Получение и распределение питательных веществ взаимосвязаны с особенностями поиска пищи и жизненного цикла насекомых. Для компенсации дефицита определенных питательных веществ на разных стадиях жизни насекомые могут получать их путем дополнительного питания, например, питаясь выделениями позвоночных в процессе, известном как «лужицы». Комар Anopheles arabiani, по-видимому, недоедает и, следовательно, нуждается в питательных веществах как для метаболизма, так и для размножения. Целью данного исследования было оценить, улучшает ли перемешивание An. arabiensis коровьей мочой для получения питательных веществ характеристики жизненного цикла.
Убедитесь в безопасности. Комаров вида Arabiensis привлекал запах свежей, 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой коровьей мочи, а поведение самок, ищущих хозяина и питавшихся кровью (через 48 часов после приема крови), измеряли с помощью Y-образного ольфактометра, а беременных самок оценивали на предмет готовности к нересту. Затем с помощью комбинированного химического и электрофизиологического анализа идентифицировали биологически активные соединения в коровьей моче всех четырех возрастных групп. Синтетические смеси биологически активных соединений оценивали в Y-образных трубках и полевых испытаниях. Для исследования коровьей мочи и ее основного азотсодержащего соединения мочевины в качестве потенциальных дополнительных кормов для переносчиков малярии измеряли параметры питания и характеристики жизненного цикла. Оценивали долю самок комаров и количество поглощенной коровьей мочи и мочевины. После кормления оценивали выживаемость самок, их способность к полету на привязи и репродуктивную функцию.
Ищут кровь и пищу хозяина. В лабораторных и полевых исследованиях арабов привлекал естественный и искусственный запах свежей и выдержанной коровьей мочи. Беременные самки были безразличны к реакции на коровью мочу в местах нереста. Самки, ищущие хозяина и сосущие кровь, активно поглощают коровью мочу и мочевину и распределяют эти ресурсы в соответствии с жизненными компромиссами в зависимости от физиологического состояния для полета, выживания или размножения.
Приобретение и распространение коровьей мочи комарами Anopheles arabinis для улучшения характеристик жизненного цикла. Дополнительное кормление коровьей мочой напрямую влияет на переносчиков, увеличивая ежедневную выживаемость и плотность переносчиков, и косвенно, изменяя летную активность, поэтому его следует учитывать в будущих моделях.
Получение и распределение питательных веществ интегрирует особенности поиска пищи и жизненного цикла насекомых [1,2,3]. Насекомые способны выбирать и добывать пищу, а также компенсировать недостаток питательных веществ в зависимости от их доступности [1, 3]. Распределение питательных веществ зависит от жизненного цикла и может приводить к различным требованиям к качеству и количеству пищи на разных стадиях развития насекомых [1, 2]. Для компенсации дефицита определенных питательных веществ насекомые могут получать их путем дополнительного питания, например, на грязи, различных экскрементах и ​​выделениях позвоночных, а также на падали — процесс, известный как «лужи» [2]. Хотя в основном описаны различные виды бабочек и мотыльков, водоемы встречаются и у других отрядов насекомых, и привлечение к таким ресурсам и питание ими может оказывать существенное влияние на здоровье и другие особенности жизненного цикла [2, 4, 5, 6], 7]. Малярийный комар Anopheles gambiae sensu lato (sl) появляется на свет в виде «истощенной» взрослой особи. [8], поэтому полив может играть важную роль в характеристиках его жизненного цикла, но это поведение до сих пор игнорировалось. Использование перемешивания как средства увеличения потребления питательных веществ этим важным организмом заслуживает внимания, поскольку это может иметь важные эпидемиологические последствия.
Потребление азота взрослыми самками комаров рода Anopheles ограничено из-за низких запасов калорий, накопленных на стадии личинки, и неэффективного использования крови [9]. Самки Ann. gambiae sl обычно компенсируют это, дополнительно питаясь кровью [10, 11], тем самым подвергая больше людей риску заражения болезнью и повышая риск хищничества для самих комаров. В качестве альтернативы комары могут использовать дополнительное питание экскрементами позвоночных для получения азотистых соединений, которые улучшают адаптацию и маневренность полета, как это демонстрируют другие насекомые [2]. В этом отношении интересен сильный и отчетливый интерес одного из родственных видов в комплексе видов An. gambiae sl, Anopheles arabinis, к свежей и выдержанной коровьей моче [12, 13, 14]. Anopheles arabinis является оппортунистическим в своих предпочтениях в отношении хозяев и, как известно, ассоциируется с крупным рогатым скотом и питается им. Коровья моча является богатым ресурсом азотистых соединений, причем мочевина составляет 50-95% общего азота в свежей моче [15, 16]. По мере старения коровьей мочи микроорганизмы используют эти ресурсы для уменьшения сложности азотистых соединений в течение 24 часов [15]. При быстром увеличении аммиака, связанном со снижением органического азота, процветают алкалофильные микроорганизмы (многие из которых продуцируют соединения, токсичные для комаров) [15], которые могут быть особенно привлекательны для самок Ann. arabiensis, предпочитающих мочу, выдержанную 24 часа или менее [13, 14].
В этом исследовании изучалось поведение комаров An. arabiensis, питающихся кровью, и их хозяина. В течение первого цикла выработки гонадотропинов оценивалась способность An. arabiensis усваивать азотистые соединения, включая мочевину, путем смешивания мочи. Затем была проведена серия экспериментов для оценки того, как самки комаров распределяют этот потенциальный источник питательных веществ для повышения выживаемости, размножения и дальнейшего поиска пищи. Наконец, оценивался запах свежей и выдержанной коровьей мочи, чтобы определить, являются ли они надежными подсказками для хозяина и питающихся кровью комаров An. В поисках этого потенциального источника питательных веществ An. arabiensis обнаружил химические корреляции, лежащие в основе наблюдаемой дифференциальной привлекательности. Синтетические смеси запахов летучих органических соединений (ЛОС), идентифицированных в выдержанной в течение 24 часов моче, были дополнительно оценены в полевых условиях, расширяя результаты, полученные в лабораторных условиях, и демонстрируя влияние запаха бычьей мочи на различные физиологические состояния. Привлечение комаров. Полученные результаты подтверждают, что An. Arabiensis поглощает и распространяет азотистые соединения, содержащиеся в моче позвоночных, влияя на характеристики жизненного цикла. Эти результаты обсуждаются в контексте потенциальных эпидемиологических последствий и того, как их можно использовать для наблюдения и контроля за переносчиками заболеваний.
Комары Anopheles arabicans (штамм Dongola) содержались при температуре 25 ± 2 °C, относительной влажности 65 ± 5% и 12-часовом световом/темновом цикле. Личинки выращивались в пластиковых лотках (20 см × 18 см × 7 см), заполненных дистиллированной водой, и получали корм для рыб Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Германия). Куколки собирали в чашки объемом 30 мл (Nolato Hertila, Åstorp, Швеция), а затем переносили в клетки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science, Тайчжун, Тайвань) для вылупления взрослых особей. Взрослым особям предоставляли 10%-ный раствор сахарозы в неограниченном количестве до 4 дней после вылупления (dpe), после чего самкам, ищущим хозяина, предлагали пищу непосредственно перед экспериментом или морили голодом в течение ночи, давая им дистиллированную воду. Перед экспериментом, как описано ниже, самок, используемых для экспериментов в летательных аппаратах, морили голодом всего 4-6 часов, предоставляя им воду в неограниченном количестве. Для подготовки кровососущих комаров к последующим биоанализам, самкам в возрасте 4 дней после вылупления предоставляли дефибротированную овечью кровь (Håtunalab, Bro, SE) с помощью мембранной системы кормления (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Затем полностью истощенных самок переводили в отдельные клетки и предоставляли им корм непосредственно, как описано ниже, или 10% раствор сахарозы в неограниченном количестве в течение 3 дней до экспериментов, описанных ниже. Последние самки использовались для биоанализов в летательных аппаратах, были переведены в лабораторию, где им предоставляли дистиллированную воду в неограниченном количестве в течение 4-6 часов перед экспериментом.
Для количественной оценки потребления мочи и мочевины взрослыми самками An.Arab использовались эксперименты по кормлению. Самкам, ищущим хозяина и питающимся кровью, в течение 48 часов предоставляли рацион, содержащий 1% разбавленной свежей и выдержанной коровьей мочи, различные концентрации мочевины и два контрольных раствора (10% сахарозы и воды). Кроме того, в рацион добавляли пищевой краситель (1 мг/мл ксиленцианида FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стокгольм, Швеция), который поставляли в матрице 4 × 4 в микроцентрифужные пробирки объемом 250 мкл (Axygen Scientific, Юнион-Сити, Калифорния, США; рис. 1А). Заполняйте до краев (~300 мкл). Чтобы избежать конкуренции между комарами и потенциального воздействия красителя, поместите 10 комаров в большую чашку Петри (диаметром 12 см и высотой 6 см; Semadeni, Остермундиген, Швейцария; Рисунок 1А) в полной темноте при температуре 25 ± 2 см °C и относительной влажности 65 ± 5%. Эти эксперименты повторяли от 5 до 10 раз. После приема пищи комаров помещали при температуре -20 °C до дальнейшего анализа.
Ищите коровью мочу и мочевину, абсорбированные самками комаров Anopheles arabianus, как хозяев, так и кровососущих самок. В эксперименте по кормлению (A) самкам комаров давали рацион, состоящий из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). Самки, ищущие хозяина (B) и питающиеся кровью (C), абсорбировали больше сахарозы, чем при любом другом протестированном рационе. Обратите внимание, что самки, ищущие хозяина, абсорбировали 72-часовую коровью мочу меньше, чем 168-часовую коровью мочу (B). Среднее общее содержание азота (± стандартное отклонение) в моче представлено на врезке. Самки, ищущие хозяина (D, F) и кровососущие (E, G), поглощают мочевину в зависимости от дозы. Средние объемы вдыхаемого воздуха (D, E) с разными буквенными обозначениями значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Погрешности указаны на графике. Обозначения представляют собой стандартную ошибку среднего (BE). Прямая пунктирная линия представляет собой логарифмически-линейную линию регрессии (F, G).
Для высвобождения абсорбированной пищи комаров помещали по одному в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 230 мкл дистиллированной воды, после чего ткани измельчали ​​с помощью одноразового пестика и беспроводного мотора (VWR International, Лунд, Швеция), а затем центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (200 мкл) переносили в 96-луночный микропланшет (Sigma-Aldrich), и абсорбцию (λ620 нм) определяли с помощью спектрофотометра на основе микропланшетного ридера (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ортенберг, Германия). В качестве альтернативы комаров измельчали ​​в 1 мл дистиллированной воды, 900 мкл которой переносили в кювету для спектрофотометрического анализа (λ620 нм; UV 1800, Shimadzu, Киста, Швеция). Для количественного определения Для определения количества потребляемой пищи была построена стандартная кривая путем серийного разведения с концентрацией цианида ксилола от 0,2 мкл до 2,4 мкл (1 мг/мл). Затем оптическая плотность известных концентраций красителя использовалась для определения количества пищи, потребленной каждым комаром.
Данные об объеме анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным попарным сравнением по Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Линейный регрессионный анализ описывал зависимость потребления мочевины от концентрации и сравнивал реакции между комарами, ищущими хозяина, и кровососущими комарами (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Приблизительно 20 мкл образцов мочи от каждой возрастной группы связывали с Chromosorb® W/AW (10 мг 80/100 меш, Sigma Aldrich) и инкапсулировали в оловянные капсулы (8 мм × 5 мм). Капсулы помещали в камеру сгорания анализатора CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) для определения содержания азота в свежей и старой моче в соответствии с протоколом производителя. Общее содержание азота (г N л-1) определяли на основе известных концентраций мочевины, используемых в качестве стандарта.
Для оценки влияния диеты на выживаемость самок, ищущих хозяина и сосающих кровь, комаров помещали поодиночке в большие чашки Петри (диаметром 12 см и высотой 6 см; Semadeni) с отверстием в крышке, закрытым сеткой (диаметром 3 см), для вентиляции и снабжения пищей. Диета предоставлялась непосредственно после 4-го дня после вылупления и включала 1%-ный раствор свежей и выдержанной коровьей мочи, четыре концентрации мочевины и два контрольных раствора: 10% сахарозы и воду. Каждую диету пипеткой наносили на стоматологический тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), вставленный в 5-миллилитровый шприц (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), снимали поршень и помещали на чашку Петри (рисунок 1).1А). Меняйте диету каждый день. Поддерживайте порядок в лаборатории, как описано выше. Выживших комаров подсчитывали дважды в день, а мертвых комаров выбрасывали до Последний комар погиб (n = 40 на каждую группу). Выживаемость комаров, питавшихся различными диетами, была статистически проанализирована с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера и лог-ранговых тестов для сравнения распределения выживаемости между диетами (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Самодельная летающая мельница для комаров, созданная на основе работы Аттисано и др.[17], изготовлена ​​из прозрачных акриловых панелей толщиной 5 мм (10 см в ширину x 10 см в длину x 10 см в высоту) без передней и задней панелей (рис. 3: сверху). Поворотный механизм с вертикальной трубкой, изготовленной из колонки для газовой хроматографии (внутренний диаметр 0,25 мм; длина 7,5 см), концы которой приклеены к игле для насекомых, подвешенной между парой неодимовых магнитов на расстоянии 9 см друг от друга. Горизонтальная трубка из того же материала (длина 6,5 см) разделяла вертикальную трубку пополам, образуя прикрепленный рычаг и рычаг, несущий небольшой кусочек алюминиевой фольги в качестве сигнала, прерывающего свет.
Самкам, голодавшим в течение 24 часов, давали вышеуказанную диету в течение 30 минут перед фиксацией. Затем полностью накормленных самок комаров индивидуально анестезировали на льду в течение 2-3 минут и прикрепляли к булавкам для насекомых с помощью пчелиного воска (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а затем привязывали к плечам горизонтальных трубок. Летающая мельница. Количество оборотов за один полет регистрировали с помощью специально разработанного регистратора данных, затем сохраняли и отображали с помощью программного обеспечения PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Летающую мельницу помещали в помещение с регулируемым климатом (12 ч:12 ч, свет:темнота, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % относительной влажности).
Для визуализации характера летной активности рассчитывались общее пройденное расстояние (м) и общее количество последовательных полетов в час за 24-часовой период. Кроме того, средние расстояния, пройденные отдельными самками, сравнивались между группами и анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного анализа Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), где среднее расстояние рассматривалось как зависимая переменная, а группа — как независимый фактор. Дополнительно рассчитывалось среднее количество кругов с шагом в 10 минут.
Для оценки влияния диеты на репродуктивную функцию An. arabiensis, шесть самок (4 дня после вылупления) были переведены непосредственно в клетки Бугдорма (30 см × 30 см × 30 см) после взятия крови, а затем получали экспериментальную диету в течение 48 часов, как описано выше. Затем диету убрали, и на третий день на 48 часов установили чашки для нереста (30 мл; Nolato Hertila), наполненные 20 мл дистиллированной воды, меняя их каждые 24 часа. Каждый режим питания повторяли 20-50 раз. Подсчитывали и регистрировали количество икринок в каждой экспериментальной клетке. Субвыборки икринок использовали для оценки среднего размера и вариации длины отдельных икринок (n ≥ 200 на каждую диету) с помощью микроскопа Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE), оснащенного камерой Leica Camera (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Германия). Оставшиеся яйца содержались в помещении с контролируемым климатом в стандартных условиях выращивания в течение 24 часов, после чего была проведена оценка подвыборки недавно вылупившихся личинок 1-й стадии (n ≥ 200 на каждую диету), как описано выше. Количество яиц, а также размер яиц и личинок сравнивались между вариантами обработки с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного анализа Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Из образцов мочи зебу (породы Арси), собранных через 1 час после отбора проб, а также через 24, 72 и 168 часов после созревания, были отобраны летучие вещества из газовой фазы. Для удобства образцы мочи собирали рано утром, пока коровы еще находились в коровнике. Образцы мочи собирали у 10 особей, и 100-200 мл каждого образца переносили в отдельные полиамидные пакеты для запекания (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) в 3-литровые полиамидные емкости с крышками в винилхлоридные пластиковые бочки. Летучие вещества из газовой фазы каждого образца бычьей мочи собирали либо непосредственно (свежая моча), либо после созревания при комнатной температуре в течение 24, 72 и 168 часов, то есть каждый образец мочи был репрезентативным для каждой возрастной группы.
Для сбора летучих веществ из паровой фазы использовалась замкнутая система, в которой поток газа, отфильтрованного активированным углем (100 мл/мин), циркулировал через полиамидный мешок в адсорбционную колонку в течение 2,5 ч с помощью диафрагменного вакуумного насоса (KNF Neuberger, Фрайбург, Германия). В качестве контроля сбор из паровой фазы проводился из пустого полиамидного мешка. Адсорбционная колонка была изготовлена ​​из тефлоновой трубки (5,5 см x 3 мм внутреннего диаметра), содержащей 35 мг Porapak Q (50/80 меш; Waters Associates, Милфорд, Массачусетс, США) между пробками из стекловаты. Перед использованием колонку промывали 1 мл перегнанного н-гексана (Merck, Дармштадт, Германия) и 1 мл пентана (99,0% чистый растворитель, хроматографической чистоты, Sigma Aldrich). Адсорбированные летучие вещества элюировали 400 мкл пентана. Собранные образцы из паровой фазы объединяли и затем хранили при -20°C до использования для дальнейшего анализа.
Поведенческие реакции комаров-паразитов, ищущих хозяина и питающихся кровью. Летучие экстракты из газовой фазы, собранные из свежей мочи, мочи, собранной через 24, 72 и 168 часов, анализировались на наличие летучих экстрактов из комаров Arabidopsis с использованием ольфактометра с прямой стеклянной трубкой [18]. Эксперименты проводились в течение ZT 13-15, пикового периода активности комаров-паразитов в поисках дома. [19]. Стеклянный ольфактометр (80 см × 9,5 см внутреннего диаметра) освещался сверху красным светом интенсивностью 3 ± 1 лк. Поток воздуха, отфильтрованный активированным углем и увлажненный (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % относительной влажности), проходил через биоанализ со скоростью 30 см/с. Воздух проходил через ряд сеток из нержавеющей стали, создавая ламинарный поток и однородную структуру шлейфа. Диспенсер для зубных тампонов (4 см × Экстракт летучих веществ (1 см; L:D; DAB Dental AB) подвешивали на 5-сантиметровой катушке на наветренном конце ольфактометра, при этом стимулятор меняли каждые 5 минут. Для анализа в качестве стимулятора использовали 10 мкл каждого экстракта из паровой фазы, разбавленного в соотношении 1:10. В качестве контроля использовали равное количество пентана. Отдельных комаров, ищущих хозяина или сосающих кровь, помещали в индивидуальные клетки для выпуска за 2-3 часа до начала эксперимента. Клетку для выпуска размещали на наветренной стороне ольфактометра, комарам давали акклиматизироваться в течение 1 минуты, после чего открывали заслонку клетки для выпуска. Привлекательность к экспериментальной или контрольной группе анализировали как долю комаров, которые вступили в контакт с источником в течение 5 минут после выпуска. Каждый экстракт летучих веществ из паровой фазы и контрольный образец повторяли не менее 30 раз, и чтобы избежать влияния какого-либо одного дня, количество экспериментальных групп было одинаковым. Контрольные образцы тестировались каждый экспериментальный день. Ответы на вопросы о поиске у хозяина и животных, питавшихся кровью, анализировались с использованием арабского языка по сравнению с наборами данных о газовой фазе с помощью номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением коэффициентов шансов (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Реакция на нерест у Ан. Экстракты газовой фазы свежей и выдержанной коровьей мочи анализировались в клетках Бугдорма (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science). Пластиковые стаканчики (30 мл; Nolato Hertila), заполненные 20 мл дистиллированной воды, служили субстратом для нереста и размещались в противоположных углах клетки на расстоянии 24 см друг от друга. В экспериментальные стаканчики добавляли по 10 мкл каждого экстракта газовой фазы в разведении 1:10. Для добавления в контрольный стаканчик использовали равное количество пентана. Экспериментальные и контрольные стаканчики менялись местами между экспериментами для контроля влияния положения. Десять самок, накормленных кровью, были выпущены в экспериментальные клетки в ZT 9-11, и через 24 часа подсчитывали количество икры в стаканчиках. Формула для расчета индекса нереста: (количество икры, отложенной в экспериментальном стаканчике – количество икры, отложенной в контрольном стаканчике) / (общее количество икры) (приложили). Каждая обработка повторялась 8 раз.
Анализ самок An. arabiensis методом газовой хроматографии с детектированием электронно-антенного рисунка (ГХ-ЭАД) проводили, как описано ранее [20]. Вкратце, свежие летучие экстракты из паровой фазы разделяли с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 6890 (Санта-Клара, Калифорния, США), оснащенного колонкой HP-5 (30 м × 0,25 мм внутреннего диаметра, толщина пленки 0,25 мкм, Agilent Technologies). и стареющей мочи. В качестве подвижной фазы использовался водород со средней линейной скоростью потока 45 см·с⁻¹. Каждый образец (2 мкл) вводился в течение 30 секунд в бесщелевом режиме при температуре на входе 225 °C. Температура печи ГХ программировалась от 35 °C (выдержка 3 минуты) до 300 °C (выдержка 10 минут) со скоростью 10 °C/мин⁻¹. В разветвитель элюата ГХ добавляли 4 psi азота, который разделяли в соотношении 1:1 в низкообъемном перекрестном устройстве Gerstel 3D/2 (Gerstel, Мюльхайм, Германия) между пламенно-ионизационным детектором и детектором электроаналитического рассеяния (ЭАД). Элюат из капилляра ГХ для ЭАД пропускали через линию переноса Gerstel ODP-2, которая отслеживает температуру печи ГХ плюс 5 °C, в стеклянную трубку (10 см × 8 мм), где он смешивался с увлажненным воздухом, отфильтрованным через угольный фильтр (1,5 л). мин−1). Антенна располагалась на расстоянии 0,5 см от выходного отверстия трубки. Каждая отдельная особь комара учитывалась в одной повторной выборке, а для комаров, ищущих хозяина, проводилось не менее трех повторных измерений на образцах мочи каждого возраста.
Идентификация биоактивных соединений в образцах газовой фазы свежей и выдержанной бычьей мочи с использованием комбинированного газового хроматографа и масс-спектрометра (ГХ-МС; 6890 ГХ и 5975 МС; Agilent Technologies) для регистрации реакции антенн в ГХ-ЭД анализе, работающем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. ГХ был оснащен капиллярной колонкой из плавленого кварца HP-5MS UI с покрытием (60 м × 0,25 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0,25 мкм) с использованием гелия в качестве подвижной фазы со средней линейной скоростью потока 35 см·с⁻¹. Вводили 2 мкл образца с использованием тех же настроек инжектора и температуры печи, что и для ГХ-ЭД анализа. Соединения идентифицировали на основе времени удерживания (индекс Ковача) и масс-спектров, сравнивая их с пользовательской библиотекой и библиотекой NIST14 (Agilent). Идентифицированные соединения подтверждали путем введения аутентичных стандартов (дополнительный файл). 1: Таблица S2). Для количественного определения в качестве внешнего стандарта вводили гептилацетат (10 нг, химическая чистота 99,8%, Aldrich).
Оценка эффективности синтетической смеси запахов, состоящей из биоактивных соединений, идентифицированных в свежей и выдержанной моче, для привлечения ищущих хозяина и кровососущих комаров Ans. arabiensis, с использованием того же ольфактометра и протокола, что и выше. Синтетические смеси имитировали состав и пропорции соединений в смешанных летучих экстрактах из свежей, 24-часовой, 48-часовой, 72-часовой и 168-часовой выдержанной мочи (Рисунок 5D-G; Дополнительный файл 1: Таблица S2). Для анализа использовали 10 мкл разведения полностью синтетической смеси в соотношении 1:100, с общей скоростью высвобождения в диапазоне приблизительно 140-2400 нг ч⁻¹, для оценки привлекательности для хозяина и кровососущих комаров. После этого тест проводили на полных смесях, из которых удаляли субтрактивные смеси отдельных соединений полной смеси. Реакции поиска у хозяина и кровососущих комаров Ans. arabiensis по сравнению с синтетической смесью и Анализ смесей, полученных методом вычитания, проводился с использованием номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением коэффициентов шансов (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Чтобы оценить, может ли коровья моча служить сигналом среды обитания для малярийных комаров, свежую и выдержанную коровью мочу, собранную описанным выше способом, и воду помещали в сетчатые ведра объемом 3 л (100 мл) и устанавливали в ловушки с приманкой для комаров. (Версия BG-HDT; BioGents, Регенсбург, Германия). Десять ловушек были размещены на расстоянии 50 м друг от друга на пастбище, в 400 м от деревни (Силай, Эфиопия, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E), где не было скота, на постоянных местах размножения комаров и в деревнях. Пять ловушек были нагреты для имитации присутствия хозяина, а пять ловушек остались без нагрева. Каждое место обработки менялось каждую ночь в течение пяти ночей. Количество комаров, пойманных в ловушки с приманкой из мочи разного возраста, сравнивалось с использованием логистической регрессии с бета-биномиальным распределением (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Исследование проводилось в эндемичной по малярии деревне недалеко от города Маки, регион Оромия, Эфиопия (8° 11′ 08″ с.ш., 38° 81′ 70″ в.д.; рис. 6А). Исследование проводилось с середины августа до середины сентября, перед ежегодной обработкой помещений инсектицидами длительного действия, а также в течение длительного сезона дождей. Для исследования были выбраны пять пар домов (на расстоянии 20–50 м друг от друга), расположенных на окраине деревни (рис. 6А). Критерии отбора домов были следующими: в доме не разрешалось содержать животных, не разрешалось готовить пищу в помещении (заготовка дров или древесного угля) (по крайней мере, в течение периода исследования), и в домах проживало не более двух человек, спящих без инсектицидов. под обработанной москитной сеткой. Этическое одобрение было получено от Институционального совета по этике исследований (IRB/022/2016) факультета естественных наук (CNS-IRB) Аддис-Абебского университета в соответствии с руководящими принципами, установленными Декларацией Всемирной медицинской ассоциации по этике медицинских исследований с участием человека (Хельсинкская декларация). Согласие от каждого главы домохозяйства было получено при содействии сотрудников службы здравоохранения. Весь процесс одобрен местными администрациями на уровне района и квартала («кебеле»). Экспериментальная схема представляла собой латинский квадрат 2 × 2, в котором синтетические смеси и контрольные образцы были размещены в парных домах в первую ночь и поменяны местами между домами в следующую экспериментальную ночь. Этот процесс был повторен десять раз. Кроме того, для оценки активности комаров в выбранных домах ловушки CDC были настроены на работу в течение пяти последовательных ночей в начале, середине и конце полевого испытания в одно и то же время суток.
Синтетическая смесь, содержащая шесть биоактивных соединений, была растворена в гептане (97,0% растворителя, хроматографической чистоты, Sigma Aldrich) и высвобождалась со скоростью 140 нг ч⁻¹ с помощью хлопкового фитильного дозатора [20]. Фитильный дозатор позволял высвобождать все соединения в постоянных пропорциях на протяжении всего 12-часового эксперимента. Гептан использовался в качестве контроля. Флакон был подвешен рядом с точкой входа световой ловушки Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (John W. Hock Company, Гейнсвилл, Флорида, США; Рисунок 6А). Ловушки были подвешены на высоте 0,8–1 м над землей, у изножья кровати, а доброволец спал под необработанной москитной сеткой и работал с 18:00 до 06:30. Комары, пойманные по полу и физиологическому состоянию (непитавшиеся, накормленные, полубеременные и беременные [21]), впоследствии были проверены с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации вида, морфологически идентифицированного как A. gambiae sl. Члены комплекса [23]. В полевом исследовании отлов парных домов анализировался с использованием номинальной логистической модели, где привлекательность была зависимой переменной, а обработка (синтетическая смесь против контроля) — фиксированным эффектом (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Здесь мы приводим значения χ² и p-значения из теста отношения правдоподобия.
Оцените безопасность. arabiensis смогла получить мочу, свой основной источник азота, мочевину, путем прямого кормления в течение 48 часов после введения в течение 4 дней после (dpe) экспериментов по кормлению самок, ищущих хозяина и питающихся кровью (рис. 1A). Как самки, ищущие хозяина, так и самки, питающиеся кровью, усваивали значительно больше сахарозы, чем любой другой диеты или воды (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 и F(5,299) = 56,00, p < 0,0001 соответственно; рис. 1B,C). Кроме того, самки, ищущие хозяина, потребляли меньше мочи через 72 часа по сравнению с мочой через 168 часов (рис. 1B). При предложении диеты, содержащей мочевину, самки, ищущие хозяина, усваивали значительно большее количество мочевины при концентрации 2,69 мМ по сравнению со всеми другими концентрациями и водой, в то время как их показатели были неотличимы от 10% сахарозы (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Рисунок 1D). Это контрастировало с реакцией самок, питавшихся кровью, которые обычно усваивали значительно больше диет, содержащих мочевину, чем воды, хотя и значительно меньше, чем 10% сахарозы (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Рисунок 1).1E). Кроме того, при сравнении двух физиологических состояний, самки, которым была сделана флеботомия, усваивали больше мочевины, чем самки, ищущие хозяина, при самых низких концентрациях, а эти самки усваивали аналогичное количество мочевины при более высоких концентрациях (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Рис. 1F, G). Хотя потребление из диеты, содержащей мочевину, по-видимому, имело оптимальные значения (Рис. 1D, E), самки в Оба физиологических состояния способны модулировать количество абсорбированной мочевины во всем диапазоне ее концентраций логарифмически-линейным образом (рис. 1F,G). Аналогично, комары, по-видимому, контролируют поглощение азота, регулируя количество абсорбированной мочи, поскольку количество азота в моче отражается в количестве абсорбированного азота (рис. 1B, вставки C и B).
Для оценки влияния мочи и мочевины на выживаемость комаров, ищущих хозяина и сосающих кровь, самок кормили мочой всех четырех возрастов (свежей, через 24 ч, 72 ч и 168 ч после отложения) и различными концентрациями мочевины, а также дистиллированной водой и 10% раствором сахарозы в качестве контроля (Рисунок 2А). Этот анализ выживаемости показал, что диета оказывала значительное влияние на общую выживаемость самок, ищущих хозяина (моча: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Рис. 2B, C) и самок, питавшихся кровью (моча: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Рисунок 2D,E). Во всех экспериментах у самок, получавших диету из мочи, мочевины и воды, наблюдалась значительно более низкая выживаемость по сравнению с самками, получавшими диету из сахарозы (Рисунок 2B-E). Самки, ищущие хозяина и получавшие свежую и несвежую мочу, демонстрировали разные показатели выживаемости, при этом у тех, кто получал несвежую мочу в течение 72 часов (p = 0,016), вероятность выживания была самой низкой (Рис. 2B). Кроме того, самки, ищущие хозяина и получавшие 135 мМ мочевины, выживали дольше, чем контрольные самки, получавшие воду (p < 0,04) (Рис. 2C). По сравнению с водой, самки, получавшие свежую мочу и суточную мочу, выживали дольше (p = 0,001 и p = 0,012 соответственно; Рисунок 2D), в то время как самки, получавшие суточную мочу, выживали дольше, чем те, кто получал короткую свежую мочу и суточную мочу (p < 0,0 ...). = 0,013 соответственно; Рисунок 2D). При кормлении 135 мМ мочевиной самки, питавшиеся кровью, выживали дольше, чем при всех других концентрациях мочевины и воды (p < 0,013; Рисунок 2E).
Выживаемость самок комаров Anopheles arabini, питающихся коровьей мочой и мочевиной, как в качестве хозяина, так и в качестве кровососущих. В биотесте (А) самкам комаров предоставляли рацион, состоящий из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). Выживаемость комаров, ищущих хозяина (B, C) и кровососущих комаров (D, E), регистрировали каждые 12 часов до тех пор, пока не погибли все самки, питавшиеся мочой (B, D) и мочевиной (C, E), а также контрольными образцами (сахароза и вода).
Общее расстояние и количество оборотов, определенные в ходе теста на летную активность в течение 24 часов, различались между комарами, ищущими хозяина, и кровососущими комарами, которые в целом демонстрировали меньшую летную активность (рис. 3). Комары, ищущие хозяина и предоставлявшие свежую и выдержанную мочу или сахарозу и воду, демонстрировали различные модели полета (рис. 3): самки, питавшиеся свежей мочой, были более активны на рассвете, в то время как те, кто питался мочой 24- и 168-часовой выдержки, демонстрировали разные модели полета и были преимущественно дневными. Самки комаров, предоставлявшие сахарозу или 72-часовую мочу, проявляли активность на протяжении всего 24-часового периода, в то время как самки, предоставлявшие воду, были более активны в середине периода. Комары, питавшиеся сахарозой, демонстрировали самый высокий уровень активности поздно ночью и рано утром, в то время как те, кто употреблял мочу 72-часовой выдержки, испытывали устойчивое снижение активности в течение 24 часов (рис. 3).
Летные характеристики самок комаров Anopheles arabini, питающихся коровьей мочой и мочевиной и ищущих жертву. В ходе теста на летную площадку самки комаров, питавшиеся свежей и выдержанной коровьей мочой, различными концентрациями мочевины, сахарозой (10%) и дистиллированной водой (H2O), были прикреплены к горизонтальным, свободно вращающимся рычагам (вверху). Для самок, ищущих жертву (слева) и питающихся кровью (справа), регистрировались общее расстояние и количество полетов в час для каждого рациона в течение 24 часов (темный: серый; светлый: белый). Среднее расстояние и среднее количество полетов показаны справа от графика циркадной активности. Погрешности обозначены стандартной ошибкой среднего значения. Статистический анализ см. в тексте.
В целом, общая летная активность самок, ищущих хозяина, следовала закономерности, аналогичной закономерности изменения дальности полета за 24 часа. Средняя дальность полета значительно зависела от потребляемой пищи (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), а самки, ищущие хозяина и употреблявшие мочу в течение 72 часов, пролетали значительно большие расстояния по сравнению со всеми другими рационами (p < 0,0001), и комары, питавшиеся сахарозой, летали дальше, чем комары, питавшиеся свежей (p = 0,022) и 24-часовой мочой (p = 0,022). В отличие от закономерности летной активности, описываемой рационом на основе мочи, самки, ищущие хозяина и питавшиеся мочевиной, демонстрировали устойчивую летную активность в течение 24 часов, достигая пика во второй половине темной фазы (рис. 3). Хотя закономерности активности были схожими, самки, ищущие хозяина и питавшиеся мочевиной, значительно увеличивали среднюю дальность полета в зависимости от поглощенной концентрации. (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Самки, ищущие хозяина и получавшие мочевину любой концентрации, летали дольше, чем самки, получавшие воду или сахарозу (p < 0,03).
Общая летная активность кровососущих комаров оставалась стабильной и сохранялась в течение 24 часов при всех диетах, при этом наблюдалось увеличение активности мочеиспускания во второй половине темного периода у самок, питавшихся водой, а также у самок, питавшихся свежей и 24-часовой пищей (изображение 3). В то время как диета с мочой значительно влияла на среднюю дальность полета у самок, питавшихся кровью (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), диета с мочевиной не оказывала такого влияния (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) при сравнении с другими диетами с мочой и контрольной диетой (свежая, p = 0,0091; 72 часа, p = 0,0022; 168 часов, p = 0,001; сахароза, p = 0,0017; дистиллированная вода, p = 0,036).
Влияние кормления мочой и мочевиной на репродуктивные параметры оценивали в биотестах на откладку яиц (рис. 4А) и исследовали по количеству отложенных яиц каждой самкой, размеру яиц и количеству только что вылупившихся личинок первой стадии. Количество отложенных яиц. У самок арабских мух, получавших мочу, варьировалось в зависимости от диеты (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; рис. 4B). Самки, получавшие суточную мочу и кровь, откладывали значительно больше яиц, чем самки, получавшие другие виды мочи, и были аналогичны самкам, получавшим сахарозу (рис. 4B). Аналогично, размер яиц, отложенных самками, получавшими мочу, варьировал в зависимости от диеты (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), при этом самки, получавшие суточную мочу и сахарозу, откладывали значительно более крупные яйца, чем самки, получавшие воду, тогда как яйца самок, получавших 168-часовую мочу, были значительно меньше. (Рис. 4С). Кроме того, диета с мочой значительно повлияла на размер личинок (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), при этом из яиц, отложенных самками, питавшимися мочой в возрасте 24 и 72 часов, вылуплялись значительно более крупные личинки, чем из яиц, отложенных самками, питавшимися водой, и самками, питавшимися мочой в течение 168 часов (Рис. 4D).
Репродуктивная активность самок Anopheles arabinis, питающихся коровьей мочой и мочевиной. Самки комаров, питавшиеся кровью, получали рацион, состоящий из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O) в течение 48 часов, после чего их помещали в биотесты и получали субстраты для откладки яиц (A). Количество яиц (B, E), размер яиц (C, F) и размер личинок (D, G) значительно зависели от предоставленного рациона (коровья моча: BD; мочевина: EG). Средние значения для каждого параметра, измеренного с использованием разных буквенных обозначений, значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Погрешности представлены стандартной ошибкой среднего значения.
Мочевина, являющаяся основным азотистым компонентом мочи, при добавлении в рацион самок, питающихся кровью, значительно влияла на репродуктивные параметры во всех исследованиях. Количество яиц, отложенных самками, получавшими мочевину после приема крови, зависело от концентрации мочевины (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001); самки, получавшие мочевину в концентрациях от 134 мкМ до 1,34 мМ, откладывали больше яиц (рис. 4E). Самки, получавшие мочевину в концентрациях 134 мкМ и выше, откладывали более крупные яйца, чем самки, питавшиеся водой (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; рис. 4F), а размер личинок, хотя и зависел от аналогичных концентраций мочевины у матерей (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), был более изменчивым (рис. 4G).
Общая привлекательность летучих экстрактов из газовой фазы бычьей мочи для поиска хозяина. Оценка привлекательности Arabiensis в стеклянном ольфактометре (рис. 5А) показала значительное влияние возраста мочи (χ² = 15,9, df = 4, p = 0,0032; рис. 5B). Постхоковый анализ показал, что запах застоявшейся мочи через 24 часа вызывал значительно более высокий уровень привлекательности по сравнению со всеми другими вариантами обработки (72 часа: p = 0,0060, 168 часов: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), за исключением запаха свежей мочи (p = 0,13; рис. 5B). Хотя общая привлекательность кровососущих комаров к запаху мочи существенно не различалась (χ² = 8,78, df = 4, p = 0,067; рис. 5C), было обнаружено, что эти самки значительно более привлекательны для запаха газовой фазы. летучих экстрактов по сравнению с мочой, выдержанной в течение 72 часов, по сравнению с контрольной группой (p = 0,0066; рисунок 5C).
Поведенческие реакции на запахи натуральной и синтетической коровьей мочи при поиске хозяина и кровососущих комаров Anopheles arabianus. Схема стеклянного трубчатого ольфактометра (A). Привлечение летучих экстрактов из свежей и выдержанной коровьей мочи к комарам-хозяевам (B) и кровососущим комарам (C). Найдите реакцию щупалец комара Anopheles arabianus. Показаны экстракты из свежей (D), 24-часовой (E), 72-часовой (F) и 168-часовой (G) выдержанной коровьей мочи. Траектории электронного антенного детектирования (EAD) показывают изменения напряжения в ответ на биоактивные соединения в газовой фазе, элюированные из газового хроматографа и детектированные пламенно-ионизационным детектором (FID). Шкала представляет амплитуду ответа (мВ) в зависимости от времени удерживания (с). Показаны свойства и скорости высвобождения (мкг·ч⁻¹) биологически активных соединений. Одна звездочка (*) указывает на устойчивую низкую амплитуду. Ответ. Двойные звездочки (**) указывают на невоспроизводимые ответы. Найдите хозяина (H) и кровососущего насекомого (I). An. arabiensis по-разному реагирует на синтетические смеси запахов свежей и выдержанной коровьей мочи. Средние доли комаров, привлеченных к разным буквенным названиям, значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Погрешности на графике представляют собой стандартную ошибку шкалы.
У самок Ann. arabiensis через 72 и 120 часов после приема крови во время нереста не было выявлено предпочтения летучим экстрактам из свежей и выдержанной коровьей мочи по сравнению с контрольными образцами, содержащими пентан (χ2 = 3,07, p > 0,05; Дополнительный файл 1: Рис. S1).
Для самок Ann. arabiensis анализы GC-EAD и GC-MS выявили восемь, шесть, три и три биологически активных соединения (рисунок 5D-G). Хотя наблюдались различия в количестве соединений, вызывающих электрофизиологические реакции, большинство из этих соединений присутствовало в каждом летучем экстракте из газовой фазы, собранном из свежей и старой мочи. Поэтому для каждого экстракта в дальнейший анализ были включены только те соединения, которые вызывали физиологическую реакцию антенн самок выше порогового значения.
Общая скорость высвобождения летучих биоактивных соединений в газовой фазе увеличилась с 29 мкг·ч⁻¹ в свежей моче до 242 мкг·ч⁻¹ в моче, выдержанной в течение 168 часов, главным образом за счет п-крезола и м-формальдегида, а также фенола. В отличие от этого, скорость высвобождения других соединений, таких как 2-циклогексен-1-он и деканаль, снижалась с увеличением возраста мочи, что коррелировало с наблюдаемым снижением интенсивности сигнала (количества) на хроматограмме (рис. 5D-G, левая панель) и физиологическими реакциями на эти соединения (рис. 5D-G, правая панель).
В целом, синтетическая смесь имела аналогичное естественное соотношение биоактивных соединений, идентифицированных в летучих экстрактах газовой фазы свежей и выдержанной мочи (рис. 5D–G), и, по-видимому, не вызывала значительного интереса у комаров, ищущих хозяина (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; рис. 5H) или кровососущих комаров (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; рис. 5I). Однако апостериорные попарные сравнения между вариантами обработки показали, что комары, ищущие хозяина, были значительно более привлекательны для синтетической смеси 24-часовой выдержанной мочи по сравнению с контрольными образцами пентана (p = 0,0086; рис. 5H).
Для оценки роли отдельных компонентов в синтетических смесях мочи, выдержанной в течение 24 часов, шесть субтрактивных смесей были оценены по сравнению с полными смесями в Y-образном тесте, в котором были удалены отдельные соединения. Для комаров, ищущих хозяина, вычитание отдельных соединений из полной смеси оказало значительное влияние на поведенческие реакции (χ² = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Дополнительный файл 1: Рисунок S2A), все субтрактивные смеси были более привлекательными, чем полностью смешанные. В отличие от этого, удаление отдельных соединений из полностью синтетической смеси не повлияло на поведенческие реакции кровососущих комаров (χ² = 11,38, df = 6, p = 0,077), за исключением деканаля, который привел к более низким уровням привлекательности по сравнению с полной смесью (p = 0,022; Дополнительный файл 1: Рисунок S2B).
В эндемичной по малярии деревне в Эфиопии в течение десяти ночей оценивалась эффективность синтетической смеси 24-часовой коровьей мочи для привлечения комаров в полевых условиях (рис. 6А). Всего было поймано и идентифицировано 4861 комар, из которых 45,7% составляли Anthropus gambiae sl, 18,9% — Anopheles pharoensis и 35,4% — Culex spp. (Дополнительный файл 1: Таблица S1). Anopheles arabinis — единственный представитель комплекса видов An. gambiae, идентифицированный с помощью ПЦР-анализа. В среднем за ночь было поймано 320 комаров, при этом ловушки с синтетической смесью приманок ловили больше комаров, чем парные ловушки без смеси (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). На каждой из Пять контрольных ночей в начале, середине и конце эксперимента. В каждой паре ловушек было поймано примерно одинаковое количество комаров, что указывает на отсутствие различий между домами (χ2(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³, ​​p > 0,05) и отсутствие снижения численности популяции в течение периода исследования. По сравнению с контрольными ловушками, количество комаров, пойманных в ловушки, содержащие синтетическую смесь, значительно увеличилось: поиск хозяина (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), недавнее кровососание (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) и беременность (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Дополнительный файл 1: Таблица S1). Это также отражается в общем количестве пойманных комаров: поиск хозяина > кровососание > беременность > полубеременный > мужчина.
Полевая оценка эффективности 24-часовой смеси синтетического запаха коровьей мочи. Полевые испытания проводились в южно-центральной Эфиопии (карта), недалеко от города Маки (вставка), с использованием световой ловушки Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (справа) в парных домах, с использованием латинского квадрата (аэрофотоснимок) (A). Фотоловушки CDC с синтетической приманкой привлекают и захватывают самок Anopheles arabesques (B), но не Anopheles farroes (C), по-разному, что является эффектом, зависящим от физиологического состояния. Кроме того, эти ловушки захватили значительно большее количество комаров-хозяев Culex. (D) По сравнению с контролем. Столбики слева представляют средний индекс отбора комаров, пойманных в парах ловушек с приманкой (зеленый) и контрольных (открытых) ловушек (N = 10), а столбики справа представляют средний индекс отбора в парах контрольных ловушек (открытые; N = 5). Звездочками отмечены уровни статистической значимости (*p = 0,01 и ***p < 0,0001).
Три вида были по-разному отловлены в ловушках, содержащих синтетические смеси. При поиске хозяина (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), питании кровью (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) и беременности (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) в ловушку, выпускающую синтетическую смесь, был пойман комар вида Arabiensis (рис. 6B), в то время как количество An не отличалось. Были обнаружены комары вида Arabiensis в разных физиологических состояниях (рис. 6C). Для комаров рода Culex было обнаружено только значительное увеличение числа комаров, ищущих хозяев, в ловушках, приманенных синтетической смесью (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; рис. 6D), по сравнению с контрольными ловушками.
Для оценки того, используют ли малярийные комары запах коровьей мочи в качестве сигнала о среде обитания хозяина, использовались ловушки с приманкой, расположенные вне потенциальных мест обитания хозяев между местами размножения и сельскими общинами в Эфиопии. В отсутствие сигналов о хозяине, тепла, а также при наличии или отсутствии запаха коровьей мочи, комары не были пойманы (Дополнительный файл 1: Рисунок S3). Однако при высокой температуре и запахе коровьей мочи самки малярийных комаров привлекались и отлавливались, хотя и в небольшом количестве, независимо от возраста мочи (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Дополнительный файл 1: Рисунок S3). В отличие от этого, контрольные образцы с водой не отлавливали малярийных комаров при высоких температурах (Дополнительный файл 1: Рисунок S3).
Малярийные комары получают и распределяют азотсодержащие соединения посредством компенсаторного питания коровьей мочой (т.е. лужами) для улучшения жизненных характеристик, подобно другим насекомым [2, 4, 24, 25, 26]. Коровья моча — это легкодоступный возобновляемый ресурс, тесно связанный с местами отдыха переносчиков малярии, такими как коровники и высокая растительность рядом с сельскими домами и местами нереста. Самки комаров находят этот ресурс по запаху и способны регулировать поглощение азотистых соединений в моче, включая мочевину, основной азотистый компонент мочи [15, 16]. В зависимости от физиологического состояния самки комара, питательные вещества в моче распределяются для повышения летной активности и выживаемости самок, ищущих хозяина, а также для выживаемости и репродуктивных характеристик особей, питавшихся кровью, в течение первого гонадотропного цикла. Поэтому смешивание мочи играет важную питательную роль для переносчиков малярии, которые находятся в замкнутом состоянии, подобно истощенным взрослым [8], поскольку оно обеспечивает самок Комары, способные получать важные азотистые соединения, питаясь с низким риском. Это открытие имеет значительные эпидемиологические последствия, поскольку самки увеличивают продолжительность жизни, активность и репродуктивную способность, что влияет на их способность переносить болезни. Кроме того, такое поведение может стать объектом будущих программ борьбы с переносчиками болезней.