Хвала вам што сте посетили Nature.com. Користите верзију прегледача са ограниченом CSS подршком. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Поред тога, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Приказује вртешку од три слајда одједном. Користите дугмад Претходно и Следеће да бисте се кретали кроз три слајда истовремено или користите клизаче на крају да бисте се кретали кроз три слајда одједном.
Самоорганишуће неуронске органеле представљају обећавајућу in vitro платформу за моделирање људског развоја и болести. Међутим, органоидима недостаје повезаност која постоји in vivo, што ограничава сазревање и спречава интеграцију са другим круговима који контролишу понашање. Овде показујемо да кортикални органоиди изведени из људских матичних ћелија трансплантирани у соматосензорни кортекс неонаталних голих пацова развијају зреле типове ћелија које се интегришу у сензорна и мотивациона кола. МРИ је открила раст органоида након трансплантације код неколико линија матичних ћелија и животиња, док је анализа једног језгра открила прогресију кортикогенезе и појаву транскрипционог програма зависног од активности. Заиста, трансплантирани кортикални неурони показују сложенија морфолошка, синаптичка и својства унутрашње мембране него њихови in vitro пандани, што омогућава откривање неуронских дефеката код пацијената са Тимотијевим синдромом. Анатомско и функционално праћење је показало да трансплантиране органеле примају таламокортикалне и кортикокортикалне улазе, а in vivo снимци неуронске активности сугеришу да ови улази могу генерисати сензорне одговоре у људским ћелијама. Коначно, кортикални органоиди продужавају аксоне кроз мозак пацова, а њихова оптогенетска активација доводи до понашања тражења награде. Дакле, трансплантирани неурони људског кортекса сазревају и учествују у колима домаћина која контролишу понашање. Очекујемо да ће овај приступ олакшати детекцију фенотипова на нивоу ланца у ћелијама изведеним од пацијента који се не могу детектовати другим средствима.
Развој људског мозга је изванредан самоорганизујући процес у којем ћелије пролиферирају, диференцирају се, мигрирају и повезују се како би формирале функционална неуронска кола која се даље усавршавају кроз сензорно искуство. Кључни проблем у разумевању развоја људског мозга, посебно у контексту болести, јесте недостатак приступа можданом ткиву. Самоорганизујуће органеле, укључујући органоиде људског кортекса (hCO; такође познате као сфера људског кортекса), могу генерисати 2,3,4,5,6. Међутим, неколико ограничења ограничава њихову ширу примену на разумевање развоја и функционисања неуронских кола. Посебно није јасно да ли је сазревање hCO ограничено одсуством одређених микроеколошких и сензорних улаза присутних in vivo. Поред тога, пошто hCO нису интегрисани у кола која могу генерисати исходе понашања, њихова употреба у моделирању генетски сложених и бихејвиоралних неуропсихијатријских поремећаја је тренутно ограничена.
Трансплантација hCO у нетакнути живи мозак може превазићи ова ограничења. Претходне студије су показале да су људски неурони трансплантирани у кортекс глодара способни да преживе, пројектују и комуницирају са ћелијама глодара7,8,9,10,11,12. Међутим, ови експерименти се обично изводе на одраслим животињама, што може ограничити синаптичку и аксонску интеграцију. Овде описујемо парадигму трансплантације у којој смо трансплантирали 3D hCO изведен из hiPS ћелија у примарни соматосензорни кортекс (S1) имунодефицијентних пацова у раној фази пластичног развоја. Трансплантирани hCO (t-hCO) неурони пролазе кроз значајно сазревање, примају таламокортикалне и кортикално-кортикалне улазе који изазивају сензорне одговоре и проширују аксонске пројекције у мозак пацова како би покренули понашање тражења награде. Продужено сазревање t-hCO открило је неуронске дефекте код пацијената са Тимотијевим синдромом (TS), тешким генетским поремећајем узрокованим мутацијама у напонски осетљивом L-типу CaV1.2 калцијумовом каналу (кодираном од стране CACNA1C).
Да бисмо проучили људске кортикалне неуроне у колима in vivo, стереотактички смо трансплантирали интактни 3Д hCO у S1 раних постнаталних атимичних пацова (3-7 дана након рођења) (Сл. 1а и проширени подаци са Сл. 1а-ц). У овом тренутку, таламокортикалне и кортикокортикалне аксонске пројекције још нису завршиле своју S1 инервацију (реф. 13). Стога је овај приступ осмишљен да максимизира интеграцију t-hCO уз минимизирање утицаја на ендогена кола. Да бисмо визуализовали локацију t-hCO код живих животиња, извршили смо Т2-пондерисане МРИ реконструкције мозга пацова 2-3 месеца након трансплантације (Сл. 1б и проширени подаци, Сл. 1д). t-hCO су лако уочљиви, а мерења запремине t-hCO су била слична онима израчунатим из фиксних пресека (Проширени подаци, слика 1д, е; P > 0,05). t-hCO су лако уочљиви, а мерења запремине t-hCO су била слична онима израчунатим из фиксних пресека (Проширени подаци, слика 1д, е; P > 0,05). т-хЦО легко наблудались, а объемние измерение т-хЦО били аналогно рассчитаним дла фиксираних срезов (расширение данние, рис. 1д, е; П> 0,05). t-hCO₂ су лако уочљиви, а волуметријска мерења t-hCO₂ су била слична онима израчунатим за фиксне пресеке (проширени подаци, сл. 1д, е; P > 0,05).很容易观察到т-хЦО, 并且т-хЦО的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似 (扩展数据图1д、е；П > 0,05；)很容易观察到т-хЦО, 并且т-хЦО т-хЦО легко наблудалса, а объемние измерение т-хЦО били аналогно рассчитанним дла фиксированних срезов (расширение данние, рис. 1д, е; П> 0,05). t-hCO је лако примећен, а волуметријска мерења t-hCO су била слична онима израчунатим за фиксне пресеке (проширени подаци, сл. 1д, е; P > 0,05).Одредили смо t-hCO код 81% трансплантираних животиња приближно 2 месеца након трансплантације (n = 72 животиње; hCO из 10 hiPS ћелијских линија; hiPS ћелијске линије у Додатној табели 1). Од њих, 87% се налазило у можданој кори (Сл. 1ц). Извођењем серијских МРИ скенирања у више временских тачака код истог трансплантираног пацова, открили смо девет пута већу запремину t-hCO у року од 3 месеца (Сл. 1д и проширени подаци, Сл. 1ф). Трансплантиране животиње су имале високу стопу преживљавања (74%) 12 месеци након трансплантације (проширени подаци, Сл. 1г и Додатна табела 2), и нису пронађена очигледна моторичка или меморијска оштећења, глиоза или електроенцефалограм (ЕЕГ). Подаци Сл. 1г и Додатна табела 2). 1х–м и 3е).
а, Шематски приказ експерименталног дизајна. hCO2 добијен из hiPS ћелија је трансплантиран у S1 новорођених голих пацова 30-60. дана диференцијације. б, Т2-пондерисани коронални и хоризонтални МРИ снимци који приказују t-hCO2 у S1 2 месеца након трансплантације. Скала, 2 мм. ц, Квантификација стопа успеха калемљења приказана за сваку hiPS ћелијску линију (n = 108, бројеви унутар стубића означавају количину t-hCO2 по hIPS ћелијској линији) и кортикалну или субкортикалну локацију (n = 88). д, МРИ слика коронарне артерије (лево; скала, 3 мм) и одговарајућа 3Д волуметријска реконструкција (скала, 3 мм) која показује повећање t-hCO2 током 3 месеца. е, Преглед t-hCO2 образаца у можданој кори пацова. Скала, 1 мм. ф, Репрезентативне имуноцитохемијске слике t-hCO приказане одозго слева надесно (током диференцијације): PPP1R17 (4 месеца стар), NeuN (8 месеци стар), SOX9 и GFAP (8 месеци стар), PDGFRα; (8 месеци), MAP2 (8 месеци) и IBA1 (8 месеци). Скала, 20 µм. Коекспресија HNA указује на ћелије људског порекла. г, snRNA-seq: Снимање редукције димензионалности помоћу обједињене многострукости и пројекције (UMAP) свих висококвалитетних t-hCO језгара након Сераове интеграције (n=3 t-hCO узорка, n=2 hiPS ћелијске линије). Астроцити, ћелије астроцитне линије; cyc prog, циркулишући прогенитори; GluN DL, дубоки глутаматергички неурони; GluN DL/SP, дубоки и субламеларни глутаматергички неурони; GluN UL, глутаматергички неурони горњег слоја; олигодендроцити, олигодендроцити; OPC, прогениторске ћелије олигодендроцита; RELN, рилин неурони. х, Анализа обогаћивања гена онтологије (ГО) термином гена значајно повећаних (прилагођено P <0,05, промена пута > 2, изражено у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима. х, Анализа обогаћивања гена онтологије (ГО) термином гена значајно повећаних (прилагођено P <0,05, промена пута > 2, изражено у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима. х, Анализ обогасениа терминов Гене Онтологи (ГО) дла генов со значајној активации (скорректированниј П <0,05, кратност изменениа > 2, експресиа по крајној мери в 10% једра) в глутаматергических неуронах т-хЦО по сравнениу с глутаматергичними неуронами хЦО. х, Анализа обогаћивања термином генске онтологије (GO) за гене са значајном активацијом (прилагођено P <0,05, промена прегиба >2, експресија у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима. х，与хЦО 谷氨酸能神经元相比，т-хЦО 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整（调整0,05, 倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(ГО) 术语富雐ゆ寭富雐 х, 与 хцо 谷氨酸 能 元 相比, т-хцо 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 显着 上调 （05 ，0.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(ГО) 术语富集分析。 х, гени знатно активизовались (скорригированниј П <0,05, кратност изменениа> 2, експрессируетса по скрајној мери в 10% једра) в глутаматергических неуронах т-хЦО по сравнениу с глутаматергическими нејронами хЦО Онтологическиј (ГО) анализ термина обогасениа. х, гени су били значајно појачани (прилагођено P < 0,05, промена пута > 2, изражени у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима Онтолошка (GO) анализа термина обогаћивања.Испрекидана линија означава вредност aq од 0,05. i, UMAP снимање типова GluN ћелија у t-hCO коришћењем преноса ознака из референтног скупа података 22 snRNA-seq моторног кортекса одраслих. CT — кортикоталамичке ћелије, ET — екстрацеребралне ћелије, IT — интерне теленцефалне ћелије, NP — блиска пројекција.
Затим смо проценили цитоархитектуру и укупни ћелијски састав t-hCO. Бојење антителима ендотелних ћелија пацова открило је васкуларизацију са t-hCO, док је бојење IBA1 открило присуство микроглије пацова у целом графту (Слика 1ф и проширени подаци, Слика 3ц,д). Имунобојење је открило ћелије позитивне на људски нуклеарни антиген (HNA) које коекспресују PPP1R17 (кортикални прогенитори), NeuN (неурони), SOX9 и GFAP (глијалне ћелије) или PDGFRα (олигодендроцитни прогенитори) (Слика 1ф). Да бисмо проучили ћелијски састав t-hCO при резолуцији појединачних ћелија, извршили смо секвенцирање РНК једног језгра (snRNA-seq) након приближно 8 месеци диференцијације. Филтрација у маси и уклањање језгара пацова дали су 21.500 висококвалитетних мапа људских мононуклеара (Слика 1г и проширени подаци, Слика 4а,б). Експресиони обрасци типичних маркера ћелијског типа идентификовали су кластере главних класа кортикалних ћелија, укључујући дубоке и површинске глутаматергичке неуроне, циркулишуће прогениторе, олигодендроците и астроцитну лозу (Сл. 1г, проширени подаци, Сл. 4ц и Додатна табела 3). Имунобојење за SATB2 и CTIP2 показало је да упркос присуству кортикалних подтипова, t-hCO није показао јасну анатомску стратификацију (проширени подаци, Сл. 3а). snRNA-seq hCO са упареним стадијумом произвео је углавном сличне класе ћелија, са неколико изузетака, укључујући одсуство олигодендроцита и присуство GABAергичких неурона, што може одражавати претходно објављене повољне in vitro услове за латералне прогениторске ћелије15 (проширени подаци, Сл. 4ф-и и Додатна табела 4). Анализа диференцијалне експресије гена открила је значајне разлике у глутаматергичким неуронима између t-hCO и hCO (Додатна табела 5), укључујући активацију скупова гена повезаних са сазревањем неурона, као што су синаптичка сигнализација, дендритска локализација и активност напонски зависних канала (Слика 1h и Додатна табела 5), табела 6). Сходно томе, кортикални глутаматергички t-hCO неурони показали су убрзано транскрипционо сазревање.
Да бисмо разјаснили да ли су ове транскрипционе промене у t-hCO повезане са морфолошким разликама између hCO in vitro и t-hCO in vivo, реконструисали смо hCO и hCO испуњене биоцитином упарене са стадијумом у акутним пресецима након 7–8 месеци диференцијације. hCO неурони (Сл. 2а). t-hCO неурони су били значајно већи, имали су 1,5 пута већи пречник соме, двоструко више дендрита и укупно шестоструко повећање укупне дужине дендрита у поређењу са in vitro hCO (Сл. 2б). Поред тога, приметили смо значајно већу густину дендритичних бодљи у t-hCO неуронима него у hCO неуронима (Сл. 2ц). Ово сугерише да t-hCO неурони пролазе кроз екстензивно дендритско издуживање и гранање, што, у комбинацији са континуираном ћелијском пролиферацијом, може допринети интензивном расту t-hCO након трансплантације (Сл. 1д и Проширени подаци Сл. 1ф). Ово нас је подстакло да истражимо електрофизиолошка својства. Капацитет мембране био је осам пута већи (проширени подаци, сл. 8д), мембрански потенцијал у стању мировања био је хиперполаризованији (приближно 20 mV), а убризгавање струје изазвало је већу максималну брзину побуђивања у t-hCO неуронима него у hCO неуронима. in vitro (сл. 2д), е), што је у складу са већим и сложенијим морфолошким карактеристикама t-hCO. Поред тога, учесталост спонтаних ексцитаторних постсинаптичких струјних догађаја (EPSC) била је значајно већа у t-hCO неуронима (сл. 2ф), што сугерише да је повећана густина дендритичних бодљи примећених у t-hCO неуронима повезана са функционалном ексцитабилношћу. сексуална синапса. Потврдили смо незрели карактер hCO неурона in vitro снимањем обележених глутаматергичких неурона (проширени подаци, сл. 6а-ц).
а, 3Д реконструкција биоцитином испуњених hCO и t-hCO неурона након 8 месеци диференцијације. б, Квантификација морфолошких карактеристика (n = 8 hCO неурона, n = 6 t-hCO неурона; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, Квантификација морфолошких карактеристика (n = 8 hCO неурона, n = 6 t-hCO неурона; **P = 0,0084, *P = 0,0179 и ***P < 0,0001). б, количественнаа оценка морфологических признаков (н = 8 неуронов хЦО, н = 6 неуронов т-хЦО; ** П = 0,0084, * П = 0,0179 и *** П <0,0001). б, квантификација морфолошких карактеристика (n=8 hCO неурона, n=6 t-hCO неурона; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001). б，形态学特征的量化 (н = 8 个хЦО 神经元，н = 6 个т-хЦО 神经元；**П = 0,0084，0*П790) 0,0001). б，形态学特征的量化 (н = 8 个хЦО 神经元，н = 6 个т-хЦО 神经元；**П = 0,0084，0*П790) 0,0001). б, количественнаа оценка морфологических признаков (н = 8 неуронов хЦО, н = 6 неуронов т-хЦО; ** П = 0,0084, * П = 0,0179 и *** П <0,0001). б, квантификација морфолошких карактеристика (n=8 hCO неурона, n=6 t-hCO неурона; **P=0,0084, *P=0,0179 и ***P<0,0001).ц, 3Д реконструкција дендритичних грана hCO и t-hCO након 8 месеци диференцијације. Црвене звездице означавају претпостављене дендритичке бодље. Квантификација густине дендритичних бодљи (n = 8 hCO неурона, n = 6 t-hCO неурона; **P = 0,0092). д, Квантификација мембранског потенцијала у мировању (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). д, Квантификација мембранског потенцијала у мировању (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). д, количественнаа оценка мембранного потенцијала покоа (н = 25 неуронов хЦО, н = 16 неуронов т-хЦО; *** П <0,0001). д, квантификација мембранског потенцијала у мировању (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). д，静息膜电位的量化 (н = 25 хЦО 神经元, н = 16 т-хЦО 神经元；***П < 0,0001）). д，静息膜电位的量化 (н = 25 хЦО 神经元, н = 16 т-хЦО 神经元；***П < 0,0001）). д, количественнаа оценка мембранного потенцијала покоа (н = 25 неуронов хЦО, н = 16 неуронов т-хЦО; *** П <0,0001). д, квантификација мембранског потенцијала у мировању (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). е, Понављајуће акционо потенцијално паљење у hCO и t-hCO индуковано повећањем струјних ињекција и квантификација максималне брзине паљења (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). е, Понављајуће акционо потенцијално паљење у hCO и t-hCO индуковано повећањем струјних ињекција и квантификација максималне брзине паљења (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). е, поновное возбуждение потенцијала дејствиа в хЦО и т-хЦО, визванное увеличение тока, и количественнаа оценка максималне скорости возбуждениа (н = 25 неуронов хЦО, н = 16 неуронов т-хЦО; *** П <0,0001). е, поновно паљење акционог потенцијала у hCO и t-hCO индуковано повећањем струје и квантификацијом максималне брзине паљења (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; *** P < 0,0001). е，通过增加电流注入诱导的хЦО 和т-хЦО 重复动作电位放电，以及最大放电电，以及最大缚电珎， т-хЦО个хЦО 神经元，н = 16 个т-хЦО 神经元；***П < 0,0001）。 Е, 通过 增加 电流 注入 的 的 хцо 和 т-хцо 重复 电位 放电, 以及 最 大 ， ， ， ， ， ， ， ， ， （ （ ＇ ＇ ） 的 2个 хцо 神经 ， н = 16 个 т-хцо 神经 ； *** п <0,0001) 。 е, повтораусееса возбуждение потенциала дејствиа хЦО и т-хЦО, визванное повећање подачи тока, и количественнаа оценка максималне скорости возбуждениа (н = 25 неуронов хЦО, н = 16 неуронов т-хЦО; *** П <0,0001). е, понављајуће паљење акционих потенцијала hCO и t-hCO изазваних повећаним напајањем струјом и квантификацијом максималне брзине паљења (n = 25 hCO неурона, n = 16 t-hCO неурона; *** P < 0,0001). ф, Спонтане EPSC (sEPSC) у hCO и t-hCO неуронима након 8 месеци диференцијације и квантификација учесталости синаптичких догађаја (n = 25 hCO неурона, n = 17 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). ф, Спонтане EPSC (sEPSC) у hCO и t-hCO неуронима након 8 месеци диференцијације и квантификација учесталости синаптичких догађаја (n = 25 hCO неурона, n = 17 t-hCO неурона; ***P < 0,0001). ф, спонтане ЕПСЦ (сЕПСЦ) у неуронах хЦО и т-хЦО преко 8 месеци диференцијације и количествена оценка фреквенције синаптичких догађаја (н = 25 неуронова хЦО, н = 17 неуронова т-хЦО; *** П <0,0001) . ф, Спонтане EPSC (sEPSC) у hCO и t-hCO неуронима након 8 месеци диференцијације и квантификација стопа синаптичких догађаја (n=25 hCO неурона, n=17 t-hCO неурона; ***P<0,0001). ф，分化8.神经元，н = 17 т-хЦО 神经元；***П <0,0001）. ф，分化8 个月时хЦО 和т-хЦО 神经元中的自发性ЕПСЦс (сЕПСЦс)，以及突触事件频率的，以及突触事件频率的，以及突触事件频率的，神率的量匼 (н = 25 хЦО 神率的量匼 (н = 25хЦО П < 0,0001)). ф, спонтане ЕПСЦ (сЕПСЦ) у неуронах хЦО и т-хЦО преко 8 месеци диференцираности и количествена оценка фреквенције синаптичких догађаја (н = 25 неуронова хЦО, н = 17 неуронова т-хЦО; *** П <0,0001). ф, Спонтане EPSC (sEPSC) у hCO и t-hCO неуронима након 8 месеци диференцијације и квантификација стопа синаптичких догађаја (n = 25 hCO неурона, n = 17 t-hCO неурона; *** P <0,0001).За bf, hCO и t-hCO у линији 1208-2 су узети из исте серије за диференцијацију која се одржава паралелно. г, Анализа обогаћивања генског скупа (једнострани Фишеров тачан тест) гена значајно појачано регулисаних (прилагођено P < 0,05, промена пута > 2, изражено у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима са генским скуповима и раног одговора (ERG) и касног одговора (LRG) зависних од активности идентификованих из in vivo студије на мишевима16 и људски специфичних LRG из in vitro неурона17. г, Анализа обогаћивања генског скупа (једнострани Фишеров тачан тест) гена значајно појачано регулисаних (прилагођено P < 0,05, промена пута > 2, изражено у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронима са генским скуповима и раног одговора (ERG) и касног одговора (LRG) зависних од активности идентификованих из in vivo студије на мишевима16 и људски специфичних LRG из in vitro неурона17. г, анализа обогасениа набора генов (односторонниј точниј критеријум Фишера) генов со значајној активации (скорректированниј П <0,05, кратност изменениа > 2, експресија по мањој мери у 10% једра) у глутаматергическим неуронахом т-хЦО по сравнењу с глутаматергичними неуронами као што је хЦО него, (Л раньские генови генов и хРГЕРГ) зависасих от активности, идентификованих в исследовании на мишах ин виво16, и специфичних дла человека ЛРГ из неуронов ин витро17. г, анализа обогаћивања генског скупа (једнострани Фишеров тачан тест) гена са значајном активацијом (прилагођено P <0,05, промена прегиба >2, експресија у најмање 10% језгара) у t-hCO глутаматергичким неуронима у поређењу са hCO глутаматергичким неуронским скуповима и раних (ERG) и касних (LRG) гена зависних од активности идентификованих код in vivo мишева16 и људски специфичних LRG из неурона in vitro17. г，т-хЦО谷氨酸能神经元与хЦО谷氨酸能神经元相比，т -хЦО谷氨酸能神经元显着上调 (调整后П<0,05，倍数变化) >2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧Ф исхер精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ЕРГ)和晚期反应(ЛРГ) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异む г ， т-хцо 谷氨酸 神经 元 与 хцо 谷氨酸 神经 元 相比 ， т-хцо 谷氨酸 神经 腃 与经 腃п <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分羮 （卉 （卉 （卉体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (лрг) 活性 基因 的 组 基 基神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性ЛРГ。 г, глутаматергические неурони т-хЦО били су знатно активизирани по сравњењу с глутаматеријским неуронами хЦО (скорректированниј П<0,05, кратност измене> 2, не мање од 10% Анализ обогасениа набора генов (односторонниј точни тест Фишера) раннего ответа (ЕРГ) и назависни ЛРГ активности, истраживања мишах ин виво16 и неуронах ин витро17, специфични дла человека. г, т-хЦО глутаматергички неурони су били значајно појачани у поређењу са хЦО глутаматергичким неуронима (кориговани P <0,05, промена пута >2, најмање 10% Анализа обогаћивања гена раног одговора (ЕРГ) и касног одговора (једнострани Фишеров тачан тест) гени зависни од активности одговора (ЛРГ) идентификовани код in vivo мишева16 и in vitro неурона.17 Људски специфични ЛРГ.Испрекидана линија означава P вредност од 0,05 кориговану Бонферонијем. h, експресија GluN гена (псеудо-паковање и скалирање сваког гена) је значајно повећана у snRNA-seq репликама LRG гена у t-hCO глутаматергичким неуронима. i, имунобојење које показује експресију SCG2 у t-hCO (горњи) и hCO (доњи) неуронима. Беле стрелице показују SCG2+ ћелије. Скала, 25 µm. Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација.
На основу повећане активности t-hCO примећене у ex vivo пресецима, snRNA-seq је открио зависну од активности појачану регулацију генских транскрипата у t-hCO у поређењу са hCO in vitro. Глутаматергични t-hCO неурони су експримирали више нивое гена који регулишу активност касног одговора (Сл. 2g,h), што је пронађено у претходним студијама на мишјим и људским неуронима16,17. На пример, BDNF18, SCG2 и OSTN, ген који регулише активност специфичан за примате, показали су повећану експресију у t-hCO неуронима у поређењу са hCO неуронима (Сл. 2g-i). Дакле, t-hCO неурони су показали побољшане карактеристике сазревања у поређењу са hCO неуронима транскрипционим, морфолошким и функционалним анализама.
Да бисмо даље проценили повезаност сазревања t-hCO са развојем људског мозга, извршили смо транскриптомска поређења типова кортикалних ћелија фетуса и одраслих19,20 и одраслих21,22, као и опсежне податке о експресији кортикалних гена23 током развоја (проширени подаци, сл. 5). . Са претходним радом24, глобални статус сазревања hCO и t-hCO транскриптома на 7–8 месеци диференцијације је углавном у складу са временом развоја in vivo и највише је еквивалентан касном феталном животу (Проширени подаци, сл. 5а). Приметно је да смо приметили повећану зрелост транскриптома код t-hCO у поређењу са hCO усклађеним са годинама, као и активацију транскриптома повезану са синаптогенезом, астрогенезом и мијелинацијом (проширени подаци, сл. 5б-д). На ћелијском нивоу, пронашли смо доказе о тањем подтипу кортекса код t-hCO, са кластерима глутаматергичких неурона који се преклапају са подтиповима неурона одраслих L2/3, L5 и L6 (слика 1и). Насупрот томе, преклапање кластера између глутаматергичких t-hCO неурона и феталних кортикалних неурона било је ограниченије у средини трудноће (проширени подаци, слика 5е-ј). Да бисмо утврдили да ли су t-hCO неурони функционално слични људским постнаталним неокорикалним неуронима, извршили смо електрофизиолошка снимања и анатомске реконструкције људских L2/3 пирамидалних неурона у оштрим пресецима људског постнаталног кортекса (проширени подаци, слика 7а). Електрофизиолошка својства L2/3 пирамидалних неурона била су слична својствима t-hCO пирамидалних неурона (проширени подаци, слика 7е). Морфолошки, L2/3 неурони из постнаталних људских узорака били су сличнији t-hCO него hCO, иако су L2/3 ћелије биле дуже, садржале су више грана укупно и имале су већу густину кичме (слика 3г и проширени подаци, слика 7б-). Г).
а, трансплантација hCO произведеног контролним и TS hiPS ћелијским линијама у новорођене пацове. б, 3Д реконструкција t-hCO неурона испуњених биоцитином након 8 месеци диференцијације. ц, квантификација средње дужине дендрита (n = 19 контролних неурона, n = 21 TS неурона; **P = 0,0041). д, 3Д-реконструисане дендритичне гране из контроле и ТС t-hCO након 8 месеци диференцијације и квантификација густине дендритских кичми (н = 16 контролних неурона, н = 21 ТС неурона, ***П < 0,0001). д, 3Д-реконструисане дендритичне гране из контроле и ТС t-hCO након 8 месеци диференцијације и квантификација густине дендритских кичми (н = 16 контролних неурона, н = 21 ТС неурона, ***П < 0,0001). д, 3Д-реконструкција дендритних ветвеј из контроле и ТС т-хЦО преко 8 месеци диференцијације и количествена оценка плотности дендритних шипова (н = 16 контролних неуронова, н = 21 ТС неуронова, *** П <0,0001). д, 3Д реконструкција дендритичних грана из контролне и t-hCO TS групе након 8 месеци диференцијације и квантификација густине дендритичних кичми (n=16 контролних неурона, n=21 TS неурона, ***P<0,0001). д，分化8 个月时对照和ТС т-хЦО 的3Д 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = н16个对照神经元，н = 21 个 ТС 神经元，***П <0,0001）。 д ， 分化 8 个 时 对照 和 тс т-хцо 的 3д 重建 分支 分支 以及 树突棘 密化 = н16 ，神经 元 ， н = 21 个 тс 神经 ， *** п <0,0001 ）。 д, 3Д-реконструкциа дендритних ветвеј контрола и ТС т-хЦО через 8 месеци диференцираности и количественаа плотности дендритних шипов (н = 16 контролних неуронов, н = 21 ТС неуронов, *** П <0,0001). д, 3Д реконструкција контролних дендритичних грана и ТС t-hCO на 8 месеци диференцијације и квантификација густине дендритичних кичми (н=16 контролних неурона, н=21 ТС неурона, ***П<0,0001).Црвене звездице означавају претпостављене дендритичне бодље. е, спонтане ЕПСЦ у контролним и ТС т-хЦО неуронима након 8 месеци диференцијације. ф, кумулативни графикон фреквенције и квантификација фреквенције и амплитуде синаптичких догађаја (н=32 контролна неурона, н=26 ТС неурона; **P=0,0076 и P=0,8102). г, Шолова анализа ТС и контролних неурона у hCO и t-хЦО. Испрекидане линије приказују људске Л2/3 постнаталне пирамидалне неуроне ради поређења (н = 24 контролна т-хЦО неурона, н = 21 ТС т-хЦО неурона, н = 8 контролних хЦО неурона и н = 7 ТС хЦО неурона). Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација
Способност t-hCO да реплицира морфолошке и функционалне карактеристике неурона људског кортекса на високом нивоу подстакла нас је да истражимо да ли се t-hCO може користити за откривање фенотипова болести. Фокусирали смо се на синдром Стирџипа, тешки неуроразвојни поремећај узрокован мутацијама добитка од функције у гену који кодира CaV1.2, који покреће транскрипцију гена зависну од активности у неуронима. Добили смо hCO од три пацијента са синдромом Стирџипа који су носили најчешћу супституцију (p.G406R) и три контролне групе (Сл. 3а). Након трансплантације, открили смо да је дендритична морфологија измењена код неурона синдрома Стирџипа у поређењу са контролним групама (Сл. 3б и проширени подаци, Сл. 8а,б), са двоструким повећањем броја примарних дендрита и укупним повећањем средње и укупне смањења дужине дендрита (Сл. 3ц и проширени подаци, Сл. 8ц). Ово је било повезано са повећаном густином бодљи и повећаном учесталошћу спонтаних EPSC код неурона синдрома Стирџипа у поређењу са контролним неуронима (Сл. 3д–ф и проширени подаци, Сл. 8г). Даља анализа је открила обрасце абнормалног дендритичног гранања у t-hCO TS у поређењу са контролама, али не и у in vitro TS hCO у сличној фази диференцијације (Сл. 3г). Ово је у складу са нашим претходним извештајима о смањивању дендритичких ћелија зависном од активности у TS и истиче способност ове платформе за трансплантацију да детектује фенотипове болести in vivo.
Затим смо питали у којој мери су t-hCO ћелије функционално интегрисане у пацовски S1. S1 код глодара прима јаке синаптичке улазе из ипсилатералних вентралних базалних и задњих таламичких језгара, као и из ипсилатералног моторног и секундарног соматосензорног кортекса и контралатералног S1 (Сл. 4а). Да бисмо обновили образац инервације, инфицирали смо hCO вирусом беснила-dG-GFP/AAV-G и трансплантирали hCO у S1 пацова 3 дана касније. Уочили смо густу GFP експресију у неуронима ипсилатералног S1 и вентралних базалних ганглија 7–14 дана након трансплантације (Сл. 4б, ц). Поред тога, бојење таламичких маркера нетрин G1 антителима открило је присуство таламичких завршетака у t-hCO (Сл. 4д, е). Да бисмо проценили да ли ове аферентне пројекције могу изазвати синаптичке одговоре у t-hCO ћелијама, извршили смо снимање целих ћелија из људских ћелија у оштрим пресецима таламокортикалног слоја. Електрична стимулација пацовског S1, унутрашње капсуле, беле масе, влакана у близини t-hCO или оптогенетска активација таламичких завршетака који експресују опсин у t-hCO индуковала је кратколатентне EPSC у t-hCO неуронима изложеним антагонисту AMPA рецептора NBQX. (Сл. 4f, g и проширени подаци, Сл. 9a–g). Ови подаци показују да је t-hCO анатомски интегрисан у мозак пацова и да га може активирати ткиво домаћина пацова.
а, Шематски дијаграм експеримента праћења беснила. б, GFP и људски специфична експресија STEM121 између t-hCO и мождане коре пацова (горњи панел). Такође је приказана експресија GFP у ипсилатералном вентралном базалном једру (VB) пацова (доле лево) и ипсилатералном S1 (доле десно). Скала, 50 µм. Црвени квадрати представљају подручја мозга где су снимљене слике. ц, квантификација ћелија које експримирају GFP (n = 4 пацова). д, е — Нетрин G1+ таламички терминали у t-hCO. д приказује коронални пресек који садржи t-hCO и VB језгра. Скала, 2 мм. е приказује експресију Нетрина G1 и STEM121 у t-hCO (лево) и VB (десно) неуронима. Скала, 50 µм. Наранџаста испрекидана линија означава границу t-hCO. ф, г, Струјни трагови t-hCO неурона након електричне стимулације код S1 пацова (ф) или унутрашње капсуле (г), са (љубичасто) или без (црно) NBQX (лево). Амплитуде EPSC са и без NBQX (н = 6 S1 неурона, *P = 0,0119; и н = 6 неурона унутрашње капсуле, **P = 0,0022) (центар). Проценат t-hCO неурона који показују EPSC као одговор на електричну стимулацију пацова S1 (ф) или унутрашње капсуле (г) (десно). aCSF, вештачка цереброспинална течност. х, шематски дијаграм 2P експеримента снимања (лево). Експресија GCaMP6s у t-hCO (средина). Скала, 100 µм. Временски интервал флуоресценције GCaMP6s (десно). и, Z-скор спонтане активности флуоресценције. ј, шематски приказ стимулације бркова. к, z-скор 2P трајекторије флуоресценције у једном испитивању, поравнате са девијацијом бркова у времену нула (испрекидана линија) у ћелијама примера. л, популационо усредњени z-скор одговори свих ћелија поравнати са девијацијом бркова у времену нула (испрекидана линија) (црвена) или насумично генерисани временски жигови (сива). м. Шематски дијаграм експеримента оптичког обележавања. н, Необрађене криве напона из примера t-hCO ћелије током стимулације плавим ласером или скретања бркова. Црвене стрелице означавају прве шиљке изазване светлошћу (горе) или изазване скретањем бркова (доле). Сиво сенкање означава периоде скретања бркова. о, Вршни светлосни таласни облици и одговори скретања бркова. п, шиљци једног покушаја, поравнати са девијацијом бркова у ћелијама примера. 0 означава девијацију бркова (испрекидана линија). q, популационо усредњена брзина паљења z-скора за све фотосензитивне ћелије, поравната са девијацијом бркова у времену нула (испрекидана линија) (црвена) или насумично генерисани временски жигови (сива). r, Удео фотосензитивних јединица значајно модулисаних девијацијом бркова (n = 3 пацова) (лево). Латенција пика z-скора (n = 3 пацова; n = 5 (светлозелена), n = 4 (тамнозелена) и n = 4 (цијан) јединице модулације дефлекције бркова по пацову) (десно). Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација
Затим смо питали да ли t-hCO може бити активиран сензорним стимулусима in vivo. Трансплантирали смо hCO који експресује генетски кодиране индикаторе калцијума GCaMP6 у S1 пацове. Након 150 дана, извршили смо влакнасту фотометрију или двофотонско снимање калцијума (Слика 4х и проширени подаци, Слика 10а). Открили смо да t-hCO ћелије показују синхронизовану ритмичку активност (Слика 4и, Проширени подаци, Слика 10б и Додатни видео 1). Да бисмо окарактерисали вршну активност t-hCO, извршили смо екстрацелуларне електрофизиолошке снимке код анестезираних трансплантираних пацова (проширени подаци, Слика 10ц-ф). Генерисали смо стереотаксичне координате из МРИ слика; стога, ове снимљене јединице представљају претпостављене људске неуроне, иако сама електрофизиологија не дозвољава одређивање врсте порекла. Посматрали смо синхронизоване налете активности (проширени подаци, Слика 10д). Налети су трајали око 460 мс и били су одвојени периодима тишине од око 2 с (проширени подаци, Слика 10д, е). Појединачне јединице су испалиле у просеку око три метка по рафалу, што је приближно 73% регистрованих јединица по рафалу. Активности појединачних јединица биле су у високој корелацији, а ове корелације су биле веће од оних код јединица идентификованих код невакцинисаних животиња забележених под истим условима (проширени подаци, сл. 10ф). Да бисмо даље окарактерисали одговоре шиљака идентификованих неурона људског порекла, извршили смо експерименте светлосног обележавања на анестезираним пацовима којима је трансплантиран hCO који експресује светлосно осетљиви катјонски канал родопсин 2 (hChR2), путем којег t-hCO неурони препознају кратко латенцију (мање од 10 ms) као одговор на стимулусе плаве светлости (сл. 4м–о). t-hCO неурони су показали налете спонтане активности на фреквенцијама сличним онима примећеним у снимању калцијума, као и електрофизиолошким снимцима изведеним у t-hCO у одсуству светлосног обележавања (проширени подаци, сл. 10ц-г). Није примећена спонтана активност у одговарајућим фазама hCO забележеним in vitro. Да бисмо проценили да ли t-hCO може бити активиран сензорним стимулусима, накратко смо скренули бркове пацова даље од t-hCO (Сл. 4j,m и проширени подаци, Сл. 10h,k). Према претходним студијама8,10, подскуп t-hCO ћелија показао је повећану активност као одговор на скретање бркова, што није примећено када су подаци упоређени са случајним временским ознакама (Сл. 4k–q и проширени подаци, Сл. 10h–q). Заиста, око 54% ​​опто-обележених појединачних јединица показало је значајно повећану стопу буђења након стимулације бркова, достижући врхунац на око 650 ms (Сл. 4r). Узети заједно, ови подаци сугеришу да t-hCO прима одговарајуће функционалне улазе и да се може активирати стимулусима из околине.
Затим смо истражили да ли t-hCO може да активира кола код пацова ради контроле понашања. Прво смо истражили да ли аксони t-hCO неурона пројектују се у околна ткива пацова. Инфицирали смо hCO лентивирусом који кодира hChR2 фузионисан са EYFP (hChR2-EYFP). Након 110 дана, посматрали смо експресију EYFP у ипсилатералним кортикалним регионима, укључујући аудиторни, моторни и соматосензорни кортекс, као и у субкортикалним регионима, укључујући стријатум, хипокампус и таламус (Сл. 5а). Да бисмо проценили да ли ове еферентне пројекције могу изазвати синаптичке одговоре у ћелијама пацова, оптички смо активирали t-hCO ћелије које експримирају hChR2-EYFP снимањем ћелија мождане коре пацова у оштрим пресецима мозга. Активација t-hCO аксона плавом светлошћу изазвала је кратколатентне EPSC у неуронима пирамидалне коре пацова, које је блокирао NBQX (Сл. 5б–г). Поред тога, ове реакције би могле бити блокиране тетродотоксином (TTX) и обновљене помоћу 4-аминопиридина (4-AP), што сугерише да су узроковане моносинаптичким везама (Сл. 5е).
а, Шематски дијаграм праћења аксона (лево). Експресија t-hCO EYFP (десно). Скала, 100 µм. А1, аудиторни кортекс, ACC, предњи цингулативни кортекс, d. striatum, дорзални стријатум, HPC, хипокампус; Дијафрагма, латерални септум, mPFC, медијални префронтални кортекс, пири, пириформни кортекс, v. striatum, вентрални стријатум, VPM, вентропостомедијално једро таламуса, VTA, вентрални тегментални регион. Црвени квадрати представљају подручја мозга где су снимљене слике. б, Шематски дијаграм експеримента стимулације. ц, д, Примери одговора фотострује индуковане плавом светлошћу (горе) и напона (доле) у људским (c) EYFP+ t-hCO или пацовским (d) EYFP- ћелијама. е, ф, Тренутни трагови неурона пацова након стимулације плавом светлошћу аксона t-hCO са TTX и 4-AR (зелена), TTX (сива) или aCSF (црна) (е), са (љубичаста) или без (црна) ) ) NBQX (е). г, латенција одговора изазваних плавом светлошћу у ћелијама пацова (n = 16 ћелија); хоризонталне траке означавају просечну латенцију (7,13 ms) (лево). Амплитуда светлошћу изазваних EPSC-ова снимљених са или без NBQX (n = 7 ћелија; ***P < 0,0001) (средина). Амплитуда светлошћу изазваних EPSC-ова снимљених са или без NBQX (n = 7 ћелија; ***P < 0,0001) (средина). Амплитуда визванних светом ЕПСЦ, регистрованих с или без НБККС (н = 7 ћелија; ***П <0,0001) (у центру). Амплитуда светлошћу индукованих EPSC-ова забележених са или без NBQX (n = 7 ћелија; ***P < 0,0001) (центар).使用或不使用НБККС 记录的光诱发ЕПСЦ 的振幅（н = 7 个细胞；***П < 0,0001) (。中）)使用或不使用НБККС 记录的光诱发ЕПСЦ 的振幅（н = 7 个细胞；***П < 0,0001) (。中）) Амплитуда визванних светом ЕПСЦ, регистрованих с или без НБККС (н = 7 ћелија; ***П <0,0001) (у центру). Амплитуда светлошћу индукованих EPSC-ова забележених са или без NBQX (n = 7 ћелија; ***P < 0,0001) (центар).Проценат ћелија пацова које показују ЕПСЦ које реагују на плаву светлост (десно). h, Шематски дијаграм задатка понашања. d0, дан 0. i. Перформансе примерних животиња 1. дана (лево) или 15. дана (десно) тренинга. Просечан број лизања извршених 1. дана (лево) или 15. дана (десно у средини) (n = 150 покушаја плавог светла, n = 150 покушаја црвеног светла; ***P < 0,0001). Просечан број лизања извршених 1. дана (лево) или 15. дана (десно у средини) (n = 150 покушаја плавог светла, n = 150 покушаја црвеног светла; ***P < 0,0001). Среднее количество облизиваниј, виполнених в день 1 (слева) или день 15 (у центре справа) (н = 150 испитаниј с синим светом, н = 150 испитаниј с красним светом; ***П <0,0001). Просечан број лизања извршених 1. дана (лево) или 15. дана (десно у центру) (n = 150 покушаја плавог светла, n = 150 покушаја црвеног светла; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天 (右中)执行的平均舔次数（н = 150 次蓝光试验, н = 15,0н次红光试验；***П < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天 (右中)执行的平均舔次数（н = 150 次蓝光试验, н = 15,0н次红光试验；***П < 0,001 Среднее количество облизиваниј, виполнених в день 1 (слева) или день 15 (у центре справа) (н = 150 испитаниј с синим светом, н = 150 испитаниј с красним светом; ***П <0,0001). Просечан број лизања извршених 1. дана (лево) или 15. дана (десно у центру) (n = 150 покушаја плавог светла, n = 150 покушаја црвеног светла; ***P < 0,0001).Кумулативни лизања за испитивања црвеном и плавом светлошћу 1. дана (лево у центру) или 15. дана (десно). НС, није значајно. ј, к, Карактеристике понашања свих животиња којима је трансплантиран t-hCO експресујући hChR2-EYFP (ј) или контролни флуорофор (к) 1. или 15. дана (hChR2-EYFP: n = 9 пацова, ** P = 0,0049; контрола: n = 9, P = 0,1497). л, Еволуција резултата преференције (н = 9 хХР2, н = 9 контрола; **П < 0,001, ***П < 0,0001). л, Еволуција резултата преференције (н = 9 хХР2, н = 9 контрола; **П < 0,001, ***П < 0,0001). л, Еволуциа показатела предпочтениа (н = 9 хЦхР2, н = 9 контролних; **П <0,001, ***П <0,0001). л, Еволуција резултата преференције (н = 9 хХР2, н = 9 контрола; **П < 0,001, ***П < 0,0001). л，偏好评分的演变 (н = 9 хЦхР2, н = 9 对照；**П < 0,001,***П < 0,0001)。 л，偏好评分的演变 (н = 9 хЦхР2, н = 9 对照；**П < 0,001,***П < 0,0001)。 л, Еволуциа показателеј предпочтениа (н = 9 хЦхР2, н = 9 контроле; **П <0,001, ***П <0,0001). л, Еволуција резултата преференција (н = 9 хХР2, н = 9 контрола; **П < 0,001, ***П < 0,0001).м, експресија ФОС као одговор на оптогенетску активацију т-хЦО у С1. Приказане су слике експресије FOS (лево) и квантификације (n = 3 по групи; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (десно). Приказане су слике експресије FOS (лево) и квантификације (n = 3 по групи; *P < 0,05, **P < 0,01 и ***P < 0,001) (десно). Показани изображениа експрессии ФОС (слева) и количественного определениа (н = 3 на групу; * П <0,05, ** П <0,01 и *** П <0,001) (справа). Слике експресије FOS (лево) и квантификације (n = 3 по групи; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) су приказане (десно).显示了ФОС 表达 (左）和量化 (每组н = 3；*П < 0,05、**П < 0,01 和***П < 0,001)) (的右)显示了ФОС 表达 (左）和量化 (每组н = 3；*П < 0,05、**П < 0,01 和***П < 0,001)) (的右) Показани изображениа експрессии ФОС (слева) и количественного определениа (н = 3 на групу; * П <0,05, ** П <0,01 и *** П <0,001) (справа). Слике експресије FOS (лево) и квантификације (n = 3 по групи; *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001) су приказане (десно).Скала, 100 µm. Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна грешка BLA, базолатералне тонзиле, MDT, дорзомедијалног таламичног једра, PAG, периакведукталне сиве боје.
Коначно, питали смо се да ли t-hCO може да модулира понашање пацова. Да бисмо ово тестирали, трансплантирали смо hCO који експресује hChR2-EYFP у S1, а 90 дана касније, имплантирали смо оптичка влакна у t-hCO за испоруку светлости. Затим смо тренирали пацове модификованом парадигмом оперантног условљавања (Сл. 5х). Животиње смо ставили у комору за тестирање понашања и насумично применили плаве (473 nm) и црвене (635 nm) ласерске стимулусе у трајању од 5 секунди. Животиње су добијале награду у облику воде ако су лизале током стимулације плавом светлошћу, али нису лизале током стимулације црвеном светлошћу. Првог дана тренинга, животиње нису показале разлику у лизању када су стимулисане плавом или црвеном светлошћу. Међутим, 15. дана, животиње којима је трансплантиран hCO који експресује hChR2-EYFP показале су активније лизање када су стимулисане плавом светлошћу у поређењу са стимулацијом црвеном светлошћу. Ове промене у понашању лизања нису примећене код контролних животиња којима је трансплантиран hCO који експресује контролни флуорофор (стопа успеха учења: hChR2 89%, EYFP 0%, слика 5i-1 и додатни видео 2). Ови подаци указују на то да t-hCO ћелије могу активирати неуроне пацова да би стимулисале понашање тражења награде. Да бисмо открили која неуронска кола t-hCO пацова могу бити укључена у ове промене у понашању, оптогенетски смо активирали t-hCO код тренираних животиња и сакупили ткива 90 минута касније. Имунохистохемија је открила експресију FOS протеина зависног од активности у неколико региона мозга који су укључени у мотивисано понашање, укључујући медијални префронтални кортекс, медијални таламус и периакведукталну сиву масу, која је била експресована или код нестимулисаних контролних животиња или код животиња. пиринач. 5m). Узети заједно, ови подаци указују на то да t-hCO може модулирати неуронску активност пацова да би покренуо понашање.
Неурални органоиди представљају обећавајући систем за проучавање људског развоја и болести in vitro, али су ограничени недостатком веза између кола која постоје in vivo. Развили смо нову платформу у којој смо трансплантирали hCO у S1 имунокомпромитованих раних постнаталних пацова како бисмо проучили развој и функцију људских ћелија in vivo. Показали смо да t-hCO развија зреле типове ћелија који нису примећени in vitro28 и да је t-hCO анатомски и функционално интегрисан у мозак глодара. Интеграција t-hCO у неурална кола глодара омогућила нам је да успоставимо везу између ћелијске активности људи и проучаваног понашања животиња, показујући да t-hCO неурони могу модулирати неуронску активност пацова како би покренули бихевиоралне реакције.
Платформа коју описујемо има неколико предности у односу на претходна истраживања о трансплантацији људских ћелија у мозгове глодара. Прво, трансплантирали смо hCO у кортекс у развоју пацова у раним постнаталним годинама, што може олакшати анатомску и функционалну интеграцију. Друго, t-hCO МРИ праћење нам је омогућило да проучимо положај и раст калема код живих животиња, што нам је омогућило да спроведемо дугорочне студије на више животиња и утврдимо поузданост неколико hiPS ћелијских линија. Коначно, трансплантирали смо интактне органоиде, уместо изоловане суспензије појединачних ћелија, које су мање деструктивне за људске ћелије и могу да подстакну интеграцију и стварање неурона људског кортекса у мозгу пацова.
Признајемо да, упркос напретку на овој платформи, временска, просторна и међуврсна ограничења спречавају формирање људских неуронских кола са високом верношћу, чак и након трансплантације у раној фази развоја. На пример, није јасно да ли спонтана активност примећена у t-hCO представља развојни фенотип сличан ритмичкој активности примећеној током кортикалног развоја или је то последица одсуства супресивних типова ћелија присутних у t-hCO. Слично томе, није јасно у којој мери одсуство ламинације у t-hCO утиче на повезаност ланца30. Будући рад ће се фокусирати на интеграцију других типова ћелија као што су људска микроглија, људске ендотелне ћелије и различите пропорције GABAергичких интернеурона, као што је приказано коришћењем склопа 6 in vitro, као и на разумевање како се неурална интеграција и обрада могу догодити у измењеним t-hCO транскрипционим, синаптичким и бихевиоралним нивоима у ћелијама добијеним од пацијената.
Све у свему, ова in vivo платформа представља моћан ресурс који може допунити in vitro развој људског мозга и истраживање болести. Очекујемо да ће нам ова платформа омогућити да откријемо нове фенотипове на нивоу ланца у иначе недостижним ћелијама изведеним од пацијената и да тестирамо нове терапијске стратегије.
Генерисали смо hCO2.5 из HiPS ћелија као што је претходно описано. Да би се иницирала производња hCO из hiPS ћелија култивисаних на слојевима за храњење, интактне колоније hiPS ћелија су уклоњене из посуда за култивацију помоћу диспазе (0,35 мг/мл) и пребачене у пластичне посуде за културу са ултраниским приањањем које садрже посуде са hiPS медијумом за ћелијску културу. (Corning) допуњеним са два SMAD инхибитора дорзоморфином (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) и ROCK инхибитором Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Током првих 5 дана, hiPS ћелијски медијум је мењан свакодневно и додавани су дорзоморфин и SB-431542. Шестог дана у суспензији, неуронски сфероиди су пребачени у неуронски медијум који садржи неуробазал-А (10888, Life Technologies), додатак Б-27 без витамина А (12587, Life Technologies), ГлутаМакс (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допуњен епидермалним фактором раста (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) и фактором раста фибробласта 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24. дана. Од 25. до 42. дана, медијум је допуњен неуротрофичним фактором изведеним из мозга (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) и неуротрофином 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) са променама медијума сваког другог дана. Шестог дана у суспензији, неуронски сфероиди су пребачени у неуронски медијум који садржи неуробазал-А (10888, Life Technologies), додатак Б-27 без витамина А (12587, Life Technologies), ГлутаМакс (1:100, Life Technologies), пеницилин и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допуњен епидермалним фактором раста (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) и фактором раста фибробласта 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems) до 24. дана. Од 25. до 42. дана, медијум је допуњен неуротрофичним фактором изведеним из мозга (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) и неуротрофином 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) са променама медијума сваког другог дана.Шестог дана у суспензији, неуронски сфероиди су пребачени у неуронски медијум који садржи Neurobasal-A (10888, Life Technologies), додатак витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин.и стрептомицин (1:100, Лифе Тецхнологиес) и допуњени епидермалним фактором роста (ЕГФ; 20 нг/мл; Р&Д Системс) и фактором роста фибробластов 2 (ФГФ2; 20 нг/мл; Р&Д Системс) до 24-го дана. и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и допуњен епидермалним фактором раста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором раста фибробласта 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24. дана.Од 25. до 42. дана, у медијум су додани неуротрофични фактор изведен из мозга (BDNF; 20 нг мл-1, Peprotech) и неуротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1, Peprotech), мењајући медијум сваког другог дана.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有неуробасал-А (10888, Лифе Тецхнологиес)、不含维生、不含维生补充剂 (12587, Лифе Тецхнологиес)、ГлутаМак (1:100), Лифе Тецхнологиес）、青霉素的神经培养基中和Лифе:01和Тецхнологиес）并辅以表皮生长因子（ЕГФ；20 нг мл-1；Р&Д Системс）和成纤维细胞生长因子；-ДГФ2；Ф2（ФГ мл-1；Р&Д Системс Системи）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 неуробасал-а （10888 ， Лифе Тецхнологиес０ 不的 б-27 补充剂 (12587, Лифе Тецхнологиес) Глутамак (1: 100), Лифе ТецхНОГИС 青霉素 的 神经 培养 埓 （缠霭 基100 ， Лифе Тецхнологиес） 表皮 生长 因子 (（(20 нг мл-1 ； р & д Системс) 成 纤维 细胞 生长 2 （фгф2 ； 20 нг мл- 1；Р& Системи）直至第24天。 На 6-ј дан суспензије неуросфере били су преведени у добавку, која садржи неуробазал-А (10888, Лифе Тецхнологиес), добавку В-27 без витамина А (12587, Лифе Тецхнологиес), ГлутаМак (1:100, Лифе Тецхнологиес), пеницилин-стр001 нејпл. Тецхнологиес) с добавлением епидермального фактора роста (ЕГФ; 20 нг мл-1; Р&Д Системс) и фактора роста фибробластов 2 (ФГФ2; 20 нг мл-1) 1; Шестог дана, суспензије неуросфера су пребачене на додатак исхрани који садржи неуробазал-А (10888, Life Technologies), додатак Б-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрептомицин неутрализован пеницилином (1:100, Life Technologies) допуњен епидермалним фактором раста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактором раста фибробласта 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Р&Д Системс) до 24-го дна. Системи за истраживање и развој) до 24. дана.Од 25. до 42. дана, неуротрофични фактор изведен из мозга (BDNF; 20 нг мл-1, Peprotech) и неуротрофични фактор 3 (NT3; 20 нг мл-1, Peprotech) су додавани у медијум за култивацију сваког другог дана. Медијум је промењен једном.Почевши од 43. дана, hCO₂ је одржаван у неуробазалној-А подлози без допуњавања (NM; 1088022, Thermo Fisher) са променом подлоге сваких 4–6 дана. Да би се добио hCO₂ из hiPS ћелија култивисаних у условима без храњења, hiPS ћелије су инкубиране са Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) на 37°C током 7 минута, дисоциране на појединачне ћелије и посејане на AggreWell 800 плоче (34815, STEMCELL Technologies) при густини од 3 × 10⁶ појединачних ћелија по бунарићу у Essential 8 подлози допуњеној ROCK инхибитором Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). После 24 сата, медијум у бунарчићима је пипетиран горе-доле у ​​медијум који садржи Essential 6 медијум (A1516401, Life Technologies) допуњен дорзоморфином (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) и SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Од 2. до 6. дана, Essential 6 медијум је свакодневно замењиван дорзоморфином и додатком SB-431542. Од шестог дана, суспензије неуросфера су пребачене у неуробазални медијум и одржаване као што је горе описано.
Сви поступци на животињама су спроведени у складу са смерницама за негу животиња које је одобрио Административни комитет за негу лабораторијских животиња Универзитета Станфорд (APLAC). Гравидни еутимични RNU (rnu/+) пацови су купљени (Charles River Laboratories) или смештени. Животиње су држане на 12-часовном циклусу светлости и таме са храном и водом ad libitum. Младунци голих (FOXN1–/–) пацова старости од три до седам дана идентификовани су по расту незрелих бркова пре елиминације. Штенци (мушки и женски) су анестезирани са 2-3% изофлурана и стављени на стереотаксични оквир. Извршена је трепанација лобање пречника приближно 2-3 мм изнад S1 уз очување интегритета дуре матер. Затим се користи игла од 30-G (приближно 0,3 мм) непосредно изван краниотомије да се пробије дура. Затим се на танки парафилм димензија 3×3 цм нанесе HCO3 и уклони вишак подлоге. Користећи Хамилтонов шприц причвршћен за иглу од 23 G, 45°, нежно увуците hCO₂ у најдисталнији крај игле. Затим поставите шприц на шприц пумпу повезану са стереотаксичним уређајем. Затим поставите врх игле преко претходно направљене рупе за убод ширине 0,3 mm у дури (z = 0 mm) и сузите шприц за 1–2 mm (z = приближно –1,5 mm) док се игла не нађе између дуре А. Не формира се густо затварање. Затим подигните шприц до центра кортикалне површине на z = -0,5 mm и убризгајте hCO₂ брзином од 1-2 µl у минути. Након завршетка убризгавања hCO₂, игла се повлачи брзином од 0,2-0,5 mm у минути, кожа се зашива, а штене се одмах ставља на топлу грејну подлогу до потпуног опоравка. Неким животињама је извршена трансплантација билатерално.
Све процедуре на животињама су спроведене у складу са смерницама за негу животиња које је одобрио APLAC Универзитет Станфорд. Пацови (старији од 60 дана након трансплантације) су индуковани анестезијом од 5% изофлурана и анестезирани са 1-3% изофлурана током снимања. За визуелизацију је коришћен активно заштићени хоризонтални скенер бушотина од 7 Тесла, Bruker (Bruker Corp.), са градијентним погоном компаније International Electric Company (IECO), заштићени градијентни уложак унутрашњег пречника од 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) користећи AVANCE.III, осмоканални вишекалемни РФ и вишејезгарне могућности, и пратећу Paravision 6.0.1 платформу. Снимање је извршено коришћењем активно раздвојеног волуметријског РФ калема унутрашњег пречника од 86 mm и четвороканалног крио-хлађеног РФ калема само за пријем. Аксијални 2Д Турбо-RARE (време понављања = 2500 мс, време одјека = 33 мс, 2 просека) са 16 снимака слојева, дебљина слоја 0,6–0,8 мм, који садржи 256 × 256 узорака. Сигнали су примљени помоћу квадратурне примопредајничке волуметријске РФ завојнице са унутрашњим пречником од 2 цм (Rapid MR International, LLC). Коначно, користе се уграђене функције процене површине Имарис (BitPlane) за 3Д рендеровање и анализу запремине. Успешна трансплантација је дефинисана као она у којој су се формирала подручја континуираног Т2-пондерисаног МРИ сигнала у трансплантираној хемисфери. Одбацивање графта је дефинисано као графт који није произвео подручја континуираног Т2-пондерисаног МРИ сигнала у трансплантираној хемисфери. Субкортикални t-hCO је искључен из накнадне анализе.
Да би се стабилно експресовали GCaMP6s у hCO за двофотонско снимање калцијума, hiPS ћелије су инфициране са pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, након чега је уследила селекција антибиотика. Укратко, ћелије су дисоциране са EDTA и суспендоване у 1 ml Essential 8 медијума при густини од приближно 300.000 ћелија у присуству полибрена (5 μg/ml) и 15 μl вируса. Ћелије су затим инкубиране у суспензији 60 минута и посејане при густини од 50.000 ћелија по бунарићу. Након конфлуенције, ћелије су третиране са 5-10 μg ml-1 пуромицина током 5-10 дана или док се нису појавиле стабилне колоније. Акутна hCO инфекција је извршена као што је претходно описано5 са неким модификацијама. Укратко, hCO је пребачен 30-45. дана у Eppendorf микроцентрифужне епрувете од 1,5 ml које садрже 100 µl нервног медијума. Затим се уклони приближно 90 µl медијума, 3-6 µl лентивируса високог титра (од 0,5 x 108 до 1,2 x 109) се дода у епрувету, а hCO3 се преноси у инкубатор на 30 минута. Након тога, додајте 90–100 µl медијума у ​​сваку епрувету и вратите епрувете у инкубатор преко ноћи. Следећег дана, пребаците hCO3 у свеж нервни медијум у плочама са ниским причвршћивањем. После 7 дана, hCO3 је пребачен на плоче са 24 бунарића са стакленим дном ради визуелизације и процене квалитета инфекције. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE и pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE су генерисани помоћу VectorBuilder-а. Лентивирус се користи у већини експеримената јер је интегрисан у геном домаћина, омогућавајући експресију репортерског гена у инфицираним ћелијским линијама. За праћење беснила, hCO је 30-45. дана коинфициран са вирусом беснила-ΔG-eGFP и AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид #67528, Addgene), темељно испран 3 дана, а затим трансплантиран пацовима у S1 фази и одржаван in vivo 7-14 дана.
За имуноцитохемију, животиње су анестезиране и транскардијално перфузиране са PBS, а затим са 4% параформалдехидом (PFA у PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозгови су фиксирани у 4% PFA током 2 сата или преко ноћи на 4°C, криоконзервирани у 30% сахарози у PBS током 48-72 сата и уграђени у 1:1, 30% сахарозу:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) и коронални пресеци су направљени на 30 µm коришћењем криостата (Leica). За имунохистохемију дебелих пресека, животиње су перфузиране са PBS, а мозак је дисециран и секциониран коронално на 300–400 µm коришћењем вибратома (Leica) и пресеци су фиксирани са 4% PFA током 30 минута. Затим су криосечци или дебели пресеци испрани са PBS-ом, блокирани 1 сат на собној температури (10% нормалног магарчевог серума (NDS) и 0,3% Triton X-100 разблаженог у PBS-у) и блокирани раствором за блокирање на 4°C. – Инкубација Криосечци су инкубирани преко ноћи, а дебели пресеци су инкубирани 5 дана. Примарна коришћена антитела била су: анти-NeuN (миш, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (пацов, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зец, 1:1.000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилетина, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миш, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зец, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зец, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (зец, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миш, 1:50; аб9774, абкам), анти-SCG2 (зец, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миш, 1:50; аб51502, абкам), анти-GAD65/67 (зец, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Примарна коришћена антитела била су: анти-NeuN (миш, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (пацов, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зец, 1:1.000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилетина, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миш, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зец, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зец, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (зец, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миш, 1:50; аб9774, абкам), анти-SCG2 (зец, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миш, 1:50; аб51502, абкам), анти-GAD65/67 (зец, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Использовались следуусие первичние антитела: анти-НеуН (мишиние, 1:500; аб104224, абцам), анти-ЦТИП2 (крисиние, 1:300; аб18465, абцам), анти-ГФАП (кроличьи, 1:1000; З0334, Дако1: антику-00; ГТКС13970, ГенеТек), анти-ХНА (мишь, 1:200; аб191181, абцам), анти-НеуН (кролик, 1:500; АБН78, Миллипоре), анти-ПДГФРА (кролик, 1:200; сц-338, Санта-Круз), анти-ППП1Р17 (кролик, 1:200; ХПА047819, Атлас Антибодиес), анти-РЕЦА-1 (мишь, 1:50; аб9774, абцам), анти-СЦГ2 (кролик , 1:100; 20357-1-АП, Протеинтецх), анти-СОКС:5, СОКС; Р&Д Системс), нетрин Г1а (козиј, 1:100; АФ1166, Р&Д Системс), анти-СТЕМ121 (мишиниј , 1:200; И40410, Такара Био), анти-САТБ2 (мишь, 1:50; аб51502, абцам/, анти-ГАД65 1:400; АБН904, Миллипоре) и анти-ИБА1 (коза, 1 : 100; аб5076, абкам). Примарна коришћена антитела била су: анти-NeuN (миш, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (пацов, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зец, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (пилетина, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миш, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зец, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зец, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (зец, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (миш, 1:50; ab9774), абкам), анти-SCG2 (зец, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миш, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зец, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗НеуН (小鼠,1:500；аб104224,абцам)抗ЦТИП2 (大鼠，1:3) 00；аб18465，абцам），抗ГФАП（兔，1:1,000；З0334，Дако），抗-ГФ П (鸡, 1:1,000; ГТКС13970, ГенеТек), 抗ХНА (小鼠, 1:200; аб1911) 81, абцам, 抗НеуН (兔, 1:500; АБН78, Миллипоре), 抗ПДГФРА (兔), 1:200；сц-338, Санта Цруз）, 抗ППП1Р17 (兔, 1:200；ХПА047819), Атлас抗体）,抗РЕЦА-1 (小鼠,1:50；аб9774,абцам)，抗СЦГ2 (兔）), 1:100；20357-1-АП,Протеинтецх）,抗СОКС9 (山羊，1:500；АФ3075,Р&Д Системс)，Нетрин Г1а（山羊，1:100；АФ1166,Р&Д Системс），抗СТЕМ121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗НеуН (小鼠,1:500；аб104224,абцам)抗ЦТИП2 (大鼠，1) :300；аб18465,абцам）,抗ГФАП（兔，1:1,000；З0334,Дако），抗-ГФП (鸡, 1:1,000; ГТКС13970, ГенеТек), 抗ХНА (小鼠, 1:200；аб 191181, абцам, 抗 НеуН (兔, 1:500), АБН78, Миллипоре, 弔, 1: 200；сц-338, Санта Цруз）, 抗ППП1Р17 (兔, 1:200；ХПА047819), Атлас抗体）,抗РЕЦА-1 (小鼠,1:50；аб9774,абцам)，抗СЦГ2 100；20357-1-АП,Протеинтецх）,抗СОКС9 (山羊,1:500；АФ3075,Р&Д Системс),Нетрин Г1а（山羊，1:106，1:106 Системи）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миш, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зец, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abcam).Примарна коришћена антитела била су: анти-NeuN (миш, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (пацов, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (зец, 1:1000; Z0334, Dako). , анти-GFP (пилетина, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (миш, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (зец, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (зец, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анти-PPP1R17 (зец, 1:200; HPA047819, Atlas антитело), ​​анти-RECA-1 (миш, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (зец), 1:100;20357-1-АП, Протеинтецх), анти-СОКС9 (коза, 1:500; АФ3075, Р&Д Системс), Нетрин Г1а (коза, 1:100; АФ1166, Р&Д Системс), анти -СТЕМ121 (мишь, 1:200; 1:210-, И400-, И402) 1:50; аб51502, абцам), анти-ГАД65/67 (кролик, 1:400; АБН904, Миллипоре) и анти-ИБА1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (миш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (миш, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (зец, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, abkam).Пресеци су затим испрани са PBS-ом и инкубирани са секундарним антителом током 1 сата на собној температури (замрзнути пресеци) или преко ноћи на 4°C (дебели пресеци). Коришћено је секундарно антитело Alexa Fluor (Life Technologies) разблажено 1:1000 у раствору за блокирање. Након испирања са PBS-ом, језгра су визуализована помоћу Hoechst 33258 (Life Technologies). Коначно, препарати су стављени на микроскоп са покровним стаклом (Fisher Scientific) користећи Aquamount (Polysciences) и анализирани на Keyence флуоресцентном микроскопу (BZ-X анализатор) или Leica TCS SP8 конфокалном микроскопу (Las-X) на слици. Слике су обрађене помоћу програма ImageJ (Фиџи). Да би се квантификовао удео људских неурона у t-hCO и кортексу пацова, снимљене су правоугаоне слике ширине 387,5 μm у центру t-hCO, на или близу ивице кортекса пацова. Маргине графта су одређене проценом промена у транспарентности ткива, HNA+ језгрима и/или присуству аутофлуоресценције ткива. На свакој слици, укупан број NeuN+ и HNA+ ћелија је подељен са укупним бројем NeuN+ ћелија у истој области. Да би се осигурало да се броје само ћелије са језгрима у равни слике, у прорачун су укључене само ћелије које су такође Hoechst+. Две слике раздвојене за најмање 1 mm су усредњене како би се смањила статистичка грешка.
Недељу дана пре узимања узорака, животиње са трансплантацијом hCO₃ (приближно 8 месеци диференцијације) су смештене у тамну просторију са подрезаним брковима како би се минимизирала сензорна стимулација. Изолација језгара је извршена као што је претходно описано, са неким модификацијама. Укратко, t-hCO₃ и hCO₃ су уништени коришћењем детерџентно-механичке лизе ћелија и стаклене млинице за ткиво од 2 мл (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Сирова језгра су затим филтрирана коришћењем филтера од 40 µm и центрифугирана на 320 g током 10 минута на 4 °C пре него што је извршена анализа градијентом густине сахарозе. Након корака центрифугирања (320 g током 20 минута на 4 °C), узорци су ресуспендовани у 0,04% BSA/PBS са додатком 0,2 јединице µl-1 RNase инхибитора (40 u µl-1, AM2682, Ambion) и пропуштени кроз проточни филтер од 40 µm. Дисоцирана језгра су затим ресуспендована у PBS-у који садржи 0,02% BSA и напуњена на Chromium Single Cell 3′ чип (процењени опоравак од 8.000 ћелија по траци). snRNA-seq библиотеке су припремљене помоћу Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq библиотеке су припремљене помоћу Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки снРНА-сек били приготовлени с помосьу Цхромиум Сингле целл 3′ ГЕМ, Либрари & Гел Беад Кит в3 (10к Геномицс). Библиотеке snRNA-seq су припремљене коришћењем Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). снРНА-сек 文库是使用Цхромиум Сингле целл 3′ ГЕМ、Либрари & Гел Беад Кит в3 (10к Геномицс) 制备的。 снРНА-сек 文库是使用Цхромиум Сингле целл 3′ ГЕМ、Либрари & Гел Беад Кит в3 (10к Геномицс) 制备的。 Библиотеку снРНА-сек готовили с использованием Цхромиум Сингле Целл 3′ ГЕМ, Либрари & Гел Беад Кит в3 (10к Геномицс). Библиотека snRNA-seq је припремљена коришћењем Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Библиотеке из различитих узорака су обједињене и секвенциониране помоћу програма Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Нивои експресије гена за сваки претпостављени нуклеарни бар-код квантификовани су коришћењем софтверског пакета за анализу 10x Genomics CellRanger (верзија 6.1.2). Конкретно, очитавања су упоређена са комбинацијом људских (GRCh38, Ensemble, верзија 98) и пацовских (Rnor_6.0, Ensemble, верзија 100) референтних генома креираних помоћу команде mkref и коришћењем команде count са командом –include-introns=TRUE за квантификацију, укључујући очитавања мапирана на интронске регионе. За t-hCO узорке, људска језгра су идентификована на основу конзервативног захтева да најмање 95% свих мапираних очитавања одговара људском геному. Све наредне анализе су извршене на филтрираном излазу низа бар-кодова из CellRanger-а коришћењем R пакета (верзија 4.1.2) Seurat (верзија 4.1.1)32.
Да би се осигурало да се у накнадну анализу укључе само језгра високог квалитета, за сваки узорак је примењен итеративни процес филтрирања. Прво, идентификују се и уклањају језгра ниског квалитета са мање од 1000 пронађених јединствених гена и више од 20% укупних митохондрија. Након тога, матрица сирових бројева гена је нормализована регуларизованом негативном биномном регресијом коришћењем функције sctransform(vst.flavor=”v2″), која је такође идентификовала 3000 најваријабилнијих гена користећи подразумеване параметре. Смањење димензије је извршено на горњим варијабилним генима коришћењем анализе главних компоненти (PCA) са подразумеваним параметрима користећи димензију скупа података од 30 (dims = 30 је изабрано на основу визуелног прегледа места колена и коришћено је за све узорке и анализе ансамбла). Затим смо извршили неколико кругова итеративног кластеровања (резолуција = 1) да бисмо класификовали гене на основу абнормално ниског броја гена (медијана испод 10. перцентила), абнормално високог броја митохондријалних гена (медијана изнад 95. перцентила) како бисмо идентификовали и уклонили претпостављене ћелије ниског квалитета, кластере и/или висок удео сумњивих близанаца идентификованих коришћењем пакета DoubletFinder33 (средњи резултат DoubletFinder изнад 95. перцентила). t-hCO узорци (n=3) и hCO узорци (n=3) су интегрисани одвојено коришћењем функције IntegrateData са горе наведеним параметрима. Затим Још један круг квалитативног филтрирања интегрисаног скупа података је извршен као што је горе описано.
Након уклањања језгара ниског квалитета, интегрисани скуп података је груписан (резолуција = 0,5) и уграђен за потребе визуелизације UMAP34. Маркер гени за сваки кластер су одређени коришћењем функције FindMarkers са подразумеваним параметрима израчунатим из нормализованих података о експресији гена. Идентификујемо и класификујемо главне ћелијске класе комбиновањем референтних скупова података феталног и адултног кортекса са експресијом маркер гена 19,20,21,35 и анотацијом. Конкретно, циркулишући прекурсори су идентификовани експресијом MKI67 и TOP2A. Прогениторски кластери су дефинисани одсуством митотских транскрипата, високим преклапањем са мултипотентним глијалним прогениторским кластерима описаним у касној метафази феталног кортекса, и експресијом EGFR и OLIG1. Користимо термин астроцит да бисмо обухватили неколико стања диференцијације астроцита, од касне радијалне глије до сазревања астроцита. Астроцитни кластери експресују високе нивое SLC1A3 и AQP4 и показано је да се мапирају са подтиповима феталне радијалне глије и/или адултних астроцита. ОПЦ експресују PDGFRA и SOX10, док олигодендроцити експресују маркере мијелинације (MOG и MYRF). Глутаматергички неурони су идентификовани присуством неуронских транскрипата (SYT1 и SNAP25), одсуством GABAергичких маркера (GAD2) и експресијом NEUROD6, SLC17A7, BCL11B или SATB2. GluN неурони су даље подељени у горње (експресија SATB2 и губитак BCL11B) и дубоке (експресија BCL11B) подкласе. Претпостављени неурони подплоче (SP) експресују познате SP18 маркере као што су ST18 и SORCS1 поред дубоких GluN маркера. Ћелије сличне хороидном плексусу идентификоване су експресијом TTR, а ћелије сличне менингеалним ћелијама су експресовале гене повезане са фибробластима и мапирале пиалне/васкуларне ћелије из референтног скупа података.
Диференцијална анализа експресије гена између t-hCO и hCO подкласа је спроведена коришћењем новоразвијене псеудо-серијске методе репродуковане у узорцима имплементираним коришћењем Libra R пакета (верзија 1.0.0). Конкретно, edgeR лог-тестови вероватноће (верзија 3.36.0, пакет R) су спроведени за групе сумирањем броја гена у ћелијама за дату класу ћелија за сваку репликацију узорка. За визуелизацију топлотне мапе, нормализоване вредности на милион (CPM) су израчунате коришћењем edgeR (функција cpm()) и скалиране (да би се постигла средња вредност = 0, стандардна девијација = 1). Извршена је анализа обогаћивања Gene Ontology (GO) значајно појачаних t-hCO GluN гена (P вредност коригована Бенџамини-Хохбергом мања од 0,05 изражена у најмање 10% t-hCO GluN ћелија и повећање промене од најмање 2 пута) коришћењем ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Користимо апликацију ToppFun са подразумеваним параметрима и извештавамо о P-вредностима коригованим Бенџамини-Хохбергом, израчунатим из хипергеометријских тестова са GO анотацијама.
Да бисмо упарили наше кластере snRNA-seq са анотираним ћелијским кластерима из референтних студија примарне RNA-seq једноћелијских или snRNA-seq одраслих 19,20,21,22, применили смо приступ интеграције упарених скупова података. Користили смо SCTransform (v2) ток нормализације у Seurat-у да бисмо интегрисали и упоредили преклапања кластера између скупова података (користећи исте параметре као горе). Појединачни скупови података су насумично подскупљени до 500 ћелија или језгара по оригиналном кластеру ради рачунарске ефикасности. Користећи сличан приступ као што је претходно описано, преклапање кластера је дефинисано као удео ћелија или језгара у сваком обједињеном кластеру који се преклапа са ознаком референтног кластера. Да бисмо даље класификовали GluN ћелије, користили смо Seurat-ов ток рада TransferData за GluN подскуп податке да бисмо доделили ознаке референтних скупова података нашим GluN ћелијама.
Да бисмо проценили статус сазревања глобалног транскриптома узорака t-hCO и hCO, упоредили смо наше псеудо-узорке са BrainSpan/psychENCODE23, који се састоји од велике РНК секвенце која обухвата развој људског мозга. Извршили смо PCA на комбинованој матрици генске експресије нормализоване по обрасцу из кортикалних узорака 10 недеља након зачећа и касније, у 5567 гена (заједно са нашим подацима) који су претходно идентификовани као активни у BrainSpan кортикалним узорцима (дефинисано као више од 50% у развојној варијанси објашњеној старошћу коришћењем кубног модела)38. Поред тога, извели смо гене повезане са главним транскриптомским потписима неуроразвоја користећи ненегативну матричну факторизацију као што је претходно описано. Тежине узорака израчунате коришћењем поступка ненегативне матричне факторизације приказане су на сликама 5б са проширеним подацима за сваки од пет потписа које су описали Zhu et al.38. Поново, транскрипциони маркери зависни од активности изведени су из претходно објављених студија. Посебно, ЕРГ и ЛРГ су били значајно појачани у глутаматергичким неуронима идентификованим колекцијом snRNA-seq из визуелног кортекса миша након визуелне стимулације из Додатне табеле 3 Хрватин и др.16. Људски обогаћени ЛРГ су добијени из култура људског феталног мозга активираних KCl-ом и сакупљени 6 сати након стимулације, а филтрирани гени су били значајно појачани код људи, али не и код глодара (Додатна табела 4). Анализа обогаћивања генског скупа коришћењем ових генских скупова је извршена коришћењем једносмерног Фишеровог егзактног теста.
Анестезирати пацове изофлураном, уклонити мозак и ставити га у хладан (приближно 4°C) оксигенисани (95% O2 и 5% CO2) раствор сахарозе за пресеке који садрже: 234 mM сахарозу, 11 mM глукозу, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 и 0,5 mM CaCl2 (око 310 mOsm). Коронални пресеци мозга пацова (300–400 µm) који садрже t-hCO2 направљени су коришћењем вибратома Leica VT1200 као што је претходно описано39. Пресеци су затим пренети у комору за сечење са континуираном оксигенацијом на собној температури која садржи aCSF припремљен од: 10 mM глукозе, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 и 126 mM NaCl (298 mOsm). најмање 45 минута пре снимања. Пресеци су снимани у уроњеној комори где су континуирано перфузовани са aCSF (бочица са 95% O2 и 5% CO2). Сви подаци су снимани на собној температури. t-hCO неурони су завршени пипетом од боросиликатног стакла напуњеном раствором који садржи 127 mM калијум глуконата, 8 mM NaCl, 4 mM магнезијум ATP, 0,3 mM натријум GTP, 10 mM HEPES и 0,6 mM EGTA, pH 7,2, интерни раствор подешен са KOH (290 mOsm). Да би се опоравио, биоцитин (0,2%) је додат у раствор за снимање.
Подаци су прикупљени коришћењем појачала MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитализатора Digidata 1550B (Molecular Devices), нископропусни филтрирани на 2 kHz, дигитализовани на 20 kHz и анализирани коришћењем Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). и прилагођених MATLAB функција (Mathworks). Потенцијал споја је израчунат помоћу JPCalc-а, а уноси су подешени на израчунату вредност од -14 mV. Операција IV се састоји од низа струјних корака у корацима од 10-25 pA, од -250 до 750 pA.
Таламус, бела маса и S1 аферентне вене су електрично стимулисане у таламокортикалним пресецима током снимања hCO неурона помоћу патч-клемп технологије, као што је претходно описано. Укратко, мозак је постављен на сто за 3Д штампање нагнут под углом од 10°, а предњи део мозга је исечен под углом од 35°. Мозак је затим залепљен за пресечену површину и пресечен, чувајући таламокортикалне избочене аксоне. Биполарне волфрамове електроде (0,5 MΩ) су монтиране на други микроманипулатор и стратешки позициониране да стимулишу четири региона по ћелији (унутрашња капсула, бела масе, S1 и hCO). Снимите синаптичке одговоре након фазне стимулације од 300 µA на 0,03–0,1 Hz.
Неурони hChR2 који експресују hCO су активирани на 480 nm, а светлосни импулси генерисани LED диодом (Prizmatix) су примењени кроз објектив ×40 (0,9 NA; Olympus) да би се забележила експресија hChR2 у близини ћелија. Пречник осветљеног поља је приближно 0,5 mm, а укупна снага је 10-20 mW. Ширина импулса је подешена на 10 ms, што одговара импулсу датом током експеримента учења понашања. Коришћене су различите фреквенције стимулације, од 1 до 20 Hz, али је само први импулс серије коришћен за квантификацију. Интервали између низова су обично дужи од 30 s како би се минимизирао ефекат на синаптичке инхибиторне или олакшавајуће путеве. Да бисмо тестирали да ли је hChR2 одговор моносинаптички, применили смо TTX (1 μM) у купатило док EPSC реакција није нестала, а затим смо применили 4-аминопиридин (4-AP; 100 μM). Типично, одговор се враћа у року од неколико минута, са нешто дужим кашњењем између паљења LED диоде и генерисања EPSC. NBQX (10 μM) је коришћен за тестирање да ли је одговор покренут AMPA рецепторима.
Оштри hCO пресеци су направљени као што је претходно описано. Укратко, hCO пресеци су уграђени у 4% агарозу и пренети у ћелије које садрже 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 и 10 mM d-(+)-глукозу. Пресеци су исечени на 200–300 µm на собној температури коришћењем Leica VT1200 вибратора и чувани у ASF на собној температури. Затим је извршено „patch-camp“ снимање целих ћелија на hCO пресецима под директним SliceScope микроскопом (Scientifica). Пресеци су перфузовани са aCSF (95% O2 и 5% CO2) и ћелијски сигнали су забележени на собној температури. hCO неурони су примењени помоћу боросиликатне стаклене пипете напуњене раствором који садржи 127 mM калијум глуконата, 8 mM NaCl, 4 mM магнезијум АТП, 0,3 mM натријума GTP, 10 mM HEPES и 0,6 mM EGTA, интерног pH 7,2, подешеног са KOH (осмоларност 290). Ради опоравка, додати 0,2% биоцитина у интерни раствор.
Подаци су прикупљени помоћу програма Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) коришћењем појачала MultiClamp 700B (Molecular Devices) и дигитализатора Digidata 1550B (Molecular Devices), филтрирани нископропусним каналом на 2 kHz, дигитализовани на 20 kHz и анализирани коришћењем програма Clampfit (верзија 10.6) за анализу (molecular devices) и прилагођених MATLAB функција (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенцијал споја је израчунат помоћу JPCalc-а, а уноси су прилагођени израчунатом потенцијалу споја од -14 mV. Операција IV се састоји од низа струјних корака у корацима од 5-10 pA од -50 до 250 pA.
За морфолошку реконструкцију уштипнутих неурона, у интерни раствор је додато 0,2% биоцитина (Sigma-Aldrich). Ћелије су прајмиране најмање 15 минута након „хаковања“. Пипета се затим полако увлачи 1-2 минута док се регистрована мембрана потпуно не затвори. Након поступка физиологије пресека, пресеци су фиксирани преко ноћи на 4°C у 4% PFA, испрани са PBS X3 и разблажени 1:1000 са стрептавидин-коњугованим DyLight 549 или DyLight 405 (Vector Labs). Ћелије напуњене биоцитином (2%; Sigma-Aldrich) су обележене током снимања помоћу патч клемпа на собној температури током 2 сата. Пресеци су затим монтирани на микроскопска стакла помоћу Aquamount-а (Thermo Scientific) и визуализовани следећег дана на Leica TCS SP8 конфокалном микроскопу коришћењем објектива за имeрзију у уље са нумеричком апертуром ×40 1,3, увећањем ×0,9–1,0, xy. Брзина узорковања је приближно 7 пиксела по микрону. Z-стекови у интервалима од 1 µm су добијани серијски, а z-стекови мозаици и аутоматско спајање засновано на Leica технологији су извршени да би се покрило целокупно дендритско стабло сваког неурона. Неурони су затим праћени полуручно коришћењем neuTube 40 интерфејса и генерисане су SWC датотеке. Датотеке су затим отпремљене у SimpleNeuriteTracer41 Fiji додатак (ImageJ, верзија 2.1.0; NIH).
Људско кортикално ткиво је добијено уз информисани пристанак у складу са протоколом који је одобрио Институционални одбор за ревизију Универзитета Станфорд. Два узорка људског постпорођајног ткива (3 и 18 година старости) добијена су ресекцијом фронталног кортекса (средњи фронтални гирус) као део операције рефракторне епилепсије. Након ресекције, ткиво је сакупљено у ледено хладном NMDG-aCSF-у који садржи: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM глукозе, 2 mM тиоуреје, 5 mM натријум аскорбата, 3 mM натријум пирувата, 0,5 mM CaCl2 4H2O и 10 mM MgSO4 7H2O. Титрирати до pH 7,3-7,4 концентрованом хлороводоничном киселином. Ткива су достављена у лабораторију у року од 30 минута, а коронални пресеци су узети према горе описаном поступку.
Све процедуре на животињама су спроведене у складу са смерницама за негу животиња које је одобрио APLAC Универзитет Станфорд. Пацови (старији од 140 дана након трансплантације) су анестезирани 5% изофлураном и анестезирани са 1-3% изофлурана интраоперативно. Животиње су стављене у стереотаксични оквир (Kopf) и бупренорфин са продуженим ослобађањем (SR) је убризган поткожно. Лобања је изложена, очишћена и уметнуто је 3-5 коштаних шрафова. Да бисмо циљали t-hCO₂, генерисали смо стереотаксичне координате из МРИ слика. На месту од интереса је избушен отвор, а влакна (пречника 400 µm, NA 0,48, Doric) су спуштена 100 µm испод површине hCO₂ и причвршћена за лобању УВ-полимеризујућим зубарским цементом (Relyx).
Снимања помоћу оптичких фотометријских влакана су извршена као што је претходно описано42. Да би се забележила спонтана активност, пацови су смештени у чист кавез, а оптички кабл пречника 400 µм (Doric) повезан са системом за аквизицију података помоћу оптичких влакана и фотометријских влакана повезан је са имплантираним оптичким каблом. Током 10-минутног снимања моторичке активности, животиње су могле слободно да истражују кавез. Да би се забележила евокована активност, пацови (више од 140 дана након трансплантације) су анестезирани са 5% изофлурана за индукцију и 1-3% изофлурана за одржавање. Животиња је постављена у стереотактички оквир (Kopf), а бркови на супротној страни t-hCO₂ су скраћени на око 2 цм и провучени кроз мрежу повезану са пиезоелектричним актуатором (PI). Оптички кабл пречника 400 µм (Doric) је повезан са имплантираним влакном и повезан са системом за аквизицију података. Бркови на супротној страни t-hCO су затим скренути 50 пута (2 mm на 20 Hz, 2 s по презентацији) у насумичним временима помоћу пиезоелектричног погона током периода снимања од 20 минута. Користите Arduino MATLAB Support Package да бисте контролисали време скретања помоћу прилагођеног MATLAB кода. Догађаји су синхронизовани са софтвером за аквизицију података коришћењем импулса транзистор-транзисторске логике (TTL).
Пацови (старији од 140 дана након трансплантације) су индуковани анестезијом од 5% изофлурана и анестезирани са 1-3% изофлурана интраоперативно. Животиње су стављене у стереотаксични оквир (Kopf) и бупренорфин СР и дексаметазон су им убризгани поткожно. Лобања је огољена, очишћена и уметнуто је 3-5 коштаних шрафова. Да бисмо циљали t-hCO, генерисали смо стереотаксичне координате из МРИ слика. Кружна краниотомија (пречника приближно 1 цм) је извршена бушилицом велике брзине директно преко трансплантираног hCO. Када је кост што тања, али пре бушења кроз целу кост, користите форцепс да бисте уклонили преостали нетакнути карлични диск како бисте открили испод њега t-hCO. Краниотомија је напуњена стерилним физиолошким раствором, а покровно стакло и посебна игла за главу су причвршћени за лобању помоћу УВ-очврснутог стоматолошког цемента (Relyx).
Двофотонско снимање је извршено коришћењем Bruker мултифотонског микроскопа са Nikon LWD (×16, 0,8 NA) објективом. GCaMP6 снимање је извршено на 920 nm са 1,4x увећањем једне z-равни и 8x просеком од 7,5 fps. Пацови су индуковани 5% изофлуранском анестезијом и одржавани са 1-3% изофлурана. Пацови су смештени у прилагођени носач за главу и постављени испод сочива. Добијен је 3-минутни позадински снимак моторичке активности. Током 20 минута снимања, 50 удисаја (свака презентација дужине 100 ms) је насумично испоручено на јастучић бркова насупрот t-hCO₂ помоћу пикосприцера. Користите Arduino MATLAB Support Package за контролу времена бурста помоћу прилагођеног MATLAB кода. Синхронизујте догађаје са софтвером за аквизицију података (PrairieView 5.5) користећи TTL импулсе. За анализу, слике су кориговане за xy кретање коришћењем афине корекције у MoCo програму покренутом на Фиџију. Екстракција флуоресцентних трагова из појединачних ћелија коришћењем CNMF-E43. Флуоресценција је екстрахована за сваки регион од интереса, конвертована у dF/F криве, а затим конвертована у z-вредности.
Пацови (старији од 140 дана након трансплантације) су анестезирани 5% изофлураном и анестезирани са 1-3% изофлурана интраоперативно. Животиње су стављене у стереотаксични оквир (Kopf) и бупренорфин SR и дексаметазон су им убризгани поткожно. Бркови на супротној страни t-hCO су исечени на око 2 цм и провучени кроз мрежицу ​​повезану са пиезоелектричним актуатором. Лобања је изложена и очишћена. За лобању је причвршћен вијак за уземљење од нерђајућег челика. Да бисмо циљали t-hCO, генерисали смо стереотаксичне координате из МРИ слика. Извршите кружну краниотомију (пречника приближно 1 цм) бушилицом велике брзине одмах изнад t-hCO. Када је кост што тања, али пре бушења кроз целу кост, користите форцепс да бисте уклонили преостали нетакнути карлични диск како бисте открили испод t-hCO. Појединачне ћелије су снимане коришћењем 32-каналних или 64-каналних силицијумских сонди високе густине (Cambridge Neurotech) уземљених на завртње за уземљење и претходно појачаних RHD појачавачима (Intan). Користите манипулатор да спустите електроде до циљног места кроз краниотомију, која је напуњена стерилним физиолошким раствором. Прикупљање података је вршено на фреквенцији од 30 kHz коришћењем система за аквизицију података Open Ephys. Снимање је настављено само када смо детектовали високо корелирану ритмичку спонтану активност у више од 10 канала, што сугерише да су се електроде налазиле у графту (на основу података двофотонског снимања калцијума). Добијен је 10-минутни позадински снимак моторичке активности. Бркови на супротној страни t-hCO2 су затим скренути 50 пута (2 mm на 20 Hz, 2 s по презентацији) у насумичним временима помоћу пиезоелектричног погона током периода снимања од 20 минута. Користећи MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b), контролишите време скретања помоћу прилагођеног MATLAB кода. Користите TTL импулсе за синхронизацију догађаја са софтвером за аквизицију података.
За експерименте оптичког обележавања, оптички патч корд од 200 µм (Doric) повезан са ласером од 473 nm (Omicron) повезан је са оптичким влакном од 200 µм постављеним преко краниотомије. Непосредно пре овога, подесите снагу џампера на 20 mW. Користите манипулатор да спустите електроде до циљног места кроз краниотомију, која је напуњена стерилним физиолошким раствором. На почетку снимања, емитовано је десет импулса светлости од 473 nm (фреквенција 2 Hz, трајање импулса 10 ms). Фотосензитивне ћелије су дефинисане као ћелије које су показале шиљасти одговор у року од 10 ms светлости у 70% или више покушаја.