상위 가변 유전자에 대해 기본 매개변수를 사용하는 주성분 분석(PCA)을 사용하여 차원 축소를 수행했으며, 데이터 세트 차원은 30으로 설정했습니다(dims = 30은 무릎 부위의 육안 검사를 기반으로 선택되었으며 모든 샘플 및 앙상블 분석에 사용되었습니다). 그런 다음, 비정상적으로 낮은 유전자 수(중앙값이 10백분위수 미만), 비정상적으로 높은 미토콘드리아 유전자 수(중앙값이 95백분위수 초과)를 기준으로 유전자를 분류하기 위해 반복적 클러스터링(해상도 = 1)을 여러 번 수행하여 품질이 낮은 추정 세포 클러스터 및/또는 DoubletFinder33 패키지를 사용하여 확인된 의심 쌍둥이의 높은 비율(평균 DoubletFinder 점수가 95백분위수 초과)을 식별하고 제거했습니다. t-hCO 샘플(n=3) 및 hCO 샘플(n=3)을 위의 매개변수를 사용하여 IntegrateData 함수를 사용하여 개별적으로 통합했습니다. 그런 다음, 위에서 설명한 대로 통합된 데이터 세트에 대한 정성적 필터링을 한 번 더 수행했습니다.
저품질 커널을 제거한 후, 통합 데이터 세트를 그룹화(해상도 = 0.5)하여 UMAP34 시각화 목적으로 임베드했습니다. 각 클러스터의 마커 유전자는 FindMarkers 함수를 사용하여 정규화된 유전자 발현 데이터에서 계산된 기본 매개변수를 사용하여 결정했습니다. 태아 및 성인 대뇌 피질 참조 데이터 세트와 마커 유전자 발현(19,20,21,35) 및 주석을 결합하여 주요 세포 클래스를 식별하고 분류했습니다. 특히, 순환 전구 세포는 MKI67과 TOP2A의 발현을 통해 식별했습니다. 전구 세포 클러스터는 유사분열 전사체의 부재, 후기 중기 태아 피질에서 나타나는 다능성 신경교 전구 세포 클러스터와의 높은 중첩, 그리고 EGFR 및 OLIG1 발현으로 정의했습니다. 본 연구에서는 후기 방사형 신경교 세포에서 성상세포 성숙까지 다양한 성상세포 분화 단계를 포괄하는 용어로 성상세포(astrocyte)라는 용어를 사용했습니다. 성상세포 클러스터는 높은 수준의 SLC1A3와 AQP4를 발현하며, 태아 방사상 신경교세포 및/또는 성체 성상세포의 아형과 일치하는 것으로 나타났습니다. OPC는 PDGFRA와 SOX10을 발현하는 반면, 희소돌기아교세포는 수초화 마커(MOG와 MYRF)를 발현합니다. 글루탐산성 뉴런은 뉴런 전사체(SYT1과 SNAP25)의 존재, GABA성 마커(GAD2)의 부재, 그리고 NEUROD6, SLC17A7, BCL11B 또는 SATB2의 발현을 통해 확인되었습니다. GluN 뉴런은 상위(SATB2 발현 및 BCL11B 소실)와 심부(BCL11B 발현) 하위 유형으로 더 세분화되었습니다. 추정 아판(SP) 뉴런은 심부 GluN 마커 외에도 ST18과 SORCS1과 같은 알려진 SP18 마커를 발현합니다. 맥락막 유사 세포는 TTR 발현을 통해 식별되었으며, 수막 유사 세포는 섬유아세포 관련 유전자를 발현하고 참조 데이터 세트의 연막/혈관 세포를 매핑했습니다.
t-hCO와 hCO 하위 클래스 간 유전자 발현의 차등 분석은 Libra R 패키지(버전 1.0.0)를 사용하여 구현된 샘플에서 재현되는 새로 개발된 의사 배치 방법을 사용하여 수행되었습니다. 구체적으로, edgeR 로그 가능도 검정(버전 3.36.0, 패키지 R)은 각 샘플 복제에 대해 주어진 세포 클래스의 세포 내 유전자 수를 합산하여 그룹에 대해 수행되었습니다. 히트맵 시각화를 위해, 백만당 정규화(CPM) 값은 edgeR(cpm() 함수)을 사용하여 계산하고 크기 조정(평균 = 0, 표준 편차 = 1 달성)했습니다. 상당히 상향조절된 t-hCO GluN 유전자의 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행했습니다(Benjamini-Hochberg 보정 P 값은 t-hCO GluN 세포의 최소 10%에서 발현되고 변화량이 최소 2배 증가함). ToppGene Suite(https://toppgene.cchmc.org/)37를 사용하여 수행했습니다. 우리는 기본 매개변수를 사용하는 ToppFun 앱을 사용하고 GO 주석이 달린 초기하 검정에서 계산된 Benjamini-Hochberg 수정 P값을 보고합니다.
snRNA-seq 클러스터를 일차 단일 세포 RNA-seq 또는 성체 snRNA-seq19,20,21,22에 대한 참조 연구에서 얻은 주석이 달린 세포 클러스터와 일치시키기 위해, 쌍 데이터셋 통합 접근법을 적용했습니다. Seurat의 SCTransform(v2) 정규화 워크플로를 사용하여 데이터셋 간의 클러스터 중복을 통합하고 비교했습니다(위와 동일한 매개변수 사용). 계산 효율성을 위해 개별 데이터셋은 원래 클러스터당 최대 500개의 세포 또는 핵으로 무작위로 부분집합되었습니다. 이전에 설명한 것과 유사한 접근법을 사용하여, 클러스터 중복은 각 풀링된 클러스터에서 참조 클러스터의 레이블과 중복되는 세포 또는 핵의 비율로 정의했습니다. GluN을 추가로 분류하기 위해 Seurat의 GluN 부분집합 데이터에 대한 TransferData 워크플로를 사용하여 참조 데이터셋 레이블을 GluN 세포에 할당했습니다.
t-hCO 및 hCO 샘플의 전체 전사체의 성숙 상태를 평가하기 위해, 본 연구에서는 유사-벌크 샘플을 인간 뇌 발달에 걸친 대규모 RNA 서열로 구성된 BrainSpan/psychENCODE23와 비교했습니다. 수정 후 10주차와 그 이후의 피질 샘플에서 얻은 패턴-정규화된 유전자 발현 행렬을 이용하여, 이전에 BrainSpan 피질 샘플에서 활성으로 확인된(3차 모델을 사용하여 연령으로 설명되는 발달 분산의 50% 이상으로 정의) 5567개 유전자(본 연구 데이터와 함께)에 대해 PCA를 수행했습니다. 또한, 이전에 기술된 바와 같이 비음성 행렬 분해를 사용하여 신경발달의 주요 전사체 특징과 관련된 유전자를 도출했습니다. 비음성 행렬 분해 절차를 사용하여 계산된 샘플 가중치는 Zhu 등이 기술한 5가지 특징 각각에 대한 확장 데이터와 함께 그림 5b에 도시되어 있습니다. 활성 의존성 전사 마커는 이전에 발표된 연구에서 도출되었습니다. 특히, ERG와 LRG는 시각적 자극 후 마우스 시각 피질 snRNA-seq 수집을 통해 확인된 글루탐산성 뉴런에서 유의하게 상향조절되었다(보충 표 3, Hrvatin et al.16). 인간에서 농축된 LRG는 KCl로 활성화된 인간 태아 뇌 배양물에서 얻어 자극 후 6시간 후에 회수하였으며, 여과된 유전자는 인간에서 유의하게 상향조절되었지만 설치류에서는 그렇지 않았다(보충 표 4). 이러한 유전자 세트를 이용한 유전자 세트 농축 분석은 일원 피셔 정확 검정을 사용하여 수행되었다.
이소플루란으로 쥐를 마취하고, 뇌를 적출하여 234 mM 수크로스, 11 mM 포도당, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4, 0.5 mM CaCl2(약 310 mOsm)를 함유하는 절편을 차가운(약 4°C) 산소화된(95% O2, 5% CO2) 수크로스 용액에 담는다. t-hCO를 함유하는 쥐 뇌 관상 절편(300–400 µm)은 이전에 기술된 바와 같이 Leica VT1200 진동절편기를 사용하여 제작하였다39. 그런 다음 절편을 연속 실온 산소 공급이 가능한 절편 챔버로 옮겼습니다. 이 챔버에는 10 mM 포도당, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 및 126 mM NaCl(298 mOsm)로 제조된 aCSF가 포함되어 있었습니다. 기록 최소 45분 전에 절편을 aCSF(95% O2 및 5% CO2 바이알)로 연속 관류하는 침지 챔버에서 기록했습니다. 모든 데이터는 실온에서 기록했습니다. t-hCO 뉴런은 127 mM 글루콘산칼륨, 8 mM NaCl, 4 mM 마그네슘 ATP, 0.3 mM 나트륨 GTP, 10 mM HEPES 및 0.6 mM EGTA(pH 7.2, KOH(290 mOsm)로 내부 조정된 용액)로 채워진 붕규산 유리 피펫으로 종결했습니다. 회수를 위해, 바이오시틴(0.2%)을 기록 용액에 첨가했습니다.
데이터는 MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices)와 Digidata 1550B 디지타이저(Molecular Devices)를 사용하여 수집하고, 2kHz에서 저역 통과 필터링을 거친 후 20kHz에서 디지털화하고, Clampfit(Molecular Devices), Origin(OriginPro, 2021b, OriginLab) 및 사용자 정의 MATLAB 함수(Mathworks)를 사용하여 분석했습니다. 접합 전위는 JPCalc를 사용하여 계산했으며, 입력 값은 -14mV로 조정했습니다. 작업 IV는 -250pA에서 750pA까지 10~25pA 단위의 일련의 전류 단계로 구성됩니다.
이전에 기술한 바와 같이, hCO 뉴런의 패치 클램프 기록 중 시상피질 절편에서 시상, 백질, S1 구심성 신경을 전기적으로 자극했습니다. 간략하게 설명하면, 뇌를 10° 각도로 기울인 3D 프린팅 테이블에 놓고 뇌 앞부분을 35° 각도로 절단했습니다. 그런 다음 뇌를 절단면에 붙이고 절단하여 시상피질의 돌출된 축삭을 보존했습니다. 양극성 텅스텐 전극(0.5 MΩ)을 두 번째 미세 조작기에 장착하고 세포당 네 영역(내피, 백질, S1, hCO)을 자극하도록 전략적으로 배치했습니다. 0.03~0.1 Hz에서 300 µA 위상 자극 후 시냅스 반응을 기록했습니다.
hChR2를 발현하는 hCO 뉴런을 480nm에서 활성화하고, LED(Prizmatix)에서 생성된 광 펄스를 ×40 대물렌즈(0.9 NA; Olympus)를 통해 적용하여 세포 근처의 hChR2 발현을 기록했습니다. 조사야 직경은 약 0.5mm이고 총 전력은 10-20mW입니다. 펄스 폭은 행동 학습 실험에서 제공된 펄스에 해당하는 10ms로 설정했습니다. 1~20Hz의 다양한 자극 주파수가 사용되었지만, 정량화에는 시리즈의 첫 번째 펄스만 사용했습니다. 시냅스 억제 또는 촉진 경로에 미치는 영향을 최소화하기 위해 각 펄스 사이의 간격은 일반적으로 30초보다 깁니다. hChR2 반응이 단일 시냅스인지 확인하기 위해 EPSC 반응이 사라질 때까지 TTX(1μM)를 욕조에 적용한 다음 4-아미노피리딘(4-AP; 100μM)을 적용했습니다. 일반적으로 반응은 몇 분 내에 나타나며, LED 점등과 EPSC 생성 사이에는 약간 더 긴 지연 시간이 있습니다. NBQX(10 μM)를 사용하여 이러한 반응이 AMPA 수용체에 의해 유발되는지 여부를 확인했습니다.
날카로운 hCO 절편을 이전에 설명한 대로 제작했습니다. 간략하게 설명하면, hCO 절편을 4% 아가로스에 포매하고 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM d-(+)-포도당을 함유하는 세포로 옮겼습니다. 절편은 실온에서 Leica VT1200 진동기를 사용하여 200~300 µm로 절단하고 실온에서 ASF에 보관했습니다. 그런 다음, SliceScope 현미경(Scientifica)을 직접 사용하여 hCO 절편에서 전체 세포의 패치 캠프 기록을 수행했습니다. 절편에 aCSF(95% O2, 5% CO2)를 관류하고 실온에서 세포 신호를 기록했습니다. hCO 뉴런은 127 mM 글루콘산칼륨, 8 mM NaCl, 4 mM 마그네슘 ATP, 0.3 mM 나트륨 GTP, 10 mM HEPES, 0.6 mM EGTA를 포함하는 용액으로 채워진 붕규산 유리 피펫을 사용하여 적용했습니다. 내부 pH는 7.2이며, KOH(삼투압 290)로 조정했습니다. 회수를 위해 내부 용액에 0.2% 바이오시틴(Biocytin)을 첨가했습니다.
데이터는 MultiClamp 700B 증폭기(Molecular Devices)와 Digidata 1550B 디지타이저(Molecular Devices)를 사용하여 Clampex(Clampex 11.1, Molecular Devices)를 통해 수집되었으며, 2kHz에서 저역 통과 필터링을 수행하고 20kHz에서 디지털화한 후, 분석에는 Clampfit(버전 10.6)과 사용자 정의 MATLAB 함수(MATLAB 2019b, Mathworks)를 사용하여 분석했습니다. 접합 전위는 JPCalc를 사용하여 계산되었으며, 입력값은 계산된 접합 전위인 -14 mV로 조정되었습니다. 동작 IV는 -50 pA에서 250 pA까지 5~10 pA 단위로 구성된 일련의 전류 스텝으로 구성됩니다.
끼인 신경 세포의 형태학적 재구성을 위해 0.2% 바이오시틴(Sigma-Aldrich)을 내부 용액에 첨가했습니다.세포는 해킹 후 최소 15분 동안 프라이밍합니다.그런 다음 등록된 막이 완전히 밀봉될 때까지 피펫을 1~2분 동안 천천히 빼냅니다.절편 생리학 절차에 따라 절편을 4% PFA에서 4°C에서 하룻밤 동안 고정하고 PBS X3로 세척한 다음 스트렙타비딘이 결합된 DyLight 549 또는 DyLight 405(Vector Labs)로 1:1000으로 희석했습니다.바이오시틴(2%; Sigma-Aldrich)으로 채워진 세포는 실온에서 2시간 동안 패치 클램프 기록 중에 표지했습니다.그런 다음 절편을 Aquamount(Thermo Scientific)를 사용하여 현미경 슬라이드에 장착하고 다음 날 숫자 개구수 ×40 1.3, 배율 ×0.9~1.0, xy의 오일 침지 대물렌즈를 사용하여 Leica TCS SP8 공초점 현미경으로 시각화했습니다. 샘플링 속도는 마이크론당 약 7픽셀입니다. 1µm 간격의 Z-스택을 연속적으로 수집하고, 각 뉴런의 전체 수상돌기 트리를 포함하도록 Z-스택 모자이크와 라이카 기반 자동 스티칭을 수행했습니다. 그런 다음 neuTube 40 인터페이스를 사용하여 뉴런을 반수동으로 추적하고 SWC 파일을 생성했습니다. 이 파일은 SimpleNeuriteTracer41 Fiji 플러그인(ImageJ, 버전 2.1.0; NIH)에 업로드되었습니다.
인간 대뇌 피질 조직은 스탠퍼드 대학교 기관윤리위원회(IRB)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 사전 동의 하에 채취했습니다. 난치성 간질 수술의 일환으로 전두엽 피질(중전두회)을 절제하여 산후 인간 조직 검체 두 개(3세 및 18세)를 채취했습니다. 절제 후, 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM 포도당, 2 mM 티오우레아, 5 mM 아스코르브산나트륨, 3 mM 피루브산나트륨, 0.5 mM CaCl2·4H2O, 10 mM MgSO4·7H2O를 함유한 얼음처럼 차가운 NMDG-aCSF 용액에서 조직을 채취했습니다. 진한 염산을 사용하여 pH 7.3-7.4로 적정했습니다. 조직은 30분 이내에 실험실로 전달되었고, 위에 설명된 절차에 따라 관상 절편이 채취되었습니다.
모든 동물 실험은 스탠퍼드 대학교 APLAC 승인 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이식 후 140일 이상 된 쥐는 5% 이소플루란 마취로 유도하였고, 수술 중 1~3% 이소플루란으로 마취하였습니다. 동물을 입체 좌표계(Kopf)에 위치시키고 서방형 부프레노르핀(SR)을 피하 주사하였습니다. 두개골을 노출시키고 세척한 후 3~5개의 뼈 나사를 삽입하였습니다. t-hCO를 표적으로 삼기 위해 MRI 영상에서 입체 좌표를 생성하였습니다. 관심 부위에 천공을 뚫고 섬유(직경 400µm, NA 0.48, 도릭)를 hCO 표면 아래 100µm 지점에 위치시킨 후 UV 경화형 치과용 시멘트(Relyx)로 두개골에 고정하였습니다.
섬유 광도 측정 기록은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다42. 자발적인 활동을 기록하기 위해 쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 광섬유 광도 측정 데이터 수집 시스템에 연결된 400µm 직경의 광섬유 패치 케이블(Doric)을 이식된 광섬유 케이블에 연결했습니다. 10분 동안 운동 활동을 기록하는 동안 동물은 케이지를 자유롭게 탐험할 수 있었습니다. 유발된 활동을 기록하기 위해 쥐(이식 후 140일 이상)는 유도를 위해 5% 이소플루란으로 마취하고 유지를 위해 1-3% 이소플루란으로 마취했습니다. 동물을 입체 좌표 프레임(Kopf)에 넣고 t-hCO 반대편의 수염을 약 2cm로 다듬고 압전 액추에이터(PI)에 연결된 메시를 통과시킵니다. 400µm 광섬유 패치 케이블(Doric)을 이식된 섬유에 연결하고 데이터 수집 시스템에 연결했습니다. t-hCO 반대편의 수염(whisker)은 압전 구동 장치를 사용하여 20분 동안 무작위로 50회(20Hz에서 2mm, 각 제시 시간당 2초) 편향되었습니다. Arduino MATLAB 지원 패키지를 사용하여 사용자 지정 MATLAB 코드로 편향 시간을 제어합니다. 이벤트는 트랜지스터-트랜지스터 로직(TTL) 펄스를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어와 동기화됩니다.
쥐(이식 후 140일 이상)에게 5% 이소플루란 마취를 시행하고 수술 중 1-3% 이소플루란으로 마취시켰다. 동물을 입체 좌표계(Kopf)에 넣고 부프레노르핀 SR과 덱사메타손을 피하 주사했다. 두개골을 노출시키고 세척한 후 3-5개의 뼈 나사를 삽입했다. t-hCO를 표적으로 삼기 위해 MRI 이미지에서 입체 좌표를 생성했다. 이식된 hCO 바로 위에 고속 드릴을 사용하여 원형 두개골 절개술(직경 약 1cm)을 시행했다. 뼈가 최대한 얇아지면 전체 뼈를 뚫기 전에 겸자를 사용하여 남아 있는 손상되지 않은 골반 디스크를 제거하여 아래에 있는 t-hCO를 드러냈다. 두개골 절개술 부위에 멸균 식염수를 채우고 커버슬립과 특수 헤드 핀을 UV 경화 치과용 시멘트(Relyx)를 사용하여 두개골에 부착했다.
2광자 이미징은 Nikon LWD(×16, 0.8 NA) 대물렌즈가 있는 Bruker 다광자 현미경을 사용하여 수행했습니다. GCaMP6 이미징은 920nm에서 1.4배 단일 z-평면 배율과 8배 평균 7.5fps로 수행했습니다. 쥐는 5% 이소플루란 마취로 유도하고 1-3% 이소플루란으로 유지했습니다. 쥐를 맞춤형 머리 고정 장치에 넣고 렌즈 아래에 두었습니다. 운동 활동의 3분 배경 기록을 얻었습니다. 20분 동안 기록하는 동안 50회 퍼프(각 제시 길이는 100ms)를 피코스프라이서를 사용하여 t-hCO 반대편의 수염 패드에 무작위로 전달했습니다. Arduino MATLAB 지원 패키지를 사용하여 사용자 지정 MATLAB 코드로 버스트 시간을 제어합니다. TTL 펄스를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어(PrairieView 5.5)와 이벤트를 동기화합니다. 분석을 위해 피지에서 출시된 MoCo 프로그램의 아핀 보정을 사용하여 이미지를 xy 운동에 대해 보정했습니다. CNMF-E43을 사용하여 개별 세포에서 형광 흔적을 추출했습니다. 각 관심 영역에서 형광을 추출하여 dF/F 곡선으로 변환한 후 z-점수로 변환했습니다.
쥐(이식 후 140일 이상)에게 5% 이소플루란 마취를 시행하고, 수술 중 1~3% 이소플루란으로 마취하였다. 동물을 입체 좌표계(Kopf)에 위치시키고 부프레노르핀 SR과 덱사메타손을 피하 주사하였다. t-hCO 반대편의 수염을 약 2cm로 잘라 압전 액추에이터에 연결된 메쉬에 통과시켰다. 두개골을 노출시키고 세척하였다. 스테인리스 스틸 접지 나사를 두개골에 부착하였다. t-hCO를 표적으로 삼기 위해 MRI 영상에서 입체 좌표를 생성하였다. t-hCO 바로 위에서 고속 드릴을 사용하여 원형 두개골 절개술(직경 약 1cm)을 시행하였다. 뼈가 최대한 얇아지면, 뼈 전체를 뚫기 전에 집게를 사용하여 남아 있는 온전한 골반 디스크를 제거하여 아래에 있는 t-hCO를 드러냈다. 개별 세포는 접지 나사에 접지된 32채널 또는 64채널 고밀도 실리콘 프로브(Cambridge Neurotech)를 사용하여 기록하고 RHD 증폭기(Intan)로 사전 증폭했습니다. 무균 식염수로 채워진 두개골 절개술을 통해 조작기를 사용하여 전극을 목표 부위로 내립니다. 데이터 수집은 Open Ephys 데이터 수집 시스템을 사용하여 30kHz 주파수에서 수행되었습니다. 10개 이상의 채널에서 높은 상관관계를 갖는 리듬적 자발적 활동이 감지될 때만 기록을 계속했는데, 이는 전극이 이식편에 위치함을 시사합니다(2광자 칼슘 영상 데이터 기반). 운동 활동에 대한 10분 배경 기록을 얻었습니다. 그런 다음 t-hCO 반대편의 수염을 압전 구동으로 무작위 시간에 50회(20Hz에서 2mm, 제시당 2초) 편향시켰고, 20분 동안 기록했습니다. Arduino용 MATLAB 지원 패키지(MATLAB 2019b)를 사용하여 맞춤형 MATLAB 코드로 편향 시간을 제어합니다. TTL 펄스를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어와 이벤트를 동기화합니다.
광학 마킹 실험을 위해, 473nm 레이저(오미크론)에 연결된 200µm 광 패치 코드(도릭)를 두개골 절개부 위에 놓인 200µm 광섬유에 연결했습니다. 바로 직전에 점퍼 전력을 20mW로 조정했습니다. 멸균 식염수로 채워진 두개골 절개부를 통해 조작기를 사용하여 전극을 목표 부위까지 내렸습니다. 기록 시작 시, 473nm(주파수 2Hz, 펄스 지속시간 10ms)의 광 펄스 10개가 방출되었습니다. 광민감성 세포는 실험의 70% 이상에서 빛 발생 후 10ms 이내에 스파이크 반응을 보이는 세포로 정의했습니다.