Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Turklāt, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stiliem un JavaScript.
Vienlaikus parāda trīs slaidu karuseli. Izmantojiet pogas Iepriekšējais un Nākamais, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem, vai arī izmantojiet slīdņa pogas galā, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem.
Pašsalikšanās neironu organoīdi ir daudzsološa in vitro platforma cilvēka attīstības un slimību modelēšanai. Tomēr organoīdiem trūkst savienojamības, kas pastāv in vivo, kas ierobežo nobriešanu un novērš integrāciju ar citām ķēdēm, kas kontrolē uzvedību. Šeit mēs parādām, ka no cilvēka cilmes šūnām iegūti kortikālie organoīdi, transplantēti jaundzimušu kailu žurku somatosensorajā garozā, attīstās nobrieduši šūnu tipi, kas integrējas sensorajās un ar motivāciju saistītajās ķēdēs. MRI atklāja pēctransplantācijas organoīdu augšanu vairākās cilmes šūnu līnijās un dzīvniekiem, savukārt viena kodola analīze atklāja kortikoģenēzes progresēšanu un aktivitātes atkarīgas transkripcijas programmas rašanos. Patiešām, transplantētajiem kortikālajiem neironiem ir sarežģītākas morfoloģiskas, sinaptiskas un iekšējās membrānas īpašības nekā to in vitro analogiem, kas ļauj noteikt neironu defektus pacientiem ar Timotija sindromu. Anatomiskā un funkcionālā izsekošana ir parādījusi, ka transplantētās organellas saņem talamokortikālus un kortikokortikālus ievades signālus, un neironu aktivitātes in vivo ieraksti liecina, ka šie ievades signāli var radīt sensorās reakcijas cilvēka šūnās. Visbeidzot, kortikālie organoīdi pagarina aksonus visā žurku smadzenēs, un to optogēnētiskā aktivācija noved pie atlīdzības meklēšanas uzvedības. Tādējādi transplantētie cilvēka garozas neironi nobriest un piedalās saimnieka neironu shēmās, kas kontrolē uzvedību. Mēs sagaidām, ka šī pieeja atvieglos tādu šķiedru līmeņa fenotipu noteikšanu no pacientiem iegūtās šūnās, kurus nevar noteikt ar citiem līdzekļiem.
Cilvēka smadzeņu attīstība ir ievērojams pašorganizēšanās process, kurā šūnas proliferējas, diferencējas, migrē un savienojas, veidojot funkcionālas neironu shēmas, kuras tiek tālāk pilnveidotas, izmantojot sensoro pieredzi. Galvenā problēma cilvēka smadzeņu attīstības izpratnē, īpaši slimību kontekstā, ir piekļuves trūkums smadzeņu audiem. Pašorganizējošās organellas, tostarp cilvēka garozas organoīdi (hCO; pazīstami arī kā cilvēka garozas sfēra), var ģenerēt 2,3,4,5,6. Tomēr vairāki ierobežojumi ierobežo to plašāku pielietojumu neironu shēmu attīstības un darbības izpratnē. Jo īpaši nav skaidrs, vai hCO nobriešanu ierobežo noteiktu mikrovides un sensoro ievades signālu trūkums in vivo. Turklāt, tā kā hCO nav integrētas shēmās, kas var ģenerēt uzvedības rezultātus, to lietderība ģenētiski sarežģītu un uzvedības neiropsihiatrisku traucējumu modelēšanā pašlaik ir ierobežota.
HCO transplantācija neskartās, dzīvās smadzenēs var pārvarēt šos ierobežojumus. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka cilvēka neironi, kas transplantēti grauzēju garozā, spēj izdzīvot, projicēt signālus un sazināties ar grauzēju šūnām7,8,9,10,11,12. Tomēr šie eksperimenti parasti tiek veikti ar pieaugušiem dzīvniekiem, kas var ierobežot sinaptisko un aksonu integrāciju. Šeit mēs aprakstām transplantācijas paradigmu, kurā mēs transplantējām no hiPS šūnām iegūtu 3D hCO imūndeficīta žurku primārajā somatosensorajā garozā (S1) plastiskās attīstības agrīnā stadijā. Transplantētie hCO (t-hCO) neironi piedzīvo ievērojamu nobriešanu, saņem talamokortikālus un kortikāli-kortikālus signālus, kas izraisa sensoras reakcijas, un pagarina aksonu projekcijas žurku smadzenēs, lai veicinātu atlīdzības meklēšanas uzvedību. Ilgstoša t-hCO nobriešana ir atklājusi neironu defektus pacientiem ar Timotija sindromu (TS), smagu ģenētisku slimību, ko izraisa mutācijas spriegumam jutīgā L tipa CaV1.2 kalcija kanālā (ko kodē CACNA1C).
Lai pētītu cilvēka kortikālo neironu neironu aktivitātes shēmās in vivo, mēs stereotaktiski transplantējām neskartu 3D hCO3 agrīnu postnatālu atimisku žurku S1 audos (3.–7. diena pēc dzimšanas) (1.a attēls un paplašinātie dati 1.a–c attēlā). Šajā brīdī talamokortikālās un kortikokortikālās aksonu projekcijas vēl nav pabeigušas savu S1 inervāciju (13. atsauce). Tādējādi šī pieeja ir izstrādāta, lai maksimāli palielinātu t-hCO3 integrāciju, vienlaikus samazinot ietekmi uz endogēnajām shēmām. Lai vizualizētu t-hCO3 atrašanās vietu dzīvos dzīvniekos, mēs veicām žurku T2 svērtās MRI smadzeņu rekonstrukcijas 2–3 mēnešus pēc transplantācijas (1.b attēls un paplašinātie dati, 1.d attēls). t-hCO3 bija viegli novērojami, un t-hCO3 tilpuma mērījumi bija līdzīgi tiem, kas aprēķināti no fiksētām šķēlēm (paplašinātie dati, 1.d, e attēls; P > 0,05). t-hCO3 bija viegli novērojami, un t-hCO3 tilpuma mērījumi bija līdzīgi tiem, kas aprēķināti no fiksētām šķēlēm (paplašinātie dati, 1.d, e attēls; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансрезох данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO bija viegli novērojami, un tilpuma t-hCO mērījumi bija līdzīgi tiem, kas aprēķināti fiksētām sekcijām (paplašināti dati, 1.d, e att.; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图、e；P > 0,05＀很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированзеревых данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO bija viegli novērojams, un tilpuma t-hCO mērījumi bija līdzīgi tiem, kas aprēķināti fiksētām sekcijām (paplašināti dati, 1.d, e att.; P > 0,05).Aptuveni 2 mēnešus pēc transplantācijas mēs noteicām t-hCO 81% transplantēto dzīvnieku (n = 72 dzīvnieki; hCO no 10 hiPS šūnu līnijām; hiPS šūnu līnijas 1. papildtabulā). No tiem 87% atradās smadzeņu garozā (1.c attēls). Veicot sērijveida MRI skenēšanu vairākos laika punktos vienai un tai pašai transplantētai žurkai, mēs konstatējām deviņkārtīgu t-hCO tilpuma palielināšanos 3 mēnešu laikā (1.d attēls un paplašinātie dati, 1.f attēls). Transplantētajiem dzīvniekiem bija augsts izdzīvošanas rādītājs (74%) 12 mēnešus pēc transplantācijas (paplašinātie dati, 1.g attēls un 2. papildtabula), un netika konstatēti acīmredzami motorikas vai atmiņas traucējumi, glioze vai elektroencefalogramma (EEG). Dati 1.g attēlā un 2. papildtabulā. 1h–m un 3.e).
a. Eksperimentālā dizaina shēma. No hiPS šūnām iegūtais hCO3 tika transplantēts jaundzimušu kailu žurku S1 audos 30.–60. diferenciācijas dienā. b. T2 svērtie koronālie un horizontālie MRI attēli, kas parāda t-hCO3 S1 audos 2 mēnešus pēc transplantācijas. Mēroga josla, 2 mm. c. Katras hiPS šūnu līnijas iesakņošanās panākumu rādītāju kvantitatīva noteikšana (n = 108, skaitļi joslās norāda t-hCO3 daudzumu katrā hIPS šūnu līnijā) un kortikālā vai subkortikālā atrašanās vieta (n = 88). d. Koronārās artērijas MRI attēls (pa kreisi; mēroga josla, 3 mm) un atbilstošā 3D tilpuma rekonstrukcija (mēroga josla, 3 mm), kas parāda t-hCO3 pieaugumu 3 mēnešu laikā. e. Žurku smadzeņu garozas t-hCO3 modeļu pārskats. Mēroga josla, 1 mm. f, t-hCO reprezentatīvi imūncitoķīmiskie attēli, kas parādīti no augšas pa kreisi uz labo pusi (diferenciācijas laikā): PPP1R17 (4 mēneši), NeuN (8 mēneši), SOX9 un GFAP (8 mēneši), PDGFRα; (8 mēneši), MAP2 (8 mēneši) un IBA1 (8 mēneši). Mēroga josla, 20 µm. HNA koekspresija norāda uz cilvēka izcelsmes šūnām. g, snRNS sekvencēšana: visu augstas kvalitātes t-hCO kodolu vienotā kolektora un projekcijas (UMAP) dimensiju samazināšanas attēlveidošana pēc Seurat integrācijas (n = 3 t-hCO paraugi, n = 2 hiPS šūnu līnijas). Astrocīti, astrocītu līnijas šūnas; cyc prog, cirkulējošie progenitori; GluN DL, dziļie glutamāterģiskie neironi; GluN DL/SP, dziļie un sublamelārie glutamāterģiskie neironi; GluN UL, augšējā slāņa glutamāterģiskie neironi; oligodendrocīti, oligodendrocīti; OPC, oligodendrocītu cilmes šūnas; RELN, reelīna neironi. h, gēnu ontoloģijas (GO) terminu bagātināšanas analīze gēniem, kas ir ievērojami paaugstināti (koriģēts P 2, izteikts vismaz 10% kodolu) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem. h, gēnu ontoloģijas (GO) terminu bagātināšanas analīze gēniem, kas ir ievērojami paaugstināti (koriģēts P 2, izteikts vismaz 10% kodolu) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem. h, Анализ обогащения терминов Gēnu ontoloģija (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, книязминов, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутамачерских neironāli HCO. h, gēnu ontoloģijas (GO) terminu bagātināšanas analīze gēniem ar ievērojamu aktivāciju (koriģēta P 2, ekspresija vismaz 10% kodolos) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谎 弐 5 p， 弎 弎 p， 弎 ０变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 皚 焳 的 皚的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне по крайне) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический () термина обогащения. h, t-hCO glutamāterģiskajos neironos gēni tika ievērojami paaugstināti (koriģēts P 2, izteikts vismaz 10% kodolu), salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem. Bagātināšanas termina ontoloģiskā (GO) analīze.Punktētā līnija norāda aq vērtību 0,05. i, GluN šūnu tipu UMAP attēlveidošana t-hCO3, izmantojot marķējuma pārnesi no atsauces 22 snRNS-seq pieaugušo motorās garozas datu kopas. CT — kortikotalama šūnas, ET — ekstracerebrālās šūnas, IT — iekšējās telencephalālās šūnas, NP — tuvā projekcija.
Pēc tam mēs novērtējām t-hCO citoarhitektūru un kopējo šūnu sastāvu. Žurku endotēlija šūnu antivielu krāsošana atklāja vaskularizāciju ar t-hCO, savukārt IBA1 krāsošana atklāja žurku mikrogliju klātbūtni visā transplantātā (1.f attēls un paplašinātie dati, 3.c,d attēls). Imūnkrāsošana atklāja cilvēka kodola antigēna (HNA) pozitīvas šūnas, kas koekspresē PPP1R17 (kortikālos progenitorus), NeuN (neironus), SOX9 un GFAP (no glialām iegūtas šūnas) vai PDGFRα (oligodendrocītu progenitorus) (1.f attēls). Lai pētītu t-hCO šūnu sastāvu vienas šūnas izšķirtspējā, pēc aptuveni 8 mēnešu diferenciācijas veicām vienas šūnas RNS sekvencēšanu (snRNA-seq). Žurku kodolu masveida filtrēšana un atdalīšana deva 21 500 augstas kvalitātes cilvēka mononukleāro karšu (1.g attēls un paplašinātie dati, 4.a,b attēls). Tipisku šūnu tipa marķieru ekspresijas modeļi identificēja galveno kortikālo šūnu klašu kopas, tostarp dziļos un virspusējos glutamāterģiskos neironus, cirkulējošos progenitorus, oligodendrocītus un astrocītu līniju (1.g att., paplašināti dati, 4.c att. un 3. papildtabula). SATB2 un CTIP2 imūnkrāsošana parādīja, ka, neskatoties uz kortikālo apakštipu klātbūtni, t-hCO neuzrādīja skaidru anatomisku stratifikāciju (paplašināti dati, 3.a att.). stadijai atbilstošs snRNA-seq hCO radīja plaši līdzīgas šūnu klases, ar dažiem izņēmumiem, tostarp oligodendrocītu neesamību un GABAerģisko neironu klātbūtni, kas var atspoguļot iepriekš ziņotos labvēlīgos in vitro apstākļus sānu cilmes šūnām15 (paplašināti dati, 4.f–i att. un 4. papildtabula). Diferenciālā gēnu ekspresijas analīze atklāja būtiskas atšķirības glutamāterģiskajos neironos starp t-hCO3 un hCO3 (5. papildtabula), tostarp ar neironu nobriešanu saistītu gēnu kopu aktivāciju, piemēram, sinaptisko signalizāciju, dendrītisko lokalizāciju un spriegumam jutīgu kanālu aktivitāti (1. h attēls un 5. papildtabula). 6. tabula). Attiecīgi kortikālajiem glutamāterģiskajiem t-hCO3 neironiem bija paātrināta transkripcijas nobriešana.
Lai noskaidrotu, vai šīs transkripcijas izmaiņas t-hCO bija saistītas ar morfoloģiskajām atšķirībām starp hCO in vitro un t-hCO in vivo, pēc 7–8 mēnešu diferenciācijas akūtās sekcijās mēs rekonstruējām stadijām atbilstošus ar biocitīniem pildītus hCO un hCO3. hCO neironi (2.a att.). t-hCO neironi bija ievērojami lielāki, tiem bija 1,5 reizes lielāks somas diametrs, divreiz vairāk dendrītu un kopumā sešas reizes lielāks kopējais dendrītu garums salīdzinājumā ar in vitro hCO3 (2.b att.). Turklāt mēs novērojām ievērojami lielāku dendritisko dzelkšņu blīvumu t-hCO neironos nekā hCO neironos (2.c att.). Tas liecina, ka t-hCO neironi piedzīvo plašu dendritisko pagarināšanos un sazarošanos, kas kombinācijā ar nepārtrauktu šūnu proliferāciju var veicināt intensīvu t-hCO3 augšanu pēc transplantācijas (1.d att. un paplašinātie dati 1.f att.). Tas pamudināja mūs izpētīt elektrofizioloģiskās īpašības. Membrānas kapacitāte bija astoņas reizes lielāka (paplašināti dati, 8.d att.), miera stāvokļa membrānas potenciāls bija hiperpolarizētāks (aptuveni 20 mV), un strāvas injekcija inducēja augstāku maksimālo ierosmes ātrumu t-hCO neironos nekā hCO neironos. In vitro (2.d att., e), kas atbilst lielākām un sarežģītākām t-hCO morfoloģiskajām iezīmēm. Turklāt spontānu ierosmes postsinaptisko strāvu notikumu (EPSC) biežums t-hCO neironos bija ievērojami lielāks (2.f att.), kas liecina, ka t-hCO neironos novērotais palielinātais dendritisko dzeloņu blīvums bija saistīts ar funkcionālo uzbudināmību. Mēs apstiprinājām hCO neironu nenobriedušo raksturu in vitro, reģistrējot iezīmētos glutamāterģiskos neironus (paplašināti dati, 6.a–c att.).
a, biocitīniem pildītu hCO3 un t-hCO3 neironu 3D rekonstrukcija pēc 8 mēnešu diferenciācijas. b, Morfoloģisko pazīmju kvantitatīva noteikšana (n = 8 hCO neironi, n = 6 t-hCO neironi; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 un ***P <0, 0001). b, Morfoloģisko pazīmju kvantitatīva noteikšana (n = 8 hCO neironi, n = 6 t-hCO neironi; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 un ***P <0, 0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 P = 0,0084, 0,0 * 7). b, morfoloģisko pazīmju kvantitatīva noteikšana ( n = 8 hCO neironi, n = 6 t-hCO neironi; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 un *** P <0, 0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90,017P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90,017P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 P = 0,0084, 0,0 * 7). b, morfoloģisko pazīmju kvantitatīva noteikšana ( n = 8 hCO neironi, n = 6 t-hCO neironi; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 un *** P <0, 0001).c, hCO3 un t-hCO3 dendritisko zaru 3D rekonstrukcija pēc 8 mēnešu diferenciācijas. Sarkanās zvaigznītes norāda iespējamos dendritiskos dzeloņus. Dendritisko dzeloņu blīvuma kvantitatīvā noteikšana (n = 8 hCO3 neironi, n = 6 t-hCO3 neironi; **P = 0,0092). d, atpūtas membrānas potenciāla kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 16 t-hCO neironi; ***P <0, 0001). d, atpūtas membrānas potenciāla kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 16 t-hCO neironi; ***P <0, 0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, miera membrānas potenciāla kvantitatīvā noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 16 t-hCO neironi; ***P <0, 0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, miera membrānas potenciāla kvantitatīvā noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 16 t-hCO neironi; ***P <0, 0001). e, atkārtota darbības potenciāla aktivizēšana hCO3 un t-hCO3, ko izraisa pieaugošas strāvas injekcijas, un maksimālā aktivizēšanas ātruma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO3 neironi, n = 16 t-hCO3 neironi; ***P < 0,0001). e, atkārtota darbības potenciāla aktivizēšana hCO3 un t-hCO3, ko izraisa pieaugošas strāvas injekcijas, un maksimālā aktivizēšanas ātruma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO3 neironi, n = 16 t-hCO3 neironi; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественкая омациалийнкая скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, darbības potenciāla atkārtota aktivācija hCO3 un t-hCO3, ko izraisa strāvas palielināšanās un maksimālā aktivācijas ātruma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO3 neironi, n = 16 t-hCO3 neironi; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率 最大放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 最 大 的 5 5个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и ковцинчи тока максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, atkārtota hCO un t-hCO darbības potenciālu aktivizēšana, ko izraisa palielināta strāvas padeve, un maksimālā aktivizēšanas ātruma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 16 t-hCO neironi; *** P < 0,0001). f, spontānas EPSC (sEPSC) hCO un t-hCO neironos 8 diferenciācijas mēnešos un sinaptisko notikumu biežuma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 17 t-hCO neironi; ***P <0, 0001). f, spontānas EPSC (sEPSC) hCO un t-hCO neironos 8 diferenciācijas mēnešos un sinaptisko notikumu biežuma kvantitatīva noteikšana (n = 25 hCO neironi, n = 17 t-hCO neironi; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцестынка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, spontāni EPSC (sEPSC) hCO un t-hCO neironos 8 mēnešu diferenciācijas un sinaptisko notikumu biežuma kvantitatīvās noteikšanas laikā ( n = 25 hCO neironi, n = 17 t-hCO neironi; *** P <0, 0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC (sEPSCs)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC (sEPSCs)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцестынка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, spontānas EPSC (sEPSC) hCO un t-hCO neironos 8 mēnešu diferenciācijas un sinaptisko notikumu biežuma kvantitatīvas noteikšanas laikā (n = 25 hCO neironi, n = 17 t-hCO neironi; *** P <0, 0001).Bf, hCO3 un t-hCO3 1208-2 līnijā tika ņemti no vienas un tās pašas diferenciācijas partijas, kas tika uzturēta paralēli. g, Gēnu kopas bagātināšanas analīze (vienpusējs Fišera precīzais tests) gēniem, kuriem ir būtiska augšupregulācija (koriģēts P < 0,05, reizes izmaiņas > 2, izteikts vismaz 10% kodolu) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem ar gan agrīnās atbildes (ERG), gan vēlīnās atbildes (LRG) aktivitātes atkarīgu gēnu gēnu kopām, kas identificētas no in vivo peles pētījuma16 un cilvēkam specifiskiem LRG no in vitro neironiem17. g, Gēnu kopas bagātināšanas analīze (vienpusējs Fišera precīzais tests) gēniem, kuriem ir būtiska augšupregulācija (koriģēts P < 0,05, reizes izmaiņas > 2, izteikts vismaz 10% kodolu) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģiskajiem neironiem ar gan agrīnās atbildes (ERG), gan vēlīnās atbildes (LRG) aktivitātes atkarīgu gēnu gēnu kopām, kas identificētas no in vivo peles pētījuma16 un cilvēkam specifiskiem LRG no in vitro neironiem17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорва0,05 активацией кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, нотергическими, зав идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, gēnu kopas bagātināšanas analīze (vienpusējs Fišera precīzais tests) gēniem ar ievērojamu aktivāciju (koriģēta P<0,05, reizes izmaiņas >2, ekspresija vismaz 10% kodolu) t-hCO glutamāterģiskajos neironos, salīdzinot ar hCO glutamāterģisko neironu kopām, kas satur gan agrīnus (ERG), gan vēlīnus (LRG) aktivitātes atkarīgus gēnus, kas identificēti in vivo pelēm16 un cilvēkiem specifiskiem LRG no neironiem in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特LRG异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 尃 调 神经 元<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 䧈单 （单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基因 的 基 因 的 基 因神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическимие (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностороней) тчстения) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные in исованисле vivo16 un нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO3 glutamāterģiskie neironi bija ievērojami paaugstināti, salīdzinot ar hCO3 glutamāterģiskajiem neironiem (koriģēts P<0,05, reizes izmaiņas >2, vismaz 10%). Agrīnās atbildes reakcijas (ERG) un vēlīnās atbildes reakcijas gēnu bagātināšanas analīze (vienpusējs Fišera precīzais tests), atbildes reakcijas aktivitātes atkarīgie gēni (LRG), kas identificēti in vivo pelēm16 un in vitro neironiem17. Cilvēkam specifiski LRG.Punktētā līnija norāda uz Bonferroni koriģētu P vērtību 0,05. h, GluN gēna ekspresija (katra gēna pseido-pakotne un mērogošana) bija ievērojami paaugstināta LRG gēnu snRNS-seq replikās t-hCO glutamāterģiskajos neironos. i, imūnkrāsošana, kas parāda SCG2 ekspresiju t-hCO (augšējā) un hCO (apakšējā) neironos. Baltās bultiņas norāda uz SCG2+ šūnām. Mēroga josla, 25 µm. Dati ir izteikti kā vidējais ± standartnovirze.
Pamatojoties uz paaugstinātu t-hCO aktivitāti, kas novērota ex vivo šķēlēs, snRNA-seq atklāja aktivitātes atkarīgu gēnu transkriptu augšupregulāciju t-hCO salīdzinājumā ar hCO in vitro. Glutamaterģiskie t-hCO neironi ekspresēja augstāku gēnu līmeni, kas regulē vēlīno atbildes reakcijas aktivitāti (2.g, h att.), kas tika konstatēts iepriekšējos pētījumos ar peļu un cilvēku neironiem16,17. Piemēram, BDNF18, SCG2 un OSTN, primātiem specifisks aktivitāti regulējošs gēns, uzrādīja paaugstinātu ekspresiju t-hCO neironos salīdzinājumā ar hCO neironiem (2.g-i att.). Tādējādi t-hCO neironiem bija uzlabotas nobriešanas īpašības salīdzinājumā ar hCO neironiem, veicot transkripcijas, morfoloģisko un funkcionālo analīzi.
Lai tālāk novērtētu t-hCO nobriešanas saistību ar cilvēka smadzeņu attīstību, mēs veicām augļa un pieauguša cilvēka garozas šūnu tipu19,20 un pieauguša cilvēka21,22 transkriptomiskus salīdzinājumus, kā arī plašus datus par garozas gēnu ekspresiju23 attīstības laikā (paplašināti dati, 5. att.). Saskaņā ar iepriekšējiem darbiem24, globālais hCO un t-hCO transkriptomu nobriešanas statuss 7–8 diferenciācijas mēnešos lielā mērā atbilst in vivo attīstības laikam un ir visatbilstošākais vēlīnam augļa dzīves posmam (paplašināti dati, 5.a att.). Jāatzīmē, ka mēs novērojām palielinātu transkriptomu briedumu t-hCO salīdzinājumā ar vecumam atbilstošu hCO, kā arī transkriptomu aktivāciju, kas saistīta ar sinaptoģenēzi, astroģenēzi un mielinizāciju (paplašināti dati, 5.b–d att.). Šūnu līmenī mēs atradām pierādījumus par plānāku garozas apakštipu t-hCO, glutamāterģisko neironu kopām pārklājoties ar pieaugušo L2/3, L5 un L6 neironu apakštipiem (1.i attēls). Turpretī klasteru pārklāšanās starp glutamāterģiskajiem t-hCO neironiem un augļa kortikālajiem neironiem grūtniecības vidū bija ierobežotāka (paplašināti dati, 5.e–j attēls). Lai noteiktu, vai t-hCO neironi ir funkcionāli līdzīgi cilvēka postnatālajiem neokortikālajiem neironiem, mēs veicām cilvēka L2/3 piramīdneironu elektrofizioloģiskos ierakstus un anatomiskās rekonstrukcijas cilvēka postnatālās garozas asās daļās (paplašināti dati, 7.a attēls). L2/3 piramīdneironu elektrofizioloģiskās īpašības bija līdzīgas t-hCO piramīdneironu īpašībām (paplašināti dati, 7.e attēls). Morfoloģiski L2/3 neironi no postnatāliem cilvēku paraugiem bija līdzīgāki t-hCO nekā hCO, lai gan L2/3 šūnas bija garākas, kopumā saturēja vairāk zaru un tām bija lielāks mugurkaula blīvums (3.g attēls un paplašināti dati, 7.b–G attēls).
a, kontroles un TS hiPS šūnu līniju saražotā hCO3 transplantācija jaundzimušām žurkām. b, ar biocitīniem pildītu t-hCO3 neironu 3D rekonstrukcija pēc 8 mēnešu diferenciācijas. c, vidējā dendrīta garuma kvantitatīva noteikšana (n = 19 kontroles neironi, n = 21 TS neirons; **P = 0,0041). d, 3D rekonstruēti dendrītiskie zari no kontroles un TS t-hCO 8 diferenciācijas mēnešos un dendrītisko mugurkaula blīvuma kvantitatīva noteikšana (n = 16 kontroles neironi, n = 21 TS neirons, ***P <0, 0001). d, 3D rekonstruēti dendrītiskie zari no kontroles un TS t-hCO 8 diferenciācijas mēnešos un dendrītisko mugurkaula blīvuma kvantitatīva noteikšana (n = 16 kontroles neironi, n = 21 TS neirons, ***P <0, 0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинчеостных плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, dendritisko zaru 3D rekonstrukcija no kontroles un t-hCO TS 8 diferenciācijas mēnešos un dendritiskā mugurkaula blīvuma kvantitatīvā noteikšana ( n = 16 kontroles neironi, n = 21 TS neirons, *** P <0, 0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n化16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки un колинцирополотна дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontroles dendritisko zaru un TS t-hCO 3D rekonstrukcija 8 diferenciācijas mēnešos un dendritisko mugurkaula blīvuma kvantitatīvā noteikšana ( n = 16 kontroles neironi, n = 21 TS neirons, *** P <0, 0001).Sarkanās zvaigznītes norāda iespējamās dendritiskās tapas. e, spontānas EPSC kontroles un TS t-hCO neironos pēc 8 mēnešu diferenciācijas. f, kumulatīvās frekvences diagramma un sinaptisko notikumu frekvences un amplitūdas kvantitatīva noteikšana (n = 32 kontroles neironi, n = 26 TS neironi; **P = 0,0076 un P = 0,8102). g, TS un kontroles neironu Šolla analīze hCO un t-hCO. Pārtrauktās līnijas salīdzināšanai parāda cilvēka L2/3 postnatālos piramīdveida neironus (n = 24 kontroles t-hCO neironi, n = 21 TS t-hCO neirons, n = 8 kontroles hCO neironi un n = 7 TS hCO neironi). Dati ir izteikti kā vidējais ± standartnovirze.
t-hCO spēja augstā līmenī replicēt cilvēka garozas neironu morfoloģiskās un funkcionālās iezīmes pamudināja mūs izpētīt, vai t-hCO varētu izmantot slimību fenotipu noteikšanai. Mēs koncentrējāmies uz TS – smagu neiroattīstības traucējumu, ko izraisa funkciju pastiprinošas mutācijas gēnā, kas kodē CaV1.2, kurš neironos ierosina aktivitātes atkarīgu gēnu transkripciju. Mēs ieguvām hCO no trim TS pacientiem, kuriem bija visizplatītākā aizvietošana (p.G406R), un trim kontroles grupas dalībniekiem (3.a att.). Pēc transplantācijas mēs atklājām, ka TS neironu dendrītiskā morfoloģija bija mainījusies, salīdzinot ar kontroles grupu (3.b att. un paplašinātie dati, 8.a,b att.), ar divkāršu primāro dendrītu skaita pieaugumu un kopējo dendrītu garuma palielināšanos un kopējo samazināšanos (3.c att. un paplašinātie dati, 8.c att.). Tas bija saistīts ar palielinātu dzeloņu blīvumu un palielinātu spontānu EPSC biežumu TS neironos, salīdzinot ar kontroles grupas dalībniekiem (3.d–f att. un paplašinātie dati, 8.g att.). Turpmākā analīze atklāja patoloģiskas dendritisko sazarojumu modeļus t-hCO TS, salīdzinot ar kontroles grupu, bet ne in vitro TS hCO līdzīgā diferenciācijas stadijā (3.g att.). Tas atbilst mūsu iepriekšējiem ziņojumiem par aktivitātes atkarīgu dendritisko sarukšanu TS un izceļ šīs transplantācijas platformas spēju noteikt slimības fenotipus in vivo.
Pēc tam mēs jautājām, cik lielā mērā t-hCO šūnas ir funkcionāli integrētas žurku S1. Grauzēju S1 saņem spēcīgu sinaptisku ievadi no ipsilaterālā ventrālā bazālā un mugurējā talāma kodola, kā arī no ipsilaterālā motorā un sekundārā somatosensorā garozas, un kontralaterālā S1 (4.a att.). Lai atjaunotu inervācijas modeli, mēs inficējām hCO ar trakumsērgas vīrusu-dG-GFP/AAV-G un 3 dienas vēlāk transplantējām hCO S1 žurkai. Mēs novērojām blīvu GFP ekspresiju ipsilaterālā S1 un ventrālo bazālo gangliju neironos 7–14 dienas pēc transplantācijas (4.b, c att.). Turklāt talāma marķiera netrīna G1 antivielu krāsošana atklāja talāma galu klātbūtni t-hCO (4.d, e att.). Lai novērtētu, vai šīs aferentās projekcijas varētu izraisīt sinaptiskas atbildes t-hCO šūnās, mēs veicām pilnšūnu ierakstus no cilvēka šūnām talamokortikālā slāņa asās daļās. Žurkas S1, iekšējās kapsulas, baltās vielas, šķiedru t-hCO tuvumā elektriskā stimulācija vai opsīnu ekspresējošo talāma galu optogēniska aktivācija t-hCO izraisīja īslaicīgas EPSC t-hCO neironos, kas pakļauti AMPA receptoru antagonista NBQX iedarbībai. (4.f, g attēls un paplašināti dati, 9.a–g attēls). Šie dati parāda, ka t-hCO ir anatomiski integrēts žurkas smadzenēs un to spēj aktivizēt žurkas saimnieka audi.
a, Trakumsērgas izsekošanas eksperimenta shematiska diagramma. b, GFP un cilvēkam specifiskā STEM121 ekspresija starp t-hCO un žurkas smadzeņu garozu (augšējais panelis). Parādīta arī GFP ekspresija žurkas ipsilaterālajā ventrālajā bazālajā kodolā (VB) (apakšējā kreisajā stūrī) un ipsilaterālajā S1 (apakšējā labajā stūrī). Mēroga josla, 50 µm. Sarkanie kvadrāti attēlo smadzeņu zonas, kurās tika uzņemti attēli. c, šūnu, kas ekspresē GFP, kvantifikācija (n = 4 žurkas). d, e — Netrin G1+ talāma termināļi t-hCO. d parāda koronālo griezumu, kas satur t-hCO un VB kodolus. Mēroga josla, 2 mm. e parāda Netrin G1 un STEM121 ekspresiju t-hCO (kreisajā) un VB (labajā) neironos. Mēroga josla, 50 µm. Oranžā punktētā līnija norāda t-hCO robežu. f, g, t-hCO neironu strāvas līknes pēc elektriskās stimulācijas S1 žurkā (f) vai iekšējā kapsulā (g) ar (violets) vai bez (melns) NBQX (pa kreisi). EPSC amplitūdas ar un bez NBQX (n = 6 S1 neironi, *P = 0,0119; un n = 6 iekšējās kapsulas neironi, **P = 0,0022) (centrā). T-hCO neironu procentuālā daļa, kuriem ir EPSC, reaģējot uz žurkas S1 (f) vai iekšējās kapsulas (g) elektrisko stimulāciju (pa labi). aCSF, mākslīgais cerebrospinālais šķidrums. h, 2P attēlveidošanas eksperimenta shematiska diagramma (pa kreisi). GCaMP6 ekspresija t-hCO (vidū). Mēroga josla, 100 µm. GCaMP6 fluorescences laika intervāls (pa labi). i, spontānas aktivitātes fluorescences Z-rādītājs. j, ūsu stimulācijas shematisks attēlojums. k, z-ieskaitītas 2P fluorescences trajektorijas vienā izmēģinājumā, saskaņotas ar ūsu novirzi nulles laikā (punktēta līnija) piemēra šūnās. l, visu šūnu populācijas vidējās z-ieskaitles atbildes, kas saskaņotas ar ūsu novirzi nulles laikā (punktēta līnija) (sarkans) vai nejauši ģenerētiem laika zīmogiem (pelēks). m. Eksperimenta shematiska diagramma ar optisko marķēšanu. n, Neapstrādātas sprieguma līknes no piemēra t-hCO šūnas zilā lāzera stimulācijas vai ūsu novirzes laikā. Sarkanās bultiņas norāda pirmos impulsus, ko izraisa gaisma (augšā) vai ūsu novirze (apakšā). Pelēkais ēnojums norāda ūsu novirzes periodus. o, Maksimālās gaismas viļņu formas un ūsu novirzes atbildes. p, viena mēģinājuma impulsi, saskaņoti ar ūsu novirzi piemēra šūnās. 0 norāda ūsu novirzi (punktēta līnija). q, visu gaismjutīgo šūnu populācijas vidējā z-ieskaitles aktivācijas ātrums, saskaņots ar ūsu novirzi nulles laikā (punktēta līnija) (sarkans) vai nejauši ģenerētiem laika zīmogiem (pelēks). r, gaismjutīgo vienību īpatsvars, ko būtiski modulē ūsu novirze (n = 3 žurkas) (pa kreisi). Maksimālā z-rādītāja latentums (n = 3 žurkas; n = 5 (gaiši zaļa), n = 4 (tumši zaļa) un n = 4 (ciāna) ūsu novirzes modulācijas vienības uz žurku) (pa labi). Dati ir izteikti kā vidējais aritmētiskais ± standartnovirze.
Pēc tam mēs jautājām, vai t-hCO3 varētu aktivizēt ar sensoriem stimuliem in vivo. Mēs transplantējām S1 žurkām hCO3, kas ekspresē ģenētiski kodētos kalcija indikatorus GCaMP6. Pēc 150 dienām mēs veicām šķiedru fotometriju vai divu fotonu kalcija attēlveidošanu (4.h att. un paplašinātie dati, 10.a att.). Mēs atklājām, ka t-hCO3 šūnas uzrādīja sinhronizētu ritmisku aktivitāti (4.i att., paplašinātie dati, 10.b attēls un 1. papildvideo). Lai raksturotu t-hCO3 aktivitātes maksimumu, mēs veicām ekstracelulārus elektrofizioloģiskos ierakstus anestēzētām transplantētām žurkām (paplašinātie dati, 10.c-f att.). Mēs esam ģenerējuši stereotaksiskās koordinātas no MRI attēliem; tādējādi šīs reģistrētās vienības pārstāv iespējamos cilvēka neironus, lai gan elektrofizioloģija vien neļauj noteikt izcelsmes sugu. Mēs novērojām sinhronizētus aktivitātes uzliesmojumus (paplašinātie dati, 10.d att.). Uzliesmojumi ilga aptuveni 460 ms un tika atdalīti ar aptuveni 2 s klusuma periodiem (paplašinātie dati, 10.d, e att.). Atsevišķas vienības izšāva vidēji aptuveni trīs šāvienus vienā uzliesmojumā, kas ir aptuveni 73% no reģistrētajām vienībām vienā uzliesmojumā. Atsevišķu vienību aktivitātes bija ļoti korelētas, un šīs korelācijas bija augstākas nekā vienībām, kas identificētas nevakcinētiem dzīvniekiem, reģistrētas tādos pašos apstākļos (paplašināti dati, 10.f att.). Lai vēl vairāk raksturotu identificēto no cilvēka iegūtu neironu impulsu reakcijas, mēs veicām gaismas marķēšanas eksperimentus ar anestēzētām žurkām, kurām transplantēja hCO3, kas ekspresē gaismas jutīgo katjonu kanālu rodopsīnu 2 (hChR2), caur kuru t-hCO neironiem ir īsa latentuma atpazīšana (mazāk nekā 10 ms), reaģējot uz zilās gaismas stimuliem (4.m–o att.). t-hCO neironi uzrādīja spontānas aktivitātes uzliesmojumus frekvencēs, kas līdzīgas tām, kas novērotas kalcija attēlveidošanā, kā arī elektrofizioloģiskajos ierakstos, kas veikti t-hCO3 bez gaismas marķēšanas (paplašināti dati, 10.c–g att.). Atbilstošajos hCO3 posmos, kas reģistrēti in vitro, spontāna aktivitāte netika novērota. Lai novērtētu, vai t-hCO3 var aktivizēt sensoriski stimuli, mēs īslaicīgi novirzījām žurku ūsas prom no t-hCO3 (4.j,m att. un paplašinātie dati, 10.h,k att.). Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem8,10, daļa t-hCO3 šūnu uzrādīja paaugstinātu aktivitāti, reaģējot uz ūsu novirzi, kas netika novērota, salīdzinot datus ar nejaušiem laika zīmogiem (4.k–q att. un paplašinātie dati, 10.h–q att.). Patiešām, aptuveni 54% no optiski iezīmētajām atsevišķajām vienībām uzrādīja ievērojami paaugstinātu uzbudinājuma ātrumu pēc ūsu stimulācijas, sasniedzot maksimumu aptuveni 650 ms (4.r att.). Kopumā šie dati liecina, ka t-hCO3 saņem atbilstošus funkcionālos ievades signālus un to var aktivizēt vides stimuli.
Pēc tam mēs pētījām, vai t-hCO varētu aktivizēt žurku neironu ķēdes, lai kontrolētu uzvedību. Vispirms mēs pētījām, vai t-hCO neironu aksoni projicējas apkārtējos žurkas audos. Mēs inficējām hCO ar lentivīrusu, kas kodē hChR2, kas sapludināts ar EYFP (hChR2-EYFP). Pēc 110 dienām mēs novērojām EYFP ekspresiju ipsilaterālos kortikālajos reģionos, tostarp dzirdes, motorajā un somatosensorajā garozā, kā arī subkortikālajos reģionos, tostarp striatumā, hipokampā un talāmā (5.a att.). Lai novērtētu, vai šīs eferentās projekcijas varētu izraisīt sinaptiskas atbildes žurku šūnās, mēs optiski aktivizējām t-hCO šūnas, kas ekspresē hChR2-EYFP, reģistrējot žurku smadzeņu garozas šūnas asos smadzeņu griezumos. T-hCO aksonu aktivācija ar zilo gaismu inducēja īsas latentuma EPSC žurku piramīdās garozas neironos, kurus bloķēja NBQX (5.b–g att.). Turklāt šīs reakcijas varēja bloķēt tetrodotoksīns (TTX) un atjaunot ar 4-aminopiridīnu (4-AP), kas liecina, ka tās izraisīja monosinaptiski savienojumi (5.e att.).
a, Aksonu izsekošanas shematiska diagramma (pa kreisi). t-hCO3 EYFP ekspresija (pa labi). Mēroga josla, 100 µm. A1, dzirdes garoza, ACC, priekšējā cingulārā garoza, d. striatums, dorsālais striatums, HPC, hipokamps; Diafragma, laterālā starpsiena, mPFC, mediālā prefrontālā garoza, piriformā garoza, v. striatums, ventrālais striatums, VPM, talāma ventropostomidālais kodols, VTA, ventrālais tegmentālais reģions. Sarkanie kvadrāti attēlo smadzeņu zonas, kurās tika uzņemti attēli. b, Stimulācijas eksperimenta shematiska diagramma. c, d, Zilās gaismas inducētās fotostrāvas (augšā) un sprieguma (apakšā) reakcijas piemēri cilvēka (c) EYFP+ t-hCO3 vai žurkas (d) EYFP- šūnās. e, f, Žurku neironu strāvas līknes pēc t-hCO aksonu stimulācijas ar zilo gaismu ar TTX un 4-AR (zaļš), TTX (pelēks) vai aCSF (melns) (e), ar (violets) vai bez (melns)) ) NBQX (e). g, zilās gaismas izraisītu reakciju latentums žurku šūnās (n = 16 šūnas); horizontālās joslas norāda vidējo latentumu (7,13 ms) (pa kreisi). Gaismas izraisīto EPSC amplitūda, kas reģistrēta ar vai bez NBQX (n = 7 šūnas; ***P <0, 0001) (vidū). Gaismas izraisīto EPSC amplitūda, kas reģistrēta ar vai bez NBQX (n = 7 šūnas; ***P <0, 0001) (vidū). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Gaismas izraisītu EPSC amplitūda, kas reģistrēta ar vai bez NBQX (n = 7 šūnas; ***P <0, 0001) (centrā).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（丂）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（丂） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Gaismas izraisītu EPSC amplitūda, kas reģistrēta ar vai bez NBQX (n = 7 šūnas; ***P <0, 0001) (centrā).Žurku šūnu procentuālā daļa, kurām ir EPSC, kas reaģē uz zilo gaismu (pa labi). h, Uzvedības uzdevuma shematiska diagramma. d0, 0. diena. i. Priekšzīmīgu dzīvnieku sniegums apmācības 1. dienā (pa kreisi) vai 15. dienā (pa labi). Vidējais laizīšanas reižu skaits, kas veikts 1. dienā (pa kreisi) vai 15. dienā (pa labi centrā) (n = 150 zilās gaismas mēģinājumi, n = 150 sarkanās gaismas mēģinājumi; ***P < 0,0001). Vidējais laizīšanas reižu skaits, kas veikts 1. dienā (pa kreisi) vai 15. dienā (pa labi centrā) (n = 150 zilās gaismas mēģinājumi, n = 150 sarkanās gaismas mēģinājumi; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Vidējais laizījumu skaits, kas veikts 1. dienā (pa kreisi) vai 15. dienā (centrā labajā pusē) (n = 150 zilās gaismas mēģinājumi, n = 150 sarkanās gaismas mēģinājumi; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Vidējais laizījumu skaits, kas veikts 1. dienā (pa kreisi) vai 15. dienā (centrā labajā pusē) (n = 150 zilās gaismas mēģinājumi, n = 150 sarkanās gaismas mēģinājumi; ***P < 0,0001).Kumulatīvie laizāmie paraugi sarkanās un zilās gaismas izmēģinājumiem 1. dienā (centrā pa kreisi) vai 15. dienā (pa labi). NS, nav statistiski nozīmīgs. j, k, Visu dzīvnieku, kuriem 1. vai 15. dienā transplantēja t-hCO3, kas ekspresē hChR2-EYFP (j) vai kontroles fluoroforu (k), uzvedības raksturlielumi (hChR2-EYFP: n = 9 žurkas, ** P = 0,0049; kontrole: n = 9, P = 0,1497). l, preferenču rādītāja evolūcija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, preferenču rādītāja evolūcija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, preferenču rādītāja evolūcija (n = 9 hChR2, n = 9 kontroles; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, preferenču rādītāju evolūcija (n = 9 hChR2, n = 9 kontroles; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS ekspresija, reaģējot uz t-hCO3 optogēnisko aktivāciju S1. Tiek parādīti FOS ekspresijas attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (n = 3 katrā grupā; *P <0, 05, **P <0, 01 un ***P <0, 001) (pa labi). Tiek parādīti FOS ekspresijas attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (n = 3 katrā grupā; *P <0, 05, **P <0, 01 un ***P <0, 001) (pa labi). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,0пра1, 0,01). Tiek parādīti FOS ekspresijas attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (n = 3 katrā grupā; *P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001) (pa labi).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）囃叀）叀显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）囃叀）叀 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,0пра1, 0,01). Tiek parādīti FOS ekspresijas attēli (pa kreisi) un kvantitatīvā noteikšana (n = 3 katrā grupā; *P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001) (pa labi).Mēroga josla, 100 µm. Dati ir izteikti kā BLA, bazolaterālās mandeles, MDT, dorsomediālā talāma kodola, PAG, periakveduktālā pelēkā apgabala vidējais rādītājs ± standartkļūda.
Visbeidzot, mēs jautājām, vai t-hCO3 varētu modulēt žurku uzvedību. Lai to pārbaudītu, mēs transplantējām hChR2-EYFP ekspresējošu hCO3 S1, un 90 dienas vēlāk mēs implantējām optiskās šķiedras t-hCO3 gaismas piegādei. Pēc tam mēs apmācījām žurkas ar modificētu operantās kondicionēšanas paradigmu (5.h att.). Mēs ievietojām dzīvniekus uzvedības testa kamerā un nejauši pielietojām 5 sekunžu zila (473 nm) un sarkana (635 nm) lāzera stimulus. Dzīvnieki saņēma ūdens atlīdzību, ja tie laizīja zilās gaismas stimulācijas laikā, bet nelaizīja sarkanās gaismas stimulācijas laikā. Pirmajā apmācības dienā dzīvniekiem nebija atšķirības laizīšanā, stimulējot ar zilu vai sarkanu gaismu. Tomēr 15. dienā dzīvnieki, kuriem transplantēja hCO3, kas ekspresēja hChR2-EYFP, parādīja aktīvāku laizīšanu, stimulējot ar zilu gaismu, salīdzinot ar sarkanās gaismas stimulāciju. Šīs laizīšanas uzvedības izmaiņas netika novērotas kontroles dzīvniekiem, kuriem transplantēja hCO3, kas ekspresēja kontroles fluoroforu (mācīšanās panākumu līmenis: hChR2 89%, EYFP 0%, 5.i-1. attēls un 2. papildinošais video). Šie dati liecina, ka t-hCO šūnas var aktivizēt žurku neironus, lai stimulētu atlīdzības meklēšanas uzvedību. Lai noskaidrotu, kuri žurku t-hCO neironu ķēdes varētu būt iesaistītas šajās uzvedības izmaiņās, mēs optoģenētiski aktivizējām t-hCO apmācītiem dzīvniekiem un 90 minūtes vēlāk savācām audus. Imunohistoķīmija atklāja aktivitātes atkarīgā FOS proteīna ekspresiju vairākās smadzeņu zonās, kas iesaistītas motivētā uzvedībā, tostarp mediālajā prefrontālajā garozā, mediālajā talāmā un periakveduktālajā pelēkajā vielā, kas tika ekspresēta vai nu nestimulētiem kontroles dzīvniekiem, vai dzīvniekiem. rīsi. 5m). Kopumā šie dati liecina, ka t-hCO var modulēt žurku neironu aktivitāti, lai vadītu uzvedību.
Neironu organoīdi ir daudzsološa sistēma cilvēka attīstības un slimību izpētei in vitro, taču tos ierobežo savienojumu trūkums starp neironu ķēdēm, kas pastāv in vivo. Esam izstrādājuši jaunu platformu, kurā transplantējām hCO imūnkompromitētu agrīna postnatāla vecuma žurku S1 audos, lai pētītu cilvēka šūnu attīstību un funkcijas in vivo. Esam pierādījuši, ka t-hCO attīsta nobriedušus šūnu tipus, kas nav novēroti in vitro28, un ka t-hCO ir anatomiski un funkcionāli integrēts grauzēju smadzenēs. t-hCO integrācija grauzēju neironu ķēdēs ļāva mums izveidot saikni starp cilvēka šūnu aktivitāti un pētīto dzīvnieku uzvedību, parādot, ka t-hCO neironi var modulēt žurku neironu aktivitāti, lai veicinātu uzvedības reakcijas.
Mūsu aprakstītajai platformai ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar iepriekšējiem pētījumiem par cilvēka šūnu transplantāciju grauzēju smadzenēs. Pirmkārt, mēs transplantējām hCO3 agrīnā postnatālā periodā esošu žurku smadzeņu garozas attīstībā, kas var veicināt anatomisku un funkcionālu integrāciju. Otrkārt, t-hCO3 MRI monitorings ļāva mums pētīt transplantāta pozīciju un augšanu dzīvos dzīvniekos, ļaujot veikt ilgtermiņa pētījumus ar vairākiem dzīvniekiem un noteikt vairāku hiPS šūnu līniju uzticamību. Visbeidzot, mēs transplantējām veselus organoīdus, nevis izolētas atsevišķu šūnu suspensijas, kas ir mazāk destruktīvas cilvēka šūnām un var veicināt cilvēka smadzeņu garozas neironu integrāciju un veidošanos žurku smadzenēs.
Mēs atzīstam, ka, neskatoties uz sasniegumiem šajā platformā, laika, telpas un starpsugu ierobežojumi neļauj veidot cilvēka neironu ķēdes ar augstu precizitāti pat pēc transplantācijas agrīnā attīstības stadijā. Piemēram, nav skaidrs, vai spontānā aktivitāte, kas novērota t-hCO, atspoguļo attīstības fenotipu, kas līdzīgs ritmiskajai aktivitātei, kas novērota kortikālās attīstības laikā, vai arī tā ir saistīta ar nomācošo šūnu tipu neesamību t-hCO. Līdzīgi nav skaidrs, cik lielā mērā laminācijas neesamība t-hCO ietekmē ķēdes savienojamību30. Turpmākais darbs būs vērsts uz citu šūnu tipu, piemēram, cilvēka mikroglijas, cilvēka endotēlija šūnu un dažādu GABAerģisko interneuronu proporciju, integrēšanu, kā parādīts, izmantojot 6. komplektu in vitro, kā arī uz izpratni par to, kā neironu integrācija un apstrāde var notikt izmainītā t-hCO transkripcijas, sinaptiskajā un uzvedības līmenī šūnās, kas iegūtas no pacientiem.
Kopumā šī in vivo platforma ir spēcīgs resurss, kas var papildināt cilvēka smadzeņu attīstības un slimību pētījumus in vitro. Mēs paredzam, ka šī platforma ļaus mums atklāt jaunus šķiedru līmeņa fenotipus citādi grūti sasniedzamās no pacientiem iegūtās šūnās un testēt jaunas terapeitiskās stratēģijas.
Mēs ģenerējām hCO2,5 no HiPS šūnām, kā aprakstīts iepriekš. Lai uzsāktu hCO2 ražošanu no hiPS šūnām, kas kultivētas uz barotnes slāņiem, veselas hiPS šūnu kolonijas tika izņemtas no kultūras trauciņiem, izmantojot dispāzi (0,35 mg/ml), un pārvietotas uz īpaši zemas piesaistes plastmasas kultūrām paredzētiem trauciņiem ar hiPS šūnu kultūras barotni (Corning), kas papildināta ar diviem SMAD inhibitoriem: dorsomorfīnu (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) un SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris), kā arī ROCK inhibitoru Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pirmo 5 dienu laikā hiPS šūnu barotne tika mainīta katru dienu un pievienots dorsomorfīns un SB-431542. Sestajā suspensijas dienā neironu sferoīdi tika pārvietoti uz neironu barotni, kas saturēja neirobasālo-A (10888, Life Technologies), B-27 piedevu bez A vitamīna (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilīnu un streptomicīnu (1:100, Life Technologies), un papildināti ar epidermas augšanas faktoru (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) un fibroblastu augšanas faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) līdz 24. dienai. No 25. līdz 42. dienai barotne tika papildināta ar no smadzenēm iegūtu neirotrofisko faktoru (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) un neirotrofīnu 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), mainot barotni katru otro dienu. Sestajā suspensijas dienā neironu sferoīdi tika pārvietoti uz neironu barotni, kas saturēja neirobasālo-A (10888, Life Technologies), B-27 piedevu bez A vitamīna (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilīnu un streptomicīnu (1:100, Life Technologies), un papildināti ar epidermas augšanas faktoru (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) un fibroblastu augšanas faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) līdz 24. dienai. No 25. līdz 42. dienai barotne tika papildināta ar no smadzenēm iegūtu neirotrofisko faktoru (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) un neirotrofīnu 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), mainot barotni katru otro dienu.Sestajā suspensijas dienā neironu sferoīdi tika pārvietoti uz neironu barotni, kas satur Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 piedevu bez A vitamīna (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) un penicilīnu.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) un фактомифром роста 20 нг/мл; R&D sistēmas) līdz 24-го дня. un streptomicīnu (1:100, Life Technologies) un papildinātu ar epidermas augšanas faktoru (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) un fibroblastu augšanas faktoru 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) līdz 24. dienai.No 25. līdz 42. dienai barotnei pievienoja no smadzenēm iegūtu neirotrofisko faktoru (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) un neirotrofīnu 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), mainot barotni katru otro dienu.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含焴A2生砠B不含焴A2生皴补充剂 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100), Life Technologies) Tehnoloģijas）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2；2（FGF2R&ml；D Sistēmas）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 绁 納 嚍 唟 丟 丟b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 培养 基 中 培养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 須 0 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； pētniecības un attīstības sistēmas） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Sistēmas）直至第24天. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technобавкук-7 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D sistēmas) un фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6. dienā neirosfēras suspensijas tika nomainītas pret uztura bagātinātāju, kas satur neirobasālu-A (10888, Life Technologies), B-27 vitamīna uztura bagātinātāju bez A vitamīna (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), ar penicilīnu neitralizētu streptomicīnu (1:100, Life Technologies), kas papildināts ar epidermas augšanas faktoru (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) un fibroblastu augšanas faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D sistēmas) līdz 24-го дня. Pētniecības un attīstības sistēmas) līdz 24. dienai.No 25. līdz 42. dienai barotnei katru otro dienu pievienoja no smadzenēm iegūtu neirotrofisko faktoru (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) un neirotrofisko faktoru 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). Barotne tika mainīta vienu reizi.Sākot ar 43. dienu, hCO3 tika uzturēts nepapildinātā neirobasālā-A vidē (NM; 1088022, Thermo Fisher), mainot vidi ik pēc 4–6 dienām. Lai iegūtu hCO3 no hiPS šūnām, kas kultivētas bezbarošanas apstākļos, hiPS šūnas tika inkubētas ar Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) 37°C temperatūrā 7 minūtes, sadalītas atsevišķās šūnās un uzklātas uz AggreWell 800 plāksnēm (34815, STEMCELL Technologies) ar blīvumu 3 × 106 atsevišķas šūnas uz iedobi Essential 8 vidē, kas papildināta ar ROCK inhibitoru Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pēc 24 stundām iedobēs esošās barotnes ar pipeti tika pārvietotas augšup un lejup barotnē, kas saturēja Essential 6 barotni (A1516401, Life Technologies), kas papildināta ar dorsomorfīnu (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) un SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). No 2. līdz 6. dienai Essential 6 barotne katru dienu tika aizstāta ar dorsomorfīnu un papildinājumu SB-431542. Sākot ar sesto dienu, neirosfēru suspensijas tika pārnestas uz neirobasālo barotni un uzturētas, kā aprakstīts iepriekš.
Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar Stenfordas Universitātes laboratorijas dzīvnieku aprūpes administratīvās komitejas (APLAC) apstiprinātajām dzīvnieku aprūpes vadlīnijām. Grūsnas eitimiskas RNU (rnu/+) žurkas tika iegādātas (Charles River Laboratories) vai izmitinātas. Dzīvnieki tika turēti 12 stundu gaismas-tumsas ciklā ar barību un ūdeni ad libitum. Kailie (FOXN1–/–) žurku mazuļi vecumā no trim līdz septiņām dienām tika identificēti pēc nenobriedušu ūsu augšanas pirms izkaušanas. Kucēni (tēviņi un mātītes) tika anestēti ar 2-3% izoflurānu un novietoti uz stereotaksiska rāmja. Tika veikta galvaskausa trepanācija ar aptuveni 2-3 mm diametru virs S1, saglabājot cietā smadzeņu apvalka integritāti. Pēc tam tieši ārpus kraniotomijas tika izmantota 30-G adata (aptuveni 0,3 mm), lai caurdurtu cieto smadzeņu apvalku. Pēc tam uz plānas 3×3 cm parafilmas uzklājiet HCO3 un noņemiet lieko barotni. Izmantojot Hamilton šļirci, kas piestiprināta pie 23 G, 45° adatas, uzmanīgi ievelciet hCO3 adatas tālākajā galā. Pēc tam uzstādiet šļirci uz šļirces sūkņa, kas pievienots stereotaksiskajai ierīcei. Pēc tam novietojiet adatas galu virs iepriekš izveidota 0,3 mm plata cauruma cietajā smadzeņu apvalkā (z = 0 mm) un sašauriniet šļirci par 1–2 mm (z = aptuveni –1,5 mm), līdz adata atrodas starp cieto smadzeņu apvalku A. Izveidojas blīvs blīvējums. Pēc tam paceliet šļirci līdz kortikālās virsmas centram pie z = -0,5 mm un injicējiet hCO3 ar ātrumu 1–2 µl minūtē. Pēc hCO3 injekcijas pabeigšanas adata tiek izvilkta ar ātrumu 0,2–0,5 mm minūtē, āda tiek sašūta un kucēns nekavējoties tiek novietots uz silta sildoša paliktņa līdz pilnīgai atveseļošanai. Dažiem dzīvniekiem tika veikta divpusēja transplantācija.
Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar Stenfordas Universitātes APLAC apstiprinātajām dzīvnieku aprūpes vadlīnijām. Žurkām (vairāk nekā 60 dienas pēc transplantācijas) tika veikta 5% izoflurāna anestēzija un attēlveidošanas laikā anestēzija ar 1-3% izoflurānu. Vizualizācijai tika izmantots 7 Tesla aktīvi ekranēts horizontāls urbuma skeneris Bruker (Bruker Corp.) ar International Electric Company (IECO) gradienta piedziņu, ekranēts gradienta ieliktnis ar iekšējo diametru 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s), izmantojot AVANCE. III, astoņu kanālu daudzspoļu RF un daudzkodolu iespējas, kā arī pievienoto Paravision 6.0.1 platformu. Ierakstīšana tika veikta, izmantojot aktīvi atvienotu tilpuma RF spoli ar iekšējo diametru 86 mm un četru kanālu kriodzesējamu RF spoli tikai uztveršanai. Axial 2D Turbo-RARE (atkārtošanās laiks = 2500 ms, atbalss laiks = 33 ms, 2 vidējie rādītāji) ar 16 šķēlumu uztveršanu, šķēles biezums 0,6–0,8 mm, kas satur 256 × 256 paraugus. Signāli tika uztverti, izmantojot kvadratūras raidītāja-uztvērēja volumetrisko RF spoli ar iekšējo diametru 2 cm (Rapid MR International, LLC). Visbeidzot, 3D renderēšanai un tilpuma analīzei tika izmantotas iebūvētās Imaris (BitPlane) virsmas novērtēšanas funkcijas. Veiksmīga transplantācija tika definēta kā tāda, kurā transplantētajā puslodē izveidojās nepārtraukta T2 svērta MRI signāla zonas. Transplantāta atgrūšana tika definēta kā transplantāts, kas transplantētajā puslodē neradīja nepārtraukta T2 svērta MRI signāla zonas. Subkortikālais t-hCO2 tika izslēgts no turpmākās analīzes.
Lai stabili ekspresētu GCaMP6s hCO vidē divu fotonu kalcija attēlveidošanai, hiPS šūnas tika inficētas ar pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, kam sekoja antibiotiku atlase. Īsumā, šūnas tika disociētas ar EDTA un suspendētas 1 ml Essential 8 barotnes ar aptuveni 300 000 šūnu blīvumu polibrēna (5 μg/ml) un 15 μl vīrusa klātbūtnē. Pēc tam šūnas tika inkubētas suspensijā 60 minūtes un iesētas ar blīvumu 50 000 šūnas uz iedobi. Pēc saplūšanas šūnas tika apstrādātas ar 5–10 μg ml-1 puromicīna 5–10 dienas vai līdz parādījās stabilas kolonijas. Akūta hCO infekcija tika veikta, kā aprakstīts iepriekš5, ar dažām modifikācijām. Īsumā, 30.–45. dienā hCO pārvietoja 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifūgas mēģenēs, kas satur 100 µl nervu barotnes. Pēc tam aptuveni 90 µl barotnes izņem, mēģenē pievieno 3–6 µl augsta titra lentivīrusa (no 0,5 x 108 līdz 1,2 x 109) un hCO3 pārnes uz inkubatoru uz 30 minūtēm. Pēc tam katrā mēģenē pievieno 90–100 µl barotnes un mēģenes uz nakti ievieto atpakaļ inkubatorā. Nākamajā dienā hCO3 pārnes uz svaigu nervu barotni zemas piestiprināšanas plāksnēs. Pēc 7 dienām hCO3 tika pārnests uz 24 iedobju stikla dibena plāksnēm vizualizācijai un infekcijas kvalitātes novērtēšanai. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE un pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE tika ģenerēti, izmantojot VectorBuilder. Lentivīruss tiek izmantots vairumā eksperimentu, jo tas ir integrēts saimnieka genomā, ļaujot reportiera gēnu ekspresiju inficētās šūnu līnijās. Trakumsērgas novērošanai 30.–45. dienā hCO tika koinficēts ar trakumsērgas-ΔG-eGFP un AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmīda Nr. 67528, Addgene), rūpīgi mazgāts 3 dienas un transplantēts žurkām S1 stadijā un uzturēts in vivo 7–14 dienas.
Imunohistoķīmijai dzīvnieki tika anestēti un transkardiāli perfuzēti ar PBS, kam sekoja 4% paraformaldehīds (PFA PBS; Electron Microscopy Sciences). Smadzenes tika fiksētas 4% PFA 2 stundas vai nakti 4°C temperatūrā, kriokonservētas 30% saharozes PBS šķīdumā 48–72 stundas un ievietotas 1:1 30% saharozes:OCT šķīdumā (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), un koronālie griezumi tika izgatavoti 30 µm biezumā, izmantojot kriostatu (Leica). Biezu griezumu imūnhistoķīmijai dzīvnieki tika perfuzēti ar PBS, smadzenes tika preparētas un koronāli griezumi veikti 300–400 µm biezumā, izmantojot vibratomu (Leica), un griezumi tika fiksēti ar 4% PFA 30 minūtes. Pēc tam kriosekcijas vai biezās sekcijas tika mazgātas ar PBS, bloķētas 1 stundu istabas temperatūrā (10% normāls ēzeļa serums (NDS) un 0,3% Triton X-100, atšķaidīts PBS) un bloķētas ar bloķējošu šķīdumu 4°C temperatūrā. – Inkubācija Kriosekcijas tika inkubētas nakti, un biezās sekcijas tika inkubētas 5 dienas. Izmantotās primārās antivielas bija: anti-NeuN (pele, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žurka, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (trušs, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (vista, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pele, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (trušs, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (trušs, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (trušs, 1:200; HPA047819, Atlas antivielas), anti-RECA-1 (pele, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (trušs, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kaza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kaza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (pele, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pele, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (trušs, 1:400; ABN904, Millipore) un anti-IBA1 (kaza, 1:100; ab5076, abcam). Izmantotās primārās antivielas bija: anti-NeuN (pele, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žurka, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (trušs, 1:1000; Z0334, Dako), anti-D-GFP (vista, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pele, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (trušs, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (trušs, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (trušs, 1:200; HPA047819, Atlas antivielas), anti-RECA-1 (pele, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (trušs, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kaza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kaza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (pele, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pele, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (trušs, 1:400; ABN904, Millipore) un anti-IBA1 (kaza, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (30;ке, CTIP2: 00; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1,1910, мы1,1910; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antivielas), ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a,;,1:1&101a, Sistēmas), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904), иBAiант904, (коза, 1:100; аб5076, абкам). Galvenās izmantotās antivielas bija: anti-NeuN (pele, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žurka, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (trušs, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (vista, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pele, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (trušs, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (trušs, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (trušs, 1:200; HPA047819, Atlas antivielas), anti-RECA-1 (pele, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (trušs, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kaza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrīns G1a (kaza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (pele, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pele, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (trušs, 1:400; ABN904, Millipore) un anti-IBA1 (kaza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100（山羊，1:100， Sistēmas）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pele, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (trušs, 1:400; ABN904, Millipore) un anti-IBA1 (kaza, 1:100; ab5076, abcam).Galvenās izmantotās antivielas bija: anti-NeuN (pele, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žurka, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (trušs, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (vista, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pele, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (trušs, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (trušs, 1:200; sc-338, Santa Krusa), anti-PPP1R17 (trušs, 1:200; HPA047819, Atlas antiviela), anti-RECA-1 (pele, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (trušs), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM120,,1:401,, мыш20; Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) un анти-IBA1 (коза; 1, баб00ка; 1, 1500; 1, 150 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kaza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kaza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (pele, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pele, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (trušs, 1:400; ABN904, Millipore) un anti-IBA1 (kaza, 1:100; ab5076, abkam).Pēc tam griezumi tika mazgāti ar PBS un inkubēti ar sekundāro antivielu 1 stundu istabas temperatūrā (saldēti griezumi) vai nakti 4°C temperatūrā (biezi griezumi). Tika izmantota Alexa Fluor sekundārā antiviela (Life Technologies), kas atšķaidīta 1:1000 bloķējošā šķīdumā. Pēc mazgāšanas ar PBS kodoli tika vizualizēti ar Hoechst 33258 (Life Technologies). Visbeidzot, preparāti tika novietoti uz mikroskopa ar segstikliem (Fisher Scientific), izmantojot Aquamount (Polysciences), un analizēti ar Keyence fluorescences mikroskopu (BZ-X analizatoru) vai Leica TCS SP8 konfokālo mikroskopu (Las-X) uz attēla. Attēli tika apstrādāti, izmantojot ImageJ programmu (Fidži). Lai kvantitatīvi noteiktu cilvēka neironu īpatsvaru t-hCO un žurkas garozā, t-hCO centrā, žurkas garozas malā vai tās tuvumā tika uzņemti 387,5 μm plati taisnstūrveida attēli. Transplantāta malas tika noteiktas, novērtējot audu caurspīdīguma izmaiņas, HNA+ kodolus un/vai audu autofluorescences klātbūtni. Katrā attēlā kopējais NeuN+ un HNA+ šūnu skaits tika dalīts ar kopējo NeuN+ šūnu skaitu tajā pašā apgabalā. Lai nodrošinātu, ka tiek skaitītas tikai šūnas ar kodoliem attēla plaknē, aprēķinā tiek iekļautas tikai šūnas, kurām ir arī Hoechst+ kodi. Lai samazinātu statistisko kļūdu, tika aprēķināta divu attēlu vidējā vērtība, kas atdalīti ar vismaz 1 mm.
Vienu nedēļu pirms paraugu savākšanas hCO3 transplantācijas dzīvnieki (aptuveni 8 mēnešus veci diferenciācijas periodā) tika ievietoti tumšā telpā ar apgrieztiem ūsām, lai samazinātu sensorisko stimulāciju. Kodolu izolēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš, ar dažām modifikācijām. Īsumā, t-hCO3 un hCO3 tika iznīcināti, izmantojot mazgāšanas līdzekļa-mehānisko šūnu līzi un 2 ml stikla audu dzirnaviņas (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Neattīrītie kodoli pēc tam tika filtrēti, izmantojot 40 µm filtru, un centrifugēti ar 320 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā, pirms tika veikta saharozes blīvuma gradients. Pēc centrifugēšanas posma (320 g 20 minūtes 4 °C temperatūrā) paraugi tika atkārtoti suspendēti 0,04% BSA/PBS, pievienojot 0,2 vienības µl-1 RNāzes inhibitora (40 u µl-1, AM2682, Ambion), un izvadīti caur 40 µm plūsmas filtru. Disociētie kodoli pēc tam tika atkārtoti suspendēti PBS, kas satur 0, 02% BSA, un ielādēti Chromium Single Cell 3' mikroshēmā (paredzamā atgūšana 8000 šūnu uz joslu). snRNA-seq bibliotēkas tika sagatavotas, izmantojot Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq bibliotēkas tika sagatavotas, izmantojot Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq bibliotēkas tika sagatavotas, izmantojot Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq bibliotēka tika sagatavota, izmantojot Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Dažādu paraugu bibliotēkas tika apvienotas un sekvencētas, izmantojot Admera Health, izmantojot NovaSeq S4 (Illumina).
Katra iespējamā kodola svītrkoda gēnu ekspresijas līmeņi tika kvantificēti, izmantojot 10x Genomics CellRanger analīzes programmatūras pakotni (6.1.2. versija). Konkrēti, nolasījumi tika salīdzināti ar cilvēka (GRCh38, Ensemble, 98. versija) un žurkas (Rnor_6.0, Ensemble, 100. versija) atsauces genomu kombināciju, kas izveidota ar komandu mkref, un izmantojot count ar komandu –include-introns=TRUE, lai kvantitatīvi noteiktu iekļautos nolasījumus, kas kartēti intronu reģioniem. t-hCO paraugiem cilvēka kodoli tika identificēti, pamatojoties uz konservatīvo prasību, ka vismaz 95% no visiem kartētajiem nolasījumiem atbilst cilvēka genomam. Visas turpmākās analīzes tika veiktas ar filtrētu svītrkodu masīvu, kas izvadīts no CellRanger, izmantojot R pakotni (4.1.2. versija) Seurat (4.1.1. versija)32.
Lai nodrošinātu, ka turpmākajā analīzē tiek iekļauti tikai augstas kvalitātes kodoli, katram paraugam tika ieviests iteratīvs filtrēšanas process. Vispirms tiek identificēti un noņemti zemas kvalitātes kodoli, kuros atrasti mazāk nekā 1000 unikālu gēnu un vairāk nekā 20% no kopējā mitohondriju skaita. Pēc tam neapstrādātā gēnu skaita matrica tika normalizēta ar regularizētu negatīvu binomiālo regresiju, izmantojot sctransform(vst.flavor=”v2”) funkciju, kas arī identificēja 3000 mainīgākos gēnus, izmantojot noklusējuma parametrus. Dimensiju samazināšana tika veikta augšējo mainīgo gēniem, izmantojot galveno komponentu analīzi (PCA) ar noklusējuma parametriem, izmantojot datu kopas dimensiju 30 (dims = 30 tika izvēlēts, pamatojoties uz ceļa locītavu vizuālu pārbaudi, un izmantots visiem paraugiem un ansambļa analīzēm). Pēc tam mēs veicām vairākas iteratīvas klasterizācijas kārtas (izšķirtspēja = 1), lai klasificētu gēnus, pamatojoties uz patoloģiski zemu gēnu skaitu (mediāna zem 10. procentiles), patoloģiski augstu mitohondriju gēnu skaitu (mediāna virs 95. procentiles), lai identificētu un noņemtu iespējamās zemas kvalitātes šūnas. Klasterus un/vai lielu aizdomīgo dvīņu īpatsvaru, kas identificēti, izmantojot DoubletFinder33 paketi (vidējais DoubletFinder rādītājs virs 95. procentiles). t-hCO paraugi (n=3) un hCO paraugi (n=3) tika integrēti atsevišķi, izmantojot IntegrateData funkciju ar iepriekš minētajiem parametriem. Pēc tam vēl viena integrētās datu kopas kvalitatīvās filtrēšanas kārta tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.
Pēc zemas kvalitātes kodolu noņemšanas integrētais datu kopums tika grupēts (izšķirtspēja = 0,5) un iegults UMAP34 vizualizācijas nolūkos. Katra klastera marķieru gēni tika noteikti, izmantojot FindMarkers funkciju ar noklusējuma parametriem, kas aprēķināti no normalizētiem gēnu ekspresijas datiem. Mēs identificējam un klasificējam galvenās šūnu klases, apvienojot augļa un pieaugušo kortikālo atsauces datu kopas ar marķieru gēnu ekspresiju 19,20,21,35 un anotāciju. Jo īpaši cirkulējošie prekursori tika identificēti pēc MKI67 un TOP2A ekspresijas. Progenitoru klasteri tika definēti pēc mitotisko transkriptu neesamības, augstas pārklāšanās ar multipotentām gliālu progenitoru klasteriem, kas aprakstīti vēlīnā metafāzes augļa garozā, un EGFR un OLIG1 ekspresijas. Mēs lietojam terminu "astrocīts", lai aptvertu vairākus astrocītu diferenciācijas stāvokļus, sākot no vēlīnās radiālās glijas līdz astrocītu nobriešanai. Astrocītu klasteri ekspresē augstu SLC1A3 un AQP4 līmeni, un ir pierādīts, ka tie sakrīt ar augļa radiālās glijas un/vai pieaugušo astrocītu apakštipiem. OPC ekspresē PDGFRA un SOX10, savukārt oligodendrocīti ekspresē mielinizācijas marķierus (MOG un MYRF). Glutamaterģiskie neironi tika identificēti pēc neironu transkriptu klātbūtnes (SYT1 un SNAP25), GABAerģisko marķieru neesamības (GAD2) un NEUROD6, SLC17A7, BCL11B vai SATB2 ekspresijas. GluN neironi tika tālāk iedalīti augšējās (SATB2 ekspresija un BCL11B zudums) un dziļajās (BCL11B ekspresija) apakšklasēs. Iespējamās apakšplāksnes (SP) neironi papildus dziļajiem GluN marķieriem ekspresē zināmus SP18 marķierus, piemēram, ST18 un SORCS1. Dziļdzīslenes pinumam līdzīgās šūnas tika identificētas pēc TTR ekspresijas, un meningeālam līdzīgās šūnas ekspresēja ar fibroblastiem saistītus gēnus un kartēja pial/vaskulārās šūnas atsauces datu kopā.
Gēnu ekspresijas diferenciālā analīze starp t-hCO3 un hCO3 apakšklasēm tika veikta, izmantojot jaunizstrādātu pseidopartijas metodi, kas reproducēta paraugos, kas ieviesti, izmantojot Libra R pakotni (1.0.0 versija). Konkrēti, edgeR log-ticamības testi (3.36.0 versija, R pakotne) tika veikti grupām, summējot gēnu skaitu šūnās dotajai šūnu klasei katrā parauga replikācijā. Karstuma kartes vizualizācijai normalizētās uz miljonu (CPM) vērtības tiek aprēķinātas, izmantojot edgeR (cpm() funkcija), un mērogotas (lai sasniegtu vidējo vērtību = 0, standartnovirzi = 1). Tika veikta gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīze ievērojami augšupregulētiem t-hCO3 GluN gēniem (Benjamini-Hochberg koriģētā P vērtība mazāka par 0,05, kas ekspresēta vismaz 10% t-hCO3 GluN šūnu, un izmaiņas palielināšanās vismaz 2 reizes), kas tika veikta, izmantojot ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Mēs izmantojam ToppFun lietotni ar noklusējuma parametriem un ziņojam par Benjamini-Hohberga koriģētām P vērtībām, kas aprēķinātas no GO anotētiem hiperģeometriskiem testiem.
Lai saskaņotu mūsu snRNS sekvencēšanas klasterus ar anotētiem šūnu klasteriem no primāro vienas šūnas RNS sekvencēšanas vai pieaugušo snRNS sekvencēšanas atsauces pētījumiem19,20,21,22, mēs izmantojām pāru datu kopu integrācijas pieeju. Mēs izmantojām Seurat normalizācijas darbplūsmu SCTransform (v2), lai integrētu un salīdzinātu klasteru pārklāšanos starp datu kopām (izmantojot tos pašus parametrus kā iepriekš). Atsevišķas datu kopas tika nejauši sadalītas apakškopās līdz 500 šūnām vai kodoliem katrā sākotnējā klasterī, lai nodrošinātu skaitļošanas efektivitāti. Izmantojot līdzīgu pieeju, kā aprakstīts iepriekš, klasteru pārklāšanās tika definēta kā šūnu vai kodolu īpatsvars katrā apvienotajā klasterī, kas pārklājās ar atsauces klastera etiķeti. Lai sīkāk klasificētu GluN, mēs izmantojām Seurat TransferData darbplūsmu GluN apakškopu datiem, lai piešķirtu atsauces datu kopu etiķetes mūsu GluN šūnām.
Lai novērtētu t-hCO3 un hCO3 paraugu globālā transkriptoma nobriešanas statusu, mēs salīdzinājām mūsu pseido-kopapjoma paraugus ar BrainSpan/psychENCODE23, kas sastāv no lielas RNS sekvences, kas aptver cilvēka smadzeņu attīstību. Mēs veicām PCA kombinētai, pēc modeļa normalizētai gēnu ekspresijas matricai no kortikālajiem paraugiem 10 nedēļas pēc ieņemšanas un vēlāk 5567 gēnos (kopā ar mūsu datiem), kas iepriekš tika identificēti kā aktīvi BrainSpan kortikālajos paraugos (definēti kā vairāk nekā 50% attīstības dispersijas, kas izskaidrojama ar vecumu, izmantojot kubisko modeli)38. Turklāt mēs ieguvām gēnus, kas saistīti ar galvenajiem neiroattīstības transkriptoma parakstiem, izmantojot nenegatīvu matricas faktorizāciju, kā aprakstīts iepriekš. Paraugu svari, kas aprēķināti, izmantojot nenegatīvas matricas faktorizācijas procedūru, ir attēloti 5.b attēlā ar paplašinātiem datiem katram no pieciem parakstiem, ko aprakstījuši Zhu et al.38. Atkal aktivitātes atkarīgie transkripcijas marķieri tika iegūti no iepriekš publicētiem pētījumiem. Jo īpaši ERG un LRG bija ievērojami paaugstināti glutamāterģiskajos neironos, kas tika identificēti ar peles redzes garozas snRNS-seq kolekciju pēc vizuālās stimulācijas no 3. papildtabulas Hrvatin et al.16. Ar cilvēkiem bagātināti LRG tika iegūti no KCl aktivētām cilvēka augļa smadzeņu kultūrām un savākti 6 stundas pēc stimulācijas, un filtrētie gēni bija ievērojami paaugstināti cilvēkiem, bet ne grauzējiem (4. papildtabula). Gēnu kopu bagātināšanas analīze, izmantojot šos gēnu kopumus, tika veikta, izmantojot vienvirziena Fišera precīzo testu.
Žurkām anestēt ar izoflurānu, izņemt smadzenes un ievietot aukstā (aptuveni 4°C) ar skābekli piesātinātā (95% O2 un 5% CO2) saharozes šķīdumā griezumiem, kas satur: 234 mM saharozi, 11 mM glikozi, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 un 0,5 mM CaCl2 (aptuveni 310 mOsm). Žurku smadzeņu koronālie griezumi (300–400 µm), kas satur t-hCO3, tika izgatavoti, izmantojot Leica VT1200 vibratomu, kā aprakstīts iepriekš39. Pēc tam griezumi tika pārvietoti uz griezumu kameru ar nepārtrauktu istabas temperatūras skābekli, kas saturēja aCSF, kas sagatavots no: 10 mM glikozes, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 un 126 mM NaCl (298 mOsm). vismaz 45 minūtes pirms reģistrēšanas. Sekcijas tika reģistrētas iegremdētā kamerā, kur tās nepārtraukti perfuzēja ar aCSF (95% O2 un 5% CO2 flakons). Visi dati tika reģistrēti istabas temperatūrā. t-hCO neironi tika pārtraukti ar borsilikāta stikla pipeti, kas piepildīta ar šķīdumu, kas satur 127 mM kālija glikonātu, 8 mM NaCl, 4 mM magnija ATP, 0,3 mM nātrija GTP, 10 mM HEPES un 0,6 mM EGTA, pH 7,2, iekšējais šķīdums, pielāgots KOH (290 mOsm). Lai atgūtu, reģistrēšanas šķīdumam tika pievienots biocitīns (0,2%).
Dati tika iegūti, izmantojot MultiClamp 700B pastiprinātāju (Molecular Devices) un Digidata 1550B digitalizētāju (Molecular Devices), zemfrekvences filtrēšanu ar frekvenci 2 kHz, digitalizēšanu ar frekvenci 20 kHz un analīzi, izmantojot Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) un pielāgotas MATLAB funkcijas (Mathworks). Pārejas potenciāls tika aprēķināts, izmantojot JPCalc, un ieraksti tika pielāgoti aprēķinātajai vērtībai -14 mV. IV operācija sastāv no virknes strāvas soļu ar 10–25 pA soļiem, no -250 līdz 750 pA.
Kā aprakstīts iepriekš, talamokortikālos griezumos, veicot hCO neironu reģistrēšanu ar plāksteru skavām, tika elektriski stimulēti talamokortikālie fragmenti. Īsumā, smadzenes tika novietotas uz 3D drukas galda, kas bija sasvērts 10° leņķī, un smadzeņu priekšējā daļa tika sagriezta 35° leņķī. Pēc tam smadzenes tika pielīmētas pie griezuma virsmas un sagrieztas, saglabājot talamokortikālos izvirzītos aksonus. Bipolāri volframa elektrodi (0,5 MΩ) tika uzstādīti uz otrā mikromanipulatora un stratēģiski novietoti, lai stimulētu četrus reģionus katrā šūnā (iekšējā kapsula, baltā viela, S1 un hCO). Reģistrējiet sinaptiskās atbildes pēc 300 µA fāziskās stimulācijas ar frekvenci 0,03–0,1 Hz.
hChR2 ekspresējošie hCO neironi tika aktivizēti pie 480 nm, un gaismas impulsi, ko ģenerēja LED (Prizmatix), tika pielietoti caur ×40 objektīvu (0,9 NA; Olympus), lai reģistrētu hChR2 ekspresiju šūnu tuvumā. Apgaismotā lauka diametrs ir aptuveni 0,5 mm, un kopējā jauda ir 10–20 mW. Impulsa platums tika iestatīts uz 10 ms, kas atbilst impulsam, kas tika dots uzvedības mācīšanās eksperimenta laikā. Tika izmantotas dažādas stimulācijas frekvences no 1 līdz 20 Hz, bet kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots tikai pirmais sērijas impulss. Intervāli starp impulsu sērijām parasti ir garāki par 30 s, lai samazinātu ietekmi uz sinaptiskajiem inhibējošajiem vai veicinošajiem ceļiem. Lai pārbaudītu, vai hChR2 atbilde bija monosinaptiska, vannai pievienojām TTX (1 μM), līdz EPSC reakcija pazuda, un pēc tam pievienojām 4-aminopiridīnu (4-AP; 100 μM). Parasti atbilde tiek atgriezta dažu minūšu laikā, ar nedaudz ilgāku aizkavēšanos starp LED ieslēgšanos un EPSC ģenerēšanu. Lai pārbaudītu, vai reakciju virza AMPA receptori, tika izmantots NBQX (10 μM).
Asas hCO3 sekcijas tika izveidotas, kā aprakstīts iepriekš. Īsumā, hCO3 sekcijas tika iestrādātas 4% agarozē un pārvietotas uz šūnām, kas saturēja 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 un 10 mM d-(+)-glikozi. Sekcijas tika sagrieztas 200–300 µm biezumā istabas temperatūrā, izmantojot Leica VT1200 vibratoru, un uzglabātas ASF istabas temperatūrā. Pēc tam hCO3 sekcijās, izmantojot tiešu SliceScope mikroskopu (Scientifica), tika veikta veselu šūnu patch-camp reģistrācija. Sekcijas tika perfūzētas ar aCSF (95% O2 un 5% CO2), un šūnu signāli tika reģistrēti istabas temperatūrā. hCO neironi tika uzklāti, izmantojot borsilikāta stikla pipeti, kas piepildīta ar šķīdumu, kas satur 127 mM kālija glikonātu, 8 mM NaCl, 4 mM magnija ATP, 0,3 mM nātrija GTP, 10 mM HEPES un 0,6 mM EGTA, iekšējais pH 7, 2, noregulēts ar KOH (osmolaritāte 290). Atgūšanas nolūkos iekšējam šķīdumam pievieno 0,2% biocitīna.
Dati tika iegūti ar Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices), izmantojot MultiClamp 700B pastiprinātāju (Molecular Devices) un Digidata 1550B digitalizētāju (Molecular Devices), zemfrekvences filtrēšana tika veikta ar 2 kHz frekvenci, digitalizēti ar 20 kHz frekvenci un analizēti, izmantojot Clampfit (10.6. versija) analīzei (molekulārajām ierīcēm) un pielāgotas MATLAB funkcijas (MATLAB 2019b, Mathworks). Pārejas potenciāls tika aprēķināts, izmantojot JPCalc, un ieraksti tika pielāgoti aprēķinātajam pārejas potenciālam -14 mV. IV operācija sastāv no virknes strāvas soļu ar 5-10 pA soļiem no -50 līdz 250 pA.
Saspiestu neironu morfoloģiskai rekonstrukcijai iekšējam šķīdumam pievienoja 0,2 % biocitīna (Sigma-Aldrich). Pēc uzlaušanas šūnas tiek sagatavotas vismaz 15 minūtes. Pēc tam pipeti lēnām ievelk 1–2 minūtes, līdz reģistrētā membrāna ir pilnībā noslēgta. Pēc griezuma fizioloģiskās procedūras griezumi tika fiksēti nakti 4 °C temperatūrā 4 % PFA, mazgāti ar PBS X3 un atšķaidīti 1:1000 ar streptavidīnam konjugētu DyLight 549 vai DyLight 405 (Vector Labs). Ar biocitīnu (2 %; Sigma-Aldrich) piepildītās šūnas tika marķētas plāksteru skavas ierakstīšanas laikā istabas temperatūrā 2 stundas. Pēc tam griezumi tika uzmontēti uz mikroskopijas stikliņiem, izmantojot Aquamount (Thermo Scientific), un nākamajā dienā vizualizēti Leica TCS SP8 konfokālajā mikroskopā, izmantojot eļļas imersijas objektīvu ar skaitlisko apertūru ×40 1,3, palielinājumu ×0,9–1,0, xy. Paraugu ņemšanas ātrums ir aptuveni 7 pikseļi uz mikronu. Z-kaudzītes ar 1 µm intervālu tika iegūtas sērijveidā, un katra neirona visa dendritiskā koka aptveršanai tika veiktas z-kaudzītes mozaīkas un Leica automātiskā sašūšana. Pēc tam neironi tika izsekoti pusmanuāli, izmantojot neuTube 40 saskarni, un tika ģenerēti SWC faili. Pēc tam faili tika augšupielādēti SimpleNeuriteTracer41 Fiji spraudnī (ImageJ, 2.1.0 versija; NIH).
Cilvēka kortikālie audi tika iegūti ar informētu piekrišanu saskaņā ar Stenfordas Universitātes Institucionālās pārskata padomes apstiprinātu protokolu. Divi cilvēka pēcdzemdību audu paraugi (3 un 18 gadus veci) tika iegūti, veicot frontālās garozas (vidējā frontālās girusa) rezekciju kā daļu no operācijas refraktāras epilepsijas ārstēšanai. Pēc rezekcijas audi tika savākti ledusaukstā NMDG-aCSF, kas satur: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glikozi, 2 mM tiourīnvielu, 5 mM nātrija askorbātu, 3 mM nātrija piruvātu, 0,5 mM CaCl2 4H2O un 10 mM MgSO4 7H2O. Titrēja līdz pH 7,3-7,4 ar koncentrētu sālsskābi. Audi tika nogādāti laboratorijā 30 minūšu laikā, un koronālie griezumi tika ņemti saskaņā ar iepriekš aprakstīto procedūru.
Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar Stenfordas Universitātes APLAC apstiprinātajām dzīvnieku aprūpes vadlīnijām. Žurkām (vairāk nekā 140 dienas pēc transplantācijas) tika veikta 5% izoflurāna anestēzija un operācijas laikā tās tika anestēzētas ar 1-3% izoflurāna. Dzīvnieki tika ievietoti stereotaksiskā rāmī (Kopf) un subkutāni injicēja ilgstošas ​​darbības buprenorfīnu (SR). Galvaskauss tika atsegts, notīrīts un ievietotas 3-5 kaulu skrūves. Lai mērķētu uz t-hCO2, mēs ģenerējām stereotaksiskās koordinātas no MRI attēliem. Interesējošajā vietā tika izurbts urbums, un šķiedras (400 µm diametrs, NA 0,48, Doric) tika pazeminātas 100 µm zem hCO2 virsmas un piestiprinātas pie galvaskausa ar UV starojumā cietējošu zobu cementu (Relyx).
Šķiedru fotometriskie ieraksti tika veikti, kā aprakstīts iepriekš42. Lai reģistrētu spontāno aktivitāti, žurkas tika ievietotas tīrā būrī, un implantētajam optiskajam kabelim tika pievienots 400 µm diametra optiskās šķiedras plākstera kabelis (Doric), kas savienots ar optiskās šķiedras fotometrisko datu ieguves sistēmu. 10 minūšu motorās aktivitātes ierakstīšanas laikā dzīvnieki varēja brīvi izpētīt būri. Lai reģistrētu izraisīto aktivitāti, žurkas (vairāk nekā 140 dienas pēc transplantācijas) tika anestēzētas ar 5% izoflurānu indukcijai un 1-3% izoflurānu uzturēšanai. Dzīvnieks tiek ievietots stereotaktiskajā rāmī (Kopf), un ūsas t-hCO3 pretējā pusē tiek apgrieztas līdz aptuveni 2 cm garumam un izvadītas caur sietu, kas savienots ar pjezoelektrisko aktuatoru (PI). 400 µm optiskās šķiedras plākstera kabelis (Doric) tika pievienots implantētajai šķiedrai un savienots ar datu ieguves sistēmu. Pēc tam t-hCO pretējā pusē esošās ūsas 20 minūšu ierakstīšanas periodā tika novirzītas 50 reizes (2 mm pie 20 Hz, 2 s katrā prezentācijas reizē) nejaušos laikos, izmantojot pjezoelektrisko piedziņu. Izmantojiet Arduino MATLAB atbalsta paketi, lai kontrolētu novirzes laiku ar pielāgotu MATLAB kodu. Notikumi tiek sinhronizēti ar datu ieguves programmatūru, izmantojot tranzistora-tranzistora loģikas (TTL) impulsus.
Žurkām (vairāk nekā 140 dienas pēc transplantācijas) tika veikta 5% izoflurāna anestēzija un intraoperatīvi anestēzija ar 1-3% izoflurāna. Dzīvnieki tika ievietoti stereotaksiskā rāmī (Kopf), un subkutāni tika injicēts buprenorfīns SR un deksametazons. Galvaskauss tika atsegts, notīrīts un ievietotas 3-5 kaulu skrūves. Lai mērķētu uz t-hCO2, mēs ģenerējām stereotaksiskās koordinātas no MRI attēliem. Tieši virs transplantētās hCO2 tika veikta apļveida kraniotomija (aptuveni 1 cm diametrā) ar ātrgaitas urbi. Kad kauls ir pēc iespējas plānāks, bet pirms visa kaula urbšanas, ar pinceti tika noņemts atlikušais neskartais iegurņa disks, lai atsegtu zem tā esošo t-hCO2. Kraniotomija tika piepildīta ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, un galvaskausam ar UV starojumā cietējošu zobu cementu (Relyx) tika piestiprināts pārklājums un speciāla galvas tapa.
Divu fotonu attēlveidošana tika veikta, izmantojot Bruker daudzfotonu mikroskopu ar Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektīvu. GCaMP6 attēlveidošana tika veikta pie 920 nm ar 1,4x vienas z plaknes palielinājumu un 8x vidēji 7,5 kadri sekundē. Žurkām tika ierosināta anestēzija ar 5% izoflurāna anestēziju un uzturēta ar 1-3% izoflurāna. Žurkas tika ievietotas speciāli izgatavotā galvas stiprinājumā un novietotas zem lēcas. Tika iegūts 3 minūšu fona motorās aktivitātes ieraksts. 20 ierakstīšanas minūšu laikā, izmantojot pikospriceru, uz ūsu spilventiņa pretējā pusē t-hCO3 tika nejauši piegādātas 50 ieelpas (katra prezentācija 100 ms gara). Izmantojiet Arduino MATLAB atbalsta paketi, lai kontrolētu impulsu laiku ar pielāgotu MATLAB kodu. Sinhronizējiet notikumus ar datu ieguves programmatūru (PrairieView 5.5), izmantojot TTL impulsus. Analīzei attēli tika koriģēti atbilstoši xy kustībai, izmantojot afīno korekciju MoCo programmā, kas tika palaista Fidži. Fluorescences pēdu ekstrakcija no atsevišķām šūnām, izmantojot CNMF-E43. Fluorescence tika ekstrahēta katram interesējošajam reģionam, konvertēta uz dF/F līknēm un pēc tam konvertēta uz z-rādītājiem.
Žurkām (vairāk nekā 140 dienas pēc transplantācijas) tika veikta 5% izoflurāna anestēzija un intraoperatīvi anestēzija ar 1-3% izoflurāna. Dzīvnieki tika ievietoti stereotaksiskā rāmī (Kopf), un subkutāni tika injicēts buprenorfīns SR un deksametazons. Ūsas t-hCO pretējā pusē tika nogrieztas apmēram 2 cm garumā un izvērstas caur sietu, kas savienots ar pjezoelektrisko aktuatoru. Galvaskauss tika atsegts un notīrīts. Pie galvaskausa tika piestiprināta nerūsējošā tērauda zemējuma skrūve. Lai mērķētu uz t-hCO, mēs ģenerējām stereotaksiskās koordinātas no MRI attēliem. Veiciet apļveida kraniotomiju (aptuveni 1 cm diametrā) ar ātrgaitas urbi tieši virs t-hCO. Kad kauls ir pēc iespējas plānāks, bet pirms visa kaula urbšanas, izmantojiet knaibles, lai noņemtu atlikušo neskarto iegurņa disku, lai atklātu zem tā esošo t-hCO. Atsevišķas šūnas tika reģistrētas, izmantojot 32 kanālu vai 64 kanālu augsta blīvuma silīcija zondes (Cambridge Neurotech), kas iezemētas ar zemējuma skrūvēm un iepriekš pastiprinātas ar RHD pastiprinātājiem (Intan). Izmantojiet manipulatoru, lai nolaistu elektrodus mērķa vietā caur kraniotomiju, kas ir piepildīta ar sterilu fizioloģisko šķīdumu. Datu vākšana tika veikta 30 kHz frekvencē, izmantojot Open Ephys datu ieguves sistēmu. Ierakstīšana turpinājās tikai tad, kad mēs konstatējām ļoti korelētu ritmisku spontānu aktivitāti vairāk nekā 10 kanālos, kas liecina, ka elektrodi atradās transplantātā (pamatojoties uz divu fotonu kalcija attēlveidošanas datiem). Tika iegūts 10 minūšu fona ieraksts par motoro aktivitāti. Pēc tam ūsas t-hCO3 pretējā pusē tika novirzītas 50 reizes (2 mm pie 20 Hz, 2 s katrā prezentācijā) nejaušos laikos ar pjezoelektrisko piedziņu 20 minūšu ierakstīšanas periodā. Izmantojot MATLAB atbalsta paketi Arduino (MATLAB 2019b), kontrolējiet novirzes laiku ar pielāgotu MATLAB kodu. Izmantojiet TTL impulsus, lai sinhronizētu notikumus ar datu ieguves programmatūru.
Optiskās marķēšanas eksperimentiem 200 µm optiskais savienojuma vads (Doric), kas savienots ar 473 nm lāzeru (Omicron), tika savienots ar 200 µm optisko šķiedru, kas novietota virs kraniotomijas. Tieši pirms tam noregulējiet tilta jaudu uz 20 mW. Izmantojiet manipulatoru, lai nolaistu elektrodus mērķa vietā caur kraniotomiju, kas ir piepildīta ar sterilu fizioloģisko šķīdumu. Ierakstīšanas sākumā tika izstaroti desmit gaismas impulsi ar 473 nm frekvenci (frekvence 2 Hz, impulsa ilgums 10 ms). Fotosensitīvas šūnas tika definētas kā šūnas, kurām 70% vai vairāk izmēģinājumu 10 ms laikā bija novērojama smailes reakcija.