Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak s tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda odjednom ili upotrijebite klizače na kraju za pomicanje kroz tri slajda odjednom.
Samoorganizirajući neuronski organeli predstavljaju obećavajuću in vitro platformu za modeliranje ljudskog razvoja i bolesti. Međutim, organoidima nedostaje povezanost koja postoji in vivo, što ograničava sazrijevanje i sprječava integraciju s drugim krugovima koji kontroliraju ponašanje. Ovdje pokazujemo da kortikalni organoidi dobiveni iz ljudskih matičnih stanica transplantirani u somatosenzorni korteks neonatalnih golih štakora razvijaju zrele tipove stanica koje se integriraju u senzorne i motivacijske krugove. MRI je otkrio rast organoida nakon transplantacije u nekoliko linija matičnih stanica i kod životinja, dok je analiza jedne jezgre otkrila progresiju kortikogeneze i pojavu transkripcijskog programa ovisnog o aktivnosti. Doista, transplantirani kortikalni neuroni pokazuju složenija morfološka, ​​sinaptička i svojstva unutarnjih membrana od svojih in vitro pandana, što omogućuje otkrivanje neuronskih defekata u bolesnika s Timothyjevim sindromom. Anatomsko i funkcionalno praćenje pokazalo je da transplantirani organeli primaju talamokortikalne i kortikokortikalne ulaze, a in vivo snimke neuronske aktivnosti sugeriraju da ti ulazi mogu generirati senzorne odgovore u ljudskim stanicama. Konačno, kortikalni organoidi produžuju aksone kroz mozak štakora, a njihova optogenetska aktivacija dovodi do ponašanja traženja nagrade. Dakle, transplantirani neuroni ljudskog korteksa sazrijevaju i sudjeluju u krugovima domaćina koji kontroliraju ponašanje. Očekujemo da će ovaj pristup olakšati otkrivanje fenotipova na razini lanca u stanicama izvedenim od pacijenta koje nije moguće otkriti drugim sredstvima.
Razvoj ljudskog mozga je izvanredan samoorganizirajući proces u kojem stanice proliferiraju, diferenciraju se, migriraju i povezuju kako bi formirale funkcionalne neuronske krugove koji se dalje usavršavaju kroz senzorno iskustvo. Ključni problem u razumijevanju razvoja ljudskog mozga, posebno u kontekstu bolesti, jest nedostatak pristupa moždanom tkivu. Samoorganizirajuće organele, uključujući organoide ljudskog korteksa (hCO; poznate i kao sfera ljudskog korteksa), mogu generirati 2,3,4,5,6. Međutim, nekoliko ograničenja ograničava njihovu širu primjenu na razumijevanje razvoja i funkcioniranja neuronskih krugova. Posebno nije jasno je li sazrijevanje hCO-a ograničeno odsutnošću određenih mikrookolišnih i senzornih ulaza prisutnih in vivo. Osim toga, budući da hCO-i nisu integrirani u krugove koji mogu generirati bihevioralne ishode, njihova korisnost u modeliranju genetski složenih i bihevioralnih neuropsihijatrijskih poremećaja trenutno je ograničena.
Transplantacija hCO u netaknuti živi mozak može prevladati ta ograničenja. Prethodne studije pokazale su da ljudski neuroni transplantirani u korteks glodavaca mogu preživjeti, projicirati i komunicirati sa stanicama glodavaca7,8,9,10,11,12. Međutim, ovi se eksperimenti obično provode na odraslim životinjama, što može ograničiti sinaptičku i aksonsku integraciju. Ovdje opisujemo paradigmu transplantacije u kojoj smo transplantirali 3D hCO dobiven iz hiPS stanica u primarni somatosenzorni korteks (S1) imunodeficijentnih štakora u ranoj fazi plastičnog razvoja. Transplantirani hCO (t-hCO) neuroni prolaze kroz značajno sazrijevanje, primaju talamokortikalne i kortikalno-kortikalne ulaze koji izazivaju senzorne odgovore i proširuju aksonske projekcije u mozak štakora kako bi potaknuli ponašanje traženja nagrade. Produženo sazrijevanje t-hCO otkrilo je neuronske defekte u bolesnika s Timothyjevim sindromom (TS), teškim genetskim poremećajem uzrokovanim mutacijama u naponski osjetljivom kalcijevom kanalu CaV1.2 tipa L (kodiranom od strane CACNA1C).
Kako bismo in vivo proučavali ljudske kortikalne neurone u krugovima, stereotaktički smo transplantirali intaktni 3D hCO u S1 ranih postnatalnih atimičnih štakora (3.-7. dan postnatalno) (slika 1a i prošireni podaci sa slika 1a-c). U ovom trenutku, talamokortikalne i kortikokortikalne aksonske projekcije još nisu završile svoju S1 inervaciju (ref. 13). Stoga je ovaj pristup osmišljen kako bi se maksimizirala integracija t-hCO uz minimiziranje utjecaja na endogene krugove. Kako bismo vizualizirali lokaciju t-hCO u živim životinjama, izveli smo T2-ponderirane MRI rekonstrukcije mozga štakora 2-3 mjeseca nakon transplantacije (slika 1b i prošireni podaci, slika 1d). t-hCO2 su lako uočljivi, a mjerenja volumena t-hCO2 bila su slična onima izračunatim iz fiksnih presjeka (Prošireni podaci, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 su lako uočljivi, a mjerenja volumena t-hCO2 bila su slična onima izračunatim iz fiksnih presjeka (Prošireni podaci, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO je lako promatrao, a volumenska mjerenja t-hCO bila su na isti način izračunata za fiksirane rezove (rasšireni podaci, slika 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 su lako uočljivi, a volumetrijska mjerenja t-hCO2 bila su slična onima izračunatim za fiksne presjeke (prošireni podaci, slika 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO se lako promatrao, a volumenska mjerenja t-hCO bila su na isti način izračunata za fiksirani rez (rasšireni podaci, slika 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 se lako uočavao, a volumetrijska mjerenja t-hCO2 bila su slična onima izračunatim za fiksne presjeke (prošireni podaci, slika 1d, e; P > 0,05).Odredili smo t-hCO₂ u 81% transplantiranih životinja otprilike 2 mjeseca nakon transplantacije (n = 72 životinje; hCO₂ iz 10 hiPS staničnih linija; hiPS stanične linije u Dodatnoj tablici 1). Od njih, 87% se nalazilo u moždanoj kori (slika 1c). Izvođenjem serijskih MRI skeniranja u više vremenskih točaka kod istog transplantiranog štakora, otkrili smo deveterostruko povećanje volumena t-hCO₂ unutar 3 mjeseca (slika 1d i prošireni podaci, slika 1f). Transplantirane životinje imale su visoku stopu preživljavanja (74%) 12 mjeseci nakon transplantacije (prošireni podaci, slika 1g i Dodatna tablica 2), a nisu pronađena očita motorička ili memorijska oštećenja, glioza ili elektroencefalogram (EEG). Podaci (slika 1g i dodatna tablica 2). 1h–m i 3e).
a, Shematski prikaz eksperimentalnog dizajna. hCO2 dobiven iz hiPS stanica transplantiran je u S1 novorođenih golih štakora 30. do 60. dana diferencijacije. b, T2-ponderirane koronalne i horizontalne MRI slike koje prikazuju t-hCO2 u S1 2 mjeseca nakon transplantacije. Mjerilo, 2 mm. c, Kvantifikacija stopa uspješnosti usađivanja prikazana je za svaku hiPS staničnu liniju (n = 108, brojevi unutar stupaca označavaju količinu t-hCO2 po hIPS staničnoj liniji) i kortikalnu ili subkortikalnu lokaciju (n = 88). d, MRI slika koronarne arterije (lijevo; mjerilo, 3 mm) i odgovarajuća 3D volumetrijska rekonstrukcija (mjerilo, 3 mm) koja pokazuje porast t-hCO2 tijekom 3 mjeseca. e, Pregled t-hCO2 obrazaca u moždanoj kori štakora. Mjerilo, 1 mm. f, Reprezentativne imunocitokemijske slike t-hCO prikazane od gore lijeva na desno (tijekom diferencijacije): PPP1R17 (4 mjeseca star), NeuN (8 mjeseci star), SOX9 i GFAP (8 mjeseci star), PDGFRα; (8 mjeseci), MAP2 (8 mjeseci) i IBA1 (8 mjeseci). Mjerilo, 20 µm. Koekspresija HNA ukazuje na stanice ljudskog podrijetla. g, snRNA-seq: Snimanje redukcije dimenzionalnosti ujedinjene mnogostrukosti i projekcije (UMAP) svih visokokvalitetnih jezgri t-hCO nakon Seurat integracije (n=3 uzorka t-hCO, n=2 hiPS stanične linije). Astrociti, stanice astrocitne linije; cyc prog, cirkulirajući progenitori; GluN DL, duboki glutamatergički neuroni; GluN DL/SP, duboki i sublamelarni glutamatergički neuroni; GluN UL, glutamatergički neuroni gornjeg sloja; oligodendrociti, oligodendrociti; OPC, progenitorske stanice oligodendrocita; RELN, reelin neuroni. h, Analiza obogaćivanja termina Gene Ontology (GO) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, izraženo u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima. h, Analiza obogaćivanja termina Gene Ontology (GO) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, izraženo u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima. h, obogaćeni termini Gene Ontology (GO) za genove sa znatnom aktivacijom (ispravljeni P <0,05, analiza kratnosti > 2, ekspresija krajnje mjere u 10% nuklearnog) u glutamaterijskim neuronima t-hCO u usporedbi s glutamaterijskim neuronima hCO. h, Analiza obogaćivanja termina genske ontologije (GO) za gene sa značajnom aktivacijom (prilagođeno P <0,05, promjena struka >2, ekspresija u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geni su značajno aktivirani (ispravljen P <0,05, kratnost izmjene> 2, ekspresirano krajnje u mjerenju od 10% jedra) u glutamaterijskim neuronima t-hCO u usporedbi s glutamaterijskim neuronima hCO Ontološka (GO) analiza termina obogaćenja. h, geni su bili značajno pojačano regulirani (prilagođeni P < 0,05, promjena struka > 2, izraženi u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima Ontološka (GO) analiza termina obogaćivanja.Točkasta linija označava vrijednost aq od 0,05. i, UMAP snimanje tipova GluN stanica u t-hCO2 korištenjem prijenosa oznaka iz referentnog skupa podataka 22 snRNA-seq motornog korteksa odraslih. CT — kortikotalamičke stanice, ET — ekstracerebralne stanice, IT — unutarnje telencefalne stanice, NP — bliska projekcija.
Zatim smo procijenili citoarhitekturu i ukupni stanični sastav t-hCO. Bojenje antitijelima endotelnih stanica štakora otkrilo je vaskularizaciju s t-hCO, dok je bojenje IBA1 otkrilo prisutnost mikroglije štakora u cijelom transplantatu (slika 1f i prošireni podaci, slika 3c,d). Imunobojenje je otkrilo stanice pozitivne na ljudski nuklearni antigen (HNA) koje koeksprimiraju PPP1R17 (kortikalni progenitori), NeuN (neuroni), SOX9 i GFAP (glijalne stanice) ili PDGFRα (oligodendrocitne progenitore) (slika 1f). Kako bismo proučili stanični sastav t-hCO pri rezoluciji pojedinačnih stanica, proveli smo sekvenciranje RNA jedne jezgre (snRNA-seq) nakon približno 8 mjeseci diferencijacije. Filtracija u skupnom stanju i uklanjanje jezgri štakora dali su 21 500 visokokvalitetnih mapa ljudskih mononukleara (slika 1g i prošireni podaci, slika 4a,b). Obrasci ekspresije tipičnih markera staničnog tipa identificirali su nakupine glavnih klasa kortikalnih stanica, uključujući duboke i površinske glutamatergičke neurone, cirkulirajuće progenitore, oligodendrocite i astrocitnu lozu (slika 1g, prošireni podaci, slika 4c i dodatna tablica 3). Imunobojenje za SATB2 i CTIP2 pokazalo je da unatoč prisutnosti kortikalnih podtipova, t-hCO nije pokazao jasnu anatomsku stratifikaciju (prošireni podaci, slika 3a). snRNA-seq hCO usklađen prema stadiju proizveo je uglavnom slične klase stanica, uz nekoliko iznimaka, uključujući odsutnost oligodendrocita i prisutnost GABAergičkih neurona, što može odražavati prethodno objavljene povoljne in vitro uvjete za lateralne progenitorske stanice15 (prošireni podaci, slika 4f-i i dodatna tablica 4). Analiza diferencijalne ekspresije gena otkrila je značajne razlike u glutamatergičkim neuronima između t-hCO i hCO (Dodatna tablica 5), ​​uključujući aktivaciju skupova gena povezanih s neuronskim sazrijevanjem kao što su sinaptička signalizacija, dendritička lokalizacija i aktivnost naponski kontroliranih kanala (Slika 1h i Dodatna tablica 5, tablica 6). Sukladno tome, kortikalni glutamatergički t-hCO neuroni pokazali su ubrzano transkripcijsko sazrijevanje.
Kako bismo razjasnili jesu li ove transkripcijske promjene u t-hCO povezane s morfološkim razlikama između hCO in vitro i t-hCO in vivo, rekonstruirali smo hCO i hCO ispunjene biocitinom u akutnim presjecima nakon 7-8 mjeseci diferencijacije. hCO neuroni (slika 2a). t-hCO neuroni bili su značajno veći, imali su 1,5 puta veći promjer some, dvostruko više dendrita i ukupno šesterostruko povećanje ukupne duljine dendrita u usporedbi s in vitro hCO (slika 2b). Osim toga, primijetili smo značajno veću gustoću dendritičkih bodlji u t-hCO neuronima nego u hCO neuronima (slika 2c). To sugerira da t-hCO neuroni prolaze kroz opsežno dendritično izduživanje i grananje, što, u kombinaciji s kontinuiranom proliferacijom stanica, može doprinijeti intenzivnom rastu t-hCO nakon transplantacije (slika 1d i prošireni podaci, slika 1f). To nas je potaknulo da istražimo elektrofiziološka svojstva. Kapacitet membrane bio je osam puta veći (prošireni podaci, slika 8d), membranski potencijal u stanju mirovanja bio je hiperpolariziraniji (približno 20 mV), a ubrizgavanje struje izazvalo je veću maksimalnu brzinu ekscitacije u t-hCO neuronima nego u hCO neuronima. in vitro (slika 2d), e), što je u skladu s većim i složenijim morfološkim značajkama t-hCO. Osim toga, učestalost spontanih ekscitacijskih postsinaptičkih strujnih događaja (EPSC) bila je značajno veća u t-hCO neuronima (slika 2f), što sugerira da je povećana gustoća dendritičnih bodlji uočena u t-hCO neuronima povezana s funkcionalnom ekscitabilnošću. spolna sinapsa. Potvrdili smo nezreli karakter hCO neurona in vitro snimanjem obilježenih glutamatergičnih neurona (prošireni podaci, slike 6a-c).
a, 3D rekonstrukcija biocitinom ispunjenih hCO i t-hCO neurona nakon 8 mjeseci diferencijacije. b, Kvantifikacija morfoloških značajki (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, Kvantifikacija morfoloških značajki (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, količinska ocjena morfoloških priznaka (n = 8 neurona hCO, n = 6 neurona t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških značajki (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b, količinska ocjena morfoloških priznaka (n = 8 neurona hCO, n = 6 neurona t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških značajki (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001).c, 3D rekonstrukcija dendritičnih grana hCO i t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije. Crvene zvjezdice označavaju pretpostavljene dendritične bodlje. Kvantifikacija gustoće dendritičkih bodlji (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0092). d, Kvantifikacija mirujućeg membranskog potencijala (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, Kvantifikacija mirujućeg membranskog potencijala (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, količinska ocjena membranskog potencijala pokoja (n = 25 neurona hCO, n = 16 neurona t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskog potencijala u mirovanju (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, količinska ocjena membranskog potencijala pokoja (n = 25 neurona hCO, n = 16 neurona t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskog potencijala u mirovanju (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, Ponavljano djelovanje akcijskog potencijala u hCO i t-hCO inducirano povećanjem strujnih injekcija i kvantifikacija maksimalne brzine djelovanja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, Ponavljano djelovanje akcijskog potencijala u hCO i t-hCO inducirano povećanjem strujnih injekcija i kvantifikacija maksimalne brzine djelovanja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, ponovno povećanje potencijalnog djelovanja u hCO i t-hCO, povećano povećanje toka, i količinska ocjena maksimalne brzine izlučivanja (n = 25 neurona hCO, n = 16 neurona t-hCO; *** P <0,0001). e, ponovno aktiviranje akcijskog potencijala u hCO i t-hCO inducirano povećanjem struje i kvantifikacija maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, ponavljajuće se pobuđivanje potencijalnog djelovanja hCO i t-hCO, povećano povećanje isporuke toka, i količinska ocjena maksimalne brzine pobuđivanja (n = 25 neurona hCO, n = 16 neurona t-hCO; *** P <0,0001). e, ponovljeno aktiviranje akcijskih potencijala hCO i t-hCO induciranih povećanom opskrbom strujom i kvantifikacijom maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC-ove (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC-ove (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, spontani EPSC (sEPSC) u neuronima hCO i t-hCO kroz 8 mjeseci razlike i kvantitativna procjena učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 neurona hCO, n = 17 neurona t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC-ove (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija stope sinaptičkih događaja (n=25 hCO neurona, n=17 t-hCO neurona; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, spontani EPSC (sEPSC) u neuronima hCO i t-hCO kroz 8 mjeseci razlike i kvantitativna procjena učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 neurona hCO, n = 17 neurona t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC-ove (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija stope sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; *** P < 0,0001).Za bf, hCO i t-hCO u liniji 1208-2 uzeti su iz iste serije za diferencijaciju koja se održava paralelno. g, Analiza obogaćivanja genskog skupa (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima s genskim skupovima i ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (LRG) ovisnih o aktivnosti identificiranih iz in vivo studije na miševima16 i ljudski specifičnim LRG-ovima iz in vitro neurona17. g, Analiza obogaćivanja genskog skupa (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima s genskim skupovima i ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (LRG) ovisnih o aktivnosti identificiranih iz in vivo studije na miševima16 i ljudski specifičnim LRG-ovima iz in vitro neurona17. g, analiza obogaćenja skupa gena (odnostrani točni Fišerov kriterij) gena sa značajnom aktivacijom (ispravljeni P <0,05, kratnost izmjene > 2, ekspresija u manjoj mjeri u 10% jedra) u glutamaterijskim neuronima t-hCO u usporedbi s glutamaterijskim neuronima hCO skup gena kao raniji (ERG), tako i pozadinski (LRG) genovi, zavisnih od aktivnosti, identificiranih u istraživanju miševa in vivo16, i specifičnih za LRG čovjeka iz neurona in vitro17. g, analiza obogaćivanja genskog skupa (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena sa značajnom aktivacijom (prilagođeno P <0,05, promjena struka >2, ekspresija u najmanje 10% jezgri) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u usporedbi sa skupovima hCO glutamatergičnih neurona i ranih (ERG) i kasnih (LRG) gena ovisnih o aktivnosti identificiranih u in vivo miševa16 i ljudskim LRG-ovima iz neurona in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, glutamatergetski neuroni t-hCO značajno su aktivirani u usporedbi s glutamatergenskim neuronima hCO (ispravljeni P<0,05, кратnost promjena> 2, ne manje od 10% Analiza obogaćenog skupa gena (odnostrani točni Fišerov test) rani odgovor (ERG) i prethodni gen, ovisni o odgovoru aktivnosti (LRG), identificirani u istraživanju myšah in vivo16 i neuronah in vitro17, specifične za čovjeka. g, t-hCO glutamatergički neuroni bili su značajno pojačano regulirani u usporedbi s hCO glutamatergičkim neuronima (prilagođeno P <0,05, promjena struka >2, najmanje 10% Analiza obogaćivanja gena ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (jednostrani Fisherov egzaktni test) geni ovisni o aktivnosti odgovora (LRG) identificirani su u in vivo miševa16 i in vitro neurona.17 LRG-ovi specifični za čovjeka.Točkasta linija označava Bonferronijevu korigiranu P vrijednost od 0,05. h-1, ekspresija GluN gena (pseudo-pakiranje i skaliranje svakog gena) bila je značajno povišena u snRNA-seq replikama LRG gena u t-hCO glutamatergičkim neuronima. i, imunobojenje koje pokazuje ekspresiju SCG2 u t-hCO (gornji) i hCO (donji) neuronima. Bijele strelice pokazuju na SCG2+ stanice. Mjerilo, 25 µm. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.
Na temelju povećane aktivnosti t-hCO uočene u ex vivo presjecima, snRNA-seq otkrio je ovisnu o aktivnosti pojačanu regulaciju genskih transkripata u t-hCO u usporedbi s hCO in vitro. Glutamatergični t-hCO neuroni eksprimirali su više razine gena koji reguliraju aktivnost kasnog odgovora (slika 2g,h), što je pronađeno u prethodnim studijama na mišjim i ljudskim neuronima16,17. Na primjer, BDNF18, SCG2 i OSTN, gen koji regulira aktivnost specifičan za primate, pokazali su povećanu ekspresiju u t-hCO neuronima u usporedbi s hCO neuronima (slika 2g-i). Dakle, t-hCO neuroni pokazali su poboljšane karakteristike sazrijevanja u usporedbi s hCO neuronima transkripcijskim, morfološkim i funkcionalnim analizama.
Kako bismo dodatno procijenili povezanost sazrijevanja t-hCO s razvojem ljudskog mozga, proveli smo transkriptomske usporedbe tipova fetalnih i odraslih kortikalnih stanica19,20 i odraslih21,22, kao i opsežne podatke o ekspresiji kortikalnih gena23 tijekom razvoja (prošireni podaci, slika 5). U usporedbi s prethodnim radom24, globalni status sazrijevanja transkriptoma hCO i t-hCO u 7-8 mjeseci diferencijacije uglavnom je u skladu s vremenom razvoja in vivo i najviše je ekvivalentan kasnom fetalnom životu (Prošireni podaci, slika 5a). Značajno je da smo uočili povećanu zrelost transkriptoma u t-hCO u usporedbi s hCO odgovarajuće dobi, kao i aktivaciju transkriptoma povezanu sa sinaptogenezom, astrogenezom i mijelinizacijom (prošireni podaci, slike 5b-d). Na staničnoj razini pronašli smo dokaze o tanjem podtipu korteksa u t-hCO, s nakupinama glutamatergičnih neurona koji se preklapaju s odraslim podtipovima neurona L2/3, L5 i L6 (slika 1i). Nasuprot tome, preklapanje klastera između glutamatergičnih t-hCO neurona i fetalnih kortikalnih neurona bilo je ograničenije u sredini trudnoće (prošireni podaci, slika 5e-j). Kako bismo utvrdili jesu li t-hCO neuroni funkcionalno slični ljudskim postnatalnim neokortikalnim neuronima, proveli smo elektrofiziološka snimanja i anatomske rekonstrukcije ljudskih L2/3 piramidalnih neurona u oštrim dijelovima ljudskog postnatalnog korteksa (prošireni podaci, slika 7a). Elektrofiziološka svojstva L2/3 piramidalnih neurona bila su slična svojstvima t-hCO piramidalnih neurona (prošireni podaci, slika 7e). Morfološki, L2/3 neuroni iz postnatalnih ljudskih uzoraka bili su sličniji t-hCO nego hCO, iako su L2/3 stanice bile dulje, sadržavale su više grana ukupno i imale su veću gustoću kralježaka (slika 3g i prošireni podaci, slika 7b-). G).
a, transplantacija hCO proizvedenog kontrolnim i TS hiPS staničnim linijama u neonatalne štakore. b, 3D rekonstrukcija t-hCO neurona ispunjenih biocitinom nakon 8 mjeseci diferencijacije. c, kvantifikacija srednje duljine dendrita (n = 19 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron; **P = 0,0041). d, 3D rekonstruirane dendritične grane iz kontrole i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičnih spina (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D rekonstruirane dendritične grane iz kontrole i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičnih spina (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstrukcija dendritnih neurona iz kontrole i TS t-hCO kroz 8 mjeseci diferenciranja i kvantitativne procjene gustine dendritnih šipova (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neurona, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija dendritičnih grana iz kontrolnog i t-hCO TS-a nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičkih spina (n=16 kontrolnih neurona, n=21 TS neuron, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D rekonstrukcija dendritnih neurona i kontrola TS t-hCO kroz 8 mjeseci diferenciranja i kvantitativna procjena gustine dendritnih šipova (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neurona, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija kontrolnih dendritičnih grana i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičnih spina (n=16 kontrolnih neurona, n=21 TS neuron, ***P<0,0001).Crvene zvjezdice označavaju pretpostavljene dendritične bodlje. e, spontane EPSC-ove u kontrolnim i TS t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije. f, kumulativni dijagram frekvencije i kvantifikacija frekvencije i amplitude sinaptičkih događaja (n=32 kontrolna neurona, n=26 TS neurona; **P=0,0076 i P=0,8102). g, Scholl analiza TS i kontrolnih neurona u hCO i t-hCO. Isprekidane linije prikazuju ljudske L2/3 postnatalne piramidalne neurone za usporedbu (n = 24 kontrolna t-hCO neurona, n = 21 TS t-hCO neuron, n = 8 kontrolnih hCO neurona i n = 7 TS hCO neurona). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija
Sposobnost t-hCO da replicira morfološke i funkcionalne značajke neurona ljudskog korteksa na visokoj razini potaknula nas je da istražimo može li se t-hCO koristiti za otkrivanje fenotipova bolesti. Usredotočili smo se na TS, teški neurološki razvojni poremećaj uzrokovan mutacijama s pojačanom funkcijom u genu koji kodira CaV1.2, a koji pokreće transkripciju gena ovisnu o aktivnosti u neuronima. Dobili smo hCO od tri pacijenta s TS-om koji nose najčešću supstituciju (p.G406R) i tri kontrolne skupine (slika 3a). Nakon transplantacije otkrili smo da je dendritička morfologija promijenjena u TS neuronima u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 3b i prošireni podaci, slika 8a,b), s dvostrukim povećanjem broja primarnih dendrita i ukupnim povećanjem srednjeg i ukupnog smanjenja duljine dendrita (slika 3c i prošireni podaci, slika 8c). To je bilo povezano s povećanom gustoćom bodlji i povećanom učestalošću spontanih EPSC-ova u TS-u u usporedbi s kontrolnim neuronima (slika 3d–f i prošireni podaci, slika 8g). Daljnja analiza otkrila je obrasce abnormalnog dendritičnog grananja u t-hCO TS u usporedbi s kontrolama, ali ne i u in vitro TS hCO u sličnoj fazi diferencijacije (slika 3g). To je u skladu s našim prethodnim izvješćima o smanjenju dendritičkih stanica ovisnom o aktivnosti u TS i naglašava sposobnost ove transplantacijske platforme za otkrivanje fenotipova bolesti in vivo.
Zatim smo se pitali u kojoj su mjeri t-hCO stanice funkcionalno integrirane u štakorski S1. S1 kod glodavaca prima snažne sinaptičke ulaze iz ipsilateralnih ventralnih bazalnih i stražnjih talamičkih jezgri, kao i ipsilateralnog motoričkog i sekundarnog somatosenzornog korteksa te kontralateralnog S1 (slika 4a). Kako bismo obnovili obrazac inervacije, inficirali smo hCO virusom bjesnoće-dG-GFP/AAV-G i transplantirali hCO u štakorski S1 3 dana kasnije. Uočili smo gustu ekspresiju GFP-a u neuronima ipsilateralnog S1 i ventralnih bazalnih ganglija 7-14 dana nakon transplantacije (slika 4b, c). Osim toga, bojenje talamičkog markera netrina G1 antitijelima otkrilo je prisutnost talamičkih završetaka u t-hCO (slika 4d, e). Kako bismo procijenili mogu li ove aferentne projekcije izazvati sinaptičke odgovore u t-hCO stanicama, proveli smo snimke cijelih stanica iz ljudskih stanica u oštrim dijelovima talamokortikalnog sloja. Električna stimulacija štakorskog S1, unutarnje kapsule, bijele tvari, vlakana u blizini t-hCO ili optogenetska aktivacija talamičkih završetaka koji eksprimiraju opsin u t-hCO inducirala je kratkolatentne EPSC-ove u t-hCO neuronima izloženim antagonistu AMPA receptora NBQX. (Slika 4f, g i prošireni podaci, Slika 9a–g). Ovi podaci pokazuju da je t-hCO anatomski integriran u mozak štakora i da ga može aktivirati tkivo domaćina štakora.
a, Shematski dijagram eksperimenta praćenja bjesnoće. b, GFP i ljudska ekspresija STEM121 između t-hCO i moždane kore štakora (gornja ploča). Također je prikazana ekspresija GFP-a u ipsilateralnoj ventralnoj bazalnoj jezgri (VB) štakora (dolje lijevo) i ipsilateralnom S1 (dolje desno). Mjerilo, 50 µm. Crveni kvadrati predstavljaju područja mozga gdje su slike snimljene. c, kvantifikacija stanica koje eksprimiraju GFP (n = 4 štakora). d, e — talamički terminali Netrina G1+ u t-hCO. d prikazuje koronalni presjek koji sadrži jezgre t-hCO i VB. Mjerilo, 2 mm. e prikazuje ekspresiju Netrina G1 i STEM121 u neuronima t-hCO (lijevo) i VB (desno). Mjerilo, 50 µm. Narančasta isprekidana linija označava granicu t-hCO. f, g, Trenutni tragovi t-hCO neurona nakon električne stimulacije u S1 štakora (f) ili unutarnje kapsule (g), s (ljubičasto) ili bez (crno) NBQX (lijevo). Amplitude EPSC-a sa i bez NBQX-a (n = 6 S1 neurona, *P = 0,0119; i n = 6 neurona unutarnje kapsule, **P = 0,0022) (sredina). Postotak t-hCO neurona koji pokazuju EPSC kao odgovor na električnu stimulaciju S1 štakora (f) ili unutarnje kapsule (g) (desno). aCSF, umjetna cerebrospinalna tekućina. h, shematski dijagram 2P eksperimenta snimanja (lijevo). Ekspresija GCaMP6 u t-hCO (sredina). Mjerilo, 100 µm. Vremenski tijek fluorescencije GCaMP6 (desno). i, Z-vrijednost spontane aktivnosti fluorescencije. j, shematski prikaz stimulacije brkova. k, z-vrijednost 2P fluorescentnih trajektorija u jednom pokusu, usklađena s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) u primjernim stanicama. l, populacijski prosječni z-vrijednosti svih stanica usklađene s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) (crvena) ili nasumično generirane vremenske oznake (sivo). m. Shematski dijagram eksperimenta optičkog označavanja. n, Sirove krivulje napona iz primjerne t-hCO ćelije tijekom stimulacije plavim laserom ili otklona brkova. Crvene strelice označavaju prve šiljke uzrokovane svjetlošću (gore) ili uzrokovane otklonom brkova (dolje). Sivo sjenčanje označava razdoblja otklona brkova. o, Valni oblici vršne svjetlosti i odgovori otklona brkova. p, šiljci jednog pokušaja, usklađeni s odstupanjem brkova u stanicama primjera. 0 označava odstupanje brkova (isprekidana linija). q, populacijski prosječna brzina okidanja z-vrijednosti za sve fotosenzitivne stanice, usklađena s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) (crvena) ili nasumično generirane vremenske oznake (sivo). r, Udio fotosenzitivnih jedinica značajno moduliranih devijacijom brkova (n = 3 štakora) (lijevo). Latencija vršnog z-vrijednosti (n = 3 štakora; n = 5 (svijetlozelena), n = 4 (tamnozelena) i n = 4 (cijan) modulacijske jedinice devijacije brkova po štakoru) (desno). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija
Zatim smo se pitali može li se t-hCO aktivirati senzornim podražajima in vivo. Transplantirali smo hCO koji eksprimira genetski kodirane kalcijeve indikatore GCaMP6 u S1 štakore. Nakon 150 dana, proveli smo vlaknastu fotometriju ili dvofotonsko snimanje kalcija (slika 4h i prošireni podaci, slika 10a). Otkrili smo da t-hCO stanice pokazuju sinkroniziranu ritmičku aktivnost (slika 4i, prošireni podaci, slika 10b i dodatni video 1). Kako bismo karakterizirali vršnu aktivnost t-hCO, proveli smo izvanstanične elektrofiziološke snimke kod anesteziranih transplantiranih štakora (prošireni podaci, slike 10c-f). Generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika; stoga ove snimljene jedinice predstavljaju pretpostavljene ljudske neurone, iako sama elektrofiziologija ne dopušta određivanje vrste podrijetla. Promatrali smo sinkronizirane nalete aktivnosti (prošireni podaci, slika 10d). Naleti su trajali oko 460 ms i bili su odvojeni razdobljima tišine od oko 2 s (prošireni podaci, slike 10d, e). Pojedinačne jedinice ispalile su u prosjeku oko tri metka po rafalu, što je približno 73% registriranih jedinica po rafalu. Aktivnosti pojedinačnih jedinica bile su u visokoj korelaciji, a te korelacije bile su veće od onih jedinica identificiranih kod necijepljenih životinja snimljenih pod istim uvjetima (prošireni podaci, slika 10f). Kako bismo dodatno karakterizirali odgovore šiljaka identificiranih neurona ljudskog podrijetla, proveli smo eksperimente svjetlosnog označavanja na anesteziranim štakorima transplantiranim s hCO koji eksprimira svjetlosno osjetljivi kationski kanal rodopsin 2 (hChR2), putem kojeg t-hCO neuroni prepoznaju kratku latenciju (manje od 10 ms) kao odgovor na podražaje plavim svjetlom (slika 4m–o). t-hCO neuroni pokazali su nalete spontane aktivnosti na frekvencijama sličnim onima uočenim u snimanju kalcija, kao i elektrofiziološkim snimkama provedenim u t-hCO u odsutnosti svjetlosnog označavanja (prošireni podaci, slika 10c-g). Nije uočena spontana aktivnost u odgovarajućim fazama hCO snimljenim in vitro. Kako bismo procijenili može li se t-hCO aktivirati senzornim podražajima, nakratko smo skrenuli brkove štakora dalje od t-hCO (slika 4j,m i prošireni podaci, slika 10h,k). Prema prethodnim studijama8,10, podskup t-hCO stanica pokazao je povećanu aktivnost kao odgovor na otklon brkova, što nije uočeno kada su podaci uspoređeni sa slučajnim vremenskim oznakama (slika 4k-q i prošireni podaci, slika 10h-q). Doista, oko 54% opto-obilježenih pojedinačnih jedinica pokazalo je značajno povećanu stopu uzbuđenja nakon stimulacije brkova, s vrhuncem na oko 650 ms (slika 4r). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da t-hCO prima odgovarajuće funkcionalne ulaze i da se može aktivirati podražajima iz okoliša.
Zatim smo istražili može li t-hCO aktivirati sklopove u štakora kako bi kontrolirao ponašanje. Prvo smo istražili projiciraju li se aksoni t-hCO neurona u okolna tkiva štakora. Inficirali smo hCO lentivirusom koji kodira hChR2 spojen s EYFP (hChR2-EYFP). Nakon 110 dana, uočili smo ekspresiju EYFP-a u ipsilateralnim kortikalnim regijama, uključujući slušne, motoričke i somatosenzorne kortekse, kao i u subkortikalnim regijama, uključujući striatum, hipokampus i talamus (slika 5a). Kako bismo procijenili mogu li ove eferentne projekcije izazvati sinaptičke odgovore u stanicama štakora, optički smo aktivirali t-hCO stanice koje eksprimiraju hChR2-EYFP snimanjem stanica moždane kore štakora u oštrim presjecima mozga. Aktivacija t-hCO aksona plavim svjetlom inducirala je EPSC-ove kratke latencije u neuronima piramidalne kore štakora, koje je blokirao NBQX (slike 5b–g). Osim toga, te odgovore mogao je blokirati tetrodotoksinom (TTX), a obnoviti 4-aminopiridinom (4-AP), što sugerira da su uzrokovani monosinaptičkim vezama (slika 5e).
a, Shematski dijagram praćenja aksona (lijevo). Ekspresija t-hCO EYFP (desno). Mjerilo, 100 µm. A1, slušni korteks, ACC, prednji cingularni korteks, d. striatum, dorzalni striatum, HPC, hipokampus; Dijafragma, lateralni septum, mPFC, medijalni prefrontalni korteks, piri, piriformni korteks, v. striatum, ventralni striatum, VPM, ventropostomedijalna jezgra talamusa, VTA, ventralna tegmentalna regija. Crveni kvadrati predstavljaju područja mozga gdje su slike snimljene. b, Shematski dijagram eksperimenta stimulacije. c, d, Primjeri odgovora fotostruje inducirane plavom svjetlošću (gore) i napona (dolje) u ljudskim (c) EYFP+ t-hCO ili štakorskim (d) EYFP- stanicama. e, f, Trenutni tragovi neurona štakora nakon stimulacije plavom svjetlošću aksona t-hCO s TTX i 4-AR (zeleno), TTX (sivo) ili aCSF (crno) (e), s (ljubičasto) ili bez (crno) ) ) NBQX (e). g, latencija odgovora induciranih plavom svjetlošću u stanicama štakora (n = 16 stanica); horizontalne trake označavaju prosječnu latenciju (7,13 ms) (lijevo). Amplituda EPSC-ova izazvanih svjetlošću snimljenih s ili bez NBQX-a (n = 7 stanica; ***P < 0,0001) (sredina). Amplituda EPSC-ova izazvanih svjetlošću snimljenih s ili bez NBQX-a (n = 7 stanica; ***P < 0,0001) (sredina). Amplituda izazvanog svijeta EPSC, registrirana s ili bez NBQX (n = 7 stanica; ***P <0,0001) (u središtu). Amplituda svjetlošću induciranih EPSC-ova zabilježenih s ili bez NBQX-a (n = 7 stanica; ***P < 0,0001) (sredina).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Amplituda izazvanog svijeta EPSC, registrirana s ili bez NBQX (n = 7 stanica; ***P <0,0001) (u središtu). Amplituda svjetlošću induciranih EPSC-ova zabilježenih s ili bez NBQX-a (n = 7 stanica; ***P < 0,0001) (sredina).Postotak stanica štakora koje pokazuju EPSC-ove koji reagiraju na plavo svjetlo (desno). h, Shematski dijagram zadatka ponašanja. d0, dan 0. i. Izvedba primjernih životinja 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno) treninga. Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001). Srednji broj ocrtanih, izvršenih u danu 1 (slijep) ili danu 15 (u sredini sprave) (n = 150 ispitivanja sa sinim svijetom, n = 150 ispitivanja s crvenim svijetom; ***P <0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0,001 Srednji broj ocrtanih, izvršenih u danu 1 (slijep) ili danu 15 (u sredini sprave) (n = 150 ispitivanja sa sinim svijetom, n = 150 ispitivanja s crvenim svijetom; ***P <0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001).Kumulativni lizanja za ispitivanja crvenom i plavom svjetlošću 1. dana (sredina lijevo) ili 15. dana (desno). NS, nije značajno. j,k, Karakteristike ponašanja svih životinja kojima je transplantiran t-hCO koji eksprimira hChR2-EYFP (j) ili kontrolni fluorofor (k) 1. ili 15. dana (hChR2-EYFP: n = 9 štakora, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Évolûciâ pokazatelâ predpoloženiâ (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolnih; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Évolûciâ pokazatelej predpostavki (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, ekspresija FOS-a kao odgovor na optogenetsku aktivaciju t-hCO u S1. Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po skupini; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (desno). Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po skupini; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (desno). Prikazane su slike ekspresije FOS (udio) i kvantitativna određivanja (n = 3 u skupini; * P <0,05, ** P <0,01 i *** P <0,001) (slučaj). Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po skupini; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (desno).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Prikazane su slike ekspresije FOS (udio) i kvantitativna određivanja (n = 3 u skupini; * P <0,05, ** P <0,01 i *** P <0,001) (slučaj). Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po skupini; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (desno).Mjerilo, 100 µm. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna pogreška BLA, bazolateralnog tonzila, MDT-a, dorzomedijalne talamičke jezgre, PAG-a, periakveduktalne sive boje.
Konačno, pitali smo može li t-hCO modulirati ponašanje štakora. Kako bismo to testirali, transplantirali smo hCO koji eksprimira hChR2-EYFP u S1, a 90 dana kasnije implantirali smo optička vlakna u t-hCO za isporuku svjetlosti. Zatim smo štakore trenirali modificiranom paradigmom operantnog uvjetovanja (slika 5h). Životinje smo stavili u komoru za testiranje ponašanja i nasumično primijenili 5 sekundi plavih (473 nm) i crvenih (635 nm) laserskih podražaja. Životinje su dobivale nagradu u obliku vode ako su lizale tijekom stimulacije plavim svjetlom, ali nisu lizale tijekom stimulacije crvenim svjetlom. Prvog dana treninga životinje nisu pokazale razliku u lizanju kada su stimulirane plavim ili crvenim svjetlom. Međutim, 15. dana, životinje kojima je transplantiran hCO koji eksprimira hChR2-EYFP pokazale su aktivnije lizanje kada su stimulirane plavim svjetlom u usporedbi sa stimulacijom crvenim svjetlom. Ove promjene u ponašanju lizanja nisu uočene kod kontrolnih životinja kojima je transplantiran hCO koji eksprimira kontrolni fluorofor (stopa uspjeha učenja: hChR2 89%, EYFP 0%, slika 5i-1 i dodatni video 2). Ovi podaci sugeriraju da t-hCO stanice mogu aktivirati neurone štakora kako bi potaknule ponašanje traženja nagrade. Kako bismo saznali koji bi t-hCO neuronski krugovi štakora mogli biti uključeni u ove promjene u ponašanju, optogenetski smo aktivirali t-hCO kod dresiranih životinja i uzeli tkiva 90 minuta kasnije. Imunohistokemija je otkrila ekspresiju FOS proteina ovisnog o aktivnosti u nekoliko regija mozga uključenih u motivirano ponašanje, uključujući medijalni prefrontalni korteks, medijalni talamus i periakveduktalnu sivu tvar, koja je bila eksprimirana ili kod nestimuliranih kontrolnih životinja ili kod životinja. riža. 5m). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da t-hCO može modulirati neuronsku aktivnost štakora kako bi potaknuo ponašanje.
Neuralni organoidi predstavljaju obećavajući sustav za proučavanje ljudskog razvoja i bolesti in vitro, ali su ograničeni nedostatkom veza između krugova koji postoje in vivo. Razvili smo novu platformu u kojoj smo transplantirali hCO u S1 imunokompromitiranih ranih postnatalnih štakora kako bismo proučavali razvoj i funkciju ljudskih stanica in vivo. Pokazali smo da t-hCO razvija zrele tipove stanica koji nisu uočeni in vitro28 te da je t-hCO anatomski i funkcionalno integriran u mozak glodavaca. Integracija t-hCO u neuralne krugove glodavaca omogućila nam je uspostavljanje veze između stanične aktivnosti ljudi i proučavanog ponašanja životinja, pokazujući da t-hCO neuroni mogu modulirati neuronsku aktivnost štakora kako bi potaknuli bihevioralne reakcije.
Platforma koju opisujemo ima nekoliko prednosti u odnosu na prethodna istraživanja o transplantaciji ljudskih stanica u mozgove glodavaca. Prvo, transplantirali smo hCO₂ u korteks ranih postnatalnih štakora, što može olakšati anatomsku i funkcionalnu integraciju. Drugo, t-hCO₂ MRI praćenje omogućilo nam je proučavanje položaja i rasta transplantata kod živih životinja, što nam je omogućilo provođenje dugoročnih studija na više životinja i utvrđivanje pouzdanosti nekoliko hiPS staničnih linija. Konačno, transplantirali smo intaktne organoide, umjesto izoliranih suspenzija pojedinačnih stanica, koje su manje destruktivne za ljudske stanice i mogu potaknuti integraciju i stvaranje neurona ljudskog korteksa u mozgu štakora.
Priznajemo da unatoč napretku u ovoj platformi, vremenska, prostorna i međuvrsna ograničenja sprječavaju formiranje ljudskih neuronskih krugova s ​​visokom vjernošću, čak i nakon transplantacije u ranoj fazi razvoja. Na primjer, nije jasno predstavlja li spontana aktivnost uočena u t-hCO razvojni fenotip sličan ritmičkoj aktivnosti uočenoj tijekom kortikalnog razvoja ili je to zbog odsutnosti supresivnih tipova stanica prisutnih u t-hCO. Slično tome, nije jasno u kojoj mjeri odsutnost laminacije u t-hCO utječe na povezanost lanca30. Budući rad usredotočit će se na integraciju drugih tipova stanica kao što su ljudska mikroglija, ljudske endotelne stanice i različiti udjeli GABAergičkih interneurona, kao što je prikazano korištenjem sklopa 6 in vitro, kao i na razumijevanje kako se neuronska integracija i obrada mogu dogoditi u promijenjenim transkripcijskim, sinaptičkim i bihevioralnim razinama t-hCO u stanicama dobivenim od pacijenata.
Sveukupno, ova in vivo platforma predstavlja snažan resurs koji može nadopuniti in vitro istraživanje razvoja ljudskog mozga i bolesti. Očekujemo da će nam ova platforma omogućiti otkrivanje novih fenotipova na razini lanca u inače nedostižnim stanicama dobivenim od pacijenata i testiranje novih terapijskih strategija.
Generirali smo hCO2.5 iz HiPS stanica kako je prethodno opisano. Kako bi se pokrenula proizvodnja hCO iz hiPS stanica uzgajanih na hranjivim slojevima, intaktne kolonije hiPS stanica uklonjene su iz zdjelica za kulturu pomoću dispaze (0,35 mg/mL) i prenesene u zdjelice s plastičnim kulturama s ultra-niskim prianjanjem koje sadrže hiPS staničnu podlogu za kulturu. (Corning) nadopunjenu s dva SMAD inhibitora dorsomorfinom (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) te ROCK inhibitorom Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Tijekom prvih 5 dana, medij hiPS stanica mijenjao se svakodnevno, a dodavali su se dorsomorfin i SB-431542. Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoidi su preneseni u neuronski medij koji sadrži neurobazalni A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin i streptomicin (1:100, Life Technologies) te je nadopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dana. Od 25. do 42. dana, medij je nadopunjen neurotrofičnim faktorom izvedenim iz mozga (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) uz promjene medija svaki drugi dan. Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoidi su preneseni u neuronski medij koji sadrži neurobazalni A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin i streptomicin (1:100, Life Technologies) te je nadopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dana. Od 25. do 42. dana, medij je nadopunjen neurotrofičnim faktorom izvedenim iz mozga (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) uz promjene medija svaki drugi dan.Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoidi su preneseni u neuronski medij koji sadrži Neurobasal-A (10888, Life Technologies), dodatak prehrani B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) i penicilin.i streptomicin (1:100, Life Technologies) i dopunjeni epidermalni faktor rasta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i faktor rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24 dana. i streptomicin (1:100, Life Technologies) te nadopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24. dana.Od 25. do 42. dana, u medij su dodani neurotrofični faktor izveden iz mozga (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), a medij se mijenjao svaki drugi dan.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Tehnologije）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Sustavi）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素（（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R & D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Sustavi）直至第24天。 U 6. danu suspenzije neurosfere bile su prebačene u dodatke koji sadrže neurobazal-A (10888, Life Technologies), dodatak V-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin-neutralizirani streptomicin (1:100, Life). Technologies) s dodatkom epidermalnog faktora rasta (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i faktora rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Šestog dana, suspenzije neurosfera prebačene su na dodatak prehrani koji sadrži neurobazal-A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicin neutraliziran penicilinom (1:100, Life Technologies) dopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) do 24 dana. Sustavi istraživanja i razvoja) do 24. dana.Od 25. do 42. dana, neurotrofični faktor izveden iz mozga (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofični faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) dodavani su u medij za kulturu svaki drugi dan. Medij se mijenjao jednom.Počevši od 43. dana, hCO₂ je održavan u nedopunjenom neurobazalnom-A mediju (NM; 1088022, Thermo Fisher) s promjenom medija svakih 4-6 dana. Kako bi se dobio hCO₂ iz hiPS stanica uzgajanih u uvjetima bez hranilice, hiPS stanice su inkubirane s Accutaseom (AT-104, Innovate Cell Technologies) na 37°C tijekom 7 minuta, disocirane na pojedinačne stanice i nasađene na AggreWell 800 ploče (34815, STEMCELL Technologies) pri gustoći od 3 × 10⁶ pojedinačnih stanica po jažici u Essential 8 mediju nadopunjenom ROCK inhibitorom Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Nakon 24 sata, medij u jažicama je pipetom prebačen u medij koji sadrži Essential 6 medij (A1516401, Life Technologies) nadopunjen dorzomorfinom (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Od 2. do 6. dana, Essential 6 medij je svakodnevno zamjenjivan dorzomorfinom i dodatkom SB-431542. Od šestog dana, suspenzije neurosfera su prenesene u neurobazalni medij i održavane kako je gore opisano.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrio Administrativni odbor za njegu laboratorijskih životinja Sveučilišta Stanford (APLAC). Gravidni eutimni RNU (rnu/+) štakori kupljeni su (Charles River Laboratories) ili smješteni. Životinje su držane na 12-satnom ciklusu svjetlo-tama s hranom i vodom ad libitum. Mladunci golih (FOXN1–/–) štakora u dobi od tri do sedam dana identificirani su rastom nezrelih brkova prije izlučivanja. Štenci (muški i ženski) anestezirani su s 2-3% izoflurana i postavljeni na stereotaksični okvir. Izvršena je trepanacija lubanje promjera približno 2-3 mm iznad S1 uz održavanje integriteta dure mater. Zatim se upotrijebi igla 30-G (približno 0,3 mm) neposredno izvan kraniotomije za probijanje dure. Nakon toga nanesite HCO3 na tanki parafilm 3×3 cm i uklonite višak medija. Pomoću Hamiltonove štrcaljke pričvršćene na iglu 23 G pod kutom od 45°, nježno uvucite hCO₃ u najdistalniji kraj igle. Zatim postavite štrcaljku na pumpu za štrcaljku spojenu na stereotaksički uređaj. Zatim postavite vrh igle preko prethodno napravljene rupe za ubod širine 0,3 mm u duri (z = 0 mm) i suzite štrcaljku za 1–2 mm (z = približno –1,5 mm) dok se igla ne nađe između dure mater A. Ne stvori se gusto brtvljenje. Zatim podignite štrcaljku do središta kortikalne površine pri z = -0,5 mm i ubrizgajte hCO₃ brzinom od 1-2 µl u minuti. Nakon završetka injekcije hCO₃, igla se uvlači brzinom od 0,2-0,5 mm u minuti, koža se zašije, a štene se odmah stavlja na toplu grijaću podlogu do potpunog oporavka. Neke su životinje transplantirane bilateralno.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrilo Sveučilište Stanford APLAC. Štakori (stariji od 60 dana nakon transplantacije) anestezirani su s 5% izofluranom i anestezirani s 1-3% izoflurana tijekom snimanja. Za vizualizaciju je korišten aktivno zaštićeni horizontalni skener za bušotine od 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) s gradijentnim pogonom International Electric Company (IECO), zaštićenim gradijentnim umetkom unutarnjeg promjera 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) koristeći AVANCE.III, osmokanalne višezavojne RF i višejezgrene mogućnosti te prateću Paravision 6.0.1 platformu. Snimanje je provedeno pomoću aktivno dekupirane volumetrijske RF zavojnice unutarnjeg promjera 86 mm i četverokanalne kriogenski hlađene RF zavojnice samo za prijem. Aksijalni 2D Turbo-RARE (vrijeme ponavljanja = 2500 ms, vrijeme odjeka = 33 ms, 2 prosjeka) sa 16 snimaka slojeva, debljina sloja 0,6–0,8 mm, koji sadrži 256 × 256 uzoraka. Signali su primljeni pomoću kvadraturne primopredajne volumetrijske RF zavojnice s unutarnjim promjerom od 2 cm (Rapid MR International, LLC). Konačno, korištene su ugrađene Imaris (BitPlane) funkcije procjene površine za 3D renderiranje i analizu volumena. Uspješna transplantacija definirana je kao ona u kojoj su se u transplantiranoj hemisferi formirala područja kontinuiranog T2-ponderiranog MRI signala. Odbacivanje transplantata definirano je kao transplantat koji nije stvorio područja kontinuiranog T2-ponderiranog MRI signala u transplantiranoj hemisferi. Subkortikalni t-hCO2 isključen je iz naknadne analize.
Kako bi se stabilno eksprimirali GCaMP6s u hCO2 za dvofotonsko snimanje kalcija, hiPS stanice su inficirane s pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, nakon čega je slijedila selekcija antibiotika. Ukratko, stanice su disocirane s EDTA i suspendirane u 1 ml Essential 8 medija pri gustoći od približno 300 000 stanica u prisutnosti polibrena (5 μg/ml) i 15 μl virusa. Stanice su zatim inkubirane u suspenziji 60 minuta i posijane pri gustoći od 50 000 stanica po jažici. Nakon konfluencije, stanice su tretirane s 5-10 μg ml-1 puromicina tijekom 5-10 dana ili dok se nisu pojavile stabilne kolonije. Akutna hCO infekcija provedena je kako je prethodno opisano5 uz neke izmjene. Ukratko, hCO2 je prenesen 30.-45. dana u 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugalne epruvete koje sadrže 100 µl živčanog medija. Zatim se ukloni približno 90 µl medija, u epruvetu se doda 3-6 µl lentivirusa visokog titra (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109), a hCO2 se prenese u inkubator na 30 minuta. Nakon toga se u svaku epruvetu doda 90–100 µl medija i epruvete se vrate u inkubator preko noći. Sljedećeg dana, hCO2 se prenese u svježi živčani medij u pločama s niskim pričvršćivanjem. Nakon 7 dana, hCO2 je prenesen na ploče sa staklenim dnom s 24 jažice radi vizualizacije i procjene kvalitete infekcije. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE i pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE generirani su pomoću VectorBuildera. Lentivirus se koristi u većini eksperimenata jer je integriran u genom domaćina, omogućujući ekspresiju reporterskog gena u zaraženim staničnim linijama. Za praćenje bjesnoće, hCO je 30.-45. dana koinficiran s virusom bjesnoće-ΔG-eGFP i AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid #67528, Addgene), temeljito ispran 3 dana te transplantiran u štakore u S1 i održavan in vivo 7-14 dana.
Za imunocitokemiju, životinje su anestezirane i transkardijalno perfuzirane s PBS-om, a zatim s 4% paraformaldehidom (PFA u PBS-u; Electron Microscopy Sciences). Mozgovi su fiksirani u 4% PFA tijekom 2 sata ili preko noći na 4°C, krioprezervirani u 30% saharozi u PBS-u tijekom 48-72 sata, te ugrađeni u 1:1, 30% saharozu:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) i koronalni rezovi su napravljeni na 30 µm pomoću kriostata (Leica). Za imunohistokemiju debelih rezova, životinje su perfuzirane s PBS-om, a mozak je diseciran i koronalno sekcioniran na 300-400 µm pomoću vibratoma (Leica) i rezovi su fiksirani s 4% PFA tijekom 30 minuta. Zatim su kriosekcije ili debeli rezovi isprani s PBS-om, blokirani 1 sat na sobnoj temperaturi (10% normalnog magarećeg seruma (NDS) i 0,3% Triton X-100 razrijeđenog u PBS-u) i blokirani otopinom za blokiranje na 4°C. – Inkubacija Kriosekcije su inkubirane preko noći, a debeli rezovi 5 dana. Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (štakor, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kunić, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kunić, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (štakor, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kunić, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kunić, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Iskorišteni su sljedeći primarni antiteli: anti-NeuN (myšinye, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krisinye, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (krolični, 1:1000; Z0334, Dako), anti--GFP (kurica, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myšʹ, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (krolik, 1:200; sc-338, Santa-Kruz), anti-PPP1R17 (krolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (moj, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (krolik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kozij, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kozij, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myšinyj , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myšʹ, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (štakor, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774), abcam), anti-SCG2 (kunić, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kunić, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam，抗GFAP(兔，1:1,000；Z0334，Dako，抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore，抗PDGFRA(兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1(小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2(兔）), 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems，抗STEM121＠(小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP(兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN４(兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Sustavi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (štakor, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijelo), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zec), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti -STEM121 (moj, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (moj, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kunić, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Rezovi su zatim isprani s PBS-om i inkubirani sa sekundarnim antitijelom tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi (smrznuti rezovi) ili preko noći na 4°C (debeli rezovi). Korišteno je sekundarno antitijelo Alexa Fluor (Life Technologies) razrijeđeno 1:1000 u otopini za blokiranje. Nakon ispiranja s PBS-om, jezgre su vizualizirane s Hoechst 33258 (Life Technologies). Konačno, preparati su stavljeni na mikroskop s pokrovnim stakalcima (Fisher Scientific) pomoću Aquamounta (Polysciences) i analizirani na Keyence fluorescentnom mikroskopu (BZ-X analizator) ili Leica TCS SP8 konfokalnom mikroskopu (Las-X) na slici. Slike su obrađene pomoću programa ImageJ (Fiji). Kako bi se kvantificirao udio ljudskih neurona u t-hCO i korteksu štakora, snimljene su pravokutne slike širine 387,5 μm u središtu t-hCO, na ili blizu ruba korteksa štakora. Granice presađivanja određene su procjenom promjena u prozirnosti tkiva, HNA+ jezgrama i/ili prisutnošću autofluorescencije tkiva. Na svakoj slici, ukupan broj NeuN+ i HNA+ stanica podijeljen je s ukupnim brojem NeuN+ stanica u istom području. Kako bi se osiguralo da se broje samo stanice s jezgrama u ravnini slike, u izračun su uključene samo stanice koje su također Hoechst+. Dvije slike razdvojene za najmanje 1 mm usrednjene su kako bi se smanjila statistička pogreška.
Tjedan dana prije uzimanja uzoraka, životinje s transplantiranim hCO₃ (otprilike 8 mjeseci diferencijacije) stavite u tamnu sobu s podrezanim brkovima kako bi se smanjila senzorna stimulacija. Izolacija jezgri provedena je kako je prethodno opisano, uz neke izmjene. Ukratko, t-hCO₃ i hCO₃ uništeni su korištenjem deterdžentno-mehaničke lize stanica i 2 ml staklenog mlina za tkivo (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Sirove jezgre su zatim filtrirane pomoću filtera od 40 µm i centrifugirane na 320 g tijekom 10 minuta na 4 °C prije izvođenja gradijenta gustoće saharoze. Nakon koraka centrifugiranja (320 g tijekom 20 minuta na 4 °C), uzorci su resuspendirani u 0,04% BSA/PBS s dodatkom 0,2 jedinice µl-1 inhibitora RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) i propušteni kroz protočni filter od 40 µm. Disocirane jezgre su zatim resuspendirane u PBS-u koji sadrži 0,02% BSA i nanesene na Chromium Single Cell 3′ čip (procijenjeni oporavak 8000 stanica po traci). snRNA-seq biblioteke su pripremljene pomoću Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteke su pripremljene pomoću Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteke snRNA-seq pripremljene su pomoću Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteke su pripremljene korištenjem Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteka snRNA-seq pripremljena je korištenjem Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteka je pripremljena korištenjem Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteke iz različitih uzoraka su objedinjene i sekvencirane pomoću Admera Health na NovaSeq S4 (Illumina).
Razine ekspresije gena za svaki pretpostavljeni nuklearni barkod kvantificirane su pomoću softverskog paketa za analizu 10x Genomics CellRanger (verzija 6.1.2). Točnije, očitanja su uspoređena s kombinacijom ljudskih (GRCh38, Ensemble, verzija 98) i štakorskih (Rnor_6.0, Ensemble, verzija 100) referentnih genoma stvorenih naredbom mkref i korištenjem naredbe count s naredbom –include-introns=TRUE za kvantifikaciju uključenih očitanja mapiranih na intronske regije. Za uzorke t-hCO2, ljudske jezgre identificirane su na temelju konzervativnog zahtjeva da najmanje 95% svih mapiranih očitanja odgovara ljudskom genomu. Sve naknadne analize provedene su na filtriranom izlazu niza barkodova iz CellRangera pomoću paketa R (verzija 4.1.2) Seurat (verzija 4.1.1)32.
Kako bi se osiguralo da se u naknadnu analizu uključe samo visokokvalitetne jezgre, za svaki je uzorak proveden iterativni proces filtriranja. Prvo se identificiraju i uklanjaju jezgre niske kvalitete s manje od 1000 pronađenih jedinstvenih gena i više od 20% ukupnih mitohondrija. Nakon toga, matrica sirovog broja gena normalizirana je regulariziranom negativnom binomnom regresijom korištenjem funkcije sctransform(vst.flavor=”v2″), koja je također identificirala 3000 najvarijabilnijih gena korištenjem zadanih parametara. Redukcija dimenzije provedena je na gornjim varijabilnim genima korištenjem analize glavnih komponenti (PCA) sa zadanim parametrima korištenjem dimenzije skupa podataka od 30 (dims = 30 odabran je na temelju vizualnog pregleda mjesta koljena i korišten je za sve uzorke i analize ansambla). Zatim smo proveli nekoliko krugova iterativnog grupiranja (rezolucija = 1) kako bismo klasificirali gene na temelju abnormalno niskog broja gena (medijan ispod 10. percentila), abnormalno visokog broja mitohondrijskih gena (medijan iznad 95. percentila) kako bismo identificirali i uklonili pretpostavljene stanice niske kvalitete, klastere i/ili visok udio sumnjivih blizanaca identificiranih korištenjem paketa DoubletFinder33 (srednji DoubletFinder rezultat iznad 95. percentila). Uzorci t-hCO (n=3) i hCO (n=3) integrirani su odvojeno korištenjem funkcije IntegrateData s gore navedenim parametrima. Zatim Još jedan krug kvalitativnog filtriranja integriranog skupa podataka proveden je kako je gore opisano.
Nakon uklanjanja jezgri niske kvalitete, integrirani skup podataka je grupiran (rezolucija = 0,5) i ugrađen u svrhu vizualizacije UMAP34. Marker geni za svaki klaster određeni su pomoću funkcije FindMarkers s zadanim parametrima izračunatim iz normaliziranih podataka o ekspresiji gena. Identificiramo i klasificiramo glavne stanične klase kombiniranjem referentnih skupova podataka fetalne i adultne kore s ekspresijom marker gena 19,20,21,35 i napomenama. Posebno su cirkulirajući prekursori identificirani ekspresijom MKI67 i TOP2A. Progenitorski klasteri definirani su odsutnošću mitotičkih transkripata, visokim preklapanjem s multipotentnim glijalnim progenitorskim klasterima opisanim u kasnoj metafazi fetalnog korteksa te ekspresijom EGFR i OLIG1. Pojam astrocit koristimo kako bismo obuhvatili nekoliko stanja diferencijacije astrocita, od kasne radijalne glije do sazrijevanja astrocita. Astrocitni klasteri eksprimiraju visoke razine SLC1A3 i AQP4 i pokazalo se da se mapiraju s podtipovima fetalne radijalne glije i/ili adultnih astrocita. OPC-i eksprimiraju PDGFRA i SOX10, dok oligodendrociti eksprimiraju markere mijelinacije (MOG i MYRF). Glutamatergički neuroni identificirani su prisutnošću neuronskih transkripata (SYT1 i SNAP25), odsutnošću GABAergičkih markera (GAD2) i ekspresijom NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ili SATB2. GluN neuroni dalje su podijeljeni u gornje (ekspresija SATB2 i gubitak BCL11B) i duboke (ekspresija BCL11B) podklase. Putativni neuroni podploče (SP) eksprimiraju poznate SP18 markere kao što su ST18 i SORCS1 uz duboke GluN markere. Stanice slične žilnom pleksusu identificirane su ekspresijom TTR-a, a stanice slične meningealnima eksprimirale su gene povezane s fibroblastima i mapirale pijalne/vaskularne stanice referentnog skupa podataka.
Diferencijalna analiza ekspresije gena između t-hCO i hCO podklasa provedena je korištenjem novo razvijene pseudo-batch metode reproducirane u uzorcima implementiranim korištenjem Libra R paketa (verzija 1.0.0). Točnije, edgeR log-likelihood testovi (verzija 3.36.0, paket R) provedeni su za grupe zbrajanjem broja gena u stanicama za danu staničnu klasu za svaku replikaciju uzorka. Za vizualizaciju toplinske karte, normalizirane vrijednosti na milijun (CPM) izračunate su korištenjem edgeR (cpm() funkcija) i skalirane (kako bi se postigla srednja vrijednost = 0, standardna devijacija = 1). Provedena je analiza obogaćivanja Gene Ontology (GO) značajno pojačanih t-hCO GluN gena (P vrijednost korigirana Benjamini-Hochbergom manja od 0,05 izražena u najmanje 10% t-hCO GluN stanica i povećanje promjene od najmanje 2 puta) korištenjem ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Koristimo aplikaciju ToppFun s zadanim parametrima i izvještavamo o P-vrijednostima korigiranim Benjamini-Hochbergom izračunatim iz hipergeometrijskih testova s ​​GO oznakama.
Kako bismo uskladili naše snRNA-seq klastere s označenim staničnim klasterima iz referentnih studija primarne jednostanične RNA-seq ili odrasle snRNA-seq19,20,21,22, primijenili smo pristup integracije uparenih skupova podataka. Koristili smo tijek rada normalizacije SCTransform (v2) u Seuratu za integraciju i usporedbu preklapanja klastera između skupova podataka (koristeći iste parametre kao gore). Pojedinačni skupovi podataka nasumično su podskupljeni do 500 stanica ili jezgri po izvornom klasteru radi računalne učinkovitosti. Koristeći sličan pristup kao što je prethodno opisan, preklapanje klastera definirano je kao udio stanica ili jezgri u svakom združenom klasteru koji se preklapa s oznakom referentnog klastera. Za daljnju klasifikaciju GluN-ova, koristili smo Seuratov tijek rada TransferData za podatke o podskupovima GluN-a kako bismo dodijelili oznake referentnih skupova podataka našim GluN stanicama.
Kako bismo procijenili status sazrijevanja globalnog transkriptoma uzoraka t-hCO i hCO, usporedili smo naše pseudo-bulk uzorke s BrainSpan/psychENCODE23, koji se sastoji od velike RNA sekvence koja obuhvaća razvoj ljudskog mozga. PCA smo proveli na kombiniranoj matrici genske ekspresije normaliziranoj uzorkom iz kortikalnih uzoraka 10 tjedana nakon začeća i kasnije, u 5567 gena (zajedno s našim podacima) koji su prethodno identificirani kao aktivni u BrainSpan kortikalnim uzorcima (definirano kao više od 50% u razvojnoj varijanci objašnjenoj dobi korištenjem kubnog modela)38. Osim toga, izveli smo gene povezane s glavnim transkriptomskim potpisima neurološkog razvoja koristeći nenegativnu faktorizaciju matrice kao što je prethodno opisano. Težine uzorka izračunate korištenjem postupka nenegativne faktorizacije matrice prikazane su na slikama 5b s proširenim podacima za svaki od pet potpisa koje su opisali Zhu i suradnici38. Ponovno, transkripcijski markeri ovisni o aktivnosti izvedeni su iz prethodno objavljenih studija. Posebno, ERG i LRG bili su značajno povišeni u glutamatergičkim neuronima identificiranim kolekcijom snRNA-seq mišjeg vidnog korteksa nakon vizualne stimulacije iz Dodatne tablice 3 Hrvatin i sur.16. LRG-ovi obogaćeni ljudima dobiveni su iz kultura ljudskog fetalnog mozga aktiviranih KCl-om i sakupljeni 6 sati nakon stimulacije, a filtrirani geni bili su značajno povišeni kod ljudi, ali ne i kod glodavaca (Dodatna tablica 4). Analiza obogaćivanja genskog skupa korištenjem ovih genskih skupova provedena je jednosmjernim Fisherovim egzaktnim testom.
Štakore anestezirati izofluranom, ukloniti mozgove i staviti u hladnu (otprilike 4°C) oksigeniranu (95% O2 i 5% CO2) otopinu saharoze za rezove koji sadrže: 234 mM saharoze, 11 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 i 0,5 mM CaCl2 (oko 310 mOsm). Koronalni rezovi mozga štakora (300–400 µm) koji sadrže t-hCO2 napravljeni su pomoću vibratoma Leica VT1200 kako je prethodno opisano39. Rezovi su zatim preneseni u komoru za rezanje s kontinuiranom oksigenacijom na sobnoj temperaturi koja sadrži aCSF pripremljen od: 10 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 i 126 mM NaCl (298 mOsm). najmanje 45 minuta prije snimanja. Presjeci su snimljeni u uronjenoj komori gdje su kontinuirano perfuzirani s aCSF-om (bočica s 95% O2 i 5% CO2). Svi podaci su snimljeni na sobnoj temperaturi. t-hCO neuroni su terminirani pipetom od borosilikatnog stakla napunjenom otopinom koja sadrži 127 mM kalijevog glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijevog ATP-a, 0,3 mM natrijevog GTP-a, 10 mM HEPES-a i 0,6 mM EGTA, pH 7,2, unutarnja otopina prilagođena s KOH (290 mOsm). Kako bi se oporavili, u otopinu za snimanje dodan je biocitin (0,2%).
Podaci su prikupljeni pomoću pojačala MultiClamp 700B (Molecular Devices) i digitalizatora Digidata 1550B (Molecular Devices), niskopropusno filtrirani na 2 kHz, digitalizirani na 20 kHz i analizirani pomoću Clampfita (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) i prilagođenih MATLAB funkcija (Mathworks). Potencijal spoja izračunat je pomoću JPCalc-a, a unosi su prilagođeni izračunatoj vrijednosti od -14 mV. Operacija IV sastoji se od niza strujnih koraka u koracima od 10-25 pA, od -250 do 750 pA.
Talamus, bijela tvar i S1 aferentni vlakna električno su stimulirana u talamokortikalnim presjecima tijekom patch-clamp snimanja hCO neurona, kao što je prethodno opisano. Ukratko, mozak je postavljen na stol za 3D ispis nagnut pod kutom od 10°, a prednji dio mozga je prerezan pod kutom od 35°. Mozak je zatim zalijepljen na prerezanu površinu i prerezan, čuvajući talamokortikalne izbočene aksone. Bipolarne volframove elektrode (0,5 MΩ) postavljene su na drugi mikromanipulator i strateški postavljene kako bi stimulirale četiri regije po stanici (unutarnja kapsula, bijela tvar, S1 i hCO). Zabilježite sinaptičke odgovore nakon fazne stimulacije od 300 µA na 0,03–0,1 Hz.
Neuroni hChR2 koji eksprimiraju aktivirani su na 480 nm, a svjetlosni impulsi generirani LED diodom (Prizmatix) primijenjeni su kroz objektiv ×40 (0,9 NA; Olympus) za snimanje ekspresije hChR2 u blizini stanica. Promjer osvijetljenog polja je približno 0,5 mm, a ukupna snaga je 10-20 mW. Širina impulsa postavljena je na 10 ms, što odgovara impulsu danom tijekom eksperimenta učenja ponašanja. Korištene su različite frekvencije stimulacije, od 1 do 20 Hz, ali samo je prvi impuls serije korišten za kvantifikaciju. Intervali između nizova obično su dulji od 30 s kako bi se smanjio učinak na sinaptičke inhibitorne ili olakšavajuće putove. Kako bismo testirali je li odgovor hChR2 monosinaptički, primijenili smo TTX (1 μM) u kupelj dok EPSC reakcija nije nestala, a zatim primijenili 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM). Tipično, odgovor se vraća unutar nekoliko minuta, s nešto duljim kašnjenjem između paljenja LED diode i stvaranja EPSC-a. NBQX (10 μM) je korišten za testiranje je li odgovor potaknut AMPA receptorima.
Oštri hCO rezovi su stvoreni kako je prethodno opisano. Ukratko, hCO rezovi su ugrađeni u 4% agarozu i preneseni u stanice koje sadrže 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 10 mM d-(+)-glukozu. Rezovi su izrezani na 200–300 µm na sobnoj temperaturi pomoću Leica VT1200 vibratora i pohranjeni u ASF-u na sobnoj temperaturi. Zatim je provedeno patch-camp snimanje cijelih stanica na hCO rezovima pod izravnim SliceScope mikroskopom (Scientifica). Rezovi su perfuzirani s aCSF-om (95% O2 i 5% CO2) i stanični signali su zabilježeni na sobnoj temperaturi. hCO neuroni su naneseni pomoću pipete od borosilikatnog stakla napunjene otopinom koja sadrži 127 mM kalijevog glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijevog ATP-a, 0,3 mM natrijevog GTP-a, 10 mM HEPES-a i 0,6 mM EGTA, unutarnjeg pH 7,2, podešenog s KOH (osmolarnost 290). Za potrebe oporavka, dodajte 0,2% biocitina u unutarnju otopinu.
Podaci su prikupljeni pomoću programa Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) korištenjem pojačala MultiClamp 700B (Molecular Devices) i digitalizatora Digidata 1550B (Molecular Devices), niskopropusno filtrirani na 2 kHz, digitalizirani na 20 kHz i analizirani pomoću programa Clampfit (verzija 10.6) za analizu (Molecular Devices) i prilagođenih MATLAB funkcija (MATLAB 2019b, Mathworks). Potencijal spoja izračunat je pomoću JPCalc-a, a unosi su prilagođeni izračunatom potencijalu spoja od -14 mV. Operacija IV sastoji se od niza strujnih koraka u koracima od 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Za morfološku rekonstrukciju stisnutih neurona, u unutarnju otopinu dodano je 0,2% biocitina (Sigma-Aldrich). Stanice se pripremaju najmanje 15 minuta nakon hakiranja. Pipeta se zatim polako uvlači 1-2 minute dok se registrirana membrana potpuno ne zatvori. Nakon postupka fiziologije presjeka, presjeci su fiksirani preko noći na 4°C u 4% PFA, isprani s PBS X3 i razrijeđeni 1:1000 sa streptavidinom konjugiranim DyLight 549 ili DyLight 405 (Vector Labs). Stanice ispunjene biocitinom (2%; Sigma-Aldrich) označene su tijekom snimanja patch clampom na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata. Presjeci su zatim montirani na mikroskopska stakalca pomoću Aquamounta (Thermo Scientific) i vizualizirani sljedeći dan na konfokalnom mikroskopu Leica TCS SP8 pomoću uljno imerznog objektiva s numeričkom aperturom ×40 1,3, povećanjem ×0,9–1,0, xy. Brzina uzorkovanja je približno 7 piksela po mikronu. Z-složenci u intervalima od 1 µm dobiveni su serijski, a z-složenci mozaici i automatsko spajanje temeljeno na Leici provedeni su kako bi se pokrilo cijelo dendritično stablo svakog neurona. Neuroni su zatim poluručno praćeni pomoću sučelja neuTube 40 i generirane su SWC datoteke. Datoteke su zatim prenesene u dodatak SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, verzija 2.1.0; NIH).
Ljudsko kortikalno tkivo dobiveno je uz informirani pristanak prema protokolu koji je odobrio Institucionalni odbor za reviziju Sveučilišta Stanford. Dva uzorka ljudskog postporođajnog tkiva (3 i 18 godina starosti) dobivena su resekcijom frontalnog korteksa (srednji frontalni girus) kao dio operacije refraktorne epilepsije. Nakon resekcije, tkivo je uzeto u ledeno hladnom NMDG-aCSF-u koji sadrži: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukoze, 2 mM tiouree, 5 mM natrijevog askorbata, 3 mM natrijevog piruvata, 0,5 mM CaCl2 4H2O i 10 mM MgSO4 7H2O. Titrirati do pH 7,3-7,4 koncentriranom klorovodičnom kiselinom. Tkiva su dostavljena u laboratorij unutar 30 minuta, a koronalni rezovi su uzeti prema gore opisanom postupku.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrila APLAC Sveučilišta Stanford. Štakori (stariji od 140 dana nakon transplantacije) anestezirani su 5%-tnom izofluranom i intraoperativno anestezirani s 1-3% izoflurana. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) i potkožno im je injiciran buprenorfin (SR) s produljenim oslobađanjem. Lubanja je izložena, očišćena i umetnuto je 3-5 koštanih vijaka. Za ciljanje t-hCO2, generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Na mjestu interesa izbušena je rupa od svrdla, a vlakna (promjera 400 µm, NA 0,48, Doric) spuštena su 100 µm ispod površine hCO2 i pričvršćena na lubanju UV-stvrdnjavajućim zubnim cementom (Relyx).
Snimanja optičkom fotometrijom provedena su kako je prethodno opisano42. Za snimanje spontane aktivnosti, štakori su smješteni u čisti kavez, a optički patch kabel (Doric) promjera 400 µm (Doric) spojen na sustav za akviziciju optičkih fotometrijskih podataka spojen je na implantirani optički kabel. Tijekom 10-minutnog snimanja motoričke aktivnosti, životinje su mogle slobodno istraživati ​​kavez. Za snimanje evocirane aktivnosti, štakori (više od 140 dana nakon transplantacije) anestezirani su s 5% izoflurana za indukciju i 1-3% izoflurana za održavanje. Životinja je smještena u stereotaktički okvir (Kopf), a brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 podrezani su na oko 2 cm i provučeni kroz mrežicu spojenu na piezoelektrični aktuator (PI). Optički patch kabel (Doric) promjera 400 µm (Doric) spojen je na implantirano vlakno i spojen na sustav za akviziciju podataka. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 su zatim skrenuti 50 puta (2 mm pri 20 Hz, 2 s po prezentaciji) u nasumičnim vremenima pomoću piezoelektričnog pogona tijekom 20-minutnog razdoblja snimanja. Koristite Arduino MATLAB Support Package za kontrolu vremena otklona pomoću prilagođenog MATLAB koda. Događaji su sinkronizirani sa softverom za prikupljanje podataka pomoću TTL (tranzistorsko-tranzistorskih logičkih impulsa).
Štakori (stariji od 140 dana nakon transplantacije) anestezirani su s 5% izofluranom i intraoperativno anestezirani s 1-3% izoflurana. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) te su im potkožno injektirani buprenorfin SR i deksametazon. Lubanja je izložena, očišćena i umetnuto je 3-5 vijaka za kost. Za ciljanje t-hCO2, generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Kružna kraniotomija (promjera približno 1 cm) izvedena je bušilicom velike brzine izravno iznad transplantiranog hCO2. Nakon što je kost što tanja, ali prije bušenja kroz cijelu kost, pincetom se uklanja preostali netaknuti zdjelični disk kako bi se otkrio t-hCO2 ispod nje. Kraniotomija je napunjena sterilnom fiziološkom otopinom, a pokrovno stakalce i poseban klin za glavu pričvršćeni su na lubanju UV-stvrdnutim zubnim cementom (Relyx).
Dvofotonsko snimanje provedeno je pomoću Bruker multifotonskog mikroskopa s Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektivom. GCaMP6 snimanje provedeno je na 920 nm s 1,4x povećanjem u jednoj z-ravnini i 8x prosjekom od 7,5 fps. Štakori su anestezirani 5%-tnom izofluranom i održavani s 1-3% izoflurana. Štakori su smješteni u prilagođeni nosač za glavu i postavljeni ispod leće. Dobivena je 3-minutna pozadinska snimka motoričke aktivnosti. Tijekom 20 minuta snimanja, 50 udisaja (svaka prezentacija duga 100 ms) nasumično je isporučeno na jastučić brkova nasuprot t-hCO2 pomoću pikospricera. Koristite Arduino MATLAB Support Package za kontrolu vremena bursta s prilagođenim MATLAB kodom. Sinkronizirajte događaje sa softverom za prikupljanje podataka (PrairieView 5.5) pomoću TTL impulsa. Za analizu, slike su korigirane za xy gibanje pomoću afine korekcije u MoCo programu pokrenutom na Fidžiju. Ekstrakcija fluorescentnih tragova iz pojedinačnih stanica pomoću CNMF-E43. Fluorescencija je ekstrahirana za svako područje interesa, pretvorena u dF/F krivulje, a zatim pretvorena u z-vrijednosti.
Štakori (stariji od 140 dana nakon transplantacije) anestezirani su 5%-tnom izofluranskom anestezijom i intraoperativno anestezirani s 1-3% izoflurana. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) te su im potkožno injektirani buprenorfin SR i deksametazon. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 odrezani su na oko 2 cm i provučeni kroz mrežicu spojenu na piezoelektrični aktuator. Lubanja je izložena i očišćena. Na lubanju je pričvršćen vijak za uzemljenje od nehrđajućeg čelika. Za ciljanje t-hCO2 generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Izvršite kružnu kraniotomiju (promjera približno 1 cm) bušilicom velike brzine neposredno iznad t-hCO2. Nakon što je kost što tanja, ali prije bušenja kroz cijelu kost, upotrijebite pincetu za uklanjanje preostalog netaknutog zdjeličnog diska kako biste otkrili t-hCO2 ispod. Pojedinačne stanice su snimljene pomoću 32-kanalnih ili 64-kanalnih silikonskih sondi visoke gustoće (Cambridge Neurotech) uzemljenih na vijke za uzemljenje i prethodno pojačanih RHD pojačalima (Intan). Pomoću manipulatora spustite elektrode na ciljno mjesto kroz kraniotomiju, koja je ispunjena sterilnom fiziološkom otopinom. Prikupljanje podataka provedeno je na frekvenciji od 30 kHz pomoću sustava za akviziciju podataka Open Ephys. Snimanje je nastavljeno samo kada smo detektirali visoko koreliranu ritmičku spontanu aktivnost u više od 10 kanala, što sugerira da su se elektrode nalazile u transplantatu (na temelju podataka dvofotonskog snimanja kalcija). Dobivena je 10-minutna pozadinska snimka motoričke aktivnosti. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 su zatim skrenuti 50 puta (2 mm pri 20 Hz, 2 s po prezentaciji) u nasumičnim vremenima piezoelektričnim pogonom tijekom 20-minutnog razdoblja snimanja. Korištenjem MATLAB paketa podrške za Arduino (MATLAB 2019b), kontrolirajte vrijeme otklona prilagođenim MATLAB kodom. Koristite TTL impulse za sinkronizaciju događaja sa softverom za akviziciju podataka.
Za eksperimente optičkog označavanja, optički patch kabel od 200 µm (Doric) spojen na laser od 473 nm (Omicron) spojen je na optičko vlakno od 200 µm postavljeno preko kraniotomije. Neposredno prije toga, podesite snagu kratkospojnika na 20 mW. Pomoću manipulatora spustite elektrode na ciljno mjesto kroz kraniotomiju, koja je ispunjena sterilnom fiziološkom otopinom. Na početku snimanja emitirano je deset svjetlosnih impulsa od 473 nm (frekvencija 2 Hz, trajanje impulsa 10 ms). Fotosenzitivne stanice definirane su kao stanice koje su pokazale šiljasti odgovor unutar 10 ms svjetlosti u 70% ili više pokusa.