Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان محدود CSS سپورٽ سان برائوزر ورزن استعمال ڪري رهيا آهيو. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). ان کان علاوه، جاري سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکاريون ٿا.
هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن جو ڪاروسيل ڏيکاري ٿو. هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن مان گذرڻ لاءِ پوئين ۽ اڳيون بٽڻ استعمال ڪريو، يا هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن مان گذرڻ لاءِ آخر ۾ سلائڊر بٽڻ استعمال ڪريو.
خود گڏ ٿيندڙ نيورل آرگنيلز انساني ترقي ۽ بيماري جي ماڊلنگ لاءِ هڪ واعدو ڪندڙ ان ويٽرو پليٽ فارم جي نمائندگي ڪن ٿا. بهرحال، آرگنيلز ۾ ڪنيڪٽوٽي جي کوٽ آهي جيڪا ان ويوو ۾ موجود آهي، جيڪا پختگي کي محدود ڪري ٿي ۽ ٻين سرڪٽس سان انضمام کي روڪي ٿي جيڪي رويي کي ڪنٽرول ڪن ٿا. هتي اسان ڏيکاريون ٿا ته انساني اسٽيم سيل مان نڪتل ڪارٽيڪل آرگنيلز جيڪي نيونيٽال ننگي چوٽن جي سوماتوسينسري ڪارٽيڪس ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيا ويا آهن، بالغ سيل قسمون پيدا ڪن ٿا جيڪي حسي ۽ ترغيب سان لاڳاپيل سرڪٽس ۾ ضم ٿين ٿا. ايم آر آءِ ڪيترن ئي اسٽيم سيل لائنن ۽ جانورن ۾ پوسٽ ٽرانسپلانٽ آرگنائيڊ واڌ کي ظاهر ڪيو، جڏهن ته سنگل ڪور تجزيي ڪارٽيڪوجينيسس جي ترقي ۽ سرگرمي تي منحصر ٽرانسڪرپشن پروگرام جي ظهور کي ظاهر ڪيو. درحقيقت، ٽرانسپلانٽ ٿيل ڪارٽيڪل نيورون انهن جي ان ويٽرو هم منصبن جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ پيچيده مورفولوجيڪل، سيناپٽڪ، ۽ اندروني جھلي جي خاصيتن کي ظاهر ڪن ٿا، جيڪو ٽيموٿي جي سنڊروم سان مريضن ۾ نيورونل خرابين جي ڳولا جي اجازت ڏئي ٿو. جسماني ۽ فنڪشنل ٽريڪنگ ڏيکاريو آهي ته ٽرانسپلانٽ ٿيل آرگنيلز ٿالاموڪارٽيڪل ۽ ڪارٽيڪوڪارٽيڪل ان پٽ حاصل ڪن ٿا، ۽ نيورل سرگرمي جي ان ويوو رڪارڊنگ مان ظاهر ٿئي ٿو ته اهي ان پٽ انساني سيلز ۾ حسي ردعمل پيدا ڪري سگهن ٿا. آخرڪار، ڪارٽيڪل آرگنائيڊز سڄي چوهڙ جي دماغ ۾ محورن کي وڌائين ٿا، ۽ انهن جي آپٽوجينيٽڪ چالو ٿيڻ انعام جي ڳولا واري رويي ڏانهن وٺي ٿو. اهڙيءَ طرح، ٽرانسپلانٽ ٿيل انساني ڪارٽيڪس نيورون پختو ٿين ٿا ۽ ميزبان جي سرڪٽ ۾ حصو وٺن ٿا جيڪي رويي کي ڪنٽرول ڪن ٿا. اسان اميد ڪريون ٿا ته هي طريقو مريض مان نڪتل سيلز ۾ اسٽرينڊ-ليول فينوٽائپس جي ڳولا کي آسان بڻائيندو جيڪي ٻين طريقن سان نه ڳولي سگهجن ٿا.
انساني دماغ جي ترقي هڪ قابل ذڪر خود ترتيب ڏيڻ وارو عمل آهي جنهن ۾ سيلز وڌندا آهن، فرق ڪندا آهن، منتقل ٿيندا آهن، ۽ فنڪشنل نيورونل سرڪٽ ٺاهڻ لاءِ ڳنڍيندا آهن جيڪي حسي تجربي ذريعي وڌيڪ بهتر ڪيا ويندا آهن. انساني دماغ جي ترقي کي سمجهڻ ۾ هڪ اهم مسئلو، خاص طور تي بيماري جي حوالي سان، دماغ جي ٽشو تائين رسائي جي کوٽ آهي. خود ترتيب ڏيڻ وارا عضوا، بشمول انساني ڪارٽيڪس آرگنائيڊز (hCO؛ انساني ڪارٽيڪس اسپير جي نالي سان پڻ سڃاتو وڃي ٿو)، 2,3,4,5,6 پيدا ڪري سگهن ٿا. بهرحال، ڪيتريون ئي حدون انهن جي وسيع استعمال کي نيورل سرڪٽ جي ترقي ۽ ڪم کي سمجهڻ تائين محدود ڪن ٿيون. خاص طور تي، اهو واضح ناهي ته ڇا hCO پختگي vivo ۾ موجود ڪجهه مائڪرو ماحولياتي ۽ حسي ان پٽ جي غير موجودگي جي ڪري محدود آهي. ان کان علاوه، ڇاڪاڻ ته hCOs سرڪٽ ۾ ضم نه ڪيا ويا آهن جيڪي رويي جا نتيجا پيدا ڪري سگهن ٿا، جينياتي طور تي پيچيده ۽ رويي جي نيوروپسائيڪائٽرڪ خرابين کي ماڊل ڪرڻ ۾ انهن جي افاديت هن وقت محدود آهي.
هڪ زنده دماغ ۾ hCO جي ٽرانسپلانٽيشن انهن حدن کي ختم ڪري سگهي ٿي. پوئين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته انساني نيورون جيڪي روڊنٽ ڪارٽيڪس ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيا ويا آهن اهي زنده رهڻ، پروجيڪٽ ڪرڻ ۽ روڊنٽ سيلز سان رابطو ڪرڻ جي قابل آهن 7,8,9,10,11,12. تاهم، اهي تجربا عام طور تي بالغ جانورن تي ڪيا ويندا آهن، جيڪي شايد Synaptic ۽ axonal انضمام کي محدود ڪن. هتي، اسان هڪ ٽرانسپلانٽيشن پيراڊائم بيان ڪريون ٿا جنهن ۾ اسان پلاسٽڪ ڊولپمينٽ جي شروعاتي مرحلي تي hiPS سيلز مان نڪتل 3D hCO کي مدافعتي گهٽتائي واري چوٽن جي پرائمري سوماتوسينسري ڪارٽيڪس (S1) ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو. ٽرانسپلانٽ ٿيل hCO (t-hCO) نيورون ڪافي پختگي مان گذرن ٿا، ٿالاموڪارٽيڪل ۽ ڪارٽيڪل-ڪارٽيڪل ان پٽ حاصل ڪن ٿا جيڪي حسي ردعمل کي جنم ڏين ٿا، ۽ انعام جي ڳولا واري رويي کي هلائڻ لاءِ چوٿون دماغ ۾ محوري پروجئشن کي وڌايو. t-hCO جي وڌايل پختگي ٽموٿي جي سنڊروم (TS) سان مريضن ۾ نيورونل خرابيون ظاهر ڪيون آهن، هڪ سخت جينياتي خرابي جيڪا وولٽيج-حساس L-قسم CaV1.2 ڪلسيم چينل ۾ ميوٽيشنز جي ڪري ٿي (CACNA1C پاران انڪوڊ ٿيل).
انساني ڪارٽيڪل نيورونز کي سرڪٽس ۾ وييو ۾ پڙهڻ لاءِ، اسان اسٽيريوٽيڪٽڪ طور تي 3D hCO کي شروعاتي پوسٽ نيٽل ايٿيمڪ چوٿن جي S1 ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو (ڏينهن 3-7 پوسٽ نيٽل) (شڪل 1a ۽ شڪل 1a-c جو وڌايل ڊيٽا). هن نقطي تي، ٿالاموڪارٽيڪل ۽ ڪارٽيڪوڪارٽيڪل ايڪسونل پروجيڪشن اڃا تائين پنهنجو S1 انرويشن مڪمل نه ڪيو آهي (حوالو 13). ان ڪري، هي طريقو t-hCO انضمام کي وڌ کان وڌ ڪرڻ لاءِ ٺاهيو ويو آهي جڏهن ته اينڊوجينس سرڪٽس تي اثر کي گهٽ ۾ گهٽ ڪيو وڃي. زنده جانورن ۾ t-hCO جي جڳهه کي ڏسڻ لاءِ، اسان ٽرانسپلانٽيشن کان 2-3 مهينن بعد چوٿن جي T2-وزن واري MRI دماغ جي تعمير نو ڪئي (شڪل 1b ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 1d). t-hCO کي آساني سان ڏٺو ويو ۽ t-hCO جي حجم جي ماپ مقرر ٿيل سلائسن مان ڳڻپيل ماپن جي برابر هئي (وڌايل ڊيٽا شڪل 1d,e; P > 0.05). t-hCO کي آساني سان ڏٺو ويو ۽ t-hCO جي حجم جي ماپ مقرر ٿيل سلائسن مان ڳڻپيل ماپن جي برابر هئي (وڌايل ڊيٽا شڪل 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. پي> 0،05). t-hCO آساني سان مشاهدو ڪيو ويو، ۽ واليوميٽرڪ t-hCO ماپون مقرر حصن لاءِ حساب ڪيل ماپن سان ملندڙ جلندڙ هيون (وڌايل ڊيٽا، شڪل 1d، e؛ P > 0.05).很容易观察到t-hCO، 并且t-hCO体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO، 并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d.) پي> 0،05). t-hCO آساني سان ڏٺو ويو، ۽ واليوميٽرڪ t-hCO ماپون مقرر حصن لاءِ حساب ڪيل ماپن سان ملندڙ جلندڙ هيون (وڌايل ڊيٽا، شڪل 1d، e؛ P > 0.05).اسان ٽرانسپلانٽيشن کان تقريبن 2 مهينا پوءِ 81 سيڪڙو ٽرانسپلانٽ ٿيل جانورن ۾ t-hCO جو تعين ڪيو (n = 72 جانور؛ 10 hiPS سيل لائينن مان hCO؛ ضمني جدول 1 ۾ hiPS سيل لائينون). انهن مان، 87 سيڪڙو دماغي ڪارٽيڪس ۾ واقع هئا (شڪل 1c). ساڳئي ٽرانسپلانٽ ٿيل چوٿين ۾ ڪيترن ئي وقت جي پوائنٽن تي سيريل ايم آر آءِ اسڪين ڪرڻ سان، اسان 3 مهينن اندر t-hCO جي مقدار ۾ نو ڀيرا واڌ ڏٺي (شڪل 1d ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 1f). ٽرانسپلانٽ ٿيل جانورن ۾ ٽرانسپلانٽيشن کان پوءِ 12 مهينن ۾ بقا جي شرح (74٪) وڌيڪ هئي (وڌايل ڊيٽا، شڪل 1g ۽ ضمني جدول 2)، ۽ ڪو به ظاهري موٽر يا ياداشت جي خرابي، گليوسس، يا اليڪٽرو اينسيفالوگرام (EEG) نه مليو. ڊيٽا شڪل 1g ۽ ضمني جدول 2). 1h-m ۽ 3e).
الف، تجرباتي ڊيزائن جو اسڪيميٽڪ. hiPS سيلز مان نڪتل hCO کي فرق جي 30-60 ڏينهن تي نئين ڄاول ننگي چوهڙن جي S1 ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو ويو. ب، T2-وزن واري ڪورونل ۽ افقي MRI تصويرون ٽرانسپلانٽيشن کان 2 مهينن بعد S1 ۾ t-hCO ڏيکارين ٿيون. اسڪيل بار، 2 ملي ميٽر. ج، هر hiPS سيل لائن لاءِ ڏيکاريل اينگرافمينٽ ڪاميابي جي شرحن جي مقدار (n = 108، بار اندر انگ هر hIPS سيل لائن لاءِ t-hCO جي مقدار کي ظاهر ڪن ٿا) ۽ ڪارٽيڪل يا سب ڪارٽيڪل مقام (n = 88). د، ڪورونري شريان جي MRI تصوير (کاٻي؛ اسڪيل بار، 3 ملي ميٽر) ۽ لاڳاپيل 3D وولوميٽرڪ تعمير (اسڪيل بار، 3 ملي ميٽر) 3 مهينن دوران t-hCO ۾ واڌ ڏيکاريندي. e، چوٿون دماغي ڪارٽيڪس ۾ t-hCO نمونن جو جائزو. اسڪيل بار، 1 ملي ميٽر. f، t-hCO جون نمائندي اميونوسائيٽو ڪيميڪل تصويرون مٿي کاٻي کان ساڄي طرف ڏيکاريل آهن (تفرق دوران): PPP1R17 (4 مهينا پراڻو)، NeuN (8 مهينا پراڻو)، SOX9 ۽ GFAP (8 مهينا پراڻو)، PDGFRα؛ (8 مهينا)، MAP2 (8 مهينا) ۽ IBA1 (8 مهينا). اسڪيل بار، 20 µm. HNA جو گڏيل اظهار انساني اصل جي سيلز کي ظاهر ڪري ٿو. g، snRNA-seq: سيورٽ انٽيگريشن کان پوءِ سڀني اعليٰ معيار جي t-hCO نيوڪلئي جي گڏيل ميني فولڊ ۽ پروجئشن (UMAP) طول و عرض گهٽائڻ واري تصوير (n=3 t-hCO نموني، n=2 hiPS سيل لائينون). ايسٽروسائيٽس، ايسٽروسائيٽ لائن جا سيلز؛ سائڪ پروگ، گردش ڪندڙ پروجينٽر؛ GluN DL، ڊيپ گلوٽاميٽرجڪ نيورون؛ GluN DL/SP، ڊيپ ۽ سبليميلر گلوٽاميٽرجڪ نيورون؛ GluN UL، مٿئين پرت گلوٽاميٽرجڪ نيورون؛ اوليگوڊينڊروسائيٽس، اوليگوڊينڊروسائيٽس؛ OPC، اوليگوڊينڊروسائيٽ پروجينٽر سيلز؛ RELN، ريلين نيورون. h، جين آنٽولوجي (GO) اصطلاح جي افزودگي جو تجزيو، جين جي خاص طور تي اپ ريگيوليشن (ايڊجسٽ ٿيل P < 0.05، فولڊ تبديلي > 2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ ظاهر ڪيل) hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾. h، جين آنٽولوجي (GO) اصطلاح جي افزودگي جو تجزيو، جين جي خاص طور تي اپ ريگيوليشن (ايڊجسٽ ٿيل P < 0.05، فولڊ تبديلي > 2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ ظاهر ڪيل) hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾. h، Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность, эясми2 > по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h، hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾ t-hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورون ۾ اهم چالو ٿيڻ سان جين لاءِ جين آنٽولوجي (GO) اصطلاح افزودگي تجزيو (ايڊجسٽ ٿيل P<0.05، فولڊ تبديلي >2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ اظهار). h، 与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2، 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 ， 变 变 5 p <.变化> 2، 至少 10% 的核中表达） 基因 基因 基因 的 的至少 10% 的核中表达） 基因 基因 的本体论(GO) 术语富集分析. h، гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней %0,05) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тербощанию. h، t-hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورونز ۾ جينز کي خاص طور تي اپ ريگيوليٽ ڪيو ويو (ايڊجسٽ ٿيل P < 0.05، فولڊ تبديلي > 2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ ظاهر ڪيو ويو) hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورونز جي مقابلي ۾ افزودگي اصطلاح جي اونٽولوجيڪل (GO) تجزيو.ڊاٽ ٿيل لڪير 0.05 جي aq قدر کي ظاهر ڪري ٿي. i، هڪ ريفرنس 22 snRNA-seq بالغ موٽر ڪارٽيڪس ڊيٽاسيٽ مان ليبل ٽرانسفر استعمال ڪندي t-hCO ۾ GluN سيل قسمن جي UMAP تصوير. CT - corticothalamic سيلز، ET - extracerebral سيلز، IT - اندروني ٽيلينسفالڪ سيلز، NP - پروجئشن جي ويجهو.
پوءِ اسان t-hCO جي سائيٽو آرڪيٽيڪچر ۽ مجموعي سيلولر ساخت جو جائزو ورتو. چوٿين اينڊوٿيليل سيلز جي اينٽي باڊي اسٽيننگ t-hCO سان ويسڪولرائيزيشن کي ظاهر ڪيو، جڏهن ته IBA1 اسٽيننگ سڄي گرافٽ ۾ چوٿين مائڪروگليا جي موجودگي کي ظاهر ڪيو (شڪل 1f ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 3c، d). اميونو اسٽيننگ انساني نيوڪليئر اينٽيجن (HNA) مثبت سيلز کي ظاهر ڪيو جيڪي PPP1R17 (ڪارٽيڪل پروجينٽر)، NeuN (نيورون)، SOX9 ۽ GFAP (گليل مان نڪتل سيلز) يا PDGFRα (اوليگوڊينڊروسائيٽ پروجينٽر) (شڪل 1f) کي گڏيل طور تي ظاهر ڪن ٿا. سنگل سيل ريزوليوشن تي t-hCO جي سيلولر ساخت جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، اسان تقريبن 8 مهينن جي فرق کان پوءِ سنگل ڪور آر اين اي سيڪوئنسنگ (snRNA-seq) ڪيو. چوٿون نيوڪلئي جي بلڪ فلٽريشن ۽ هٽائڻ سان 21,500 اعليٰ معيار جا انساني مونو نيوڪليئر نقشا مليا (شڪل 1g ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 4a، b). عام سيل قسم جي نشانن جي اظهار جي نمونن وڏي ڪارٽيڪل سيل ڪلاسن جي ڪلسٽرن جي سڃاڻپ ڪئي، جنهن ۾ ڊيپ ۽ سپرفيشل گلوٽاميٽرجڪ نيورون، گردش ڪندڙ پروجينٽر، اوليگوڊينڊروسائٽس، ۽ ايسٽروسائيٽ نسب شامل آهن (شڪل 1g، وڌايل ڊيٽا، شڪل 4c، ۽ ضمني جدول 3). SATB2 ۽ CTIP2 لاءِ اميونوسٽيننگ ڏيکاريو ته ڪارٽيڪل ذيلي قسمن جي موجودگي جي باوجود، t-hCO واضح جسماني سطح نه ڏيکاريو (وڌايل ڊيٽا، شڪل 3a). اسٽيج سان ملندڙ snRNA-seq hCO وسيع طور تي ساڳيا سيل ڪلاس پيدا ڪيا، ڪجھ استثنا سان، جن ۾ اوليگوڊينڊروسائٽس جي غير موجودگي ۽ GABAergic نيورون جي موجودگي شامل آهي، جيڪي شايد ليٽرل پروجينٽر سيلز 15 لاءِ اڳ ۾ رپورٽ ڪيل سازگار ان ويٽرو حالتن کي ظاهر ڪن ٿا (وڌايل ڊيٽا، شڪل 4f - i ۽ ضمني جدول 4). ڊفرنشل جين ايڪسپريشن تجزيي t-hCO ۽ hCO جي وچ ۾ گلوٽامٽرجڪ نيورونز ۾ اهم فرق ظاهر ڪيا (ضمني جدول 5)، جنهن ۾ نيورونل پختگي سان لاڳاپيل جين جي سيٽن جي چالو ڪرڻ شامل آهي جهڙوڪ سيناپٽڪ سگنلنگ، ڊينڊريٽڪ لوڪلائيزيشن، ۽ وولٽيج-گيٽڊ چينل سرگرمي (شڪل 1h ۽ ضمني جدول 5). جدول 6). مطابق، ڪارٽيڪل گلوٽامٽرجڪ t-hCO نيورونز تيز ٽرانسڪرپشنل پختگي جي نمائش ڪئي.
اهو واضح ڪرڻ لاءِ ته ڇا t-hCO ۾ اهي ٽرانسڪرپشنل تبديليون hCO ان ويٽرو ۽ t-hCO ان وييو جي وچ ۾ مورفولوجيڪل فرق سان لاڳاپيل هيون، اسان 7-8 مهينن جي فرق کان پوءِ ايڪيوٽ سيڪشن ۾ اسٽيج سان ملندڙ بايو سائٽين سان ڀريل hCO ۽ hCO کي ٻيهر تعمير ڪيو. hCO نيورون (شڪل 2a). t-hCO نيورون خاص طور تي وڏا هئا، سوما قطر جو 1.5 ڀيرا، ڊينڊرائٽس کان ٻه ڀيرا، ۽ ان ويٽرو hCO جي مقابلي ۾ ڪل ڊينڊرائٽڪ ڊيگهه ۾ مجموعي طور تي ڇهه ڀيرا واڌ هئي (شڪل 2b). ان کان علاوه، اسان hCO نيورون جي ڀيٽ ۾ t-hCO نيورون ۾ ڊينڊرائٽڪ اسپائن جي کثافت کي تمام گهڻو وڌيڪ ڏٺو (شڪل 2c). اهو مشورو ڏئي ٿو ته t-hCO نيورون وسيع ڊينڊرائٽڪ ڊگھائي ۽ شاخنگ مان گذرن ٿا، جيڪي مسلسل سيل جي واڌ سان گڏ، ٽرانسپلانٽيشن کان پوءِ t-hCO جي شديد واڌ ۾ حصو وٺي سگهن ٿا (شڪل 1d ۽ وڌايل ڊيٽا تصوير 1f). هن اسان کي اليڪٽرو فزيولوجيڪل ملڪيتن جي جاچ ڪرڻ لاءِ چيو. جھلي جي گنجائش اٺ ڀيرا وڌيڪ هئي (وڌايل ڊيٽا، شڪل 8d)، آرام واري حالت جھلي جي صلاحيت وڌيڪ هائپرپولرائزڊ هئي (تقريبن 20 mV)، ۽ موجوده انجيڪشن hCO نيورون جي ڀيٽ ۾ t-hCO نيورون ۾ وڌيڪ وڌ ۾ وڌ جوش جي شرح کي جنم ڏنو. ان ويٽرو ۾ (شڪل 2d)، e)، جيڪو t-hCO جي وڏين ۽ وڌيڪ پيچيده مورفولوجيڪل خاصيتن سان مطابقت رکي ٿو. ان کان علاوه، t-hCO نيورون (شڪل 2f) ۾ خود بخود جوش واري پوسٽ سينيپٽڪ موجوده واقعن (EPSC) جي تعدد خاص طور تي وڌيڪ هئي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته t-hCO نيورون ۾ مشاهدو ڪيل ڊينڊريٽڪ اسپائن جي وڌندڙ کثافت فنڪشنل ايڪسائيٽيبلٽي سان لاڳاپيل هئي. جنسي سنيپس. اسان ليبل ٿيل گلوٽامٽرجڪ نيورون (وڌايل ڊيٽا، شڪل 6a-c) کي رڪارڊ ڪندي ويٽرو ۾ hCO نيورون جي نابالغ ڪردار جي تصديق ڪئي.
الف، 8 مهينن جي فرق کان پوءِ بايو سائٽين سان ڀريل ايڇ سي او ۽ ٽي-ايڇ سي او نيورون جي 3D تعمير نو. b، مورفولوجيڪل خاصيتن جي مقدار (n = 8 hCO نيوران، n = 6 t-hCO نيوران؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 ۽ ***P < 0.0001). b، مورفولوجيڪل خاصيتن جي مقدار (n = 8 hCO نيوران، n = 6 t-hCO نيوران؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 ۽ ***P < 0.0001). б، количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO، n = 6 нейронов t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, * *** 0,0179). b، مورفولوجيڪل خاصيتن جي مقدار (n=8 hCO نيوران، n=6 t-hCO نيوران؛ **P=0.0084، *P=0.0179، ۽ ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*000000000005 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*000000000005 б، количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO، n = 6 нейронов t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, * *** 0,0179). b، مورفولوجيڪل خاصيتن جي مقدار (n=8 hCO نيوران، n=6 t-hCO نيوران؛ **P=0.0084، *P=0.0179، ۽ ***P<0.0001).c، 8 مهينن جي فرق کان پوءِ hCO ۽ t-hCO ڊينڊريٽڪ شاخن جي 3D تعمير نو. ڳاڙهي تارا پوٽيٽو ڊينڊريٽڪ اسپائن کي ظاهر ڪن ٿا. ڊينڊريٽڪ اسپائن جي کثافت جي مقدار (n = 8 hCO نيوران، n = 6 t-hCO نيوران؛ **P = 0.0092). d، آرام واري جھلي جي صلاحيت جي مقدار (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). d، آرام واري جھلي جي صلاحيت جي مقدار (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). d، количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). d، آرام ڪندڙ جھلي جي امڪاني مقدار (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). ڊي، 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P <0.0001）. ڊي، 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P <0.0001）. d، количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). d، آرام ڪندڙ جھلي جي امڪاني مقدار (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). e، hCO ۽ t-hCO ۾ بار بار ٿيندڙ عمل جي صلاحيت فائرنگ، موجوده انجيڪشن کي وڌائڻ، ۽ وڌ ۾ وڌ فائرنگ جي شرح جي مقدار جي ڪري (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). e، hCO ۽ t-hCO ۾ بار بار ٿيندڙ عمل جي صلاحيت فائرنگ، موجوده انجيڪشن کي وڌائڻ، ۽ وڌ ۾ وڌ فائرنگ جي شرح جي مقدار جي ڪري (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ ***P < 0.0001). e، повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO، вызванное увеличением тока، и количественная оценка максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). e، hCO ۽ t-hCO ۾ عمل جي صلاحيت ٻيهر فائرنگ، وڌ ۾ وڌ فائرنگ جي شرح جي موجوده واڌ ۽ مقدار جي ڪري (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ *** P < 0.0001). e، 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）. اي ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 丞 n 5 hco ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e، повторяющеся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO، вызванное увеличением подачи тока, и количественкаициальная возбуждение скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). e، hCO ۽ t-hCO جي بار بار فائرنگ، وڌندڙ موجوده فراهمي ۽ وڌ ۾ وڌ فائرنگ جي شرح جي مقدار جي ڪري پيدا ٿيل عمل جي صلاحيت (n = 25 hCO نيوران، n = 16 t-hCO نيوران؛ *** P < 0.0001). f، 8 مهينن جي فرق تي hCO ۽ t-hCO نيورون ۾ خودبخود EPSCs (sEPSCs)، ۽ Synaptic واقعن جي تعدد جي مقدار (n = 25 hCO نيورون، n = 17 t-hCO نيورون؛ ***P < 0.0001). f، 8 مهينن جي فرق تي hCO ۽ t-hCO نيورون ۾ خودبخود EPSCs (sEPSCs)، ۽ Synaptic واقعن جي تعدد جي مقدار (n = 25 hCO نيورون، n = 17 t-hCO نيورون؛ ***P < 0.0001). f, SPONTANNые EPSC (sEPSC) ۾ NEIRONAH HCO ۽ t-hCO چيريز 8 مھينن جي ڊفيفرنس ۽ ڪوليچسٽ ويننايا اوڪينس 5 нейронов hCO، n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) . f، hCO ۽ t-hCO نيورون ۾ خودبخود EPSCs (sEPSCs) 8 مهينن جي فرق ۽ synaptic واقعن جي شرحن جي مقدار تي (n=25 hCO نيورون، n=17 t-hCO نيورون؛ ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n 神经频率的量化（n 17 t-hCO 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, SPONTANNые EPSC (sEPSC) ۾ NEIRONAH HCO ۽ t-hCO چيريز 8 مھينن جي ڊفيفرنس ۽ ڪوليچسٽ ويننايا اوڪينس 5 нейронов hCO، n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001). f، hCO ۽ t-hCO نيورون ۾ خودبخود EPSCs (sEPSCs) 8 مهينن جي فرق ۽ synaptic واقعن جي شرحن جي مقدار تي (n = 25 hCO نيورون، n = 17 t-hCO نيورون؛ *** P<0.0001).bf لاءِ، لائن 1208-2 ۾ hCO ۽ t-hCO متوازي ۾ رکيل ساڳئي فرق واري بيچ مان ورتا ويا هئا. g، جين سيٽ افزودگي تجزيو (هڪ طرفي فشر جو صحيح ٽيسٽ) جين جو خاص طور تي اپ ريگيوليشن (ايڊجسٽ ٿيل P < 0.05، فولڊ تبديلي > 2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ ظاهر ڪيل) t-hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون ۾ hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾ ابتدائي جواب (ERG) ۽ دير جواب (LRG) سرگرمي تي منحصر جين جي جين سيٽن سان هڪ ان ويوو ماؤس اسٽڊي 16 ۽ ان ويٽرو نيورون 17 مان انساني مخصوص LRGs مان سڃاڻپ ڪئي وئي. g، جين سيٽ افزودگي تجزيو (هڪ طرفي فشر جو صحيح ٽيسٽ) جين جو خاص طور تي اپ ريگيوليشن (ايڊجسٽ ٿيل P < 0.05، فولڊ تبديلي > 2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ ظاهر ڪيل) t-hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون ۾ hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾ ابتدائي جواب (ERG) ۽ دير جواب (LRG) سرگرمي تي منحصر جين جي جين سيٽن سان هڪ ان ويوو ماؤس اسٽڊي 16 ۽ ان ويٽرو نيورون 17 مان انساني مخصوص LRGs مان سڃاڻپ ڪئي وئي. g، анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректирован, 5 изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических по сравнению с глутамению hCO наборы генов как RANNEGO (ERG)، так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мыслодовании на мыс1чех, для человека LRG и з нейронов in vitro17. g، t-hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورونز ۾ اهم چالو ٿيڻ سان جين جي جين سيٽ جي افزودگي (هڪ-ٽيلڊ فشر جو صحيح ٽيسٽ) جو تجزيو (ايڊجسٽ ٿيل P<0.05، فولڊ تبديلي >2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ نيوڪلئي ۾ اظهار) hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورونز جي مقابلي ۾ شروعاتي (ERG) ۽ دير سان (LRG) سرگرمي تي منحصر جين جي سيٽن جي ان ويوو چوٿون 16 ۽ انساني مخصوص LRGs ۾ نيورونز ان ويٽرو 17 مان. g،t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05، 倍数变化>2،在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析(单侧F) isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG)和晚期反应 (LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元谨酸 神经 元调与 5.0 p.倍数> 2، 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 فشر研究 中 的早期 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因的基因组 16和烞烞煥17 中 中 17 中 17 人类特异性LRG. g، глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% انااليز обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) رانوٽ позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG)، идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG، специфичные для человека. g، t-hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورون hCO گلوٽاميٽرجڪ نيورون جي مقابلي ۾ خاص طور تي اپ ريگيوليشن ڪيا ويا (ايڊجسٽ ٿيل P<0.05، فولڊ تبديلي >2، گهٽ ۾ گهٽ 10٪ ابتدائي جواب (ERG) ۽ دير سان جواب جين جي افزودگي تجزيو (هڪ ٽيلڊ فشر جو صحيح ٽيسٽ) جواب سرگرمي تي منحصر جين (LRGs) ان ويوو چوٿون 16 ۽ ان ويٽرو نيورون ۾ سڃاڻپ ڪئي وئي. 17 انساني مخصوص LRGs.ڊاٽ ٿيل لڪير 0.05. h جي بونفروني-درست ٿيل P قدر کي ظاهر ڪري ٿي، GluN جين جو اظهار (هر جين جو سيوڊو-پيڪيج ۽ اسڪيلنگ) t-hCO گلوٽامٽرجڪ نيورون ۾ LRG جين جي snRNA-seq نقلن ۾ خاص طور تي اپ ريگيوليٽ ڪيو ويو هو. i، امونوسٽيننگ t-hCO (مٿي) ۽ hCO (هيٺيون) نيورون ۾ SCG2 اظهار ڏيکاريندي. اڇا تير SCG2+ سيلز ڏانهن اشارو ڪن ٿا. اسڪيل بار، 25 µm. ڊيٽا کي اوسط ± معياري انحراف طور ظاهر ڪيو ويو آهي.
ايڪس ويوو سلائسز ۾ ڏٺل t-hCO جي وڌندڙ سرگرمي جي بنياد تي، snRNA-seq hCO جي مقابلي ۾ t-hCO ۾ جين ٽرانسڪرپٽس جي سرگرمي تي منحصر اپ ريگيوليشن کي ظاهر ڪيو. گلوٽاماٽرجڪ t-hCO نيورون دير سان جوابي سرگرمي کي منظم ڪندڙ جين جي اعلي سطحن جو اظهار ڪيو (شڪل 2g،h)، جيڪي مائوس ۽ انساني نيورون 16،17 ۾ پوئين مطالعي ۾ مليا هئا. مثال طور، BDNF18، SCG2، ۽ OSTN، هڪ پرائيميٽ مخصوص سرگرمي کي منظم ڪندڙ جين، hCO نيورون جي مقابلي ۾ t-hCO نيورون ۾ وڌندڙ اظهار ڏيکاريو (شڪل 2g-i). اهڙيءَ طرح، t-hCO نيورون ٽرانسڪرپشنل، مورفولوجيڪل، ۽ فنڪشنل تجزين ذريعي hCO نيورون جي مقابلي ۾ بهتر پختگي خاصيتون ڏيکاريون.
انساني دماغ جي ترقي سان t-hCO جي پختگي جي وابستگي کي وڌيڪ جائزو وٺڻ لاءِ، اسان جنين ۽ بالغن جي ڪارٽيڪل سيل جي قسمن 19,20 ۽ بالغن جي 21,22 جي ٽرانسڪرپٽوميڪ مقابلي ڪئي ۽ گڏوگڏ ترقي دوران ڪارٽيڪل جين اظهار 23 تي وسيع ڊيٽا (وڌايل ڊيٽا، شڪل 5). پوئين ڪم 24 سان، 7-8 مهينن جي فرق تي عالمي hCO ۽ t-hCO ٽرانسڪرپٽومي پختگي جي حيثيت ان ويوو ڊولپمينٽ وقت سان وسيع طور تي مطابقت رکي ٿي ۽ دير سان جنين جي زندگي جي برابر آهي (وڌايل ڊيٽا شڪل 5a). خاص طور تي، اسان عمر سان ملندڙ hCO جي مقابلي ۾ t-hCO ۾ وڌندڙ ٽرانسڪرپٽومي پختگي جو مشاهدو ڪيو، انهي سان گڏ سنيپٽوجينيسس، ايسٽروجينيسس، ۽ مائيلينيشن سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽومي ايڪٽيويشن (وڌايل ڊيٽا، شڪل 5b-d). سيلولر سطح تي، اسان t-hCO ۾ هڪ پتلي ڪارٽيڪس ذيلي قسم جا ثبوت مليا، گلوٽامٽرجڪ نيورون جا ڪلسٽر بالغ L2/3، L5، ۽ L6 نيورون ذيلي قسم سان اوورليپنگ ڪندا آهن (شڪل 1i). ان جي ابتڙ، حمل جي وچ ۾ گلوٽاميٽرجڪ t-hCO نيورون ۽ فيٽل ڪارٽيڪل نيورون جي وچ ۾ ڪلسٽر اوورليپ وڌيڪ محدود هو (وڌايل ڊيٽا، شڪل 5e-j). اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا t-hCO نيورون انساني پوسٽ نيٽل نيوڪارٽيڪل نيورون سان ڪم ڪندڙ طور تي ملندڙ جلندڙ آهن، اسان انساني پوسٽ نيٽل ڪارٽيڪس جي تيز حصن ۾ انساني L2/3 پيرامڊل نيورون جي اليڪٽرروفيزيولوجيڪل رڪارڊنگ ۽ اناٽوميڪل تعمير نو ڪئي (وڌايل ڊيٽا، شڪل 7a). L2/3 پيرامڊل نيورون جون اليڪٽرروفيزيولوجيڪل خاصيتون t-hCO پيرامڊل نيورون (وڌايل ڊيٽا، شڪل 7e) سان ملندڙ جلندڙ هيون. مورفولوجي طور تي، پوسٽ نيٽل انساني نمونن مان L2/3 نيورون hCO جي ڀيٽ ۾ t-hCO سان وڌيڪ ملندڙ جلندڙ هئا، جيتوڻيڪ L2/3 سيل ڊگھا هئا، مجموعي طور تي وڌيڪ شاخون هيون، ۽ انهن جي اسپائن جي کثافت وڌيڪ هئي (شڪل 3g ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 7b-). G).
a، ڪنٽرول ۽ TS hiPS سيل لائينن ذريعي پيدا ٿيندڙ hCO جي ٽرانسپلانٽيشن، جيڪا نيونيٽال چوٿون ۾ ڪئي وئي آهي. b، 8 مهينن جي فرق کان پوءِ بايو سائٽين سان ڀريل t-hCO نيورون جي 3D تعمير نو. c، سراسري ڊينڊريٽڪ ڊيگهه جي مقدار (n = 19 ڪنٽرول نيورون، n = 21 TS نيورون؛ **P = 0.0041). d، 8 مهينن جي فرق تي ڪنٽرول ۽ TS t-hCO مان 3D-ٻيهر ٺهيل ڊينڊريٽڪ شاخون، ۽ ڊينڊريٽڪ اسپائن ڊينسٽي جي مقدار (n = 16 ڪنٽرول نيورون، n = 21 TS نيورون، ***P < 0.0001). d، 8 مهينن جي فرق تي ڪنٽرول ۽ TS t-hCO مان 3D-ٻيهر ٺهيل ڊينڊريٽڪ شاخون، ۽ ڊينڊريٽڪ اسپائن ڊينسٽي جي مقدار (n = 16 ڪنٽرول نيورون، n = 21 TS نيورون، ***P < 0.0001). d، 3D-Reconструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO شيئرز 8 месяцев дифференцировки и количественная оцидинка шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d، 8 مهينن جي فرق ۽ ڊينڊريٽڪ اسپائن ڊينسٽي ڪوانٽيفڪيشن تي ڪنٽرول ۽ t-hCO TS مان ڊينڊريٽڪ شاخن جي 3D تعمير نو (n=16 ڪنٽرول نيورون، n=21 TS نيورون، ***P<0.0001). ڊي، 分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个煥烦的量化（n 21 个TS 神经元، ***P <0.0001）. ڊي، 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 16 密度元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ） . d، 3D-Reconструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO چيريز 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d، ڪنٽرول ڊينڊريٽڪ شاخن ۽ TS t-hCO جي 3D تعمير نو 8 مهينن جي فرق ۽ ڊينڊريٽڪ اسپائن ڊينسٽي ڪوانٽيفڪيشن تي (n=16 ڪنٽرول نيورون، n=21 TS نيورون، ***P<0.0001).ڳاڙهي تارا پوٽيٽو ڊينڊريٽڪ اسپائن کي ظاهر ڪن ٿا. e، ڪنٽرول ۾ خودبخود EPSCs ۽ TS t-hCO نيورون 8 مهينن جي فرق کان پوءِ. f، مجموعي فريڪوئنسي پلاٽ ۽ سيناپٽڪ واقعن جي فريڪوئنسي ۽ ايمپليٽيوڊ جي مقدار (n=32 ڪنٽرول نيورون، n=26 TS نيورون؛ **P=0.0076 ۽ P=0.8102). g، hCO ۽ t-hCO ۾ TS ۽ ڪنٽرول نيورون جو Scholl تجزيو. ڊيشڊ لائينون مقابلي لاءِ انساني L2/3 پوسٽ نيٽل پرامڊل نيورون ڏيکارين ٿيون (n = 24 ڪنٽرول t-hCO نيورون، n = 21 TS t-hCO نيورون، n = 8 ڪنٽرول hCO نيورون، ۽ n = 7 TS hCO نيورون). ڊيٽا کي سراسري ± معياري انحراف جي طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي.
انساني ڪارٽيڪس نيورسن جي مورفولوجيڪل ۽ فنڪشنل خاصيتن کي اعليٰ سطح تي نقل ڪرڻ جي t-hCO جي صلاحيت اسان کي اهو ڳولڻ تي مجبور ڪيو ته ڇا t-hCO کي بيماري جي فينوٽائپس کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪري سگهجي ٿو. اسان TS تي ڌيان ڏنو، هڪ سخت نيورو ڊولپمينٽل خرابي جيڪا CaV1.2 جي انڪوڊنگ ۾ گين آف فنڪشن ميوٽيشنز جي ڪري ٿئي ٿي، جيڪا نيورسن ۾ سرگرمي تي منحصر جين ٽرانسڪرپشن شروع ڪري ٿي. اسان ٽن TS مريضن کان hCO حاصل ڪيو جيڪي سڀ کان عام متبادل (p.G406R) ۽ ٽي ڪنٽرول (شڪل 3a) کڻندا هئا. ٽرانسپلانٽيشن کان پوءِ، اسان ڏٺو ته ڪنٽرولز جي مقابلي ۾ TS نيورسن ۾ ڊينڊريٽڪ مورفولوجي تبديل ڪئي وئي هئي (شڪل 3b ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 8a، b)، پرائمري ڊينڊريٽس جي تعداد ۾ ٻه ڀيرا واڌ ۽ ڊينڊريٽڪ ڊيگهه ۾ سراسري ۽ مجموعي گهٽتائي ۾ مجموعي واڌ (شڪل 3c ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 8c). هي ڪنٽرول نيورونز جي مقابلي ۾ TS ۾ اسپائن جي وڌندڙ کثافت ۽ خود بخود EPSCs جي وڌندڙ تعدد سان لاڳاپيل هو (شڪل 3d-f ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 8g). وڌيڪ تجزيي ڪنٽرولز جي مقابلي ۾ t-hCO TS ۾ غير معمولي ڊينڊريٽڪ برانچنگ جا نمونا ظاهر ڪيا، پر ان ويٽرو TS hCO ۾ فرق جي ساڳئي مرحلي تي نه (شڪل 3g). اهو TS ۾ سرگرمي تي منحصر ڊينڊريٽڪ ڇڪڻ جي اسان جي پوئين رپورٽن سان مطابقت رکي ٿو ۽ هن ٽرانسپلانٽ پليٽ فارم جي صلاحيت کي اجاگر ڪري ٿو ته جيئن ويوو ۾ بيماري فينوٽائپس کي ڳولي سگهجي.
پوءِ اسان پڇيو ته ڪهڙي حد تائين t-hCO سيلز ڪم ڪندڙ طور تي چوٿون S1 ۾ ضم ٿيل آهن. چوٿون ۾ S1 ipsilateral ventral basal ۽ posterior thalamic nuclei، انهي سان گڏ ipsilateral موٽر ۽ سيڪنڊري somatosensory cortices، ۽ contralateral S1 (شڪل 4a) کان مضبوط synaptic input حاصل ڪري ٿو. innervation pattern کي بحال ڪرڻ لاءِ، اسان hCO کي ريبيز وائرس-dG-GFP/AAV-G سان متاثر ڪيو ۽ hCO کي 3 ڏينهن بعد S1 rat ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو. اسان ٽرانسپلانٽيشن کان 7-14 ڏينهن بعد ipsilateral S1 ۽ ventral basal ganglia جي نيورون ۾ گهاٽي GFP اظهار جو مشاهدو ڪيو (شڪل 4b، c). ان کان علاوه، thalamic مارڪر نيٽرين G1 جي اينٽي باڊي اسٽيننگ t-hCO ۾ thalamic endings جي موجودگي کي ظاهر ڪيو (شڪل 4d، e). اهو جائزو وٺڻ لاءِ ته ڇا اهي afferent projections t-hCO سيلز ۾ synaptic response کي جنم ڏئي سگهن ٿا، اسان thalamocortical پرت جي تيز حصن ۾ انساني سيلز مان پوري سيل رڪارڊنگ ڪئي. چوٿون S1، اندروني ڪيپسول، اڇو مادو، t-hCO جي ويجهو فائبر يا t-hCO ۾ آپسن-اظهار ڪندڙ ٿالامڪ اينڊنگز جي آپٽوجينيٽڪ ايڪٽيويشن، AMPA ريڪٽر مخالف NBQX جي سامهون ايندڙ t-hCO نيورونز ۾ مختصر دير واري EPSCs کي متاثر ڪيو. (شڪل 4f، g ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 9a-g). اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته t-hCO جسماني طور تي چوٿون دماغ ۾ ضم ٿيل آهي ۽ چوٿون ميزبان ٽشو پاران چالو ٿيڻ جي قابل آهي.
a، ريبيز ٽريڪنگ تجربي جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. b، GFP ۽ انساني مخصوص STEM121 اظهار t-hCO ۽ چوٿون دماغي ڪارٽيڪس (مٿين پينل) جي وچ ۾. چوٿون ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (هيٺيون کاٻي) ۽ ipsilateral S1 (هيٺيون ساڄي) ۾ GFP اظهار پڻ ڏيکاريو ويو آهي. اسڪيل بار، 50 µm. ڳاڙهو چورس دماغ جي انهن علائقن جي نمائندگي ڪن ٿا جتي تصويرون ورتيون ويون هيون. c، GFP (n = 4 چوٿون) ظاهر ڪندڙ سيلز جي مقدار. d، e - t-hCO ۾ نيٽرين G1+ ٿالامڪ ٽرمينل. d هڪ ڪورونل سيڪشن ڏيکاري ٿو جنهن ۾ t-hCO ۽ VB نيوڪلئي شامل آهن. اسڪيل بار، 2 ملي ميٽر. e t-hCO (کاٻي) ۽ VB (ساڄي) نيورون ۾ نيٽرين G1 ۽ STEM121 اظهار ڏيکاري ٿو. اسڪيل بار، 50 µm. نارنگي ڊاٽ ٿيل لڪير t-hCO سرحد کي ظاهر ڪري ٿي. f، g، S1 چوٿون (f) يا اندروني ڪيپسول (g) ۾ برقي محرڪ کان پوءِ t-hCO نيورون جا موجوده نشان، (جامني) يا بغير (ڪارو) NBQX (کاٻي) سان. NBQX سان ۽ بغير EPSC ايمپليٽيوڊ (n = 6 S1 نيورون، *P = 0.0119؛ ۽ n = 6 اندروني ڪيپسول نيورون، **P = 0.0022) (وچ). چوٿون S1 (f) يا اندروني ڪيپسول (g) (ساڄي) جي برقي محرڪ جي جواب ۾ EPSC ڏيکاريندڙ t-hCO نيورون جو سيڪڙو. aCSF، مصنوعي دماغي اسپائنل فلوئڊ. h، 2P اميجنگ تجربي جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام (کاٻي). t-hCO ۾ GCaMP6s جو اظهار (وچ). اسڪيل بار، 100 µm. GCaMP6s جو فلوروسينس ٽائيم ليپس (ساڄي). i، خود بخود سرگرمي فلوروسينس جو Z-اسڪور. j، مونچھن جي محرڪ جو اسڪيميٽڪ مثال. k، هڪ آزمائش ۾ z-اسڪور ٿيل 2P فلوروسينس ٽريجڪٽريز، مثال طور سيلز ۾ وقت صفر تي ويسڪر ڊيويئيشن سان ترتيب ڏنل. l، وقت صفر تي ويسڪر ڊيويئيشن سان ترتيب ڏنل سڀني سيلز جا آبادي-اوسط z-اسڪور جواب (ڊيشڊ لائين) (ڳاڙهو) يا بي ترتيب طور تي ٺاهيل ٽائيم اسٽيمپ (گرين). m. آپٽيڪل مارڪنگ تي تجربي جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. n، نيرو ليزر محرک يا ويسڪر ڊيفيليشن دوران هڪ مثال t-hCO سيل مان خام وولٽيج وکر. ڳاڙهي تير روشني (مٿي) جي ڪري يا ويسڪر ڊيفيليشن (هيٺ) جي ڪري پهرين اسپائڪس کي ظاهر ڪن ٿا. گرين شيڊنگ ويسڪر ڊيفيليشن جي دورن کي ظاهر ڪري ٿي. o، چوٽي جي روشني جي موج ۽ ويسڪر ڊيفيليشن ردعمل. p، هڪ واحد ڪوشش جا اسپائڪس، مثال جي سيلز ۾ ويسڪر جي ڊيويئيشن سان ترتيب ڏنل. 0 ويسڪر ڊيويئيشن (ڊيشڊ لائين) کي ظاهر ڪري ٿو. q، سڀني فوٽو حساس سيلز لاءِ آبادي-اوسط z-اسڪور فائرنگ جي شرح، وقت صفر تي ويسڪر ڊيويئيشن سان ترتيب ڏنل (ڊيشڊ لائين) (ڳاڙهو) يا بي ترتيب طور تي ٺاهيل ٽائيم اسٽيمپ (گرين). r، ڦوٽو حساس يونٽن جو تناسب جيڪو ويسڪر ڊيوئيشن (n = 3 چوٿون) (کاٻي پاسي) پاران خاص طور تي ماڊل ڪيو ويو آهي. چوٽي ز-اسڪور ليٽيسي (n = 3 چوٿون؛ n = 5 (هلڪو سائو)، n = 4 (ڪارو سائو)، ۽ n = 4 (سائين) ويسڪر ڊيفليڪشن ماڊليشن يونٽ في چوٿون) (ساڄي پاسي). ڊيٽا کي اوسط ± معياري انحراف جي طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي.
پوءِ اسان پڇيو ته ڇا t-hCO کي حسي محرڪن ذريعي چالو ڪري سگهجي ٿو. اسان hCO کي S1 چوٽن ۾ جينياتي طور تي انڪوڊ ٿيل ڪيلشيم اشارن GCaMP6 کي ظاهر ڪندي ٽرانسپلانٽ ڪيو. 150 ڏينهن کان پوءِ، اسان فائبر فوٽوميٽري يا ٻه-فوٽون ڪيلشيم اميجنگ ڪئي (شڪل 4h ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 10a). اسان ڏٺو ته t-hCO سيلز هم وقت ساز تال واري سرگرمي جي نمائش ڪئي (شڪل 4i، وڌايل ڊيٽا، شڪل 10b ۽ اضافي وڊيو 1). چوٽي t-hCO سرگرمي کي نمايان ڪرڻ لاءِ، اسان بي حسي واري ٽرانسپلانٽ چوٽن ۾ خارجي سيلولر اليڪٽرروفيزيولوجيڪل رڪارڊنگ ڪئي (وڌايل ڊيٽا، شڪل 10c-f). اسان MRI تصويرن مان اسٽيريوٽيڪسڪ ڪوآرڊينيٽس پيدا ڪيا آهن؛ ان ڪري، اهي رڪارڊ ٿيل يونٽ پوٽيٽو انساني نيورون جي نمائندگي ڪن ٿا، جيتوڻيڪ اليڪٽروفيزيولوجي صرف اصل جي هڪ قسم کي طئي ڪرڻ جي اجازت نٿو ڏئي. اسان سرگرمي جي هم وقت ساز ٿيل ڦاٽن جو مشاهدو ڪيو (وڌايل ڊيٽا، شڪل 10d). ڦاٽ تقريباً 460 ايم ايس تائين رهيا ۽ انهن کي تقريباً 2 سيڪنڊن جي خاموشي جي دورن سان الڳ ڪيو ويو (وڌايل ڊيٽا، شڪل 10d، e). انفرادي يونٽن هر ڦاٽ جي سراسري طور تي تقريباً ٽي رائونڊ فائر ڪيا، جيڪو رجسٽرڊ يونٽن جو في ڦاٽ جو تقريباً 73٪ آهي. انفرادي يونٽن جون سرگرميون تمام گهڻيون لاڳاپيل هيون، ۽ اهي لاڳاپا انهن يونٽن کان وڌيڪ هئا جيڪي غير ويڪسين ٿيل جانورن ۾ ساڳئي حالتن ۾ رڪارڊ ڪيا ويا هئا (وڌايل ڊيٽا، شڪل 10f). سڃاڻپ ٿيل انساني نڪتل نيورون جي اسپائڪ جوابن کي وڌيڪ نمايان ڪرڻ لاءِ، اسان hCO سان ٽرانسپلانٽ ٿيل اينسٿيٽائيزڊ چوٿن تي روشني ٽيگنگ تجربا ڪيا جيڪي روشني سان حساس ڪيشن چينل روڊوپسن 2 (hChR2) کي ظاهر ڪن ٿا، جنهن ذريعي t-hCO نيورون مختصر دير جي سڃاڻپ (10 ايم ايس کان گهٽ) نيري روشني جي محرک جي جواب ۾ (شڪل 4m–o). t-hCO نيورونز ڪيلشيم اميجنگ ۾ مشاهدو ڪيل فريڪوئنسيز تي خود بخود سرگرمي جا ڦڙا ڏيکاريا، انهي سان گڏ روشني جي نشان جي غير موجودگي ۾ t-hCO ۾ انجام ڏنل اليڪٽرروفيزيولوجيڪل رڪارڊنگ (وڌايل ڊيٽا، شڪل 10c-g). ويٽرو ۾ رڪارڊ ٿيل hCO جي لاڳاپيل مرحلن ۾ ڪا به خود بخود سرگرمي نه ڏٺي وئي. اهو جائزو وٺڻ لاءِ ته ڇا t-hCO کي حسي محرڪن ذريعي چالو ڪري سگهجي ٿو، اسان مختصر طور تي چوٿون وسڪرز کي t-hCO کان پري ڪيو (شڪل 4j، m ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 10h، k). پوئين مطالعي مطابق 8،10، t-hCO سيلز جو هڪ ذيلي سيٽ وسڪر ڊيفلڪشن جي جواب ۾ وڌندڙ سرگرمي ڏيکاري، جيڪو ڊيٽا کي بي ترتيب ٽائيم اسٽيمپ سان مقابلو ڪرڻ وقت نه ڏٺو ويو (شڪل 4k-q ۽ وڌايل ڊيٽا، شڪل 10h-q). حقيقت ۾، آپٽو-ليبل ٿيل سنگل يونٽن مان تقريباً 54٪ وسڪر محرک کان پوءِ هڪ خاص طور تي وڌندڙ جوش جي شرح ڏيکاري، تقريبن 650 ايم ايس تي چوٽي (شڪل 4r). گڏ ڪيل، اهي ڊيٽا تجويز ڪن ٿا ته t-hCO مناسب فنڪشنل ان پٽ حاصل ڪري ٿو ۽ ماحولياتي محرڪن ذريعي چالو ٿي سگهي ٿو.
پوءِ اسان جاچ ڪئي ته ڇا t-hCO رويي کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ چوهڙن ۾ سرڪٽ کي چالو ڪري سگهي ٿو. اسان پهرين جاچ ڪئي ته ڇا t-hCO نيورون جا محور چوهڙن جي آس پاس جي بافتن ۾ پروجيڪٽ ڪن ٿا. اسان hCO کي EYFP (hChR2-EYFP) سان ملائي hChR2 کي انڪوڊنگ ڪندڙ لينٽي وائرس سان متاثر ڪيو. 110 ڏينهن کان پوءِ، اسان EYFP اظهار کي ipsilateral cortical علائقن ۾ ڏٺو، جنهن ۾ آڊيٽري، موٽر، ۽ somatosensory cortices شامل آهن، انهي سان گڏ subcortical علائقن ۾، جن ۾ striatum، hippocampus، ۽ thalamus شامل آهن (شڪل 5a). اهو جائزو وٺڻ لاءِ ته ڇا اهي ايفرينٽ پروجيڪشن چوهڙن جي سيلن ۾ synaptic ردعمل پيدا ڪري سگهن ٿا، اسان نظرياتي طور تي t-hCO سيلز کي چالو ڪيو جيڪي تيز دماغي حصن ۾ چوهڙن جي دماغي ڪارٽيڪس سيلز کي رڪارڊ ڪندي hChR2-EYFP کي ظاهر ڪن ٿا. چوهڙن جي پرامڊل ڪارٽيڪس نيورونز ۾ نيري روشني سان t-hCO محورن جي چالو ڪرڻ، جيڪي NBQX (شڪل 5b-g) پاران بلاڪ ڪيا ويا هئا. ان کان علاوه، انهن جوابن کي ٽيٽروڊوٽوڪسن (TTX) ذريعي بلاڪ ڪري سگهجي ٿو ۽ 4-امينوپائريڊائن (4-AP) ذريعي بحال ڪري سگهجي ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي مونوسنيپٽڪ ڪنيڪشن جي ڪري ٿيا هئا (شڪل 5e).
a، ايڪسون ٽريڪنگ جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام (کاٻي پاسي). t-hCO EYFP اظهار (ساڄي پاسي). اسڪيل بار، 100 µm. A1، آڊيٽري ڪورٽيڪس، ACC، اينٽيريئر سينگوليٽ ڪورٽيڪس، ڊي. اسٽريٽم، ڊورسل اسٽريٽم، HPC، هپپوڪيمپس؛ ڊايافرام، ليٽرل سيپٽم، ايم پي ايف سي، ميڊيل پريفرنٽل ڪورٽيڪس، پيري، پيريفارم ڪورٽيڪس، وي. اسٽريٽم، وينٽرل اسٽريٽم، وي پي ايم، ٿيليمس جو وينٽروپوسٽوميڊيل نيوڪليس، VTA، وينٽرل ٽيگمينٽل علائقو. ڳاڙهو چورس دماغ جي انهن علائقن جي نمائندگي ڪن ٿا جتي تصويرون ورتيون ويون هيون. b، محرڪ تجربي جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. c، d، انسان ۾ نيري روشني سان متاثر ٿيل فوٽو ڪرنٽ (مٿي) ۽ وولٽيج (هيٺ) جي جواب جون مثالون (c) EYFP+ t-hCO يا چوٿون (d) EYFP- سيلز. e، f، TTX ۽ 4-AR (سائي)، TTX (گرين) يا aCSF (ڪارو) (e) سان t-hCO محور جي نيري روشني جي محرک کان پوءِ چوٿين نيورون جا موجوده نشان، (violet) سان يا بغير (ڪارو) ) NBQX (e). g، چوٿين سيلز ۾ نيري روشني جي ڪري پيدا ٿيندڙ جوابن جي دير (n = 16 سيلز)؛ افقي بار سراسري دير (7.13 ms) (کاٻي) کي ظاهر ڪن ٿا. روشني سان پيدا ٿيندڙ EPSCs جو طول و عرض NBQX سان يا ان کان سواءِ رڪارڊ ڪيو ويو (n = 7 سيلز؛ ***P < 0.0001) (وچ). روشني سان پيدا ٿيندڙ EPSCs جو طول و عرض NBQX سان يا ان کان سواءِ رڪارڊ ڪيو ويو (n = 7 سيلز؛ ***P < 0.0001) (وچ). اي پي ايس سي جي ضابطن ۾ شامل ڪيو ويو آهي، اين بي جي ايڪس اينڪس (اين = 7 ڪليٽوڪ؛ *** پي <0,0001) (سينٽريٽ ۾). روشني سان متاثر ٿيل EPSCs جو طول و عرض NBQX سان يا ان کان سواءِ رڪارڊ ڪيو ويو (n = 7 سيلز؛ ***P < 0.0001) (وچ ۾).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；**P <0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；**P <0.0001）（中）. اي پي ايس سي جي ضابطن ۾ شامل ڪيو ويو آهي، اين بي جي ايڪس اينڪس (اين = 7 ڪليٽوڪ؛ *** پي <0,0001) (سينٽريٽ ۾). روشني سان متاثر ٿيل EPSCs جو طول و عرض NBQX سان يا ان کان سواءِ رڪارڊ ڪيو ويو (n = 7 سيلز؛ ***P < 0.0001) (وچ ۾).نيري روشني (ساڄي) تي جواب ڏيڻ واري EPSC ڏيکاريندڙ چوٿين سيلن جو سيڪڙو. h، رويي جي ڪم جو اسڪيميٽڪ ڊاگرام. d0، ڏينهن 0. i. تربيت جي ڏينهن 1 (کاٻي) يا ڏينهن 15 (ساڄي) تي مثالي جانورن جي ڪارڪردگي. ڏينهن 1 (کاٻي) يا ڏينهن 15 (ساڄي مرڪز) تي ڪيل لِڪس جو سراسري تعداد (n = 150 نيري روشني جا تجربا، n = 150 ڳاڙهي روشني جا تجربا؛ ***P < 0.0001). ڏينهن 1 (کاٻي) يا ڏينهن 15 (ساڄي مرڪز) تي ڪيل لِڪس جو سراسري تعداد (n = 150 نيري روشني جا تجربا، n = 150 ڳاڙهي روشني جا تجربا؛ ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, свисто1м 150) испытаний с красным светом؛ ***P <0,0001). ڏينهن 1 (کاٻي) يا ڏينهن 15 (وچ ۾ ساڄي) تي ڪيل لِڪس جو سراسري تعداد (n = 150 نيري روشني جا تجربا، n = 150 ڳاڙهي روشني جا تجربا؛ ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验**P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, свисто1м 150) испытаний с красным светом؛ ***P <0,0001). ڏينهن 1 (کاٻي) يا ڏينهن 15 (وچ ۾ ساڄي) تي ڪيل لِڪس جو سراسري تعداد (n = 150 نيري روشني جا تجربا، n = 150 ڳاڙهي روشني جا تجربا؛ ***P < 0.0001).ڏينهن 1 (وچ ۾ کاٻي پاسي) يا ڏينهن 15 (ساڄي پاسي) تي ڳاڙهي ۽ نيري روشني جي آزمائشن لاءِ مجموعي لِڪس. NS، اهم نه آهي. j,k, t-hCO سان ٽرانسپلانٽ ڪيل سڀني جانورن جي رويي جون خاصيتون جيڪي hChR2-EYFP (j) ظاهر ڪن ٿيون يا ڏينهن 1 يا 15 تي فلوروفور (k) کي ڪنٽرول ڪن ٿيون (hChR2-EYFP: n = 9 چوٿون، ** P = 0.0049؛ ڪنٽرول: n = 9، P = 0.1497). l، ترجيحي اسڪور جو ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 ڪنٽرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، ترجيحي اسڪور جو ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 ڪنٽرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 контрольных؛ **P <0,001، ***P <0,0001). l، ترجيحي اسڪور جو ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 ڪنٽرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）. l، Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 контролей؛ **P <0,001، ***P <0,0001). l، ترجيحي اسڪور جو ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 ڪنٽرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001).m، S1 ۾ t-hCO جي آپٽوجينيٽڪ ايڪٽيويشن جي جواب ۾ FOS اظهار. FOS اظهار (کاٻي پاسي) جون تصويرون، ۽ مقدار (n = 3 في گروپ؛ *P < 0.05، **P < 0.01 ۽ ***P < 0.001) (ساڄي پاسي) ڏيکاريل آهن. FOS اظهار (کاٻي پاسي) جون تصويرون، ۽ مقدار (n = 3 في گروپ؛ *P < 0.05، **P < 0.01 ۽ ***P < 0.001) (ساڄي پاسي) ڏيکاريل آهن. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу؛ * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) . FOS اظهار (کاٻي پاسي) ۽ مقدار جي تصديق (n = 3 في گروپ؛ *P<0.05، **P<0.01، ۽ ***P<0.001) جون تصويرون ڏيکاريل آهن (ساڄي پاسي).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу؛ * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) . FOS اظهار (کاٻي پاسي) ۽ مقدار جي تصديق (n = 3 في گروپ؛ *P<0.05، **P<0.01، ۽ ***P<0.001) جون تصويرون ڏيکاريل آهن (ساڄي پاسي).اسڪيل بار، 100 µm. ڊيٽا کي BLA، بيسوليٽرل ٽانسل، MDT، ڊورسوميڊيل ٿالامڪ نيوڪليس، PAG، پيرياڪيڊڪٽل گرين جي سراسري ± معياري غلطي طور ظاهر ڪيو ويو آهي.
آخرڪار، اسان پڇيو ته ڇا t-hCO چوهڙن جي رويي کي تبديل ڪري سگهي ٿو. ان کي جانچڻ لاءِ، اسان hChR2-EYFP-اظهار ڪندڙ hCO کي S1 ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو، ۽ 90 ڏينهن بعد، اسان روشني پهچائڻ لاءِ آپٽيڪل فائبر کي t-hCO ۾ امپلانٽ ڪيو. پوءِ اسان چوٿين کي هڪ تبديل ٿيل آپريٽ ڪنڊيشننگ پيراڊائم (شڪل 5h) سان تربيت ڏني. اسان جانورن کي هڪ رويي جي ٽيسٽ چيمبر ۾ رکيو ۽ بي ترتيب طور تي 5 سيڪنڊ نيرو (473 nm) ۽ ڳاڙهو (635 nm) ليزر محرک لاڳو ڪيو. جانورن کي پاڻي جو انعام مليو جيڪڏهن اهي نيري روشني جي محرک دوران چاٽندا هئا پر ڳاڙهي روشني جي محرک دوران نه چاٽندا هئا. تربيت جي پهرين ڏينهن تي، جانورن کي نيري يا ڳاڙهي روشني سان متحرڪ ڪرڻ تي چاٽ ۾ ڪو فرق نه ڏيکاريو. جڏهن ته، 15 هين ڏينهن تي، hCO سان ٽرانسپلانٽ ڪيل جانورن hChR2-EYFP کي ظاهر ڪندي ڳاڙهي روشني جي محرک جي مقابلي ۾ نيري روشني سان متحرڪ ڪرڻ تي وڌيڪ فعال چاٽ ڏيکاريو. چاٽڻ جي رويي ۾ اهي تبديليون ڪنٽرول جانورن ۾ نه ڏٺيون ويون جيڪي hCO سان ٽرانسپلانٽ ڪيا ويا هئا جيڪي ڪنٽرول فلوروفور کي ظاهر ڪن ٿا (سکڻ جي ڪاميابي جي شرح: hChR2 89٪، EYFP 0٪، شڪل 5i-1 ۽ ضمني وڊيو 2). اهي ڊيٽا تجويز ڪن ٿا ته t-hCO سيلز انعام جي طلب واري رويي کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ چوٿون نيورون چالو ڪري سگهن ٿا. اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته ڪهڙو چوٿون t-hCO نيورل سرڪٽ انهن رويي جي تبديلين ۾ شامل ٿي سگهي ٿو، اسان 90 منٽن بعد تربيت يافته جانورن ۽ ڪٽ ڪيل ٽشوز ۾ آپٽوجينيٽيڪل طور تي t-hCO کي چالو ڪيو. امونوهسٽو ڪيمسٽري ڪيترن ئي دماغي علائقن ۾ سرگرمي تي منحصر FOS پروٽين جو اظهار ظاهر ڪيو جيڪو متحرڪ رويي ۾ شامل آهي، جنهن ۾ ميڊيل پريفرنٽل ڪارٽيڪس، ميڊيل ٿالامس، ۽ پيرياڪيڊڪٽل گرين ميٽر شامل آهن، جيڪو يا ته غير متحرڪ ڪنٽرول جانورن ۾ يا جانورن ۾ ظاهر ڪيو ويو هو. چانور. 5m). گڏ ڪيو ويو، اهي ڊيٽا تجويز ڪن ٿا ته t-hCO رويي کي هلائڻ لاءِ چوٿون نيورونل سرگرمي کي ماڊل ڪري سگهي ٿو.
نيورل آرگنائيڊز انساني ترقي ۽ بيماري جي مطالعي لاءِ هڪ اميد افزا نظام جي نمائندگي ڪن ٿا، پر اهي سرڪٽس جي وچ ۾ رابطن جي کوٽ جي ڪري محدود آهن جيڪي وييو ۾ موجود آهن. اسان هڪ نئون پليٽ فارم تيار ڪيو آهي جنهن ۾ اسان انساني سيل جي ترقي ۽ وييو ۾ ڪم ڪرڻ جو مطالعو ڪرڻ لاءِ مدافعتي ڪم ڪندڙ ابتدائي پوسٽ نيٽل چوٽن جي S1 ۾ hCO ٽرانسپلانٽ ڪيو. اسان ڏيکاريو آهي ته t-hCO بالغ سيل قسمن کي ترقي ڪري ٿو جيڪي ويٽرو ۾ نه ڏٺا ويا آهن28 ۽ اهو t-hCO جسماني ۽ فعال طور تي چوٿون دماغ ۾ ضم ٿيل آهي. چوٿون نيورل سرڪٽس ۾ t-hCO جي انضمام اسان کي انساني سيلولر سرگرمي ۽ جانورن جي رويي جي مطالعي جي وچ ۾ هڪ لنڪ قائم ڪرڻ جي اجازت ڏني، اهو ڏيکاري ٿو ته t-hCO نيورون رويي جي ردعمل کي هلائڻ لاءِ چوٿون نيورونل سرگرمي کي ماڊل ڪري سگهن ٿا.
اسان جيڪو پليٽ فارم بيان ڪريون ٿا ان ۾ انساني سيلن کي ڪُوڙن جي دماغن ۾ ٽرانسپلانٽ ڪرڻ تي پوئين تحقيق جي ڀيٽ ۾ ڪيترائي فائدا آهن. پهريون، اسان hCO کي ابتدائي پوسٽنيٽل چوٽن جي ترقي پذير ڪارٽيڪس ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو، جيڪو جسماني ۽ فنڪشنل انضمام کي آسان بڻائي سگھي ٿو. ٻيو، t-hCO MRI مانيٽرنگ اسان کي جيئري جانورن ۾ گرافٽ پوزيشن ۽ واڌ جو مطالعو ڪرڻ جي اجازت ڏني، اسان کي ڊگهي مدت جي گھڻ-جانورن جي مطالعي کي ڪرڻ ۽ ڪيترن ئي hiPS سيل لائنن جي اعتبار کي قائم ڪرڻ جي اجازت ڏني. آخرڪار، اسان الڳ ٿيل سنگل سيل معطلي جي بدران، برقرار آرگنائيڊس کي ٽرانسپلانٽ ڪيو، جيڪي انساني سيلن لاءِ گهٽ تباهي ڪندڙ آهن ۽ چوٿن جي دماغن ۾ انساني ڪارٽيڪس نيورون جي انضمام ۽ نسل کي فروغ ڏئي سگهن ٿا.
اسان تسليم ڪريون ٿا ته هن پليٽ فارم ۾ ترقي جي باوجود، وقتي، فضائي، ۽ ڪراس-اسپيسيز رڪاوٽون انساني نيورل سرڪٽس جي ٺهڻ کي روڪين ٿيون، ترقي جي شروعاتي مرحلي ۾ ٽرانسپلانٽيشن کان پوءِ به. مثال طور، اهو واضح ناهي ته ڇا t-hCO ۾ مشاهدو ڪيل خود بخود سرگرمي ڪارٽيڪل ڊولپمينٽ دوران مشاهدو ڪيل تال واري سرگرمي وانگر هڪ ترقياتي فينوٽائپ جي نمائندگي ڪري ٿي، يا ڇا اهو t-hCO ۾ موجود دٻائيندڙ سيل قسمن جي غير موجودگي جي ڪري آهي. ساڳئي طرح، اهو واضح ناهي ته t-hCO ۾ ليمينيشن جي غير موجودگي ڪيتري حد تائين زنجير ڪنيڪٽيويٽي کي متاثر ڪري ٿي30. مستقبل جو ڪم ٻين سيل قسمن جهڙوڪ انساني مائڪروگليا، انساني اينڊوٿيليل سيلز، ۽ GABAergic انٽرنيورون جي مختلف تناسب کي ضم ڪرڻ تي ڌيان ڏيندو جيئن اسيمبلي 6 ان ويٽرو استعمال ڪندي ڏيکاريو ويو آهي، انهي سان گڏ اهو سمجهڻ ته ڪيئن نيورل انٽيگريشن ۽ پروسيسنگ تبديل ٿيل t-hCO ۾ ٿي سگهي ٿي. مريضن کان حاصل ڪيل سيلن ۾ ٽرانسڪرپشنل، سيناپٽڪ ۽ رويي جي سطح.
مجموعي طور تي، هي ان ويوو پليٽ فارم هڪ طاقتور وسيلو جي نمائندگي ڪري ٿو جيڪو ان ويٽرو انساني دماغ جي ترقي ۽ بيمارين جي تحقيق کي پورو ڪري سگهي ٿو. اسان اميد ڪريون ٿا ته هي پليٽ فارم اسان کي ٻي صورت ۾ بيوقوف مريضن مان نڪتل سيلز ۾ ناول اسٽرينڊ-ليول فينوٽائپس کي دريافت ڪرڻ ۽ نئين علاج جي حڪمت عملين کي جانچڻ جي اجازت ڏيندو.
اسان اڳ ۾ بيان ڪيل طور تي HiPS سيلز مان hCO2.5 پيدا ڪيو. فيڊر ليئرز تي ڪلچر ڪيل hiPS سيلز مان hCO پيداوار شروع ڪرڻ لاءِ، hiPS سيلز جي برقرار ڪالونين کي ڊسپيز (0.35 mg/mL) استعمال ڪندي ڪلچر ڊشز مان هٽايو ويو ۽ hiPS سيل ڪلچر ميڊيم سان گڏ ڊشز تي مشتمل الٽرا لو اٽيچمينٽ پلاسٽڪ ڪلچرز ۾ منتقل ڪيو ويو. (ڪارننگ) ٻن SMAD انبيٽرز ڊورسومورفين (5 μM؛ P5499، سگما-الڊرچ) ۽ SB-431542 (10 μM؛ 1614، ٽوڪريس) ۽ ROCK انبيٽر Y-27632 (10 μM؛ S1049، سيليڪ ڪيم) سان گڏ ڪيو ويو. پهرين 5 ڏينهن دوران، hiPS سيل ميڊيم روزانو تبديل ڪيو ويو ۽ ڊورسومورفين ۽ SB-431542 شامل ڪيا ويا. معطلي جي ڇهين ڏينهن تي، نيورل اسفيروئڊس کي نيوروبيسل-اي (10888، لائف ٽيڪنالاجيز)، وٽامن اي کان سواءِ بي-27 سپليمينٽ (12587، لائف ٽيڪنالاجيز)، گلوٽا ميڪس (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز)، پينسلين ۽ اسٽريپٽومائسن (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز) تي مشتمل نيورل ميڊيم ۾ منتقل ڪيو ويو ۽ ڏينهن 24 تائين ايپيڊرمل گروٿ فيڪٽر (EGF؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ آر اينڊ ڊي سسٽمز) ۽ فائبروبلاسٽ گروٿ فيڪٽر 2 (FGF2؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ آر اينڊ ڊي سسٽمز) سان گڏ ڪيو ويو. ڏينهن 25 کان ڏينهن 42 تائين، ميڊيم کي دماغ مان نڪتل نيوروٽروفڪ فيڪٽر (BDNF؛ 20 اين جي ايم ايل−1، پيپروٽيڪ) ۽ نيوروٽروفين 3 (NT3؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ پيپروٽيڪ) سان گڏ ڪيو ويو، هر ٻئي ڏينهن وچولي تبديلين سان. معطلي جي ڇهين ڏينهن تي، نيورل اسفيروئڊس کي نيوروبيسل-اي (10888، لائف ٽيڪنالاجيز)، وٽامن اي کان سواءِ بي-27 سپليمينٽ (12587، لائف ٽيڪنالاجيز)، گلوٽا ميڪس (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز)، پينسلين ۽ اسٽريپٽومائسن (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز) تي مشتمل نيورل ميڊيم ۾ منتقل ڪيو ويو ۽ ڏينهن 24 تائين ايپيڊرمل گروٿ فيڪٽر (EGF؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ آر اينڊ ڊي سسٽمز) ۽ فائبروبلاسٽ گروٿ فيڪٽر 2 (FGF2؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ آر اينڊ ڊي سسٽمز) سان گڏ ڪيو ويو. ڏينهن 25 کان ڏينهن 42 تائين، ميڊيم کي دماغ مان نڪتل نيوروٽروفڪ فيڪٽر (BDNF؛ 20 اين جي ايم ايل−1، پيپروٽيڪ) ۽ نيوروٽروفين 3 (NT3؛ 20 اين جي ايم ايل−1؛ پيپروٽيڪ) سان گڏ ڪيو ويو، هر ٻئي ڏينهن وچولي تبديلين سان.معطلي جي ڇهين ڏينهن تي، نيورل اسفيروئڊس کي هڪ نيورل ميڊيم ۾ منتقل ڪيو ويو جنهن ۾ نيوروباسال-اي (10888، لائيف ٽيڪنالاجيز)، وٽامن اي کان سواءِ بي-27 سپليمينٽ (12587، لائيف ٽيڪنالاجيز)، گلوٽا ميڪس (1:100، لائيف ٽيڪنالاجيز)، پينسلين شامل هئا.и стрептомицин (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста; ng/ml; R&D Systems) ۽ اسٽريپٽومائسن (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز) ۽ ايپيڊرمل گروٿ فيڪٽر (EGF؛ 20 ng/ml؛ R&D سسٽم) ۽ فائبروبلاسٽ گروٿ فيڪٽر 2 (FGF2؛ 20 ng/ml؛ R&D سسٽم) سان گڏ 24 ڏينهن تائين.25 کان 42 ڏينهن تائين، دماغ مان نڪتل نيوروٽروفڪ فيڪٽر (BDNF؛ 20 ng ml-1، پيپروٽيڪ) ۽ نيوروٽروفين 3 (NT3؛ 20 ng ml-1، پيپروٽيڪ) کي ميڊيم ۾ شامل ڪيو ويو، هر ٻئي ڏينهن ميڊيم کي تبديل ڪيو ويو.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,Life Technologies）、不含维生素A B27补充剂 (12587، لائف ٽيڪنالاجيز)، گلوٽا ميڪس (1: 100، لائف ٽيڪنالاجيز) ٽيڪنالاجيز) 并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D سسٽم 和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a 的 第 第 6 天 将 神经补充剂（12587، لائف ٽيڪنالاجي） Glutamax （1: 100، Life TechNOGIS 青霉素 神经 培养 基 中 链霉素: 1 لائف ٽيڪنالاجيز 表皮 生长 因子 （（； (20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1； R&D Systems）笩囤 4 . 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку 2 витамина А (12587, لائف ٽيڪنالاجيز), GlutaMax (1:100, لائف ٽيڪنالاجيز), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) فيڪٽري روسٽا (EGF؛ 20 انگ ml-1؛ R&D سسٽم) ۽ фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; ڇهين ڏينهن تي، نيوروسفيئر سسپنشن کي هڪ سپليمينٽ ۾ تبديل ڪيو ويو جنهن ۾ نيوروبيسل-اي (10888، لائف ٽيڪنالاجيز)، وٽامن اي کان سواءِ بي-27 سپليمينٽ (12587، لائف ٽيڪنالاجيز)، گلوٽا ميڪس (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز)، پينسلين-نيوٽرلائيزڊ اسٽريپٽومائسن (1:100، لائف ٽيڪنالاجيز) شامل هئا جيڪي ايپيڊرمل گروٿ فيڪٽر (EGF؛ 20 اين جي ايم ايل-1؛ آر اينڊ ڊي سسٽم) ۽ فائبروبلاسٽ گروٿ فيڪٽر 2 (FGF2؛ 20 اين جي ايم ايل-1) 1 سان گڏ هئا؛ آر اينڊ ڊي سسٽم) 24 سالن تائين. آر اينڊ ڊي سسٽم) 24 ڏينهن تائين.25 کان 42 ڏينهن تائين، دماغ مان نڪتل نيوروٽروفڪ فيڪٽر (BDNF؛ 20 ng ml-1، پيپروٽيڪ) ۽ نيوروٽروفڪ فيڪٽر 3 (NT3؛ 20 ng ml-1، پيپروٽيڪ) هر ٻئي ڏينهن ڪلچر ميڊيم ۾ شامل ڪيا ويا. هڪ ڀيرو وچولي تبديلي.ڏينهن 43 کان شروع ڪندي، hCO کي غير اضافي نيوروبيسل-اي ميڊيم (NM; 1088022, Thermo Fisher) ۾ هر 4-6 ڏينهن ۾ وچولي تبديلي سان برقرار رکيو ويو. فيڊر لیس حالتن ۾ ڪلچر ڪيل hiPS سيلز مان hCO حاصل ڪرڻ لاءِ، hiPS سيلز کي Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) سان 37°C تي 7 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، سنگل سيلز ۾ الڳ ڪيو ويو، ۽ AggreWell 800 پليٽس (34815, STEMCELL Technologies) تي 3 × 106 سنگل سيلز في ويل جي کثافت تي Essential 8 ميڊيم ۾ پليٽ ڪيو ويو، جنهن ۾ ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) شامل ڪيو ويو. 24 ڪلاڪن کان پوءِ، کوهن ۾ موجود ميڊيا کي مٿي ۽ هيٺ پائپ ڪيو ويو جنهن ۾ ايسينشل 6 ميڊيا (A1516401، لائف ٽيڪنالاجيز) شامل هئي جنهن ۾ ڊورسومورفين (2.5 μM؛ P5499، سگما-الڊرچ) ۽ SB-431542 (10 μM؛ 1614) شامل هئا.، ٽوڪريڊا). ڏينهن 2 کان 6 تائين، ايسينشل 6 ميڊيم کي روزانو ڊورسومورفين ۽ سپليمينٽ SB-431542 سان تبديل ڪيو ويو. ڇهين ڏينهن کان، نيوروسفيئر سسپنشن کي نيوروبيسل ميڊيم ڏانهن منتقل ڪيو ويو ۽ مٿي بيان ڪيل طور تي برقرار رکيو ويو.
سڀني جانورن جي طريقيڪار کي اسٽينفورڊ يونيورسٽي ليبارٽري اينيمل ڪيئر ايڊمنسٽريٽو ڪميٽي (APLAC) پاران منظور ڪيل جانورن جي سنڀال جي هدايتن جي مطابق انجام ڏنو ويو. حاملہ ايٿيمڪ RNU (rnu/+) چوٿون خريد ڪيون ويون (چارلس درياء ليبارٽريز) يا رهائش ڏني وئي. جانورن کي کاڌي ۽ پاڻي جي اشتهاري طور تي 12 ڪلاڪن جي روشني-اونداهي چڪر تي رکيو ويو. ٽن کان ست ڏينهن جي عمر جي ننگي (FOXN1–/–) چوٿون ڪتا ڪٽڻ کان اڳ نابالغ وسڪرن جي واڌ سان سڃاڻپ ڪيا ويا. ڪتن (نر ۽ مادي) کي 2-3٪ آئسو فلورين سان بي هوشي ڪئي وئي ۽ هڪ اسٽيريوٽيڪسڪ فريم تي رکيو ويو. ڊورا ميٽر جي سالميت کي برقرار رکندي S1 کان مٿي تقريبن 2-3 ملي ميٽر جي قطر سان کوپڙي جو ٽريپينيشن ڪيو ويو. پوءِ ڊورا کي سوراخ ڪرڻ لاءِ ڪرينيوٽومي جي ٻاهران 30-G سوئي (تقريبن 0.3 ملي ميٽر) استعمال ڪريو. پوءِ HCO کي هڪ پتلي 3×3 سينٽي ميٽر پيرا فلم تي لاڳو ڪريو ۽ اضافي وچولي کي هٽايو. 23 G، 45° سوئي سان ڳنڍيل هيميلٽن سرنج استعمال ڪندي، نرميءَ سان hCO کي سوئي جي سڀ کان پري واري پڇاڙيءَ ۾ ڇڪيو. پوءِ سرنج کي اسٽيريوٽيڪسڪ ڊيوائس سان ڳنڍيل سرنج پمپ تي نصب ڪريو. پوءِ سوئي جي نوڪ کي ڊورا (z = 0 mm) ۾ اڳ ۾ ٺهيل 0.3 ملي ميٽر ويڪر پنڪچر سوراخ تي رکو ۽ سرنج کي 1-2 ملي ميٽر (z = تقريبن -1.5 ملي ميٽر) تنگ ڪريو جيستائين سوئي ڊورا ميٽر A جي وچ ۾ نه هجي. هڪ گهاٽو مهر ٺهي وڃي. پوءِ سرنج کي z = -0.5 ملي ميٽر تي ڪارٽيڪل مٿاڇري جي مرڪز ڏانهن وڌايو ۽ hCO کي 1-2 µl في منٽ جي شرح سان انجيڪشن ڪريو. hCO انجيڪشن مڪمل ٿيڻ کان پوءِ، سوئي کي 0.2-0.5 ملي ميٽر في منٽ جي شرح سان واپس ورتو ويندو آهي، چمڙي کي سلائي ڪيو ويندو آهي، ۽ ڪتي کي فوري طور تي مڪمل بحالي تائين گرم حرارتي پيڊ تي رکيو ويندو آهي. ڪجهه جانورن کي ٻٽي طور تي ٽرانسپلانٽ ڪيو ويو هو.
سڀئي جانورن جا طريقا اسٽينفورڊ يونيورسٽي APLAC پاران منظور ٿيل جانورن جي سنڀال جي هدايتن جي مطابق ڪيا ويا. چوٿين (پيوندڪاري کان 60 ڏينهن کان وڌيڪ) کي 5٪ آئسوفلورين اينستيسيا سان متاثر ڪيو ويو ۽ تصويرنگ دوران 1-3٪ آئسوفلورين سان بي هوشي ڪئي وئي. ويزوئلائيزيشن لاءِ، هڪ 7 ٽيسلا فعال طور تي شيلڊ ٿيل افقي بورهول اسڪينر بروڪر (بروڪر ڪارپوريشن) هڪ انٽرنيشنل اليڪٽرڪ ڪمپني (IECO) گريڊينٽ ڊرائيو سان، هڪ شيلڊ ٿيل گريڊينٽ انسرٽ 120 ملي ميٽر (600 mT/m، 1000 T/m/s) جي اندروني قطر سان AVANCE استعمال ڪندي استعمال ڪيو ويو. III، اٺ-چينل ملٽي ڪوئل RF ۽ ملٽي ڪور صلاحيتون، ۽ ان سان گڏ پيرا ويزن 6.0.1 پليٽ فارم. رڪارڊنگ هڪ فعال طور تي ڊيڪپل ٿيل واليوميٽرڪ RF ڪوئل استعمال ڪندي ڪئي وئي جنهن جو اندروني قطر 86 ملي ميٽر ۽ هڪ چار-چينل ڪرائو-ڪولڊ RF ڪوئل صرف وصول ڪرڻ لاءِ. محوري 2D ٽربو-RARE (ورهاڱي جو وقت = 2500 ms، گونج جو وقت = 33 ms، 2 سراسري) 16 سلائس ڪيپچر سان، سلائس جي ٿولهه 0.6-0.8 mm، جنهن ۾ 256 × 256 نمونا شامل آهن. سگنل 2 سينٽي ميٽر جي اندروني قطر سان هڪ ڪواڊريچر ٽرانسيور واليوميٽرڪ آر ايف ڪوئل استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا (ريپڊ ايم آر انٽرنيشنل، ايل ايل سي). آخرڪار، 3D رينڊرنگ ۽ حجم تجزيي لاءِ بلٽ ان اماريس (بٽ پلين) مٿاڇري جي تخميني افعال استعمال ڪريو. هڪ ڪامياب ٽرانسپلانٽ کي هڪ طور بيان ڪيو ويو جنهن ۾ ٽرانسپلانٽ ٿيل اڌ گول ۾ مسلسل T2-وزن واري ايم آر آئي سگنل جا علائقا ٺاهيا ويا. گرافٽ رد ڪرڻ کي هڪ گرافٽ طور بيان ڪيو ويو جيڪو ٽرانسپلانٽ ٿيل اڌ گول ۾ مسلسل T2-وزن واري ايم آر آئي سگنل جا علائقا پيدا نه ڪندو هو. سب ڪارٽيڪل t-hCO کي بعد جي تجزيي مان خارج ڪيو ويو.
ٻن-فوٽن ڪيلشيم اميجنگ لاءِ hCO ۾ GCaMP6s کي مستحڪم طور تي ظاهر ڪرڻ لاءِ، hiPS سيلز کي pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro سان متاثر ڪيو ويو ۽ ان کان پوءِ اينٽي بايوٽڪ جي چونڊ ڪئي وئي. مختصر طور تي، سيلز کي EDTA سان الڳ ڪيو ويو ۽ پوليبريين (5 μg/ml) ۽ 15 μl وائرس جي موجودگي ۾ تقريبن 300,000 سيلز جي کثافت تي 1 ml Essential 8 ميڊيم ۾ معطل ڪيو ويو. پوءِ سيلز کي 60 منٽن لاءِ معطلي ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو ۽ هر کوهه ۾ 50,000 سيلز جي کثافت تي ٻج ڪيو ويو. سنگم کان پوءِ، سيلز کي 5-10 ڏينهن لاءِ 5-10 μg ml-1 پيورومائسن سان علاج ڪيو ويو يا جيستائين مستحڪم ڪالونيون ظاهر نه ٿين. تيز hCO انفيڪشن اڳ ۾ بيان ڪيل 5 مطابق ڪجهه تبديلين سان ڪيو ويو. مختصر ۾، ڏينهن 30-45 hCO کي 1.5 ml Eppendorf مائڪرو سينٽرفيوج ٽيوب ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ 100 μl نرو ميڊيم شامل آهن. پوءِ تقريباً 90 µl ميڊيم ڪڍيو ويندو آهي، 3-6 µl هاءِ ٽائيٽر لينٽي وائرس (0.5 x 108 کان 1.2 x 109 تائين) ٽيوب ۾ شامل ڪيو ويندو آهي، ۽ hCO کي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽر ڏانهن منتقل ڪيو ويندو آهي. پوءِ هر ٽيوب ۾ 90-100 µl ميڊيم شامل ڪريو ۽ ٽيوب کي رات جو انڪيوبيٽر ڏانهن واپس موڪليو. ٻئي ڏينهن، گهٽ اٽيچمينٽ پليٽن ۾ تازي اعصاب ميڊيم ڏانهن hCO منتقل ڪريو. 7 ڏينهن کان پوءِ، انفيڪشن جي معيار جي تصور ۽ تشخيص لاءِ hCO کي 24-کوئلي شيشي جي هيٺان پليٽن ۾ منتقل ڪيو ويو. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ۽ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ویکٹر بلڊر پاران پيدا ڪيا ويا. لينٽي وائرس اڪثر تجربن ۾ استعمال ٿيندو آهي ڇاڪاڻ ته اهو ميزبان جينوم ۾ ضم ٿيل آهي، متاثر ٿيل سيل لائنن ۾ رپورٽر جين جي اظهار جي اجازت ڏئي ٿو. ريبيز جي پيروي لاءِ، ڏينهن 30-45 hCO کي ريبيز-ΔG-eGFP ۽ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (پلازمڊ #67528، ايڊجين) سان گڏ متاثر ڪيو ويو، 3 ڏينهن تائين چڱي طرح ڌوئي ويو، ۽ S1 ۾ چوهڙن ۾ ٽرانسپلانٽ ڪيو ويو ۽ 7-14 ڏينهن تائين وييو ۾ رکيو ويو.
اميونوسائيٽو ڪيمسٽري لاءِ، جانورن کي بي هوشي ڏني وئي ۽ پي بي ايس سان ٽرانس ڪارڊيئلي پرفيوز ڪيو ويو جنهن کان پوءِ 4٪ پيرافارملڊيهائيڊ (پي بي ايس ۾ پي ايف اي؛ اليڪٽران مائڪروسڪوپي سائنسز). دماغن کي 4٪ پي ايف اي ۾ 2 ڪلاڪن لاءِ يا رات جو 4 ° سي تي مقرر ڪيو ويو، 48-72 ڪلاڪن لاءِ پي بي ايس ۾ 30٪ سوڪروز ۾ ڪرائوپريزرو ڪيو ويو، ۽ 1:1، 30٪ سوڪروز ۾ شامل ڪيو ويو: او سي ٽي (ٽشو-ٽيڪ او سي ٽي ڪمپائونڊ 4583، ساڪورا فائنٽيڪ) ۽ ڪورونل سيڪشن 30 µm تي ڪرائوسٽٽ (لائيڪا) استعمال ڪندي ٺاهيا ويا. ٿلهي حصن جي اميونوسٽو ڪيمسٽري لاءِ، جانورن کي پي بي ايس سان پرفيوز ڪيو ويو، ۽ دماغ کي وائبرٽوم (لائيڪا) استعمال ڪندي 300-400 µm تي ڪورونلي طور تي ڪٽيو ويو ۽ سيڪشن 30 منٽن لاءِ 4٪ پي ايف اي سان مقرر ڪيو ويو. پوءِ ڪرائو سيڪشن يا ٿلها حصا پي بي ايس سان ڌوتا ويا، ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاءِ بلاڪ ڪيا ويا (10٪ نارمل ڊونڪ سيرم (اين ڊي ايس) ۽ 0.3٪ ٽرائٽن ايڪس-100 پي بي ايس ۾ ملائي) ۽ 4 ° سي تي بلاڪنگ محلول سان بلاڪ ڪيا ويا. - انڪيوبيشن ڪرائو سيڪشن کي رات جو انڪيوبيٽ ڪيو ويو ۽ ٿلها حصا 5 ڏينهن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيا ويا. استعمال ٿيندڙ بنيادي اينٽي باڊيز هي هيون: اينٽي-نيو اين (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam) اينٽي-CTIP2 (چوٿون، 1:300؛ ab18465، abcam)، اينٽي-GFAP (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، ڊاڪو)، اينٽي-GFP (ڪڪڙ، 1:1,000؛ GTX13970، جين ٽيڪس)، اينٽي-HNA (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اينٽي-نيو اين (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملي پور)، اينٽي-PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا ڪروز)، اينٽي-PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اٽلس اينٽي باڊيز)، اينٽي-RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اينٽي-SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي-SOX9 (بڪري، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، نيٽرين G1a (بڪري، 1:100؛ AF1166، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽي-STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، تاڪارا بايو)، اينٽي-SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اينٽي-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملي پور) ۽ اينٽي-IBA1 (بڪري، 1:100؛ ab5076، abcam). استعمال ٿيندڙ بنيادي اينٽي باڊيز هي هيون: اينٽي-نيو اين (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam) اينٽي-CTIP2 (چوٿون، 1:300؛ ab18465، abcam)، اينٽي-GFAP (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، ڊاڪو)، اينٽي-GFP (چکن، 1:1,000؛ GTX13970، جين ٽيڪس)، اينٽي-HNA (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اينٽي-نيو اين (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملي پور)، اينٽي-PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا ڪروز)، اينٽي-PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اٽلس اينٽي باڊيز)، اينٽي-RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اينٽي-SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي-SOX9 (بڪري، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، نيٽرين G1a (بڪري، 1:100؛ AF1166، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽي-STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، تاڪارا بايو)، اينٽي-SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اينٽي-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملي پور) ۽ اينٽي-IBA1 (بڪري، 1:100؛ ab5076، abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (mышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, ab16, abcam) اينٽي-GFAP (ڪروليچي، 1:1000؛ Z0334، ڊاڪو)، اينٽي- -GFP (ڪيوريزا، 1:1000؛ GTX13970، جيني ٽيڪس)، اينٽي-HNA (مئش، 1:200)، ab1N1919 (ڪروليڪ، 1:500؛ ABN78، مليپور) اينٽي-PDGFRA (ڪروليڪ، 1:200؛ sc-338، سانتا-ڪروز)، اينٽي-PPP1R17 (کروليڪ، 1:200؛ HPA047819، ائٽلس اينٽي باڊيز)، اينٽي-RECA-1 (م:19؛ 7؛ 7؛ 7؛ 5؛ 7؛؛ اينٽي-SCG2 (ڪروليڪ، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي-SOX9 (ڪوزي، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽرين G1a (ڪوزي، 1:100، R166)، سسٽم ANTI-STEM121 (Mышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (mышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) ۽ ANTI-IBA1 (ڪوزا, 1:100; аб507). استعمال ٿيندڙ بنيادي اينٽي باڊيز هي هيون: اينٽي-نيو اين (ماؤس، 1:500؛ ab104224، abcam)، اينٽي-CTIP2 (چوٿون، 1:300؛ ab18465، abcam)، اينٽي-GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ڊاڪو)، اينٽي-GFP (چکن، 1:1000؛ GTX13970، جين ٽيڪس)، اينٽي-HNA (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اينٽي-نيو اين (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملي پور)، اينٽي-PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا ڪروز)، اينٽي-PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اٽلس اينٽي باڊيز)، اينٽي-RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اينٽي- SCG2 (خرگوش، 1:100؛ 20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي- SOX9 (بڪري، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، نيٽرين G1a (بڪري، 1:100؛ AF1166، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽي- STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، تاڪارا بايو)، اينٽي- SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اينٽي- GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملي پور) ۽ اينٽي- IBA1 (بڪري، 1:100؛ ab5076، abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1:3 00؛ ab18465، abcam)، 抗GFAP (兔، 1:1,000؛ Z0334، Dako)، 抗-GF پي (鸡، 1:1,000؛ GTX13970، جيني ٽيڪس)، 抗HNA (小鼠، 1: 200؛ 1911ع) 81، abcam)، 抗NeuN (兔، 1:500) ABN78، مليپور، 抗PDGFRA (兔، 1:200؛sc-338، سانتا کروز، 抗PPP1R17 (兔، 1:200؛ HPA047819، ائٽلس)抗体）، 抗RECA-1（小鼠، 1:50；ab9774، abcam）،抗SCG2（兔）، 1:100；20357-1-AP، Proteintech）، 抗SOX9（山羊، 1:500；AF3075، R&D Systems）، Netrin G1a（山羊）، 1:100；AF1166； سسٽم)، 抗STEM121 (小鼠، 1:200؛使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠,1 : 300؛ اب 18465، ايب ڪيم)، 抗GFAP (兔، 1:1,000؛ Z0334، ڊاڪو)، 抗-GFP（鸡； 1:1,000；GTX13970；GeneTex））, 抗HNA）小鼠، 1:200；ab 191181، ايب ڪيم)، نيون (兔، 1:500؛ ABN78، مليپور، 弔، 抗1: 200-sc-338، سانتا Cruz)، 抗PPP1R17（兔، 1:200；HPA047819، Atlas 抗体）،抗RECA-1（小鼠، 1:50；ab9774، abcam）، SCG2 100；20357-1-AP، Proteintech）، 抗SOX9（山羊، 1:500；AF3075,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊,1:100；AF1166,R&0s:R&0;Y40410، تاڪارا بايو)، اينٽي-SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اينٽي-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملي پور) ۽ اينٽي-IBA1 (بڪري، 1:100؛ ab5076، abcam).استعمال ٿيندڙ بنيادي اينٽي باڊيز هي هيون: اينٽي-نيو اين (مائوس، 1:500؛ ab104224، abcam)، اينٽي-CTIP2 (چوٿون، 1:300؛ ab18465، abcam)، اينٽي-GFAP (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ڊاڪو). ، اينٽي-GFP (چکن، 1:1000؛ GTX13970، جين ٽيڪس)، اينٽي-HNA (ماؤس، 1:200؛ ab191181، abcam)، اينٽي-NeuN (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملي پور)، اينٽي-PDGFRA (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا ڪروز)، اينٽي-PPP1R17 (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اٽلس اينٽي باڊي)، اينٽي-RECA-1 (ماؤس، 1:50؛ ab9774، abcam)، اينٽي-SCG2 (خرگوش)، 1:100؛20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي-SOX9 (ڪوزا، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، نيٽرن جي 1a (ڪوزا، 1:100؛ AF1166، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽي-STEM121، Y4001; ٽاڪارا بايو)، ANTI-SATB2 (mышь, 1:50; ab51502, abcam), ANTI-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (ڪوزا, 1:100, бакама6); 20357-1-AP، پروٽين ٽيڪ)، اينٽي-SOX9 (بکري، 1:500؛ AF3075، آر اينڊ ڊي سسٽم)، نيٽرين G1a (بکري، 1:100؛ AF1166، آر اينڊ ڊي سسٽم)، اينٽي-STEM121 (ماؤس، 1:200؛ Y40410، تاڪارا بايو)، اينٽي-SATB2 (ماؤس، 1:50؛ ab51502، abcam)، اينٽي-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملي پور)، ۽ اينٽي-IBA1 (بکري، 1:100؛ ab5076، abkam).پوءِ حصن کي PBS سان ڌوتو ويو ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊي سان 1 ڪلاڪ لاءِ ڪمري جي حرارت تي (منجمد حصن) يا رات جو 4°C (ٿلها حصا) تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. Alexa Fluor سيڪنڊري اينٽي باڊي (لائف ٽيڪنالاجيز) 1:1000 ۾ بلاڪنگ محلول ۾ ملائي استعمال ڪيو ويو. PBS سان ڌوئڻ کان پوءِ، نيوڪلئي کي Hoechst 33258 (لائف ٽيڪنالاجيز) سان تصور ڪيو ويو. آخرڪار، سلائيڊز کي هڪ مائڪروسڪوپ تي ڪور سلپس (فشر سائنٽيفڪ) سان Aquamount (Polysciences) استعمال ڪندي رکيو ويو ۽ تصوير تي Keyence fluorescent microscope (BZ-X analyzer) يا Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) تي تجزيو ڪيو ويو. تصويرن کي ImageJ پروگرام (Fiji) استعمال ڪندي پروسيس ڪيو ويو. t-hCO ۽ چوٿون ڪارٽيڪس ۾ انساني نيورون جي تناسب کي مقدار ڏيڻ لاءِ، 387.5 μm ويڪر مستطيل تصويرون t-hCO جي مرڪز تي، چوٿون ڪارٽيڪس جي ڪناري تي يا ان جي ويجهو ورتيون ويون. گرافٽ مارجن ٽشو شفافيت، HNA+ نيوڪلئي، ۽/يا ٽشو آٽو فلوروسينس جي موجودگي ۾ تبديلين جو جائزو وٺي طئي ڪيا ويا. هر تصوير ۾، NeuN+ ۽ HNA+ سيلز جي ڪل تعداد کي ساڳئي علائقي ۾ NeuN+ سيلز جي ڪل تعداد سان ورهايو ويو. اهو يقيني بڻائڻ لاءِ ته صرف تصوير جي جهاز ۾ نيوڪلئي سان سيلز ڳڻيا وڃن، صرف اهي سيلز جيڪي Hoechst+ پڻ آهن انهن کي حساب ۾ شامل ڪيو ويو آهي. شمارياتي غلطي کي گهٽائڻ لاءِ گهٽ ۾ گهٽ 1 ملي ميٽر سان الڳ ٿيل ٻن تصويرن جو اوسط ڪيو ويو.
نموني گڏ ڪرڻ کان هڪ هفتو اڳ، hCO ٽرانسپلانٽ جانورن (تقريبن 8 مهينن جي فرق) کي هڪ اونداهي ڪمري ۾ رکون جنهن ۾ مُڇون تراشيون وڃن ته جيئن حسي محرڪ کي گهٽ ۾ گهٽ ڪري سگهجي. نيوڪلئي جي الڳ ڪرڻ کي اڳ ۾ بيان ڪيل طريقي سان ڪيو ويو، ڪجهه ترميمن سان. مختصر طور تي، t-hCO ۽ hCO کي ڊٽرجنٽ-مڪينيڪل سيل ليسس ۽ 2 ملي گلاس ٽشو گرائنڊر (D8938، سگما-الڊرچ/ڪِمبلي) استعمال ڪندي تباهه ڪيو ويو. پوءِ خام نيوڪلئي کي 40 µm فلٽر استعمال ڪندي فلٽر ڪيو ويو ۽ 320 g تي 10 منٽن لاءِ 4 °C تي سينٽريفيوج ڪيو ويو ان کان اڳ جو هڪ سُڪروز ڊينسٽي گريڊينٽ ڪيو وڃي. سينٽريفيوگيشن قدم کان پوءِ (4 °C تي 20 منٽن لاءِ 320 g)، نمونن کي 0.04% BSA/PBS ۾ µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1، AM2682، Ambion) جي 0.2 يونٽن جي اضافي سان ٻيهر معطل ڪيو ويو ۽ 40 µm فلو فلٽر مان گذريو ويو. پوءِ الڳ ٿيل نيوڪلئي کي PBS ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو جنهن ۾ 0.02٪ BSA شامل هو ۽ هڪ ڪروميم سنگل سيل 3′ چپ تي لوڊ ڪيو ويو (في لين 8,000 سيلز جي اندازي مطابق بحالي). snRNA-seq لائبريريون ڪروميم سنگل سيل 3′ GEM، لائبريري ۽ جيل بيڊ ڪٽ v3 (10x جينومڪس) سان تيار ڪيون ويون. snRNA-seq لائبريريون ڪروميم سنگل سيل 3′ GEM، لائبريري ۽ جيل بيڊ ڪٽ v3 (10x جينومڪس) سان تيار ڪيون ويون. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جينومڪس). snRNA-seq لائبريريون ڪروميم سنگل سيل 3′ GEM، لائبريري ۽ جيل بيڊ ڪٽ v3 (10x جينومڪس) استعمال ڪندي تيار ڪيون ويون. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جينومڪس). snRNA-seq لائبريري ڪروميم سنگل سيل 3′ GEM، لائبريري ۽ جيل بيڊ ڪٽ v3 (10x جينومڪس) استعمال ڪندي تيار ڪئي وئي هئي.مختلف نمونن مان لائبريريون ايڊميرا هيلٿ پاران نووا سيڪ ايس 4 (ايلومينا) تي گڏ ڪيون ويون ۽ ترتيب ڏنيون ويون.
هر پوٽيٽو نيوڪليئر بارڪوڊ لاءِ جين ايڪسپريشن ليولز کي 10x جينومڪس سيل رينجر اينالائسز سافٽ ويئر پيڪيج (ورژن 6.1.2) استعمال ڪندي مقدار ۾ طئي ڪيو ويو. خاص طور تي، ريڊز کي mkref ڪمانڊ سان ٺاهيل انساني (GRCh38، اينسمبل، ورزن 98) ۽ چوٿون (Rnor_6.0، اينسمبل، ورزن 100) ريفرنس جينومز جي ميلاپ سان ملايو ويو ۽ مقدار ۾ شامل ڪرڻ لاءِ -include-introns=TRUE ڪمانڊ سان ڳڻپ استعمال ڪندي انٽرون علائقن ۾ ميپ ڪيل ريڊنگ شامل آهن. t-hCO نمونن لاءِ، انساني نيوڪلئي جي سڃاڻپ قدامت پسند ضرورت جي بنياد تي ڪئي وئي ته گهٽ ۾ گهٽ 95٪ سڀني ميپ ٿيل ريڊز انساني جينوم سان ملن. بعد ۾ سڀ تجزيا سيل رينجر مان فلٽر ٿيل بارڪوڊ ايري آئوٽ پُٽ تي R پيڪيج (ورزن 4.1.2) سيورٽ (ورزن 4.1.1) 32 استعمال ڪندي ڪيا ويا.
انهي ڳالهه کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته ايندڙ تجزيي ۾ صرف اعليٰ معيار جا مرڪز شامل ڪيا وڃن، هر نموني لاءِ هڪ ٻيهر فلٽرنگ جو عمل لاڳو ڪيو ويو. پهريون، گهٽ معيار وارا مرڪز جن ۾ 1000 کان گهٽ منفرد جين مليا ۽ ڪل مائيٽوڪونڊريا جو 20 سيڪڙو کان وڌيڪ سڃاڻپ ۽ هٽايو ويو. بعد ۾، خام جين نمبر ميٽرڪس کي sctransform(vst.flavor=”v2″) فنڪشن استعمال ڪندي باقاعده منفي بائنوميل ريگريشن ذريعي نارمل ڪيو ويو، جنهن ڊفالٽ پيرا ميٽرز استعمال ڪندي 3000 سڀ کان وڌيڪ متغير جين جي سڃاڻپ پڻ ڪئي. 30 جي ڊيٽا سيٽ جي طول و عرض کي استعمال ڪندي ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان پرنسپل ڪمپونينٽ ايناليسس (PCA) استعمال ڪندي مٿين متغير جين تي طول و عرض جي گھٽتائي ڪئي وئي (dims = 30 کي گوڏن جي سائيٽن جي بصري معائني جي بنياد تي چونڊيو ويو ۽ سڀني نمونن ۽ اينسمبل تجزين لاءِ استعمال ڪيو ويو). پوءِ اسان غير معمولي طور تي گهٽ جين ڳڻپ (10 هين پرسنٽائل کان هيٺ ميڊين)، غير معمولي طور تي وڌيڪ مائيٽوڪونڊريل جين ڳڻپ (95 هين پرسنٽائل کان مٿي ميڊين) جي بنياد تي جين کي درجه بندي ڪرڻ لاءِ ٻيهر ڪلسٽرنگ (ريزوليوشن = 1) جا ڪيترائي دور ڪيا ته جيئن گهٽ معيار جي پوٽيٽو سيلز کي سڃاڻڻ ۽ ختم ڪرڻ لاءِ. ڪلسٽر ۽/يا شڪي ٽوئنز جو هڪ وڏو تناسب جيڪو DoubletFinder33 پيڪيج استعمال ڪندي سڃاڻپ ڪيو ويو (مطلب DoubletFinder اسڪور 95 هين پرسنٽائل کان مٿي). t-hCO نمونا (n=3) ۽ hCO نمونا (n=3) الڳ الڳ استعمال ڪندي ضم ڪيا ويا. مٿي ڏنل پيرا ميٽرز سان انٽيگريٽ ڊيٽا فنڪشن. پوءِ انٽيگريٽڊ ڊيٽا سيٽ جي ڪوالٽيٽيو فلٽرنگ جو هڪ ٻيو دور مٿي بيان ڪيل طريقي سان ڪيو ويو.
گهٽ معيار جي ڪرنل کي هٽائڻ کان پوءِ، انٽيگريٽيڊ ڊيٽا سيٽ کي گروپ ڪيو ويو (ريزوليوشن = 0.5) ۽ UMAP34 بصري مقصدن لاءِ شامل ڪيو ويو. هر ڪلسٽر لاءِ مارڪر جين کي FindMarkers فنڪشن استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو هو، نارملائيزڊ جين ايڪسپريشن ڊيٽا مان ڳڻپيل ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان. اسان جنين ۽ بالغ ڪارٽيڪل ريفرنس ڊيٽا سيٽ کي مارڪر جين ايڪسپريشن 19,20,21,35 ۽ تشريح سان گڏ ڪري وڏي سيل ڪلاس جي سڃاڻپ ۽ درجه بندي ڪريون ٿا. خاص طور تي، گردش ڪندڙ اڳڪٿين کي MKI67 ۽ TOP2A جي ايڪسپريشن ذريعي سڃاڻپ ڪيو ويو. پروجينٽر ڪلسٽرز کي مائيٽوٽڪ ٽرانسڪرپٽس جي غير موجودگي، ليٽ ميٽافيز فيٽل ڪارٽيڪس ۾ بيان ڪيل ملٽي پوٽينٽ گليئل پروجينٽر ڪلسٽرز سان اعلي اوورليپ، ۽ EGFR ۽ OLIG1 ايڪسپريشن ذريعي بيان ڪيو ويو. اسان ايسٽروسائيٽ جي اصطلاح کي ايسٽروسائيٽ فرق جي ڪيترن ئي حالتن کي شامل ڪرڻ لاءِ استعمال ڪندا آهيون، ليٽ ريڊيل گليا کان ايسٽروسائيٽس جي پختگي تائين. ايسٽروسائيٽ ڪلسٽر SLC1A3 ۽ AQP4 جي اعليٰ سطحن کي ظاهر ڪن ٿا ۽ جنين ريڊيل گليا ۽/يا بالغ ايسٽروسائيٽس جي ذيلي قسمن سان نقشو ٺاهي ڏيکاريو ويو آهي. OPCs PDGFRA ۽ SOX10 ظاهر ڪن ٿا جڏهن ته oligodendrocytes myelination مارڪرز (MOG ۽ MYRF) ظاهر ڪن ٿا. Glutamatergic نيورون جي سڃاڻپ نيورونل ٽرانسڪرپٽس (SYT1 ۽ SNAP25) جي موجودگي، GABAergic مارڪرز (GAD2) جي غير موجودگي، ۽ NEUROD6، SLC17A7، BCL11B، يا SATB2 جي اظهار ذريعي ڪئي وئي. GluN نيورون کي وڌيڪ اپر (SATB2 اظهار ۽ BCL11B جو نقصان) ۽ ڊيپ (BCL11B اظهار) ذيلي ڪلاسز ۾ ورهايو ويو. پوٽيٽو سب پليٽ (SP) نيورون ڊيپ GluN مارڪرز کان علاوه سڃاتل SP18 مارڪرز جهڙوڪ ST18 ۽ SORCS1 جو اظهار ڪن ٿا. Choroid plexus-like cells جي سڃاڻپ TTR اظهار ذريعي ڪئي وئي، ۽ meningeal-like cells جي سڃاڻپ fibroblast سان لاڳاپيل جينز ۽ ريفرنس ڊيٽا سيٽ جي pial/vascular سيلز جي نقشي سان ڪئي وئي.
t-hCO ۽ hCO ذيلي ڪلاسن جي وچ ۾ جين جي اظهار جو فرقي تجزيو هڪ نئين ترقي يافته سيوڊو-بيچ طريقو استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو لبرا آر پيڪيج (ورژن 1.0.0) استعمال ڪندي لاڳو ڪيل نمونن ۾ ٻيهر پيدا ڪيو ويو. خاص طور تي، edgeR لاگ-لائڪلي هوڊ ٽيسٽ (ورزن 3.36.0، پيڪيج R) هر نموني جي نقل لاءِ ڏنل سيل ڪلاس لاءِ سيلز ۾ جين جي تعداد کي گڏ ڪندي گروپن لاءِ ڪيا ويا. هيٽ ميپ ويزوئلائيزيشن لاءِ، نارملائيزڊ في ملين (CPM) ويلوز کي edgeR (cpm() فنڪشن) استعمال ڪندي ڳڻيو ويندو آهي ۽ اسڪيل ڪيو ويندو آهي (مطلب = 0، معياري انحراف = 1 حاصل ڪرڻ لاءِ). جين آنٽولوجي (GO) افزودگي جو تجزيو خاص طور تي اپريگيولڊ t-hCO GluN جينز جو ڪيو ويو (بينجاميني-هچبرگ t-hCO GluN سيلز جي گهٽ ۾ گهٽ 10٪ ۾ ظاهر ڪيل 0.05 کان گهٽ جي P ويليو کي درست ڪيو ۽ گهٽ ۾ گهٽ 2 ڀيرا تبديلي ۾ واڌ). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 استعمال ڪندي ڪيو ويو. اسين ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان ToppFun ايپ استعمال ڪندا آهيون ۽ GO-اينوٽيڊ هائپرجيوميٽرڪ ٽيسٽن مان ڳڻپيل بينجمني-هوچبرگ-درست ٿيل P-ويليوز جي رپورٽ ڪندا آهيون.
اسان جي snRNA-seq ڪلسٽرن کي پرائمري سنگل سيل RNA-seq يا بالغ snRNA-seq19,20,21,22 جي ريفرنس اسٽڊيز مان اينوٽيٽيڊ سيل ڪلسٽرن سان ملائڻ لاءِ، اسان هڪ جوڙيل ڊيٽا سيٽ انٽيگريشن اپروچ لاڳو ڪيو. اسان ڊيٽا سيٽس جي وچ ۾ ڪلسٽر اوورليپس کي ضم ڪرڻ ۽ مقابلو ڪرڻ لاءِ Seurat ۾ SCTransform (v2) نارملائيزيشن ورڪ فلو استعمال ڪيو (مٿي ڏنل ساڳين پيرا ميٽرز کي استعمال ڪندي). انفرادي ڊيٽا سيٽس کي ڪمپيوٽيشنل ڪارڪردگي لاءِ هر اصل ڪلسٽر ۾ 500 سيلز يا ڪور تائين بي ترتيب طور تي سبسٽ ڪيو ويو. اڳ ۾ بيان ڪيل ساڳئي طريقي کي استعمال ڪندي، ڪلسٽر اوورليپ کي هر پول ٿيل ڪلسٽر ۾ سيلز يا نيوڪلئي جي تناسب جي طور تي بيان ڪيو ويو جيڪو ريفرنس ڪلسٽر جي ليبل سان اوورليپ ڪيو ويو. GluNs کي وڌيڪ درجه بندي ڪرڻ لاءِ، اسان GluN سبسيٽ ڊيٽا لاءِ Seurat جي TransferData ورڪ فلو کي استعمال ڪيو ته جيئن اسان جي GluN سيلز کي ريفرنس ڊيٽا سيٽ ليبل تفويض ڪري سگهجي.
t-hCO ۽ hCO نمونن جي عالمي ٽرانسڪرپٽوم جي پختگي جي حيثيت جو جائزو وٺڻ لاءِ، اسان پنهنجي سيوڊو-بلڪ نمونن جو مقابلو BrainSpan/psychENCODE23 سان ڪيو، جيڪو انساني دماغ جي ترقي کي پکڙيل هڪ وڏي RNA تسلسل تي مشتمل آهي. اسان تصور کان 10 هفتا پوءِ ۽ بعد ۾، 5567 جينز ۾ (اسان جي ڊيٽا سان گڏ) ڪارٽيڪل نمونن مان هڪ گڏيل نموني-نارملائيزڊ جين ايڪسپريشن ميٽرڪس تي PCA ڪيو جيڪي اڳ ۾ BrainSpan ڪارٽيڪل نمونن ۾ فعال طور تي سڃاڻپ ڪيا ويا هئا (ڪيوبڪ ماڊل استعمال ڪندي عمر جي لحاظ کان وضاحت ڪيل ترقياتي فرق ۾ 50٪ کان وڌيڪ طور تي بيان ڪيو ويو آهي)38. ان کان علاوه، اسان اڳ ۾ بيان ڪيل غير منفي ميٽرڪس فيڪٽرائيزيشن استعمال ڪندي نيورو ڊولپمينٽ جي وڏي ٽرانسڪرپٽوم دستخطن سان لاڳاپيل جين حاصل ڪيا. غير منفي ميٽرڪس فيڪٽرائيزيشن طريقيڪار استعمال ڪندي حساب ڪيل نموني وزن شڪل 5b ۾ Zhu et al.38 پاران بيان ڪيل پنجن دستخطن مان هر هڪ لاءِ وڌايل ڊيٽا سان پلاٽ ڪيا ويا آهن. ٻيهر، سرگرمي تي منحصر ٽرانسڪرپشنل مارڪر اڳ ۾ شايع ٿيل مطالعي مان نڪتل هئا. خاص طور تي، ERG ۽ LRG کي ماؤس بصري ڪارٽيڪس snRNA-seq ڪليڪشن پاران سڃاڻپ ڪيل گلوٽامٽرجڪ نيورونز ۾ خاص طور تي اپ ريگيوليٽ ڪيو ويو هو، ضمني جدول 3 Hrvatin et al.16 مان بصري محرڪ کان پوءِ. انساني افزوده LRGs KCl-فعال انساني جنين جي دماغي ڪلچر مان حاصل ڪيا ويا ۽ محرڪ کان 6 ڪلاڪ پوءِ حاصل ڪيا ويا، ۽ فلٽر ٿيل جين انسانن ۾ خاص طور تي اپ ريگيوليٽ ڪيا ويا پر ڪُوڙن ۾ نه (ضمني جدول 4). انهن جين سيٽن کي استعمال ڪندي جين سيٽ جي افزودگي جو تجزيو هڪ طرفي فشر جي صحيح ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو.
آئسوفلورين سان چوهڙن کي بي هوشي ڪريو، دماغ ڪڍو ۽ ٿڌي (تقريبن 4°C) آڪسيجن سان ڀريل (95% O2 ۽ 5% CO2) سوڪروز محلول ۾ رکو جن ۾ شامل آهن: 234 mM سوڪروز، 11 mM گلوڪوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mM KCl، 1.25 mM. NaH2PO4، 10 mM MgSO4 ۽ 0.5 mM CaCl2 (تقريبن 310 mOsm). چوهڙن جي دماغ جي ڪورونل سيڪشن (300-400 µm) جن ۾ t-hCO2 شامل آهن، هڪ Leica VT1200 وائبرٽوم استعمال ڪندي ٺاهيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي39. پوءِ حصن کي هڪ سيڪشننگ چيمبر ۾ منتقل ڪيو ويو جنهن ۾ مسلسل ڪمري جي گرمي پد تي آڪسيجنيشن شامل هئي جنهن ۾ aCSF تيار ڪيو ويو: 10 mM گلوڪوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaHPO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2 ۽ 126 mM NaCl (298 mOsm). رڪارڊنگ کان گهٽ ۾ گهٽ 45 منٽ اڳ. حصن کي هڪ ٻرندڙ چيمبر ۾ رڪارڊ ڪيو ويو جتي انهن کي مسلسل aCSF (95% O2 ۽ 5% CO2 شيشي) سان پرفيوز ڪيو ويو. سڀ ڊيٽا ڪمري جي حرارت تي رڪارڊ ڪيا ويا. t-hCO نيورون کي بوروسيليڪيٽ گلاس پائيپٽ سان ختم ڪيو ويو جنهن ۾ 127 mM پوٽاشيم گلوڪونيٽ، 8 mM NaCl، 4 mM ميگنيشيم ATP، 0.3 mM سوڊيم GTP، 10 mM HEPES، ۽ 0.6 mM EGTA، pH 7.2، اندروني حل KOH (290 mOsm) سان ترتيب ڏنل هو. بحالي لاءِ، بايو سائٽين (0.2٪) رڪارڊنگ حل ۾ شامل ڪيو ويو.
ڊيٽا هڪ ملٽي ڪليمپ 700B ايمپليفائر (ماليڪيولر ڊيوائسز) ۽ هڪ ڊجيڊيٽا 1550B ڊجيٽائيزر (ماليڪيولر ڊيوائسز) استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي، 2 kHz تي گهٽ پاس فلٽر ڪيو ويو، 20 kHz تي ڊجيٽائيز ڪيو ويو، ۽ ڪلمپفٽ (ماليڪيولر ڊيوائسز)، اوريجن (اوريجن پرو). 2021b، اوريجن ليب). ۽ ڪسٽم MATLAB فنڪشنز (ميٿ ورڪ) استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو. جنڪشن پوٽينشل کي JPCalc استعمال ڪندي ڳڻيو ويو ۽ داخلائن کي -14 mV جي حساب ڪيل قدر سان ترتيب ڏنو ويو. آپريشن IV ۾ 10-25 pA مرحلن ۾ موجوده مرحلن جو هڪ سلسلو شامل آهي، -250 کان 750 pA تائين.
hCO نيورون جي پيچ-ڪلمپ رڪارڊنگ دوران ٿيلاموس، اڇو مادو، ۽ S1 افيئرنٽس کي برقي طور تي ٿيلاموس ڪارٽيڪل سلائسن ۾ متحرڪ ڪيو ويو، جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي. مختصر طور تي، دماغ کي 10° زاويه تي جھڪيل 3D پرنٽنگ ٽيبل تي رکيو ويو، ۽ دماغ جي اڳيان 35° زاويه تي ڪٽيو ويو. پوءِ دماغ کي ڪٽيل مٿاڇري سان چپڪايو ويو ۽ سيڪشن ڪيو ويو، ٿيلاموس ڪارٽيڪل پروٽيوڊنگ ايڪسون کي محفوظ ڪندي. بائيپولر ٽنگسٽن اليڪٽروڊ (0.5 MΩ) کي ٻئي مائڪرو مينيپوليٽر تي نصب ڪيو ويو ۽ هر سيل ۾ چار علائقن (اندروني ڪيپسول، اڇو مادو، S1 ۽ hCO) کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ حڪمت عملي طور تي پوزيشن ڪئي وئي. 0.03-0.1 Hz تي 300 µA فاسڪ محرک کان پوءِ سنيپٽڪ جوابن کي رڪارڊ ڪريو.
hChR2-اظهار ڪندڙ hCO نيورونز کي 480 nm تي چالو ڪيو ويو ۽ هڪ LED (Prizmatix) پاران پيدا ٿيندڙ روشني جي دال کي ×40 مقصد (0.9 NA؛ اولمپس) ذريعي سيلز جي ويجهو hChR2 اظهار کي رڪارڊ ڪرڻ لاءِ لاڳو ڪيو ويو. روشن ٿيل فيلڊ قطر تقريبن 0.5 ملي ميٽر آهي ۽ ڪل طاقت 10-20 ميگاواٽ آهي. نبض جي ويڪر 10 ايم ايس تي مقرر ڪئي وئي هئي، جيڪا رويي جي سکيا جي تجربي دوران ڏنل نبض سان مطابقت رکي ٿي. مختلف محرڪ فريڪوئنسيون استعمال ڪيون ويون، 1 کان 20 هرٽز تائين، پر صرف سيريز جي پهرين نبض کي مقدار جي تشخيص لاءِ استعمال ڪيو ويو. ٽرينن جي وچ ۾ وقفو عام طور تي 30 سيڪنڊن کان وڌيڪ ڊگهو هوندو آهي ته جيئن Synaptic inhibitory يا سهولت ڏيندڙ رستن تي اثر کي گهٽائي سگهجي. اهو جانچڻ لاءِ ته ڇا hChR2 جواب مونوسنيپٽڪ هو، اسان غسل خاني تي TTX (1 μM) لاڳو ڪيو جيستائين EPSC رد عمل غائب نه ٿي ويو، ۽ پوءِ 4-aminopyridine (4-AP؛ 100 μM) لاڳو ڪيو. عام طور تي، جواب ڪجهه منٽن اندر واپس ايندو آهي، LED فائرنگ ۽ EPSC جنريشن جي وچ ۾ ٿوري گهڻي دير سان. NBQX (10 μM) استعمال ڪيو ويو ته جيئن جانچ ڪري سگهجي ته جواب AMPA ريڪٽرز ذريعي هلائي ٿو يا نه.
تيز hCO سيڪشن ٺاهيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي. مختصر طور تي، hCO سيڪشن 4٪ اگروز ۾ شامل ڪيا ويا ۽ 126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2، 26 mM NaHCO3 ۽ 10 mM d-(+) -گلوڪوز تي مشتمل سيلز ۾ منتقل ڪيا ويا. سيڪشنز کي ڪمري جي حرارت تي 200-300 µm تي Leica VT1200 وائبريٽر استعمال ڪندي ڪٽيو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي ASF ۾ محفوظ ڪيو ويو. پوءِ، سڄي سيلز جي پيچ ڪيمپ رڪارڊنگ hCO سيڪشنز تي سڌي سلائس اسڪوپ مائڪروسڪوپ (سائنٽيفيڪا) جي تحت ڪئي وئي. سيڪشنز کي aCSF (95٪ O2 ۽ 5٪ CO2) سان پرفيوز ڪيو ويو ۽ سيل سگنل ڪمري جي حرارت تي رڪارڊ ڪيا ويا. hCO نيورون هڪ بوروسيليڪيٽ گلاس پائيپٽ استعمال ڪندي لاڳو ڪيا ويا جنهن ۾ 127 mM پوٽاشيم گلوڪونيٽ، 8 mM NaCl، 4 mM ميگنيشيم ATP، 0.3 mM سوڊيم GTP، 10 mM HEPES، ۽ 0.6 mM EGTA، اندروني pH 7، 2، KOH (osmolarity 290) سان ترتيب ڏنل محلول سان ڀريل هو. بحالي جي مقصدن لاءِ، اندروني محلول ۾ 0.2٪ بايوسائيٽن شامل ڪريو.
ڪلمپيڪس (ڪلمپيڪس 11.1، ماليڪيولر ڊيوائسز) پاران ملٽي ڪليمپ 700B ايمپليفائر (ماليڪيولر ڊيوائسز) ۽ ڊجيڊيٽا 1550B ڊجيٽائيزر (ماليڪيولر ڊيوائسز) استعمال ڪندي ڊيٽا حاصل ڪئي وئي، 2 kHz تي گهٽ پاس فلٽر ڪيو ويو، 20 kHz تي ڊجيٽائيز ڪيو ويو، ۽ تجزيو لاءِ ڪلمپفٽ (ورزن 10.6) استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو، ماليڪيولر ڊيوائسز) ۽ ڪسٽم MATLAB فنڪشنز (MATLAB 2019b، Mathworks). جنڪشن پوٽينشل کي JPCalc استعمال ڪندي ڳڻيو ويو ۽ داخلائن کي -14 mV جي حساب ڪيل جنڪشن پوٽينشل سان ترتيب ڏنو ويو. آپريشن IV ۾ -50 کان 250 pA تائين 5-10 pA مرحلن ۾ موجوده مرحلن جو هڪ سلسلو شامل آهي.
پنچ ٿيل نيورونز جي مورفولوجيڪل تعمير نو لاءِ، اندروني محلول ۾ 0.2٪ بايو سائٽين (سگما-الڊرچ) شامل ڪئي وئي. هيڪنگ کان پوءِ سيلز کي گهٽ ۾ گهٽ 15 منٽن لاءِ پرائم ڪيو ويندو آهي. پوءِ پائيپٽ کي 1-2 منٽن لاءِ آهستي آهستي اندر ڪڍيو ويندو آهي جيستائين رجسٽرڊ جھلي مڪمل طور تي سيل نه ٿي وڃي. سيڪشن فزيالوجي جي طريقيڪار جي پٺيان، سيڪشنز کي رات جو 4٪ PFA ۾ 4° C تي مقرر ڪيو ويو، PBS X3 سان ڌوئي، ۽ اسٽريپٽاوڊين-ڪنجوگيٽڊ ڊائي لائيٽ 549 يا ڊائي لائيٽ 405 (ویکٹر ليبز) سان 1:1000 کي ملائي ڇڏيو ويو. بايو سائٽين (2٪؛ سگما-الڊرچ) سان ڀريل سيلز کي 2 ڪلاڪن لاءِ ڪمري جي حرارت تي پيچ ڪلمپ رڪارڊنگ دوران ليبل ڪيو ويو. پوءِ سيڪشنز کي ايڪوا ماؤنٽ (ٿرمو سائنٽيفڪ) استعمال ڪندي مائڪروسڪوپي سلائيڊز تي لڳايو ويو ۽ ايندڙ ڏينهن ليڪا TCS SP8 ڪنفوڪل مائڪروسڪوپ تي هڪ عددي ايپرچر ×40 1.3، ميگنيفڪيشن ×0.9–1.0، xy سان آئل امسرشن آبجيڪٽو استعمال ڪندي تصور ڪيو ويو. نموني جي شرح تقريبن 7 پڪسل في مائڪرون آهي. 1 µm وقفن تي Z-اسٽيڪ سيريل طور تي حاصل ڪيا ويا، ۽ هر نيورون جي پوري ڊينڊريٽڪ ٽري کي ڍڪڻ لاءِ Z-اسٽيڪ موزائيڪس ۽ ليڪا تي ٻڌل آٽو-اسٽيچنگ ڪئي وئي. پوءِ نيورون کي نيوٽيوب 40 انٽرفيس استعمال ڪندي نيم دستي طور تي ٽريڪ ڪيو ويو ۽ SWC فائلون ٺاهيا ويا. پوءِ فائلون SimpleNeuriteTracer41 Fiji پلگ ان (ImageJ، ورجن 2.1.0؛ NIH) تي اپ لوڊ ڪيون ويون.
انساني ڪارٽيڪل ٽشو اسٽينفورڊ يونيورسٽي جي اداري جي نظرثاني بورڊ پاران منظور ڪيل پروٽوڪول جي مطابق باخبر رضامندي سان حاصل ڪيو ويو. انساني پوسٽ پارٽم ٽشو (3 ​​۽ 18 سالن جي عمر) جا ٻه نمونا فرنٽل ڪارٽيڪس (وچ فرنٽل گائرس) جي ري سيڪشن ذريعي ريفريڪٽري ايپيليپسي لاءِ سرجري جي حصي طور حاصل ڪيا ويا. ري سيڪشن کان پوءِ، برفاني ٿڌي NMDG-aCSF ۾ ٽشو حاصل ڪريو جنهن ۾ شامل آهن: 92 mM NMDG، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 30 mM NaHCO3، 20 mM HEPES، 25 mM گلوڪوز، 2 mM thiourea، 5 mM سوڊيم اسڪربيٽ، 3 mM سوڊيم پائروويٽ، 0.5 mM CaCl2 4H2O ۽ 10 mM MgSO4 7H2O. مرڪوز هائيڊروڪلورڪ ايسڊ سان pH 7.3-7.4 تي ٽائيٽريٽ ڪريو. ٽشوز 30 منٽن اندر ليبارٽري ۾ پهچايا ويا ۽ مٿي بيان ڪيل طريقيڪار مطابق ڪورونل سيڪشن ورتا ويا.
سڀني جانورن جي طريقيڪار کي اسٽينفورڊ يونيورسٽي APLAC پاران منظور ٿيل جانورن جي سنڀال جي هدايتن جي مطابق انجام ڏنو ويو. چوٿين (پيوندڪاري کان پوءِ 140 ڏينهن کان وڌيڪ) کي 5٪ آئسوفلورين اينستيسيا سان متاثر ڪيو ويو ۽ آپريشن دوران 1-3٪ آئسوفلورين سان بي هوشي ڪئي وئي. جانورن کي هڪ اسٽيريوٽيڪسڪ فريم (Kopf) ۾ رکيو ويو ۽ مسلسل رليز بيوپرينورفين (SR) کي چمڙي جي هيٺان انجيڪشن لڳايو ويو. کوپڙي کي بي نقاب ڪيو ويو، صاف ڪيو ويو ۽ 3-5 هڏن جا اسڪرو داخل ڪيا ويا. t-hCO کي نشانو بڻائڻ لاءِ، اسان MRI تصويرن مان اسٽيريوٽيڪسڪ ڪوآرڊينيٽس پيدا ڪيا. دلچسپي جي جاءِ تي هڪ گڙ سوراخ ڪيو ويو ۽ فائبر (400 µm قطر، NA 0.48، ڊورڪ) کي hCO مٿاڇري کان 100 µm هيٺ ڪيو ويو ۽ UV-علاج لائق ڏندن جي سيمينٽ (Relyx) سان کوپڙي تائين محفوظ ڪيو ويو.
فائبر فوٽوميٽرڪ رڪارڊنگ اڳ ۾ بيان ڪيل 42 مطابق ڪئي وئي. خود بخود سرگرمي کي رڪارڊ ڪرڻ لاءِ، چوٿن کي هڪ صاف پنجري ۾ رکيو ويو ۽ هڪ 400 µm قطر فائبر آپٽڪ پيچ ڪيبل (ڊورڪ) هڪ فائبر آپٽڪ فوٽوميٽرڪ ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري نظام سان ڳنڍيل هو، امپلانٽ ٿيل فائبر آپٽڪ ڪيبل سان ڳنڍيل هو. موٽر سرگرمي جي 10 منٽن جي رڪارڊنگ دوران، جانور پنجري کي ڳولڻ لاءِ آزاد هئا. پيدا ٿيل سرگرمي کي رڪارڊ ڪرڻ لاءِ، چوٿون (پيوندڪاري کان 140 ڏينهن کان وڌيڪ) انڊڪشن لاءِ 5٪ آئسوفلورين ۽ سار سنڀال لاءِ 1-3٪ آئسوفلورين سان بي هوش ڪيا ويا. جانور کي هڪ اسٽيريوٽيڪٽڪ فريم (ڪوپف) ۾ رکو ۽ t-hCO جي مخالف پاسي تي ويسرز کي تقريباً 2 سينٽي ميٽر تائين ڪٽيو ويو ۽ هڪ پيزو اليڪٽرڪ ايڪٽيوٽر (PI) سان ڳنڍيل هڪ ميش مان گذريو ويو. هڪ 400 µm فائبر آپٽڪ پيچ ڪيبل (ڊورڪ) امپلانٽ ٿيل فائبر سان ڳنڍيل هو ۽ ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري نظام سان ڳنڍيل هو. t-hCO جي مخالف پاسي تي ويندڙن کي پوءِ 20 منٽن جي رڪارڊنگ جي عرصي دوران پيزو اليڪٽرڪ ڊرائيو ذريعي بي ترتيب وقتن تي 50 ڀيرا (2 ملي ميٽر 20 هرٽز تي، 2 سيڪنڊ في پريزنٽيشن) موڙيو ويو. ڪسٽم MATLAB ڪوڊ سان موڙڻ واري وقت کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ Arduino MATLAB سپورٽ پيڪيج استعمال ڪريو. ٽرانزسٽر-ٽرانزسٽر لاجڪ (TTL) پلس استعمال ڪندي واقعن کي ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري سافٽ ويئر سان هم وقت ساز ڪيو ويندو آهي.
چوٿون (پيوندڪاري کان پوءِ 140 ڏينهن کان وڌيڪ) 5٪ آئسوفلورين اينستيسيا سان متاثر ڪيون ويون ۽ آپريشن دوران 1-3٪ آئسوفلورين سان بي هوشي ڪئي وئي. جانورن کي اسٽيريوٽڪسڪ فريم (ڪوپف) ۾ رکيو ويو ۽ بيوپرينورفين ايس آر ۽ ڊيڪساميٿاسون کي چمڙي جي هيٺان انجڪشن ڪيو ويو. کوپڙي کي ظاهر ڪيو ويو، صاف ڪيو ويو ۽ 3-5 هڏن جا اسڪرو داخل ڪيا ويا. ٽي-ايڇ سي او کي نشانو بڻائڻ لاءِ، اسان ايم آر آءِ تصويرن مان اسٽيريوٽڪسڪ ڪوآرڊينيٽس ٺاهيا. هڪ گول ڪرينيوٽومي (تقريبن 1 سينٽي ميٽر قطر) هڪ تيز رفتار ڊرل سان سڌو سنئون ٽرانسپلانٽ ٿيل ايڇ سي او تي ڪئي وئي. هڪ ڀيرو هڏي ممڪن طور تي پتلي ٿي وڃي، پر پوري هڏي ذريعي سوراخ ڪرڻ کان اڳ، باقي برقرار پيلوڪ ڊسڪ کي هٽائڻ لاءِ فورسپس استعمال ڪريو ته جيئن هيٺيون ٽي-ايڇ سي او ظاهر ٿئي. ڪرينيوٽومي جراثيم کان پاڪ لوڻ سان ڀريل هئي، ۽ هڪ ڪور سلپ ۽ هڪ خاص هيڊ پن کي کوپڙي سان يو وي-ڪيورڊ ڊينٽل سيمينٽ (ريليڪس) سان ڳنڍيو ويو.
ٻن-فوٽن تصويرن جي تصويرن کي بروڪر ملٽي فوٽون مائڪروسڪوپ استعمال ڪندي نڪون LWD (×16, 0.8 NA) مقصد سان ڪيو ويو. GCaMP6 تصويرن کي 920 nm تي 1.4x سنگل زي-پلين ميگنيفڪيشن ۽ 8x سراسري 7.5 fps سان ڪيو ويو. چوٿين کي 5٪ آئسوفلورين اينستيسيا سان متاثر ڪيو ويو ۽ 1-3٪ آئسوفلورين سان برقرار رکيو ويو. چوٿين کي هڪ ڪسٽم ٺهيل هيڊ فڪسچر ۾ رکيو ويو ۽ لينس جي هيٺان رکيو ويو. موٽر سرگرمي جي 3 منٽن جي پس منظر جي رڪارڊنگ حاصل ڪئي وئي. رڪارڊنگ جي 20 منٽن دوران، 50 پف (هر پيشڪش 100 ايم ايس ڊگهو) بي ترتيب طور تي ٽي-ايڇ سي او جي سامهون ويسڪر پيڊ تي پهچايو ويو هڪ پڪوسپريسر استعمال ڪندي. ڪسٽم MATLAB ڪوڊ سان برسٽ ٽائيم کي ڪنٽرول ڪرڻ لاءِ Arduino MATLAB سپورٽ پيڪيج استعمال ڪريو. TTL دال استعمال ڪندي ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري سافٽ ويئر (PrairieView 5.5) سان واقعن کي هم وقت سازي ڪريو. تجزيي لاءِ، تصويرن کي فجي ۾ شروع ڪيل MoCo پروگرام ۾ افائن اصلاح استعمال ڪندي xy حرڪت لاءِ درست ڪيو ويو. CNMF-E43 استعمال ڪندي انفرادي سيلز مان فلوروسينٽ نشانن جو ڪڍڻ. دلچسپي جي هر علائقي لاءِ فلوروسينس ڪڍيو ويو، dF/F وکر ۾ تبديل ڪيو ويو، ۽ پوءِ z-اسڪور ۾ تبديل ڪيو ويو.
چوٿون (پيوندڪاري کان پوءِ 140 ڏينهن کان وڌيڪ) 5٪ آئسوفلورين اينستيسيا سان متاثر ڪيون ويون ۽ آپريشن دوران 1-3٪ آئسوفلورين سان بي هوشي ڪئي وئي. جانورن کي اسٽيريوٽڪسڪ فريم (ڪوپف) ۾ رکيو ويو ۽ بيوپرينورفين ايس آر ۽ ڊيڪساميٿاسون کي چمڙي جي هيٺان انجيڪشن لڳايو ويو. ٽي-ايڇ سي او جي مخالف پاسي تي ويڇن کي تقريبن 2 سينٽي ميٽر تائين ڪٽيو ويو ۽ پيزو اليڪٽرڪ ايڪٽيوٽر سان ڳنڍيل هڪ ميش ذريعي ڌاڳو ڪيو ويو. کوپڙي کي بي نقاب ڪيو ويو ۽ صاف ڪيو ويو. هڪ اسٽينلیس اسٽيل گرائونڊ اسڪرو کوپڙي سان ڳنڍيل آهي. ٽي-ايڇ سي او کي نشانو بڻائڻ لاءِ، اسان ايم آر آءِ تصويرن مان اسٽيريوٽڪسڪ ڪوآرڊينيٽس ٺاهيا. ٽي-ايڇ سي او جي مٿان هڪ تيز رفتار ڊرل سان هڪ گول ڪرينيوٽومي (تقريبن 1 سينٽي ميٽر قطر) انجام ڏيو. هڪ ڀيرو هڏي ممڪن طور تي پتلي ٿي وڃي، پر پوري هڏي ذريعي سوراخ ڪرڻ کان اڳ، باقي برقرار پيلوڪ ڊسڪ کي هٽائڻ لاءِ فورسپس استعمال ڪريو ته جيئن هيٺيون ٽي-ايڇ سي او ظاهر ٿئي. انفرادي سيلز کي 32-چينل يا 64-چينل هاءِ ڊينسٽي سلڪون پروبس (ڪيمبرج نيوروٽيڪ) استعمال ڪندي رڪارڊ ڪيو ويو جيڪي گرائونڊ اسڪرو تي گرائونڊ ڪيا ويا ۽ آر ايڇ ڊي ايمپليفائرز (انتان) سان اڳ ۾ ايمپليفائيڊ ڪيا ويا. ڪرينيوٽومي ذريعي اليڪٽروڊز کي ٽارگيٽ سائيٽ تي گهٽائڻ لاءِ مينپوليٽر استعمال ڪريو، جيڪو جراثيم کان پاڪ لوڻ سان ڀريل آهي. ڊيٽا گڏ ڪرڻ اوپن ايفيس ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري نظام کي استعمال ڪندي 30 ڪلو هرٽز جي فريڪوئنسي تي ڪيو ويو. رڪارڊنگ صرف تڏهن جاري رهي جڏهن اسان 10 کان وڌيڪ چينلز ۾ انتهائي لاڳاپيل تال واري خود بخود سرگرمي کي ڳولي لڌو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اليڪٽروڊز گرافٽ ۾ واقع هئا (ٻه فوٽون ڪيلشيم اميجنگ ڊيٽا جي بنياد تي). موٽر سرگرمي جي 10 منٽن جي پس منظر جي رڪارڊنگ حاصل ڪئي وئي. t-hCO جي مخالف پاسي تي وسڪرز کي پوءِ 20 منٽن جي رڪارڊنگ جي عرصي دوران پيزو اليڪٽرڪ ڊرائيو ذريعي بي ترتيب وقتن تي 50 ڀيرا (20 هرٽز تي 2 ملي ميٽر، 2 سيڪنڊ في پريزنٽيشن) موڙيو ويو. Arduino لاءِ MATLAB سپورٽ پيڪيج (MATLAB 2019b) استعمال ڪندي، ڪسٽم MATLAB ڪوڊ سان موڙڻ جو وقت ڪنٽرول ڪريو. ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري سافٽ ويئر سان واقعن کي هم وقت سازي ڪرڻ لاءِ TTL پلس استعمال ڪريو.
آپٽيڪل مارڪنگ تجربن لاءِ، هڪ 200 µm آپٽيڪل پيچ ڪارڊ (ڊورڪ) جيڪو 473 nm ليزر (Omicron) سان ڳنڍيل هو، هڪ 200 µm آپٽيڪل فائبر سان ڳنڍيل هو جيڪو ڪرينيوٽومي مٿان رکيل هو. ان کان فوري طور تي، جمپر پاور کي 20 ميگاواٽ تائين ترتيب ڏيو. ڪرينيوٽومي ذريعي اليڪٽروڊز کي ٽارگيٽ سائيٽ تي گهٽائڻ لاءِ مينپوليٽر استعمال ڪريو، جيڪو جراثيم کان پاڪ لوڻ سان ڀريل آهي. رڪارڊنگ جي شروعات ۾، روشني جا ڏهه دال 473 nm (فريڪونسي 2 هرٽز، نبض جي مدت 10 ايم ايس) خارج ڪيا ويا. فوٽو حساس سيلز کي سيلز طور بيان ڪيو ويو جيڪي 70٪ يا وڌيڪ آزمائشن ۾ 10 ايم ايس روشني جي اندر اسپائڪ ردعمل ڏيکاريندا هئا.