Pinagsasama ng pagkuha at pamamahagi ng sustansya ang mga katangian ng paghahanap ng pagkain ng insekto at kasaysayan ng buhay. Upang mapunan ang mga kakulangan sa mga partikular na sustansya sa iba't ibang yugto ng buhay, maaaring makuha ng mga insekto ang mga sustansyang ito sa pamamagitan ng karagdagang pagpapakain, halimbawa, sa pamamagitan ng pagkain sa mga sekresyon ng vertebrate sa isang prosesong kilala bilang mga puddles. Ang lamok na Anopheles arabiani ay tila kulang sa nutrisyon at, samakatuwid, ay nangangailangan ng mga sustansya para sa parehong metabolismo at reproduksyon. Ang layunin ng pag-aaral na ito ay upang masuri kung ang pag-alog ng An. arabiensis sa ihi ng baka para sa pagkuha ng sustansya ay nagpapabuti sa mga katangian ng kasaysayan ng buhay.
Siguraduhing ligtas ito. Ang arabiensis ay naakit sa amoy ng sariwa at lumaking ihi ng baka sa loob ng 24, 72, at 168 oras, at ang mga babaeng lamok na naghahanap ng host at pinakain ng dugo (48 oras pagkatapos kumain ng dugo) ay sinukat sa isang Y-tube olfactometer, at ang mga buntis na babae ay tinasa para sa spawning test. Isang pinagsamang kemikal at electrophysiological analysis ang ginamit upang matukoy ang mga bioactive compound sa ihi ng baka sa lahat ng apat na klase ng edad. Ang mga sintetikong halo ng mga bioactive compound ay sinuri sa mga Y-tube at field trial. Upang siyasatin ang ihi ng baka at ang pangunahing nitrogen-containing compound na urea bilang mga potensyal na supplemental diet para sa mga malaria vector, sinukat ang mga parameter ng pagpapakain at mga katangian ng life history. Ang proporsyon ng mga babaeng lamok at ang dami ng ihi ng baka at urea na nasipsip ay tinasa. Pagkatapos pakainin, ang mga babae ay tinasa para sa survival, tethered flight, at reproduction.
Hanapin ang dugo at pagkain ng host. Sa mga pag-aaral sa laboratoryo at larangan, ang mga Arabo ay naaakit sa natural at sintetikong amoy ng sariwa at lumang ihi ng baka. Ang mga buntis na babae ay walang pakialam sa mga tugon ng ihi ng baka sa mga lugar ng pangingitlog. Ang mga babaeng naghahanap ng host at sumisipsip ng dugo ay aktibong sumisipsip ng ihi ng baka at urea at inilalaan ang mga mapagkukunang ito ayon sa mga trade-off sa kasaysayan ng buhay bilang isang function ng pisyolohikal na estado para sa paglipad, kaligtasan, o pagpaparami.
Ang pagkuha at pamamahagi ng ihi ng baka ng Anopheles arabinis para sa pinahusay na mga katangian ng kasaysayan ng buhay. Ang karagdagang pagpapakain ng ihi ng baka ay direktang nakakaapekto sa kapasidad ng vector sa pamamagitan ng pagtaas ng pang-araw-araw na kaligtasan at densidad ng vector, at hindi direkta sa pamamagitan ng pagbabago sa aktibidad ng paglipad at samakatuwid ay dapat isaalang-alang sa mga modelo sa hinaharap.
Ang pagkuha at pamamahagi ng sustansya ay nagsasama ng mga katangian ng paghahanap ng pagkain at kasaysayan ng buhay ng insekto [1,2,3]. Ang mga insekto ay nakakapili at nakakakuha ng pagkain at nagsasagawa ng compensatory feeding batay sa pagkakaroon ng pagkain at mga kinakailangan sa sustansya [1, 3]. Ang pamamahagi ng mga sustansya ay nakasalalay sa proseso ng kasaysayan ng buhay at maaaring humantong sa iba't ibang mga kinakailangan para sa kalidad at dami ng diyeta sa iba't ibang yugto ng buhay ng mga insekto [1, 2]. Upang mabawi ang mga kakulangan sa mga partikular na sustansya, maaaring makuha ng mga insekto ang mga sustansya na ito sa pamamagitan ng supplemental feeding, tulad ng sa putik, iba't ibang dumi at mga sekresyon ng mga vertebrate, at carrion, isang prosesong kilala bilang mga puddle [2]. Bagama't pangunahing inilalarawan ang iba't ibang uri ng paru-paro at gamu-gamo, ang mga watering hole ay nangyayari rin sa iba pang mga order ng insekto, at ang pag-akit at pagkain sa mga ganitong uri ng mapagkukunan ay maaaring magkaroon ng makabuluhang epekto sa kalusugan at iba pang mga katangian ng kasaysayan ng buhay [2, 4, 5, 6],7]. Ang lamok na may malaria na Anopheles gambiae sensu lato (sl) ay lumilitaw bilang isang 'malnourished' na nasa hustong gulang [8], kaya ang pagdidilig ay maaaring gumanap ng mahalagang papel sa mga katangian ng kasaysayan ng buhay nito, ngunit ang pag-uugaling ito ay napabayaan sa ngayon. Ang paggamit ng pag-aalog bilang isang paraan ng pagdaragdag ng paggamit ng sustansya sa mahalagang sangkap na ito ay nararapat pansinin dahil maaaring magkaroon ito ng mahahalagang epekto sa epidemiolohiya.
Limitado ang paggamit ng nitrogen sa mga babaeng lamok na Anopheles na nasa hustong gulang dahil sa mababang reserbang calorie na dala mula sa yugto ng larva at hindi mahusay na paggamit ng blood meal [9]. Karaniwang binabawi ito ng babaeng Ann.gambiae sl sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga supplemental blood meal [10, 11], sa gayon ay mas maraming tao ang nasa panganib na mahawaan ng sakit at mas malaki ang panganib ng pagkalat ng mga lamok. Bilang kahalili, maaaring gamitin ng mga lamok ang supplemental feeding ng dumi ng vertebrate upang makakuha ng mga nitrogenous compound na nagpapahusay sa adaptasyon at kakayahang lumipad, tulad ng ipinakita ng ibang mga insekto [2]. Kaugnay nito, ang malakas at natatanging atraksyon ng isa sa mga kapatid na species sa loob ng An. Ang Gambian sl species complex, ang Anopheles arabinis, ang sariwa at lumang ihi ng baka [12,13,14], ay kawili-wili. Ang Anopheles arabinis ay oportunistiko sa mga kagustuhan ng host nito at kilalang nakikipag-ugnayan at kumakain sa mga baka. Ang ihi ng baka ay isang mapagkukunan na mayaman sa nitrogenous compound, kung saan ang urea ay bumubuo ng 50-95% ng kabuuang nitrogen sa sariwang ihi [15, 16]. Habang tumatanda ang ihi ng baka, ginagamit ng mga mikroorganismo ang mga mapagkukunang ito upang mabawasan ang pagiging kumplikado ng mga nitrogenous compound sa loob ng 24 na oras [15]. Dahil sa mabilis na pagtaas ng ammonia, na nauugnay sa pagbaba ng organic nitrogen, ang mga alkalophilic microorganism (na marami sa mga ito ay gumagawa ng mga compound na nakalalason sa mga lamok) ay nabubuhay [15], na maaaring ang babaeng Ann.arabiensis ay mas naaakit sa ihi na may edad na 24 oras o mas mababa pa [13, 14].
Sa pag-aaral na ito, hinanap ang mga An na pinapakain ng host at dugo. Sa unang siklo ng gonadotropin nito, sinuri ang arabiensis para sa pagkuha ng mga nitrogenous compound, kabilang ang urea, sa pamamagitan ng paghahalo ng ihi. Sumunod, isang serye ng mga eksperimento ang isinagawa upang masuri kung paano inilalaan ng mga babaeng lamok ang potensyal na mapagkukunang sustansya para sa pinabuting kaligtasan, reproduksyon at karagdagang paghahanap ng pagkain. Panghuli, sinuri ang amoy ng sariwa at lumang ihi ng baka upang matukoy kung ang mga ito ay nagbigay ng maaasahang mga pahiwatig para sa An na pinapakain ng host at dugo. Sa kanilang paghahanap para sa potensyal na mapagkukunang sustansya na ito, natuklasan ng arabiensis ang mga ugnayan ng kemikal sa likod ng naobserbahang pagkakaiba-iba ng pagiging kaakit-akit. Ang mga sintetikong halo ng amoy ng mga volatile organic compound (VOC) na natukoy sa 24-oras na lumang ihi ay higit pang sinuri sa ilalim ng mga kondisyon sa bukid, na nagpapalawak sa mga resultang nakuha sa ilalim ng mga kondisyon sa laboratoryo at nagpapakita ng epekto ng amoy ng ihi ng baka sa iba't ibang mga estado ng pisyolohikal. Pag-akit sa lamok. Kinukumpirma ng mga resultang nakuha na ang An. arabiensis ay nakakakuha at namamahagi ng mga nitrogenous compound na matatagpuan sa ihi ng vertebrate upang maimpluwensyahan ang mga katangian ng kasaysayan ng buhay. Ang mga resultang ito ay tinalakay sa konteksto ng mga potensyal na kahihinatnan ng epidemiolohiya at kung paano ito magagamit para sa pagsubaybay at pagkontrol ng vector.
Ang mga Anopheles arabicans (Dongola strain) ay pinanatili sa 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH at 12:12 oras na light-dark cycle. Ang mga larvae ay pinalaki sa mga plastik na tray (20 cm × 18 cm × 7 cm) na nilagyan ng distilled water at pinakain ng Tetramin® fish food (Tetra Werke, Melle, DE). Ang mga pupa ay kinolekta sa 30 ml na tasa (Nolato Hertila, Åstorp, SE) at pagkatapos ay inilipat sa mga kulungan ng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) upang payagan ang paglabas ng mga nasa hustong gulang. Ang mga nasa hustong gulang ay binigyan ng 10% sucrose solution ad libitum hanggang 4 na araw pagkatapos ng paglabas (dpe), kung saan ang mga babaeng naghahanap ng host ay binigyan ng diyeta bago ang eksperimento, o pinakain ng distilled water magdamag bago ang eksperimento, gaya ng inilarawan sa ibaba. Ang mga babaeng ginamit para sa mga eksperimento sa flight tube ay pinakain lamang ng 4-6 na oras. gamit ang tubig ad libitum. Upang ihanda ang mga lamok na sumisipsip ng dugo para sa mga kasunod na bioassay, 4 na babaeng dpe ang binigyan ng defibrotic na dugo ng tupa (Håtunalab, Bro, SE) gamit ang isang membrane feeding system (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Ang mga babaeng ganap na siksikan ay inilipat sa mga indibidwal na kulungan at direktang binigyan ng diyeta, gaya ng inilarawan sa ibaba, o 10% sucrose ad libitum sa loob ng 3 araw bago ang mga eksperimentong inilarawan sa ibaba. Ang mga huling nabanggit na babae ay ginamit para sa mga flight tube bioassay at inilipat sa laboratoryo, at pagkatapos ay uminom ng distilled water ad libitum sa loob ng 4-6 na oras bago ang eksperimento.
Ginamit ang mga feeding assay upang masukat ang pagkonsumo ng ihi at urea sa nasa hustong gulang na babaeng An-Arab. Ang mga babaeng naghahanap ng host at pinakain ng dugo ay binigyan ng diyeta na naglalaman ng 1% diluted na sariwa at lumang ihi ng baka, iba't ibang konsentrasyon ng urea, at dalawang kontrol (10% sucrose at tubig) sa loob ng 48 oras. Bilang karagdagan, ang food coloring (1 mg ml-1 xylene cyanide FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ay idinagdag sa diyeta at ibinigay sa isang 4 × 4 matrix sa 250 µl microcentrifuge tubes (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Figure 1A) Punan hanggang sa gilid (~300 µl). Upang maiwasan ang kompetisyon sa pagitan ng mga lamok at mga potensyal na epekto ng kulay ng tina, ilagay ang 10 lamok sa isang malaking Petri dish (12 cm ang diyametro at 6 cm ang taas; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figure 1A) sa ganap na kadiliman sa 25 ± 2 cm °C at 65 ± 5% relative humidity. Ang mga eksperimentong ito ay inulit nang 5 hanggang 10 beses. Pagkatapos malantad sa pagkain, ang mga lamok ay inilagay sa -20 °C hanggang sa karagdagang pagsusuri.
Hanapin ang ihi ng baka at urea na hinihigop ng babaeng Anopheles arabianus na may host at sumisipsip ng dugo. Sa pagsubok sa pagpapakain (A), ang mga babaeng lamok ay binigyan ng diyeta na binubuo ng sariwa at lumang ihi ng baka, iba't ibang konsentrasyon ng urea, sucrose (10%), at distilled water (H2O). Ang mga babaeng lamok na naghahanap ng host (B) at pinapakain ng dugo (C) ay sumisipsip ng mas maraming sucrose kaysa sa anumang iba pang diyeta na sinubukan. Tandaan na ang mga babaeng naghahanap ng host ay sumisipsip ng 72-oras na ihi ng baka na mas mababa sa 168-oras na ihi ng baka (B). Ang mean total nitrogen content (± standard deviation) ng ihi ay kinakatawan sa inset. Ang mga babaeng naghahanap ng host (D, F) at sumisipsip ng dugo (E, G) ay kumukuha ng urea sa paraang dose-dependent. Ang mean inhaled volumes (D, E) na may iba't ibang pangalan ng letra ay makabuluhang naiiba sa isa't isa (one-way ANOVA gamit ang post hoc analysis ni Tukey; p < 0.05). Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard error ng mean (BE). Ang tuwid na gitling na linya ay kumakatawan sa log-linear regression line (F, G)
Para mailabas ang nasipsip na pagkain, ang mga lamok ay isa-isang inilagay sa 1.5 ml na microcentrifuge tubes na naglalaman ng 230 µl ng distilled water at ang tissue ay pinagalaw gamit ang disposable pestle at cordless motor (VWR International, Lund, SE), na sinundan ng centrifugation sa 10 krpm sa loob ng 10 minuto. Ang supernatant (200 µl) ay inilipat sa isang 96-well microplate (Sigma-Aldrich) at ang absorbance (λ620) ay natukoy gamit ang isang spectrophotometer-based microplate reader (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Bilang alternatibo, ang mga lamok ay giniling sa 1 ml ng distilled water, 900 µl nito ay inilipat sa isang cuvette para sa spectrophotometric analysis (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Para masukat ang dietary intake, isang standard curve ang inihanda sa pamamagitan ng serial dilution upang magbunga ng 0.2 µl hanggang 2.4 µl ng 1. mg ml-1 xylene cyanide. Pagkatapos, ginamit ang optical density ng mga kilalang konsentrasyon ng dye upang matukoy ang dami ng pagkain na nakain ng bawat lamok.
Sinuri ang datos ng volume gamit ang one-way analysis of variance (ANOVA) na sinundan ng post hoc pairwise comparisons ni Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Inilarawan ng mga linear regression analyses ang concentration-dependent urea intake at inihambing ang mga tugon sa pagitan ng mga lamok na naghahanap ng host at sumisipsip ng dugo (GraphPad Prism v8.0.0 para sa Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Humigit-kumulang 20 µl ng mga sample ng ihi mula sa bawat pangkat ng edad ang itinali sa Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) at inilagay sa mga lata na kapsula (8 mm × 5 mm). Ang mga kapsula ay ipinasok sa silid ng pagkasunog ng isang CHNS/O analyzer (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) upang matukoy ang nilalaman ng nitrogen sa sariwa at lumang ihi ayon sa protocol ng tagagawa. Ang kabuuang nitrogen (g N l-1) ay tinantiya batay sa mga kilalang konsentrasyon ng urea na ginamit bilang pamantayan.
Upang masuri ang epekto ng diyeta sa kaligtasan ng babaeng naghahanap ng host at sumisipsip ng dugo, ang mga lamok ay isa-isang inilagay sa malalaking Petri dish (12 cm ang diyametro at 6 cm ang taas; Semadeni) na may butas na natatakpan ng mesh sa takip (3 cm ang diyametro) na may Para sa bentilasyon at suplay ng pagkain. Ang mga diyeta ay ibinigay kaagad pagkatapos ng 4 na dpe at kasama ang 1% diluted na sariwa at luma na ihi ng baka, apat na konsentrasyon ng urea, at dalawang kontrol, 10% sucrose at tubig. Ang bawat diyeta ay itinurok sa isang dental tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) na ipinasok sa isang 5 ml na hiringgilya (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), tinanggal ang plunger, at inilagay sa ibabaw ng isang petri dish (figure 1).1A).Baguhin ang iyong diyeta araw-araw.Panatilihin ang lab gaya ng inilarawan sa itaas.Ang mga natitirang lamok ay binilang dalawang beses sa isang araw, habang ang mga patay na lamok ay itinapon hanggang sa mamatay ang huling lamok (n = 40 bawat paggamot).Ang kaligtasan ng mga lamok na pinakain ng iba't ibang diyeta ay sinuri sa istatistika gamit ang mga survival curve ng Kaplan-Meyer at mga pagsubok na log-rank upang ihambing ang mga paghahambing ng distribusyon ng kaligtasan sa pagitan ng mga diyeta (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Isang pasadyang gilingan para sa paglipad ng lamok batay kay Attisano et al.[17], na gawa sa 5 mm na kapal na malinaw na acrylic panel (10 cm ang lapad x 10 cm ang haba x 10 cm ang taas) na walang mga panel sa harap at likuran (Larawan 3: itaas). Isang pivot assembly na may patayong tubo na gawa sa gas chromatography column (0.25 mm id; 7.5 cm L) na ang mga dulo ay nakadikit sa isang karayom ​​ng insekto na nakasabit sa pagitan ng isang pares ng neodymium magnet na may 9 cm ang pagitan. Isang pahalang na tubo na gawa sa parehong materyal (6.5 cm L) ang humati sa patayong tubo upang bumuo ng isang nakatali na braso at isang braso na nagdadala ng isang maliit na piraso ng aluminum foil bilang isang signal na pumipigil sa liwanag.
Ang mga babaeng lamok na pinagutom nang 24 oras ay binigyan ng nabanggit na diyeta sa loob ng 30 minuto bago ang pagpigil. Ang mga babaeng lamok na pinakain nang buo ay isa-isang binigyan ng pampamanhid sa yelo sa loob ng 2-3 minuto at ikinabit sa mga pin ng insekto gamit ang beeswax (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) at pagkatapos ay itinali sa mga braso ng pahalang na tubo. Flying Mill. Ang mga rebolusyon bawat paglipad ay naitala ng isang custom-built na data logger, pagkatapos ay iniimbak at ipinakita gamit ang PC-Lab 2000™ software (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Ang flight mill ay inilagay sa isang silid na kinokontrol ang klima (12 oras:12 oras, maliwanag: madilim, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Upang mailarawan ang padron ng aktibidad sa paglipad, ang kabuuang distansyang nilipad (m) at ang kabuuang bilang ng magkakasunod na aktibidad sa paglipad ay kinalkula bawat oras sa loob ng 24 na oras. Bilang karagdagan, ang karaniwang distansyang nilipad ng mga indibidwal na babae ay inihambing sa iba't ibang paggamot at sinuri gamit ang one-way ANOVA at post hoc analysis ni Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kung saan ang karaniwang distansya ay itinuturing na isang dependent variable, habang ang paggamot ay isang independent factor. Bukod pa rito, ang karaniwang bilang ng mga round ay kinalkula sa 10 minutong palugit.
Upang masuri ang epekto ng diyeta sa pagganap ng reproduktibo ng An.arabiensis, anim na babae (4 na dpe) ang direktang inilipat sa mga kulungan ng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) pagkatapos ng pagkolekta ng dugo at pagkatapos ay binigyan ng eksperimental na diyeta sa loob ng 48 oras gaya ng inilarawan sa itaas. Pagkatapos ay tinanggal ang mga diyeta at ang mga spawning cup (30 ml; Nolato Hertila) na puno ng 20 ml ng distilled water ay ibinigay sa ikatlong araw sa loob ng 48 oras, na pinapalitan bawat 24 oras. Ulitin ang bawat dietary regimen nang 20-50 beses. Ang mga itlog ay binilang at itinala para sa bawat eksperimental na kulungan. Ang mga subsample ng mga itlog ay ginamit upang masuri ang mean size at haba ng pagkakaiba-iba ng mga indibidwal na itlog (n ≥ 200 bawat diyeta) gamit ang isang Dialux-20 microscope (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) na nilagyan ng Leica Camera (DFC) 320 R2; (Leica Microsystems Ltd., DE). Ang mga natitirang itlog ay itinago sa isang silid na kontrolado ang klima sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon ng pag-aalaga sa loob ng 24 na oras, at isang subsample ng mga bagong lumitaw na larvae ng unang instar (n ≥ 200 bawat diyeta) ang sinukat, gaya ng inilarawan sa itaas. Ang bilang ng mga itlog at ang laki ng mga itlog at larvae ay inihambing sa pagitan ng mga paggamot at gamit ang one-way ANOVA at post hoc analysis ni Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Ang mga headspace volatile mula sa sariwa (1 oras pagkatapos ng sampling), 24 oras, 72 oras at 168 oras na gulang na ihi ay kinolekta mula sa mga sample na nakolekta mula sa mga bakang Zebu, mga lahing Arsi. Para sa kaginhawahan, ang mga sample ng ihi ay kinolekta nang maaga sa umaga habang ang mga baka ay nasa kamalig pa rin. Ang mga sample ng ihi ay kinolekta mula sa 10 indibidwal at 100-200 ml ng bawat sample ay inilipat sa mga indibidwal na polyamide baking bag (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) sa 3 litrong polyamide na may takip sa mga plastik na drum na vinyl chloride. Ang mga headspace volatile mula sa bawat sample ng ihi ng baka ay kinolekta nang direkta (sariwa) o pagkatapos ng pagkahinog sa temperatura ng silid sa loob ng 24 oras, 72 oras at 168 oras, ibig sabihin, ang bawat sample ng ihi ay kumakatawan sa bawat pangkat ng edad.
Para sa pangongolekta ng mga headspace volatiles, isang closed-loop system ang ginamit upang i-circulate ang isang activated carbon-filtered gas stream (100 ml min-1) sa pamamagitan ng isang polyamide bag patungo sa adsorption column sa loob ng 2.5 oras gamit ang diaphragm vacuum pump (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Bilang kontrol, ang pangongolekta ng headspace ay isinagawa mula sa isang walang laman na polyamide bag. Ang adsorption column ay gawa sa Teflon tubing (5.5 cm x 3 mm id) na naglalaman ng 35 mg ng Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) sa pagitan ng mga glass wool plug. Bago gamitin, ang column ay hinugasan gamit ang 1 ml redistilled n-hexane (Merck, Darmstadt, DE) at 1 ml pentane (99.0% pure solvent GC grade, Sigma Aldrich). Ang mga adsorbed volatiles ay ni-elute gamit ang 400 μl ng pentane. Ang mga pangongolekta ng headspace ay pinagsama-sama at pagkatapos ay iniimbak sa -20°C hanggang sa magamit para sa karagdagang pagsusuri.
Ang mga tugon sa pag-uugali ng mga naghahanap ng host at kumakain ng dugo na An. Ang mga headspace volatile extract na nakolekta mula sa sariwa, 24-oras, 72-oras, at 168-oras na ihi ay sinuri para sa mga volatile extract mula sa mga lamok na Arabidopsis gamit ang isang tuwid na glass tube olfactometer [18]. Ang mga eksperimento ay isinagawa noong ZT 13-15, ang pinakamataas na panahon ng aktibidad ni An sa paghahanap ng bahay. Arab [19]. Ang isang glass tube olfactometer (80 cm × 9.5 cm id) ay inilawan ng 3 ± 1 lx ng pulang ilaw mula sa itaas. Ang sinala at pinabasang daloy ng hangin na uling (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relative humidity) ay nakapasa sa bioassay sa 30 cm s-1. Ang hangin ay pinadaan sa isang serye ng mga stainless steel mesh screen, na lumilikha ng isang laminar flow at isang pare-parehong istruktura ng plume. Dental tampon dispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), na nakasabit mula sa isang 5 cm coil sa windward end ng olfactometer, na may mga pagpapalit ng stimulator kada 5 minuto. Para sa pagsusuri, 10 μl ng bawat headspace extract, na diluted 1:10, ang ginamit bilang stimulus. Isang pantay na dami ng pentane ang ginamit bilang kontrol. Ang mga indibidwal na lamok na naghahanap ng host o sumisipsip ng dugo ay inilagay sa mga indibidwal na release cage 2-3 oras bago magsimula ang eksperimento. Ang release cage ay inilagay sa downwind side ng olfactometer, at ang mga lamok ay hinayaan na mag-acclimate sa loob ng 1 minuto, at pagkatapos ay binuksan ang butterfly valve ng cage upang makalabas. Ang atraksyon sa paggamot o kontrol ay sinuri bilang ang proporsyon ng mga lamok na nakipag-ugnayan sa pinagmulan sa loob ng 5 minuto ng paglabas. Ang bawat headspace volatile extract at kontrol ay kinopya nang hindi bababa sa 30 beses, at upang maiwasan ang mga epekto ng anumang isang araw, ang parehong bilang ng mga paggamot at kontrol ay sinubukan sa bawat araw ng eksperimento. Mga tugon ng paghahanap mula sa host at mga taong pinapakain ng dugo. Ang mga set ng Arabic laban sa headspace ay sinuri gamit ang nominal logistic regression na sinundan ng pairwise comparisons para sa odd ratios (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Tugon ni An sa pangingitlog. Ang mga katas ng headspace mula sa sariwa at matatandang ihi ng baka ay sinuri sa mga kulungan ng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Ang mga plastik na tasa (30 mL; Nolato Hertila) na puno ng 20 mL ng distilled water ang nagbigay ng substrate para sa pangingitlog at inilagay sa magkabilang sulok ng kulungan, na may pagitan na 24 cm. Ang mga treatment cup ay inayos gamit ang 10 μl ng bawat headspace extract sa 1:10 dilution. Isang pantay na dami ng pentane ang ginamit upang ayusin ang control cup. Ang mga treatment cup at control cup ay ipinagpalit sa pagitan ng bawat eksperimento upang makontrol ang mga epekto ng posisyon. Sampung babaeng pinapakain ng dugo ang pinakawalan sa mga experimental cage sa ZT 9-11 at ang mga itlog sa mga tasa ay binilang pagkalipas ng 24 oras. Ang pormula para sa pagkalkula ng spawning index ay: (ang bilang ng mga itlog na nangitlog sa treatment cup – ang bilang ng mga itlog na nangitlog sa control cup)/(ang kabuuang bilang ng mga itlog na nangitlog). Ang bawat treatment ay inulit nang 8 beses.
Ang pagsusuri ng gas chromatographic at electron antenna pattern detection (GC-EAD) ng babaeng An.arabiensis ay isinagawa gaya ng naunang inilarawan [20]. Sa madaling salita, ang mga sariwang headspace volatile extract ay pinaghiwalay gamit ang isang Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) na nilagyan ng HP-5 column (30 m × 0.25 mm id, 0.25 μm film thickness, Agilent Technologies). at tumatandang ihi. Ginamit ang hydrogen bilang mobile phase na may average linear flow rate na 45 cm s-1. Ang bawat sample (2 μl) ay ini-inject sa loob ng 30 segundo sa splitless mode na may inlet temperature na 225 °C. Ang temperatura ng GC oven ay na-program mula 35 °C (3 minutong hold) hanggang 300 °C (10 minutong hold) sa 10 °C min-1. Sa GC effluent splitter, 4 psi ng nitrogen ang idinagdag at hinati nang 1:1 sa isang Gerstel 3D/2 low dead volume cross (Gerstel, Mülheim, DE) sa pagitan ng flame ionization detector at ng EAD. Ang GC effluent capillary para sa EAD ay pinadaan sa isang Gerstel ODP-2 transfer line, na sumusubaybay sa temperatura ng GC oven kasama ang 5 °C, papunta sa isang glass tube (10 cm × 8 mm), kung saan ito ay hinaluan ng carbon-filtered, humidified air (1.5 l min−1). Ang antenna ay inilagay 0.5 cm mula sa labasan ng tubo. Ang bawat indibidwal na lamok ay bumubuo ng isang replika, at para sa mga lamok na naghahanap ng host, hindi bababa sa tatlong replika ang isinagawa sa mga sample ng ihi ng bawat edad.
Pagtukoy sa mga bioactive compound sa mga koleksyon ng headspace ng sariwa at lumang ihi ng baka gamit ang pinagsamang GC at mass spectrometer (GC-MS; 6890 GC at 5975 MS; Agilent Technologies) upang makakuha ng mga tugon sa antenna sa pagsusuri ng GC-EAD, na tumatakbo sa electron impact ionization mode sa 70 eV. Ang GC ay nilagyan ng HP-5MS UI-coated fused silica capillary column (60 m × 0.25 mm inner diameter, 0.25 μm film thickness) gamit ang helium bilang mobile phase na may average linear flow rate na 35 cm s-1. Isang 2 μl sample ang iniksyon gamit ang parehong mga setting ng injector at temperatura ng oven gaya ng para sa pagsusuri ng GC-EAD. Ang mga compound ay kinilala batay sa kanilang retention time (Kovát index) at mass spectra kumpara sa custom library at sa NIST14 library (Agilent). Ang mga natukoy na compound ay kinumpirma sa pamamagitan ng pag-iniksyon ng mga tunay na pamantayan (Karagdagang File 1: Table S2). Para sa quantification, heptyl acetate (10 ng, 99.8% kemikal na kadalisayan, Aldrich) ay itinurok bilang panlabas na pamantayan.
Pagsusuri sa bisa ng isang sintetikong pinaghalong amoy na binubuo ng mga bioactive compound na natukoy sa sariwa at lumang ihi upang maakit ang host-seeking at blood-suffosing na Ans.arabiensis, gamit ang parehong olfactometer at protocol gaya ng nasa itaas. Ginaya ng mga sintetikong pinaghalong ang komposisyon at proporsyon ng mga compound sa pinaghalong headspace volatile extracts ng sariwa, 24-oras, 48-oras, 72-oras, at 168-oras na lumang ihi (Figure 5D-G; Karagdagang File 1: Table S2). Para sa pagsusuri, gumamit ng 10 μl ng 1:100 dilution ng ganap na sintetikong pinaghalong, na may pangkalahatang release rate na mula humigit-kumulang 140-2400 ng h-1, para sa pagtatasa ng pagiging kaakit-akit sa host at mga lamok na sumisipsip ng dugo. Pagkatapos, isinasagawa ang pagsubok sa kumpletong mga pinaghalong, kung saan inaalis ang mga subtractive mixture ng mga single compound ng kumpletong pinaghalong. Seek responses mula sa host at blood-fed Ans. Ang Arab vs synthetic at subtractive mixtures ay sinuri gamit ang nominal logistic regression na sinundan ng pairwise comparisons para sa odd ratios. (JMP Pro, bersyon 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Upang masuri kung ang ihi ng baka ay maaaring magsilbing hudyat sa tirahan ng mga lamok na may malaria, ang sariwa at matatandang ihi ng baka, na kinolekta gaya ng inilarawan sa itaas, at tubig ay inilagay sa mga naka-mesh na 3 litrong balde (100 ml) at inilagay sa mga pain trap ng host. (BG-HDT na bersyon; BioGents, Regensburg, DE). Sampung patibong ang inilagay nang 50 m ang layo sa pastulan, 400 m mula sa komunidad ng nayon (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) at walang baka, sa mga permanenteng lugar ng pag-aanak at mga nayon. Limang patibong ang pinainit upang gayahin ang presensya ng isang host, habang limang patibong ang hindi pinainit. Ang bawat lokasyon ng paggamot ay iniikot gabi-gabi sa loob ng kabuuang limang gabi. Ang bilang ng lamok na nahuli sa mga paing ihi na may iba't ibang edad ay inihambing gamit ang logistic regression na may beta binomial distribution (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Sa isang nayon na endemic ang malaria malapit sa bayan ng Maki, rehiyon ng Oromia, Ethiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figure 6A). Isinagawa ang pag-aaral sa pagitan ng kalagitnaan ng Agosto at kalagitnaan ng Setyembre bago ang taunang indoor residual spraying, kasama ang mahabang tag-ulan. Limang pares ng bahay (20–50 m ang layo) na matatagpuan sa labas ng nayon ang napili para sa pag-aaral (Fig. 6A). Ang mga pamantayang ginamit sa pagpili ng mga bahay ay: walang mga hayop na pinapayagan sa loob ng bahay, walang pagluluto sa loob ng bahay (gumuguhit ng panggatong o uling) ang pinapayagan (kahit man lang sa panahon ng pagsubok), at mga bahay na may maximum na dalawang naninirahan, na natutulog sa mga walang insecticide. sa ilalim ng ginamot na kulambo. Ang etikal na pag-apruba ay ipinagkaloob ng Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) ng Faculty of Natural Sciences (CNS-IRB), Addis Ababa University, alinsunod sa mga alituntuning itinatag ng World Medical Association Declaration of Helsinki. Ang pahintulot mula sa bawat pinuno ng sambahayan ay nakuha sa tulong ng mga kawani ng health extension. Ang buong proseso ay inendorso ng mga lokal na administrasyon sa antas ng distrito at ward ('kebele'). Ang disenyo ng eksperimento ay sumunod sa isang 2 × 2 Latin square na disenyo, kung saan ang mga sintetikong halo at kontrol ay itinalaga sa mga pares na bahay sa unang gabi at nagpalitan sa pagitan ng mga bahay sa susunod na gabi ng eksperimento. Ang prosesong ito ay inulit ng sampung beses. Bukod pa rito, upang matantya ang aktibidad ng lamok sa mga piling bahay, ang mga CDC trap ay itinakda upang tumakbo ng limang magkakasunod na gabi sa simula, gitna at katapusan ng field trial sa parehong oras ng araw.
Isang sintetikong timpla na naglalaman ng anim na bioactive compound ang tinunaw sa heptane (97.0% solvent GC grade, Sigma Aldrich) at inilabas sa 140 ng h-1 gamit ang isang cotton wick dispenser [20]. Ang wick dispenser ay nagpahintulot sa lahat ng compound na mailabas sa pare-parehong proporsyon sa buong 12 oras na eksperimento. Ginamit ang heptane bilang kontrol. Ang vial ay nakasabit sa tabi ng entry point ng Centers for Disease Control and Prevention (CDC) light trap (John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; Figure 6A). Ang mga trap ay isinabit sa taas na 0.8 – 1 m mula sa lupa, malapit sa paanan ng kama, at isang boluntaryo ang natulog sa ilalim ng hindi ginagamot na kulambo at inoperahan sa pagitan ng 6:00 at 6:30. Ang mga lamok na nahuli ayon sa kasarian at pisyolohikal na katayuan (hindi pinakain, pinakain, semi-buntis, at buntis [21] ay sinuri gamit ang polymerase chain reaction (PCR) analysis upang matukoy ang species na morphologically natukoy bilang A. gambiae sl. Mga miyembro ng complex [23]. Sa field Sa isang pag-aaral, ang trap trap ng mga pares na bahay ay sinuri gamit ang isang nominal logistic fit model, kung saan ang atraksyon ang dependent variable at ang treatment (synthetic mixture vs control) ang fixed effect (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Dito, iniuulat namin ang χ2 at p-values ​​​​mula sa likelihood ratio test.
Suriin kung ligtas ito. Nakuha ng arabiensis ang ihi, ang pangunahing pinagmumulan ng nitroheno nito, ang urea, sa pamamagitan ng direktang pagpapakain, sa loob ng 48 oras ng pagbibigay sa loob ng 4 na araw pagkatapos ng (dpe) mga pagsubok sa pagpapakain sa babaeng naghahanap ng host at nagpapakain ng dugo (Fig. 1A). Ang parehong babaeng naghahanap ng host at sumisipsip ng dugo ay nakasipsip ng mas maraming sucrose kaysa sa anumang iba pang diyeta o tubig (F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 at F(5,299) = 56.00, p < 0.0001, ayon sa pagkakabanggit; Fig. 1B,C). Bukod pa rito, ang mga babaeng naghahanap ng host ay kumain ng mas kaunti sa ihi sa loob ng 72 oras kumpara sa ihi sa loob ng 168 oras (Fig. 1B). Nang inalok ng diyeta na naglalaman ng urea, ang mga babaeng naghahanap ng host ay nakasipsip ng mas malaking dami ng urea sa 2.69 mM kumpara sa lahat ng iba pang konsentrasyon at tubig, habang hindi maiiba sa 10% sucrose (F(10,813) = 15.72, p < 0.0001; Figure 1D). Ito ay kabaligtaran ng tugon ng mga babaeng pinapakain ng dugo, na karaniwang sumisipsip ng mas maraming diyeta na naglalaman ng urea kaysa sa tubig, bagama't mas mababa sa 10% sucrose (F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; Figure 1).1E). Bukod pa rito, kapag inihambing sa pagitan ng dalawang pisyolohikal na estado, ang mga babaeng may phlebotomy ay sumisipsip ng mas maraming urea kaysa sa mga babaeng naghahanap ng host sa pinakamababang konsentrasyon, at ang mga babaeng ito ay sumisipsip ng magkatulad na dami ng urea sa mas mataas na konsentrasyon (F(1,953)= 78.82, p < 0.0001; Fig. 1F, G). Bagama't ang pag-inom mula sa diyeta na naglalaman ng urea ay tila may pinakamainam na mga halaga (Fig. 1D,E), ang mga babae sa parehong pisyolohikal na estado ay nagawang baguhin ang dami ng urea na sinisipsip sa buong saklaw ng mga konsentrasyon ng urea sa isang log-linear na paraan (Fig. 1F,G). Gayundin, lumilitaw na kinokontrol ng mga lamok ang kanilang pagsipsip ng nitroheno sa pamamagitan ng pag-regulate sa dami ng nasisipsip na ihi, dahil ang dami ng nitroheno sa ihi ay makikita sa dami ng nasisipsip (Mga inset ng Larawan 1B, C at B).
Upang masuri ang mga epekto ng ihi at urea sa kaligtasan ng mga lamok na naghahanap ng host at sumisipsip ng dugo, ang mga babae ay pinakain ng ihi ng lahat ng apat na edad (sariwa, 24 oras, 72 oras, at 168 oras pagkatapos ng pagdeposito) at isang hanay ng mga konsentrasyon ng urea, pati na rin ang distilled water at 10% sucrose ang nagsilbing kontrol (Larawan 2A). Ipinakita ng pagsusuring ito ng kaligtasan na ang diyeta ay may makabuluhang epekto sa pangkalahatang kaligtasan ng mga babaeng naghahanap ng host (ihi: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; Larawan 2B, C) at mga babaeng pinapakain ng dugo (ihi: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0.0001; Larawan 2D, E). Sa lahat ng Sa mga eksperimento, ang mga babaeng pinakain ng ihi, urea, at tubig ay may mas mababang survival rate kumpara sa mga babaeng pinakain ng sucrose diet (Figure 2B-E). Ang mga babaeng naghahanap ng host na pinakain ng sariwa at lumang ihi ay nagpakita ng iba't ibang survival rate, kung saan ang mga pinakain ng 72-oras na lumang ihi (p = 0.016) ang may pinakamababang survival probability (Fig. 2B). Bukod pa rito, ang mga babaeng naghahanap ng host na pinakain ng 135 mM urea ay mas matagal na nabuhay kaysa sa mga kontrol sa tubig (p < 0.04) (Fig. 2C). Kung ikukumpara sa tubig, ang mga babaeng pinakain ng sariwang ihi at 24-oras na ihi ay mas matagal na nabuhay (p = 0.001 at p = 0.012, ayon sa pagkakabanggit; Figure 2D), habang ang mga babaeng pinakain ng 72-oras na ihi ay mas matagal na nabuhay kaysa sa mga pinakain ng maikli at sariwang ihi na 24-oras na luma na ihi (p < 0.0001 at p = 0.013, ayon sa pagkakabanggit; Figure 2D). Nang pinakain ng 135 mM urea, ang mga babaeng pinakain ng dugo ay mas matagal na nabuhay kaysa sa lahat ng iba pang konsentrasyon ng urea at tubig (p < 0.013; Pigura 2E).
Kaligtasan ng babaeng Anopheles arabinis na kumakain ng ihi ng baka at urea. Sa bioassay (A), ang mga babaeng lamok ay binigyan ng diyeta na binubuo ng sariwa at lumang ihi ng baka, iba't ibang konsentrasyon ng urea, sucrose (10%) at distilled water (H2O). Ang kaligtasan ng mga lamok na naghahanap ng host (B, C) at sumisipsip ng dugo (D, E) ay naitala bawat 12 oras hanggang sa mamatay ang lahat ng babaeng lamok na kumain ng ihi (B, D) at urea (C, E), at ang mga kontrol, Sucrose at tubig.
Ang kabuuang distansya at bilang ng mga bala na natukoy sa pagsubok sa flight mill sa loob ng 24 na oras ay nagkaiba sa pagitan ng mga lamok na naghahanap ng host at mga lamok na sumisipsip ng dugo, na nagpakita ng mas kaunting aktibidad sa paglipad sa pangkalahatan (Larawan 3). Ang mga lamok na naghahanap ng host na nagbigay ng sariwa at lumang ihi o sucrose at tubig ay nagpakita ng magkakaibang mga pattern ng paglipad (Larawan 3), kung saan ang mga babae ay kumakain ng sariwang ihi na mas aktibo sa madaling araw, habang ang mga pinakain ng 24 at 168 oras na gulang na mga lamok. Ang mga lamok na kumain ng ihi ay nagpakita ng iba't ibang mga pattern ng paglipad at pangunahing diurnal. Ang mga babaeng lamok na nagbigay ng sucrose o 72-oras na ihi ay nagpakita ng aktibidad sa buong 24-oras na panahon, habang ang mga babae na nagbigay ng tubig ay mas aktibo sa kalagitnaan ng panahon. Ang mga lamok na pinakain ng sucrose ay nagpakita ng pinakamataas na antas ng aktibidad sa gabi at madaling araw, habang ang mga nakakain ng 72-oras na gulang na ihi ay nakaranas ng patuloy na pagbaba ng aktibidad sa loob ng 24 na oras (Larawan 3).
Paglipad ng babaeng Anopheles arabinis na naghahanap ng dugo at sumisipsip ng ihi ng baka at urea sa paglipad. Sa pagsubok sa flight mill, ang mga babaeng lamok na pinakain ng sariwa at lumang ihi ng baka, iba't ibang konsentrasyon ng urea, sucrose (10%), at distilled water (H2O) ay itinali sa pahalang at malayang umiikot na mga braso (sa itaas). Para sa mga babaeng naghahanap ng host (kaliwa) at sumisipsip ng dugo (kanan), ang kabuuang distansya at bilang ng mga paglipad bawat oras para sa bawat diyeta sa loob ng 24 na oras na panahon ay naitala (madilim: kulay abo; mapusyaw: puti). Ang average na distansya at average na bilang ng mga laban ay ipinapakita sa kanan ng circadian activity graph. Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard error ng mean. Tingnan ang teksto sa pagsusuring istatistika.
Sa pangkalahatan, ang pangkalahatang aktibidad sa paglipad ng mga babaeng naghahanap ng host ay sumunod sa isang pattern na katulad ng distansya ng paglipad sa loob ng 24 na oras na panahon. Ang average na distansya ng paglipad ay malaki ang naapektuhan ng kinain na diyeta (F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001), at ang mga babaeng naghahanap ng host na nakain ng 72 oras na ihi ay lumipad nang mas malayo kumpara sa lahat ng iba pang diyeta (p < 0.0001), at ang mga lamok na pinapakain ng sucrose ay lumipad nang mas matagal kaysa sa mga lamok na pinapakain ng sariwa (p = 0.022) at 24-oras na gulang na ihi (p = 0.022). Kabaligtaran sa pattern ng aktibidad sa paglipad na inilarawan ng diyeta sa ihi, ang mga babaeng naghahanap ng host na pinapakain ng urea ay nagpakita ng patuloy na aktibidad sa paglipad sa loob ng 24 na oras na panahon, na umabot sa pinakamataas na antas sa ikalawang kalahati ng madilim na yugto (Larawan 3). Bagama't magkatulad ang mga pattern ng aktibidad, ang mga babaeng naghahanap ng host na pinapakain ng urea ay makabuluhang nagpataas ng average na distansya ng paglipad depende sa nasipsip na konsentrasyon (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001). Ang mga babaeng pinakain ng anumang konsentrasyon ng urea ay lumipad nang mas matagal kaysa sa mga babaeng pinakain ng tubig o sucrose (p < 0.03).
Ang pangkalahatang aktibidad sa paglipad ng mga lamok na sumisipsip ng dugo ay matatag at nagpatuloy sa loob ng 24 na oras sa lahat ng diyeta, na may pagtaas ng aktibidad ng ihi sa ikalawang kalahati ng panahon ng kadiliman para sa mga babaeng pinakain ng tubig pati na rin sa mga babaeng pinakain ng sariwa at 24 na oras ang edad (larawan 3). Bagama't ang diyeta sa ihi ay may malaking epekto sa karaniwang distansya ng paglipad sa mga babaeng pinakain ng dugo (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), ang diyeta sa urea ay hindi (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) kasama ang ibang diyeta sa ihi at kontrol (sariwa, p = 0.0091; 72 oras, p = 0.0022; 168 oras, p = 0.001; sucrose, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036).
Ang mga epekto ng pagpapakain ng ihi at urea sa mga parametro ng reproduktibo ay tinasa sa mga bioassay ng pangingitlog (Larawan 4A) at sinuri ayon sa bilang ng mga itlog na inilatag ng bawat babae, laki ng itlog, at bagong hasang larvae sa unang instar. Ang bilang ng mga itlog na inilatag. Ang mga babaeng Arab na pinakain ng ihi ay iba-iba ayon sa diyeta (F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; Larawan 4B). Ang mga babaeng pinakain ng 24-oras na ihi at blood meal ay mas maraming nangitlog kaysa sa mga babaeng pinakain ng ibang urine diet at katulad ng mga pinakain ng sucrose (Larawan 4B). Gayundin, ang laki ng mga itlog na inilatag ng mga babaeng pinakain ng ihi ay iba-iba ayon sa diyeta (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001), kung saan ang 24-oras na ihi at mga babaeng pinakain ng sucrose ay mas malalaking nangitlog kaysa sa mga babaeng pinakain ng tubig, habang ang mga itlog ng mga babaeng pinakain ng 168 oras na ihi ay mas maliit (Larawan 4C). Bilang karagdagan, ang diyeta ng ihi ay makabuluhang nakaapekto sa laki ng larva (F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001), na may mas malalaking larvae na lumalabas mula sa mga itlog na inilagak ng mga babaeng 24- at 72-oras na gulang na pinakain ng ihi kaysa sa mga itlog na inilagak mula sa mga larvae. Mga babaeng pinapakain ng tubig at 168-oras na pinapakain ng ihi (Larawan 4D).
Ang reproduktibong pagganap ng babaeng Anopheles arabinis na kumakain ng ihi ng baka at urea. Ang mga babaeng lamok na pinapakain ng dugo ay pinakain ng mga diyeta na binubuo ng sariwa at lumang ihi ng baka, iba't ibang konsentrasyon ng urea, sucrose (10%), at distilled water (H2O) sa loob ng 48 oras bago ilagay sa bioassays at kumuha ng mga substrate na nangingitlog sa loob ng 48 oras (A). Ang bilang ng itlog (B, E), laki ng itlog (C, F) at laki ng larvae (D, G) ay makabuluhang naapektuhan ng diyeta na ibinigay (ihi ng baka: BD; urea: EG). Ang mean para sa bawat parameter na nasukat gamit ang iba't ibang pangalan ng letra ay makabuluhang naiiba sa isa't isa (one-way ANOVA gamit ang post hoc analysis ni Tukey; p < 0.05). Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard error ng mean.
Bilang pangunahing sangkap na may nitroheno sa ihi, ang urea, kapag ibinigay bilang diyeta sa mga babaeng pinapakain ng dugo, ay may malaking epekto sa mga parametro ng reproduksyon sa lahat ng mga pag-aaral. Ang bilang ng mga itlog na ipinangitlog ng mga babaeng pinakain ng urea, pagkatapos ng pagkain ng dugo, depende sa konsentrasyon ng urea (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001), ang mga babaeng pinakain ng konsentrasyon ng urea sa pagitan ng 134 µM at 1.34 mM ay nangitlog ng mas maraming beses (Larawan 4E). Ang mga babaeng pinakain ng konsentrasyon ng urea na 134 µM o higit pa ay nangitlog ng mas malalaking itlog kaysa sa mga babaeng pinakain ng tubig (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; Larawan 4F), at ang laki ng larva, bagama't naapektuhan ng magkatulad na konsentrasyon ng urea sa mga ina (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001) ay mas pabagu-bago (Larawan 4G).
Pangkalahatang atraksyon sa mga host-seeking bovine urine headspace volatile extracts. Ang arabiensis na sinuri sa glass tube olfactometer (Fig. 5A) ay makabuluhang naapektuhan ng edad ng ihi (χ2 = 15.9, df = 4, p = 0.0032; Fig. 5B). Ipinakita ng post hoc analysis na ang mabahong amoy ng ihi sa loob ng 24 na oras ay nagdulot ng mas mataas na antas ng pagiging kaakit-akit kumpara sa lahat ng iba pang paggamot (72 oras: p = 0.0060, 168 oras: p = 0.012, pentane: p = 0.00070), Maliban sa amoy ng sariwang ihi (p = 0.13; Figure 5B). Bagama't ang pangkalahatang atraksyon ng mga lamok na sumisipsip ng dugo sa amoy ng ihi ay hindi makabuluhang naiiba (χ2 = 8.78, df = 4, p = 0.067; Fig. 5C), ang mga babaeng ito ay natagpuang mas kaakit-akit sa mga headspace volatile extracts kumpara sa 72-oras na gulang na ihi kumpara sa mga kontrol (p = 0.0066; Pigura 5C).
Mga tugon sa pag-uugali sa natural at sintetikong amoy ng ihi ng baka sa paghahanap ng host at pinapakain ng dugo na Anopheles arabianus. Eskematiko ng glass tube olfactometer (A). Pag-akit ng mga pabagu-bagong katas ng headspace mula sa sariwa at lumang ihi ng baka patungo sa host (B) at mga lamok na sumisipsip ng dugo (C). Hanapin ang reaksyon ng galamay ng Lord An. Ang mga katas ng headspace na nakahiwalay mula sa sariwa (D), 24-oras (E), 72-oras (F), at 168-oras (G) na lumang ihi ng baka ay ipinapakita. Ang mga bakas ng electron antenna detection (EAD) ay nagpapakita ng mga pagbabago sa boltahe bilang tugon sa mga bioactive compound sa headspace na kinuha mula sa gas chromatograph at na-detect ng isang flame ionization detector (FID). Ang scale bar ay kumakatawan sa response amplitude (mV) kumpara sa retention time (s). Ang mga katangian at release rates (µg h-1) ng mga biologically active compound ay ipinapakita. Ang isang asterisk (*) ay nagpapahiwatig ng isang pare-parehong low-amplitude response. Ang mga dobleng asterisk (**) ay nagpapahiwatig ng mga hindi maaaring kopyahing tugon. Hanapin ang host (H) at ang sumisipsip ng dugo (I) na An.arabiensis ay may iba't ibang apela sa mga sintetikong halo ng sariwa at lumang amoy ng ihi ng baka. Ang karaniwang proporsyon ng mga lamok na naaakit sa iba't ibang pangalan ng letra ay makabuluhang naiiba sa isa't isa (one-way ANOVA gamit ang post hoc analysis ni Tukey; p < 0.05). Ang mga error bar ay kumakatawan sa standard error ng iskala.
Ang babaeng Ann.arabiensis, 72 oras at 120 oras pagkatapos ng blood meat, habang nanganganak, ay walang ipinakitang preperensya para sa mga headspace volatile extracts mula sa sariwa at matatandang ihi ng baka kumpara sa mga kontrol na pentane (χ2 = 3.07, p > 0.05; Karagdagang file 1: Fig. S1).
Para sa babaeng Ann.arabiensis, ang mga pagsusuri ng GC-EAD at GC-MS ay nakatukoy ng walo, anim, tatlo at tatlong bioactive compound (Larawan 5D-G). Bagama't may mga pagkakaiba sa bilang ng mga compound na nagdulot ng mga electrophysiological response na naobserbahan, karamihan sa mga compound na ito ay nasa bawat headspace volatile extract na nakolekta mula sa sariwa at lumang ihi. Samakatuwid, para sa bawat extract, tanging ang mga compound na nagdulot ng pisyolohikal na tugon mula sa babaeng antena na higit sa threshold ang isinama sa mga karagdagang pagsusuri.
Ang kabuuang volatile release rate ng mga bioactive compound sa headspace collection ay tumaas mula 29 µg h-1 sa sariwang ihi hanggang 242 µg h-1 sa 168-oras na pinalaking ihi, pangunahin dahil sa pagtaas ng p-cresol at m-formaldehyde. Sa kabaligtaran, ang mga release rate ng iba pang mga compound, tulad ng 2-cyclohexen-1-one at decanal, ay bumaba kasabay ng pagtaas ng edad ng ihi, na nauugnay sa naobserbahang pagbaba ng signal intensity (kasaganaan) sa chromatogram (Fig. 5D)-G kaliwang panel) at mga pisyolohikal na tugon sa mga compound na ito (Fig. 5D-G kanang panel).
Sa pangkalahatan, ang sintetikong timpla ay may katulad na natural na ratio ng mga bioactive compound na nakilala sa mga volatile extract ng sariwa at lumang urine headspaces (Fig. 5D–G) at tila hindi nagdulot ng makabuluhang apela sa paghahanap ng host (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; Fig. 5H) o mga lamok na sumisipsip ng dugo (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; Fig. 5I). Gayunpaman, ang post hoc pairwise comparisons sa pagitan ng mga treatment ay nagpakita na ang mga lamok na naghahanap ng host ay makabuluhang kaakit-akit sa sintetikong timpla ng 24-oras na lumang ihi kumpara sa mga pentane control (p = 0.0086; Figure 5H).
Upang masuri ang papel ng mga indibidwal na sangkap sa mga sintetikong halo ng ihi na 24-oras ang edad, anim na subtractive mixture ang sinuri laban sa kumpletong halo sa Y-tube assay, kung saan inalis ang mga indibidwal na compound. Para sa mga lamok na naghahanap ng host, ang pagbabawas ng mga indibidwal na compound mula sa kumpletong halo ay nagkaroon ng makabuluhang epekto sa mga tugon sa pag-uugali (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; Karagdagang file 1: Figure S2A), lahat ng subtractive mixture ay mas kaakit-akit kaysa sa Mas Maliit kaysa sa ganap na halo. Sa kabaligtaran, ang pag-alis ng mga indibidwal na compound mula sa ganap na sintetikong halo ay hindi nakakaapekto sa mga tugon sa pag-uugali ng mga lamok na sumisipsip ng dugo (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), maliban sa decanal, na nagresulta sa mas mababang antas kumpara sa kumpletong halo na Attraction (p = 0.022; Karagdagang File 1: Figure S2B).
Sa isang nayon sa Ethiopia na endemic ang malaria, ang bisa ng isang sintetikong halo ng 24-oras na ihi ng baka sa pag-akit ng mga lamok sa ilalim ng mga kondisyon sa bukid ay sinuri sa loob ng sampung gabi (Fig. 6A). Isang kabuuang 4,861 na lamok ang nahuli at natukoy, kung saan 45.7% ay Anthropus.gambiae sl, 18.9% ay Anopheles pharoensis at 35.4% ay Culex spp. (Karagdagang file 1: Table S1). Ang Anopheles arabinis ang tanging miyembro ng An.Gambian species complex na natukoy sa pamamagitan ng PCR analysis. Sa karaniwan, 320 lamok ang nahuli bawat gabi, kung saan ang mga bitag na may sintetikong halo ng pain ay nakahuli ng mas maraming lamok kaysa sa mga pares na bitag na walang halo (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). Ang mga bitag na walang pain ay inilagay sa bawat isa sa limang gabi ng kontrol sa simula, gitna, at katapusan ng pagsubok. Katulad na bilang ng mga lamok ang nahuli sa bawat pares ng mga bitag, na nagpapahiwatig ng walang bias sa pagitan ng mga bahay (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0.05) at walang pagbaba ng populasyon sa panahon ng pag-aaral. Kung ikukumpara sa mga control trap, ang bilang ng mga lamok na nahuli sa mga bitag na naglalaman ng sintetikong halo ay tumaas nang malaki: paghahanap ng host (χ2(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), kamakailang pagpapakain ng dugo (χ2(0, 650) = 32.2, p < 0.0001) at pagbubuntis (χ2(0, 228) = 6.27, p = 0.0123; Karagdagang file 1: Table S1). Ito ay makikita rin sa kabuuang bilang ng mga lamok na nahuli: naghahanap ng host > sumisipsip ng dugo > buntis > medyo buntis > lalaki.
Pagsusuri sa larangan ng bisa ng 24-oras na sintetikong timpla ng amoy ng ihi ng baka. Isinagawa ang mga pagsubok sa larangan sa timog-gitnang Ethiopia (mapa), malapit sa bayan ng Maki (ilagay), gamit ang isang Centers for Disease Control (CDC) light trap (kanan) sa mga pares na bahay, na may disenyong Latin square (larawan sa himpapawid) (A). Ang mga sintetikong odor-bait na CDC phototrap ay umaakit at nakahuli ng mga babaeng Anopheles arabesques (B), ngunit hindi ng Anopheles farroes (C), sa ibang paraan, isang epektong nakadepende sa estado ng katawan. Bilang karagdagan, ang mga bitag na ito ay nakahuli ng makabuluhang pagtaas ng bilang ng mga host na lamok na Culex. (D) Kung ikukumpara sa kontrol. Ang mga bar sa kaliwa ay kumakatawan sa average na selection index ng mga lamok na nahuli sa mga pares ng odorant bait (berde) at control (bukas) na mga bitag (N = 10), habang ang mga bar sa kanan ay kumakatawan sa average na selection index sa mga pares ng control trap (bukas; N = 5). Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng mga antas ng statistical significance (*p = 0.01 at ***p < 0.0001)
Ang tatlong uri ay nahuli nang magkaiba sa mga bitag na naglalaman ng mga sintetikong halo. Sa paghahanap ng host (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), pagpapakain sa dugo (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) at pagbubuntis (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) ang isang .arabiensis ay nakulong sa bitag na naglalabas ng sintetikong halo (Fig. 6B), habang ang dami ng An ay hindi naiiba. Ang Pharoensis sa iba't ibang pisyolohikal na estado ay natagpuan (Fig. 6C). Para sa Culex, isang makabuluhang pagtaas lamang sa bilang ng mga lamok na naghahanap ng host ang natagpuan sa mga bitag na nilagyan ng pain ng sintetikong halo (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; Fig. 6D), kumpara sa mga control trap.
Ang mga pain trap ng host na matatagpuan sa labas ng mga potensyal na host sa pagitan ng mga lugar ng pagpaparami at mga rural na komunidad sa Ethiopia ay ginamit upang masuri kung ang mga lamok ng malaria ay gumagamit ng amoy ng ihi ng baka bilang hudyat ng tirahan ng host. Sa kawalan ng mga hudyat ng host, init, at mayroon o walang presensya ng amoy ng ihi ng baka, walang mga lamok na nahuli (Karagdagang file 1: Figure S3). Gayunpaman, sa presensya ng mataas na temperatura at amoy ng ihi ng baka, ang mga babaeng lamok ng malaria ay naakit at nahuli, bagama't sa maliit na bilang, anuman ang edad ng ihi (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; Karagdagang file 1: Figure S3). Sa kabaligtaran, ang mga kontrol sa tubig ay hindi nakahuli ng mga lamok ng malaria sa mataas na temperatura (Karagdagang File 1: Figure S3).
Ang mga lamok na may malaria ay nakakakuha at namamahagi ng mga compound na naglalaman ng nitrogen sa pamamagitan ng compensatory feeding sa ihi ng baka (ibig sabihin, mga puddle) upang mapahusay ang mga katangian ng kasaysayan ng buhay, katulad ng ibang mga insekto [2, 4, 24, 25, 26]. Ang ihi ng baka ay isang madaling makuhang renewable resource na malapit na nauugnay sa mga lugar ng pahingahan para sa mga tagapagdala ng malaria, tulad ng mga kulungan ng baka at matataas na halaman na malapit sa mga tahanan sa kanayunan at mga lugar ng pangingitlog. Nahahanap ng mga babaeng lamok ang mapagkukunang ito sa pamamagitan ng amoy at nagagawang kontrolin ang pagsipsip ng mga nitrogenous compound sa ihi, kabilang ang urea, ang pangunahing nitrogenous component sa ihi [15, 16]. Depende sa pisyolohikal na estado ng babaeng lamok, ang mga sustansya sa ihi ay inilalaan upang mapahusay ang aktibidad sa paglipad at kaligtasan ng mga babaeng lamok na naghahanap ng host, pati na rin ang kaligtasan at mga katangian ng reproduktibo ng mga indibidwal na pinapakain ng dugo sa panahon ng unang gonadotropic cycle. Samakatuwid, ang paghahalo ng ihi ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa nutrisyon para sa mga tagapagdala ng malaria na sarado tulad ng mga malnourished na nasa hustong gulang [8], dahil nagbibigay ito sa mga babaeng lamok ng kakayahang makakuha ng mahahalagang nitrogenous compound sa pamamagitan ng pakikibahagi sa low-risk na pagpapakain. Ang natuklasang ito ay may makabuluhang epidemiological na mga kahihinatnan, dahil pinapataas ng mga babae ang kanilang inaasahang haba ng buhay, aktibidad at output ng reproduksyon, na lahat ay nakakaapekto sa kapasidad ng vector. Bukod pa rito, ang pag-uugaling ito ay maaaring maging target ng mga programa sa pamamahala ng vector sa hinaharap.