Получение и распределение питательных веществ объединяет признаки кормодобывания и жизненного цикла насекомых. Чтобы компенсировать дефицит определенных питательных веществ на разных этапах жизни, насекомые могут получать эти питательные вещества за счет дополнительного питания, например, питаясь выделениями позвоночных в процессе, известном как лужи. Комар Anopheles arabiani, по-видимому, недоедает и, следовательно, нуждается в питательных веществах как для метаболизма, так и для размножения. Целью этого исследования было оценить, может ли An.arabiensis, перемешивание коровьей мочи с целью усвоения питательных веществ улучшает характеристики жизненного цикла.
Убедитесь, что это безопасно. arabiensis привлекал запах свежей, 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой коровьей мочи, а самок, ищущих хозяина и кормящихся кровью (через 48 часов после кровяной муки), измеряли с помощью Y-образного ольфактометра, а беременных самок оценивали на предмет нереста. Затем был использован комбинированный химический и электрофизиологический анализ для выявления биологически активных соединений в моче коров всех четырех возрастных классов. Синтетические смеси Биологически активные соединения оценивались в Y-образной трубке и в полевых испытаниях. Для исследования коровьей мочи и ее основного азотсодержащего соединения мочевины в качестве потенциальной дополнительной диеты для переносчиков малярии были измерены параметры питания и характеристики жизненного цикла. Были оценены доля самок комаров и количество поглощенной коровьей мочи и мочевины. После кормления самок оценивали на выживаемость, привязанный полет и размножение.
Искать кровь и пищу хозяина. В лабораторных и полевых исследованиях арабов привлекал естественный и синтетический запах свежей и выдержанной коровьей мочи. Беременные самки были безразличны к реакции коровьей мочи в местах нереста. Ищущие хозяина и кровососущие самки активно поглощают коровью мочу и мочевину и распределяют эти ресурсы в соответствии с компромиссами в жизненном цикле в зависимости от физиологического состояния для полета, выживания или размножения.
Получение и распределение коровьей мочи Anopheles arabinis для улучшения характеристик жизненного цикла. Дополнительное кормление коровьей мочой влияет на способность переносчиков напрямую, увеличивая ежедневную выживаемость и плотность переносчиков, и косвенно, изменяя активность полета, и поэтому его следует учитывать в будущих моделях.
Получение и распределение питательных веществ объединяет характеристики кормодобывания и жизненного цикла насекомых [1,2,3]. Насекомые способны выбирать и добывать пищу и выполнять компенсаторное питание в зависимости от наличия пищи и потребности в питательных веществах [1, 3]. Распределение питательных веществ зависит от процесса жизненного цикла и может привести к различным требованиям к качеству и количеству рациона на разных этапах жизни насекомых [1, 2]. позвоночные и падаль, процесс, известный как лужи [2]. Хотя в первую очередь описаны различные виды бабочек и мотыльков, водопои также встречаются у других отрядов насекомых, и влечение к этим типам ресурсов и питание ими может иметь значительное влияние на здоровье и другие черты жизненного цикла [2, 4, 5, 6], 7]. полив может играть важную роль в характеристиках его жизненного цикла, но на это поведение до сих пор не обращали внимания. Использование перемешивания в качестве средства увеличения потребления питательных веществ в этом важном транспортном средстве требует внимания, поскольку это может иметь важные эпидемиологические последствия.
Потребление азота взрослыми самками комаров рода Anopheles ограничено из-за низких запасов калорий, переносимых с личиночной стадии, и неэффективного использования кровяной муки [9]. Самки Ann.gambiae sl обычно компенсируют это, дополняя пищу кровью [10, 11], тем самым подвергая больше людей риску заражения болезнью и подвергая комаров большему риску нападения хищников. В качестве альтернативы комары могут использовать дополнительное питание экскрементами позвоночных для приобретения Азотистые соединения, которые улучшают адаптацию и маневренность в полете, как продемонстрировано другими насекомыми [2]. В этом отношении интересна сильная и отчетливая привлекательность одного из родственных видов в пределах комплекса видов An.The Gambian sl, Anopheles arabinis, свежей и выдержанной коровьей мочи [12,13,14]. на 50-95% общего азота в свежей моче [15, 16]. По мере старения коровьей мочи микроорганизмы используют эти ресурсы для уменьшения сложности азотистых соединений в течение 24 часов [15]. При быстром увеличении содержания аммиака, связанном со снижением содержания органического азота, процветают алкалофильные микроорганизмы (многие из которых производят соединения, токсичные для комаров) [15], которыми могут быть самки Ann.arabiensis, преимущественно привлекаемые к моче в возрасте 24 часов или меньше [13, 14].
В этом исследовании искали Ans хозяина и питающихся кровью. Во время первого цикла гонадотропина арабиенсис оценивали на приобретение азотистых соединений, включая мочевину, путем смешивания с мочой. Затем была проведена серия экспериментов, чтобы оценить, как самки комаров распределяют этот потенциальный питательный ресурс для улучшения выживания, размножения и дальнейшего поиска пищи. для этого потенциального питательного ресурса arabiensis обнаружил химические корреляции, лежащие в основе наблюдаемой дифференциальной привлекательности. Синтетические смеси летучих органических соединений (ЛОС), идентифицированные в моче 24-часовой выдержки, были дополнительно оценены в полевых условиях, расширив результаты, полученные в лабораторных условиях, и продемонстрировав влияние запаха бычьей мочи на различные физиологические состояния.Аттракцион комаров. Полученные результаты подтверждают, что An.arabiensis приобретает и распределяет азотистые соединения, обнаруженные в моче позвоночных, чтобы влиять на характеристики жизненного цикла. Эти результаты обсуждаются в контексте потенциальных эпидемиологических последствий и того, как их можно использовать для наблюдения за переносчиками и борьбы с ними.
Anopheles arabicans (штамм Dongola) содержали при температуре 25 ± 2 °C, относительной влажности 65 ± 5 % и цикле свет/темнота 12:12 ч. Личинок выращивали в пластиковых лотках (20 см × 18 см × 7 см), наполненных дистиллированной водой, и кормили кормом для рыб Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Куколки собирали в чашки емкостью 30 мл (Nolato Hertila). , Åstorp, SE), а затем переносили в клетки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science, Тайчжун, Тайвань), чтобы обеспечить появление имаго. Взрослые особи получали 10% раствор сахарозы вволю до 4 дней после появления всходов (dpe), после чего самкам, ищущим хозяина, предлагали диету непосредственно перед экспериментом или подвергали голоданию в течение ночи с дистиллированной водой до эксперимента, как описано ниже. F. самок, использованных для экспериментов с летающей трубкой, голодали всего 4-6 часов с водой без ограничений. Чтобы подготовить кровососущих комаров для последующих биологических анализов, 4 самкам dpe давали дефиброзную овечью кровь (Håtunalab, Bro, SE) с использованием системы мембранного кормления (Hemotek Discovery Workshops, Аккрингтон, Великобритания). rose ad libitum в течение 3 дней до экспериментов, описанных ниже. Последних самок использовали для биоанализа в летающих пробирках и переносили в лабораторию, а затем давали дистиллированную воду вволю в течение 4-6 часов перед экспериментом.
Для количественного определения потребления мочи и мочевины у взрослых самок An.Arab использовали анализы кормления. Самкам, ищущим хозяина и получавшим кровь, давали диету, содержащую 1% разбавленной свежей и выдержанной коровьей мочи, различные концентрации мочевины и два контроля (10% сахарозы и воды) в течение 48 часов. , Стокгольм, Швеция) добавляли в рацион и поставляли в виде матрицы 4 × 4 в микроцентрифужных пробирках объемом 250 мкл (Axygen Scientific, Union City, CA, США; рис. 1A). Заполните до края (~ 300 мкл). Рисунок 1A) в полной темноте при температуре 25 ± 2 см °C и относительной влажности 65 ± 5%. Эти эксперименты повторяли от 5 до 10 раз. После воздействия диеты комаров помещали при -20 °C до дальнейшего анализа.
Ищите бычью мочу и мочевину, поглощенную хозяином и кровососущей самкой Anopheles arabianus. В испытании с кормлением (A) самкам комаров давали диету, состоящую из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). Самки, ищущие хозяина (B) и питающиеся кровью (C), поглощали больше сахарозы, чем любая другая протестированная диета. Обратите внимание, что самки, ищущие хозяина, поглощали 72-часовая коровья моча меньше, чем 168-часовая коровья моча (B). Среднее содержание общего азота (± стандартное отклонение) в моче представлено на вставке. Самки, ищущие хозяина (D, F), и кровососущие (E, G) потребляют мочевину дозозависимым образом. представляет собой стандартную ошибку среднего (BE). Прямая пунктирная линия представляет собой логарифмически-линейную линию регрессии (F, G)
Для высвобождения поглощенной пищи комаров по отдельности помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 230 мкл дистиллированной воды, и ткани разрушали с помощью одноразового пестика и беспроводного мотора (VWR International, Лунд, Швеция) с последующим центрифугированием при 10 об/мин в течение 10 мин. Супернатант (200 мкл) переносили в 96-луночный микропланшет (Sigma-Aldrich) λ620) определяли с помощью спектрофотометра для считывания микропланшетов (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE), нм). В качестве альтернативы комаров растирали в 1 мл дистиллированной воды, 900 мкл которой переносили в кювету для спектрофотометрического анализа (λ 620 нм; УФ 1800, Shimadzu, Kista, SE). Для количественной оценки потребления с пищей строили стандартную кривую. путем серийного разбавления с получением от 0,2 мкл до 2,4 мкл цианида ксилола с концентрацией 1 мг/мл. Затем для определения количества пищи, проглоченной каждым комаром, использовали оптическую плотность известных концентраций красителя.
Объемные данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным парным сравнением Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США, 1989–2007 гг.). Линейный регрессионный анализ описал потребление мочевины в зависимости от концентрации и сравнил ответы между ищущими хозяина и кровососущими комарами (GraphPad Prism v8.0.0 для Mac, Graph Pad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).
Приблизительно 20 мкл образцов мочи из каждой возрастной группы связывали на Chromosorb® W/AW (10 мг, 80/100 меш, Sigma Aldrich) и инкапсулировали в оловянные капсулы (8 мм × 5 мм). Капсулы помещали в камеру сгорания анализатора CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) для определения содержания азота в свежей и выдержанной моче в соответствии с рекомендациями производителя. s протокол. Общий азот (г N л-1) определяли количественно на основе известных концентраций мочевины, используемых в качестве стандарта.
Чтобы оценить влияние диеты на выживаемость кровососущих и ищущих хозяина самок, комаров по отдельности помещали в большие чашки Петри (диаметром 12 см и высотой 6 см; Semadeni) с отверстием в крышке, покрытым сеткой (диаметром 3 см) для вентиляции и снабжения пищей. Диеты были предоставлены сразу после 4 dpe и включали 1% разбавленную свежую и старую коровью мочу, четыре концентрации мочевины и два контроля, 10% сахарозу и воду. Каждую диету наносили пипеткой на зубной тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), вставляли в шприц на 5 мл (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), удаляли поршень и помещали на чашку Петри (рис. 1). 1A). Меняйте диету каждый день. Поддерживайте лабораторные условия, как описано выше. погибло (n = 40 на обработку). Выживаемость комаров, питавшихся различными диетами, была статистически проанализирована с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера и логарифмических ранговых тестов для сравнения распределения выживаемости между диетами (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Изготовленная на заказ летающая мельница для комаров, разработанная Аттисано и др. [17], изготовленная из прозрачных акриловых панелей толщиной 5 мм (ширина 10 см, длина 10 см, высота 10 см) без передней и задней панелей (рис. 3: вверху). Поворотный узел с вертикальной трубкой, изготовленной из газовой хроматографической колонки (внутренний диаметр 0,25 мм; длина 7,5 см), концы которой приклеены к игле для насекомых, подвешенной между парой неодимовых магнитов на расстоянии 9 см друг от друга. Горизонтальная трубка из тот же материал (длиной 6,5 см) разделил вертикальную трубку пополам, чтобы сформировать привязанную руку и руку, на которой был небольшой кусочек алюминиевой фольги в качестве светового сигнала прерывания.
Самкам, голодавшим в течение 24 часов, давали указанную выше диету в течение 30 минут перед фиксацией. Полностью накормленных самок комаров затем подвергали индивидуальной анестезии на льду в течение 2-3 минут и прикрепляли к булавкам для насекомых с помощью пчелиного воска (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а затем привязывали к выступам горизонтальных труб. , затем сохраняли и отображали с помощью программного обеспечения PC-Lab 2000 ™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Летательную мельницу помещали в помещение с регулируемым климатом (12 ч: 12 ч, свет: темнота, 25 ± 2 ° C, относительная влажность 65 ± 5%).
Чтобы визуализировать характер полетов, рассчитывали общее пройденное расстояние (м) и общее количество последовательных полетов в час в течение 24-часового периода. Кроме того, средние расстояния, пройденные отдельными самками, сравнивали в зависимости от лечения и анализировали с использованием однофакторного ANOVA и постфактум-анализа Тьюки (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), где среднее расстояние считалось зависимой переменной, а лечение — независимым фактором. 10-минутные приращения.
Чтобы оценить влияние рациона на репродуктивную функцию An.arabiensis, шесть самок (4 dpe) после сбора крови переносили непосредственно в клетки Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см), а затем давали им экспериментальный рацион в течение 48 ч, как описано выше. Затем корма удаляли и на третий день на 48 ч давали нерестовики (30 мл; Nolato Hertila), наполненные 20 мл дистиллированной воды, меняя каждые 24 ч. Повторяйте каждый диетический режим 20-50 раз. Яйца подсчитывали и регистрировали для каждой экспериментальной клетки. Подобразцы яиц использовали для оценки изменения среднего размера и длины отдельных яиц (n ≥ 200 на рацион) с использованием микроскопа Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE), оснащенного камерой Leica (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Остальные яйца выдерживали в помещении с контролируемым климатом в стандартных условиях выращивания в течение 24 часов, после чего была измерена подвыборка недавно появившихся личинок 1-го возраста (n ≥ 200 на рацион), как описано выше. .).
Летучие вещества в свободном пространстве из свежей (через 1 час после отбора), 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой выдержки мочи собирали из образцов, собранных у крупного рогатого скота зебу, рас арси. Для удобства образцы мочи собирали рано утром, когда коровы еще находились в коровнике. te GmbH and Co., Minden, DE) в 3-литровых полиамидных бочках с крышкой из винилхлоридного пластика. Летучие вещества в свободном пространстве из каждого образца бычьей мочи собирали либо непосредственно (в свежем виде), либо после созревания при комнатной температуре в течение 24 часов, 72 часов и 168 часов, т. е. каждый образец мочи был репрезентативен для каждой возрастной группы.
Для сбора летучих веществ в свободном пространстве использовалась замкнутая система для циркуляции газового потока, отфильтрованного активированным углем (100 мл/мин), через полиамидный мешок в адсорбционную колонну в течение 2,5 ч с использованием диафрагменного вакуумного насоса (KNF Neuberger, Фрайбург, Германия). (50/80 меш; Waters Associates, Милфорд, Массачусетс, США) между заглушками из стекловаты. Перед использованием колонку промывали 1 мл бидистиллированного н-гексана (Merck, Darmstadt, DE) и 1 мл пентана (чистота растворителя 99,0%, чистота для газовой хроматографии, Sigma Aldrich). Адсорбированные летучие вещества элюировали 400 мкл пентана. -20°C до использования для дальнейшего анализа.
Поведенческие реакции ищущих хозяина и питающихся кровью An. Летучие экстракты из свежей, 24-часовой, 72-часовой и 168-часовой мочи были проанализированы на наличие летучих экстрактов комаров Arabidopsis с использованием ольфактометра с прямой стеклянной трубкой [18]. метр (80 см × 9,5 см в диаметре) освещался красным светом 3 ± 1 лк сверху. Поток увлажненного воздуха (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % относительной влажности) прошел биопробу со скоростью 30 см с-1. Воздух пропускается через ряд сетчатых экранов из нержавеющей стали, создавая ламинарный поток и однородную структуру шлейфа. Дозатор стоматологических тампонов (4 см × 1 см; L: D; DAB Dental AB), подвешенный к 5-сантиметровой катушке на наветренном конце ольфактометра, со сменой стимулятора каждые 5 минут. Клетку для выпуска помещали с подветренной стороны ольфактометра, и комарам давали возможность акклиматизироваться в течение 1 минуты, а затем открывали дроссельную заслонку клетки для выпуска. Привлекательность обработки или контроля анализировали как долю комаров, которые вступили в контакт с источником в течение 5 минут после выпуска. Каждый экстракт летучих веществ в свободном пространстве и контрольный образец повторяли не менее 30 раз, и во избежание эффектов любого одного дня в каждый экспериментальный день тестировали одинаковое количество обработок и контролей. Ответы Seek от хозяина и вскармливаемых кровью наборов Ans.Arabic по сравнению с наборами в свободном пространстве были проанализированы с использованием номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением коэффициентов нечетности (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Нерестовая реакция An. Экстракты свежей и выдержанной коровьей мочи анализировали в клетках Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science). Пластиковые стаканчики (30 мл; Nolato Hertila), наполненные 20 мл дистиллированной воды, служили субстратом для нереста и помещались в противоположные углы клетки на расстоянии 24 см друг от друга. : разведение 10. Равное количество пентана использовалось для корректировки контрольной чашки. Лечебная и контрольная чашки менялись между каждым экспериментом для контроля эффектов положения. Десять самок, получавших кровь, были выпущены в экспериментальные клетки в ZT 9-11, а икринки в чашках были подсчитаны через 24 часа. 8 раз.
Анализ самок An.arabiensis с помощью газовой хроматографии и обнаружения электронной антенны (GC-EAD) проводили, как описано ранее [20]. Вкратце, свежие летучие экстракты свободного пространства разделяли с использованием Agilent Technologies 6890 GC (Санта-Клара, Калифорния, США), оснащенного колонкой HP-5 (30 м × 0,25 мм, внутренний диаметр, толщина пленки 0,25 мкм, Agilent Technologies).и стареющая моча. В качестве подвижной фазы использовали водород со средней линейной скоростью потока 45 см·с-1. Каждый образец (2 мкл) вводили в течение 30 секунд в режиме без разделения при температуре на входе 225 °C. и разделили 1:1 в крестовине с малым мертвым объемом Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) между пламенно-ионизационным детектором и EAD. Выходящий капилляр ГХ для EAD пропускали через линию передачи Gerstel ODP-2, которая отслеживает температуру печи ГХ плюс 5 °C, в стеклянную трубку (10 см × 8 мм), где он смешивался с отфильтрованным углем увлажненным воздухом (1,5 л мин-1). антенну располагали на расстоянии 0,5 см от выходного отверстия трубки. На каждого отдельного комара приходилось по одной повторности, а для комаров-хозяев выполняли не менее трех повторов на образцах мочи каждого возраста.
Идентификация биологически активных соединений в парофазных коллекциях свежей и выдержанной бычьей мочи с использованием комбинированного ГХ-МС и масс-спектрометра (ГХ-МС; 6890 ГХ и 5975 МС; Agilent Technologies) для выявления антеннальных ответов в анализе ГХ-ЭАД, работающем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ. ГХ была оснащена капиллярной колонкой из плавленого кварца с покрытием HP-5MS UI (60 м × 0,25 мм внутреннего диаметра). , толщина пленки 0,25 мкм) с использованием гелия в качестве подвижной фазы со средней линейной скоростью потока 35 см·с-1. Образец объемом 2 мкл вводили с использованием тех же настроек инжектора и температуры печи, что и для анализа GC-EAD. ).Для количественного определения в качестве внешнего стандарта вводили гептилацетат (10 нг, химическая чистота 99,8%, Aldrich).
Оценка эффективности смеси синтетических запахов, состоящей из биоактивных соединений, идентифицированных в свежей и выдержанной моче, для привлечения ищущих хозяина и кровососущих Ans.arabiensis с использованием того же ольфактометра и протокола, что и выше. Файл 1: Таблица S2). Для анализа используйте 10 мкл разбавления 1:100 полностью синтетической смеси с общей скоростью высвобождения в диапазоне примерно 140–2400 нг ч-1 для оценки привлекательности для хозяина и кровососущих комаров. по сравнению с синтетическими и субтрактивными смесями анализировали с использованием номинальной логистической регрессии с последующим попарным сравнением коэффициентов нечетности (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Чтобы оценить, может ли коровья моча служить признаком среды обитания малярийных комаров, свежую и старую коровью мочу, собранную, как описано выше, и воду помещали в сетчатые 3-литровые ведра (100 мл) и устанавливали в ловушки-приманки.(Версия BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Десять ловушек, размещенных на расстоянии 50 м друг от друга на пастбище, в 400 м от деревенской общины (Силай, Эфиопия, 5°53´24´´ с.ш., 37°29´24´´ в.д.) и без крупного рогатого скота, на постоянных пастбищах и в деревнях. всего пять ночей. Количество комаров, пойманных в ловушки с приманкой из мочи разного возраста, сравнивали с использованием логистической регрессии с бета-биномиальным распределением (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
В эндемичной по малярии деревне недалеко от города Маки, регион Оромия, Эфиопия (8° 11′ 08″ с.ш., 38° 81′ 70″ в.д.; рис. 6А). Исследование проводилось в период с середины августа по середину сентября перед ежегодным остаточным опрыскиванием помещений, а также в период продолжительного сезона дождей. исследование (рис. 6А). Критерии, использованные для выбора домов, были следующими: в доме не допускались животные, не разрешалось готовить в помещении (таскать дрова или древесный уголь) (по крайней мере, в течение испытательного периода) и дома с максимум двумя жителями, спящими в неинсектицидах.под обработанной противомоскитной сеткой. Этическое одобрение было предоставлено Советом по обзору этики институциональных исследований (IRB / 022/2016) факультета естественных наук (CNS-IRB) Университета Аддис-Абебы в соответствии с руководящими принципами, установленными Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. дизайн следовал плану 2 × 2 латинского квадрата, в котором синтетические смеси и контрольные вещества были назначены парным домам в первую ночь и заменены между домами в следующую экспериментальную ночь. Этот процесс повторялся десять раз. Кроме того, для оценки активности комаров в выбранных домах ловушки CDC были настроены на пять последовательных ночей в начале, середине и конце полевых испытаний в одно и то же время дня.
Синтетическая смесь, содержащая шесть биоактивных соединений, была растворена в гептане (97,0% растворитель класса GC, Sigma Aldrich) и высвобождена со скоростью 140 нг ч-1 с помощью дозатора с хлопковым фитилем [20]. Дозатор с фитилем позволял высвобождать все соединения в постоянных пропорциях в течение 12-часового эксперимента. В качестве контроля использовали гептан. , Гейнсвилл, Флорида, США; рис. 6А).Ловушки подвешивались на высоте 0,8–1 м над землей, у изножья кровати, и доброволец спал под необработанной москитной сеткой и работал с 18:00 до 06:30.Комары, пойманные по полу и физиологическому статусу (голодные, сытые, полубеременные и беременные [21]), впоследствии были проверены с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации вида. морфологически идентифицированы как A. gambiae sl. Члены комплекса [23].В полевых исследованиях ловушка парных домов анализировалась с использованием модели номинального логистического соответствия, где привлекательность была зависимой переменной, а обработка (синтетическая смесь по сравнению с контролем) была фиксированным эффектом (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.).Здесь мы сообщаем значения χ2 и p из теста отношения правдоподобия.
Оцените, является ли это безопасным. arabiensis смог получить мочу, свой основной источник азота, мочевину, путем прямого кормления в течение 48 часов после введения в течение 4 дней после (dpe) испытаний кормления самок с поиском хозяина и кормлением кровью (рис. 1A). Самки как с поиском хозяина, так и с кровососущими поглощали значительно больше сахарозы, чем любая другая диета или вода (F (5,426) = 20,15, p <0,0001 и F (5,299) = 56,00, p < 0,0001 соответственно; рис. 1B, C). 0 % сахарозы (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; рис. 1D). Это контрастировало с реакцией самок, получавших кровь, которые обычно потребляли значительно больше пищи, содержащей мочевину, чем воду, хотя и значительно меньше 10 % сахарозы (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; рис. 1). 1E). , при сравнении двух физиологических состояний самки с флеботомией поглощали больше мочевины, чем самки, ищущие хозяина, при самых низких концентрациях, и эти самки поглощали одинаковое количество мочевины при более высоких концентрациях (F (1,953) = 78,82, p <0,0001;Рис. 1F, G). В то время как потребление из рациона, содержащего мочевину, имело оптимальные значения (рис. 1D, E), самки в обоих физиологических состояниях были способны модулировать количество поглощаемой мочевины во всем диапазоне концентраций мочевины логарифмически-линейным образом (рис. 1F, G).). Точно так же комары контролируют свое поглощение азота, регулируя количество поглощаемой мочи, поскольку количество азота в моче отражается на поглощаемом количестве (рис. 1B, вставки C и B).
Чтобы оценить влияние мочи и мочевины на выживаемость ищущих хозяина и кровососущих комаров, самкам давали мочу всех четырех возрастов (свежая, через 24 часа, 72 часа и 168 часов после отложения) и диапазон концентраций мочевины, а также дистиллированную воду и 10% сахарозы служили в качестве контроля (рис. 2А). : χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; рис. 2Б, В) и самки, питавшиеся кровью (моча: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; мочевина: χ2 = 137). 0,9, df = 5, p < 0,0001; рис. 2D, E). Во всех экспериментах самки, получавшие диету из мочи, мочевины и воды, имели значительно более низкие показатели выживаемости по сравнению с самками, получавшими диету с сахарозой (рис. 2B-E). Самки, ищущие хозяина, которых кормили свежей и несвежей мочой, демонстрировали разные показатели выживаемости, при этом те, которые получали несвежую мочу в течение 72 часов (p = 0,016), имели самую низкую вероятность выживания (рис. 2B). Кроме того, самки, ищущие хозяина, которых кормили 135 мМ мочевины, выживали дольше, чем контрольные водные животные (p < 0,04) (рис.2C). По сравнению с водой, женщины, которых кормили свежей мочой и 24-часовой мочой, выживали дольше (p = 0,001 и p = 0,012 соответственно; рис. 2D), в то время как женщины, получавшие 72-часовую мочу, выживали дольше, чем женщины, которых кормили короткой свежей мочой и 24-часовой мочой (p < 0,0001 и p = 0,013 соответственно; рис. 2D). s выживали дольше, чем все другие концентрации мочевины и воды (p <0,013; рисунок 2E).
Выживание хозяина и кровососущих самок Anopheles arabinis, питающихся коровьей мочой и мочевиной. В биологическом анализе (A) самкам комаров давали диету, состоящую из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O). на мочу (B, D) и мочевину (C, E), а контроль, сахарозу и воду, мертвы
Общее расстояние и количество оборотов, определенное в ходе теста на летающей мельнице за 24-часовой период, различались между ищущими хозяина и кровососущими комарами, которые в целом демонстрировали меньшую летную активность (рис. 3). Комары, ищущие хозяина, которые давали свежую и выдержанную мочу или сахарозу и воду, демонстрировали различные модели полета (рис. 3), при этом самки, питавшиеся свежей мочой, были более активны на рассвете, в то время как те, кто питался 24- и 168-часовыми комарами, У комаров, питавшихся мочой, были разные модели полета, и они в основном вели дневной образ жизни. Самки комаров, которые давали сахарозу или 72-часовую мочу, демонстрировали активность в течение 24-часового периода, в то время как самки, которые давали воду, были более активны в середине периода. Комары, питавшиеся сахарозой, демонстрировали самый высокий уровень активности поздно ночью и рано утром, в то время как те, которые потребляли 72-часовую мочу, испытывали устойчивое снижение активности в течение 24 часов (рис. 3).
Летные характеристики кровососущих самок Anopheles arabinis, ищущих охотника, питающихся коровьей мочой и мочевиной. В ходе испытаний на летную мельницу самки комаров питались свежей и выдержанной коровьей мочой, различными концентрациями мочевины, сахарозой (10%) и дистиллированной водой (H2O) и были привязаны к горизонтальным свободно вращающимся рукам (вверху). Для самок, ищущих хозяина (слева) и кровососущих (справа), общее расстояние и количество полетов за час для каждой диеты в течение 24-часового периода (темный: серый; светлый: белый). Среднее расстояние и среднее количество приступов показаны справа от графика циркадной активности. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. Статистический анализ см. в тексте.
В целом, общая летная активность самок, ищущих хозяина, следовала модели, аналогичной дальности полета в течение 24-часового периода. На среднюю дальность полета значительно влияла потребляемая диета (F (5, 138) = 28,27, p <0,0001), и самки, ищущие хозяина, потреблявшие мочу в течение 72 часов, летали на значительно большие расстояния по сравнению со всеми другими диетами (p <0,0001) и комарами, питавшимися сахарозой. летали дольше, чем свежие (p = 0,022) и 24-часовые москиты (p = 0,022), которых кормили мочой. концентрации (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Самки, ищущие хозяина, получавшие любую концентрацию мочевины, летали дольше, чем самки, получавшие либо воду, либо сахарозу (p < 0,03).
Общая летная активность кровососущих комаров была стабильной и сохранялась в течение 24 часов при всех диетах, с повышенной активностью мочи во второй половине темного периода у самок, питавшихся водой, а также у самок, которых кормили свежей водой и в возрасте 24 часов (изображение 3). В то время как уриновая диета значительно влияла на среднюю дальность полета у кровососущих самок (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), мочевинная диета не влияла (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004). 138) = 1,36, p = 0,24). с другой мочой и контрольным кормом (свежая, p = 0,0091; 72 часа, p = 0,0022; 168 часов, p = 0,001; сахароза, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Влияние кормления мочой и мочевиной на репродуктивные параметры оценивали в биоанализе яйцекладки (рис. 4А) и исследовали в зависимости от количества яиц, отложенных каждой самкой, размера яйца и недавно вылупившихся личинок первого возраста. значительно больше яиц, чем у самок, получавших другие диеты с мочой, и были аналогичны тем, которые откладывали самки, получавшие уриновую диету (рис. 4B). Точно так же размер яиц, отложенных самками, получавшими мочу, варьировался в зависимости от диеты (F (5, 209) = 12,85, p < 0,0001), при 24-часовой моче и самках, получавших сахарозу, откладывали значительно большие яйца, чем самки, получавшие водную пищу, в то время как яйца самок, получавших мочу в течение 168 часов, были значительно больше. меньше (рис. 4C). Кроме того, диета с мочой значительно влияла на размер личинок (F (5, 187) = 7,86, p <0,0001), при этом значительно более крупные личинки выходят из яиц, отложенных 24- и 72-часовыми самками, получающими мочу, чем из яиц, отложенных из яичных личинок.
Репродуктивные способности самок Anopheles arabinis, питающихся коровьей мочой и мочевиной. Самки комаров, питавшихся кровью, получали рацион, состоящий из свежей и выдержанной коровьей мочи, различных концентраций мочевины, сахарозы (10%) и дистиллированной воды (H2O) в течение 48 часов перед помещением в биопробы и получением субстратов для откладывания яиц в течение 48 часов (A). Количество яиц (B, E), размер яиц (C, F) и размер личинок ( D, G) значительно влиял предоставленный рацион (коровья моча: BD; мочевина: EG). Средние значения для каждого параметра, измеренные с использованием разных буквенных названий, значительно отличались друг от друга (однофакторный дисперсионный анализ с использованием постфактум-анализа Тьюки; p < 0,05). Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего
Будучи основным азотистым компонентом мочи, мочевина при введении в рацион самок, вскармливаемых кровью, значительно влияла на репродуктивные параметры во всех исследованиях. Количество яиц, откладываемых самками, получавшими мочевину, после кровяной муки, в зависимости от концентрации мочевины (F(11, 360) = 4,69; p <0,0001), самки, получавшие мочевину с концентрацией от 134 мкМ до 1,34 мМ, откладывали больше яиц (рис. 4E). питавшиеся мочевиной в концентрации 134 мкМ или выше, откладывали более крупные яйца, чем самки, питавшиеся водой (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; рис. 4F), и размер личинок, хотя и подвергался влиянию аналогичных концентраций мочевины у матерей (F(10, 3305) = 37,9; p <0,0001), был более изменчивым (рис. 4G).
Общая привлекательность летучих экстрактов бычьей мочи, ищущих хозяина. На arabiensis, оцененный с помощью ольфактометра со стеклянной трубкой (рис. 5A), значительно повлиял возраст мочи (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; рис. 5B). Апостериорный анализ показал, что несвежий запах мочи через 24 часа вызывал значительно более высокий уровень привлекательности по сравнению со всеми другими видами лечения (72 часа: p = 0,00). 60, 168 ч: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), за исключением запаха свежей мочи (p = 0,13; рис. 5B). летучих экстрактов в свободном пространстве по сравнению с 72-часовой мочой по сравнению с контролем (p = 0,0066; рисунок 5C).
Поведенческие реакции на естественные и синтетические запахи коровьей мочи при поиске хозяина и вскормленных кровью Anopheles arabianus. Схема ольфактометра со стеклянной трубкой (A). Привлечение летучих экстрактов из свежей и выдержанной коровьей мочи к хозяину (B) и кровососущим (C) комарам. Найдите реакцию щупалец лорда An. Показана коровья моча, выдержанная в течение 168 часов (F) и 168 часов (G). Кривые электронной антенны (EAD) показывают изменения напряжения в ответ на биоактивные соединения в свободном пространстве над продуктом, элюированные из газового хроматографа и обнаруженные пламенно-ионизационным детектором (FID). Шкала шкалы представляет амплитуду отклика (мВ) в зависимости от времени удерживания (с). Показаны свойства и скорость высвобождения (мкг ч-1) биологически активных соединений. Двойные звездочки (**) обозначают невоспроизводимые ответы. Найдите хозяина (H) и кровососа (I). An.arabiensis по-разному апеллирует к синтетическим смесям запахов свежей и выдержанной коровьей мочи.p <0,05). Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку шкалы.
Самка Ann.arabiensis, через 72 ч и 120 ч после кровяной муки, во время нереста не отдавала предпочтения летучим экстрактам из свежей и выдержанной коровьей мочи по сравнению с пентановым контролем (χ2 = 3,07, p > 0,05; дополнительный файл 1: рис. S1).
Для самок Ann.arabiensis анализы ГХ-ЭАД и ГХ-МС выявили восемь, шесть, три и три биоактивных соединения (рис. 5D-G). Хотя наблюдались различия в количестве соединений, которые вызывали электрофизиологические ответы, большинство этих соединений присутствовало в каждом свободном пространстве над головой экстракта, собранного из свежей и выдержанной мочи.
Общая скорость высвобождения летучих биоактивных соединений в парофазном сборе увеличилась с 29 мкг ч-1 в свежей моче до 242 мкг ч-1 в моче 168-часовой выдержки, в основном за счет п-крезола и м-формальдегида. Фенол увеличивается, а также фенол. на хроматограмме (рис. 5D-G, левая панель) и физиологические реакции на эти соединения (рис. 5D-G, правая панель).
В целом синтетическая смесь имела аналогичное естественное соотношение биологически активных соединений, идентифицированное в летучих экстрактах свежей и выдержанной мочи (рис. 5D-G), и не вызывала значительной привлекательности при поиске хозяина (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; рис. 5H) или кровососущих комаров (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0). 30; рис. 5I). Тем не менее, постфактум парные сравнения между обработками показали, что комары, ищущие хозяина, были значительно привлекательны для синтетической смеси 24-часовой мочи по сравнению с контролями с пентаном (p = 0,0086; рис. 5H).
Чтобы оценить роль отдельных компонентов в синтетических смесях мочи 24-часовой выдержки, шесть субтрактивных смесей были сопоставлены с полными смесями в Y-пробирке, в которой были удалены отдельные соединения. Для ищущих хозяина комаров вычитание отдельных компонентов из полной смеси оказало значительное влияние на поведенческие реакции (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; дополнительный файл 1: рисунок S2A), все субтрактивные смеси были более привлекательными, чем меньше, чем полностью смешанные. Напротив, удаление отдельных соединений из полностью синтетической смеси не влияло на поведенческие реакции кровососущих комаров (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), за исключением деканала, который привел к более низким уровням по сравнению с полной смесью Attraction (p = 0,022; дополнительный файл 1: рисунок S2B).
В эндемичной по малярии деревне в Эфиопии эффективность синтетической смеси 24-часовой коровьей мочи для привлечения комаров в полевых условиях оценивалась в течение десяти ночей (рис. 6А). Всего был пойман и идентифицирован 4861 комар, из которых 45,7% были Anthropus.gambiae sl, 18,9% - Anopheles pharoensis и 35,4% - Culex spp. (Дополнительный файл 1: Таблица S1). Anopheles arabinis — единственный член комплекса видов An.Gambian, идентифицированный с помощью ПЦР-анализа. В среднем за ночь ловилось 320 комаров, за это время ловушки с синтетическими приманками ловили больше комаров, чем парные ловушки без смеси (χ2(0, 3196) = 170,0, p <0,0001). Без приманки. ловушки устанавливали на каждую из пяти контрольных ночей в начале, середине и конце опыта. В каждую пару ловушек было отловлено одинаковое количество комаров, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки между домами (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) и отсутствии снижения популяции в течение периода исследования. По сравнению с контролем количество комаров, пойманных в ловушки, содержащие синтетическую смесь, значительно увеличилось. : поиск хозяина (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), недавнее кормление кровью (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) и беременность (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;Дополнительный файл 1: Таблица S1). Это также отражено в общем количестве пойманных комаров: ищущие хозяина > кровососущие > беременные > полубеременные > самцы.
Полевая оценка эффективности 24-часовой синтетической смеси запаха коровьей мочи. Полевые испытания были проведены в южно-центральной части Эфиопии (карта), недалеко от города Маки (вставка), с использованием световой ловушки Центра по контролю заболеваний (CDC) (справа) в парных домах с дизайном латинского квадрата (фото с воздуха) (A). Фотоловушки CDC с синтетической наживкой для запаха привлекают и захватывают самок Anopheles arabesques (B), но не Anopheles farro es (C), по-другому, эффект, зависящий от физиологического состояния. Кроме того, эти ловушки захватывают значительно большее количество комаров-хозяев Culex. (D) по сравнению с контролем. Столбцы слева представляют средний индекс отбора комаров, пойманных в пары ловушек с пахучей приманкой (зеленый) и контрольных (открытых) ловушек (N = 10), а столбцы справа представляют средний индекс отбора в парах контрольных ловушек (открытых; N = 5).). Звездочки указывают уровни статистической значимости (* p = 0,01 и *** p <0,0001).
Три вида были пойманы в ловушки, содержащие синтетические смеси, по-разному. Поиск хозяина (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), кормление кровью (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) и беременность (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) .arabiensis был попавших в ловушку, выпускающую синтетическую смесь (рис. 6Б), в то время как количество Ан не различалось. Обнаружены Pharoensis в различных физиологических состояниях (рис. 6В). пс.
Ловушки с приманкой-хозяином, расположенные за пределами потенциальных хозяев между местами размножения и сельскими общинами в Эфиопии, использовались для оценки того, используют ли малярийные комары запах коровьей мочи в качестве сигнала среды обитания хозяина. это в небольшом количестве, независимо от возраста мочи (χ2 (5, 25) = 2,29, p = 0,13; дополнительный файл 1: рисунок S3). Напротив, контроль воды не захватывал малярийных комаров при высоких температурах (дополнительный файл 1: рисунок S3).
Малярийные комары приобретают и распределяют азотсодержащие соединения посредством компенсаторного питания коровьей мочой (т.е. лужами) для улучшения жизненных признаков, подобно другим насекомым [2, 4, 24, 25, 26]. Коровья моча является легко доступным возобновляемым ресурсом, тесно связанным с местами отдыха переносчиков малярии, такими как коровники и высокая растительность вблизи сельских домов и нерестилищ. Самки комаров находят этот ресурс по запаху и способны регулировать поглощение азотистых соединений мочой, в том числе мочевины, основного азотистого компонента мочи [15, 16]. В зависимости от физиологического состояния самки комара питательные вещества в моче распределяются для повышения летной активности и выживания ищущих хозяина самок комаров, а также для выживания и репродуктивных характеристик кормящихся кровью особей во время первого гонадотропного цикла. это дает самкам комаров возможность усваивать важные азотистые соединения, питаясь с низким уровнем риска. Это открытие имеет серьезные эпидемиологические последствия, поскольку самки увеличивают продолжительность жизни, активность и репродуктивную способность, что влияет на способность переносчиков. Кроме того, такое поведение может стать целью будущих программ борьбы с переносчиками.