Ravinteiden hankinta ja jakautuminen integroivat hyönteisten ruokailun ja elämänhistorian ominaisuudet. Hyönteiset voivat kompensoida tiettyjen ravinteiden puutteita eri elämänvaiheissa täydentämällä ravintoa, esimerkiksi syömällä selkärankaisten eritteitä prosessissa, joka tunnetaan nimellä lätäköt. Anopheles arabiani -hyttynen näyttää olevan aliravittu ja tarvitsee siksi ravinteita sekä aineenvaihduntaan että lisääntymiseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, parantaako lehmän virtsan ravinteiden hankintaa koskeva An. arabiensis -hyttysen elämänhistorian ominaisuuksia.
Varmista, että se on turvallista. arabiensis-hyttysten tuoksu veti puoleensa tuoretta, 24, 72 ja 168 tuntia vanhaa lehmän virtsaa, ja isäntää etsiviä ja verta syöneitä (48 tuntia veriruoan jälkeen) naaraita mitattiin Y-putki-olfaktometrilla, ja tiineiden naaraiden kututestiä arvioitiin. Yhdistetyn kemiallisen ja elektrofysiologisen analyysin avulla tunnistettiin sitten bioaktiiviset yhdisteet lehmän virtsasta kaikissa neljässä ikäluokassa. Bioaktiivisten yhdisteiden synteettisiä seoksia arvioitiin Y-putki- ja kenttäkokeissa. Lehmän virtsan ja sen tärkeimmän typpipitoisen yhdisteen, urean, tutkimiseksi mahdollisina lisäravintoina malariavektoreille mitattiin ruokintaparametreja ja elämänhistorian ominaisuuksia. Naarashyttysten osuus sekä imeytyneen lehmän virtsan ja urean määrä arvioitiin. Ruokinnan jälkeen naaraiden eloonjäämistä, lentokykyä ja lisääntymistä arvioitiin.
Etsi isännän verta ja ravintoa. Laboratorio- ja kenttätutkimuksissa arabit olivat kiinnostuneita tuoreen ja kypsytetyn lehmän virtsan luonnollisesta ja synteettisestä tuoksusta. Tiineet naaraat olivat välinpitämättömiä lehmän virtsan reaktioille kutupaikoilla. Isäntää etsivät ja verta imevät naaraat imevät aktiivisesti lehmän virtsaa ja ureaa ja jakavat nämä resurssit elinkaaren kompromissien mukaisesti fysiologisen tilan funktiona lennon, selviytymisen tai lisääntymisen suhteen.
Anopheles arabinis -lajin lehmän virtsan hankinta ja jakelu parantaa elinhistorian ominaisuuksia. Lehmän virtsan lisäruokinta vaikuttaa vektorikapasiteettiin suoraan lisäämällä päivittäistä eloonjäämisastetta ja vektoritiheyttä sekä epäsuorasti muuttamalla lentoaktiivisuutta, joten se tulisi ottaa huomioon tulevissa malleissa.
Ravinteiden hankinta ja jakautuminen integroivat hyönteisten ravinnonhaun ja elämänhistorian ominaisuudet [1,2,3]. Hyönteiset pystyvät valitsemaan ja hankkimaan ravintoa sekä suorittamaan korvaavaa ruokailua ravinnon saatavuuden ja ravinnevaatimusten perusteella [1, 3]. Ravinteiden jakautuminen riippuu elämänhistorian prosessista ja voi johtaa erilaisiin vaatimuksiin ruokavalion laadulle ja määrälle hyönteisten eri elämänvaiheissa [1, 2]. Hyönteiset voivat kompensoida tiettyjen ravinteiden puutetta täydentämällä ravintoa, kuten mutaa, selkärankaisten erilaisia ​​ulosteita ja eritteitä sekä raatoa, mikä tunnetaan nimellä lätäköt [2]. Vaikka pääasiassa on kuvattu useita perhos- ja koiperhoslajeja, juottoreikiä esiintyy myös muissa hyönteislahkoissa, ja näiden resurssien houkutteleminen ja niistä syöminen voi vaikuttaa merkittävästi terveyteen ja muihin elämänhistorian ominaisuuksiin [2, 4, 5, 6],7]. Malariahyttynen Anopheles gambiae sensu lato (sl) esiintyy "aliravittuna" aikuisena [8], joten kastelulla voi olla tärkeä rooli sen elämänhistorian ominaisuuksissa, mutta tätä käyttäytymistä on toistaiseksi laiminlyöty. Ravistamisen käyttö keinona lisätä ravinteiden saantia tässä tärkeässä vehikkelissä ansaitsee huomiota, koska sillä voi olla merkittäviä epidemiologisia seurauksia.
Aikuisten naaraspuolisten Anopheles-hyttysten typen saanti on rajallista toukkavaiheesta peräisin olevien alhaisten kalorivarastojen ja verijauhon tehottoman käytön vuoksi [9]. Naaraspuoliset Ann.gambiae sl -hyttyset kompensoivat tätä tyypillisesti täydentämällä verijauhoja [10, 11], mikä altistaa useammat ihmiset taudin saalistusriskille ja suurentaa hyttysten saalistusriskiä. Vaihtoehtoisesti hyttyset voivat käyttää selkärankaisten ulosteiden lisäravintoa saadakseen typpipitoisia yhdisteitä, jotka parantavat sopeutumista ja lentokykyä, kuten muut hyönteiset ovat osoittaneet [2]. Tässä suhteessa on mielenkiintoista, että yksi sisaruslajeista, Anopheles arabinis, on vahva ja selkeä vetovoimainen tuoreen ja kypsytetyn lehmän virtsan suhteen [12, 13, 14]. Anopheles arabinis on isäntämieltymyksiltään opportunistinen ja sen tiedetään liittyvän karjaan ja syövän sitä. Lehmän virtsa on runsaasti typpiyhdisteitä sisältävä lähde, ja urea muodostaa 50–95 % tuoreen virtsan kokonaistypestä [15, 16]. Kuten lehmän virtsa ikääntyneet mikro-organismit hyödyntävät näitä resursseja typpiyhdisteiden monimutkaisuuden vähentämiseen 24 tunnin kuluessa [15]. Ammoniakin nopean lisääntymisen ja orgaanisen typen vähenemisen myötä alkalofiiliset mikro-organismit (joista monet tuottavat hyttysille myrkyllisiä yhdisteitä) menestyvät [15], jotka voivat olla naaraita. Ann.arabiensis vetää puoleensa ensisijaisesti 24 tuntia tai vähemmän vanhaa virtsaa [13, 14].
Tässä tutkimuksessa etsittiin isäntä- ja verellä syötyjä An-hyttystyyppejä. Ensimmäisen gonadotropiinisyklin aikana arabiensis-hyttysen virtsan sekoittamisen avulla tapahtuvaa typpiyhdisteiden, kuten urean, hankintaa arvioitiin. Seuraavaksi tehtiin sarja kokeita sen arvioimiseksi, miten naarashyttyset jakavat tämän potentiaalisen ravinnelähteen parantaakseen selviytymistä, lisääntymistä ja jatkoravinnon etsimistä. Lopuksi arvioitiin tuoreen ja kypsytetyn lehmän virtsan hajua sen määrittämiseksi, tarjoavatko ne luotettavia vihjeitä isäntä- ja verellä syödyistä An-hyttystyypeistä. Etsiessään tätä potentiaalista ravinnelähdettä arabiensis-hyttyset löysivät kemiallisia korrelaatioita havaitun erilaisen houkuttelevuuden taustalla. 24 tuntia kypsytetystä virtsasta tunnistettujen haihtuvien orgaanisten yhdisteiden (VOC) synteettisiä hajuseoksia arvioitiin edelleen kenttäolosuhteissa, laajentaen laboratorio-olosuhteissa saatuja tuloksia ja osoittaen naudan virtsan hajun vaikutuksen eri fysiologisiin tiloihin. Hyttysten houkuttelevuus. Saadut tulokset vahvistavat, että An. arabiensis hankkii ja levittää selkärankaisten virtsassa esiintyviä typpiyhdisteitä vaikuttaakseen elämänhistorian ominaisuuksiin. Näitä tuloksia käsitellään mahdollisten epidemiologisten seurausten yhteydessä ja sen yhteydessä, miten niitä voidaan käyttää vektorien seurantaan ja torjuntaan.
Anopheles arabicans -toukkia (Dongola-kanta) pidettiin 25 ± 2 °C:ssa, 65 ± 5 %:n suhteellisessa kosteudessa ja 12:12 tunnin valo-pimeäsyklissä. Toukat kasvatettiin muovitarjottimissa (20 cm × 18 cm × 7 cm), jotka oli täytetty tislatulla vedellä, ja niitä ruokittiin Tetramin®-kalanruoalla (Tetra Werke, Melle, Saksa). Kotelot kerättiin 30 ml:n kuppeihin (Nolato Hertila, Åstorp, Ruotsi) ja siirrettiin sitten Bugdorm-häkkeihin (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan), jotta aikuiset yksilöt pääsivät nousemaan. Aikuisille yksilöille annettiin 10 % sakkaroosiliuosta vapaasti neljään päivään nousemisen jälkeen (dpe), jolloin isäntää etsiville naaraille tarjottiin ruokaa välittömästi ennen koetta tai niitä pidettiin nälkäisinä yön yli tislatulla vedellä ennen koetta, kuten alla kuvataan. Lentoputkikokeissa käytettyjä naaraita pidettiin nälkäisinä vain 4–6 tuntia. vettä vapaasti. Verta imevien hyttysten valmistelua varten seuraavia biomäärityksiä varten neljälle dpe-naaraalle annettiin defibroottista lampaan verta (Håtunalab, Bro, SE) kalvoruokintajärjestelmän (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Iso-Britannia) avulla. Täysin ruuhkautuneet naaraat siirrettiin sitten yksittäisiin häkkeihin ja niille annettiin suoraan ruokaa alla kuvatulla tavalla tai 10 % sakkaroosia vapaasti 3 päivän ajan ennen alla kuvattuja kokeita. Jälkimmäisiä naaraita käytettiin lentoputkibiomäärityksiin ja siirrettiin laboratorioon, ja niille annettiin sitten tislattua vettä vapaasti 4–6 tuntia ennen koetta.
Ruokintamäärityksiä käytettiin virtsan ja urean kulutuksen kvantifiointiin aikuisilla An.Arab-naarailla. Isännän etsiville ja verellä ruokituille naaraille annettiin 48 tunnin ajan ruokavaliota, joka sisälsi 1 % laimennettua tuoretta ja kypsytettyä lehmän virtsaa, eri pitoisuuksia ureaa ja kaksi kontrollia (10 % sakkaroosia ja vettä). Lisäksi ruokavalioon lisättiin elintarvikeväriä (1 mg ml-1 ksyleenisyanidi FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Tukholma, SE) ja se toimitettiin 4 × 4-matriisissa 250 µl:n mikrosentrifugiputkissa (Axygen Scientific, Union City, CA, US; kuva 1A). Täytä reunaan asti (~300 µl). Hyttysten välisen kilpailun ja väriaineen mahdollisten vaikutusten välttämiseksi aseta 10 hyttystä suureen petrimaljaan (halkaisija 12 cm ja korkeus 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; kuva 1A) täysin pimeään 25 ± 2 cm °C:n lämpötilaan ja 65 ± 5 %:n suhteelliseen kosteuteen. Nämä kokeet toistettiin 5–10 kertaa päivässä. kertaa. Ruokavaliolle altistumisen jälkeen hyttyset asetettiin -20 °C:een jatkotutkimuksia varten.
Etsi isännän ja verta imevän Anopheles arabianus -naaraan imemää naudan virtsaa ja ureaa. Ruokintakokeessa (A) naarashyttysille annettiin ruokavaliota, joka koostui tuoreesta ja kypsytetystä lehmän virtsasta, eri pitoisuuksista ureaa, sakkaroosia (10 %) ja tislattua vettä (H2O). Isäntää etsivät (B) ja verta imevät (C) naaraat imevät enemmän sakkaroosia kuin mikään muu testattu ruokavalio. Huomaa, että isäntää etsivät naaraat imevät 72 tunnin lehmän virtsaa vähemmän kuin 168 tunnin lehmän virtsaa (B). Virtsan keskimääräinen kokonaistyppipitoisuus (± keskihajonta) on esitetty lisäkuvassa. Isäntää etsivät (D, F) ja verta imevät (E, G) naaraat ottavat ureaa annoksesta riippuvalla tavalla. Eri kirjainnimillä varustetut keskimääräiset sisäänhengitetyt tilavuudet (D, E) erosivat toisistaan ​​​​merkittävästi (yksisuuntainen ANOVA käyttäen Tukeyn post hoc -analyysia; p < 0,05). Virhepalkit edustavat keskiarvon keskivirhettä (BE). Suora katkoviiva edustaa log-lineaarista regressiosuoraa (F, G).
Imeytyneen ruoan vapauttamiseksi hyttyset asetettiin yksittäin 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkiin, jotka sisälsivät 230 µl tislattua vettä. Kudos rikottiin kertakäyttöisellä survimella ja langattomalla moottorilla (VWR International, Lund, SE), minkä jälkeen sentrifugoitiin nopeudella 10 krpm 10 minuutin ajan. Supernatantti (200 µl) siirrettiin 96-kuoppaiselle mikrolevylle (Sigma-Aldrich) ja absorbanssi (λ620) määritettiin spektrofotometripohjaisella mikrolevynlukijalla (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Vaihtoehtoisesti hyttyset jauhettiin 1 ml:aan tislattua vettä, josta 900 µl siirrettiin kyvettiin spektrofotometristä analyysiä varten (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Ravinnon saannin kvantifioimiseksi laadittiin standardikäyrä sarjalaimennuksella, jolloin saatiin 0,2 µl - 2,4 µl 1 mg ml-1 ksyleenisyanidia. Sitten tunnetun väriaineen optinen tiheys mitattiin. pitoisuuksia käytettiin määrittämään kunkin hyttysen syömän ruoan määrä.
Tilavuusdataa analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn post hoc -parivertailu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Lineaariset regressioanalyysit kuvasivat pitoisuudesta riippuvaa urean saantia ja verta imevien hyttysten vasteita (GraphPad Prism v8.0.0 Macille, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Noin 20 µl virtsanäytteitä kustakin ikäryhmästä sidottiin Chromosorb® W/AW -liin (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) ja kapseloitiin tinakapseleihin (8 mm × 5 mm). Kapselit asetettiin CHNS/O-analysaattorin (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) palotilaan typpipitoisuuden määrittämiseksi tuoreessa ja kypsytetyssä virtsassa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonaistyppi (g N l-1) kvantifioitiin standardina käytettyjen tunnettujen ureapitoisuuksien perusteella.
Ruokavalion vaikutuksen arvioimiseksi isäntää etsivien ja verta imevien naaraiden eloonjäämiseen hyttyset asetettiin yksittäin suuriin petrimaljoihin (halkaisijaltaan 12 cm ja korkeudeltaan 6 cm; Semadeni), joiden kannessa oli verkkomainen reikä (halkaisijaltaan 3 cm) ilmanvaihtoa ja ravinnonsaantia varten. Ruokavaliot annettiin suoraan 4 päivän kuluttua, ja ne sisälsivät 1 % laimennettua tuoretta ja kypsytettyä lehmän virtsaa, neljää ureapitoisuutta ja kaksi kontrollia, 10 % sakkaroosia ja vettä. Jokainen ruoka pipetoitiin hammastamponille (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), joka oli asetettu 5 ml:n ruiskuun (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), mäntä poistettiin ja asetettiin petrimaljan päälle (kuva 1).1A). Vaihda ruokavaliota joka päivä. Pidä laboratorio yllä edellä kuvatulla tavalla. Eloonjääneet hyttyset laskettiin kahdesti päivässä, kun taas kuolleet hyttyset heitettiin pois, kunnes viimeinen hyttynen kuoli (n = 40 käsittelyä kohden). Erilaisilla ruokavalioilla ruokittujen hyttysten eloonjäämistä analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Kaplan-Meyer-eloonjäämiskäyriä ja log-rank-testejä eloonjäämisjakauman vertailemiseksi. ruokavalioiden vertailut (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Attisanon ym. [17] pohjalta räätälöity hyttysten lentävä mylly, joka on valmistettu 5 mm paksuista kirkkaista akryylilevyistä (10 cm leveä x 10 cm pitkä x 10 cm korkea) ilman etu- ja takalevyjä (kuva 3: yläosa). Nivelkokoonpano, jossa on pystysuora putki, joka on valmistettu kaasukromatografiakolonnista (0,25 mm sisähalkaisija; 7,5 cm pituus), jonka päät on liimattu hyönteisen neulaan, joka on ripustettu neodyymimagneettien väliin 9 cm:n etäisyydelle toisistaan. Samasta materiaalista valmistettu vaakasuora putki (6,5 cm pituus) puolitti pystysuoran putken muodostaen kiinnitetyn varren ja varren, jossa oli pieni pala alumiinifoliota valoa katkaisevana signaalina.
24 tuntia nälkiinnyttämille naaraille annettiin edellä mainittua ruokavaliota 30 minuuttia ennen niiden kiinnittämistä. Täysin ruokitut naarashyttyset nukutettiin sitten yksittäin jäillä 2–3 minuutin ajan ja kiinnitettiin hyönteisten neuloihin mehiläisvahalla (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) ja sidottiin sitten vaakasuorien putkien haaroihin. Lentävä mylly. Kierrokset lentoa kohden tallennettiin räätälöidyllä tiedonkeruulaitteella, ja tiedot tallennettiin ja näytettiin PC-Lab 2000™ -ohjelmistolla (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Lentomylly sijoitettiin ilmastoituun huoneeseen (12 h:12 h, valo:pimeä, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RH).
Lentotoiminnan kuvion visualisoimiseksi laskettiin lennetty kokonaismatka (m) ja peräkkäisten lentotoimintojen kokonaismäärä tuntia kohden 24 tunnin aikana. Lisäksi yksittäisten naaraiden keskimääräisiä lentämiä matkoja verrattiin hoitojen välillä ja analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Tukeyn post hoc -analyysia (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), jossa keskimääräistä matkaa pidettiin riippuvana muuttujana, kun taas hoitoa riippumattomana tekijänä. Lisäksi kierrosten keskimääräinen lukumäärä lasketaan 10 minuutin välein.
Ruokavalion vaikutuksen arvioimiseksi An.arabiensis -kärpäsen lisääntymiskykyyn kuusi naarasta (4 dpe) siirrettiin suoraan Bugdorm-häkkeihin (30 cm × 30 cm × 30 cm) verinäytteenoton jälkeen, ja niille annettiin sitten kokeellista ruokavaliota 48 tunnin ajan edellä kuvatulla tavalla. Ruokavaliot poistettiin ja kolmantena päivänä annettiin 48 tunnin ajaksi kutukuppeja (30 ml; Nolato Hertila), jotka oli täytetty 20 ml:lla tislattua vettä, vaihdettu 24 tunnin välein. Kutakin ruokavaliota toistettiin 20–50 kertaa. Munat laskettiin ja tallennettiin kussakin kokeellisessa häkissä. Munien osanäytteitä käytettiin yksittäisten munien keskimääräisen koon ja pituuden vaihtelun arvioimiseen (n ≥ 200 ruokavaliota kohden) käyttämällä Dialux-20-mikroskooppia (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Saksa), joka oli varustettu Leica-kameralla (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Saksa). Jäljelle jääneitä munia pidettiin ilmastoidussa huoneessa normaaleissa kasvatusolosuhteissa 24 tunnin ajan, ja äskettäin kuoriutuneista ensimmäisen vaiheen toukista otettu osaotos (n ≥ 200 ruokavaliota kohden) mitattiin edellä kuvatulla tavalla. Munien lukumäärää sekä munien ja toukkien kokoa verrattiin käsittelyjen välillä käyttäen yksisuuntaista ANOVAa ja Tukeyn post hoc -analyysia (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Seebu- ja arsi-karjan tuoreesta (1 tunti näytteenoton jälkeen), 24 tuntia, 72 tuntia ja 168 tuntia vanhennetusta virtsasta kerättiin headspace-näytteitä. Mukavuussyistä virtsanäytteet kerättiin aikaisin aamulla lehmien ollessa vielä navetassa. Virtsanäytteet kerättiin 10 yksilöltä, ja 100–200 ml kutakin näytettä siirrettiin yksittäisiin polyamidista valmistettuihin leivinpusseihin (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Saksa) 3 litran polyamidista valmistetuissa kannellisissa vinyylikloridimuovitynnyreissä. Kunkin naudan virtsanäytteen headspace-haihtuvat aineet kerättiin joko suoraan (tuoreena) tai huoneenlämmössä 24 tunnin, 72 tunnin ja 168 tunnin kypsytyksen jälkeen, eli jokainen virtsanäyte edusti kutakin ikäryhmää.
Headspace-haihtuvien aineiden keräämiseksi käytettiin suljetun kierron järjestelmää, jossa aktiivihiilellä suodatettua kaasuvirtaa (100 ml min-1) kierrätettiin polyamidipussin läpi adsorptiokolonnin läpi 2,5 tunnin ajan kalvotyhjiöpumpulla (KNF Neuberger, Freiburg, Saksa). Kontrollina headspace-näytteet kerättiin tyhjästä polyamidipussista. Adsorptiokolonnin putki oli teflonputki (5,5 cm x 3 mm sisähalkaisija), joka sisälsi 35 mg Porapak Q:ta (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, Yhdysvallat) lasivillatulppien välissä. Ennen käyttöä kolonni huuhdeltiin 1 ml:lla uudelleen tislattua n-heksaania (Merck, Darmstadt, Saksa) ja 1 ml:lla pentaania (99,0 % puhdas liuotin, kaasukromatografialaatuinen, Sigma Aldrich). Adsorboituneet haihtuvat aineet eluoitiin 400 μl:lla pentaania. Headspace-näytteet yhdistettiin ja säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes niitä käytettiin jatkoanalyyseihin.
Isännän etsinnän ja veren syömisen An:n käyttäytymisvasteet. Tuoreesta, 24, 72 ja 168 tuntia kypsytetystä virtsasta kerätyistä Headspace-haihtuvista uutteista analysoitiin Arabidopsis-hyttysten haihtuvien uutteiden varalta käyttäen suoraa lasiputkiolfaktometria [18]. Kokeet tehtiin ZT 13-15:n aikana, Anin kodin etsintäaktiivisuuden huippujaksolla. Arab [19]. Lasiputkiolfaktometriä (sisähalkaisija 80 cm × 9,5 cm) valaistiin ylhäältäpäin tulevalla 3 ± 1 lx punaisella valolla. Hiilisuodatettu ja kostutettu ilmavirtaus (25 ± 2 °C, suhteellinen kosteus 65 ± 2 %) läpäisi biomäärityksen nopeudella 30 cm s-1. Ilma johdetaan ruostumattomasta teräksestä valmistettujen verkkojen läpi, jolloin syntyy laminaarinen virtaus ja yhtenäinen höyryrakenne. Hammastamponannostelija (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), ripustettuna 5 cm:n kelaan olfaktometrin tuulenpuoleisessa päässä, stimulaattorilla. vaihtuu 5 minuutin välein. Analyysiä varten ärsykkeenä käytettiin 10 μl kutakin headspace-uutetta laimennettuna suhteessa 1:10. Kontrollina käytettiin yhtä paljon pentaania. Yksittäiset isäntää etsivät tai verta imevät hyttyset asetettiin yksittäisiin vapautushäkkeihin 2–3 tuntia ennen kokeen alkua. Vapautushäkki asetettiin olfaktometrin tuulen alapuolelle, ja hyttysten annettiin tottua 1 minuutin ajan, minkä jälkeen häkin läppäventtiili avattiin vapauttamista varten. Hoitoa käsittelyyn tai kontrolliin analysoitiin niiden hyttysten osuutena, jotka olivat kosketuksissa lähteen kanssa 5 minuutin kuluessa vapauttamisesta. Jokainen headspace-haihtuva uute ja kontrolli toistettiin vähintään 30 kertaa, ja yksittäisen päivän vaikutusten välttämiseksi testattiin sama määrä käsittelyjä ja kontrolleja jokaisena koepäivänä. Isännän ja verellä ruokittujen Ans.Arabic- ja headspace-joukkojen etsintävasteita analysoitiin käyttämällä nominaalista logistista regressiota, jota seurasi parittaisten suhteiden vertailu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Anin kutuvaste. Tuoreesta ja kypsytetystä lehmän virtsasta peräisin olevat headspace-uutteet analysoitiin Bugdorm-häkeissä (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Kutusalustana toimivat muovikupit (30 ml; Nolato Hertila), jotka oli täytetty 20 ml:lla tislattua vettä, ja ne asetettiin häkin vastakkaisiin kulmiin 24 cm:n etäisyydelle toisistaan. Käsittelykuppeihin laimennettiin 10 μl kumpaakin headspace-uutetta laimennoksena suhteessa 1:10. Kontrollikuppia säädettiin samalla määrällä pentaania. Käsittely- ja kontrollikupit vaihdettiin kokeiden välillä sijaintivaikutusten kontrolloimiseksi. Kymmenen verellä ruokittua naarasta vapautettiin koehäkkeihin kutuaikaan 9–11 mennessä, ja kupeissa olevat munat laskettiin 24 tuntia myöhemmin. Kutuindeksin laskemiseen käytetään kaavaa: (käsittelykuppiin munittujen munien lukumäärä – kontrollikuppiin munittujen munien lukumäärä) / (munittujen munien kokonaismäärä). Jokainen käsittely toistettiin 8 kertaa.
Naaraspuolisten An.arabiensis -lajien kaasukromatografinen ja elektroniantennikuvioiden havaitsemiseen (GC-EAD) perustuva analyysi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [20]. Lyhyesti sanottuna tuoreet headspace-haihtuvat uutteet eroteltiin käyttämällä Agilent Technologies 6890 GC -laitetta (Santa Clara, CA, USA), joka oli varustettu HP-5-kolonnilla (30 m × 0,25 mm sisähalkaisija, 0,25 μm kalvonpaksuus, Agilent Technologies). ja ikääntyvää virtsaa. Vetyä käytettiin liikkuvana faasina keskimääräisellä lineaarisella virtausnopeudella 45 cm s⁻¹. Jokainen näyte (2 μl) injektoitiin 30 sekunnin ajan jakamattomassa tilassa sisääntulolämpötilan ollessa 225 °C. GC-uunin lämpötila ohjelmoitiin 35 °C:sta (3 minuutin pito) 300 °C:seen (10 minuutin pito) nopeudella 10 °C min⁻¹. GC-poistovirtausjakajaan lisättiin 4 psi typpeä ja jaettiin suhteessa 1:1 Gerstel 3D/2 -matalatilavuuksisessa ristilaitteessa (Gerstel, Mülheim, Saksa) liekki-ionisaatiodetektorin ja EAD:n välillä. GC-poistovirtauskapillaari EAD:tä varten johdettiin Gerstel ODP-2 -siirtolinjan kautta, joka seuraa GC-uunin lämpötilaa plus 5 °C, lasiputkeen (10 cm × 8 mm), jossa se sekoitettiin hiilisuodatettuun, kostutettuun ilmaan (1,5 l min⁻¹). Antenni sijoitettiin 0,5 cm:n päähän putken ulostulosta. Jokainen yksittäinen hyttynen laskettiin yhtä toistoa varten ja isäntää etsiville hyttysille tehtiin vähintään kolme toistoa kunkin iän virtsanäytteistä.
Bioaktiivisten yhdisteiden tunnistaminen tuoreen ja kypsytetyn naudan virtsan headspace-kokoelmissa käyttämällä yhdistettyä GC- ja massaspektrometriä (GC-MS; 6890 GC ja 5975 MS; Agilent Technologies) antennivasteiden aikaansaamiseksi GC-EAD-analyysissä, joka toimi elektronitörmäysionisaatiotilassa 70 eV:n virralla. GC oli varustettu HP-5MS UI -päällysteisellä kvartsista valmistetulla kapillaarikolonnilla (sisähalkaisija 60 m × 0,25 mm, kalvon paksuus 0,25 μm) käyttäen heliumia liikkuvana faasina keskimääräisen lineaarisen virtausnopeuden ollessa 35 cm s-1. 2 μl:n näyte injektoitiin käyttäen samoja injektoriasetuksia ja uunin lämpötilaa kuin GC-EAD-analyysissä. Yhdisteet tunnistettiin niiden retentioajan (Kovát-indeksi) ja massaspektrien perusteella verrattuna mukautettuun kirjastoon ja NIST14-kirjastoon (Agilent). Tunnistetut yhdisteet varmistettiin injektoimalla autenttisia standardeja (lisätiedosto 1: taulukko S2). Kvantifiointia varten käytettiin heptyyliasetaattia (10 ng, 99,8 % kemiallinen puhtaus, Aldrich). ruiskutetaan ulkoisena standardina.
Arvioidaan tuoreessa ja kypsytetyssä virtsassa tunnistetuista bioaktiivisista yhdisteistä koostuvan synteettisen hajuseoksen tehokkuutta houkutella isäntää etsiviä ja verta imeviä Ans.arabiensis -hyttysiä käyttäen samaa olfaktometriä ja protokollaa kuin edellä. Synteettiset seokset jäljittelivät yhdisteiden koostumusta ja osuuksia tuoreen, 24 tuntia, 48 tuntia, 72 tuntia ja 168 tuntia kypsytetyn virtsan sekoitettujen headspace-haihtuvien uutteiden sekoituksessa (kuva 5D-G; lisätiedosto 1: taulukko S2). Analyysissä käytetään 10 μl täysin synteettistä seosta suhteessa 1:100 laimennettuna, jonka kokonaisvapautumisnopeus vaihtelee noin 140–2400 ng h-1, jotta voidaan arvioida houkuttelevuutta isäntä- ja verta imeville hyttysille. Tämän jälkeen testi suoritetaan täydellisillä seoksilla, joista poistetaan yksittäisten yhdisteiden substraktiiviset seokset koko seoksesta. Isännän ja verta syöneiden Ans.Arabien vs. synteettisten ja substraktiivisten seosten seek-vasteita analysoitiin käyttämällä nominaalista logistista regressiota, jota seurasi parittaisten suhteiden vertailu (JMP Pro, versio 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Jotta arvioitaisiin, voisiko lehmän virtsa toimia isäntäelinympäristön vihjeenä malariahyttysille, tuoretta ja kypsytettyä lehmän virtsaa, joka oli kerätty edellä kuvatulla tavalla, ja vettä laitettiin verkkomaisiin 3 litran ämpäreihin (100 ml) ja asetettiin isäntäsyöttiloukkuihin (BG-HDT-versio; BioGents, Regensburg, Saksa). Kymmenen loukkua sijoitettiin 50 metrin päähän toisistaan ​​laitumelle, 400 metrin päähän kyläyhteisöstä (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) ilman karjaa, pysyville lisääntymisalueille ja kyliin. Viisi loukkua lämmitettiin isännän läsnäolon simuloimiseksi, kun taas viisi loukkua jätettiin lämmittämättä. Jokaista käsittelypaikkaa vaihdellaan yössä yhteensä viiden yön ajan. Eri-ikäisten virtsalajien syöteillä täytettyihin loukkuihin saatujen hyttysten määriä verrattiin käyttämällä logistista regressiota beeta-binomiaalijakaumalla (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Malariaa levittävässä kylässä lähellä Makin kaupunkia Oromian alueella Etiopiassa (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; kuva 6A). Tutkimus tehtiin elokuun puolivälin ja syyskuun puolivälin välisenä aikana ennen vuosittaista sisätilojen jäännösruiskutusta pitkän sadekauden aikana. Tutkimukseen valittiin viisi paria taloja (20–50 metrin päässä toisistaan) kylän laitamilla (kuva 6A). Talojen valintakriteereinä käytettiin seuraavia kriteerejä: eläinten pitäminen talossa ei ollut sallittua, sisätiloissa ruoanlaitto (polttopuiden tai hiilen käyttö) ei ollut sallittua (ainakaan kokeilujakson aikana) ja talot, joissa oli enintään kaksi asukasta ja nukkuminen hyönteismyrkkyä sisältämättömissä tiloissa. käsitellyn hyttysverkon alla. Addis Abeban yliopiston luonnontieteellisen tiedekunnan (CNS-IRB) tutkimuseettinen toimikunta (IRB/022/2016) on myöntänyt eettisen hyväksynnän Maailman lääkäriliiton Helsingin julistuksen ohjeiden mukaisesti. Jokaiselta perheenpäältä saatiin suostumus terveydenhuollon henkilöstön avustuksella. Koko prosessia tukevat paikallishallinnot piiri- ja vaalipiiritasolla ('kebele'). Koeasetelma noudatti 2 × 2 latinalaisen neliön mallia, jossa synteettiset seokset ja kontrollit jaettiin paritettuihin taloihin ensimmäisenä yönä ja vaihdettiin talojen välillä seuraavana koeyönä. Tämä prosessi toistettiin kymmenen kertaa. Lisäksi CDC-loukut asetettiin toimimaan viitenä peräkkäisenä yönä kenttäkokeen alussa, keskellä ja lopussa samaan aikaan päivästä hyttysten aktiivisuuden arvioimiseksi.
Kuusi bioaktiivista yhdistettä sisältävä synteettinen seos liuotettiin heptaaniin (97,0 % liuotin GC-laatu, Sigma Aldrich) ja vapautettiin nopeudella 140 ng h-1 puuvillalangan avulla [20]. Langan avulla kaikki yhdisteet vapautuivat vakio-osuuksina koko 12 tunnin kokeen ajan. Heptaania käytettiin kontrollina. Injektiopullo ripustettiin tautien torjunnan ja ehkäisyn keskusten (CDC) valoloukun (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; kuva 6A) sisääntuloaukon viereen. Loukut ripustettiin 0,8–1 metrin korkeudelle maanpinnasta lähelle sängyn jalkopäätä, ja vapaaehtoinen nukkui käsittelemättömän hyttysverkon alla ja toimi klo 18.00–06.30. Sukupuolen ja fysiologisen tilan mukaan (ruokimattomat, ruokitut, puolitiineinä ja tiineinä [21]) pyydystetyt hyttyset seulottiin myöhemmin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) morfologisesti A. gambiae sl:ksi tunnistetun lajin tunnistamiseksi. Kompleksin jäsenet [23]. Kenttätutkimuksessa loukku Paritettujen talojen pyyntiä analysoitiin käyttämällä nominaalista logistista sovitusmallia, jossa vetovoima oli riippuva muuttuja ja käsittely (synteettinen seos vs. kontrolli) kiinteä vaikutus (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Tässä raportoimme χ2- ja p-arvot uskottavuussuhdetestistä.
Arvioi, onko se turvallista. arabiensis pystyi saamaan virtsaa, sen tärkeintä typpilähdettä, ureaa, suoralla ruokinnalla 48 tunnin kuluessa antamisesta 4 päivän ajan isännänhakuisten ja vertaruokittujen naaraiden ruokintakokeiden jälkeen (kuva 1A). Sekä isännänhakuiset että vertaimevät naaraat imeytyivät merkittävästi enemmän sakkaroosia kuin mikään muu ruokavalio tai vesi (F(5 426) = 20,15, p < 0,0001 ja F(5 299) = 56,00, p < 0,0001; kuva 1B, C). Lisäksi isäntää etsivät naaraat söivät vähemmän virtsaa 72 tunnin kohdalla verrattuna virtsaan 168 tunnin kohdalla (kuva 1B). Kun isäntää etsiville naaraille tarjottiin ureaa sisältävää ruokavaliota, ne imeytyivät merkittävästi suuremman määrän ureaa 2,69 mM:n pitoisuudella verrattuna kaikkiin muihin pitoisuuksiin ja veteen, kun taas 10 % sakkaroosia ei voitu erottaa toisistaan ​​(F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; kuva 1D). Tämä oli ristiriidassa verellä ruokittujen naaraiden vasteen kanssa, jotka tyypillisesti imeytyivät merkittävästi enemmän ureaa sisältävään ruokavalioon kuin veteen, vaikkakin merkittävästi vähemmän kuin 10 % sakkaroosia (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; kuva 1).1E). Lisäksi, kun verrattiin kahta fysiologista tilaa, flebotomisoidut naaraat imeytyivät enemmän ureaa kuin isäntää etsivät naaraat pienimmillä pitoisuuksilla, ja nämä naaraat imeytyivät samanlaisilla määrillä ureaa korkeammilla pitoisuuksilla (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; kuva 1F, G). Vaikka ureaa sisältävän ruokavalion saanti näytti olevan optimaalisilla arvoilla (kuva 1D, E), naaraat pystyivät molemmissa fysiologisissa tiloissa moduloimaan imeytyneen urean määrää koko ureapitoisuusalueella log-lineaarisella tavalla (kuva 1F, G). ).Vastaavasti hyttyset näyttävät kontrolloivan typenottoaan säätelemällä imeytyvän virtsan määrää, koska virtsan typen määrä heijastuu imeytyneeseen määrään (kuva 1B, C ja B).
Virtsan ja urean vaikutusten arvioimiseksi isäntää etsivien ja verta imevien hyttysten eloonjäämiseen naaraille syötettiin kaikkien neljän ikäryhmän virtsaa (tuoretta, 24 h, 72 h ja 168 h laskeutumisen jälkeen). Kontrollina käytettiin erilaisia ​​ureapitoisuuksia sekä tislattua vettä ja 10 % sakkaroosia (kuva 2A). Tämä eloonjäämisanalyysi osoitti, että ruokavaliolla oli merkittävä vaikutus kokonaiseloonjäämiseen isäntää etsivillä naarailla (virtsa: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; kuva 2B, C) ja verta syöneillä naarailla (virtsa: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; kuva 2D, E). Kaikissa kokeissa virtsaa, ureaa ja vettä sisältävällä ruokavaliolla ruokituilla naarailla oli merkittävästi alhaisemmat selviytymisasteet verrattuna sakkaroosiruokavaliolla ruokittuihin naaraisiin (kuva 2B-E). Tuoreella ja vanhentuneella virtsalla ruokituilla isäntää etsivillä naarailla oli erilaiset selviytymisasteet, ja 72 tuntia vanhentunutta virtsaa syöttävillä naarailla (p = 0,016) oli pienin selviytymistodennäköisyys (kuva 2B). Lisäksi 135 mM urealla ruokitut isäntää etsivät naaraat selvisivät pidempään kuin vesikontrolliryhmä (p < 0,04) (kuva 2C). Veteen verrattuna tuoreella virtsalla ja 24 tunnin virtsalla ruokitut naiset selvisivät pidempään (p = 0,001 ja p = 0,012; kuva 2D), kun taas 72 tunnin virtsalla ruokitut naiset selvisivät pidempään kuin lyhyellä tuoreella virtsalla ja 24 tuntia vanhennetulla virtsalla ruokitut (p < 0,0001 ja p = 0,013; kuva 2D). 135 mM urealla ruokituilla verellä ruokituilla naarailla selvisi pidempään kuin kaikilla muilla urea- ja vesipitoisuuksilla ruokituilla naarailla. (p < 0,013; kuva 2E).
Lehmän virtsalla ja urealla syöneiden isännän ja verta imevien naaraspuolisten Anopheles arabinis -hyttysten selviytyminen. Biomäärityksessä (A) naaraspuolisille hyttysille annettiin ruokavaliota, joka koostui tuoreesta ja kypsytetystä lehmän virtsasta, eri pitoisuuksista ureaa, sakkaroosia (10 %) ja tislattua vettä (H2O). Isäntää etsivien (B, C) ja verta imevien (D, E) hyttysten selviytymistä rekisteröitiin 12 tunnin välein, kunnes kaikki virtsalla (B, D) ja urealla (C, E) syöneet naaraat sekä sakkaroosilla ja vedellä syöneet kontrollihyttyset olivat kuolleet.
Lentomyllytestissä 24 tunnin aikana määritetty kokonaismatka ja kierrosten lukumäärä erosivat isäntää etsivien ja verta imevien hyttysten välillä, sillä verta imevät hyttyset osoittivat kaiken kaikkiaan vähemmän lentoaktiivisuutta (kuva 3). Isäntää etsivät hyttyset, jotka antoivat tuoretta ja kypsytettyä virtsaa tai sakkaroosia ja vettä, osoittivat erilaisia ​​lentomalleja (kuva 3): tuoretta virtsaa syöneet naaraat olivat aktiivisempia aamunkoitteessa, kun taas 24 ja 168 tuntia ikäisiä virtsaa syöneet hyttyset osoittivat erilaisia ​​lentomalleja ja olivat pääasiassa päiväaikaisia. Sakkaroosia tai 72 tunnin virtsaa syöneet naaraat osoittivat aktiivisuutta koko 24 tunnin jakson ajan, kun taas vettä syöneet naaraat olivat aktiivisempia jakson puolivälissä. Sakkaroosia syöneet hyttyset osoittivat korkeinta aktiivisuutta myöhään yöllä ja aikaisin aamulla, kun taas 72 tuntia ikäistä virtsaa syöneiden hyttysten aktiivisuus laski tasaisesti 24 tunnin aikana (kuva 3).
Metsästäjän etsivän verta imevän naarashyttysen (Anopheles arabinis) lentosuorituskyky lehmän virtsalla ja urealla. Lentomyllytestissä naarashyttyset, jotka syövät tuoretta ja kypsytettyä lehmän virtsaa, eri pitoisuuksia ureaa, sakkaroosia (10 %) ja tislattua vettä (H2O), kiinnitettiin vaakasuoriin, vapaasti pyöriviin käsivarsiin (yllä). Isäntää etsivän (vasen) ja verta imevän (oikea) naaraan kokonaismatka ja lentojen lukumäärä tunnissa kummallakin ruokavaliolla 24 tunnin aikana tallennettiin (tumma: harmaa; vaalea: valkoinen). Keskimääräinen matka ja lentojen keskimääräinen lukumäärä näkyvät vuorokausirytmin aktiivisuuskäyrän oikealla puolella. Virhepalkit edustavat keskiarvon standardivirhettä. Tilastollinen analyysi, katso teksti.
Yleisesti ottaen isäntää etsivien naaraiden lentoaktiivisuus noudatti samanlaista kaavaa kuin lentomatka 24 tunnin aikana. Keskimääräiseen lentomatkaan vaikutti merkittävästi nauttittu ravinto (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), ja 72 tuntia virtsaa nauttineet isäntää etsivät naaraat lensivät merkittävästi pidempiä matkoja verrattuna kaikkiin muihin ruokavalioihin (p < 0,0001), ja sakkaroosilla ruokitut hyttyset lensivät pidempään kuin tuoreella (p = 0,022) ja 24 tuntia kypsytetyllä virtsalla (p = 0,022) ruokitut hyttyset. Toisin kuin virtsaruokavalion kuvaama lentoaktiivisuusmalli, urealla ruokitut isäntää etsivät naaraat osoittivat jatkuvaa lentoaktiivisuutta 24 tunnin aikana, ja se oli huipussaan pimeän vaiheen jälkipuoliskolla (kuva 3). Vaikka aktiivisuusmallit olivat samankaltaisia, urealla ruokitut isäntää etsivät naaraat pidensivät merkittävästi keskimääräistä lentomatkaa absorboituneen pitoisuuden mukaan (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Isäntää etsivät naaraat, joille annettiin millä tahansa ureapitoisuudella ruokaa, lensivät pidempään kuin naaraat, joille annettiin joko vettä tai sakkaroosia (p < 0,03).
Verta imevien hyttysten lentoaktiivisuus oli vakaata ja säilyi 24 tunnin ajan kaikilla ruokavalioilla. Virtsa-aktiivisuus lisääntyi pimeän kauden jälkipuoliskolla sekä vedellä ruokituilla naarailla että tuoreena ja 24 tuntia ikäisinä ruokituilla naarailla (kuva 3). Vaikka virtsaravitsemus vaikutti merkittävästi keskimääräiseen lentomatkaan verellä ruokituilla naarailla (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), urearavitsemus ei vaikuttanut (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) muun virtsaravinnon ja kontrolliravinnon (tuore, p = 0,0091; 72 tuntia, p = 0,0022; 168 tuntia, p = 0,001; sakkaroosi, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036) yhteydessä.
Virtsan ja urean syönnin vaikutuksia lisääntymisparametreihin arvioitiin munintabiomäärityksillä (kuva 4A), ja niitä tutkittiin kunkin naaraan munimien munien lukumäärän, munan koon ja vastakuoriutuneiden ensimmäisen vaiheen toukkien perusteella. Munittujen munien lukumäärä. Virtsalla ruokitut arabi-naaraat vaihtelivat ruokavalion mukaan (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; kuva 4B). 24 tuntia virtsa- ja veriruokitulla ruokinnalla ruokitut naaraat munivat merkittävästi enemmän munia kuin muilla virtsaruokinnalla ruokitut naaraat, ja niiden munien koko oli samanlainen kuin sakkaroosilla ruokittujen munien (kuva 4B). Samoin virtsalla ruokittujen naaraiden munimien munien koko vaihteli ruokavalion mukaan (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001). 24 tuntia virtsalla ja sakkaroosilla ruokitut naaraat munivat merkittävästi suurempia munia kuin vedellä ruokitut naaraat, kun taas 168 tuntia virtsaa ruokittujen naaraiden munat olivat merkittävästi pienempiä (kuva 4C). Lisäksi virtsaruokavalio vaikutti merkittävästi toukkien kokoon (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), ja 24 ja 72 tuntia ikäisten virtsalla syöneiden naaraiden munimista munista kuoriutuu merkittävästi suurempia toukkia kuin munivien toukkien munista. Vesisyötetyt ja 168 tuntia ikäiset virtsalla syöneet naaraat (kuva 4D).
Lehmän virtsaa ja ureaa syövien Anopheles arabinis -naarashyttyssien lisääntymiskyky. Verellä ruokituille naarashyttysille annettiin 48 tunnin ajan ruokavaliota, joka koostui tuoreesta ja kypsytetystä lehmän virtsasta, eri pitoisuuksista ureaa, sakkaroosia (10 %) ja tislattua vettä (H2O) ennen niiden asettamista biomäärityksiin ja muninta-alustojen hankkimista 48 tunnin ajan (A). Munien lukumäärään (B, E), munan kokoon (C, F) ja toukkien kokoon (D, G) vaikutti merkittävästi annettu ruokavalio (lehmän virtsa: BD; urea: EG). Kunkin eri kirjainnimillä mitatun parametrin keskiarvot erosivat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA käyttäen Tukeyn post hoc -analyysia; p < 0,05). Virhepalkit edustavat keskiarvon standardivirhettä.
Virtsan tärkeimpänä typpipitoisena komponenttina urea, kun sitä annettiin ravinnon mukana verellä syöneille naaraille, vaikutti merkittävästi lisääntymisparametreihin kaikissa tutkimuksissa. Veriaterian jälkeen urealla ruokittujen naaraiden munimien munien määrä riippui ureapitoisuudesta (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Naaraat, jotka saivat ureapitoisuuksia 134 µM ja 1,34 mM välillä, munivat enemmän munia (kuva 4E). Naaraat, jotka saivat ureapitoisuuksia 134 µM tai enemmän, munivat suurempia munia kuin naaraat, jotka saivat vettä (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; kuva 4F). Toukan koko vaihteli, vaikkakin emojen vastaavat ureapitoisuudet vaikuttivat siihen (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) (kuva 4G).
Kokonaisvaltainen vetovoima isäntää etsiviin naudan virtsan headspace-haihtuviin uutteisiin. Lasiputkiolfaktometrilla mitattuun arabiensis-hyttyseen (kuva 5A) virtsan ikä vaikutti merkittävästi (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; kuva 5B). Post hoc -analyysi osoitti, että 24 tunnin kuluttua vanhentunut virtsan haju aiheutti merkittävästi korkeamman houkuttelevuuden verrattuna kaikkiin muihin käsittelyihin (72 tuntia: p = 0,0060, 168 tuntia: p = 0,012, pentaani: p = 0,00070), lukuun ottamatta tuoreen virtsan tuoksua (p = 0,13; kuva 5B). Vaikka verta imevien hyttysten yleinen vetovoima virtsan hajuun ei ollut merkitsevästi erilainen (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; kuva 5C), näiden naaraiden havaittiin olevan merkittävästi houkuttelevampia headspace-haihtuville uutteille verrattuna 72 tuntia vanhennettuun virtsaan verrattuna kontrolliryhmään (p = 0,0066; kuva 5C).
Käyttäytymisvasteet luonnollisille ja synteettisille lehmän virtsan hajuille isännän ja verellä syödyn Anopheles arabianuksen etsinnässä. Lasiputkiolfaktometrin kaaviokuva (A). Tuoreesta ja kypsytetystä lehmän virtsasta peräisin olevien headspace-haihtuvien uutteiden vetovoima isäntähyttysiin (B) ja verta imeviin (C) hyttysiin. Määritä Lord Anin lonkeroreaktio. Kuvassa on esitetty tuoreesta (D), 24 tuntia (E), 72 tuntia (F) ja 168 tuntia (G) kypsytetystä lehmän virtsasta eristetyt headspace-uutteet. Elektroniantennidetektio (EAD) -käyrät osoittavat jännitemuutoksia vasteena kaasukromatografista eluoituihin ja liekki-ionisaatiodetektorilla (FID) havaittuihin bioaktiivisiin yhdisteisiin headspacessa. Asteikkopalkki edustaa vasteamplitudia (mV) retentioajan (s) funktiona. Kuvassa on esitetty biologisesti aktiivisten yhdisteiden ominaisuudet ja vapautumisnopeudet (µg h-1). Yksi tähti (*) osoittaa johdonmukaista matalan amplitudin vastetta. Kaksi tähteä (**) osoittavat toistettavissa olevia vasteita. Etsi isäntä (H) ja verta imevä (I) An.arabiensis -lajilla on erilaisia ​​vetovoimatekijöitä tuoreen ja kypsytetyn lehmän virtsan tuoksujen synteettisiin sekoituksiin. Eri kirjainnimiin houkutelleiden hyttysten keskimääräiset osuudet erosivat merkittävästi toisistaan ​​(yksisuuntainen ANOVA käyttäen Tukeyn post hoc -analyysia; p < 0,05). Virhepalkit edustavat asteikon keskivirhettä.
Naaraspuolisilla Ann.arabiensis -kakaduilla, 72 ja 120 tuntia veriaterian jälkeen, kutuaikana, ei havaittu mieltymystä tuoreen ja kypsytetyn lehmän virtsan headspace-haihtuviin uutteisiin verrattuna pentaanikontrolleihin (χ2 = 3,07, p > 0,05; lisätiedosto 1: kuva S1).
Naaraspuolisilla Ann.arabiensis -lajilla GC-EAD- ja GC-MS-analyysit tunnistivat kahdeksan, kuusi, kolme ja kolme bioaktiivista yhdistettä (kuva 5D-G). Vaikka elektrofysiologisia vasteita aiheuttavien yhdisteiden määrässä havaittiin eroja, useimpia näistä yhdisteistä oli läsnä jokaisessa tuoreesta ja kypsytetystä virtsasta kerätyssä headspace-haihtuvassa uutteessa. Siksi jokaisesta uutteesta jatkoanalyyseihin sisällytettiin vain yhdisteet, jotka tuottivat naaraspuolisten tuntosarvien fysiologisen vasteen kynnysarvon yläpuolella.
Bioaktiivisten yhdisteiden haihtuvien yhdisteiden kokonaisvapautumisnopeus headspace-näytteessä nousi tuoreen virtsan 29 µg h-1:stä 242 µg h-1:een 168 tuntia kypsytetyssä virtsassa, pääasiassa p-kresolin ja m-formaldehydin vuoksi. Fenolin ja fenolin lisääntymisen vuoksi. Sitä vastoin muiden yhdisteiden, kuten 2-syklohekseen-1-onin ja dekanaalin, vapautumisnopeudet laskivat virtsan iän myötä, mikä korreloi havaitun signaalin intensiteetin (runsauden) vähenemisen kanssa kromatogrammissa (kuva 5D-G, vasen paneeli) ja näiden yhdisteiden fysiologisten vasteiden kanssa (kuva 5D-G, oikea paneeli).
Kaiken kaikkiaan synteettisellä seoksella oli samanlainen luonnollinen bioaktiivisten yhdisteiden suhde kuin tuoreen ja kypsytetyn virtsan headspacen haihtuvissa uutteissa (kuva 5D–G), eikä se näyttänyt herättävän merkittävää houkuttelevuutta isännän etsinnässä (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; kuva 5H) tai verta imevien hyttysten etsinnässä (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; kuva 5I). Käsittelyjen väliset post hoc -parittaiset vertailut osoittivat kuitenkin, että isäntää etsivät hyttyset olivat merkittävästi houkuttelevia 24 tuntia kypsytetyn virtsan synteettiselle seokselle verrattuna pentaanikontrolleihin (p = 0,0086; kuva 5H).
Yksittäisten komponenttien roolin arvioimiseksi 24 tuntia kypsytetyn virtsan synteettisissä seoksissa verrattiin kuutta subtraktiivista seosta täydellisiin seoksiin Y-putkimäärityksessä, jossa yksittäiset yhdisteet poistettiin. Isäntää etsivien hyttysten osalta yksittäisten yhdisteiden poistaminen täydellisestä seoksesta vaikutti merkittävästi käyttäytymisvasteisiin (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; lisätiedosto 1: kuva S2A), kaikki subtraktiiviset seokset olivat houkuttelevampia kuin pienemmät kuin täysin sekoitetut. Sitä vastoin yksittäisten yhdisteiden poistaminen täysin synteettisestä seoksesta ei vaikuttanut verta imevien hyttysten käyttäytymisvasteisiin (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), lukuun ottamatta dekanaalia, joka johti alhaisempiin tasoihin verrattuna täydelliseen seokseen (vetovoima) (p = 0,022; lisätiedosto 1: kuva S2B).
Etiopialaisessa malariaa levittävässä kylässä arvioitiin kymmenen yön ajan 24 tuntia liotetun lehmän virtsan synteettisen seoksen tehokkuutta hyttysten houkuttelemisessa kenttäolosuhteissa (kuva 6A). Yhteensä pyydystettiin ja tunnistettiin 4 861 hyttystä, joista 45,7 % oli Anthropus.gambiae sl, 18,9 % Anopheles pharoensis ja 35,4 % Culex spp. (Lisätiedosto 1: Taulukko S1). Anopheles arabinis on ainoa PCR-analyysillä tunnistettu An.Gambian-lajikompleksin jäsen. Keskimäärin pyydystettiin 320 hyttystä yössä, ja tänä aikana synteettisillä seossyöteillä varustetut ansat pyydystivät enemmän hyttysiä kuin parilliset ansat ilman seosta (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Syötittömät ansat asetettiin jokaiselle viidelle kontrolliyölle kokeen alussa, keskellä ja lopussa. Jokaisessa ansaparissa pyydystettiin samanlainen määrä hyttysiä. Tämä osoittaa, ettei talojen välillä ole vinoumaa (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) eikä populaatio laskenut tutkimusjakson aikana. Verrokkiloukkuihin verrattuna synteettistä seosta sisältäviin loukkuihin jääneiden hyttysten määrä oli merkittävästi lisääntynyt: isäntää etsivät hyttyset (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), äskettäinen verenotto (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) ja tiineys (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; lisätiedosto 1: taulukko S1). Tämä näkyy myös pyydettyjen hyttysten kokonaismäärässä: isäntää etsivät hyttyset > verta imevät hyttyset > tiineet > puolitineet > koiraat.
Kenttätutkimus 24 tuntia vaikuttavan synteettisen lehmän virtsan hajuseoksen tehokkuudesta. Kenttäkokeita tehtiin Etelä-Keski-Etiopiassa (kartta), lähellä Makin kaupunkia (lisäosa), käyttäen tautien torjuntakeskusten (CDC) valoansaa (oikealla) parillisissa taloissa, joissa oli latinalaisen neliön muotoinen rakenne (ilmakuva) (A). Synteettiset hajusyöteillä varustetut CDC-valoansat houkuttelevat ja pyydystävät Anopheles arabesques -naaraita (B), mutta eivät Anopheles farroes -hyttysiä (C), eri tavalla, fysiologisesta tilasta riippuvalla vaikutuksella. Lisäksi nämä ansat pyydystivät merkittävästi enemmän isäntähyttysiä Culex. (D) Verrattuna kontrolliin. Vasemmalla olevat palkit edustavat hajusyötti- (vihreä) ja kontrolli- (avoimet) ansapareissa pyydettyjen hyttysten keskimääräistä valintaindeksiä (N = 10), kun taas oikealla olevat palkit edustavat keskimääräistä valintaindeksiä kontrolliansapareissa (avoimet; N = 5). Asteriskit osoittavat tilastollisen merkitsevyyden tasoja (*p = 0,01 ja ***p < 0,0001).
Kolme lajia pyydystettiin eri tavoin synteettistä seosta sisältävissä loukuissa. Isännän (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), verenoton (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) ja tiineyden (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) perusteella .arabiensis jäi loukkuun synteettistä seosta vapauttavaan loukkuun (kuva 6B), kun taas aniinin määrässä ei ollut eroa. Eri fysiologisissa tiloissa olevia Pharoensis-hyönteisiä löydettiin (kuva 6C). Culex-hyönteisten kohdalla havaittiin vain merkittävä isäntiä etsivien hyttysten määrän kasvu synteettisellä seoksella syötetyissä loukuissa (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; kuva 6D) verrattuna kontrolliloukkuihin.
Etiopiassa lisääntymisalueiden ja maaseutuyhteisöjen välillä potentiaalisten isäntien ulkopuolella sijaitsevia isäntäsyöttiloukkuja käytettiin arvioimaan, käyttävätkö malariahyttyset lehmän virtsan hajua isäntäelinympäristön vihjeenä. Ilman isäntävihjeitä, lämpöä ja lehmän virtsan hajun läsnä ollessa tai ilman hyttysiä ei saatu pyydystettyä (lisätiedosto 1: kuva S3). Korkeassa lämpötilassa ja lehmän virtsan hajussa naaraspuolisia malariahyttysiä kuitenkin houkuteltiin ja pyydystettiin, vaikkakin pieninä määrinä, virtsan iästä riippumatta (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; lisätiedosto 1: kuva S3). Sitä vastoin vesikontrollit eivät saaneet pyydystettyä malariahyttysiä korkeissa lämpötiloissa (lisätiedosto 1: kuva S3).
Malariahyttyset hankkivat ja levittävät typpipitoisia yhdisteitä korvaavan ravinnonsaanti lehmän virtsalla (eli lätäköillä) parantaakseen elinkaariominaisuuksiaan, samalla tavalla kuin muut hyönteiset [2, 4, 24, 25, 26]. Lehmän virtsa on helposti saatavilla oleva uusiutuva luonnonvara, joka liittyy läheisesti malariavektorien levähdyspaikkoihin, kuten navetoihin ja korkeaan kasvillisuuteen maaseudun kotien ja kutualueiden lähellä. Naarashyttyset paikantavat tämän luonnonvaran hajun perusteella ja pystyvät säätelemään typpiyhdisteiden, mukaan lukien urean, virtsan tärkeimmän typpikomponentin, ottoa virtsaan [15, 16]. Naarashyttysen fysiologisesta tilasta riippuen virtsan ravinteet kohdentuvat parantamaan isäntää etsivien naarashyttysten lentoaktiivisuutta ja selviytymistä sekä verellä syötyjen yksilöiden selviytymis- ja lisääntymisominaisuuksia ensimmäisen gonadotrooppisen syklin aikana. Siksi virtsan sekoittamisella on tärkeä ravitsemuksellinen rooli malariavektoreille, jotka ovat suljettuja, kuten aliravitut aikuiset [8], koska se antaa naarashyttysille mahdollisuuden hankkia tärkeitä typpiyhdisteitä osallistumalla vähäriskiseen ruokailuun. Tällä löydöksellä on merkittäviä epidemiologisia seurauksia, koska naaraiden elinajanodote, aktiivisuus ja lisääntymiskyky pidentyvät. tuotos, jotka kaikki vaikuttavat vektorin kapasiteettiin. Lisäksi tämä käyttäytyminen voi olla tulevien vektorienhallintaohjelmien kohteena.