Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്. മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, അപ്ഡേറ്റ് ചെയ്ത ഒരു ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). കൂടാതെ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലുകളും ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റും ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളുടെ ഒരു കറൗസൽ ഒരേസമയം പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു. ഒരേ സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ മുമ്പത്തേതും അടുത്തതും ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ ഒരേ സമയം മൂന്ന് സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ അവസാനത്തിലുള്ള സ്ലൈഡർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.
സ്വയം കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്ന ന്യൂറൽ ഓർഗനില്ലുകൾ മനുഷ്യ വികാസത്തെയും രോഗത്തെയും മാതൃകയാക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു വാഗ്ദാനമായ ഇൻ വിട്രോ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമാണ്. എന്നിരുന്നാലും, ഓർഗനോയിഡുകൾക്ക് ഇൻ വിവോയിൽ നിലനിൽക്കുന്ന കണക്റ്റിവിറ്റി ഇല്ല, ഇത് പക്വതയെ പരിമിതപ്പെടുത്തുകയും പെരുമാറ്റത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന മറ്റ് സർക്യൂട്ടുകളുമായുള്ള സംയോജനത്തെ തടയുകയും ചെയ്യുന്നു. നവജാത ശിശുക്കളുടെ നഗ്ന എലികളുടെ സോമാറ്റോസെൻസറി കോർട്ടക്സിലേക്ക് പറിച്ചുനടപ്പെടുന്ന മനുഷ്യ സ്റ്റെം സെൽ-ഉത്ഭവിച്ച കോർട്ടിക്കൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ സെൻസറി, പ്രചോദനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സർക്യൂട്ടുകളിലേക്ക് സംയോജിക്കുന്ന പക്വമായ കോശ തരങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഇവിടെ ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. നിരവധി സ്റ്റെം സെൽ ലൈനുകളിലും മൃഗങ്ങളിലും ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ഓർഗനോയിഡ് വളർച്ച MRI വെളിപ്പെടുത്തി, അതേസമയം സിംഗിൾ-കോർ വിശകലനം കോർട്ടിക്കോജെനിസിസിന്റെ പുരോഗതിയും പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഒരു ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രോഗ്രാമിന്റെ ആവിർഭാവവും വെളിപ്പെടുത്തി. വാസ്തവത്തിൽ, ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത കോർട്ടിക്കൽ ന്യൂറോണുകൾ അവയുടെ ഇൻ വിട്രോ എതിരാളികളേക്കാൾ സങ്കീർണ്ണമായ രൂപാന്തര, സിനാപ്റ്റിക്, ആന്തരിക മെംബ്രൺ ഗുണങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് തിമോത്തിയുടെ സിൻഡ്രോം ഉള്ള രോഗികളിൽ ന്യൂറോണൽ വൈകല്യങ്ങൾ കണ്ടെത്താൻ അനുവദിക്കുന്നു. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത ഓർഗനില്ലുകൾക്ക് തലമോകോർട്ടിക്കൽ, കോർട്ടിക്കോകോർട്ടിക്കൽ ഇൻപുട്ടുകൾ ലഭിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ശരീരഘടനയും പ്രവർത്തനപരവുമായ ട്രെയ്‌സിംഗ് തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ന്യൂറൽ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ഇൻ വിവോ റെക്കോർഡിംഗുകൾ ഈ ഇൻപുട്ടുകൾ മനുഷ്യകോശങ്ങളിൽ സെൻസറി പ്രതികരണങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. അവസാനമായി, കോർട്ടിക്കൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ എലിയുടെ തലച്ചോറിലുടനീളം ആക്സോണുകൾ വ്യാപിപ്പിക്കുന്നു, അവയുടെ ഒപ്റ്റോജെനെറ്റിക് സജീവമാക്കൽ പ്രതിഫലം തേടുന്ന സ്വഭാവത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. അങ്ങനെ, പറിച്ചുനട്ട മനുഷ്യ കോർട്ടെക്സ് ന്യൂറോണുകൾ പക്വത പ്രാപിക്കുകയും സ്വഭാവത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഹോസ്റ്റിന്റെ സർക്യൂട്ടുകളിൽ പങ്കെടുക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. മറ്റ് മാർഗ്ഗങ്ങളിലൂടെ കണ്ടെത്താൻ കഴിയാത്ത, രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉത്ഭവിച്ച കോശങ്ങളിലെ സ്ട്രാൻഡ്-ലെവൽ ഫിനോടൈപ്പുകളുടെ കണ്ടെത്തൽ സുഗമമാക്കുന്നതിന് ഈ സമീപനം സഹായിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
വികസ്വര മനുഷ്യ മസ്തിഷ്കം ഒരു ശ്രദ്ധേയമായ സ്വയം-സംഘടിപ്പിക്കുന്ന പ്രക്രിയയാണ്, അതിൽ കോശങ്ങൾ പെരുകുകയും, വ്യത്യാസപ്പെടുത്തുകയും, കുടിയേറുകയും, സംവേദനാത്മക അനുഭവത്തിലൂടെ കൂടുതൽ പരിഷ്കരിക്കപ്പെടുന്ന പ്രവർത്തനപരമായ ന്യൂറോണൽ സർക്യൂട്ടുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. മനുഷ്യ മസ്തിഷ്ക വികസനം മനസ്സിലാക്കുന്നതിലെ ഒരു പ്രധാന പ്രശ്നം, പ്രത്യേകിച്ച് രോഗത്തിന്റെ പശ്ചാത്തലത്തിൽ, മസ്തിഷ്ക കലകളിലേക്കുള്ള പ്രവേശനത്തിന്റെ അഭാവമാണ്. ഹ്യൂമൻ കോർട്ടെക്സ് ഓർഗനോയിഡുകൾ (hCO; ഹ്യൂമൻ കോർട്ടെക്സ് സ്ഫിയർ എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു) ഉൾപ്പെടെയുള്ള സ്വയം-സംഘടിപ്പിക്കുന്ന അവയവങ്ങൾക്ക് 2,3,4,5,6 ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. എന്നിരുന്നാലും, നിരവധി പരിമിതികൾ ന്യൂറൽ സർക്യൂട്ടുകളുടെ വികാസവും പ്രവർത്തനവും മനസ്സിലാക്കുന്നതിന് അവയുടെ വിശാലമായ പ്രയോഗത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു. പ്രത്യേകിച്ചും, വിവോയിൽ നിലവിലുള്ള ചില സൂക്ഷ്മ പരിസ്ഥിതി, സെൻസറി ഇൻപുട്ടുകളുടെ അഭാവം മൂലം hCO പക്വത പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നുണ്ടോ എന്ന് വ്യക്തമല്ല. കൂടാതെ, പെരുമാറ്റ ഫലങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിയുന്ന സർക്യൂട്ടുകളിൽ hCO-കൾ സംയോജിപ്പിച്ചിട്ടില്ലാത്തതിനാൽ, ജനിതകമായി സങ്കീർണ്ണവും പെരുമാറ്റപരവുമായ ന്യൂറോ സൈക്യാട്രിക് ഡിസോർഡറുകൾ മോഡലിംഗ് ചെയ്യുന്നതിൽ അവയുടെ ഉപയോഗം നിലവിൽ പരിമിതമാണ്.
ഒരു കേടുകൂടാത്ത ജീവനുള്ള തലച്ചോറിലേക്ക് hCO ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്യുന്നത് ഈ പരിമിതികളെ മറികടക്കും. എലി കോർട്ടക്സിലേക്ക് ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത മനുഷ്യ ന്യൂറോണുകൾക്ക് അതിജീവിക്കാനും പ്രൊജക്റ്റ് ചെയ്യാനും എലി കോശങ്ങളുമായി ആശയവിനിമയം നടത്താനും കഴിയുമെന്ന് മുൻ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്7,8,9,10,11,12. എന്നിരുന്നാലും, ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ സാധാരണയായി മുതിർന്ന മൃഗങ്ങളിലാണ് നടത്തുന്നത്, ഇത് സിനാപ്റ്റിക്, ആക്സോണൽ സംയോജനത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തിയേക്കാം. പ്ലാസ്റ്റിക് വികസനത്തിന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ രോഗപ്രതിരോധശേഷി കുറഞ്ഞ എലികളുടെ പ്രാഥമിക സോമാറ്റോസെൻസറി കോർട്ടെക്സിലേക്ക് (S1) ഹൈപിഎസ് കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ 3D hCO ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത ഒരു ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷൻ മാതൃകയെ ഞങ്ങൾ ഇവിടെ വിവരിക്കുന്നു. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത hCO (t-hCO) ന്യൂറോണുകൾ ഗണ്യമായ പക്വതയ്ക്ക് വിധേയമാകുന്നു, സെൻസറി പ്രതികരണങ്ങൾ ഉളവാക്കുന്ന തലമോകോർട്ടിക്കൽ, കോർട്ടിക്കൽ-കോർട്ടിക്കൽ ഇൻപുട്ടുകൾ സ്വീകരിക്കുന്നു, പ്രതിഫലം തേടുന്ന സ്വഭാവം നയിക്കാൻ എലി തലച്ചോറിലേക്ക് ആക്സോണൽ പ്രൊജക്ഷനുകൾ വ്യാപിപ്പിക്കുന്നു. വോൾട്ടേജ്-സെൻസിറ്റീവ് എൽ-ടൈപ്പ് CaV1.2 കാൽസ്യം ചാനലിലെ (CACNA1C എൻകോഡ് ചെയ്തിരിക്കുന്നത്) മ്യൂട്ടേഷനുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഗുരുതരമായ ജനിതക വൈകല്യമായ തിമോത്തി സിൻഡ്രോം (TS) ഉള്ള രോഗികളിൽ t-hCO യുടെ വിപുലീകൃത പക്വത ന്യൂറോണൽ വൈകല്യങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.
ഇൻ വിവോ സർക്യൂട്ടുകളിലെ മനുഷ്യ കോർട്ടിക്കൽ ന്യൂറോണുകളെ പഠിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക്കലി 3D hCO യെ പ്രസവാനന്തരമുള്ള ആദ്യകാല അതിമിക് എലികളുടെ S1 ലേക്ക് (പ്രസവാനന്തരം 3-7 ദിവസങ്ങൾ) ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്തു (ചിത്രം 1a ഉം ചിത്രം 1a-c യുടെ വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റയും). ഈ ഘട്ടത്തിൽ, തലമോകോർട്ടിക്കൽ, കോർട്ടിക്കോകോർട്ടിക്കൽ ആക്സോണൽ പ്രൊജക്ഷനുകൾ ഇതുവരെ അവയുടെ S1 ഇന്നർവേഷൻ പൂർത്തിയാക്കിയിട്ടില്ല (റഫ്. 13). അതിനാൽ, എൻഡോജെനസ് സർക്യൂട്ടുകളിലെ ആഘാതം കുറയ്ക്കുന്നതിനൊപ്പം t-hCO സംയോജനം പരമാവധിയാക്കുന്നതിനാണ് ഈ സമീപനം രൂപകൽപ്പന ചെയ്തിരിക്കുന്നത്. ജീവനുള്ള മൃഗങ്ങളിൽ t-hCO യുടെ സ്ഥാനം ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന്, ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് 2-3 മാസത്തിനുശേഷം ഞങ്ങൾ എലികളുടെ T2-വെയ്റ്റഡ് MRI ബ്രെയിൻ പുനർനിർമ്മാണങ്ങൾ നടത്തി (ചിത്രം 1b ഉം വിപുലീകൃത ഡാറ്റയും, ചിത്രം 1d). t-hCO എളുപ്പത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ t-hCO യുടെ വ്യാപ്ത അളവുകൾ നിശ്ചിത സ്ലൈസുകളിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കിയതിന് സമാനമായിരുന്നു (വിപുലീകൃത ഡാറ്റ ചിത്രം 1d,e; P > 0.05). t-hCO എളുപ്പത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ t-hCO യുടെ വ്യാപ്ത അളവുകൾ നിശ്ചിത സ്ലൈസുകളിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കിയതിന് സമാനമായിരുന്നു (വിപുലീകൃത ഡാറ്റ ചിത്രം 1d,e; P > 0.05). t-hCO ലെഗ്കോ നബ്ല്യൂഡലിസ്, ഒരു ഒബ്ъഎമ്ന്ыഎ ഇസ്മെരെനിയ ടി-എച്ച്സിഒ ബ്ыലി അനലൊഗിച്ന്ы രസ്ഛ്യ്തന്ыമ് ദില്യ ഫ്രെംസ്യ്രൊവന്ы данные, рис 1d, e; 0,05). t-hCO എളുപ്പത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, കൂടാതെ വോള്യൂമെട്രിക് t-hCO അളവുകൾ നിശ്ചിത വിഭാഗങ്ങൾക്കായി കണക്കാക്കിയതിന് സമാനമായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO 的 体积测量值与从固定切片计算 的 测量值相似 (扩展数据图 1D, E; p> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO ലെഗ്കോ നബ്ല്യൂഡൽസ്യ, ഒരു ഒബ്ъഎമ്ന്ыഎ ഇസ്മെരെനിയ ടി-എച്ച്സിഒ ബ്ыലി അനലൊഗിച്ന്ы രസ്ഛ്യ്തന്ыമ്യ് ദ്ല്യ്തെല്ന്ыമ്യ് (വിവരങ്ങൾ) данные, рис 1d, e; 0,05). t-hCO എളുപ്പത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു, കൂടാതെ വോള്യൂമെട്രിക് t-hCO അളവുകൾ നിശ്ചിത വിഭാഗങ്ങൾക്കായി കണക്കാക്കിയതിന് സമാനമായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 1d, e; P > 0.05).ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് ഏകദേശം 2 മാസത്തിനുശേഷം പറിച്ചുനട്ട മൃഗങ്ങളിൽ 81% എണ്ണത്തിലും ഞങ്ങൾ t-hCO നിർണ്ണയിച്ചു (n = 72 മൃഗങ്ങൾ; 10 hiPS സെൽ ലൈനുകളിൽ നിന്നുള്ള hCO; സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 1 ലെ hiPS സെൽ ലൈനുകൾ). ഇതിൽ 87% എണ്ണവും സെറിബ്രൽ കോർട്ടെക്സിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് (ചിത്രം 1c). ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത ഒരേ എലിയിൽ ഒന്നിലധികം സമയ പോയിന്റുകളിൽ സീരിയൽ MRI സ്കാനുകൾ നടത്തിയതിലൂടെ, 3 മാസത്തിനുള്ളിൽ t-hCO വോളിയത്തിൽ ഒമ്പത് മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1d ഉം വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 1f ഉം). ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷനുശേഷം 12 മാസത്തിനുള്ളിൽ ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത മൃഗങ്ങൾക്ക് ഉയർന്ന അതിജീവന നിരക്ക് (74%) ഉണ്ടായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 1g ഉം സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 2 ഉം), കൂടാതെ വ്യക്തമായ മോട്ടോർ അല്ലെങ്കിൽ മെമ്മറി വൈകല്യങ്ങൾ, ഗ്ലിയോസിസ് അല്ലെങ്കിൽ ഇലക്ട്രോഎൻസെഫലോഗ്രാം (EEG) എന്നിവ കണ്ടെത്തിയില്ല. ഡാറ്റ ചിത്രം 1g ഉം സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 2 ഉം). 1h–m ഉം 3e ഉം).
a, പരീക്ഷണാത്മക രൂപകൽപ്പനയുടെ സ്കീമാറ്റിക്. hiPS കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ hCO, വ്യത്യാസത്തിന്റെ 30-60 ദിവസങ്ങളിൽ നവജാത നഗ്ന എലികളുടെ S1 ലേക്ക് പറിച്ചുനട്ടു. b, ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് 2 മാസത്തിനുശേഷം S1-ൽ t-hCO കാണിക്കുന്ന T2-വെയ്റ്റഡ് കൊറോണൽ, തിരശ്ചീന MRI ചിത്രങ്ങൾ. സ്കെയിൽ ബാർ, 2 mm. c, ഓരോ hiPS സെൽ ലൈനിനും കാണിച്ചിരിക്കുന്ന എൻഗ്രാഫ്റ്റ്മെന്റ് വിജയ നിരക്കുകളുടെ അളവ് (n = 108, ബാറുകൾക്കുള്ളിലെ സംഖ്യകൾ hIPS സെൽ ലൈനിന് t-hCO യുടെ അളവ് സൂചിപ്പിക്കുന്നു) കോർട്ടിക്കൽ അല്ലെങ്കിൽ സബ്കോർട്ടിക്കൽ സ്ഥാനം (n = 88). d, ഒരു കൊറോണറി ആർട്ടറിയുടെ MRI ഇമേജ് (ഇടത്; സ്കെയിൽ ബാർ, 3 mm) കൂടാതെ 3 മാസത്തിനുള്ളിൽ t-hCO യുടെ വർദ്ധനവ് കാണിക്കുന്ന അനുബന്ധ 3D വോള്യൂമെട്രിക് പുനർനിർമ്മാണം (സ്കെയിൽ ബാർ, 3 mm). e, എലി സെറിബ്രൽ കോർട്ടെക്സിലെ t-hCO പാറ്റേണുകളുടെ അവലോകനം. സ്കെയിൽ ബാർ, 1 mm. f, മുകളിൽ ഇടത്തുനിന്ന് വലത്തോട്ട് കാണിച്ചിരിക്കുന്ന t-hCO യുടെ പ്രതിനിധി ഇമ്മ്യൂണോസൈറ്റോകെമിക്കൽ ചിത്രങ്ങൾ (വ്യത്യാസ സമയത്ത്): PPP1R17 (4 മാസം പഴക്കം), NeuN (8 മാസം പഴക്കം), SOX9, GFAP (8 മാസം പഴക്കം), PDGFRα; (8 മാസം), MAP2 (8 മാസം), IBA1 (8 മാസം). സ്കെയിൽ ബാർ, 20 µm. HNA യുടെ കോ-എക്സ്പ്രഷൻ മനുഷ്യ ഉത്ഭവ കോശങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. g, snRNA-seq: സീറാറ്റ് സംയോജനത്തിനുശേഷം എല്ലാ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള t-hCO ന്യൂക്ലിയസുകളുടെയും ഏകീകൃത മാനിഫോൾഡ് ആൻഡ് പ്രൊജക്ഷൻ (UMAP) ഡൈമൻഷണാലിറ്റി റിഡക്ഷൻ ഇമേജിംഗ് (n=3 t-hCO സാമ്പിളുകൾ, n=2 hiPS സെൽ ലൈനുകൾ). ആസ്ട്രോസൈറ്റുകൾ, ആസ്ട്രോസൈറ്റ് ലൈനിന്റെ കോശങ്ങൾ; സൈക് പ്രോഗ്, രക്തചംക്രമണ പ്രോജെനിറ്ററുകൾ; ഗ്ലൂഎൻ ഡിഎൽ, ആഴത്തിലുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകൾ; ഗ്ലൂഎൻ ഡിഎൽ/എസ്പി, ആഴത്തിലുള്ളതും സബ്ലാമെല്ലാർ ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളും; ഗ്ലൂഎൻ യുഎൽ, മുകളിലെ പാളി ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകൾ; ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റുകൾ, ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റുകൾ; OPC, ഒളിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റ് പ്രോജെനിറ്റർ സെല്ലുകൾ; RELN, റീലിൻ ന്യൂറോണുകൾ. h, hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായി ഉയർന്ന ക്രമത്തിൽ (ക്രമീകരിച്ച P < 0.05, മടക്ക മാറ്റം > 2, കുറഞ്ഞത് 10% ന്യൂക്ലിയസുകളിൽ പ്രകടമാക്കിയത്) ജീനുകളുടെ ജീൻ ഒന്റോളജി (GO) ടേം സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. h, hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായി ഉയർന്ന ക്രമത്തിൽ (ക്രമീകരിച്ച P < 0.05, മടക്ക മാറ്റം > 2, കുറഞ്ഞത് 10% ന്യൂക്ലിയസുകളിൽ പ്രകടമാക്കിയത്) ജീനുകളുടെ ജീൻ ഒന്റോളജി (GO) ടേം സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. h, അനാലിസ് ഒബോഗാഷെനിയ ടെർമിനോവ് ജീൻ ഒൻ്റോളജി (GO) മുതൽ ഗേനോവ് വഴി പ്രശസ്തമായ ആക്റ്റിവിറ്റി (സ്‌കോറക്ട്, പോസ്റ്റ് <0,050 ഐസ്‌മെനെനിയ > 2, എസ്‌പ്രെസിയ പോ ക്രെയ്‌നെയ് മെറെയിൽ 10% യാദർ) ഗ്ലൂട്ടമാറ്റർഗിക്ക് നെയ്‌റോണഹ് ടി-എച്ച്‌സിഒ പോപ്പ് സ്‌രാവ്‌നെസ് ഗ്ലൂട്ടമാറ്റേർഗിചെസ്കിമി നെയ്റോനാമി എച്ച്സിഒ. h, hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായ ആക്റ്റിവേഷൻ (ക്രമീകരിച്ച P<0.05, മടക്ക മാറ്റം >2, കുറഞ്ഞത് 10% ന്യൂക്ലിയസുകളിൽ എക്സ്പ്രഷൻ) ഉള്ള ജീനുകൾക്കായുള്ള ജീൻ ഒന്റോളജി (GO) ടേം സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整喕喕, 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （ 后 . കൂടാതെ的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, ഗെൻറി പ്രസിദ്ധീകരണ ആക്റ്റിവിസിറോവലിസ് (സ്‌കോറക്റ്റിറോവനി പി <0,05, ക്രാറ്റ്‌നോസ്‌റ്റ് ഇജ്‌മെനെനിയ> 2, എക്‌സ്‌പ്രെസ്‌സിറൂട്ട് 10% യാദർ) ഗ്ലൂട്ടമാറ്റേർഗിചെസ്‌കി നെയ്‌റോണഹ് ടി-എച്ച്‌സിഒ പോ സ്‌രാവ്‌നെനിഷൂ സ് ഗ്ലൂട്ടമാറ്റേർഗിചെസ്‌കിമി നെയ്‌റോനാമി എച്ച്‌സിഒ ഓൺടോ) ടെർമിന ഒബോഗാഷെനിയ. h, hCO ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ജീനുകൾ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ക്രമീകരിച്ച P < 0.05, മടക്ക മാറ്റം > 2, കുറഞ്ഞത് 10% ന്യൂക്ലിയസുകളിൽ പ്രകടമാക്കി). സമ്പുഷ്ടീകരണ പദത്തിന്റെ ഒന്റോളജിക്കൽ (GO) വിശകലനം.ഡോട്ട് ഇട്ട രേഖ 0.05 എന്ന aq മൂല്യം സൂചിപ്പിക്കുന്നു. i, ഒരു റഫറൻസ് 22 snRNA-seq അഡൽറ്റ് മോട്ടോർ കോർട്ടെക്സ് ഡാറ്റാസെറ്റിൽ നിന്നുള്ള ലേബൽ ട്രാൻസ്ഫർ ഉപയോഗിച്ച് t-hCO ലെ GluN സെൽ തരങ്ങളുടെ UMAP ഇമേജിംഗ്. CT — കോർട്ടിക്കോത്തലാമിക് സെല്ലുകൾ, ET — എക്സ്ട്രാസെറിബ്രൽ സെല്ലുകൾ, IT — ഇന്റേണൽ ടെലെൻസെഫാലിക് സെല്ലുകൾ, NP — നിയർ പ്രൊജക്ഷൻ.
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ t-hCO യുടെ സൈറ്റോആർക്കിടെക്ചറും മൊത്തത്തിലുള്ള സെല്ലുലാർ ഘടനയും വിലയിരുത്തി. എലി എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങളുടെ ആന്റിബോഡി സ്റ്റെയിനിംഗ് t-hCO യുമായി വാസ്കുലറൈസേഷൻ വെളിപ്പെടുത്തി, അതേസമയം IBA1 സ്റ്റെയിനിംഗ് ഗ്രാഫ്റ്റിലുടനീളം എലി മൈക്രോഗ്ലിയയുടെ സാന്നിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 1f ഉം വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 3c,d). ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റെയിനിംഗ് PPP1R17 (കോർട്ടിക്കൽ പ്രോജെനിറ്ററുകൾ), NeuN (ന്യൂറോണുകൾ), SOX9, GFAP (ഗ്ലിയൽ-ഡെറിവേഡ് സെല്ലുകൾ) അല്ലെങ്കിൽ PDGFRα (ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റ് പ്രോജെനിറ്ററുകൾ) സഹ-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന മനുഷ്യ ന്യൂക്ലിയർ ആന്റിജൻ (HNA) പോസിറ്റീവ് സെല്ലുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 1f). സിംഗിൾ സെൽ റെസല്യൂഷനിൽ t-hCO യുടെ സെല്ലുലാർ ഘടന പഠിക്കാൻ, ഏകദേശം 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിന് ശേഷം ഞങ്ങൾ സിംഗിൾ-കോർ RNA സീക്വൻസിംഗ് (snRNA-seq) നടത്തി. എലി ന്യൂക്ലിയസുകളുടെ ബൾക്ക് ഫിൽട്രേഷനും നീക്കംചെയ്യലും 21,500 ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള മനുഷ്യ മോണോ ന്യൂക്ലിയർ മാപ്പുകൾ നൽകി (ചിത്രം 1g ഉം വിപുലീകരിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 4a,b). സാധാരണ സെൽ-ടൈപ്പ് മാർക്കറുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ, ആഴത്തിലുള്ളതും ഉപരിപ്ലവവുമായ ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകൾ, സർക്കുലേറ്റിംഗ് പ്രോജെനിറ്ററുകൾ, ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റുകൾ, ആസ്ട്രോസൈറ്റ് ലൈനേജ് എന്നിവയുൾപ്പെടെ പ്രധാന കോർട്ടിക്കൽ സെൽ ക്ലാസുകളുടെ ക്ലസ്റ്ററുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (ചിത്രം 1g, വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 4c, സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 3). SATB2, CTIP2 എന്നിവയ്ക്കുള്ള ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നത് കോർട്ടിക്കൽ സബ്‌ടൈപ്പുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, t-hCO വ്യക്തമായ ശരീരഘടനാപരമായ സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷൻ കാണിച്ചില്ല എന്നാണ് (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 3a). സ്റ്റേജ്-മാച്ചഡ് snRNA-seq hCO ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റുകളുടെ അഭാവവും GABAergic ന്യൂറോണുകളുടെ സാന്നിധ്യവും ഉൾപ്പെടെ ചില അപവാദങ്ങളോടെ, വിശാലമായി സമാനമായ സെൽ ക്ലാസുകൾ ഉൽ‌പാദിപ്പിച്ചു, ഇത് ലാറ്ററൽ പ്രോജെനിറ്റർ സെല്ലുകൾക്ക് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത അനുകൂലമായ ഇൻ വിട്രോ അവസ്ഥകളെ പ്രതിഫലിപ്പിച്ചേക്കാം15 (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 4f - i, സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 4). ടി-എച്ച്‌സി‌ഒയ്ക്കും എച്ച്‌സി‌ഒയ്ക്കും ഇടയിലുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമീറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഡിഫറൻഷ്യൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വിശകലനം ഗണ്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 5), സിനാപ്റ്റിക് സിഗ്നലിംഗ്, ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ലോക്കലൈസേഷൻ, വോൾട്ടേജ്-ഗേറ്റഡ് ചാനൽ പ്രവർത്തനം തുടങ്ങിയ ന്യൂറോണൽ പക്വതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകളുടെ സെറ്റുകളുടെ സജീവമാക്കൽ ഉൾപ്പെടെ (ചിത്രം 1എച്ച്, സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 5). പട്ടിക 6). അതനുസരിച്ച്, കോർട്ടിക്കൽ ഗ്ലൂട്ടാമീറ്റർജിക് ടി-എച്ച്‌സി‌ഒ ന്യൂറോണുകൾ ത്വരിതപ്പെടുത്തിയ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പക്വത പ്രകടമാക്കി.
t-hCO-യിലെ ഈ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ മാറ്റങ്ങൾ hCO in vitro യും t-hCO in vivo യും തമ്മിലുള്ള രൂപാന്തരപരമായ വ്യത്യാസങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതാണോ എന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്, 7-8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിന് ശേഷം ഞങ്ങൾ അക്യൂട്ട് സെക്ഷനുകളിൽ സ്റ്റേജ്-മാച്ച്ഡ് ബയോസൈറ്റിൻ-പൂരിപ്പിച്ച hCO യും hCO യും പുനർനിർമ്മിച്ചു. hCO ന്യൂറോണുകൾ (ചിത്രം 2a). t-hCO ന്യൂറോണുകൾ ഗണ്യമായി വലുതായിരുന്നു, സോമ വ്യാസത്തിന്റെ 1.5 മടങ്ങ്, ഇരട്ടി ഡെൻഡ്രൈറ്റുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു, കൂടാതെ ഇൻ വിട്രോ hCO യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മൊത്തം ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നീളത്തിൽ മൊത്തത്തിൽ ആറ് മടങ്ങ് വർദ്ധനവും ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം 2b). കൂടാതെ, hCO ന്യൂറോണുകളേക്കാൾ t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് സ്പൈനുകളുടെ സാന്ദ്രത ഗണ്യമായി ഉയർന്നതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 2c). ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് t-hCO ന്യൂറോണുകൾ വിപുലമായ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നീളത്തിനും ശാഖകൾക്കും വിധേയമാകുന്നു, ഇത് തുടർച്ചയായ കോശ വ്യാപനത്തോടൊപ്പം, ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് ശേഷം t-hCO യുടെ തീവ്രമായ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമായേക്കാം (ചിത്രം 1d, എക്സ്റ്റെൻഡഡ് ഡാറ്റ ചിത്രം 1f). ഇത് ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ ഗുണങ്ങൾ അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. മെംബ്രൻ കപ്പാസിറ്റൻസ് എട്ട് മടങ്ങ് കൂടുതലായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 8d), റെസ്റ്റിംഗ്-സ്റ്റേറ്റ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ കൂടുതൽ ഹൈപ്പർപോളറൈസ് ചെയ്യപ്പെട്ടു (ഏകദേശം 20 mV), കൂടാതെ കറന്റ് ഇൻജക്ഷൻ hCO ന്യൂറോണുകളേക്കാൾ ഉയർന്ന പരമാവധി ഉത്തേജന നിരക്ക് t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ പ്രേരിപ്പിച്ചു. ഇൻ വിട്രോ (ചിത്രം 2d), e), ഇത് t-hCO യുടെ വലുതും സങ്കീർണ്ണവുമായ രൂപാന്തര സവിശേഷതകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. കൂടാതെ, സ്വയമേവയുള്ള ഉത്തേജന പോസ്റ്റ്‌സിനാപ്റ്റിക് കറന്റ് ഇവന്റുകളുടെ (EPSC) ആവൃത്തി t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായി കൂടുതലായിരുന്നു (ചിത്രം 2f), t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട ഡെൻഡ്രിറ്റിക് സ്പൈനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രത പ്രവർത്തനപരമായ ഉത്തേജനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ലൈംഗിക സിനാപ്‌സ്. ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകൾ (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 6a-c) ലേബൽ ചെയ്‌തുകൊണ്ട് hCO ന്യൂറോണുകളുടെ അപക്വ സ്വഭാവം ഇൻ വിട്രോയിൽ ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.
a, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിനു ശേഷം ബയോസൈറ്റിൻ നിറച്ച hCO, t-hCO ന്യൂറോണുകളുടെ 3D പുനർനിർമ്മാണം. b, രൂപഘടന സവിശേഷതകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയം (n = 8 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 6 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; **P = 0.0084, *P = 0.0179, ***P < 0.0001). b, രൂപഘടന സവിശേഷതകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയം (n = 8 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 6 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; **P = 0.0084, *P = 0.0179, ***P < 0.0001). ബി, കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയാ ഒഷെങ്ക മോർഫോളോജിക് പ്രിസ്‌നാക്കോവ് (n = 8 നെയ്‌റോനോവ് hCO, n = 6 നെയ്‌റോണോവ് t-hCO; ** പി = 0, 9 = 80, * 0,0 <0,0001). b, രൂപഘടന സവിശേഷതകളുടെ അളവ് (n=8 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n=6 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; **P=0.0084, *P=0.0179, ***P<0.0001). b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0084,*P = 0.0179 ബി, കോളിചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയാ ഒഷെങ്ക മോർഫോളോജിക് പ്രിസ്‌നാക്കോവ് (n = 8 നെയ്‌റോനോവ് hCO, n = 6 നെയ്‌റോണോവ് t-hCO; ** പി = 0, 9 = 80, * 0,0 <0,0001). b, രൂപഘടന സവിശേഷതകളുടെ അളവ് (n=8 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n=6 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; **P=0.0084, *P=0.0179, ***P<0.0001).c, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിനു ശേഷം hCO, t-hCO ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ശാഖകളുടെ 3D പുനർനിർമ്മാണം. ചുവന്ന നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ സാധ്യതയുള്ള ഡെൻഡ്രിറ്റിക് മുള്ളുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത അളവ് (n = 8 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 6 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; **P = 0.0092). d, റെസ്റ്റിംഗ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യലിന്റെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കൽ (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). d, റെസ്റ്റിംഗ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യലിന്റെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കൽ (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). d, കൊളീച്ചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയ ഒഷെങ്ക മെംബ്രാന്നഗോ പോട്ടൻസിയാല പോക്കോയ (n = 25 NEIRONOV hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10) d, റെസ്റ്റിംഗ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, കൊളീച്ചെസ്‌റ്റ്‌വെന്നയ ഒഷെങ്ക മെംബ്രാന്നഗോ പോട്ടൻസിയാല പോക്കോയ (n = 25 NEIRONOV hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10) d, റെസ്റ്റിംഗ് മെംബ്രൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷൻ (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). e, വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന കറന്റ് ഇഞ്ചക്ഷനുകൾ വഴി ഉണ്ടാകുന്ന hCO, t-hCO എന്നിവയിൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള പ്രവർത്തന സാധ്യതയുള്ള ഫയറിംഗ്, പരമാവധി ഫയറിംഗ് നിരക്കിന്റെ അളവ് (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). e, വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന കറന്റ് ഇഞ്ചക്ഷനുകൾ വഴി ഉണ്ടാകുന്ന hCO, t-hCO എന്നിവയിൽ ആവർത്തിച്ചുള്ള പ്രവർത്തന സാധ്യതയുള്ള ഫയറിംഗ്, പരമാവധി ഫയറിംഗ് നിരക്കിന്റെ അളവ് (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). ഇ, പൊവ്തൊര്നൊഎ വൊജ്ബുദ്ദെനിഎ പൊതെംസ്തിഅല ദെയ്സ്ത്വിയ വ് എച്ച്സിഒ ആൻഡ് ടി-എച്ച്സിഒ, വ്യ്ജ്വംനൊഎ യുവെലിഛെനിഎമ് ടോക്ക, ആൻഡ് കൊളിചെസ് മാക്‌സിമൽനോയ് സ്‌കോറോസ്‌റ്റി വോസ്‌ബുഡ്‌ഡെനിയ (n = 25 നെയ്‌റോണോവ് hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, പരമാവധി ഫയറിംഗ് നിരക്കിന്റെ (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; *** P < 0.0001) കറന്റ് വർദ്ധനവും അളവെടുപ്പും മൂലമുണ്ടാകുന്ന hCO, t-hCO എന്നിവയിലെ പ്രവർത്തന സാധ്യതയുള്ള റീ-ഫയറിംഗ്. e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的最大放电率的神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 皖 =2 量神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, പൊവ്തൊര്യയുസ്ഛ്യെസ്യ വൊജ്ബുജ്ദെനിഎ പൊതെംസ്തിഅല ഡെയ്സ്ത്വിയ എച്ച്സിഒ ആൻഡ് ടി-എച്ച്സിഒ, വ്യ്ജ്വനൊഎ ഉവെലിഛെനിഎമ് പൊദയുസ്ഛ്യ്ഹ് പുസ്തകങ്ങൾ ഒസെങ്ക മാക്സിമൽനോയ് സ്‌കോറോസ്‌റ്റി വോസ്‌ബുഡ്‌ഡെനിയ (n = 25 നെയ്‌റോനോവ് hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, വർദ്ധിച്ച കറന്റ് സപ്ലൈയും പരമാവധി ഫയറിംഗ് നിരക്കിന്റെ അളവും മൂലമുണ്ടാകുന്ന hCO യുടെയും t-hCO യുടെയും ആവർത്തന ഫയറിംഗ് (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 16 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; *** P < 0.0001). f, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിൽ hCO, t-hCO ന്യൂറോണുകളിലെ സ്വാഭാവിക EPSC-കൾ (sEPSC-കൾ), സിനാപ്റ്റിക് ഇവന്റുകളുടെ ആവൃത്തിയുടെ അളവ് (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 17 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). f, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിൽ hCO, t-hCO ന്യൂറോണുകളിലെ സ്വാഭാവിക EPSC-കൾ (sEPSC-കൾ), സിനാപ്റ്റിക് ഇവന്റുകളുടെ ആവൃത്തിയുടെ അളവ് (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 17 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P < 0.0001). f, സ്‌പോണ്ടൻ്റി ഇപിഎസ്‌സി (എസ്ഇപിഎസ്‌സി) നെയ്‌റോണാഹ് എച്ച്‌സിഒ, ടി-എച്ച്‌സിഒ ചെറസ് 8 മെസ്‌യാഷെവ് ദിനാചരണങ്ങൾ синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, സിനാപ്റ്റിക് ഇവന്റ് നിരക്കുകളുടെ വ്യത്യാസവും അളവെടുപ്പും 8 മാസത്തിനുള്ളിൽ hCO, t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ സ്വാഭാവിക EPSC-കൾ (sEPSC-കൾ) (n=25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n=17 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的事件频率的量神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, സ്‌പോണ്ടൻ്റി ഇപിഎസ്‌സി (എസ്ഇപിഎസ്‌സി) നെയ്‌റോണാഹ് എച്ച്‌സിഒ, ടി-എച്ച്‌സിഒ ചെറസ് 8 മെസ്‌യാഷെവ് ദിനാചരണങ്ങൾ синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, സിനാപ്റ്റിക് ഇവന്റ് നിരക്കുകളുടെ വ്യത്യാസവും അളവെടുപ്പും 8 മാസത്തിനുള്ളിൽ hCO, t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ സ്വാഭാവിക EPSC-കൾ (sEPSC-കൾ) (n = 25 hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 17 t-hCO ന്യൂറോണുകൾ; *** P<0.0001).bf-ന്, 1208-2 വരിയിലെ hCO, t-hCO എന്നിവ സമാന്തരമായി പരിപാലിക്കുന്ന അതേ ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ ബാച്ചിൽ നിന്നാണ് എടുത്തത്. g, t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന ജീനുകളുടെ ജീൻ സെറ്റ് സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം (ഏകപക്ഷീയമായ ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന) hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഇൻ വിവോ മൗസ് പഠനത്തിൽ നിന്ന് തിരിച്ചറിഞ്ഞ ആദ്യകാല പ്രതികരണ (ERG) ഉം വൈകി പ്രതികരണ (LRG) ഉം പ്രവർത്തന-ആശ്രിത ജീനുകളുടെ ജീൻ സെറ്റുകളുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളും16 ഇൻ വിട്രോ ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്നുള്ള മനുഷ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട LRG-കൾ17. g, t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന ജീനുകളുടെ ജീൻ സെറ്റ് സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം (ഏകപക്ഷീയമായ ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന) hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഇൻ വിവോ മൗസ് പഠനത്തിൽ നിന്ന് തിരിച്ചറിഞ്ഞ ആദ്യകാല പ്രതികരണ (ERG) ഉം വൈകി പ്രതികരണ (LRG) ഉം പ്രവർത്തന-ആശ്രിത ജീനുകളുടെ ജീൻ സെറ്റുകളുള്ള ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളും16 ഇൻ വിട്രോ ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്നുള്ള മനുഷ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട LRG-കൾ17. g, അനലിസ് ഒബോഗഷെനിയ നബോറ ഗേനോവ് (ഓഡ്‌നോസ്‌റ്റോറൻ്റി ടോച്ച്‌നി ക്രൈറ്ററി ഫിഷേറ) ഗേനോവ് സിസോ സാൻവിറ്റൽനോയ് ആക്‌ട് (സ്‌കോറക്‌റ്റിറോവണി പി <0,05, ക്രാറ്റ്‌നോസ്‌റ്റ് ഇജ്‌മെനിയ > 2, എക്‌സ്‌പ്രെസ്‌സിയ പോ മെൻഷെയിൽ നിന്ന് 10% യാഡർ) ഗ്ലൂട്ടം t-hCO по сравнению എസ് ഗ്ലൂട്ടമാറ്റേർഗിചെസ്‌കിമി നെയ്‌റോനാമി എച്ച്‌സിഒ നബോറി ഗേനോവ് കാക് റാനെഗോ (ഇആർജി), ടാക് ആൻഡ് പോസ്‌ഡ്‌നെഗോ (എൽആർജി) ഗേനോവ്, സാവിഷ്യസ് vivo16-ലെ മിഷാഹിലെ ഐഡൻ്റിഫിഷ്യൽ ഐഡൻ്റിഫിക്കേഷൻ, കൂടാതെ സ്‌പെഷ്യൽ ഫിഷെസ്‌കിഹ് വരെ ചെലോവെക എൽആർജി അല്ലെങ്കിൽ വൈറോൺ7 എന്നിവയിൽ. g, t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ഗണ്യമായ ആക്റ്റിവേഷൻ (ക്രമീകരിച്ച P<0.05, ഫോൾഡ് ചേഞ്ച് >2, കുറഞ്ഞത് 10% ന്യൂക്ലിയസുകളിൽ എക്സ്പ്രഷൻ) ഉള്ള ജീനുകളുടെ ജീൻ സെറ്റ് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന്റെ വിശകലനം (വൺ-ടെയിൽഡ് ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന) hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഇൻ വിവോ മൈസുകളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ ആദ്യകാല (ERG) ഉം വൈകിയ (LRG) ഉം പ്രവർത്തന-ആശ്രിത ജീനുകളുടെ ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുടെ സെറ്റുകളും16 ഇൻ വിട്രോയിൽ ന്യൂറോണുകളിൽ നിന്നുള്ള മനുഷ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട LRG-കൾ17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) 和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上 谐 谐 谕<0.05 , 倍数> 2 , 至少 至少 10% ഏകദേശം小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 皠 基神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, ഗ്ലൂട്ടമാറ്റേർഗിസ്‌കി നെയ്‌റോണി ടി-എച്ച്‌സിഒ ബൈലി സൻസസ്‌റ്റേലിനോ ആക്‌റ്റിവിസിറോവനി പോ സ്‌ക്രാവ്‌നെനിസ് എസ് എച്ച്‌കോം എച്ച്‌സിഒ (скорректированный P<0,05, ക്രാറ്റ്നോസ്റ്റ് ഇജ്മെനെനിയ> 2, അല്ല 10% അനലിസ് ഒബോഗഷെനിയ നബോറ ഗൺസ് ( ടെസ്‌റ്റ് ഫിഷെറ) റാനെഗോ ഒത്വെത (ERG) കൂടാതെ പോസ്ഡ്നെഗോ ഗേണി, സജീവമായ ഒട്ട് ആക്റ്റിവ്നോസ്തി ഒത്വെത (LRG), ഐഡൻ്റിഫിഷ്യൽ ഇൻഷുറൻസ് ഇൻസ്‌ലെഡോവ് 6 വിട്രോ17 ലെ നെയ്‌റോനാഹ്. എൽആർജി, സ്‌പെഷ്യൽ ഫിക്‌സ് എന്നിവ. g, t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകൾ hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ക്രമീകരിച്ച P<0.05, മടക്ക മാറ്റം >2, കുറഞ്ഞത് 10% ആദ്യകാല പ്രതികരണം (ERG) ഉം വൈകിയുള്ള പ്രതികരണ ജീൻ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനവും (വൺ-ടെയിൽഡ് ഫിഷറിന്റെ കൃത്യമായ പരിശോധന) പ്രതികരണ പ്രവർത്തന ആശ്രിത ജീനുകൾ (LRG-കൾ) ഇൻ വിവോ മൈസുകളിലും ഇൻ വിട്രോ ന്യൂറോണുകളിലും തിരിച്ചറിഞ്ഞു.17 മനുഷ്യ നിർദ്ദിഷ്ട LRG-കൾ.ഡോട്ട് ചെയ്ത രേഖ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് 0.05. h എന്ന ബോൺഫെറോണി തിരുത്തിയ P മൂല്യം, t-hCO ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിലെ LRG ജീനുകളുടെ snRNA-seq പകർപ്പുകളിൽ GluN ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ (ഓരോ ജീനിന്റെയും വ്യാജ പാക്കേജും സ്കെയിലിംഗും) ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു. i, t-hCO (മുകളിലെ) ന്യൂറോണുകളിലും hCO (താഴത്തെ) ന്യൂറോണുകളിലും SCG2 എക്സ്പ്രഷൻ കാണിക്കുന്ന ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റെയിനിംഗ്. വെളുത്ത അമ്പടയാളങ്ങൾ SCG2+ സെല്ലുകളിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 25 µm. ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
എക്സ് വിവോ സ്ലൈസുകളിൽ നിരീക്ഷിച്ച t-hCO യുടെ വർദ്ധിച്ച പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, hCO ഇൻ വിട്രോയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ t-hCO യിലെ ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഒരു അപ്‌റെഗുലേഷൻ snRNA-seq വെളിപ്പെടുത്തി. ഗ്ലൂട്ടാമറ്റെർജിക് t-hCO ന്യൂറോണുകൾ വൈകിയുള്ള പ്രതികരണ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഉയർന്ന അളവിലുള്ള ജീനുകൾ പ്രകടിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 2g,h), ഇത് എലികളിലും മനുഷ്യ ന്യൂറോണുകളിലും മുൻ പഠനങ്ങളിൽ കണ്ടെത്തി16,17. ഉദാഹരണത്തിന്, BDNF18, SCG2, പ്രൈമേറ്റ്-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തന-നിയന്ത്രണ ജീനായ OSTN എന്നിവ hCO ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് t-hCO ന്യൂറോണുകളിൽ വർദ്ധിച്ച പ്രകടനമാണ് കാണിച്ചത് (ചിത്രം 2g-i). അങ്ങനെ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ, മോർഫോളജിക്കൽ, ഫങ്ഷണൽ വിശകലനങ്ങൾ വഴി hCO ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് t-hCO ന്യൂറോണുകൾ മെച്ചപ്പെട്ട പക്വത സവിശേഷതകൾ പ്രദർശിപ്പിച്ചു.
മനുഷ്യ മസ്തിഷ്ക വികാസവുമായുള്ള t-hCO പക്വതയുടെ ബന്ധം കൂടുതൽ വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെയും മുതിർന്നവരുടെയും കോർട്ടിക്കൽ സെൽ തരങ്ങളുടെയും 19,20, മുതിർന്നവരുടെ 21,22 എന്നിവയുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിക് താരതമ്യങ്ങളും വികസന സമയത്ത് കോർട്ടിക്കൽ ജീൻ എക്സ്പ്രഷനെക്കുറിച്ചുള്ള വിപുലമായ ഡാറ്റയും ഞങ്ങൾ നടത്തി (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 5). മുൻ കൃതി 24 പ്രകാരം, 7-8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിലെ ആഗോള hCO, t-hCO ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം പക്വത നില ഇൻ വിവോ വികസന സമയവുമായി വിശാലമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ അവസാന ജീവിതത്തിന് തുല്യവുമാണ് (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ ചിത്രം 5a). ശ്രദ്ധേയമായി, പ്രായവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന hCO നെ അപേക്ഷിച്ച് t-hCO-യിൽ വർദ്ധിച്ച ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം പക്വതയും സിനാപ്റ്റോജെനിസിസ്, ആസ്ട്രോജെനിസിസ്, മൈലിനേഷൻ എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം ആക്റ്റിവേഷനും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 5b-d). സെല്ലുലാർ തലത്തിൽ, മുതിർന്നവരുടെ L2/3, L5, L6 ന്യൂറോൺ ഉപവിഭാഗങ്ങളുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്ന ഗ്ലൂട്ടാമറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളുടെ കൂട്ടങ്ങളുള്ള t-hCO-യിൽ നേർത്ത കോർട്ടെക്സ് ഉപവിഭാഗത്തിന്റെ തെളിവുകൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1i). ഇതിനു വിപരീതമായി, ഗർഭാവസ്ഥയുടെ മധ്യത്തിൽ ഗ്ലൂട്ടാമാറ്റർജിക് t-hCO ന്യൂറോണുകളും ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ കോർട്ടിക്കൽ ന്യൂറോണുകളും തമ്മിലുള്ള ക്ലസ്റ്റർ ഓവർലാപ്പ് കൂടുതൽ പരിമിതമായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 5e-j). t-hCO ന്യൂറോണുകൾ മനുഷ്യന്റെ പ്രസവാനന്തര നിയോകോർട്ടിക്കൽ ന്യൂറോണുകളുമായി പ്രവർത്തനപരമായി സാമ്യമുള്ളതാണോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, മനുഷ്യന്റെ പ്രസവാനന്തര കോർട്ടെക്സിന്റെ മൂർച്ചയുള്ള ഭാഗങ്ങളിൽ മനുഷ്യ L2/3 പിരമിഡൽ ന്യൂറോണുകളുടെ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ റെക്കോർഡിംഗുകളും ശരീരഘടന പുനർനിർമ്മാണങ്ങളും ഞങ്ങൾ നടത്തി (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 7a). L2/3 പിരമിഡൽ ന്യൂറോണുകളുടെ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ ഗുണങ്ങൾ t-hCO പിരമിഡൽ ന്യൂറോണുകളുടേതിന് സമാനമായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 7e). രൂപശാസ്ത്രപരമായി, പ്രസവാനന്തര മനുഷ്യ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള L2/3 ന്യൂറോണുകൾ hCO നെക്കാൾ t-hCO യോട് കൂടുതൽ സാമ്യമുള്ളതായിരുന്നു, എന്നിരുന്നാലും L2/3 കോശങ്ങൾ നീളമുള്ളതായിരുന്നു, മൊത്തത്തിൽ കൂടുതൽ ശാഖകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഉയർന്ന നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം 3g, വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 7b-). G).
a, കൺട്രോൾ, TS hiPS സെൽ ലൈനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിക്കുന്ന hCO നവജാത എലികളിലേക്ക് പറിച്ചുനടൽ. b, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിന് ശേഷം ബയോസൈറ്റിൻ നിറച്ച t-hCO ന്യൂറോണുകളുടെ 3D പുനർനിർമ്മാണം. c, ശരാശരി ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നീളത്തിന്റെ അളവ് (n = 19 കൺട്രോൾ ന്യൂറോണുകൾ, n = 21 TS ന്യൂറോണുകൾ; **P = 0.0041). d, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിൽ കൺട്രോളിൽ നിന്നും TS t-hCO യിൽ നിന്നുമുള്ള 3D- പുനർനിർമ്മിച്ച ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ശാഖകൾ, ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയുടെ അളവ് (n = 16 കൺട്രോൾ ന്യൂറോണുകൾ, n = 21 TS ന്യൂറോണുകൾ, ***P < 0.0001). d, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിൽ കൺട്രോളിൽ നിന്നും TS t-hCO യിൽ നിന്നുമുള്ള 3D- പുനർനിർമ്മിച്ച ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ശാഖകൾ, ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രതയുടെ അളവ് (n = 16 കൺട്രോൾ ന്യൂറോണുകൾ, n = 21 TS ന്യൂറോണുകൾ, ***P < 0.0001). d, 3D-റെക്കോൺസ്‌ട്രൂക്‌ഷ്യ ഡെൻഡ്രിറ്റ്‌നിഹ് വെറ്റ്‌വെയ്‌സ് കോൺട്രോലിയ ആൻഡ് ടിഎസ് ടി-എച്ച്‌സിഒ ചെറസ് 8 മെസ്‌യാഷെവ് ഡിഫ്‌ഫെറൻസിറോവിക്‌സി ഒഷെങ്കാ പ്ലോട്ട്നോസ്റ്റി ഡെൻഡ്രിറ്റ്നിഹ് ഷിപ്പോവ് (n = 16 കോൺട്രോൾ ന്യൂറോനോവ്, n = 21 ടിഎസ് ന്യൂറോനോവ്, *** പി <0,0001). d, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിലും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത അളക്കലിലും (n=16 നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകൾ, n=21 TS ന്യൂറോണുകൾ, ***P<0.0001) നിയന്ത്രണത്തിൽ നിന്നും t-hCO TS-ൽ നിന്നുമുള്ള ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ശാഖകളുടെ 3D പുനർനിർമ്മാണം. d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n =个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密匦 = 16 量神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）. ഡി. പ്ലൊത്നൊസ്ത്യ് ദെംദ്രിത്ന്ыഹ് ഷിപ്പോവ് (n = 16 കൊംത്രൊല്ന്ыഹ് നെയ്രൊനൊവ്, n = 21 ടി എസ് നെയ്രൊനൊവ്, *** പി <0,0001). d, 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിലും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നട്ടെല്ല് സാന്ദ്രത അളക്കലിലും (n=16 നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകൾ, n=21 TS ന്യൂറോണുകൾ, ***P<0.0001) കൺട്രോൾ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ശാഖകളുടെയും TS t-hCO യുടെയും 3D പുനർനിർമ്മാണം.ചുവന്ന നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ പുട്ടേറ്റീവ് ഡെൻഡ്രിറ്റിക് സ്പൈനുകളെയും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. e, നിയന്ത്രണത്തിലുള്ള സ്വയമേവയുള്ള EPSC-കളും 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസത്തിന് ശേഷം TS t-hCO ന്യൂറോണുകളും. f, സിനാപ്റ്റിക് ഇവന്റുകളുടെ ആവൃത്തിയുടെയും വ്യാപ്തിയുടെയും ക്യുമുലേറ്റീവ് ഫ്രീക്വൻസി പ്ലോട്ടും അളവും (n=32 നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകൾ, n=26 TS ന്യൂറോണുകൾ; **P=0.0076 ഉം P=0.8102 ഉം). g, hCO, t-hCO എന്നിവയിലെ TS, നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകളുടെ സ്കോൾ വിശകലനം. ഡാഷ് ചെയ്ത വരകൾ താരതമ്യത്തിനായി മനുഷ്യ L2/3 പ്രസവാനന്തര പിരമിഡൽ ന്യൂറോണുകളെ കാണിക്കുന്നു (n = 24 നിയന്ത്രണ t-hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 21 TS t-hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 8 നിയന്ത്രണ hCO ന്യൂറോണുകൾ, n = 7 TS hCO ന്യൂറോണുകൾ). ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
മനുഷ്യ കോർട്ടെക്സ് ന്യൂറോണുകളുടെ രൂപാന്തരപരവും പ്രവർത്തനപരവുമായ സവിശേഷതകൾ ഉയർന്ന തലത്തിൽ പകർത്താനുള്ള t-hCO യുടെ കഴിവ്, രോഗ ഫിനോടൈപ്പുകൾ കണ്ടെത്താൻ t-hCO ഉപയോഗിക്കാമോ എന്ന് പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. CaV1.2 എൻകോഡിംഗ് ചെയ്യുന്ന ജീനിലെ പ്രവർത്തന നേട്ടം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഗുരുതരമായ ന്യൂറോ ഡെവലപ്‌മെന്റൽ ഡിസോർഡറായ TS-ൽ ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു, ഇത് ന്യൂറോണുകളിൽ പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ജീൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആരംഭിക്കുന്നു. ഏറ്റവും സാധാരണമായ സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷൻ (p.G406R) ഉം മൂന്ന് നിയന്ത്രണങ്ങളും വഹിക്കുന്ന മൂന്ന് TS രോഗികളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ hCO നേടി (ചിത്രം 3a). ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷനുശേഷം, നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ TS ന്യൂറോണുകളിൽ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് മോർഫോളജിയിൽ മാറ്റം വന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3b ഉം വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 8a,b), പ്രാഥമിക ഡെൻഡ്രൈറ്റുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ ഇരട്ടി വർദ്ധനവും ഡെൻഡ്രിറ്റിക് നീളത്തിൽ ശരാശരിയിലും മൊത്തത്തിലുമുള്ള കുറവും (ചിത്രം 3c ഉം വിപുലീകൃത ഡാറ്റയും, ചിത്രം 8c). നിയന്ത്രണ ന്യൂറോണുകളെ അപേക്ഷിച്ച് ടിഎസിൽ നട്ടെല്ലുകളുടെ സാന്ദ്രതയും സ്വയമേവയുള്ള ഇപിഎസ്‌സികളുടെ ആവൃത്തിയും വർദ്ധിച്ചതുമായി ഇത് ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 3d–f ഉം വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 8g). കൂടുതൽ വിശകലനം നിയന്ത്രണങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ടി-എച്ച്‌സി‌ഒ ടിഎസിൽ അസാധാരണമായ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ബ്രാഞ്ചിംഗിന്റെ പാറ്റേണുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി, പക്ഷേ സമാനമായ വ്യത്യാസ ഘട്ടത്തിൽ ഇൻ വിട്രോ ടിഎസ് എച്ച്‌സി‌ഒയിൽ അല്ല (ചിത്രം 3g). ടിഎസിലെ പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ചുരുങ്ങലിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ഇൻ വിവോയിൽ രോഗ ഫിനോടൈപ്പുകൾ കണ്ടെത്താനുള്ള ഈ ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിന്റെ കഴിവ് എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.
പിന്നീട് ഞങ്ങൾ ചോദിച്ചു, t-hCO കോശങ്ങൾ എലി S1-ൽ എത്രത്തോളം പ്രവർത്തനപരമായി സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. എലികളിലെ S1-ന് ഐപ്സിലാറ്ററൽ വെൻട്രൽ ബേസൽ, പോസ്റ്റീരിയർ തലാമിക് ന്യൂക്ലിയസുകൾ, ഐപ്സിലാറ്ററൽ മോട്ടോർ, സെക്കൻഡറി സോമാറ്റോസെൻസറി കോർട്ടീസുകൾ, കോൺട്രാലാറ്ററൽ S1 (ചിത്രം 4a) എന്നിവയിൽ നിന്ന് ശക്തമായ സിനാപ്റ്റിക് ഇൻപുട്ടുകൾ ലഭിക്കുന്നു. ഇന്നർവേഷൻ പാറ്റേൺ പുനഃസ്ഥാപിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ hCO-യെ റാബിസ് വൈറസ്-dG-GFP/AAV-G ഉപയോഗിച്ച് ബാധിച്ചു, 3 ദിവസത്തിന് ശേഷം S1 എലിയിലേക്ക് hCO ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്തു. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് ശേഷം 7-14 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം ഇപ്സിലാറ്ററൽ S1-ന്റെയും വെൻട്രൽ ബേസൽ ഗാംഗ്ലിയയുടെയും ന്യൂറോണുകളിൽ സാന്ദ്രമായ GFP എക്സ്പ്രഷൻ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 4b, c). കൂടാതെ, തലാമിക് മാർക്കർ നെട്രിൻ G1-ന്റെ ആന്റിബോഡി സ്റ്റെയിനിംഗ് t-hCO-യിൽ തലാമിക് എൻഡിംഗുകളുടെ സാന്നിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 4d, e). ഈ അഫെറന്റ് പ്രൊജക്ഷനുകൾക്ക് t-hCO കോശങ്ങളിൽ സിനാപ്റ്റിക് പ്രതികരണങ്ങൾ ഉളവാക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് വിലയിരുത്താൻ, തലാമോകോർട്ടിക്കൽ പാളിയുടെ മൂർച്ചയുള്ള ഭാഗങ്ങളിൽ മനുഷ്യകോശങ്ങളിൽ നിന്ന് മുഴുവൻ സെൽ റെക്കോർഡിംഗുകളും ഞങ്ങൾ നടത്തി. എലി S1, ആന്തരിക കാപ്സ്യൂൾ, വെളുത്ത ദ്രവ്യം, t-hCO യ്ക്ക് സമീപമുള്ള നാരുകൾ എന്നിവയുടെ വൈദ്യുത ഉത്തേജനം അല്ലെങ്കിൽ AMPA റിസപ്റ്റർ എതിരാളി NBQX-ന് വിധേയമാകുന്ന t-hCO ന്യൂറോണുകളിലെ t-hCO ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഷോർട്ട്-ലേറ്റൻസി EPSC-കളിലെ ഓപ്‌സിൻ-എക്‌സ്‌പ്രസ്സിംഗ് തലാമിക് എൻഡിംഗുകളുടെ ഒപ്‌റ്റോജെനെറ്റിക് ആക്റ്റിവേഷൻ. (ചിത്രം 4f, g, വിപുലീകൃത ഡാറ്റ, ചിത്രം 9a-g). ഈ ഡാറ്റ t-hCO എലിയുടെ തലച്ചോറിലേക്ക് ശരീരഘടനാപരമായി സംയോജിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ടെന്നും എലി ഹോസ്റ്റ് ടിഷ്യു വഴി സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമെന്നും തെളിയിക്കുന്നു.
a, റാബിസ് ട്രാക്കിംഗ് പരീക്ഷണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. b, t-hCO യ്ക്കും എലി സെറിബ്രൽ കോർട്ടെക്സിനും ഇടയിലുള്ള GFP, മനുഷ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട STEM121 എക്സ്പ്രഷൻ (മുകളിലെ പാനൽ). എലിയുടെ ഇപ്സിലാറ്ററൽ വെൻട്രൽ ബേസൽ ന്യൂക്ലിയസ് (VB) (താഴെ ഇടത്) ലും ഇപ്സിലാറ്ററൽ S1 (താഴെ വലത്) ലും GFP എക്സ്പ്രഷനും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 50 µm. ചിത്രങ്ങൾ എടുത്ത തലച്ചോറിന്റെ ഭാഗങ്ങളെ ചുവന്ന ചതുരങ്ങൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. c, GFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങളുടെ അളവ് (n = 4 എലികൾ). d, e - t-hCO യിലെ Netrin G1+ തലാമിക് ടെർമിനലുകൾ. d t-hCO യും VB ന്യൂക്ലിയസുകളും അടങ്ങിയ ഒരു കൊറോണൽ വിഭാഗം കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 2 mm. e t-hCO (ഇടത്) ലും VB (വലത്) ന്യൂറോണുകളിലും Netrin G1, STEM121 എക്സ്പ്രഷൻ കാണിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ, 50 µm. ഓറഞ്ച് ഡോട്ടഡ് ലൈൻ t-hCO ബോർഡറിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. f, g, S1 റാറ്റ് (f) അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റേണൽ കാപ്സ്യൂൾ (g) എന്നിവയിൽ വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന് ശേഷം (പർപ്പിൾ) അല്ലെങ്കിൽ (കറുപ്പ്) NBQX ഇല്ലാതെ (ഇടത്) t-hCO ന്യൂറോണുകളുടെ നിലവിലെ ട്രെയ്‌സുകൾ. NBQX ഉള്ളതും ഇല്ലാത്തതുമായ EPSC ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡുകൾ (n = 6 S1 ന്യൂറോണുകൾ, *P = 0.0119; n = 6 ഇന്റേണൽ കാപ്സ്യൂൾ ന്യൂറോണുകൾ, **P = 0.0022) (മധ്യഭാഗം). എലി S1 (f) അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റേണൽ കാപ്സ്യൂൾ (g) (വലത്) എന്നിവയുടെ വൈദ്യുത ഉത്തേജനത്തിന് പ്രതികരണമായി EPSC കാണിക്കുന്ന t-hCO ന്യൂറോണുകളുടെ ശതമാനം. aCSF, കൃത്രിമ സെറിബ്രോസ്പൈനൽ ദ്രാവകം. h, 2P ഇമേജിംഗ് പരീക്ഷണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം (ഇടത്). t-hCO (മധ്യഭാഗം) യിൽ GCaMP6-കളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ. സ്കെയിൽ ബാർ, 100 µm. GCaMP6-കളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ടൈം ലാപ്സ് (വലത്). i, സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തന ഫ്ലൂറസെൻസിന്റെ Z-സ്കോർ. j, മീശ ഉത്തേജനത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ചിത്രീകരണം. k, ഒരു പരീക്ഷണത്തിൽ z-സ്കോർ ചെയ്ത 2P ഫ്ലൂറസെൻസ് പാതകൾ, ഉദാഹരണ സെല്ലുകളിൽ പൂജ്യത്തിലെ (ഡാഷ് ചെയ്ത ലൈൻ) സമയത്തിലെ വിസ്കർ ഡീവിയേഷനുമായി വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്നു. l, എല്ലാ സെല്ലുകളുടെയും ജനസംഖ്യാ ശരാശരി z-സ്കോർ പ്രതികരണങ്ങൾ, സമയ പൂജ്യത്തിലെ (ഡാഷ് ചെയ്ത ലൈൻ) (ചുവപ്പ്) വിസ്കർ ഡീവിയേഷനുമായി വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ക്രമരഹിതമായി സൃഷ്ടിച്ച ടൈംസ്റ്റാമ്പുകൾ (ചാരനിറം). m. ഒപ്റ്റിക്കൽ മാർക്കിംഗിലെ പരീക്ഷണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. n, നീല ലേസർ ഉത്തേജനം അല്ലെങ്കിൽ വിസ്കർ ഡിഫ്ലെക്ഷൻ സമയത്ത് ഒരു ഉദാഹരണ t-hCO സെല്ലിൽ നിന്നുള്ള അസംസ്കൃത വോൾട്ടേജ് കർവുകൾ. പ്രകാശം (മുകളിൽ) മൂലമോ വിസ്കർ ഡിഫ്ലെക്ഷൻ മൂലമോ (താഴെ) മൂലമോ ഉണ്ടാകുന്ന ആദ്യത്തെ സ്പൈക്കുകളെ ചുവന്ന അമ്പടയാളങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ചാരനിറത്തിലുള്ള ഷേഡിംഗ് വിസ്കർ ഡിഫ്ലെക്ഷന്റെ കാലഘട്ടങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. o, പീക്ക് ലൈറ്റ് വേവ്ഫോമുകളും വിസ്കർ ഡിഫ്ലെക്ഷൻ പ്രതികരണങ്ങളും. p, ഉദാഹരണത്തിലെ കോശങ്ങളിലെ വിസ്കറുകളുടെ ഡീവിയേഷനുമായി വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരൊറ്റ ശ്രമത്തിന്റെ സ്പൈക്കുകൾ. 0 വിസ്കർ ഡീവിയേഷൻ (ഡാഷ് ചെയ്ത ലൈൻ) സൂചിപ്പിക്കുന്നു. q, എല്ലാ ഫോട്ടോസെൻസിറ്റീവ് സെല്ലുകൾക്കുമുള്ള ജനസംഖ്യാ ശരാശരി z-സ്കോർ ഫയറിംഗ് നിരക്ക്, പൂജ്യത്തിലെ (ഡാഷ് ചെയ്ത ലൈൻ) (ചുവപ്പ്) വിസ്കർ ഡീവിയേഷനുമായി വിന്യസിച്ചിരിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ ക്രമരഹിതമായി സൃഷ്ടിച്ച ടൈംസ്റ്റാമ്പുകൾ (ചാരനിറം). r, വിസ്കർ ഡീവിയേഷൻ (n = 3 എലികൾ) വഴി ഗണ്യമായി മോഡുലേറ്റ് ചെയ്ത ഫോട്ടോസെൻസിറ്റീവ് യൂണിറ്റുകളുടെ അനുപാതം (ഇടത്). പീക്ക് z-സ്കോർ ലേറ്റൻസി (n = 3 എലികൾ; n = 5 (ഇളം പച്ച), n = 4 (കടും പച്ച), n = 4 (സിയാൻ) വിസ്കർ ഡിഫ്ലെക്ഷൻ മോഡുലേഷൻ യൂണിറ്റുകൾ പെർ റാറ്റ്) (വലത്). ഡാറ്റ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ ആയി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ ഇൻ വിവോ സെൻസറി ഉത്തേജനങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് t-hCO സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് ചോദിച്ചു. ജനിതകമായി എൻകോഡ് ചെയ്ത കാൽസ്യം സൂചകങ്ങളായ GCaMP6 പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന hCO ഞങ്ങൾ S1 എലികളിലേക്ക് പറിച്ചുനട്ടു. 150 ദിവസത്തിനുശേഷം, ഞങ്ങൾ ഫൈബർ ഫോട്ടോമെട്രി അല്ലെങ്കിൽ ടു-ഫോട്ടോൺ കാൽസ്യം ഇമേജിംഗ് നടത്തി (ചിത്രം 4h ഉം വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റയും, ചിത്രം 10a ഉം). t-hCO കോശങ്ങൾ സിൻക്രൊണൈസ്ഡ് റിഥമിക് ആക്റ്റിവിറ്റി പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 4i, വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10b ഉം സപ്ലിമെന്ററി വീഡിയോ 1 ഉം). പീക്ക് t-hCO പ്രവർത്തനത്തെ ചിത്രീകരിക്കാൻ, അനസ്തേഷ്യ ചെയ്ത ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് എലികളിൽ ഞങ്ങൾ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ റെക്കോർഡിംഗുകൾ നടത്തി (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10c-f). MRI ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് കോർഡിനേറ്റുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു; അതിനാൽ, ഈ റെക്കോർഡുചെയ്‌ത യൂണിറ്റുകൾ അനുമാനാത്മക മനുഷ്യ ന്യൂറോണുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജി മാത്രം ഒരു സ്പീഷീസ് ഉത്ഭവം നിർണ്ണയിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നില്ല. സിൻക്രൊണൈസ്ഡ് പ്രവർത്തന സ്ഫോടനങ്ങൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10d). സ്ഫോടനങ്ങൾ ഏകദേശം 460 ms നീണ്ടുനിന്നു, ഏകദേശം 2 s ന്റെ നിശബ്ദ കാലയളവുകളാൽ വേർതിരിച്ചു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10d, e). വ്യക്തിഗത യൂണിറ്റുകൾ ഒരു സ്ഫോടനത്തിൽ ശരാശരി മൂന്ന് റൗണ്ടുകൾ വെടിവച്ചു, ഇത് ഒരു സ്ഫോടനത്തിൽ രജിസ്റ്റർ ചെയ്ത യൂണിറ്റുകളുടെ ഏകദേശം 73% ആണ്. വ്യക്തിഗത യൂണിറ്റുകളുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ വളരെ പരസ്പരബന്ധിതമായിരുന്നു, കൂടാതെ ഈ പരസ്പരബന്ധങ്ങൾ അതേ അവസ്ഥകളിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ വാക്സിനേഷൻ എടുക്കാത്ത മൃഗങ്ങളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ യൂണിറ്റുകളേക്കാൾ കൂടുതലായിരുന്നു (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10f). തിരിച്ചറിഞ്ഞ മനുഷ്യനിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ന്യൂറോണുകളുടെ സ്പൈക്ക് പ്രതികരണങ്ങളെ കൂടുതൽ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന്, hCO ഉപയോഗിച്ച് പറിച്ചുനട്ട അനസ്തേഷ്യ ചെയ്ത എലികളിൽ ഞങ്ങൾ ലൈറ്റ്-ടാഗിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി, പ്രകാശ-സെൻസിറ്റീവ് കാറ്റേഷൻ ചാനൽ റോഡോപ്സിൻ 2 (hChR2) പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, അതിലൂടെ t-hCO ന്യൂറോണുകൾ നീല വെളിച്ച ഉത്തേജനങ്ങൾക്ക് മറുപടിയായി ഷോർട്ട്-ലേറ്റൻസി റെക്കഗ്നിഷൻ (10 ms-ൽ താഴെ) നടത്തുന്നു (ചിത്രം 4m–o). കാൽസ്യം ഇമേജിംഗിൽ നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമായ ആവൃത്തികളിൽ t-hCO ന്യൂറോണുകൾ സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പൊട്ടിത്തെറികൾ പ്രകടിപ്പിച്ചു, അതുപോലെ തന്നെ പ്രകാശ അടയാളപ്പെടുത്തലിന്റെ അഭാവത്തിൽ t-hCO-യിൽ നടത്തിയ ഇലക്ട്രോഫിസിയോളജിക്കൽ റെക്കോർഡിംഗുകളും (വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10c-g). ഇൻ വിട്രോയിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ hCO യുടെ അനുബന്ധ ഘട്ടങ്ങളിൽ സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനങ്ങളൊന്നും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല. സെൻസറി ഉത്തേജകങ്ങൾ വഴി t-hCO സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് വിലയിരുത്താൻ, ഞങ്ങൾ എലി മീശയെ t-hCO-യിൽ നിന്ന് ഹ്രസ്വമായി വ്യതിചലിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 4j,m, വിപുലീകൃത ഡാറ്റ, ചിത്രം 10h,k). മുൻ പഠനങ്ങൾ പ്രകാരം 8,10, t-hCO കോശങ്ങളുടെ ഒരു ഉപവിഭാഗം വിസ്‌കർ വ്യതിചലനത്തോടുള്ള പ്രതികരണമായി വർദ്ധിച്ച പ്രവർത്തനം കാണിച്ചു, ഡാറ്റയെ റാൻഡം ടൈം സ്റ്റാമ്പുകളുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ഇത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (ചിത്രം 4k-q, വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ, ചിത്രം 10h-q). വാസ്തവത്തിൽ, ഒപ്റ്റോ-ലേബൽ ചെയ്ത സിംഗിൾ യൂണിറ്റുകളുടെ ഏകദേശം 54% വിസ്‌കർ ഉത്തേജനത്തിന് ശേഷം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ച ഉത്തേജന നിരക്ക് കാണിച്ചു, ഏകദേശം 650 ms (ചിത്രം 4r). ഒരുമിച്ച് നോക്കുമ്പോൾ, ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് t-hCO ഉചിതമായ പ്രവർത്തനപരമായ ഇൻപുട്ടുകൾ സ്വീകരിക്കുന്നുവെന്നും പാരിസ്ഥിതിക ഉത്തേജനങ്ങളാൽ സജീവമാക്കാമെന്നുമാണ്.
തുടർന്ന്, പെരുമാറ്റം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനായി t-hCO എലികളിലെ സർക്യൂട്ടുകൾ സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. t-hCO ന്യൂറോണുകളുടെ ആക്സോണുകൾ എലിയുടെ ചുറ്റുമുള്ള കലകളിലേക്ക് പ്രൊജക്റ്റ് ചെയ്യുന്നുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ആദ്യം അന്വേഷിച്ചു. EYFP (hChR2-EYFP) യുമായി സംയോജിപ്പിച്ച hChR2 എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ഒരു ലെന്റിവൈറസ് ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ hCO ബാധിച്ചു. 110 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, ഓഡിറ്ററി, മോട്ടോർ, സോമാറ്റോസെൻസറി കോർട്ടീസുകൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഇപ്സിലാറ്ററൽ കോർട്ടിക്കൽ മേഖലകളിലും, സ്ട്രിയാറ്റം, ഹിപ്പോകാമ്പസ്, തലാമസ് എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള സബ്കോർട്ടിക്കൽ മേഖലകളിലും ഞങ്ങൾ EYFP എക്സ്പ്രഷൻ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 5a). ഈ എഫെറന്റ് പ്രൊജക്ഷനുകൾക്ക് എലി കോശങ്ങളിൽ സിനാപ്റ്റിക് പ്രതികരണങ്ങൾ ഉളവാക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് വിലയിരുത്താൻ, മൂർച്ചയുള്ള തലച്ചോറിലെ എലി സെറിബ്രൽ കോർട്ടെക്സ് കോശങ്ങളെ റെക്കോർഡുചെയ്യുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ hChR2-EYFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന t-hCO സെല്ലുകളെ ഒപ്റ്റിക്കലായി സജീവമാക്കി. NBQX തടഞ്ഞ എലി പിരമിഡൽ കോർട്ടെക്സ് ന്യൂറോണുകളിൽ നീല വെളിച്ചം പ്രേരിത ഷോർട്ട്-ലേറ്റൻസി EPSC-കളുള്ള t-hCO ആക്സോണുകളുടെ സജീവമാക്കൽ (ചിത്രം 5b-g). കൂടാതെ, ഈ പ്രതികരണങ്ങളെ ടെട്രോഡോടോക്സിൻ (TTX) തടയുകയും 4-അമിനോപിരിഡിൻ (4-AP) പുനഃസ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്യാം, ഇത് മോണോസിനാപ്റ്റിക് കണക്ഷനുകൾ മൂലമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 5e).
a, ആക്സൺ ട്രാക്കിംഗിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം (ഇടത്). t-hCO EYFP എക്സ്പ്രഷൻ (വലത്). സ്കെയിൽ ബാർ, 100 µm. A1, ഓഡിറ്ററി കോർട്ടെക്സ്, ACC, ആന്റീരിയർ സിങ്ഗുലേറ്റ് കോർട്ടെക്സ്, d. സ്ട്രിയാറ്റം, ഡോർസൽ സ്ട്രിയാറ്റം, HPC, ഹിപ്പോകാമ്പസ്; ഡയഫ്രം, ലാറ്ററൽ സെപ്തം, mPFC, മീഡിയൽ പ്രീഫ്രോണ്ടൽ കോർട്ടെക്സ്, പിരി, പിരിഫോം കോർട്ടെക്സ്, v. സ്ട്രിയാറ്റം, വെൻട്രൽ സ്ട്രിയാറ്റം, VPM, തലാമസിന്റെ വെൻട്രോപോസ്റ്റോമീഡിയൽ ന്യൂക്ലിയസ്, VTA, വെൻട്രൽ ടെഗ്മെന്റൽ മേഖല. ചുവന്ന ചതുരങ്ങൾ ചിത്രങ്ങൾ എടുത്ത തലച്ചോറിന്റെ ഭാഗങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. b, ഉത്തേജന പരീക്ഷണത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. c, d, മനുഷ്യനിൽ നീല വെളിച്ചം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ഫോട്ടോകറന്റ് (മുകളിൽ) വോൾട്ടേജ് (താഴെ) എന്നിവയുടെ പ്രതികരണത്തിന്റെ ഉദാഹരണങ്ങൾ (c) EYFP+ t-hCO അല്ലെങ്കിൽ എലി (d) EYFP- കോശങ്ങൾ. e, f, TTX ഉം 4-AR ഉം (പച്ച), TTX (ചാരനിറം) അല്ലെങ്കിൽ aCSF (കറുപ്പ്) (e), (വയലറ്റ്) ഉള്ളതോ ഇല്ലാത്തതോ (കറുപ്പ്) ഉള്ള t-hCO ആക്സോണുകളുടെ നീല വെളിച്ച ഉത്തേജനത്തിന് ശേഷമുള്ള എലി ന്യൂറോണുകളുടെ നിലവിലെ ട്രെയ്‌സുകൾ ) ) NBQX (e). g, എലി കോശങ്ങളിൽ നീല വെളിച്ചത്താൽ പ്രേരിതമാകുന്ന പ്രതികരണങ്ങളുടെ ലേറ്റൻസി (n = 16 സെല്ലുകൾ); തിരശ്ചീന ബാറുകൾ ശരാശരി ലേറ്റൻസിയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (7.13 ms) (ഇടത്). NBQX ഉള്ളതോ ഇല്ലാത്തതോ ആയ പ്രകാശത്താൽ ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന EPSC-കളുടെ വ്യാപ്തി രേഖപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (n = 7 സെല്ലുകൾ; ***P < 0.0001) (മധ്യത്തിൽ). NBQX ഉള്ളതോ ഇല്ലാത്തതോ ആയ പ്രകാശത്താൽ ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന EPSC-കളുടെ വ്യാപ്തി രേഖപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (n = 7 സെല്ലുകൾ; ***P < 0.0001) (മധ്യത്തിൽ). ആംപ്ലിറ്റൂഡ വൈസ്‌വാനിഷ് സ്വെറ്റോം ഇപിഎസ്‌സി, സർഗ്ഗിസ്റ്റ്രിറോവൺസ് അല്ലെങ്കിൽ ബെസ് എൻബിക്യുഎക്സ് (n = 7 ക്ലെറ്റോക്ക്; ***പി <0,0001) (ഇത്). NBQX ഉള്ളതോ ഇല്ലാത്തതോ ആയ പ്രകാശപ്രേരിത EPSC-കളുടെ വ്യാപ്തി രേഖപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (n = 7 സെല്ലുകൾ; ***P < 0.0001) (മധ്യത്തിൽ).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中 ആംപ്ലിറ്റൂഡ വൈസ്‌വാനിഷ് സ്വെറ്റോം ഇപിഎസ്‌സി, സർഗ്ഗിസ്റ്റ്രിറോവൺസ് അല്ലെങ്കിൽ ബെസ് എൻബിക്യുഎക്സ് (n = 7 ക്ലെറ്റോക്ക്; ***പി <0,0001) (ഇത്). NBQX ഉള്ളതോ ഇല്ലാത്തതോ ആയ പ്രകാശപ്രേരിത EPSC-കളുടെ വ്യാപ്തി രേഖപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു (n = 7 സെല്ലുകൾ; ***P < 0.0001) (മധ്യത്തിൽ).നീല വെളിച്ചത്തോട് പ്രതികരിക്കുന്ന EPSC-കൾ കാണിക്കുന്ന എലി കോശങ്ങളുടെ ശതമാനം (വലത്). h, ഒരു പെരുമാറ്റ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം. d0, ദിവസം 0. i. പരിശീലനത്തിന്റെ 1 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ 15 (വലത്) ദിവസം മാതൃകാപരമായ മൃഗങ്ങളുടെ പ്രകടനം. ദിവസം 1 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ ദിവസം 15 (വലത് മധ്യത്തിൽ) നടത്തിയ നക്കുകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം (n = 150 നീല വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ, n = 150 ചുവപ്പ് വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ; ***P < 0.0001). ദിവസം 1 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ ദിവസം 15 (വലത് മധ്യത്തിൽ) നടത്തിയ നക്കുകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം (n = 150 നീല വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ, n = 150 ചുവപ്പ് വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ; ***P < 0.0001). ദിനം 1 (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ ദിനം 15 (ഇന്ത്യൻ 15) (എൻ = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ദിവസം 1 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ ദിവസം 15 (മധ്യത്തിൽ വലത്) എന്നിവയിൽ നടത്തിയ ശരാശരി നക്കുകളുടെ എണ്ണം (n = 150 നീല വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ, n = 150 ചുവന്ന വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 ദിനം 1 (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ ദിനം 15 (ഇന്ത്യൻ 15) (എൻ = 150) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ദിവസം 1 (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ ദിവസം 15 (മധ്യത്തിൽ വലത്) എന്നിവയിൽ നടത്തിയ ശരാശരി നക്കുകളുടെ എണ്ണം (n = 150 നീല വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ, n = 150 ചുവന്ന വെളിച്ച പരീക്ഷണങ്ങൾ; ***P < 0.0001).ഒന്നാം ദിവസം (മധ്യ ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ 15-ാം ദിവസം (വലത്) ചുവപ്പ്, നീല ലൈറ്റ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായുള്ള ക്യുമുലേറ്റീവ് ലിക്കുകൾ. NS, പ്രധാനമല്ല. j,k, 1 അല്ലെങ്കിൽ 15-ാം ദിവസം hChR2-EYFP (j) പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന t-hCO ഉപയോഗിച്ച് പറിച്ചുനട്ട എല്ലാ മൃഗങ്ങളുടെയും പെരുമാറ്റ സവിശേഷതകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലൂറോഫോർ (k) നിയന്ത്രിക്കുക (hChR2-EYFP: n = 9 എലികൾ, ** P = 0.0049; നിയന്ത്രണം: n = 9, P = 0.1497). l, മുൻഗണനാ സ്കോറിന്റെ പരിണാമം (n = 9 hChR2, n = 9 നിയന്ത്രണം; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, മുൻഗണനാ സ്കോറിന്റെ പരിണാമം (n = 9 hChR2, n = 9 നിയന്ത്രണം; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эvolyutsya പൊകജതെല്യ പ്രെദ്പൊഛ്തെംയ്യ (n = 9 hChR2, n = 9 കോൺട്രോൾ; **P <0,001, ***P <0,0001). l, മുൻഗണനാ സ്കോറിന്റെ പരിണാമം (n = 9 hChR2, n = 9 നിയന്ത്രണങ്ങൾ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 കോൺട്രോലെയ്; **P <0,001, ***P <0,0001). l, മുൻഗണന സ്കോറുകളുടെ പരിണാമം (n = 9 hChR2, n = 9 നിയന്ത്രണങ്ങൾ; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1-ൽ t-hCO യുടെ ഒപ്‌റ്റോജെനെറ്റിക് ആക്റ്റിവേഷനോടുള്ള പ്രതികരണമായി FOS എക്സ്പ്രഷൻ. FOS എക്സ്പ്രഷന്റെയും (ഇടത്), ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെയും (n = 3 ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001) (വലത്) ചിത്രങ്ങൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. FOS എക്സ്പ്രഷന്റെയും (ഇടത്), ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെയും (n = 3 ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001) (വലത്) ചിത്രങ്ങൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. Показаны изображения эക്സ്പ്രെസ്സി FOS (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ കോളിചെസ്റ്റ്വെൻനോഗോ ഒപ്രെദെലെനിയം (n = 3 ന് ഗ്രുപ്പ്പ്പു; * P <0,005, ** 1 P <0,005, **1 (സ്പ്രാവ). FOS എക്സ്പ്രഷന്റെയും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെയും (n = 3 ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും; *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001) ചിത്രങ്ങൾ (വലത്) കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения эക്സ്പ്രെസ്സി FOS (സ്ലേവ) അല്ലെങ്കിൽ കോളിചെസ്റ്റ്വെൻനോഗോ ഒപ്രെദെലെനിയം (n = 3 ന് ഗ്രുപ്പ്പ്പു; * P <0,005, ** 1 P <0,005, **1 (സ്പ്രാവ). FOS എക്സ്പ്രഷന്റെയും (ഇടത്) ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷന്റെയും (n = 3 ഓരോ ഗ്രൂപ്പിനും; *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001) ചിത്രങ്ങൾ (വലത്) കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ, 100 µm. ഡാറ്റ BLA, ബാസോലാറ്ററൽ ടോൺസിൽ, MDT, ഡോർസോമെഡിയൽ തലാമിക് ന്യൂക്ലിയസ്, PAG, പെരിയാക്വെഡക്റ്റൽ ഗ്രേ എന്നിവയുടെ ശരാശരി ± സ്റ്റാൻഡേർഡ് പിശകായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
ഒടുവിൽ, t-hCO എലികളുടെ പെരുമാറ്റം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ചോദിച്ചു. ഇത് പരീക്ഷിക്കുന്നതിനായി, ഞങ്ങൾ hChR2-EYFP-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന hCO S1 ലേക്ക് പറിച്ചുനട്ടു, 90 ദിവസങ്ങൾക്ക് ശേഷം, പ്രകാശ വിതരണത്തിനായി ഞങ്ങൾ t-hCO യിലേക്ക് ഒപ്റ്റിക്കൽ ഫൈബറുകൾ ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ എലികളെ പരിഷ്കരിച്ച ഓപ്പറേറ്റിംഗ് കണ്ടീഷനിംഗ് പാരഡൈം ഉപയോഗിച്ച് പരിശീലിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 5h). ഞങ്ങൾ മൃഗങ്ങളെ ഒരു ബിഹേവിയറൽ ടെസ്റ്റ് ചേമ്പറിൽ സ്ഥാപിച്ചു, ക്രമരഹിതമായി 5 സെക്കൻഡ് നീല (473 nm), ചുവപ്പ് (635 nm) ലേസർ ഉത്തേജനങ്ങൾ പ്രയോഗിച്ചു. നീല വെളിച്ച ഉത്തേജന സമയത്ത് നക്കിയെങ്കിലും ചുവന്ന വെളിച്ച ഉത്തേജന സമയത്ത് നക്കിയില്ലെങ്കിൽ മൃഗങ്ങൾക്ക് ജല പ്രതിഫലം ലഭിച്ചു. പരിശീലനത്തിന്റെ ആദ്യ ദിവസം, നീല അല്ലെങ്കിൽ ചുവപ്പ് വെളിച്ചം ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിക്കുമ്പോൾ നക്കുന്നതിൽ മൃഗങ്ങൾക്ക് വ്യത്യാസമൊന്നും കാണിച്ചില്ല. എന്നിരുന്നാലും, 15-ാം ദിവസം, hChR2-EYFP പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന hCO ഉപയോഗിച്ച് പറിച്ചുനട്ട മൃഗങ്ങൾ ചുവന്ന വെളിച്ച ഉത്തേജനത്തേക്കാൾ നീല വെളിച്ചം ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിക്കുമ്പോൾ കൂടുതൽ സജീവമായ നക്കൽ കാണിച്ചു. നിയന്ത്രണ ഫ്ലൂറോഫോർ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന hCO ഉപയോഗിച്ച് പറിച്ചുനട്ട നിയന്ത്രണ മൃഗങ്ങളിൽ നക്കുന്ന സ്വഭാവത്തിലെ ഈ മാറ്റങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല (പഠന വിജയ നിരക്ക്: hChR2 89%, EYFP 0%, ചിത്രം 5i-1, അനുബന്ധ വീഡിയോ 2). പ്രതിഫലം തേടുന്ന സ്വഭാവത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിന് t-hCO കോശങ്ങൾക്ക് എലി ന്യൂറോണുകളെ സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഈ പെരുമാറ്റ മാറ്റങ്ങളിൽ ഏത് എലി t-hCO ന്യൂറൽ സർക്യൂട്ടുകൾ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാമെന്ന് കണ്ടെത്താൻ, 90 മിനിറ്റിനുശേഷം പരിശീലനം ലഭിച്ച മൃഗങ്ങളിലും വിളവെടുത്ത കലകളിലും ഞങ്ങൾ t-hCO ഒപ്റ്റോജെനെറ്റിക്കലായി സജീവമാക്കി. മീഡിയൽ പ്രീഫ്രോണ്ടൽ കോർട്ടെക്സ്, മീഡിയൽ തലാമസ്, പെരിയാക്വെഡക്റ്റൽ ഗ്രേ മാറ്റർ എന്നിവയുൾപ്പെടെ പ്രചോദിത സ്വഭാവത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന നിരവധി തലച്ചോറ് മേഖലകളിൽ പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള FOS പ്രോട്ടീന്റെ പ്രകടനത്തെ ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി വെളിപ്പെടുത്തി, ഇത് ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടാത്ത നിയന്ത്രണ മൃഗങ്ങളിലോ മൃഗങ്ങളിലോ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടു. അരി. 5 മി). ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, പെരുമാറ്റം നയിക്കാൻ t-hCO ന് എലി ന്യൂറോണൽ പ്രവർത്തനം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മനുഷ്യ വികാസത്തെയും രോഗത്തെയും ഇൻ വിട്രോയിൽ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു വാഗ്ദാന സംവിധാനമാണ് ന്യൂറൽ ഓർഗനോയിഡുകൾ, എന്നാൽ ഇൻ വിവോയിൽ നിലനിൽക്കുന്ന സർക്യൂട്ടുകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധങ്ങളുടെ അഭാവം കാരണം അവ പരിമിതമാണ്. ഇൻ വിവോയിൽ മനുഷ്യ കോശ വികാസത്തെയും പ്രവർത്തനത്തെയും കുറിച്ച് പഠിക്കുന്നതിനായി രോഗപ്രതിരോധശേഷി കുറഞ്ഞ ആദ്യകാല പ്രസവാനന്തര എലികളുടെ S1 ലേക്ക് hCO പറിച്ചുനടുന്ന ഒരു പുതിയ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. ഇൻ വിട്രോ28 ൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടാത്ത പക്വമായ കോശ തരങ്ങൾ t-hCO വികസിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും t-hCO എലി തലച്ചോറിൽ ശരീരഘടനാപരമായും പ്രവർത്തനപരമായും സംയോജിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ടെന്നും ഞങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. എലികളുടെ ന്യൂറൽ സർക്യൂട്ടുകളിലേക്ക് t-hCO സംയോജിപ്പിക്കുന്നത് മനുഷ്യന്റെ കോശ പ്രവർത്തനവും പഠിച്ച മൃഗങ്ങളുടെ പെരുമാറ്റവും തമ്മിൽ ഒരു ബന്ധം സ്ഥാപിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു, പെരുമാറ്റ പ്രതികരണങ്ങൾ നയിക്കാൻ t-hCO ന്യൂറോണുകൾക്ക് എലി ന്യൂറോണൽ പ്രവർത്തനത്തെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്ന് കാണിക്കുന്നു.
എലികളുടെ തലച്ചോറിലേക്ക് മനുഷ്യകോശങ്ങൾ പറിച്ചുനടുന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള മുൻ ഗവേഷണങ്ങളെ അപേക്ഷിച്ച് ഞങ്ങൾ വിവരിക്കുന്ന പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിന് നിരവധി ഗുണങ്ങളുണ്ട്. ആദ്യം, പ്രസവാനന്തര എലികളുടെ വികസ്വര കോർട്ടക്സിലേക്ക് ഞങ്ങൾ hCO പറിച്ചുനടി, ഇത് ശരീരഘടനാപരവും പ്രവർത്തനപരവുമായ സംയോജനത്തെ സുഗമമാക്കിയേക്കാം. രണ്ടാമതായി, t-hCO MRI നിരീക്ഷണം ജീവനുള്ള മൃഗങ്ങളിലെ ഗ്രാഫ്റ്റ് സ്ഥാനവും വളർച്ചയും പഠിക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു, ഇത് ദീർഘകാല മൾട്ടി-അനിമൽ പഠനങ്ങൾ നടത്താനും നിരവധി ഹൈപിഎസ് സെൽ ലൈനുകളുടെ വിശ്വാസ്യത സ്ഥാപിക്കാനും ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. ഒടുവിൽ, മനുഷ്യകോശങ്ങൾക്ക് അത്ര വിനാശകരമല്ലാത്തതും എലികളുടെ തലച്ചോറിലെ മനുഷ്യ കോർട്ടെക്സ് ന്യൂറോണുകളുടെ സംയോജനവും ഉത്പാദനവും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്നതുമായ ഒറ്റപ്പെട്ട ഒറ്റ സെൽ സസ്പെൻഷനുകൾക്ക് പകരം, ഞങ്ങൾ കേടുകൂടാത്ത ഓർഗനോയിഡുകൾ പറിച്ചുനടി.
ഈ പ്ലാറ്റ്‌ഫോമിൽ പുരോഗതി ഉണ്ടായിട്ടും, വികസനത്തിന്റെ പ്രാരംഭ ഘട്ടത്തിൽ ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് ശേഷവും, ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യതയോടെ മനുഷ്യ ന്യൂറൽ സർക്യൂട്ടുകളുടെ രൂപീകരണം താൽക്കാലിക, സ്ഥല, ക്രോസ്-സ്പീഷീസ് നിയന്ത്രണങ്ങൾ തടയുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ സമ്മതിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, t-hCO-യിൽ കാണപ്പെടുന്ന സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനം കോർട്ടിക്കൽ വികസന സമയത്ത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന താളാത്മക പ്രവർത്തനത്തിന് സമാനമായ ഒരു വികസന ഫിനോടൈപ്പിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നുണ്ടോ, അതോ t-hCO-യിൽ നിലവിലുള്ള അടിച്ചമർത്തൽ കോശ തരങ്ങളുടെ അഭാവം മൂലമാണോ എന്ന് വ്യക്തമല്ല. അതുപോലെ, t-hCO-യിലെ ലാമിനേഷന്റെ അഭാവം ചെയിൻ കണക്റ്റിവിറ്റിയെ എത്രത്തോളം ബാധിക്കുന്നുവെന്ന് വ്യക്തമല്ല. ഭാവിയിലെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ മനുഷ്യ മൈക്രോഗ്ലിയ, മനുഷ്യ എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകൾ, ഇൻ വിട്രോ അസംബ്ലി 6 ഉപയോഗിച്ച് കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ GABAergic ഇന്റേണ്യൂറോണുകളുടെ വ്യത്യസ്ത അനുപാതങ്ങൾ എന്നിവ പോലുള്ള മറ്റ് സെൽ തരങ്ങളെ സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിലും, മാറ്റം വരുത്തിയ t-hCO-യിൽ ന്യൂറൽ ഇന്റഗ്രേഷനും പ്രോസസ്സിംഗും എങ്ങനെ സംഭവിക്കാമെന്ന് മനസ്സിലാക്കുന്നതിലും ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിക്കും. രോഗികളിൽ നിന്ന് ലഭിക്കുന്ന കോശങ്ങളിലെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ, സിനാപ്റ്റിക്, പെരുമാറ്റ തലങ്ങൾ.
മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഇൻ വിവോ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഇൻ വിട്രോ മനുഷ്യ മസ്തിഷ്ക വികസനത്തിനും രോഗ ഗവേഷണത്തിനും പൂരകമാകുന്ന ശക്തമായ ഒരു ഉറവിടത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. രോഗിയിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ കോശങ്ങളിൽ നോവൽ സ്ട്രാൻഡ്-ലെവൽ ഫിനോടൈപ്പുകൾ കണ്ടെത്താനും പുതിയ ചികിത്സാ തന്ത്രങ്ങൾ പരീക്ഷിക്കാനും ഈ പ്ലാറ്റ്‌ഫോം ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുമെന്ന് ഞങ്ങൾ പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഞങ്ങൾ HiPS സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് hCO2.5 ഉൽ‌പാദിപ്പിച്ചു. ഫീഡർ ലെയറുകളിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത hiPS സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് hCO ഉൽ‌പാദനം ആരംഭിക്കുന്നതിന്, ഡിസ്പേസ് (0.35 mg/mL) ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചർ ഡിഷുകളിൽ നിന്ന് hiPS സെല്ലുകളുടെ കേടുകൂടാത്ത കോളനികൾ നീക്കം ചെയ്യുകയും hiPS സെൽ കൾച്ചർ മീഡിയം ഉള്ള ഡിഷുകൾ അടങ്ങിയ അൾട്രാ-ലോ അറ്റാച്ച്മെന്റ് പ്ലാസ്റ്റിക് കൾച്ചറുകളിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്തു. (കോർണിംഗ്) രണ്ട് SMAD ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഡോർസോമോർഫിൻ (5 μM; P5499, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ഉം SB-431542 (10 μM; 1614, ടോക്രിസ്), ROCK ഇൻഹിബിറ്റർ Y-27632 (10 μM; S1049, സെല്ലെക്കെം) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് അനുബന്ധമായി നൽകി. ആദ്യ 5 ദിവസങ്ങളിൽ, hiPS സെൽ മീഡിയം ദിവസവും മാറ്റുകയും ഡോർസോമോർഫിൻ, SB-431542 എന്നിവ ചേർക്കുകയും ചെയ്തു. സസ്പെൻഷന്റെ ആറാം ദിവസം, ന്യൂറൽ സ്ഫെറോയിഡുകളെ ന്യൂറോബാസൽ-എ (10888, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), വിറ്റാമിൻ എ ഇല്ലാതെ ബി-27 സപ്ലിമെന്റ് (12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ഗ്ലൂട്ടമാക്സ് (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), പെൻസിലിൻ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) എന്നിവ അടങ്ങിയ ന്യൂറൽ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റി, കൂടാതെ എപ്പിഡെർമൽ ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ (EGF; 20 ng ml−1; R&D സിസ്റ്റംസ്), ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D സിസ്റ്റംസ്) എന്നിവ 24-ാം ദിവസം വരെ നൽകി. 25-ാം ദിവസം മുതൽ 42-ാം ദിവസം വരെ, മീഡിയം ബ്രെയിൻ ഡിറൈവ്ഡ് ന്യൂറോട്രോഫിക് ഫാക്ടർ (BDNF; 20 ng ml−1, പെപ്രോടെക്), ന്യൂറോട്രോഫിൻ 3 (NT3; 20 ng ml−1; പെപ്രോടെക്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ ദിവസവും ഇടത്തരം മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തി. സസ്പെൻഷന്റെ ആറാം ദിവസം, ന്യൂറൽ സ്ഫെറോയിഡുകളെ ന്യൂറോബാസൽ-എ (10888, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), വിറ്റാമിൻ എ ഇല്ലാതെ ബി-27 സപ്ലിമെന്റ് (12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ഗ്ലൂട്ടമാക്സ് (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), പെൻസിലിൻ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) എന്നിവ അടങ്ങിയ ന്യൂറൽ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റി, കൂടാതെ എപ്പിഡെർമൽ ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ (EGF; 20 ng ml−1; R&D സിസ്റ്റംസ്), ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D സിസ്റ്റംസ്) എന്നിവ 24-ാം ദിവസം വരെ നൽകി. 25-ാം ദിവസം മുതൽ 42-ാം ദിവസം വരെ, മീഡിയം ബ്രെയിൻ ഡിറൈവ്ഡ് ന്യൂറോട്രോഫിക് ഫാക്ടർ (BDNF; 20 ng ml−1, പെപ്രോടെക്), ന്യൂറോട്രോഫിൻ 3 (NT3; 20 ng ml−1; പെപ്രോടെക്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ ദിവസവും ഇടത്തരം മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തി.സസ്പെൻഷന്റെ ആറാം ദിവസം, ന്യൂറൽ സ്ഫെറോയിഡുകൾ വിറ്റാമിൻ എ ഇല്ലാതെ ന്യൂറോബാസൽ-എ (10888, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ബി-27 സപ്ലിമെന്റ് (12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ഗ്ലൂട്ടമാക്സ് (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), പെൻസിലിൻ എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ന്യൂറൽ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റി.സ്‌ട്രെപ്‌ടോമിഷൻ (1:100, ലൈഫ് ടെക്‌നോളജീസ്) കൂടാതെ ഡോപോൾനെൻ്റി എപ്പിഡെർമൽ ഫാക്‌ടോറോം റോസ്റ്റ (ഇജിഎഫ്; 20 എൻജി/എംഎൽ; ആർ&ഡി സിസ്റ്റങ്ങൾ) തുടങ്ങിയവ ഫെബ്രുവരി 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D സിസ്റ്റംസ്) 24-ാം തീയതി വരെ. സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) എന്നിവ 24-ാം ദിവസം വരെ എപ്പിഡെർമൽ ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ (EGF; 20 ng/ml; R&D സിസ്റ്റംസ്), ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D സിസ്റ്റംസ്) എന്നിവയുമായി സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.25 മുതൽ 42 വരെയുള്ള ദിവസങ്ങളിൽ, തലച്ചോറിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ന്യൂറോട്രോഫിക് ഘടകം (BDNF; 20 ng ml-1, പെപ്രോടെക്), ന്യൂറോട്രോഫിൻ 3 (NT3; 20 ng ml-1, പെപ്രോടെക്) എന്നിവ മീഡിയത്തിൽ ചേർത്തു, തുടർന്ന് മീഡിയം ഒന്നിടവിട്ട് മാറ്റി.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888, Life Technologies）、不含维生紉补充剂（12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്）、GlutaMax（1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ് സാങ്കേതികവിദ്യകൾ）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D സിസ്റ്റംസ്）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D സിസ്റ്റങ്ങൾ在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， ലൈഫ് ടെക്നോളജികൾ）的 b-27 补充剂 （12587 , ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്） Glutamax （1: 100 , ലൈഫ് ടെക്നോജിസ്, ലൈഫ് ടെക്നോജിസ് 100 , ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ് 表皮 生长 因子 （（20 ng ml-1 ； r & d സിസ്റ്റങ്ങൾ സിസ്റ്റങ്ങൾ 直至第24天. ഈ ദിവസം 6-ന് സുസ്പെൻസി നെയ്റോസ്ഫെറി ബൈലി പെരെവെദെന്ы ന് ദൊബവ്കു, സോഡർഷാഷു നെയ്റോബസൽ-എ (10888), ലൈഫ് ടെക്നോളജികൾ വി-27 ബെസ് വിറ്റാമിന ആ (12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ഗ്ലൂട്ടമാക്സ് (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), പെനിസിലിൻ- നൈട്രലിസോവാൻസ് സ്ട്രെപ്റ്റോമുകൾ, ലൈഫ്1010 ഡോബാവ്ലെനിയം എപ്പിഡെർമൽനോഗോ ഫാക്ടോറ റോസ്റ്റ (ഇജിഎഫ്; 20 എൻജി എംഎൽ-1; ആർ ആൻഡ് ഡി സിസ്റ്റംസ്) കൂടാതെ ഫാക്‌ടോറ റോസ്റ്റ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്‌റ്റോവ് 2 (എഫ്ജിഎഫ്2; 20 എൻഎംഎൽ-1) 1; ആറാം ദിവസം, ന്യൂറോസ്ഫിയർ സസ്പെൻഷനുകൾ ന്യൂറോബാസൽ-എ (10888, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), വിറ്റാമിൻ എ ഇല്ലാത്ത ബി-27 സപ്ലിമെന്റ് (12587, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), ഗ്ലൂട്ടമാക്സ് (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്), പെൻസിലിൻ-ന്യൂട്രലൈസ്ഡ് സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (1:100, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു സപ്ലിമെന്റിലേക്ക് മാറ്റി, എപ്പിഡെർമൽ ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ (EGF; 20 ng ml-1; R&D സിസ്റ്റംസ്), ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് ഗ്രോത്ത് ഫാക്ടർ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 എന്നിവയോടൊപ്പം ചേർത്തു; R&D സിസ്റ്റങ്ങൾ) 24-ന്. (ആർ & ഡി സിസ്റ്റംസ്) 24 ദിവസം വരെ.25 മുതൽ 42 വരെയുള്ള ദിവസങ്ങളിൽ, തലച്ചോറിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ന്യൂറോട്രോഫിക് ഘടകം (BDNF; 20 ng ml-1, പെപ്രോടെക്), ന്യൂറോട്രോഫിക് ഘടകം 3 (NT3; 20 ng ml-1, പെപ്രോടെക്) എന്നിവ കൾച്ചർ മീഡിയത്തിൽ ഒന്നിടവിട്ട് ചേർത്തു. ഒരിക്കൽ ഇടത്തരം മാറ്റം വരുത്തി.43-ാം ദിവസം മുതൽ, സപ്ലിമെന്റില്ലാത്ത ന്യൂറോബാസൽ-എ മീഡിയത്തിൽ (NM; 1088022, തെർമോ ഫിഷർ) hCO നിലനിർത്തി, ഓരോ 4-6 ദിവസത്തിലും ഇടത്തരം മാറ്റം വരുത്തി. ഫീഡർലെസ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ കൾച്ചർ ചെയ്ത hiPS സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് hCO ലഭിക്കുന്നതിന്, hiPS സെല്ലുകളെ 37°C താപനിലയിൽ 7 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് അക്യുട്ടേസ് (AT-104, ഇന്നൊവേറ്റ് സെൽ ടെക്നോളജീസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, സിംഗിൾ സെല്ലുകളായി വിഘടിപ്പിച്ചു, ROCK ഇൻഹിബിറ്റർ Y-27632 (10 μM; S1049, സെല്ലെക്കെം) ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്ത Essential 8 മീഡിയത്തിൽ ഓരോ കിണറിനും 3 × 106 സിംഗിൾ സെല്ലുകൾ എന്ന സാന്ദ്രതയിൽ AggreWell 800 പ്ലേറ്റുകളിൽ (34815, STEMCELL ടെക്നോളജീസ്) പൂശുന്നു. 24 മണിക്കൂറിനു ശേഷം, കിണറുകളിലെ മീഡിയയെ ഡോർസോമോർഫിൻ (2.5 μM; P5499, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്), SB-431542 (10 μM; 1614) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് എസൻഷ്യൽ 6 മീഡിയ (A1516401, ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) അടങ്ങിയ മീഡിയയിലേക്ക് പൈപ്പ് ചെയ്ത് മാറ്റി. 2 മുതൽ 6 വരെ ദിവസങ്ങളിൽ, എസൻഷ്യൽ 6 മീഡിയം ഡോർസോമോർഫിനും സപ്ലിമെന്റ് SB-431542 ഉം ഉപയോഗിച്ച് ദിവസവും മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു. ആറാം ദിവസം മുതൽ, ന്യൂറോസ്ഫിയർ സസ്പെൻഷനുകൾ ന്യൂറോബാസൽ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റുകയും മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ പരിപാലിക്കുകയും ചെയ്തു.
സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി ലബോറട്ടറി അനിമൽ കെയർ അഡ്മിനിസ്ട്രേറ്റീവ് കമ്മിറ്റി (APLAC) അംഗീകരിച്ച മൃഗസംരക്ഷണ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് എല്ലാ മൃഗ നടപടിക്രമങ്ങളും നടത്തിയത്. ഗർഭിണികളായ യൂത്തിമിക് RNU (rnu/+) എലികളെ വാങ്ങി (ചാൾസ് റിവർ ലബോറട്ടറീസ്) അല്ലെങ്കിൽ പാർപ്പിച്ചു. ഭക്ഷണവും വെള്ളവും അഡ് ലിബിറ്റം ഉപയോഗിച്ച് 12 മണിക്കൂർ ലൈറ്റ്-ഡാർക്ക് സൈക്കിളിൽ മൃഗങ്ങളെ സൂക്ഷിച്ചു. മൂന്ന് മുതൽ ഏഴ് ദിവസം വരെ പ്രായമുള്ള നഗ്ന (FOXN1–/–) എലിക്കുട്ടികളെ കൊല്ലുന്നതിന് മുമ്പ് പക്വതയില്ലാത്ത മീശയുടെ വളർച്ചയിലൂടെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. നായ്ക്കുട്ടികളെ (ആണും പെണ്ണും) 2-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകി ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഫ്രെയിമിൽ സ്ഥാപിച്ചു. ഡ്യൂറ മേറ്ററിന്റെ സമഗ്രത നിലനിർത്തിക്കൊണ്ട് S1 ന് മുകളിൽ ഏകദേശം 2-3 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള തലയോട്ടിയുടെ ട്രെപാനേഷൻ നടത്തി. തുടർന്ന് ക്രാനിയോടോമിക്ക് തൊട്ടുപുറത്ത് 30-G സൂചി (ഏകദേശം 0.3 മില്ലീമീറ്റർ) ഉപയോഗിച്ച് ഡ്യൂറ തുളയ്ക്കുക. തുടർന്ന് HCO നേർത്ത 3×3 സെന്റീമീറ്റർ പാരാഫിലിമിൽ പുരട്ടി അധിക മീഡിയം നീക്കം ചെയ്യുക. 23 G, 45° സൂചിയിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു ഹാമിൽട്ടൺ സിറിഞ്ച് ഉപയോഗിച്ച്, സൂചിയുടെ ഏറ്റവും വിദൂര അറ്റത്തേക്ക് hCO സൌമ്യമായി വരയ്ക്കുക. തുടർന്ന് സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഉപകരണവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന സിറിഞ്ച് പമ്പിൽ സിറിഞ്ച് സ്ഥാപിക്കുക. തുടർന്ന് സൂചിയുടെ അഗ്രം ഡ്യൂറയിൽ (z = 0 mm) മുമ്പ് നിർമ്മിച്ച 0.3 mm വീതിയുള്ള പഞ്ചർ ദ്വാരത്തിൽ വയ്ക്കുക, സൂചി ഡ്യൂറ മേറ്ററിന് ഇടയിലാകുന്നതുവരെ സിറിഞ്ച് 1–2 mm (z = ഏകദേശം –1.5 mm) ചുരുക്കുക. ഒരു സാന്ദ്രമായ സീൽ രൂപം കൊള്ളുന്നു. തുടർന്ന് സിറിഞ്ച് കോർട്ടിക്കൽ പ്രതലത്തിന്റെ മധ്യഭാഗത്തേക്ക് z = -0.5 mm എന്ന നിരക്കിൽ ഉയർത്തുക, മിനിറ്റിൽ 1-2 µl എന്ന നിരക്കിൽ hCO കുത്തിവയ്ക്കുക. hCO കുത്തിവയ്പ്പ് പൂർത്തിയാക്കിയ ശേഷം, സൂചി മിനിറ്റിൽ 0.2-0.5 mm എന്ന നിരക്കിൽ പിൻവലിക്കുന്നു, ചർമ്മം തുന്നിച്ചേർക്കുന്നു, പൂർണ്ണമായ സുഖം പ്രാപിക്കുന്നതുവരെ നായ്ക്കുട്ടിയെ ഉടൻ തന്നെ ഒരു ചൂടുള്ള ഹീറ്റിംഗ് പാഡിൽ സ്ഥാപിക്കുന്നു. ചില മൃഗങ്ങളെ ദ്വിമുഖമായി പറിച്ചുനടുന്നു.
സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി APLAC അംഗീകരിച്ച മൃഗസംരക്ഷണ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് എല്ലാ മൃഗ നടപടിക്രമങ്ങളും നടത്തിയത്. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷൻ കഴിഞ്ഞ് 60 ദിവസത്തിൽ കൂടുതൽ എലികളെ 5% ഐസോഫ്ലൂറേൻ അനസ്തേഷ്യ ഉപയോഗിച്ച് പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ഇമേജിംഗ് സമയത്ത് 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകുകയും ചെയ്തു. ദൃശ്യവൽക്കരണത്തിനായി, ഇന്റർനാഷണൽ ഇലക്ട്രിക് കമ്പനി (IECO) ഗ്രേഡിയന്റ് ഡ്രൈവ് ഉള്ള 7 ടെസ്‌ല ആക്റ്റീവ് ഷീൽഡ് ഹോറിസോണ്ടൽ ബോർഹോൾ സ്കാനർ ബ്രൂക്കർ (ബ്രൂക്കർ കോർപ്പ്), AVANCE ഉപയോഗിച്ച് 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) ആന്തരിക വ്യാസമുള്ള ഒരു ഷീൽഡ് ഗ്രേഡിയന്റ് ഇൻസേർട്ട് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു. III, എട്ട്-ചാനൽ മൾട്ടി-കോയിൽ RF, മൾട്ടി-കോർ ശേഷികൾ, ഒപ്പം അനുബന്ധ പാരവിഷൻ 6.0.1 പ്ലാറ്റ്‌ഫോം. 86 mm ആന്തരിക വ്യാസമുള്ള ഒരു ആക്റ്റീവ് ഡീകപ്പിൾഡ് വോള്യൂമെട്രിക് RF കോയിലും റിസീവിനു മാത്രമായി നാല്-ചാനൽ ക്രയോ-കൂൾഡ് RF കോയിലും ഉപയോഗിച്ചാണ് റെക്കോർഡിംഗ് നടത്തിയത്. 16 സ്ലൈസ് ക്യാപ്‌ചറുകളുള്ള ആക്സിയൽ 2D ടർബോ-ററേ (ആവർത്തന സമയം = 2500 ms, എക്കോ സമയം = 33 ms, 2 ശരാശരികൾ) സ്ലൈസ് കനം 0.6–0.8 mm, 256 × 256 സാമ്പിളുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. 2 സെന്റീമീറ്റർ ആന്തരിക വ്യാസമുള്ള ഒരു ക്വാഡ്രേച്ചർ ട്രാൻസ്‌സീവർ വോള്യൂമെട്രിക് RF കോയിൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് സിഗ്നലുകൾ സ്വീകരിച്ചത് (റാപ്പിഡ് എംആർ ഇന്റർനാഷണൽ, എൽഎൽസി). അവസാനമായി, 3D റെൻഡറിംഗിനും വോളിയം വിശകലനത്തിനുമായി ബിൽറ്റ്-ഇൻ ഇമാരിസ് (ബിറ്റ്‌പ്ലെയിൻ) ഉപരിതല എസ്റ്റിമേഷൻ ഫംഗ്ഷനുകൾ ഉപയോഗിക്കുക. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത അർദ്ധഗോളത്തിൽ തുടർച്ചയായ T2-വെയ്റ്റഡ് MRI സിഗ്നലിന്റെ ഭാഗങ്ങൾ രൂപപ്പെടുന്ന ഒന്നായി വിജയകരമായ ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് നിർവചിക്കപ്പെട്ടു. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത അർദ്ധഗോളത്തിൽ തുടർച്ചയായ T2-വെയ്റ്റഡ് MRI സിഗ്നലിന്റെ ഭാഗങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കാത്ത ഒരു ഗ്രാഫ്റ്റായി ഗ്രാഫ്റ്റ് റിജക്ഷൻ നിർവചിക്കപ്പെട്ടു. തുടർന്നുള്ള വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് സബ്കോർട്ടിക്കൽ t-hCO ഒഴിവാക്കി.
രണ്ട് ഫോട്ടോൺ കാൽസ്യം ഇമേജിംഗിനായി hCO-യിൽ GCaMP6s സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിന്, hiPS കോശങ്ങളെ pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ഉപയോഗിച്ച് ബാധിച്ചു, തുടർന്ന് ആൻറിബയോട്ടിക്കുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, കോശങ്ങളെ EDTA-യുമായി വേർപെടുത്തി, പോളിബ്രീൻ (5 μg/ml) ന്റെയും 15 μl വൈറസിന്റെയും സാന്നിധ്യത്തിൽ ഏകദേശം 300,000 കോശങ്ങളുടെ സാന്ദ്രതയിൽ 1 മില്ലി Essential 8 മീഡിയത്തിൽ സസ്പെൻഡ് ചെയ്തു. തുടർന്ന് കോശങ്ങളെ 60 മിനിറ്റ് സസ്പെൻഷനിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ഒരു കിണറിൽ 50,000 കോശങ്ങളുടെ സാന്ദ്രതയിൽ വിത്ത് നൽകുകയും ചെയ്തു. സംഗമത്തിനുശേഷം, കോശങ്ങളെ 5-10 ദിവസത്തേക്ക് അല്ലെങ്കിൽ സ്ഥിരതയുള്ള കോളനികൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതുവരെ ചികിത്സിച്ചു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ അക്യൂട്ട് hCO അണുബാധ 5 ചില പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, 100 µl നാഡി മീഡിയം അടങ്ങിയ 1.5 മില്ലി എപ്പെൻഡോർഫ് മൈക്രോസെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളിലേക്ക് 30-45 ദിവസം hCO മാറ്റുക. തുടർന്ന് ഏകദേശം 90 µl മീഡിയം നീക്കം ചെയ്യുകയും, 3-6 µl ഹൈ ടൈറ്റർ ലെന്റിവൈറസ് (0.5 x 108 മുതൽ 1.2 x 109 വരെ) ട്യൂബിലേക്ക് ചേർക്കുകയും, hCO 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്ററിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്യുന്നു. തുടർന്ന് ഓരോ ട്യൂബിലേക്കും 90–100 µl മീഡിയം ചേർത്ത് ട്യൂബുകൾ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്ററിലേക്ക് തിരികെ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. അടുത്ത ദിവസം, താഴ്ന്ന അറ്റാച്ച്മെന്റ് പ്ലേറ്റുകളിൽ hCO പുതിയ നാഡി മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റുക. 7 ദിവസത്തിനുശേഷം, ദൃശ്യവൽക്കരണത്തിനും അണുബാധയുടെ ഗുണനിലവാരം വിലയിരുത്തുന്നതിനുമായി hCO 24-വെൽ ഗ്ലാസ് അടിഭാഗത്തെ പ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് മാറ്റി. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE, pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE എന്നിവ വെക്ടർബിൽഡർ സൃഷ്ടിച്ചു. ലെന്റിവൈറസ് മിക്ക പരീക്ഷണങ്ങളിലും ഉപയോഗിക്കുന്നു, കാരണം ഇത് ഹോസ്റ്റ് ജീനോമിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് രോഗബാധിതമായ സെൽ ലൈനുകളിൽ റിപ്പോർട്ടർ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ അനുവദിക്കുന്നു. റാബിസ് തുടർനടപടികൾക്കായി, 30-45 ദിവസം hCO-യെ റാബിസ്-ΔG-eGFP, AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (പ്ലാസ്മിഡ് #67528, ആഡ്ജീൻ) എന്നിവയുമായി സഹ-ബാധിച്ചു, 3 ദിവസം നന്നായി കഴുകി, S1 ലെ എലികളിലേക്ക് പറിച്ചുനടുകയും 7-14 ദിവസം ഇൻ വിവോയിൽ സൂക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.
ഇമ്മ്യൂണോസൈറ്റോകെമിസ്ട്രിക്ക്, മൃഗങ്ങളെ അനസ്തേഷ്യ നൽകി ട്രാൻസ്കാർഡിയലി പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു, തുടർന്ന് 4% പാരാഫോർമാൽഡിഹൈഡ് (പിബിഎസിൽ പിഎഫ്എ; ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി സയൻസസ്) നൽകി. തലച്ചോറുകളെ 4% പിഎഫ്എയിൽ 2 മണിക്കൂർ അല്ലെങ്കിൽ രാത്രി മുഴുവൻ 4°C താപനിലയിൽ ഉറപ്പിച്ചു, പിബിഎസിൽ 30% സുക്രോസിൽ 48-72 മണിക്കൂർ ക്രയോപ്രിസർവ് ചെയ്തു, 1:1, 30% സുക്രോസിൽ ഉൾച്ചേർത്തു: ഒസിടി (ടിഷ്യു-ടെക് ഒസിടി കോമ്പൗണ്ട് 4583, സകുര ഫിനെടെക്), കൊറോണൽ സെക്ഷനുകൾ 30 µm ൽ ഒരു ക്രയോസ്റ്റാറ്റ് (ലൈക്ക) ഉപയോഗിച്ച് നിർമ്മിച്ചു. കട്ടിയുള്ള സെക്ഷനുകളുടെ ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രിക്ക്, മൃഗങ്ങളെ പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്തു, തലച്ചോറിനെ വിഘടിപ്പിച്ച് 300–400 µm ൽ ഒരു വൈബ്രറ്റോം (ലൈക്ക) ഉപയോഗിച്ച് കൊറോണലി സെക്ഷനാക്കി, വിഭാഗങ്ങളെ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 4% പിഎഫ്എ ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ചു. തുടർന്ന് ക്രയോസെക്ഷനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ കട്ടിയുള്ള ഭാഗങ്ങൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 1 മണിക്കൂർ തടഞ്ഞു (10% സാധാരണ ഡോങ്കി സെറം (NDS), 0.3% ട്രൈറ്റൺ X-100 PBS-ൽ ലയിപ്പിച്ചത്) 4°C-ൽ ബ്ലോക്കിംഗ് ലായനി ഉപയോഗിച്ച് തടഞ്ഞു. – ഇൻകുബേഷൻ ക്രയോസെക്ഷനുകൾ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും കട്ടിയുള്ള ഭാഗങ്ങൾ 5 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഉപയോഗിച്ച പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ഇവയായിരുന്നു: ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മൗസ്, 1:500; ab104224, abcam) ആന്റി-സിടിഐപി2 (എലി, 1:300; ab18465, abcam), ആന്റി-ജിഎഫ്എപി (മുയൽ, 1:1,000; Z0334, ഡാക്കോ), ആന്റി-ജിഎഫ്പി (ചിക്കൻ, 1:1,000; GTX13970, ജീൻടെക്സ്), ആന്റി-എച്ച്എൻഎ (മൗസ്, 1:200; ab191181, abcam), ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മുയൽ, 1:500; ABN78, മില്ലിപോർ), ആന്റി-പിഡിജിഎഫ്ആർഎ (മുയൽ, 1:200; sc-338, സാന്താക്രൂസ്), ആന്റി-പിപിപി1ആർ17 (മുയൽ, 1:200; HPA047819, അറ്റ്ലസ് ആന്റിബോഡികൾ), ആന്റി-ആർഇസിഎ-1 (മൗസ്, 1:50; ab9774, abcam), ആന്റി-SCG2 (മുയൽ, 1:100; 20357-1-AP, പ്രോട്ടീൻടെക്), ആന്റി-SOX9 (ആട്, 1:500; AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), നെറ്റ്രിൻ G1a (ആട്, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), ആന്റി-STEM121 (മൗസ്, 1:200; Y40410, തകര ബയോ), ആന്റി-SATB2 (മൗസ്, 1:50; ab51502, abcam), ആന്റി-GAD65/67 (മുയൽ, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ), ആന്റി-IBA1 (ആട്, 1:100; ab5076, abcam). ഉപയോഗിച്ച പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ഇവയായിരുന്നു: ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മൗസ്, 1:500; ab104224, abcam) ആന്റി-സിടിഐപി2 (എലി, 1:300; ab18465, abcam), ആന്റി-ജിഎഫ്എപി (മുയൽ, 1:1,000; Z0334, ഡാക്കോ), ആന്റി-ജിഎഫ്പി (ചിക്കൻ, 1:1,000; GTX13970, ജീൻടെക്സ്), ആന്റി-എച്ച്എൻഎ (മൗസ്, 1:200; ab191181, abcam), ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മുയൽ, 1:500; ABN78, മില്ലിപോർ), ആന്റി-പിഡിജിഎഫ്ആർഎ (മുയൽ, 1:200; sc-338, സാന്താക്രൂസ്), ആന്റി-പിപിപി1ആർ17 (മുയൽ, 1:200; HPA047819, അറ്റ്ലസ് ആന്റിബോഡികൾ), ആന്റി-ആർഇസിഎ-1 (മൗസ്, 1:50; ab9774, abcam), ആന്റി-SCG2 (മുയൽ, 1:100; 20357-1-AP, പ്രോട്ടീൻടെക്), ആന്റി-SOX9 (ആട്, 1:500; AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), നെറ്റ്രിൻ G1a (ആട്, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), ആന്റി-STEM121 (മൗസ്, 1:200; Y40410, തകര ബയോ), ആന്റി-SATB2 (മൗസ്, 1:50; ab51502, abcam), ആന്റി-GAD65/67 (മുയൽ, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ), ആന്റി-IBA1 (ആട്, 1:100; ab5076, abcam). അസ്‌പോൾസോവലിസ് സ്ലെഡുഷ്യൻ പെർവിച്നി ആൻറിറ്റെല: ആൻ്റി-ന്യൂൻ (മിഷിനി, 1:500; ab104224, abcam), ANTI,0CT11 ab18465, abcam), Anti-GFAP (ക്രോളിച്, 1:1000; Z0334, Dako), Anti- -GFP (കുറിഷ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ANTI:20, ab191181, abcam), Anti-NeuN (ക്രോളിക്, 1:500; ABN78, മില്ലിപോർ), Anti-PDGFRA (ക്രൊളിക്, 1:200; sc-338, സാൻ്റ-ക്രൂസ്), ANTI-PPP1R17 (ക്രൊളിക്, 1:500; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (മൈ, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (ക്രോളിക് , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ANT, 100 AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), NETRIN G1a (കോസി, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), Anti-STEM121 (മിഷിൻ , 1:200; Y40410, തകര ബയോ), ആൻ്റി-എസ്എടിബി2 (മൈ, 1:50; ab51502, abcam), AD65ти-7 1:400; ABN904, Millipore) കൂടാതെ Anti-IBA1 (കോസ, 1:100; AB5076, ABKAM). ഉപയോഗിച്ച പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ഇവയായിരുന്നു: ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മൗസ്, 1:500; ab104224, abcam), ആന്റി-സിടിഐപി2 (എലി, 1:300; ab18465, abcam), ആന്റി-ജിഎഫ്എപി (മുയൽ, 1:1000; Z0334, ഡാക്കോ), ആന്റി-ജിഎഫ്പി (ചിക്കൻ, 1:1000; GTX13970, ജീൻടെക്സ്), ആന്റി-എച്ച്എൻഎ (മൗസ്, 1:200; ab191181, abcam), ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മുയൽ, 1:500; ABN78, മില്ലിപോർ), ആന്റി-പിഡിജിഎഫ്ആർഎ (മുയൽ, 1:200; sc-338, സാന്താക്രൂസ്), ആന്റി-പിപിപി1ആർ17 (മുയൽ, 1:200; HPA047819, അറ്റ്ലസ് ആന്റിബോഡികൾ), ആന്റി-ആർഇസിഎ-1 (മൗസ്, 1:50; ab9774, abcam), ആന്റി- SCG2 (മുയൽ, 1:100; 20357-1-AP, പ്രോട്ടീൻടെക്), ആന്റി-SOX9 (ആട്, 1:500; AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), നെട്രിൻ G1a (ആട്, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), ആന്റി- STEM121 (മൗസ്, 1:200; Y40410, തകര ബയോ), ആന്റി- SATB2 (മൗസ്, 1:50; ab51502, abcam), ആന്റി- GAD65/67 (മുയൽ, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ), ആന്റി- IBA1 (ആട്, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN 00;ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡, 1: 1,000;GTX13970, GeneTex 81, abcam），抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore,，抗PDGFRA 1:200；sc-338, സാന്താ ക്രൂസ്, 抗PPP1R17（兔, 1:200;HPA047819, അറ്റ്ലസ്抗体）,抗RECA-1, 1:100;20357-1-AP,Proteintech）,抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,R&D സിസ്റ്റംസ്,Netrin G1a（山羊,1:100；AF116 സിസ്റ്റങ്ങൾ), 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN :300;ab18465,abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GFP (鸡, 1:1,000;GTX13970, GeneTex），抗HNA（小鼠, 1:200；ab 191181, abcam），抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, മില്ലിപോർ％弔,抗1: 200；sc-338, സാന്താ ക്രൂസ്, 抗PPP1R17 100;20357-1-AP, Proteintech），抗SOX9（山羊, 1:500；AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്）, Netrin G1a（山羊, 1:100；；AF1166, 1:100；AF1166Y40410, തകര ബയോ), ആന്റി-SATB2 (മൗസ്, 1:50; ab51502, abcam), ആന്റി-GAD65/67 (മുയൽ, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ), ആന്റി-IBA1 (ആട്, 1:100; ab5076, abcam).ഉപയോഗിച്ച പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികൾ ഇവയായിരുന്നു: ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മൗസ്, 1:500; ab104224, abcam), ആന്റി-സിടിഐപി2 (എലി, 1:300; ab18465, abcam), ആന്റി-ജിഎഫ്എപി (മുയൽ, 1:1000; Z0334, ഡാക്കോ). , ആന്റി-ജിഎഫ്‌പി (ചിക്കൻ, 1:1000; GTX13970, ജീൻടെക്സ്), ആന്റി-എച്ച്എൻഎ (മൗസ്, 1:200; ab191181, abcam), ആന്റി-ന്യൂഎൻ (മുയൽ, 1:500; ABN78, മില്ലിപോർ), ആന്റി-പിഡിജിഎഫ്ആർഎ (മുയൽ, 1:200; sc-338, സാന്താക്രൂസ്), ആന്റി-പിപിപി1ആർ17 (മുയൽ, 1:200; HPA047819, അറ്റ്ലസ് ആന്റിബോഡി), ആന്റി-ആർഇസിഎ-1 (മൗസ്, 1:50; ab9774, abcam), ആന്റി-എസ്‌സിജി2 (മുയൽ), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (കോസ, 1:500; AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), NETRIN G1a (കോസ, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), ANTI, 120; STEM121; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (മൈ, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (ക്രോളിക്, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ) и, 1:IBA10; ab5076, ABKAM). 20357-1-AP, പ്രോട്ടീൻടെക്), ആന്റി-SOX9 (ആട്, 1:500; AF3075, R&D സിസ്റ്റംസ്), നെട്രിൻ G1a (ആട്, 1:100; AF1166, R&D സിസ്റ്റംസ്), ആന്റി-STEM121 (മൗസ്, 1:200; Y40410, തകര ബയോ), ആന്റി-SATB2 (മൗസ്, 1:50; ab51502, abcam), ആന്റി-GAD65/67 (മുയൽ, 1:400; ABN904, മില്ലിപോർ), ആന്റി-IBA1 (ആട്, 1:100; ab5076, abkam).പിന്നീട് ഭാഗങ്ങൾ PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, മുറിയിലെ താപനിലയിൽ (ഫ്രോസൺ സെക്ഷനുകൾ) 1 മണിക്കൂർ അല്ലെങ്കിൽ 4°C (കട്ടിയുള്ള സെക്ഷനുകൾ) ഒരു രാത്രി മുഴുവൻ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ബ്ലോക്കിംഗ് ലായനിയിൽ 1:1000 എന്ന അനുപാതത്തിൽ നേർപ്പിച്ച അലക്സാ ഫ്ലൂവർ സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി (ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) ഉപയോഗിച്ചു. PBS ഉപയോഗിച്ച് കഴുകിയ ശേഷം, ന്യൂക്ലിയസുകൾ ഒരു ഹോച്ച്സ്റ്റ് 33258 (ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്) ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. ഒടുവിൽ, സ്ലൈഡുകൾ ഒരു അക്വാമൗണ്ട് (പോളിസയൻസസ്) ഉപയോഗിച്ച് കവർസ്ലിപ്പുകൾ (ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉള്ള ഒരു മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ സ്ഥാപിച്ചു, കൂടാതെ ചിത്രത്തിൽ ഒരു കീൻസ് ഫ്ലൂറസെന്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ (BZ-X അനലൈസർ) അല്ലെങ്കിൽ ഒരു ലെയ്ക TCS SP8 കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ (ലാസ്-എക്സ്) വിശകലനം ചെയ്തു. ഇമേജ്ജെ പ്രോഗ്രാം (ഫിജി) ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു. t-hCO യിലും എലി കോർട്ടെക്സിലും മനുഷ്യ ന്യൂറോണുകളുടെ അനുപാതം അളക്കുന്നതിന്, t-hCO യുടെ മധ്യഭാഗത്ത്, എലി കോർട്ടെക്സിന്റെ അരികിലോ സമീപത്തോ 387.5 μm വീതിയുള്ള ചതുരാകൃതിയിലുള്ള ചിത്രങ്ങൾ എടുത്തു. ടിഷ്യു സുതാര്യത, HNA+ ന്യൂക്ലിയുകൾ, കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ടിഷ്യു ഓട്ടോഫ്ലൂറസെൻസിന്റെ സാന്നിധ്യം എന്നിവയിലെ മാറ്റങ്ങൾ വിലയിരുത്തിയാണ് ഗ്രാഫ്റ്റ് മാർജിനുകൾ നിർണ്ണയിച്ചത്. ഓരോ ചിത്രത്തിലും, NeuN+, HNA+ കോശങ്ങളുടെ ആകെ എണ്ണം ഒരേ പ്രദേശത്തുള്ള NeuN+ കോശങ്ങളുടെ ആകെ എണ്ണം കൊണ്ട് ഹരിച്ചു. ഇമേജ് പ്ലെയിനിൽ ന്യൂക്ലിയസുകളുള്ള കോശങ്ങൾ മാത്രമേ കണക്കാക്കുന്നുള്ളൂ എന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ, Hoechst+ കോശങ്ങളും കണക്കുകൂട്ടലിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ പിശക് കുറയ്ക്കുന്നതിന് കുറഞ്ഞത് 1 മില്ലീമീറ്റർ കൊണ്ട് വേർതിരിച്ച രണ്ട് ചിത്രങ്ങൾ ശരാശരി കണക്കാക്കി.
സാമ്പിൾ ശേഖരിക്കുന്നതിന് ഒരു ആഴ്ച മുമ്പ്, hCO ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് മൃഗങ്ങളെ (ഏകദേശം 8 മാസത്തെ വ്യത്യാസം) ഇരുണ്ട മുറിയിൽ, സെൻസറി ഉത്തേജനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് മീശകൾ വെട്ടിമാറ്റി വയ്ക്കുക. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, ചില പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ, ന്യൂക്ലിയസുകളുടെ ഒറ്റപ്പെടൽ നടത്തി. ചുരുക്കത്തിൽ, ഡിറ്റർജന്റ്-മെക്കാനിക്കൽ സെൽ ലൈസിസും 2 മില്ലി ഗ്ലാസ് ടിഷ്യു ഗ്രൈൻഡറും (D8938, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്/കിംബിൾ) ഉപയോഗിച്ച് t-hCO, hCO എന്നിവ നശിപ്പിച്ചു. തുടർന്ന് അസംസ്കൃത ന്യൂക്ലിയസുകൾ 40 µm ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും സുക്രോസ് സാന്ദ്രത ഗ്രേഡിയന്റ് നടത്തുന്നതിന് മുമ്പ് 4 °C ൽ 320 ഗ്രാം താപനിലയിൽ 10 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ഘട്ടത്തിനുശേഷം (4°C ൽ 20 മിനിറ്റിന് 320 ഗ്രാം), സാമ്പിളുകൾ 0.2 യൂണിറ്റ് µl-1 RNase ഇൻഹിബിറ്റർ (40 u µl-1, AM2682, ആംബിയോൺ) ചേർത്ത് 0.04% BSA/PBS-ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും 40 µm ഫ്ലോ ഫിൽട്ടറിലൂടെ കടന്നുപോകുകയും ചെയ്തു. പിന്നീട് വേർപിരിഞ്ഞ ന്യൂക്ലിയസുകൾ 0.02% BSA അടങ്ങിയ PBS-ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത് ഒരു Chromium Single Cell 3′ ചിപ്പിലേക്ക് ലോഡ് ചെയ്തു (ഓരോ ലെയ്‌നിലും 8,000 സെല്ലുകൾ വീണ്ടെടുക്കുമെന്ന് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു). ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x Genomics) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് snRNA-seq ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കിയത്. ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x Genomics) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് snRNA-seq ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കിയത്. ബൈബ്ലിയോട്ടെകി snRNA-seq ബൈലി പ്രിഗൊറ്റോവ്ലെന്ы കൾ ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x ജീനോമിക്സ്). ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x Genomics) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് snRNA-seq ലൈബ്രറികൾ തയ്യാറാക്കിയത്. snRNA-seq 文库是使用Chromium സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM、ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x ജീനോമിക്സ്) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM、ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x ജീനോമിക്സ്) 制备的。 ബൈബ്ലിയോട്ടെക്കു snRNA-seq GOTOVILI с ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x ജീനോമിക്സ്). ക്രോമിയം സിംഗിൾ സെൽ 3′ GEM, ലൈബ്രറി & ജെൽ ബീഡ് കിറ്റ് v3 (10x Genomics) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് snRNA-seq ലൈബ്രറി തയ്യാറാക്കിയത്.വ്യത്യസ്ത സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള ലൈബ്രറികൾ അഡ്മെറ ഹെൽത്ത് നോവസെക് എസ് 4 (ഇല്ലുമിന)-ൽ പൂൾ ചെയ്യുകയും ക്രമപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു.
10x ജീനോമിക്സ് സെൽറേഞ്ചർ വിശകലന സോഫ്റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 6.1.2) ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ അനുമാന ന്യൂക്ലിയർ ബാർകോഡിനുമുള്ള ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ലെവലുകൾ കണക്കാക്കി. പ്രത്യേകിച്ചും, mkref കമാൻഡ് ഉപയോഗിച്ച് സൃഷ്ടിച്ച ഹ്യൂമൻ (GRCh38, എൻസെംബിൾ, പതിപ്പ് 98), റാറ്റ് (Rnor_6.0, എൻസെംബിൾ, പതിപ്പ് 100) റഫറൻസ് ജീനോമുകളുടെ സംയോജനവുമായി റീഡുകൾ പൊരുത്തപ്പെടുത്തി, –include-introns=TRUE കമാൻഡ് ഉപയോഗിച്ച് ക്വാണ്ടിറ്റേഷനിൽ ഇൻട്രോൺ മേഖലകളിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്ത റീഡിംഗുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു. t-hCO സാമ്പിളുകൾക്കായി, മാപ്പ് ചെയ്ത എല്ലാ റീഡുകളുടെയും കുറഞ്ഞത് 95% മനുഷ്യ ജീനോമുമായി പൊരുത്തപ്പെടണമെന്ന യാഥാസ്ഥിതിക ആവശ്യകതയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് മനുഷ്യ ന്യൂക്ലിയസുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞത്. R പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 4.1.2) Seurat (പതിപ്പ് 4.1.1)32 ഉപയോഗിച്ച് സെൽറേഞ്ചറിൽ നിന്നുള്ള ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ബാർകോഡ് അറേ ഔട്ട്‌പുട്ടിലാണ് തുടർന്നുള്ള എല്ലാ വിശകലനങ്ങളും നടത്തിയത്.
തുടർന്നുള്ള വിശകലനത്തിൽ ഉയർന്ന നിലവാരമുള്ള ന്യൂക്ലിയുകൾ മാത്രമേ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുള്ളൂ എന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ, ഓരോ സാമ്പിളിനും ഒരു ആവർത്തന ഫിൽട്ടറിംഗ് പ്രക്രിയ നടപ്പിലാക്കി. ആദ്യം, 1000-ൽ താഴെ അദ്വിതീയ ജീനുകൾ കണ്ടെത്തിയതും മൊത്തം മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയയുടെ 20%-ൽ കൂടുതലുള്ളതുമായ താഴ്ന്ന നിലവാരമുള്ള ന്യൂക്ലിയുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞ് നീക്കം ചെയ്യുന്നു. തുടർന്ന്, sctransform(vst.flavor=”v2″) ഫംഗ്ഷൻ ഉപയോഗിച്ച് റെഗുലറൈസ്ഡ് നെഗറ്റീവ് ബൈനോമിയൽ റിഗ്രഷൻ വഴി അസംസ്കൃത ജീൻ നമ്പർ മാട്രിക്സ് നോർമലൈസ് ചെയ്തു, ഇത് ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് 3000 ഏറ്റവും വേരിയബിൾ ജീനുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. പ്രിൻസിപ്പൽ കമ്പോണന്റ് അനാലിസിസ് (PCA) ഉപയോഗിച്ച് അപ്പർ വേരിയബിൾ ജീനുകളിൽ ഡൈമൻഷൻ റിഡക്ഷൻ നടത്തി, 30 എന്ന ഡാറ്റാ സെറ്റ് അളവ് ഉപയോഗിച്ച് ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ചു (dims = 30 മുട്ടുകുത്തിയ സ്ഥലങ്ങളുടെ ദൃശ്യ പരിശോധനയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി തിരഞ്ഞെടുത്തു, എല്ലാ സാമ്പിളുകൾക്കും സമന്വയ വിശകലനങ്ങൾക്കും ഉപയോഗിച്ചു). തുടർന്ന് അസാധാരണമായി കുറഞ്ഞ ജീൻ എണ്ണം (10-ാം ശതമാനത്തിൽ താഴെയുള്ള മീഡിയൻ), അസാധാരണമായി ഉയർന്ന മൈറ്റോകോൺ‌ഡ്രിയൽ ജീൻ എണ്ണം (95-ാം ശതമാനത്തിന് മുകളിലുള്ള മീഡിയൻ) എന്നിവ അടിസ്ഥാനമാക്കി ജീനുകളെ തരംതിരിക്കുന്നതിന് ഞങ്ങൾ നിരവധി റൗണ്ട് ആവർത്തന ക്ലസ്റ്ററിംഗ് (റെസല്യൂഷൻ = 1) നടത്തി. കുറഞ്ഞ നിലവാരമുള്ള പുട്ടേറ്റീവ് സെല്ലുകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനും നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനും. ക്ലസ്റ്ററുകളും/അല്ലെങ്കിൽ DoubletFinder33 പാക്കേജ് ഉപയോഗിച്ച് തിരിച്ചറിഞ്ഞ സംശയിക്കപ്പെടുന്ന ഇരട്ടകളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതവും (95-ാം ശതമാനത്തിന് മുകളിലുള്ള ശരാശരി DoubletFinder സ്കോർ). t-hCO സാമ്പിളുകൾ (n=3), hCO സാമ്പിളുകൾ (n=3) എന്നിവ വെവ്വേറെ സംയോജിപ്പിച്ചു. മുകളിൽ പറഞ്ഞ പാരാമീറ്ററുകളുമായി ഇന്റഗ്രേറ്റ് ഡാറ്റ ഫംഗ്ഷൻ. തുടർന്ന് മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ ഇന്റഗ്രേറ്റഡ് ഡാറ്റ സെറ്റിന്റെ ഗുണപരമായ ഫിൽട്ടറിംഗിന്റെ മറ്റൊരു റൗണ്ട് നടത്തി.
കുറഞ്ഞ നിലവാരമുള്ള കേർണലുകൾ നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം, സംയോജിത ഡാറ്റാസെറ്റ് ഗ്രൂപ്പുചെയ്‌തു (റെസല്യൂഷൻ = 0.5) UMAP34 വിഷ്വലൈസേഷൻ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ഉൾച്ചേർത്തു. നോർമലൈസ് ചെയ്ത ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കിയ ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച് FindMarkers ഫംഗ്ഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഓരോ ക്ലസ്റ്ററിനുമുള്ള മാർക്കർ ജീനുകൾ നിർണ്ണയിച്ചു. മാർക്കർ ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ 19,20,21,35, അനോട്ടേഷൻ എന്നിവയുമായി ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെയും മുതിർന്നവരുടെയും കോർട്ടിക്കൽ റഫറൻസ് ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ സംയോജിപ്പിച്ച് ഞങ്ങൾ പ്രധാന സെൽ ക്ലാസുകളെ തിരിച്ചറിയുകയും തരംതിരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. പ്രത്യേകിച്ചും, MKI67, TOP2A എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ വഴി രക്തചംക്രമണ മുൻഗാമികളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. മൈറ്റോട്ടിക് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ അഭാവം, വൈകി മെറ്റാഫേസ് ഫെറ്റൽ കോർട്ടെക്സിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന മൾട്ടിപോട്ടന്റ് ഗ്ലിയൽ പ്രൊജെനിറ്റർ ക്ലസ്റ്ററുകളുമായുള്ള ഉയർന്ന ഓവർലാപ്പ്, EGFR, OLIG1 എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവയാൽ പ്രോജെനിറ്റർ ക്ലസ്റ്ററുകൾ നിർവചിക്കപ്പെട്ടു. വൈകി റേഡിയൽ ഗ്ലിയ മുതൽ ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളുടെ പക്വത വരെയുള്ള ആസ്ട്രോസൈറ്റ് വ്യത്യാസത്തിന്റെ നിരവധി അവസ്ഥകളെ ഉൾക്കൊള്ളാൻ ഞങ്ങൾ ആസ്ട്രോസൈറ്റ് എന്ന പദം ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആസ്ട്രോസൈറ്റ് ക്ലസ്റ്ററുകൾ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള SLC1A3, AQP4 എന്നിവ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ റേഡിയൽ ഗ്ലിയയുടെയും/അല്ലെങ്കിൽ മുതിർന്നവരുടെ ആസ്ട്രോസൈറ്റുകളുടെയും ഉപവിഭാഗങ്ങളുമായി മാപ്പ് ചെയ്യുന്നതായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. OPC-കൾ PDGFRA, SOX10 എന്നിവ പ്രകടിപ്പിക്കുമ്പോൾ ഒലിഗോഡെൻഡ്രോസൈറ്റുകൾ മയലിനേഷൻ മാർക്കറുകൾ (MOG, MYRF) പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു. ന്യൂറോണൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകളുടെ (SYT1, SNAP25) സാന്നിധ്യം, GABAergic മാർക്കറുകളുടെ (GAD2) അഭാവം, NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, അല്ലെങ്കിൽ SATB2 എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ എന്നിവയിലൂടെ ഗ്ലൂട്ടാമറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു. ഗ്ലൂഎൻ ന്യൂറോണുകളെ അപ്പർ (SATB2 എക്സ്പ്രഷനും BCL11B യുടെ നഷ്ടവും) ആഴത്തിലുള്ള (BCL11B എക്സ്പ്രഷനും) ഉപവിഭാഗങ്ങളായി വീണ്ടും വിഭജിച്ചു. പുട്ടേറ്റീവ് സബ്പ്ലേറ്റ് (SP) ന്യൂറോണുകൾ ആഴത്തിലുള്ള ഗ്ലൂഎൻ മാർക്കറുകൾക്ക് പുറമേ ST18, SORCS1 പോലുള്ള അറിയപ്പെടുന്ന SP18 മാർക്കറുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു. കോറോയിഡ് പ്ലെക്സസ് പോലുള്ള കോശങ്ങളെ TTR എക്സ്പ്രഷൻ വഴി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, മെനിഞ്ചിയൽ പോലുള്ള കോശങ്ങളെ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ്-അസോസിയേറ്റഡ് ജീനുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും റഫറൻസ് ഡാറ്റ സെറ്റിന്റെ പിയൽ/വാസ്കുലർ സെല്ലുകൾ മാപ്പ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
ലിബ്ര ആർ പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 1.0.0) ഉപയോഗിച്ച് നടപ്പിലാക്കിയ സാമ്പിളുകളിൽ പുനർനിർമ്മിച്ച പുതുതായി വികസിപ്പിച്ച ഒരു സ്യൂഡോ-ബാച്ച് രീതി ഉപയോഗിച്ച് t-hCO, hCO ഉപവിഭാഗങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള ജീൻ എക്സ്പ്രഷന്റെ ഡിഫറൻഷ്യൽ വിശകലനം നടത്തി. പ്രത്യേകിച്ചും, ഓരോ സാമ്പിൾ റെപ്ലിക്കേഷനും നൽകിയിരിക്കുന്ന സെൽ ക്ലാസിനായി സെല്ലുകളിലെ ജീനുകളുടെ എണ്ണം സംഗ്രഹിച്ചുകൊണ്ട് ഗ്രൂപ്പുകൾക്കായി edgeR ലോഗ്-സാധ്യതാ പരിശോധനകൾ (പതിപ്പ് 3.36.0, പാക്കേജ് R) നടത്തി. ഹീറ്റ്മാപ്പ് വിഷ്വലൈസേഷനായി, edgeR (cpm() ഫംഗ്ഷൻ) ഉപയോഗിച്ച് നോർമലൈസ്ഡ് പെർ മില്യൺ (CPM) മൂല്യങ്ങൾ കണക്കാക്കുകയും സ്കെയിൽ ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു (ശരാശരി = 0 നേടാൻ, സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ = 1). ഗണ്യമായി അപ്‌ഗ്രേഡ് ചെയ്ത t-hCO GluN ജീനുകളുടെ ജീൻ ഒന്റോളജി (GO) സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം നടത്തി (ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ് t-hCO GluN സെല്ലുകളുടെ കുറഞ്ഞത് 10% ൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന 0.05 ൽ താഴെയുള്ള P മൂല്യം തിരുത്തി, കുറഞ്ഞത് 2 തവണയെങ്കിലും മാറ്റത്തിൽ വർദ്ധനവ്). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി. ഞങ്ങൾ ഡിഫോൾട്ട് പാരാമീറ്ററുകളുള്ള ToppFun ആപ്പ് ഉപയോഗിക്കുകയും GO-അനോട്ടേറ്റഡ് ഹൈപ്പർജിയോമെട്രിക് ടെസ്റ്റുകളിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കിയ ബെഞ്ചമിനി-ഹോച്ച്ബർഗ്-തിരുത്തപ്പെട്ട പി-മൂല്യങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.
പ്രൈമറി സിംഗിൾ-സെൽ RNA-seq അല്ലെങ്കിൽ മുതിർന്ന snRNA-seq19,20,21,22 എന്നിവയുടെ റഫറൻസ് പഠനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള വ്യാഖ്യാനിച്ച സെൽ ക്ലസ്റ്ററുകളുമായി ഞങ്ങളുടെ snRNA-seq ക്ലസ്റ്ററുകളെ പൊരുത്തപ്പെടുത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ ഒരു ജോടിയാക്കിയ ഡാറ്റാസെറ്റ് ഇന്റഗ്രേഷൻ സമീപനം പ്രയോഗിച്ചു. ഡാറ്റാസെറ്റുകൾക്കിടയിലുള്ള ക്ലസ്റ്റർ ഓവർലാപ്പുകൾ സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിനും താരതമ്യം ചെയ്യുന്നതിനും ഞങ്ങൾ Seurat-ൽ SCTransform (v2) നോർമലൈസേഷൻ വർക്ക്ഫ്ലോ ഉപയോഗിച്ചു (മുകളിലുള്ള അതേ പാരാമീറ്ററുകൾ ഉപയോഗിച്ച്). കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ കാര്യക്ഷമതയ്ക്കായി വ്യക്തിഗത ഡാറ്റാസെറ്റുകളെ ക്രമരഹിതമായി 500 സെല്ലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഒരു യഥാർത്ഥ ക്ലസ്റ്ററിന് കോറുകൾ വരെ ഉപവിഭാഗമാക്കി. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ സമാനമായ ഒരു സമീപനം ഉപയോഗിച്ച്, റഫറൻസ് ക്ലസ്റ്ററിന്റെ ലേബലുമായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്ത ഓരോ പൂൾ ചെയ്ത ക്ലസ്റ്ററിലെയും സെല്ലുകളുടെയോ ന്യൂക്ലിയസുകളുടെയോ അനുപാതമായി ക്ലസ്റ്റർ ഓവർലാപ്പ് നിർവചിച്ചു. GluN-കളെ കൂടുതൽ തരംതിരിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങളുടെ GluN സെല്ലുകൾക്ക് റഫറൻസ് ഡാറ്റാസെറ്റ് ലേബലുകൾ നൽകുന്നതിന് GluN സബ്സെറ്റ് ഡാറ്റയ്ക്കായി Seurat-ന്റെ TransferData വർക്ക്ഫ്ലോ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.
t-hCO, hCO സാമ്പിളുകളുടെ ആഗോള ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോമിന്റെ പക്വത നില വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഞങ്ങളുടെ സ്യൂഡോ-ബൾക്ക് സാമ്പിളുകളെ BrainSpan/psychENCODE23 മായി താരതമ്യം ചെയ്തു, അതിൽ മനുഷ്യന്റെ മസ്തിഷ്ക വികാസത്തിൽ വ്യാപിച്ചുകിടക്കുന്ന ഒരു വലിയ RNA ശ്രേണി അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. ഗർഭധാരണത്തിന് 10 ആഴ്ചകൾക്കുശേഷം കോർട്ടിക്കൽ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്നുള്ള ഒരു സംയോജിത പാറ്റേൺ-നോർമലൈസ് ചെയ്ത ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ മാട്രിക്സിൽ ഞങ്ങൾ PCA നടത്തി, പിന്നീട്, ബ്രെയിൻസ്പാൻ കോർട്ടിക്കൽ സാമ്പിളുകളിൽ സജീവമാണെന്ന് മുമ്പ് തിരിച്ചറിഞ്ഞ 5567 ജീനുകളിൽ (ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റയോടൊപ്പം) (ഒരു ക്യൂബിക് മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് പ്രായം അനുസരിച്ച് വിശദീകരിച്ച വികസന വ്യതിയാനത്തിൽ 50% ൽ കൂടുതൽ എന്ന് നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നു) 38. കൂടാതെ, മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ നോൺ-നെഗറ്റീവ് മാട്രിക്സ് ഫാക്ടറൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ന്യൂറോ ഡെവലപ്മെന്റിന്റെ പ്രധാന ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റോം സിഗ്നേച്ചറുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ജീനുകൾ ഞങ്ങൾ ഉരുത്തിരിഞ്ഞു. നോൺ-നെഗറ്റീവ് മാട്രിക്സ് ഫാക്ടറൈസേഷൻ നടപടിക്രമം ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കിയ സാമ്പിൾ വെയ്റ്റുകൾ ചിത്രം 5b-യിൽ Zhu et al.38 വിവരിച്ച അഞ്ച് ഒപ്പുകളിൽ ഓരോന്നിനും വികസിപ്പിച്ച ഡാറ്റ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലോട്ട് ചെയ്തിരിക്കുന്നു. വീണ്ടും, മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച പഠനങ്ങളിൽ നിന്നാണ് പ്രവർത്തനത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ മാർക്കറുകൾ ഉരുത്തിരിഞ്ഞത്. പ്രത്യേകിച്ച്, സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 3 Hrvatin et al.16-ൽ നിന്നുള്ള വിഷ്വൽ സ്റ്റിമുലേഷനുശേഷം മൗസ് വിഷ്വൽ കോർട്ടെക്സ് snRNA-seq ശേഖരം തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റർജിക് ന്യൂറോണുകളിൽ ERG, LRG എന്നിവ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു. KCl-ആക്ടിവേറ്റഡ് ഹ്യൂമൻ ഗര്ഭപിണ്ഡ ബ്രെയിൻ കൾച്ചറുകളിൽ നിന്ന് മനുഷ്യ-സമ്പുഷ്ടമായ LRG-കൾ ലഭിച്ചു, ഉത്തേജനത്തിന് 6 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് വിളവെടുത്തു, കൂടാതെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ജീനുകൾ മനുഷ്യരിൽ ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു, പക്ഷേ എലികളിൽ അല്ല (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 4). ഈ ജീൻ സെറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ജീൻ സെറ്റ് സമ്പുഷ്ടീകരണത്തിന്റെ വിശകലനം ഒരു വൺ-വേ ഫിഷേഴ്‌സ് എക്‌സ്‌യാക്ട് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി.
എലികളെ ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ ചെയ്യുക, തലച്ചോറുകൾ നീക്കം ചെയ്യുക, തണുത്ത (ഏകദേശം 4°C) ഓക്സിജൻ അടങ്ങിയ (95% O2 ഉം 5% CO2 ഉം) സുക്രോസ് ലായനിയിൽ വയ്ക്കുക, അതിൽ 234 mM സുക്രോസ്, 11 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ഉം 0.5 mM CaCl2 (ഏകദേശം 310 mOsm) ഉം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ t-hCO അടങ്ങിയ എലികളുടെ തലച്ചോറിന്റെ കൊറോണൽ വിഭാഗങ്ങൾ (300–400 µm) ഒരു ലൈക്ക VT1200 വൈബ്രറ്റോം ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചത്39. തുടർന്ന് സെക്ഷനുകൾ തുടർച്ചയായ മുറിയിലെ താപനില ഓക്സിജനേഷൻ ഉള്ള ഒരു സെക്ഷനിംഗ് ചേമ്പറിലേക്ക് മാറ്റി, ഇതിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കിയത്: 10 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 126 mM NaCl (298 mOsm). റെക്കോർഡിംഗിന് കുറഞ്ഞത് 45 മിനിറ്റ് മുമ്പ്. സെക്ഷനുകൾ ഒരു മുക്കിയ ചേമ്പറിൽ റെക്കോർഡുചെയ്‌തു, അവിടെ അവ തുടർച്ചയായി aCSF (95% O2, 5% CO2 വയൽ) ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്‌തു. എല്ലാ ഡാറ്റയും മുറിയിലെ താപനിലയിൽ രേഖപ്പെടുത്തി. 127 mM പൊട്ടാസ്യം ഗ്ലൂക്കോണേറ്റ്, 8 mM NaCl, 4 mM മഗ്നീഷ്യം ATP, 0.3 mM സോഡിയം GTP, 10 mM HEPES, 0.6 mM EGTA, pH 7.2 എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ലായനി നിറച്ച ബോറോസിലിക്കേറ്റ് ഗ്ലാസ് പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് t-hCO ന്യൂറോണുകൾ അവസാനിപ്പിച്ചു, KOH (290 mOsm) ഉപയോഗിച്ച് ക്രമീകരിച്ച ആന്തരിക ലായനി. വീണ്ടെടുക്കുന്നതിനായി, റെക്കോർഡിംഗ് ലായനിയിൽ ബയോസൈറ്റിൻ (0.2%) ചേർത്തു.
മൾട്ടിക്ലാമ്പ് 700B ആംപ്ലിഫയർ (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ), ഡിജിഡാറ്റ 1550B ഡിജിറ്റൈസർ (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ നേടി, 2 kHz-ൽ ലോ-പാസ് ഫിൽട്ടർ ചെയ്‌തു, 20 kHz-ൽ ഡിജിറ്റൈസ് ചെയ്‌തു, കൂടാതെ Clampfit (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ), Origin (OriginPro) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. 2021b, OriginLab). കസ്റ്റം MATLAB ഫംഗ്‌ഷനുകൾ (Mathworks) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. JPCalc ഉപയോഗിച്ച് ജംഗ്ഷൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ കണക്കാക്കി, എൻട്രികൾ -14 mV യുടെ കണക്കാക്കിയ മൂല്യത്തിലേക്ക് ക്രമീകരിച്ചു. ഓപ്പറേഷൻ IV-ൽ -250 മുതൽ 750 pA വരെയുള്ള 10-25 pA ഘട്ടങ്ങളിലായി നിലവിലെ ഘട്ടങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പര അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ, hCO ന്യൂറോണുകളുടെ പാച്ച്-ക്ലാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗിനിടെ, തലമോകോർട്ടിക്കൽ സ്ലൈസുകളിൽ തലാമസ്, വൈറ്റ് മാറ്റർ, S1 അഫെറന്റുകൾ എന്നിവ വൈദ്യുതമായി ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെട്ടു. ചുരുക്കത്തിൽ, തലച്ചോറിനെ 10° കോണിൽ ചരിഞ്ഞ ഒരു 3D പ്രിന്റിംഗ് ടേബിളിൽ സ്ഥാപിച്ചു, തലച്ചോറിന്റെ മുൻഭാഗം 35° കോണിൽ മുറിച്ചു. തുടർന്ന് തലച്ചോറിനെ മുറിച്ച പ്രതലത്തിൽ ഒട്ടിച്ചു, തലമോകോർട്ടിക്കൽ നീണ്ടുനിൽക്കുന്ന ആക്സോണുകൾ സംരക്ഷിച്ചുകൊണ്ട് വിഭജിച്ചു. ബൈപോളാർ ടങ്സ്റ്റൺ ഇലക്ട്രോഡുകൾ (0.5 MΩ) രണ്ടാമത്തെ മൈക്രോമാനിപുലേറ്ററിൽ ഘടിപ്പിച്ച് ഓരോ സെല്ലിനും നാല് മേഖലകളെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിനായി തന്ത്രപരമായി സ്ഥാപിച്ചു (ഇൻനർ കാപ്സ്യൂൾ, വൈറ്റ് മാറ്റർ, S1, hCO). 0.03–0.1 Hz-ൽ 300 µA ഫാസിക് ഉത്തേജനത്തിന് ശേഷം സിനാപ്റ്റിക് പ്രതികരണങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തുക.
hChR2-പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന hCO ന്യൂറോണുകൾ 480 nm-ൽ സജീവമാക്കി, ഒരു LED (Prizmatix) ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന പ്രകാശ പൾസുകൾ ×40 ഒബ്ജക്റ്റീവ് (0.9 NA; ഒളിമ്പസ്) വഴി പ്രയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾക്ക് സമീപം hChR2 എക്സ്പ്രഷൻ രേഖപ്പെടുത്തി. പ്രകാശിത ഫീൽഡ് വ്യാസം ഏകദേശം 0.5 mm ആണ്, മൊത്തം പവർ 10-20 mW ആണ്. പൾസ് വീതി 10 ms ആയി സജ്ജീകരിച്ചു, ഇത് പെരുമാറ്റ പഠന പരീക്ഷണ സമയത്ത് നൽകിയ പൾസുമായി യോജിക്കുന്നു. 1 മുതൽ 20 Hz വരെയുള്ള വിവിധ ഉത്തേജന ആവൃത്തികൾ ഉപയോഗിച്ചു, എന്നാൽ ശ്രേണിയിലെ ആദ്യ പൾസ് മാത്രമാണ് അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചത്. സിനാപ്റ്റിക് ഇൻഹിബിറ്ററി അല്ലെങ്കിൽ സുഗമമാക്കുന്ന പാതകളിലെ പ്രഭാവം കുറയ്ക്കുന്നതിന് ട്രെയിനുകൾക്കിടയിലുള്ള ഇടവേളകൾ സാധാരണയായി 30 സെക്കൻഡിൽ കൂടുതലാണ്. hChR2 പ്രതികരണം മോണോസിനാപ്റ്റിക് ആണോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, EPSC പ്രതികരണം അപ്രത്യക്ഷമാകുന്നതുവരെ ഞങ്ങൾ TTX (1 μM) ബാത്തിൽ പ്രയോഗിച്ചു, തുടർന്ന് 4-അമിനോപിരിഡിൻ (4-AP; 100 μM) പ്രയോഗിച്ചു. സാധാരണയായി, LED ഫയറിംഗിനും EPSC ജനറേഷനും ഇടയിൽ അൽപ്പം കൂടുതൽ കാലതാമസത്തോടെ, കുറച്ച് മിനിറ്റുകൾക്കുള്ളിൽ ഒരു പ്രതികരണം തിരികെ ലഭിക്കും. പ്രതികരണം AMPA റിസപ്റ്ററുകളാൽ നയിക്കപ്പെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ NBQX (10 μM) ഉപയോഗിച്ചു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ മൂർച്ചയുള്ള hCO വിഭാഗങ്ങൾ സൃഷ്ടിച്ചു. ചുരുക്കത്തിൽ, hCO വിഭാഗങ്ങൾ 4% അഗറോസിൽ ഉൾച്ചേർത്ത് 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, 10 mM d-(+) -ഗ്ലൂക്കോസ് എന്നിവ അടങ്ങിയ കോശങ്ങളിലേക്ക് മാറ്റി. ലെയ്‌ക VT1200 വൈബ്രേറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 200–300 µm-ൽ മുറിച്ച് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ASF-ൽ സൂക്ഷിച്ചു. തുടർന്ന്, നേരിട്ടുള്ള സ്ലൈസ്‌കോപ്പ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പിന് (സയന്റിഫിക്ക) കീഴിൽ hCO വിഭാഗങ്ങളിൽ മുഴുവൻ കോശങ്ങളുടെയും പാച്ച്-ക്യാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗ് നടത്തി. വിഭാഗങ്ങൾ aCSF (95% O2 ഉം 5% CO2 ഉം) ഉപയോഗിച്ച് പെർഫ്യൂസ് ചെയ്യുകയും മുറിയിലെ താപനിലയിൽ സെൽ സിഗ്നലുകൾ രേഖപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്തു. 127 mM പൊട്ടാസ്യം ഗ്ലൂക്കോണേറ്റ്, 8 mM NaCl, 4 mM മഗ്നീഷ്യം ATP, 0.3 mM സോഡിയം GTP, 10 mM HEPES, 0.6 mM EGTA, ആന്തരിക pH 7, 2 എന്നിവ അടങ്ങിയ ലായനി നിറച്ച ബോറോസിലിക്കേറ്റ് ഗ്ലാസ് പൈപ്പറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് hCO ന്യൂറോണുകൾ പ്രയോഗിച്ചു, KOH (ഓസ്‌മോലാരിറ്റി 290) ഉപയോഗിച്ച് ക്രമീകരിച്ചു. വീണ്ടെടുക്കൽ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി, ആന്തരിക ലായനിയിൽ 0.2% ബയോസൈറ്റിൻ ചേർക്കുക.
മൾട്ടിക്ലാമ്പ് 700B ആംപ്ലിഫയർ (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ), ഡിജിഡാറ്റ 1550B ഡിജിറ്റൈസർ (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ക്ലാമ്പെക്സ് (ക്ലാമ്പെക്സ് 11.1, മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ) ഡാറ്റ നേടി, 2 kHz-ൽ ലോ-പാസ് ഫിൽട്ടർ ചെയ്തു, 20 kHz-ൽ ഡിജിറ്റൈസ് ചെയ്തു, വിശകലനം, മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ, ഇഷ്ടാനുസൃത MATLAB ഫംഗ്ഷനുകൾ എന്നിവയ്ക്കായി ക്ലാമ്പ്ഫിറ്റ് (പതിപ്പ് 10.6) ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു (MATLAB 2019b, Mathworks). JPCalc ഉപയോഗിച്ച് ജംഗ്ഷൻ പൊട്ടൻഷ്യൽ കണക്കാക്കി, എൻട്രികൾ -14 mV യുടെ കണക്കാക്കിയ ജംഗ്ഷൻ പൊട്ടൻഷ്യലിലേക്ക് ക്രമീകരിച്ചു. ഓപ്പറേഷൻ IV-ൽ -50 മുതൽ 250 pA വരെയുള്ള 5-10 pA ഘട്ടങ്ങളിലായി നിലവിലെ ഘട്ടങ്ങളുടെ ഒരു പരമ്പര അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.
പിഞ്ച് ചെയ്ത ന്യൂറോണുകളുടെ രൂപാന്തര പുനർനിർമ്മാണത്തിനായി, ആന്തരിക ലായനിയിൽ 0.2% ബയോസൈറ്റിൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) ചേർത്തു. ഹാക്കിംഗിന് ശേഷം കോശങ്ങൾ കുറഞ്ഞത് 15 മിനിറ്റെങ്കിലും പ്രൈം ചെയ്യുന്നു. രജിസ്റ്റർ ചെയ്ത മെംബ്രൺ പൂർണ്ണമായും സീൽ ചെയ്യുന്നതുവരെ പൈപ്പറ്റ് 1-2 മിനിറ്റ് സാവധാനം വലിച്ചെടുക്കുന്നു. സെക്ഷൻ ഫിസിയോളജി നടപടിക്രമത്തെത്തുടർന്ന്, ഭാഗങ്ങൾ രാത്രി മുഴുവൻ 4° C ൽ ഉറപ്പിച്ചു. 4% PFA-യിൽ, PBS X3 ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, സ്ട്രെപ്റ്റാവിഡിൻ-കൺജഗേറ്റഡ് ഡൈലൈറ്റ് 549 അല്ലെങ്കിൽ ഡൈലൈറ്റ് 405 (വെക്റ്റർ ലാബ്സ്) ഉപയോഗിച്ച് 1:1000 എന്ന അനുപാതത്തിൽ നേർപ്പിച്ചു. ബയോസൈറ്റിൻ (2%; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്) നിറച്ച സെല്ലുകൾ 2 മണിക്കൂർ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ പാച്ച് ക്ലാമ്പ് റെക്കോർഡിംഗ് സമയത്ത് ലേബൽ ചെയ്തു. തുടർന്ന് ഒരു അക്വാമൗണ്ട് (തെർമോ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോസ്കോപ്പി സ്ലൈഡുകളിൽ വിഭാഗങ്ങൾ മൌണ്ട് ചെയ്യുകയും അടുത്ത ദിവസം ഒരു ലെയ്ക TCS SP8 കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ എണ്ണ ഇമ്മേഴ്ഷൻ ഒബ്ജക്റ്റീവ് ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു. സാമ്പിൾ നിരക്ക് ഒരു മൈക്രോണിന് ഏകദേശം 7 പിക്സലുകൾ ആണ്. 1 µm ഇടവേളകളിൽ Z-സ്റ്റാക്കുകൾ സീരിയലായി ലഭിച്ചു, ഓരോ ന്യൂറോണിന്റെയും മുഴുവൻ ഡെൻഡ്രിറ്റിക് ട്രീയും ഉൾക്കൊള്ളുന്നതിനായി z-സ്റ്റാക്ക് മൊസൈക്കുകളും ലൈക്ക അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഓട്ടോ-സ്റ്റിച്ചിംഗും നടത്തി. തുടർന്ന് ന്യൂട്യൂബ് 40 ഇന്റർഫേസ് ഉപയോഗിച്ച് ന്യൂറോണുകളെ സെമി-മാനുവലായി ട്രാക്ക് ചെയ്യുകയും SWC ഫയലുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്തു. തുടർന്ന് ഫയലുകൾ SimpleNeuriteTracer41 ഫിജി പ്ലഗിനിലേക്ക് അപ്‌ലോഡ് ചെയ്തു (ImageJ, പതിപ്പ് 2.1.0; NIH).
സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റിയിലെ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂഷണൽ റിവ്യൂ ബോർഡ് അംഗീകരിച്ച ഒരു പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്, അറിവോടെയുള്ള സമ്മതത്തോടെയാണ് മനുഷ്യ കോർട്ടിക്കൽ ടിഷ്യു ലഭിച്ചത്. റിഫ്രാക്റ്ററി അപസ്മാരത്തിനുള്ള ശസ്ത്രക്രിയയുടെ ഭാഗമായി ഫ്രണ്ടൽ കോർട്ടെക്സ് (മിഡിൽ ഫ്രന്റൽ ഗൈറസ്) മുറിച്ചാണ് 3 ഉം 18 ഉം വയസ്സുള്ള മനുഷ്യ പ്രസവാനന്തര ടിഷ്യുവിന്റെ രണ്ട് സാമ്പിളുകൾ എടുത്തത്. മുറിച്ചതിനുശേഷം, ഐസ്-കോൾഡ് NMDG-aCSF-ൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ടിഷ്യു വിളവെടുക്കുക: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ഗ്ലൂക്കോസ്, 2 mM തയോറിയ, 5 mM സോഡിയം അസ്കോർബേറ്റ്, 3 mM സോഡിയം പൈറുവേറ്റ്, 0.5 mM CaCl2 4H2O, 10 mM MgSO4 7H2O. സാന്ദ്രീകൃത ഹൈഡ്രോക്ലോറിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് pH 7.3-7.4 ആയി ടൈട്രേറ്റ് ചെയ്യുക. മുകളിൽ വിവരിച്ച നടപടിക്രമമനുസരിച്ച് 30 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ടിഷ്യുകൾ ലബോറട്ടറിയിൽ എത്തിക്കുകയും കൊറോണൽ സെക്ഷനുകൾ എടുക്കുകയും ചെയ്തു.
സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി APLAC അംഗീകരിച്ച മൃഗസംരക്ഷണ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് എല്ലാ മൃഗ നടപടിക്രമങ്ങളും നടത്തിയത്. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷന് ശേഷം 140 ദിവസത്തിൽ കൂടുതൽ പ്രായമുള്ള എലികളെ 5% ഐസോഫ്ലൂറേൻ അനസ്തേഷ്യ ഉപയോഗിച്ച് പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്കിടെ 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകുകയും ചെയ്തു. മൃഗങ്ങളെ ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഫ്രെയിമിൽ (Kopf) സ്ഥാപിക്കുകയും സുസ്ഥിര റിലീസ് ബ്യൂപ്രെനോർഫിൻ (SR) സബ്ക്യുട്ടേനിയസായി കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. തലയോട്ടി തുറന്നുകാണിക്കുകയും വൃത്തിയാക്കുകയും 3-5 ബോൺ സ്ക്രൂകൾ തിരുകുകയും ചെയ്യുന്നു. t-hCO ലക്ഷ്യമിടാൻ, MRI ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് കോർഡിനേറ്റുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു. താൽപ്പര്യമുള്ള സ്ഥലത്ത് ഒരു ബർ ഹോൾ തുരന്നു, നാരുകൾ (400 µm വ്യാസം, NA 0.48, ഡോറിക്) hCO ഉപരിതലത്തിൽ നിന്ന് 100 µm താഴെ താഴ്ത്തി UV- ക്യൂറബിൾ ഡെന്റൽ സിമന്റ് (Relyx) ഉപയോഗിച്ച് തലയോട്ടിയിൽ ഉറപ്പിച്ചു.
മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഫൈബർ ഫോട്ടോമെട്രിക് റെക്കോർഡിംഗുകൾ നടത്തി42. സ്വയമേവയുള്ള പ്രവർത്തനം രേഖപ്പെടുത്തുന്നതിനായി, എലികളെ ഒരു വൃത്തിയുള്ള കൂട്ടിൽ വയ്ക്കുകയും ഫൈബർ ഒപ്റ്റിക് ഫോട്ടോമെട്രിക് ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സിസ്റ്റവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച 400 µm വ്യാസമുള്ള ഫൈബർ ഒപ്റ്റിക് പാച്ച് കേബിൾ (ഡോറിക്) ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്ത ഫൈബർ ഒപ്റ്റിക് കേബിളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. മോട്ടോർ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 10 മിനിറ്റ് റെക്കോർഡിംഗിനിടെ, മൃഗങ്ങൾക്ക് കൂട്ടിൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ സ്വാതന്ത്ര്യമുണ്ടായിരുന്നു. ഉത്തേജിത പ്രവർത്തനം രേഖപ്പെടുത്താൻ, എലികളെ (ട്രാൻസ്പ്ലാൻറേഷൻ കഴിഞ്ഞ് 140 ദിവസത്തിൽ കൂടുതൽ) ഇൻഡക്ഷനായി 5% ഐസോഫ്ലൂറേനും അറ്റകുറ്റപ്പണികൾക്കായി 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേനും ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകി. മൃഗത്തെ ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്റ്റിക് ഫ്രെയിമിൽ (Kopf) വയ്ക്കുക, t-hCO യുടെ എതിർവശത്തുള്ള മീശകൾ ഏകദേശം 2 സെന്റിമീറ്ററായി ട്രിം ചെയ്യുകയും പീസോഇലക്ട്രിക് ആക്യുവേറ്ററുമായി (PI) ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു മെഷിലൂടെ കടത്തിവിടുകയും ചെയ്യുന്നു. 400 µm ഫൈബർ ഒപ്റ്റിക് പാച്ച് കേബിൾ (ഡോറിക്) ഇംപ്ലാന്റ് ചെയ്ത ഫൈബറുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച് ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സിസ്റ്റവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. t-hCO യുടെ എതിർവശത്തുള്ള വിസ്‌കറുകൾ പിന്നീട് 20 മിനിറ്റ് റെക്കോർഡിംഗ് കാലയളവിൽ ഒരു പീസോ ഇലക്ട്രിക് ഡ്രൈവ് ഉപയോഗിച്ച് ക്രമരഹിതമായ സമയങ്ങളിൽ 50 തവണ (20 Hz-ൽ 2 mm, ഒരു അവതരണത്തിന് 2 s) വ്യതിചലിപ്പിച്ചു. ഇഷ്ടാനുസൃത MATLAB കോഡ് ഉപയോഗിച്ച് വ്യതിചലന സമയം നിയന്ത്രിക്കാൻ Arduino MATLAB പിന്തുണ പാക്കേജ് ഉപയോഗിക്കുക. ട്രാൻസിസ്റ്റർ-ട്രാൻസിസ്റ്റർ ലോജിക് (TTL) പൾസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇവന്റുകൾ ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സോഫ്റ്റ്‌വെയറുമായി സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.
ട്രാൻസ്പ്ലാന്റേഷൻ കഴിഞ്ഞ് 140 ദിവസത്തിൽ കൂടുതൽ പ്രായമുള്ള എലികൾക്ക് 5% ഐസോഫ്ലൂറേൻ അനസ്തേഷ്യ നൽകുകയും ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്കിടെ 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് അനസ്തേഷ്യ നൽകുകയും ചെയ്തു. മൃഗങ്ങളെ ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഫ്രെയിമിൽ (Kopf) സ്ഥാപിക്കുകയും ബ്യൂപ്രെനോർഫിൻ SR, ഡെക്സമെതസോൺ എന്നിവ സബ്ക്യുട്ടേനിയസ് ആയി കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. തലയോട്ടി തുറന്നുകാണിക്കുകയും വൃത്തിയാക്കുകയും 3-5 ബോൺ സ്ക്രൂകൾ തിരുകുകയും ചെയ്തു. t-hCO ലക്ഷ്യമിടാൻ, ഞങ്ങൾ MRI ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് കോർഡിനേറ്റുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു. ട്രാൻസ്പ്ലാൻറ് ചെയ്ത hCO ന് മുകളിൽ നേരിട്ട് ഒരു ഹൈ സ്പീഡ് ഡ്രിൽ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ക്രാനിയോടോമി (ഏകദേശം 1 സെന്റീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ളത്) നടത്തി. അസ്ഥി കഴിയുന്നത്ര നേർത്തതായിക്കഴിഞ്ഞാൽ, എന്നാൽ മുഴുവൻ അസ്ഥിയിലൂടെയും തുരക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, അടിസ്ഥാന t-hCO വെളിപ്പെടുത്തുന്നതിന് ശേഷിക്കുന്ന കേടുകൂടാത്ത പെൽവിക് ഡിസ്ക് നീക്കം ചെയ്യാൻ ഫോഴ്‌സ്‌പ്സ് ഉപയോഗിക്കുക. ക്രാനിയോടോമി അണുവിമുക്തമായ ഉപ്പുവെള്ളം കൊണ്ട് നിറച്ചു, UV-ക്യൂർഡ് ഡെന്റൽ സിമന്റ് (Relyx) ഉപയോഗിച്ച് തലയോട്ടിയിൽ ഒരു കവർസ്ലിപ്പും ഒരു പ്രത്യേക ഹെഡ് പിന്നും ഘടിപ്പിച്ചു.
നിക്കോൺ LWD (×16, 0.8 NA) ലക്ഷ്യത്തോടെ ബ്രൂക്കർ മൾട്ടിഫോട്ടോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ടു-ഫോട്ടോൺ ഇമേജിംഗ് നടത്തിയത്. 920 nm-ൽ 1.4x സിംഗിൾ z-പ്ലെയിൻ മാഗ്നിഫിക്കേഷനും 8x ശരാശരി 7.5 fps-ഉം ഉപയോഗിച്ച് GCaMP6 ഇമേജിംഗ് നടത്തി. 5% ഐസോഫ്ലൂറേൻ അനസ്തേഷ്യ ഉപയോഗിച്ച് എലികളെ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് പരിപാലിക്കുകയും ചെയ്തു. എലികളെ ഒരു ഇഷ്ടാനുസൃതമായി നിർമ്മിച്ച ഹെഡ് ഫിക്‌ചറിൽ സ്ഥാപിച്ച് ലെൻസിന് കീഴിൽ സ്ഥാപിച്ചു. മോട്ടോർ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 3 മിനിറ്റ് പശ്ചാത്തല റെക്കോർഡിംഗ് ലഭിച്ചു. 20 മിനിറ്റ് റെക്കോർഡിംഗിനിടെ, ഒരു പിക്കോസ്പ്രൈസർ ഉപയോഗിച്ച് t-hCO-യ്ക്ക് എതിർവശത്തുള്ള വിസ്കർ പാഡിലേക്ക് 50 പഫുകൾ (ഓരോ അവതരണവും 100 ms നീളമുള്ളത്) ക്രമരഹിതമായി എത്തിച്ചു. കസ്റ്റം MATLAB കോഡ് ഉപയോഗിച്ച് ബർസ്റ്റ് സമയം നിയന്ത്രിക്കാൻ Arduino MATLAB സപ്പോർട്ട് പാക്കേജ് ഉപയോഗിക്കുക. TTL പൾസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (PrairieView 5.5) ഉപയോഗിച്ച് ഇവന്റുകൾ സമന്വയിപ്പിക്കുക. വിശകലനത്തിനായി, ഫിജിയിൽ ആരംഭിച്ച മോകോ പ്രോഗ്രാമിൽ അഫൈൻ തിരുത്തൽ ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ xy ചലനത്തിനായി ശരിയാക്കി. CNMF-E43 ഉപയോഗിച്ച് വ്യക്തിഗത സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് ഫ്ലൂറസെന്റ് ട്രെയ്‌സുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ. താൽപ്പര്യമുള്ള ഓരോ മേഖലയ്ക്കും ഫ്ലൂറസെൻസ് വേർതിരിച്ചെടുത്തു, dF/F കർവുകളായി പരിവർത്തനം ചെയ്തു, തുടർന്ന് z-സ്കോറുകളായി പരിവർത്തനം ചെയ്തു.
ട്രാൻസ്പ്ലാന്റേഷൻ കഴിഞ്ഞ് 140 ദിവസത്തിൽ കൂടുതൽ പ്രായമുള്ള എലികളെ 5% ഐസോഫ്ലൂറേൻ അനസ്തേഷ്യ നൽകി ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് വിധേയമാക്കി, 1-3% ഐസോഫ്ലൂറേൻ ഉപയോഗിച്ച് ശസ്ത്രക്രിയയ്ക്ക് മുമ്പ് അനസ്തേഷ്യ നൽകി. മൃഗങ്ങളെ ഒരു സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് ഫ്രെയിമിൽ (Kopf) സ്ഥാപിക്കുകയും ബ്യൂപ്രെനോർഫിൻ SR, ഡെക്സമെതസോൺ എന്നിവ സബ്ക്യുട്ടേനിയസ് ആയി കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു. t-hCO യുടെ എതിർവശത്തുള്ള മീശകൾ ഏകദേശം 2 സെന്റീമീറ്റർ മുറിച്ച് ഒരു പീസോഇലക്ട്രിക് ആക്യുവേറ്ററുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു മെഷിലൂടെ ത്രെഡ് ചെയ്തു. തലയോട്ടി തുറന്ന് വൃത്തിയാക്കുന്നു. ഒരു സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ ഗ്രൗണ്ട് സ്ക്രൂ തലയോട്ടിയിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. t-hCO ലക്ഷ്യമിടാൻ, MRI ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ സ്റ്റീരിയോടാക്സിക് കോർഡിനേറ്റുകൾ സൃഷ്ടിച്ചു. t-hCO യ്ക്ക് തൊട്ടുമുകളിലുള്ള ഒരു ഹൈ സ്പീഡ് ഡ്രിൽ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ക്രാനിയോടോമി (ഏകദേശം 1 സെന്റീമീറ്റർ വ്യാസം) നടത്തുക. അസ്ഥി കഴിയുന്നത്ര നേർത്തതായിക്കഴിഞ്ഞാൽ, എന്നാൽ മുഴുവൻ അസ്ഥിയിലൂടെയും തുരക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, അടിസ്ഥാന t-hCO വെളിപ്പെടുത്തുന്നതിന് ശേഷിക്കുന്ന കേടുകൂടാത്ത പെൽവിക് ഡിസ്ക് നീക്കം ചെയ്യാൻ ഫോഴ്സ്പ്സ് ഉപയോഗിക്കുക. 32-ചാനൽ അല്ലെങ്കിൽ 64-ചാനൽ ഹൈ-ഡെൻസിറ്റി സിലിക്കൺ പ്രോബുകൾ (കേംബ്രിഡ്ജ് ന്യൂറോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് ഗ്രൗണ്ട് ടു ഗ്രൗണ്ട് സ്ക്രൂകൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്രീ-ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്‌ത് വ്യക്തിഗത സെല്ലുകൾ റെക്കോർഡുചെയ്‌തു. അണുവിമുക്തമായ ഉപ്പുവെള്ളം നിറച്ച ക്രാനിയോടോമിയിലൂടെ ഇലക്ട്രോഡുകൾ ലക്ഷ്യ സ്ഥലത്തേക്ക് താഴ്ത്താൻ മാനിപ്പുലേറ്റർ ഉപയോഗിക്കുക. ഓപ്പൺ എഫിസ് ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് 30 kHz ആവൃത്തിയിലാണ് ഡാറ്റ ശേഖരണം നടത്തിയത്. 10-ലധികം ചാനലുകളിൽ ഉയർന്ന പരസ്പരബന്ധിതമായ താളാത്മക സ്വതസിദ്ധമായ പ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയപ്പോൾ മാത്രമാണ് റെക്കോർഡിംഗ് തുടർന്നത്, ഇലക്ട്രോഡുകൾ ഗ്രാഫ്റ്റിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നുണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (രണ്ട്-ഫോട്ടോൺ കാൽസ്യം ഇമേജിംഗ് ഡാറ്റയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി). മോട്ടോർ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 10 മിനിറ്റ് പശ്ചാത്തല റെക്കോർഡിംഗ് ലഭിച്ചു. 20 മിനിറ്റ് റെക്കോർഡിംഗ് കാലയളവിൽ ഒരു പീസോ ഇലക്ട്രിക് ഡ്രൈവ് ഉപയോഗിച്ച് t-hCO യുടെ എതിർവശത്തുള്ള വിസ്‌കറുകൾ ക്രമരഹിതമായ സമയങ്ങളിൽ 50 തവണ (20 Hz-ൽ 2 mm, ഒരു അവതരണത്തിന് 2 s) വ്യതിചലിപ്പിച്ചു. Arduino-യ്‌ക്കുള്ള MATLAB പിന്തുണ പാക്കേജ് (MATLAB 2019b) ഉപയോഗിച്ച്, ഇഷ്ടാനുസൃത MATLAB കോഡ് ഉപയോഗിച്ച് വ്യതിചലന സമയം നിയന്ത്രിക്കുക. ഡാറ്റ അക്വിസിഷൻ സോഫ്റ്റ്‌വെയറുമായി ഇവന്റുകൾ സമന്വയിപ്പിക്കാൻ TTL പൾസുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.
ഒപ്റ്റിക്കൽ മാർക്കിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, 473 nm ലേസറുമായി (Omicron) ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന 200 µm ഒപ്റ്റിക്കൽ പാച്ച് കോർഡ് (ഡോറിക്) ക്രാനിയോടോമിക്ക് മുകളിൽ സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന 200 µm ഒപ്റ്റിക്കൽ ഫൈബറുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇതിന് തൊട്ടുമുമ്പ്, ജമ്പർ പവർ 20 mW ആയി ക്രമീകരിക്കുക. അണുവിമുക്തമായ ഉപ്പുവെള്ളം നിറച്ച ക്രാനിയോടോമിയിലൂടെ ഇലക്ട്രോഡുകൾ ലക്ഷ്യ സ്ഥലത്തേക്ക് താഴ്ത്താൻ മാനിപ്പുലേറ്റർ ഉപയോഗിക്കുക. റെക്കോർഡിംഗിന്റെ തുടക്കത്തിൽ, 473 nm (ഫ്രീക്വൻസി 2 Hz, പൾസ് ദൈർഘ്യം 10 ​​ms) പ്രകാശത്തിന്റെ പത്ത് പൾസുകൾ പുറപ്പെടുവിച്ചു. 70% അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ കൂടുതൽ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ പ്രകാശത്തിന്റെ 10 ms-നുള്ളിൽ ഒരു സ്പൈക്ക് പ്രതികരണം പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന കോശങ്ങളായി ഫോട്ടോസെൻസിറ്റീവ് സെല്ലുകളെ നിർവചിച്ചു.