Получение и распределение питательных веществ объединяет особенности добычи пищи насекомыми и жизненного цикла. Чтобы компенсировать дефицит определенных питательных веществ на разных этапах жизни, насекомые могут получать эти питательные вещества с помощью дополнительного питания, например, питаясь выделениями позвоночных в процессе, известном как «лужицы». Комар Anopheles arabiani, по-видимому, недоедает и, следовательно, нуждается в питательных веществах как для метаболизма, так и для размножения. Целью данного исследования было оценить, улучшает ли перемешивание An. arabiensis с коровьей мочой для получения питательных веществ характеристики жизненного цикла.
Убедитесь, что это безопасно. arabiensis привлекал запах свежей, 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой коровьей мочи, а ищущих хозяина и накормленных кровью (через 48 часов после приема крови) самок измеряли в Y-образном ольфактометре, а беременных самок оценивали для теста на нерест. Затем использовался комбинированный химический и электрофизиологический анализ для идентификации биологически активных соединений в коровьей моче во всех четырех возрастных группах. Синтетические смеси биологически активных соединений оценивали в Y-образных и полевых испытаниях. Для исследования коровьей мочи и ее основного азотсодержащего соединения мочевины в качестве потенциальной дополнительной диеты для переносчиков малярии измеряли параметры питания и характеристики жизненного цикла. Оценивали долю самок комаров и количество поглощенной коровьей мочи и мочевины. После кормления самок оценивали на выживаемость, привязанный полет и воспроизводство.
Ищут кровь и пищу хозяина. В лабораторных и полевых исследованиях арабов привлекал натуральный и синтетический запах свежей и выдержанной коровьей мочи. Беременные самки были безразличны к реакции на коровью мочу в местах нереста. Ищущие хозяина и сосущие кровь самки активно поглощают коровью мочу и мочевину и распределяют эти ресурсы в соответствии с жизненными циклами в зависимости от физиологического состояния для полета, выживания или размножения.
Получение и распределение коровьей мочи Anopheles arabinis для улучшения характеристик жизненного цикла. Дополнительное кормление коровьей мочой влияет на переносимость напрямую, увеличивая суточную выживаемость и плотность переносчиков, и косвенно, изменяя активность полета, и поэтому должно учитываться в будущих моделях.
Получение и распределение питательных веществ объединяет характеристики добычи пищи насекомыми и жизненного цикла [1,2,3]. Насекомые способны выбирать и получать пищу и осуществлять компенсаторное питание на основе доступности пищи и потребностей в питательных веществах [1, 3]. Распределение питательных веществ зависит от процесса жизненного цикла и может привести к различным требованиям к качеству и количеству рациона на разных этапах жизни насекомых [1, 2]. Чтобы компенсировать дефицит определенных питательных веществ, насекомые могут получать эти питательные вещества посредством дополнительного питания, например, грязью, различными экскрементами и выделениями позвоночных и падалью, процесс, известный как лужи [2]. Хотя в первую очередь описывается множество видов бабочек и моли, водопои встречаются и у других отрядов насекомых, а привлечение к этим типам ресурсов и питание ими может оказывать существенное влияние на здоровье и другие черты жизненного цикла [2, 4, 5, 6], 7]. Малярийный комар Anopheles gambiae sensu lato (sl) проявляется как «истощенный» взрослая особь [8], поэтому полив может играть важную роль в характеристиках ее жизненного цикла, но это поведение до сих пор игнорировалось. Использование перемешивания как средства увеличения потребления питательных веществ в этом важном транспортном средстве заслуживает внимания, поскольку это может иметь важные эпидемиологические последствия.
Потребление азота у взрослых самок комаров Anopheles ограничено из-за низких запасов калорий, полученных с личиночной стадии, и неэффективного использования кровяной пищи [9]. Самки Ann.gambiae sl обычно компенсируют это, дополняя себя дополнительным питанием кровью [10, 11], тем самым подвергая больше людей риску заражения болезнью, а комаров — большему риску нападения хищников. С другой стороны, комары могут использовать дополнительное питание экскрементами позвоночных для получения азотистых соединений, которые улучшают адаптацию и маневренность полета, как это продемонстрировали другие насекомые [2]. В этой связи интересна сильная и отчетливая привлекательность одного из видов-близнецов в пределах An. Гамбийский комплекс видов sl, Anopheles arabinis, свежая и выдержанная коровья моча [12,13,14]. Anopheles arabinis является оппортунистическим в своих предпочтениях в отношении хозяев и, как известно, ассоциируется с крупным рогатым скотом и питается им. Коровья моча является ресурсом, богатым азотистыми соединениями, с мочевина составляет 50-95% от общего содержания азота в свежей моче [15, 16]. По мере старения коровьей мочи микроорганизмы используют эти ресурсы для снижения сложности азотистых соединений в течение 24 часов [15]. При быстром увеличении содержания аммиака, связанном с уменьшением содержания органического азота, алкалофильные микроорганизмы (многие из которых производят токсичные для комаров соединения) процветают [15], что может быть связано с тем, что самок Ann.arabiensis преимущественно привлекает моча, возраст которой составляет 24 часа или меньше [13, 14].
В этом исследовании искали Ans хозяина и питающихся кровью. Во время своего первого цикла гонадотропинов arabiensis оценивали на предмет получения азотистых соединений, включая мочевину, путем смешивания мочи. Затем была проведена серия экспериментов, чтобы оценить, как самки комаров распределяют этот потенциальный питательный ресурс для улучшения выживания, воспроизводства и дальнейшего поиска пищи. Наконец, был оценен запах свежей и выдержанной коровьей мочи, чтобы определить, дают ли они надежные подсказки для An хозяина и питающихся кровью. В своем поиске этого потенциального пищевого ресурса arabiensis обнаружили химические корреляции, лежащие в основе наблюдаемой дифференциальной привлекательности. Синтетические смеси запахов летучих органических соединений (ЛОС), идентифицированные в моче, выдержанной в течение 24 часов, были дополнительно оценены в полевых условиях, что расширило результаты, полученные в лабораторных условиях, и продемонстрировало влияние запаха бычьей мочи на различные физиологические состояния. Привлекательность комаров. Полученные результаты подтверждают, что An. arabiensis приобретает и распределяет азотистые соединения, обнаруженные в моче позвоночных, влияя на характеристики жизненного цикла. Эти результаты обсуждаются в контексте потенциальных эпидемиологических последствий и того, как их можно использовать для надзора за переносчиками и борьбы с ними.
Anopheles arabicans (штамм Dongola) содержались при температуре 25 ± 2 °C, относительной влажности 65 ± 5% и цикле свет:темнота 12:12 ч. Личинки выращивались в пластиковых лотках (20 см × 18 см × 7 см), заполненных дистиллированной водой, и кормились рыбьим кормом Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Куколок собирали в чашки объемом 30 мл (Nolato Hertila, Åstorp, SE), а затем переносили в клетки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science, Taichung, Taiwan), чтобы дать возможность взрослым особям появиться. Взрослым особям давали 10% раствор сахарозы вволю в течение 4 дней после появления на свет (dpe), после чего самкам, ищущим хозяина, предлагали пищу непосредственно перед экспериментом или морили голодом в течение ночи с дистиллированной воды перед экспериментом, как описано ниже. Самки, используемые для экспериментов в полетной трубе, голодали всего 4-6 часов с водой ad libitum. Чтобы подготовить кровососущих комаров для последующих биопроб, 4 самкам dpe была предоставлена ​​дефибротическая овечья кровь (Håtunalab, Bro, SE) с использованием мембранной системы кормления (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Полностью перегруженных самок затем переводили в отдельные клетки и обеспечивали диетой напрямую, как описано ниже, или 10% сахарозой ad libitum в течение 3 дней до экспериментов, описанных ниже. Последние самки использовались для биопроб в полетной трубе и были переведены в лабораторию, а затем получали дистиллированную воду ad libitum в течение 4-6 часов перед экспериментом.
Для количественной оценки потребления мочи и мочевины у взрослых самок An.Arab использовались анализы кормления. Самкам, ищущим хозяина и питающимся кровью, предоставлялся рацион, содержащий 1% разбавленной свежей и выдержанной коровьей мочи, различные концентрации мочевины и два контроля (10% сахарозы и воды) в течение 48 часов. Кроме того, в рацион добавлялся пищевой краситель (1 мг мл-1 ксиленцианида FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стокгольм, Швеция), который поставлялся в матрице 4 × 4 в микроцентрифужных пробирках объемом 250 мкл (Axygen Scientific, Юнион-Сити, Калифорния, США; Рисунок 1A). Заполните до краев (~300 мкл). Чтобы избежать конкуренции между комарами и потенциального воздействия цвета красителя, поместите 10 комаров в большую чашку Петри (12 см в диаметре и 6 см в высоту; Семадени, Остермундиген, Швейцария; Рисунок 1А) в полной темноте при температуре 25 ± 2 см °C и относительной влажности 65 ± 5%. Эти эксперименты повторялись от 5 до 10 раз. После воздействия диеты комары помещались при температуре -20 °C до дальнейшего анализа.
Обратите внимание на коровью мочу и мочевину, поглощенные хозяином и кровососущей самкой Anopheles arabianus. В ходе эксперимента по кормлению (A) самкам комаров давали рацион, состоящий из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). Самки, ищущие хозяина (B) и питающиеся кровью (C), поглощали больше сахарозы, чем любая другая протестированная диета. Обратите внимание, что самки, ищущие хозяина, поглощали 72-часовую коровью мочу меньше, чем 168-часовую коровью мочу (B). Среднее общее содержание азота (± стандартное отклонение) в моче представлено на врезке. Самки, ищущие хозяина (D, F) и кровососущие (E, G) поглощают мочевину в зависимости от дозы. Средние вдыхаемые объемы (D, E) с разными буквенными названиями значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего (BE). Прямая пунктирная линия представляет собой линию логарифмически-линейной регрессии (F, G)
Для высвобождения поглощенной пищи комары были индивидуально помещены в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, содержащие 230 мкл дистиллированной воды, и ткань была разрушена с помощью одноразового пестика и беспроводного двигателя (VWR International, Лунд, Швеция), с последующим центрифугированием при 10 крпм в течение 10 мин. Супернатант (200 мкл) был перенесен в 96-луночный микропланшет (Sigma-Aldrich) и поглощение (λ620) было определено с помощью спектрофотометрического считывателя микропланшетов (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ортенберг, Германия) нм). В качестве альтернативы комары были измельчены в 1 мл дистиллированной воды, 900 мкл которой были перенесены в кювету для спектрофотометрического анализа (λ 620 нм; УФ 1800, Shimadzu, Киста, Швеция). Для количественной оценки потребления пищи была подготовлена ​​стандартная кривая путем серийного разбавления с получением от 0,2 мкл до 2,4 мкл 1 мг мл-1 цианида ксилена. Затем оптическая плотность известных концентраций красителя использовалась для определения количества пищи, съеденной каждым комаром.
Данные по объему анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими попарными сравнениями Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США, 1989–2007). Линейный регрессионный анализ описывал потребление мочевины в зависимости от концентрации и сравнивал реакции между комарами, ищущими хозяина, и кровососущими комарами (GraphPad Prism v8.0.0 для Mac, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).
Приблизительно 20 мкл образцов мочи из каждой возрастной группы были связаны на Chromosorb® W/AW (10 мг 80/100 меш, Sigma Aldrich) и заключены в жестяные капсулы (8 мм × 5 мм). Капсулы были помещены в камеру сгорания анализатора CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) для определения содержания азота в свежей и выдержанной моче в соответствии с протоколом производителя. Общее содержание азота (г N л-1) было количественно определено на основе известных концентраций мочевины, используемых в качестве стандарта.
Чтобы оценить влияние диеты на выживаемость самок, ищущих хозяина и сосающих кровь, комаров по отдельности помещали в большие чашки Петри (12 см в диаметре и 6 см в высоту; Semadeni) с закрытым сеткой отверстием в крышке (3 см в диаметре) для вентиляции и подачи пищи. Диеты предоставлялись сразу после 4 dpe и включали 1% разбавленной свежей и выдержанной коровьей мочи, четыре концентрации мочевины и два контроля, 10% сахарозы и воды. Каждую диету пипеткой наносили на стоматологический тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), вставленный в шприц объемом 5 мл (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), поршень вынимали и помещали на верхнюю часть чашки Петри (рисунок 1). 1A). Меняйте диету каждый день. Поддерживайте лабораторию, как описано выше. Выживших комаров подсчитывали дважды в день, а мертвых комаров выбрасывали до тех пор, пока не погибнет последний комар (n = 40 на обработку). Выживаемость комаров, питавшихся различными диетами, статистически анализировалась с использованием кривых выживания Каплана-Мейера и логранговых тестов для сравнения распределения выживаемости между диетами (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Изготовленная на заказ мельница для летающих комаров, основанная на работе Аттисано и др. [17], изготовленная из прозрачных акриловых панелей толщиной 5 мм (ширина 10 см x длина 10 см x высота 10 см) без передней и задней панелей (рис. 3: вверху). Шарнирный узел с вертикальной трубкой, изготовленной из колонки для газовой хроматографии (внутренний диаметр 0,25 мм; длина 7,5 см), концы которой приклеены к игле насекомого, подвешенной между парой неодимовых магнитов на расстоянии 9 см друг от друга. Горизонтальная трубка, изготовленная из того же материала (длина 6,5 см), делила пополам вертикальную трубку, образуя привязанный рычаг и рычаг, на котором был закреплен небольшой кусочек алюминиевой фольги в качестве светового прерывающего сигнала.
Самкам, голодавшим в течение 24 часов, давали указанную выше диету в течение 30 минут перед ограничением свободы. Затем полностью накормленных самок комаров по отдельности анестезировали на льду в течение 2–3 минут и прикрепляли к булавкам для насекомых с помощью пчелиного воска (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а затем привязывали к рукавам горизонтальных трубок. Летающая мельница. Обороты за полет регистрировались специально изготовленным регистратором данных, затем сохранялись и отображались с помощью программного обеспечения PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Летающая мельница была помещена в помещение с регулируемым климатом (12 ч:12 ч, свет: темнота, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% относительной влажности).
Для визуализации характера полетной активности общее пролетаемое расстояние (м) и общее количество последовательных полетных активностей рассчитывались за час в течение 24-часового периода. Кроме того, средние расстояния, пролетаемые отдельными самками, сравнивались между обработками и анализировались с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), где среднее расстояние считалось зависимой переменной, а обработка — независимым фактором. Кроме того, среднее количество раундов рассчитывалось с шагом в 10 минут.
Для оценки влияния диеты на репродуктивную способность An.arabiensis шесть самок (4 dpe) были перемещены непосредственно в клетки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см) после сбора крови, а затем им была предоставлена ​​экспериментальная диета в течение 48 часов, как описано выше. Затем диеты были удалены, и на третий день на 48 часов были предоставлены нерестовые чашки (30 мл; Nolato Hertila), наполненные 20 мл дистиллированной воды, которые менялись каждые 24 часа. Повторите каждый режим диеты 20-50 раз. Яйца были подсчитаны и зарегистрированы для каждой экспериментальной клетки. Подвыборки яиц использовались для оценки среднего размера и вариации длины отдельных яиц (n ≥ 200 на диету) с использованием микроскопа Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE), оснащенного камерой Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Оставшиеся яйца хранились в помещении с контролируемым климатом в стандартных условиях выращивания в течение 24 часов, а подвыборка недавно вылупившихся личинок 1-й стадии (n ≥ 200 на рацион) была измерена, как описано выше. Количество яиц, а также размер яиц и личинок сравнивались между обработками с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Летучие вещества из паровой фазы свежей (через 1 час после отбора проб), 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой мочи собирались из образцов, собранных у крупного рогатого скота породы зебу и арси. Для удобства образцы мочи собирались рано утром, когда коровы еще находились в коровнике. Образцы мочи собирались у 10 особей, и 100–200 мл каждого образца переносились в отдельные полиамидные пакеты для запекания (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Минден, Германия) в 3-литровых полиамидных пластиковых бочках с крышкой из винилхлорида. Летучие вещества из паровой фазы каждого образца мочи крупного рогатого скота собирались либо непосредственно (свежая), либо после созревания при комнатной температуре в течение 24, 72 и 168 часов, т. е. каждый образец мочи был репрезентативным для каждой возрастной группы.
Для сбора летучих веществ в свободном пространстве использовалась замкнутая система для циркуляции потока газа, отфильтрованного активированным углем (100 мл мин-1), через полиамидный мешок в адсорбционную колонку в течение 2,5 ч с использованием мембранного вакуумного насоса (KNF Neuberger, Фрайбург, Германия). В качестве контроля сбор парового пространства проводился из пустого полиамидного мешка. Адсорбционная колонка была изготовлена ​​из тефлоновой трубки (5,5 см x 3 мм id), содержащей 35 мг Porapak Q (50/80 меш; Waters Associates, Милфорд, Массачусетс, США) между пробками из стекловаты. Перед использованием колонку промывали 1 мл перегнанного н-гексана (Merck, Дармштадт, Германия) и 1 мл пентана (99,0% чистого растворителя для ГХ, Sigma Aldrich). Адсорбированные летучие вещества элюировали 400 мкл пентана. Сборы парового пространства объединяли и затем хранили при -20°C до использования для дальнейшего анализа.
Поведенческие реакции ищущих хозяина и кровососущих An. Летучие экстракты из свободного пространства, собранные из свежей, 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой мочи, были проанализированы на наличие летучих экстрактов из комаров Arabidopsis с помощью прямого стеклянного трубчатого ольфактометра [18]. Эксперименты проводились в течение ZT 13-15, пикового периода активности поиска дома An. Arab [19]. Стеклянный трубчатый ольфактометр (80 см × 9,5 см id) освещался сверху 3 ± 1 люкс красного света. Поток воздуха, отфильтрованный и увлажненный через уголь (25 ± 2 °C, относительная влажность 65 ± 2%), проходил биопробу со скоростью 30 см с-1. Воздух пропускается через ряд сетчатых экранов из нержавеющей стали, создавая ламинарный поток и однородную структуру шлейфа. Диспенсер для стоматологических тампонов (4 см × 1 см; Д:Д; DAB Dental AB), подвешенный к 5-сантиметровой спирали на наветренном конце ольфактометра, со сменой стимулятора каждые 5 минут. Для анализа в качестве стимула использовали 10 мкл каждого экстракта из паровой фазы, разбавленного 1:10. В качестве контроля использовали равное количество пентана. Отдельных комаров, ищущих хозяина, или кровососущих, помещали в отдельные клетки для выпуска за 2–3 часа до начала эксперимента. Клетка для выпуска помещалась на подветренной стороне ольфактометра, и комарам давали акклиматизироваться в течение 1 минуты, а затем открывали дроссельный клапан клетки для выпуска. Привлекательность к обработке или контролю анализировали как долю комаров, которые вступили в контакт с источником в течение 5 минут после выпуска. Каждый летучий экстракт из паровой фазы и контроль воспроизводили не менее 30 раз, и, чтобы избежать эффектов любого одного дня, то же количество Лекарственные и контрольные варианты тестировались в каждый экспериментальный день. Ответы на арабский язык и ответы, полученные от хозяина и кормившихся кровью, анализировались с использованием номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением для определения коэффициентов нечетности (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Нерестовая реакция Аня. Экстракты пара из свежей и выдержанной коровьей мочи анализировались в клетках Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science). Пластиковые стаканчики (30 мл; Nolato Hertila), наполненные 20 мл дистиллированной воды, служили субстратом для нереста и размещались в противоположных углах клетки на расстоянии 24 см друг от друга. В чашки для обработки добавляли по 10 мкл каждого экстракта пара в разведении 1:10. Для регулировки контрольной чашки использовали равное количество пентана. Чашки для обработки и контроля менялись между каждым экспериментом для контроля эффектов положения. Десять самок, накормленных кровью, выпускали в экспериментальные клетки в ZT 9-11, и через 24 часа подсчитывали икру в чашках. Формула для расчета индекса нереста следующая: (количество яиц, отложенных в чашке для обработки – количество яиц, отложенных в контрольной чашке)/(общее количество отложенные яйца). Каждую обработку повторяли 8 раз.
Анализ газовой хроматографии и детектирования электронной антенны (ГХ-ЭАД) самок An.arabiensis проводили, как описано ранее [20]. Вкратце, свежие летучие экстракты парофазного анализа разделяли с помощью ГХ Agilent Technologies 6890 (Санта-Клара, Калифорния, США), оснащенного колонкой HP-5 (30 м × 0,25 мм id, толщина пленки 0,25 мкм, Agilent Technologies). и старение мочи. Водород использовался в качестве подвижной фазы со средней линейной скоростью потока 45 см с-1. Каждый образец (2 мкл) вводился в течение 30 секунд в режиме без разделения потока с температурой на входе 225 °C. Температура печи ГХ была запрограммирована от 35 °C (удержание 3 минуты) до 300 °C (удержание 10 минут) при 10 °C мин-1. В делитель потока ГХ добавляли 4 фунта на квадратный дюйм азота и разделяли 1:1 в крестовине с малым мертвым объемом Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) между пламенно-ионизационным детектором и EAD. Капилляр потока ГХ для EAD пропускали через линию передачи Gerstel ODP-2, которая отслеживает температуру печи ГХ плюс 5 °C, в стеклянную трубку (10 см × 8 мм), где он смешивался с увлажненным воздухом, отфильтрованным через углерод. (1,5 л мин−1). Антенна располагалась на расстоянии 0,5 см от выходного отверстия трубки. Каждый отдельный комар учитывался в одной повторности, а для комаров, ищущих хозяина, было выполнено не менее трех повторностей на образцах мочи каждого возраста.
Идентификация биологически активных соединений в паровой фазе свежей и выдержанной бычьей мочи с использованием комбинированного ГХ и масс-спектрометра (ГХ-МС; 6890 ГХ и 5975 МС; Agilent Technologies) для выявления ответов антенн при анализе ГХ-ЭАД, работающем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. ГХ был оснащен капиллярной колонкой из плавленого кварца с покрытием HP-5MS UI (60 м × 0,25 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0,25 мкм) с использованием гелия в качестве подвижной фазы со средней линейной скоростью потока 35 см с-1. Образец объемом 2 мкл вводили с использованием тех же настроек инжектора и температуры печи, что и для анализа ГХ-ЭАД. Соединения идентифицировали на основе их времени удерживания (индекс Ковача) и масс-спектров в сравнении с пользовательской библиотекой и библиотекой NIST14 (Agilent). Идентифицированные соединения подтверждали путем ввода аутентичных стандартов. (Дополнительный файл 1: Таблица S2). Для количественной оценки в качестве внешнего стандарта вводили гептилацетат (10 нг, 99,8% химической чистоты, Aldrich).
Оценка эффективности синтетической смеси запахов, состоящей из биоактивных соединений, выявленных в свежей и выдержанной моче, для привлечения ищущих хозяина и кровососущих Ans.arabiensis, с использованием того же ольфактометра и протокола, что и выше. Синтетические смеси имитировали состав и пропорции соединений в смешанных летучих экстрактах паровой фазы свежей, 24-часовой, 48-часовой, 72-часовой и 168-часовой выдержанной мочи (Рисунок 5D-G; Дополнительный файл 1: Таблица S2). Для анализа используйте 10 мкл разбавленной 1:100 полностью синтетической смеси с общей скоростью высвобождения в диапазоне приблизительно 140-2400 нг ч-1 для оценки привлекательности для хозяина и кровососущих комаров. После этого тест проводится на полных смесях, в которых удаляются субтрактивные смеси отдельных соединений полной смеси. Поиск ответов от хозяина и кровососущих Ans.Arab против Синтетические и субтрактивные смеси анализировались с использованием номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением для определения нечетных отношений (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Чтобы оценить, может ли коровья моча служить индикатором местообитания хозяина для малярийных комаров, свежая и выдержанная коровья моча, собранная, как описано выше, и вода были помещены в сетчатые ведра объемом 3 л (100 мл) и установлены в ловушках-приманках для хозяев. (Версия BG-HDT; BioGents, Регенсбург, Германия). Десять ловушек были размещены на расстоянии 50 м друг от друга на пастбище, в 400 м от деревенской общины (Силай, Эфиопия, 5°53´24´´ с.ш., 37°29´24´´ в.д.) без крупного рогатого скота, на постоянных местах размножения и в деревнях. Пять ловушек нагревались для имитации присутствия хозяина, а пять ловушек оставались без нагрева. Каждое место обработки менялось каждую ночь в течение пяти ночей. Количество комаров, пойманных в ловушках с приманкой из мочи разных возрастов, сравнивалось с помощью логистической регрессии с бета-биномиальным распределением (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
В эндемичной по малярии деревне недалеко от города Маки, регион Оромия, Эфиопия (8° 11′ 08″ с.ш., 38° 81′ 70″ в.д.; рисунок 6А). Исследование проводилось в период с середины августа по середину сентября перед ежегодным остаточным распылением внутри помещений, а также в течение длительного сезона дождей. Для исследования были отобраны пять пар домов (на расстоянии 20–50 м друг от друга), расположенных на окраинах деревни (рис. 6А). Критерии, используемые для отбора домов, были следующими: в доме не разрешалось содержать животных, не разрешалось готовить пищу в помещении (использование дров или древесного угля) (по крайней мере, в течение испытательного периода), и в домах проживало не более двух человек, которые спали в помещениях без инсектицидов. под обработанной противомоскитной сеткой. Этическое одобрение было предоставлено Советом по этике институциональных исследований (IRB/022/2016) факультета естественных наук (CNS-IRB) Аддис-Абебского университета в соответствии с руководящими принципами, установленными Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. Согласие от каждого главы домохозяйства было получено с помощью сотрудников службы распространения медицинских знаний. Весь процесс одобрен местными администрациями на уровне округа и палаты («кебеле»). Экспериментальный дизайн соответствовал схеме латинского квадрата 2 × 2, в которой синтетические смеси и контроли были назначены парным домам в первую ночь и менялись между домами в следующую экспериментальную ночь. Этот процесс был повторен десять раз. Кроме того, для оценки активности комаров в выбранных домах ловушки CDC были установлены на пять последовательных ночей в начале, середине и конце полевого испытания в одно и то же время суток.
Синтетическая смесь, содержащая шесть биоактивных соединений, была растворена в гептане (97,0% растворитель класса ГХ, Sigma Aldrich) и выпущена со скоростью 140 нг ч-1 с использованием хлопкового фитильного дозатора [20]. Фитильный дозатор позволял всем соединениям высвобождаться в постоянных пропорциях в течение 12-часового эксперимента. Гептан использовался в качестве контроля. Флакон был подвешен рядом с точкой входа световой ловушки Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (John W. Hock Company, Гейнсвилл, Флорида, США; Рисунок 6A). Ловушки были подвешены на высоте 0,8–1 м над землей, около изножья кровати, а доброволец спал под необработанной противомоскитной сеткой и работал между 18:00 и 06:30. Комары, отловленные по полу и физиологическому статусу (голодные, сытые, полубеременные и беременные [21], впоследствии были проверены с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации морфологически идентифицированных видов. как A. gambiae sl. Члены комплекса [23]. В полевом исследовании отлов парных домов был проанализирован с использованием номинальной логистической модели соответствия, где притяжение было зависимой переменной, а обработка (синтетическая смесь против контроля) была фиксированным эффектом (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Здесь мы сообщаем значения χ2 и p из теста отношения правдоподобия.
Оцените, безопасно ли это. arabiensis смогла получить мочу, свой основной источник азота, мочевину, путем прямого кормления в течение 48 часов после введения в течение 4 дней после (dpe) испытаний (рис. 1A) самок, ищущих хозяина, и кровососущих самок, поглощали значительно больше сахарозы, чем любую другую диету или воду (F (5,426) = 20,15, p < 0,0001 и F (5,299) = 56,00, p < 0,0001, соответственно; рис. 1B,C). Кроме того, самки, ищущие хозяина, ели меньше с мочой через 72 часа по сравнению с мочой через 168 часов (рис. 1B). Когда им предлагали диету, содержащую мочевину, самки, ищущие хозяина, поглощали значительно большее количество мочевины при 2,69 мМ по сравнению со всеми другими концентрациями и водой, в то время как неразличимое из 10% сахарозы (F (10,813) = 15,72, p < 0,0001; Рисунок 1D). Это контрастировало с реакцией самок, питавшихся кровью, которые обычно поглощали значительно больше пищи, содержащей мочевину, чем воды, хотя и значительно меньше, чем 10% сахарозы (F (10,557) = 78,35, p < 0,0001; Рисунок 1).1E). Более того, при сравнении двух физиологических состояний, флеботомизированные самки поглощали больше мочевины, чем самки, ищущие хозяина, при самых низких концентрациях, и эти самки поглощали схожие количества мочевины при более высоких концентрациях (F (1,953) = 78,82, p < 0,0001; Рисунок 1F, G). В то время как потребление пищи, содержащей мочевину, по-видимому, имело оптимальные значения (рис. 1D,E), самки в обоих физиологических состояниях смогли модулировать количество поглощенной мочевины во всем диапазоне концентраций мочевины логарифмически линейным образом (рис. 1F,G). Аналогичным образом, комары, по-видимому, контролируют поглощение азота, регулируя количество поглощенной мочи, поскольку количество азота в моче отражается в поглощенном количестве (вставки рис. 1B, C и B).
Для оценки влияния мочи и мочевины на выживаемость комаров, ищущих хозяина, и кровососущих комаров, самок кормили мочой всех четырех возрастов (свежей, через 24 ч, 72 ч и 168 ч после осаждения) и мочевиной в различных концентрациях, а также дистиллированной водой и 10 % сахарозой, которые служили в качестве контроля (рисунок 2A). Этот анализ выживаемости показал, что диета оказала значительное влияние на общую выживаемость самок, ищущих хозяина (моча: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; рис. 2B, C) и самок, питавшихся кровью (моча: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Рисунок 2D,E). Во всех экспериментах самки, которых кормили диетой из мочи, мочевины и воды, показали значительно более низкие показатели выживаемости по сравнению с самками, которых кормили диетой с сахарозой (Рисунок 2B-E). Самки, ищущие хозяина, которых кормили свежей и застоявшейся мочой, показали разные показатели выживаемости, при этом те, кого кормили 72-часовой застоявшейся мочой (p = 0,016), имели самую низкую вероятность выживания (Рисунок 2B). Кроме того, самки, ищущие хозяина, которых кормили 135 мМ мочевиной, выживали дольше, чем контрольные особи, которым давали воду (p < 0,04) (Рисунок 2C). По сравнению с водой самки, которых кормили свежей мочой и 24-часовой мочой, выживали дольше (p = 0,001 и p = 0,012 соответственно; Рисунок 2D), в то время как самки, которых кормили 72-часовой мочой, выживали дольше, чем те, кого кормили короткой свежей мочой и 24-часовой выдержанной мочой (p < 0,0001 и p = 0,013 соответственно; Рисунок 2D). При введении 135 мМ мочевины самки, получавшие кровь, выживали дольше, чем при всех других концентрациях мочевины и воды (p < 0,013; Рисунок 2E).
Выживаемость хозяина и кровососущих самок Anopheles arabinis, питающихся коровьей мочой и мочевиной. В биопробе (A) самкам комаров предоставлялась диета, состоящая из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). Выживаемость комаров, ищущих хозяина (B, C), и кровососущих (D, E) комаров регистрировалась каждые 12 часов до тех пор, пока все самки, питавшиеся мочой (B, D) и мочевиной (C, E), а также контрольными особями, сахарозой и водой, не погибли.
Общее расстояние и количество раундов, определенных в ходе испытания на летной мельнице в течение 24-часового периода, различались между комарами, ищущими хозяина, и кровососущими комарами, которые в целом показали меньшую активность полета (рис. 3). Комары, ищущие хозяина, которые давали свежую и выдержанную мочу или сахарозу и воду, демонстрировали различные схемы полета (рис. 3), при этом самки, питающиеся свежей мочой, были более активны на рассвете, в то время как те, которых кормили 24- и 168-часовой мочой. Комары, питающиеся мочой, демонстрировали различные схемы полета и были в основном дневными. Самки комаров, которые давали сахарозу или 72-часовую мочу, демонстрировали активность в течение всего 24-часового периода, в то время как самки, которые давали воду, были более активны в середине периода. Комары, питающиеся сахарозой, демонстрировали самые высокие уровни активности поздно ночью и рано утром, в то время как те, которые потребляли 72-часовую мочу, демонстрировали устойчивое снижение активности в течение 24 часов (рис. 3).
Летные характеристики самки кровососущего комара Anopheles arabinis, питающейся коровьей мочой и мочевиной. В ходе летного испытания самки комаров, питавшиеся свежей и выдержанной коровьей мочой, различными концентрациями мочевины, сахарозой (10%) и дистиллированной водой (H2O), были привязаны к горизонтальным, свободно вращающимся конечностям (выше). Для самок, ищущих хозяина (слева) и кровососущих (справа), регистрировались общее расстояние и количество полетов в час для каждого рациона в течение 24-часового периода (темный: серый; светлый: белый). Среднее расстояние и среднее количество полетов показаны справа от графика циркадной активности. Погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего. Статистический анализ см. в тексте
В целом, общая активность полета самок, ищущих хозяина, следовала схеме, аналогичной расстоянию полета за 24-часовой период. Средняя дальность полета значительно зависела от потребленной пищи (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), а самки, ищущие хозяина, потреблявшие 72 часа мочи, пролетали значительно большие расстояния по сравнению со всеми другими диетами (p < 0,0001), а комары, питавшиеся сахарозой, летали дольше, чем комары, питавшиеся свежей (p = 0,022) и 24-часовой мочой (p = 0,022). В отличие от схемы активности полета, описанной для диеты с мочой, самки, ищущие хозяина, питавшиеся мочевиной, демонстрировали постоянную активность полета в течение 24-часового периода, достигая пика во второй половине темной фазы (рис. 3). Хотя схемы активности были схожими, самки, ищущие хозяина, питавшиеся мочевиной, значительно увеличивали среднюю дальность полета в зависимости от поглощенная концентрация (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Самки, ищущие хозяина, которых кормили любой концентрацией мочевины, летали дольше, чем самки, которых кормили либо водой, либо сахарозой (p < 0,03).
Общая активность полета кровососущих комаров была стабильной и поддерживалась в течение 24 часов при всех диетах, с повышенной активностью мочи во второй половине темного периода у самок, питавшихся водой, а также у самок, питавшихся свежей водой и возрастом 24 часа (изображение 3). В то время как диета с мочой значительно влияла на среднюю дальность полета у самок, питавшихся кровью (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), диета с мочевиной не оказывала такого влияния (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). с другой мочой и контрольной диетой (свежая, p = 0,0091; 72 часа, p = 0,0022; 168 часов, p = 0,001; сахароза, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Влияние кормления мочой и мочевиной на репродуктивные параметры оценивалось в биопробах откладывания яиц (рисунок 4A) и исследовалось в соответствии с количеством яиц, отложенных каждой самкой, размером яиц и недавно вылупившимися личинками первой стадии. Количество отложенных яиц. Самки арабских особей, питавшиеся мочой, различались в зависимости от рациона (F (5,222) = 4,38, p = 0,0008; рис. 4B). Самки, питавшиеся 24-часовой мочой и кровью, откладывали значительно больше яиц, чем самки, питавшиеся другими видами мочи, и были аналогичны самкам, питавшимся сахарозой (рисунок 4B). Аналогичным образом, размер яиц, отложенных самками, питавшимися мочой, различался в зависимости от рациона (F (5,209) = 12,85, p < 0,0001), причем самки, питавшиеся 24-часовой мочой и сахарозой, откладывали значительно более крупные яйца, чем самки, питавшиеся водой, в то время как яйца самок, питавшихся 168-часовой мочой были значительно меньше (рис. 4C). Кроме того, рацион питания мочой значительно влиял на размер личинок (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), при этом из яиц, отложенных самками, питавшимися мочой в течение 24 и 72 часов, вылуплялись значительно более крупные личинки, чем из яиц, отложенных из личинок, находящихся в яйцах. Самки, питавшиеся водой и мочой в течение 168 часов (рис. 4D).
Репродуктивная способность самок Anopheles arabinis, питающихся коровьей мочой и мочевиной. Самок комаров, питающихся кровью, кормили диетой, состоящей из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O) в течение 48 часов перед помещением в биопробы и получением субстратов для откладывания яиц48 часов (A). Количество яиц (B, E), размер яиц (C, F) и размер личинок (D, G) значительно зависели от предоставленной диеты (коровья моча: BD; мочевина: EG). Средние значения для каждого параметра, измеренные с использованием различных буквенных обозначений, значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего
Как основной азотистый компонент мочи, мочевина, при предоставлении в качестве диеты самкам, питавшимся кровью, значительно влияла на репродуктивные параметры во всех исследованиях. Количество яиц, отложенных самками, питавшимися мочевиной, после приема крови, зависело от концентрации мочевины (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), самки, питавшиеся концентрацией мочевины от 134 мкМ до 1,34 мМ, откладывали больше яиц (рисунок 4E). Самки, питавшиеся концентрацией мочевины 134 мкМ или выше, откладывали более крупные яйца, чем самки, питавшиеся водой (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; рисунок 4F), а размер личинок, хотя и находился под влиянием схожих концентраций мочевины у матерей (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), был более изменчивым (рисунок 4G).
Общая привлекательность для ищущих хозяина летучих экстрактов пара бычьей мочи. На arabiensis, оцененную в стеклянном трубчатом ольфактометре (рис. 5A), значительно влиял возраст мочи (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; рис. 5B). Постанализ показал, что застоявшийся запах мочи через 24 часа вызывал значительно более высокий уровень привлекательности по сравнению со всеми другими обработками (72 часа: p = 0,0060, 168 часов: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), за исключением запаха свежей мочи (p = 0,13; рис. 5B). Хотя общая привлекательность кровососущих комаров к запаху мочи существенно не отличалась (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; рис. 5C), эти самки оказались значительно более привлекательными к летучим экстрактам в свободном пространстве по сравнению с 72-часовой выдержкой мочи по сравнению с контрольной группой (p = 0,0066; Рисунок 5C).
Поведенческие реакции на запахи натуральной и синтетической коровьей мочи при поиске хозяина и накормленных кровью комаров Anopheles arabianus. Схема стеклянной трубки ольфактометра (A). Привлечение летучих экстрактов парового пространства из свежей и выдержанной коровьей мочи к хозяину (B) и кровососущим комарам (C). Найдите реакцию щупалец у комара Lord An. Показаны экстракты парового пространства, выделенные из свежей (D), 24-часовой (E), 72-часовой (F) и 168-часовой (G) выдержанной коровьей мочи. Кривые обнаружения электронной антенны (EAD) показывают изменения напряжения в ответ на биоактивные соединения в паровом пространстве, элюированные из газового хроматографа и обнаруженные пламенно-ионизационным детектором (FID). Масштабная линейка представляет амплитуду ответа (мВ) в зависимости от времени удерживания (с). Показаны свойства и скорости высвобождения (мкг ч-1) биологически активных соединений. Одна звездочка (*) указывает на постоянную низкоамплитудную ответ. Двойные звездочки (**) указывают на невоспроизводимые ответы. Найдите хозяина (H) и кровососущего (I) An.arabiensis по-разному реагирует на синтетические смеси запахов свежей и выдержанной коровьей мочи. Средние доли комаров, привлеченных разными буквенными названиями, значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием апостериорного анализа Тьюки; p < 0,05). Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку шкалы
Самка Ann.arabiensis через 72 и 120 часов после приема крови во время нереста не проявила предпочтения в отношении летучих экстрактов из паровой фазы свежей и выдержанной коровьей мочи по сравнению с пентановым контролем (χ2 = 3,07, p > 0,05; Дополнительный файл 1: Рис. S1).
Для самок Ann.arabiensis анализы ГХ-ЭАД и ГХ-МС выявили восемь, шесть, три и три биоактивных соединения (рисунок 5D-G). Хотя наблюдались различия в количестве соединений, вызывающих электрофизиологические реакции, большинство из этих соединений присутствовали в каждом летучем экстракте парофазного анализа, собранном из свежей и выдержанной мочи. Поэтому для каждого экстракта в дальнейшие анализы были включены только соединения, вызывающие физиологическую реакцию женских антенн выше порогового значения.
Общая скорость высвобождения летучих биологически активных соединений в собранной паровой фазе увеличилась с 29 мкг ч-1 в свежей моче до 242 мкг ч-1 в моче, выдержанной в течение 168 часов, в основном за счет увеличения содержания п-крезола и м-формальдегида, а также фенола. Напротив, скорость высвобождения других соединений, таких как 2-циклогексен-1-он и деканал, снижалась с увеличением возраста мочи, что коррелировало с наблюдаемым снижением интенсивности сигнала (обилия) на хроматограмме (рис. 5D-G, левая панель) и физиологических реакций на эти соединения (рис. 5D-G, правая панель).
В целом, синтетическая смесь имела аналогичное естественное соотношение биоактивных соединений, идентифицированных в летучих экстрактах свежей и выдержанной мочи (рис. 5D–G), и, по-видимому, не вызывала значительного интереса при поиске хозяина (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; рис. 5H) или кровососущих комаров (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; рис. 5I). Однако последующее парное сравнение между обработками показало, что комары, ищущие хозяина, были значительно привлекательнее для синтетической смеси 24-часовой выдержанной мочи по сравнению с контрольными образцами пентана (p = 0,0086; рисунок 5H).
Для оценки роли отдельных компонентов в синтетических смесях мочи, выдержанной 24 часа, шесть субтрактивных смесей были оценены против полных смесей в анализе с Y-образной пробиркой, в котором отдельные соединения были удалены. Для комаров, ищущих хозяина, вычитание отдельных соединений из полной смеси оказало значительное влияние на поведенческие реакции (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Дополнительный файл 1: Рисунок S2A), все субтрактивные смеси были более привлекательными, чем полностью смешанные. Напротив, удаление отдельных соединений из полностью синтетической смеси не повлияло на поведенческие реакции кровососущих комаров (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), за исключением деканаля, который привел к более низким уровням по сравнению с полной смесью Привлекательность (p = 0,022; Дополнительный файл 1: Рисунок S2B).
В эндемичной по малярии деревне в Эфиопии эффективность синтетической смеси 24-часовой коровьей мочи для привлечения комаров в полевых условиях оценивалась в течение десяти ночей (рис. 6A). Всего было поймано и идентифицировано 4861 комара, из которых 45,7% были Anthropus.gambiae sl, 18,9% были Anopheles pharoensis и 35,4% были Culex spp. (Дополнительный файл 1: Таблица S1). Anopheles arabinis является единственным представителем комплекса видов An.Gambian, идентифицированным с помощью ПЦР-анализа. В среднем за ночь было поймано 320 комаров, за это время ловушки с приманками из синтетической смеси поймали больше комаров, чем парные ловушки без смеси (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Были установлены ловушки без приманки в каждую из пяти контрольных ночей в начале, середине и конце испытания. В каждой паре ловушек было поймано одинаковое количество комаров, что указывает на отсутствие смещения между домами (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) и отсутствие снижения популяции в течение периода исследования. По сравнению с контрольными ловушками количество комаров, пойманных в ловушках, содержащих синтетическую смесь, было значительно увеличено: поиск хозяина (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), недавнее кровососание (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) и беременность (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Дополнительный файл 1: Таблица S1). Это также отражено в общем количестве пойманных комаров: поиск хозяина > кровососущие > беременные > полубеременный > мужчина.
Полевая оценка эффективности 24-часовой синтетической смеси с запахом коровьей мочи. Полевые испытания проводились в юго-центральной части Эфиопии (карта), недалеко от города Маки (вставка), с использованием световой ловушки Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) (справа) в парных домах с дизайном в виде латинского квадрата (аэрофотоснимок) (A). Синтетические фотоловушки CDC с запахом привлекают и ловят самок Anopheles arabesques (B), но не Anopheles farroes (C), другим способом, физиологический эффект зависит от состояния. Кроме того, эти ловушки поймали значительно большее количество комаров-хозяев Culex. (D) По сравнению с контролем. Столбики слева представляют средний индекс отбора комаров, пойманных в пары пахучей приманки (зеленые) и контрольных (открытых) ловушек (N = 10), тогда как столбцы справа представляют средний индекс отбора в парах контрольных ловушек (открытых; N = 5). ).Звездочки указывают на уровни статистической значимости (*p = 0,01 и ***p < 0,0001)
Три вида были пойманы по-разному в ловушки, содержащие синтетические смеси. Поиск хозяина (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), кровососание (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) и беременность (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) a .arabiensis был пойман в ловушке, выпускающей синтетическую смесь (рис. 6B), в то время как количество An не отличалось. Были обнаружены Pharoensis в различных физиологических состояниях (рис. 6C). Для Culex было обнаружено только значительное увеличение числа комаров, ищущих хозяев, в ловушках с приманкой из синтетической смеси (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; рис. 6D) по сравнению с контрольными ловушками.
Ловушки-приманки для хозяев, расположенные за пределами потенциальных хозяев между местами размножения и сельскими общинами в Эфиопии, использовались для оценки того, используют ли малярийные комары запах коровьей мочи в качестве подсказки о местообитании хозяина. При отсутствии подсказок о хозяине, жаре и при наличии или отсутствии запаха коровьей мочи ни один комар не был пойман (Дополнительный файл 1: Рисунок S3). Однако при наличии высокой температуры и запаха коровьей мочи самки малярийных комаров привлекались и отлавливались, хотя и в небольшом количестве, независимо от возраста мочи (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Дополнительный файл 1: Рисунок S3). Напротив, контроль воды не отлавливал малярийных комаров при высоких температурах (Дополнительный файл 1: Рисунок S3).
Малярийные комары приобретают и распространяют азотсодержащие соединения посредством компенсаторного питания коровьей мочой (т. е. лужами) для улучшения характеристик жизненного цикла, подобно другим насекомым [2, 4, 24, 25, 26]. Коровья моча является легкодоступным возобновляемым ресурсом, тесно связанным с местами отдыха переносчиков малярии, такими как коровники и высокая растительность вблизи сельских домов и мест нереста. Самки комаров находят этот ресурс по запаху и способны регулировать поглощение азотистых соединений в моче, включая мочевину, основной азотистый компонент в моче [15, 16]. В зависимости от физиологического состояния самки комара питательные вещества в моче распределяются для повышения активности полета и выживаемости самок комаров, ищущих хозяина, а также выживаемости и репродуктивных характеристик особей, питающихся кровью, во время первого гонадотропного цикла. Таким образом, смешивание мочи играет важную питательную роль для переносчиков малярии, которые закрыты, как истощенные взрослые [8], так как это дает самкам комаров возможность получать важные азотистые соединения, занимаясь низкорисковым питанием. Это открытие имеет важные эпидемиологические последствия, поскольку самки увеличивают продолжительность жизни, активность и репродуктивную способность, что влияет на способность переносчиков. Более того, такое поведение может стать целью будущих программ по борьбе с переносчиками.