L'adquisició i distribució de nutrients integren els trets de la recerca d'aliments i del cicle vital dels insectes. Per compensar les deficiències de nutrients específics en diferents etapes de la vida, els insectes poden obtenir aquests nutrients mitjançant una alimentació suplementària, per exemple, alimentant-se de secrecions de vertebrats en un procés conegut com a tolls. El mosquit Anopheles arabiani sembla estar desnodrit i, per tant, requereix nutrients tant per al metabolisme com per a la reproducció. L'objectiu d'aquest estudi va ser avaluar si l'agitació d'An. arabiensis sobre orina de vaca per a l'adquisició de nutrients millora les característiques del cicle vital.
Assegureu-vos que sigui segur. L'arabiensis es va sentir atreta per l'olor de l'orina fresca de vaca de 24, 72 i 168 hores, i les femelles que buscaven hoste i les alimentades amb sang (48 hores després de l'àpat de sang) es van mesurar en un olfactòmetre de tub en Y, i les femelles embarassades es van avaluar per a la prova de desova. A continuació, es va utilitzar una anàlisi química i electrofisiològica combinada per identificar compostos bioactius a l'orina de vaca en les quatre classes d'edat. Es van avaluar mescles sintètiques de compostos bioactius en assajos de tub en Y i de camp. Per investigar l'orina de vaca i el seu principal compost que conté nitrogen, la urea, com a possibles dietes suplementàries per als vectors de la malària, es van mesurar els paràmetres d'alimentació i les característiques del cicle vital. Es va avaluar la proporció de mosquits femelles i la quantitat d'orina de vaca i urea absorbides. Després de l'alimentació, es va avaluar la supervivència, el vol lligat i la reproducció de les femelles.
Busca la sang i l'aliment de l'hoste. En estudis de laboratori i de camp, els àrabs es van sentir atrets per l'olor natural i sintètica de l'orina de vaca fresca i envellida. Les femelles embarassades eren indiferents a les respostes de l'orina de vaca als llocs de desova. Les femelles que busquen hostes i xuclen sang absorbeixen activament l'orina i la urea de vaca i assignen aquests recursos segons els compromisos del cicle vital en funció de l'estat fisiològic per al vol, la supervivència o la reproducció.
Adquisició i distribució d'orina de vaca per Anopheles arabinis per millorar les característiques del cicle vital. L'alimentació suplementària d'orina de vaca afecta la capacitat del vector directament augmentant la supervivència diària i la densitat del vector, i indirectament alterant l'activitat de vol i, per tant, s'hauria de tenir en compte en models futurs.
L'adquisició i distribució de nutrients integren les característiques de la recerca d'aliments i del cicle vital dels insectes [1,2,3]. Els insectes són capaços de seleccionar i adquirir aliments i realitzar una alimentació compensatòria en funció de la disponibilitat d'aliments i els requisits de nutrients [1, 3]. La distribució de nutrients depèn del procés del cicle vital i pot conduir a diferents requisits de qualitat i quantitat de la dieta en les diferents etapes de la vida dels insectes [1, 2]. Per compensar les deficiències en nutrients específics, els insectes poden obtenir aquests nutrients mitjançant una alimentació suplementària, com ara fang, diversos excrements i secrecions de vertebrats i carronya, un procés conegut com a tolls [2]. Tot i que es descriu principalment una varietat d'espècies de papallones i arnes, els abeuradors també es produeixen en altres ordres d'insectes, i l'atracció i l'alimentació d'aquests tipus de recursos poden tenir efectes significatius sobre la salut i altres trets del cicle vital [2, 4, 5, 6], 7]. El mosquit de la malària Anopheles gambiae sensu lato (sl) emergeix com un adult "desnodrit" [8], de manera que l'aigua pot tenir un paper important en les característiques del seu cicle vital, però aquest comportament ha tingut tant... s'ha descuidat fins ara. L'ús de l'agitació com a mitjà per augmentar la ingesta de nutrients en aquest important vehicle mereix atenció, ja que pot tenir importants conseqüències epidemiològiques.
La ingesta de nitrogen en mosquits femelles adultes d'Anopheles és limitada a causa de les baixes reserves calòriques que porten des de la fase larvària i la utilització ineficient del menjar de sang [9]. Les femelles d'Ann.gambiae sl solen compensar això complementant-ho amb menjars de sang suplementaris [10, 11], cosa que posa més persones en risc de contraure la malaltia i augmenta el risc de depredació dels mosquits. Alternativament, els mosquits poden utilitzar l'alimentació suplementària d'excrements de vertebrats per adquirir compostos nitrogenats que milloren l'adaptació i la maniobrabilitat de vol, com ho demostren altres insectes [2]. En aquest sentit, és interessant l'atracció forta i distintiva d'una de les espècies germanes dins de l'orina fresca i envellida d'Anopheles arabinis [12,13,14]. L'Anopheles arabinis és oportunista en les seves preferències d'hoste i se sap que s'associa i s'alimenta del bestiar. L'orina de vaca és un recurs ric en compostos nitrogenats, amb la urea representant el 50-95% del nitrogen total de l'orina fresca [15, 16]. A mesura que l'orina de vaca envelleix, els microorganismes utilitzen aquests recursos per reduir la complexitat dels compostos nitrogenats en 24 hores [15]. Amb el ràpid augment de l'amoníac, associat a una disminució del nitrogen orgànic, prosperen els microorganismes alcalofílics (molts dels quals produeixen compostos tòxics per als mosquits) [15], que poden ser que la femella d'Ann. arabiensis s'atreu preferentment per l'orina de 24 hores o menys [13, 14].
En aquest estudi, es van buscar Ans hostes i alimentats amb sang. Durant el seu primer cicle de gonadotropina, es va avaluar l'An arabiensis per a l'adquisició de compostos nitrogenats, inclosa la urea, mitjançant la barreja d'orina. A continuació, es va dur a terme una sèrie d'experiments per avaluar com les femelles dels mosquits assignen aquest recurs potencial de nutrients per millorar la supervivència, la reproducció i la recerca d'aliments posterior. Finalment, es va avaluar l'olor de l'orina de vaca fresca i envellida per determinar si aquestes proporcionaven pistes fiables per a l'An hoste i l'alimentat amb sang. En la seva recerca d'aquest recurs nutricional potencial, l'An arabiensis va descobrir correlacions químiques darrere de l'atractiu diferencial observat. Es van avaluar més a fons les mescles d'olors sintètiques de compostos orgànics volàtils (COV) identificats en orina envellida de 24 hores en condicions de camp, ampliant els resultats obtinguts en condicions de laboratori i demostrant l'efecte de l'olor de l'orina bovina en diferents estats fisiològics. Atracció de mosquits. Els resultats obtinguts confirmen que l'An. arabiensis adquireix i distribueix compostos nitrogenats que es troben a l'orina dels vertebrats per influir en les característiques del cicle vital. Aquests resultats es discuteixen en el context de les possibles conseqüències epidemiològiques i com es poden utilitzar per a la vigilància i el control de vectors.
L'Anopheles arabicans (soca Dongola) es va mantenir a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% d'humitat relativa i un cicle de llum:foscor de 12:12 h. Les larves es van criar en safates de plàstic (20 cm × 18 cm × 7 cm) plenes d'aigua destil·lada i es van alimentar amb aliment per a peixos Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Les pupes es van recollir en gots de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) i després es van transferir a gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) per permetre l'emergència dels adults. Els adults van rebre una solució de sacarosa al 10% ad libitum fins a 4 dies després de l'emergència (dpe), moment en què les femelles que buscaven hoste van rebre dieta immediatament abans de l'experiment o es van deixar de menjar amb aigua destil·lada durant la nit abans de l'experiment, tal com es descriu a continuació. Les femelles utilitzades per a experiments amb tubs de vol només es van deixar de menjar durant 4-6 hores amb aigua ad libitum. Per preparar els mosquits xucladors de sang per a bioassajos posteriors, es va proporcionar sang d'ovella desfibròtica a 4 femelles dpe (Håtunalab, Bro, SE) mitjançant un sistema d'alimentació de membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Regne Unit). Les femelles completament congestionades es van transferir a gàbies individuals i se'ls va proporcionar dieta directament, tal com es descriu a continuació, o sacarosa al 10% ad libitum durant 3 dies abans dels experiments descrits a continuació. Aquestes últimes femelles es van utilitzar per a bioassajos de tubs de vol i es van transferir al laboratori, i després van tenir aigua destil·lada ad libitum durant 4-6 hores abans de l'experiment.
Es van utilitzar assaigs d'alimentació per quantificar el consum d'orina i urea en femelles adultes d'An.Arab. A les femelles que buscaven hostes i alimentades amb sang se'ls va proporcionar una dieta que contenia un 1% d'orina de vaca fresca i envellida diluïda, diverses concentracions d'urea i dos controls (10% de sacarosa i aigua) durant 48 h. A més, es va afegir colorant alimentari (1 mg ml-1 de cianur de xilè FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Estocolm, SE) a la dieta i es va subministrar en una matriu de 4 × 4 en tubs de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EUA; Figura 1A). Omplir fins a la vora (~300 µl). Per evitar la competència entre els mosquits i els possibles efectes del colorant, col·loqueu 10 mosquits en una placa de Petri gran (12 cm de diàmetre i 6 cm d'alçada; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) en completa foscor a 25 ± 2 cm °C i 65 ± 5% humitat relativa. Aquests experiments es van repetir de 5 a 10 vegades. Després de l'exposició a la dieta, els mosquits es van col·locar a -20 °C fins a la seva anàlisi posterior.
Busqueu orina bovina i urea absorbides per l'hoste i la femella xucladora de sang Anopheles arabianus. En la prova d'alimentació (A), es va proporcionar als mosquits femelles una dieta que consistia en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O). Les femelles que buscaven hoste (B) i les alimentades amb sang (C) van absorbir més sacarosa que qualsevol altra dieta provada. Tingueu en compte que les femelles que buscaven hoste van absorbir orina de vaca de 72 hores menys que orina de vaca de 168 hores (B). El contingut total mitjà de nitrogen (± desviació estàndard) de l'orina es representa a l'inserció. Les femelles que buscaven hoste (D, F) i les xucladores de sang (E, G) absorbeixen urea de manera dependent de la dosi. Els volums mitjans inhalats (D, E) amb diferents noms de lletres eren significativament diferents entre si (ANOVA unidireccional mitjançant l'anàlisi post hoc de Tukey; p < 0,05). Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana (BE). La línia recta discontínua representa la línia de regressió log-lineal. (F, G)
Per alliberar l'aliment absorbit, els mosquits es van col·locar individualment en tubs de microcentrífuga d'1,5 ml que contenien 230 µl d'aigua destil·lada i el teixit es va dissoldre mitjançant un morter d'un sol ús i un motor sense fil (VWR International, Lund, SE), seguit d'una centrifugació a 10 krpm durant 10 min. El sobrenedant (200 µl) es va transferir a una microplaca de 96 pous (Sigma-Aldrich) i l'absorbància (λ620) es va determinar mitjançant un lector de microplaques basat en un espectrofotòmetre (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativament, els mosquits es van triturar en 1 ml d'aigua destil·lada, 900 µl de la qual es van transferir a una cubeta per a l'anàlisi espectrofotomètrica (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Per quantificar la ingesta dietètica, es va preparar una corba estàndard per dilució seriada per obtenir de 0,2 µl a 2,4 µl d'1 mg ml-1 de cianur de xilè. A continuació, es va utilitzar la densitat òptica de concentracions de colorant conegudes per determinar la quantitat d'aliment que cada mosquit va ingerir.
Les dades de volum es van analitzar mitjançant una anàlisi de la variància unidireccional (ANOVA) seguida de comparacions per parells post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA, 1989–2007). Les anàlisis de regressió lineal van descriure la ingesta d'urea dependent de la concentració i van comparar les respostes entre els mosquits que busquen hostes i els que xuclen sang (GraphPad Prism v8.0.0 per a Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Aproximadament 20 µl de mostres d'orina de cada grup d'edat es van unir a Chromosorb® W/AW (10 mg de malla 80/100, Sigma Aldrich) i es van encapsular en càpsules d'estany (8 mm × 5 mm). Les càpsules es van inserir a la cambra de combustió d'un analitzador CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) per determinar el contingut de nitrogen en orina fresca i envellida segons el protocol del fabricant. El nitrogen total (g N l-1) es va quantificar en funció de les concentracions d'urea conegudes utilitzades com a estàndard.
Per avaluar l'efecte de la dieta en la supervivència de les femelles que busquen hostes i xuclen sang, es van col·locar individualment mosquits en grans plaques de Petri (12 cm de diàmetre i 6 cm d'alçada; Semadeni) amb un forat cobert de malla a la tapa (3 cm de diàmetre) per a la ventilació i el subministrament d'aliments. Les dietes es van proporcionar directament després de 4 dies d'excreció i incloïen orina de vaca fresca i madura diluïda a l'1%, quatre concentracions d'urea i dos controls, sacarosa al 10% i aigua. Cada dieta es va pipetejar en un tampó dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserit en una xeringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), es va treure l'èmbol i es va col·locar a sobre d'una placa de Petri (figura 1).1A). Canvieu la vostra dieta cada dia. Manteniu el laboratori tal com s'ha descrit anteriorment. Els mosquits supervivents es van comptar dues vegades al dia, mentre que els mosquits morts es van descartar fins que va morir l'últim mosquit (n = 40 per tractament). La supervivència dels mosquits alimentats amb diverses dietes es va analitzar estadísticament mitjançant corbes de supervivència de Kaplan-Meyer. i proves de log-rank per comparar la distribució de supervivència entre dietes (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un molí volador de mosquits personalitzat basat en Attisano et al.[17], fet de panells acrílics transparents de 5 mm de gruix (10 cm d'ample x 10 cm de llarg x 10 cm d'alt) sense panells frontal i posterior (Fig. 3: superior). Un conjunt pivotant amb un tub vertical fet d'una columna de cromatografia de gasos (0,25 mm de diàmetre interior; 7,5 cm de llargada) amb extrems enganxats a una agulla d'insecte suspesa entre un parell d'imants de neodimi separats per 9 cm. Un tub horitzontal fet del mateix material (6,5 cm de llargada) biseccionava el tub vertical per formar un braç ancorat i un braç que portava un petit tros de paper d'alumini com a senyal d'interrupció de la llum.
Es va administrar la dieta anterior a femelles que havien mort de fam durant 24 hores durant 30 minuts abans de ser contengudes. Les femelles de mosquit completament alimentades es van anestesiar individualment en gel durant 2-3 minuts i es van fixar a agulles d'insectes amb cera d'abella (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) i després es van lligar als braços dels tubs horitzontals. Molí volador. Les revolucions per vol es van registrar mitjançant un registrador de dades fet a mida, i després es van emmagatzemar i mostrar mitjançant el programari PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). El molí volador es va col·locar en una habitació climatitzada (12 h:12 h, llum: foscor, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% HR).
Per visualitzar el patró de l'activitat de vol, es va calcular la distància total volada (m) i el nombre total d'activitats de vol consecutives per hora durant un període de 24 hores. A més, es van comparar les distàncies mitjanes volades per femelles individuals entre els tractaments i es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional i anàlisi post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), on la distància mitjana es va considerar una variable dependent, mentre que el tractament és un factor independent. A més, el nombre mitjà de rondes es calcula en increments de 10 minuts.
Per avaluar l'efecte de la dieta en el rendiment reproductiu d'An.arabiensis, sis femelles (4 dpe) van ser transferides directament a gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) després de la recollida de sang i després se'ls va proporcionar la dieta experimental durant 48 h tal com s'ha descrit anteriorment. A continuació, es van retirar les dietes i es van proporcionar tasses de desova (30 ml; Nolato Hertila) plenes amb 20 ml d'aigua destil·lada el tercer dia durant 48 hores, canviant-les cada 24 hores. Repetiu cada règim dietètic de 20 a 50 vegades. Es van comptar i registrar els ous per a cada gàbia experimental. Es van utilitzar submostres d'ous per avaluar la mida mitjana i la variació de longitud dels ous individuals (n ≥ 200 per dieta) utilitzant un microscopi Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) equipat amb una càmera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Els ous restants es van mantenir en una sala amb clima controlat en condicions de cria estàndard durant 24 h, i es va mesurar una submostra de larves de primer estadi recentment emergides (n ≥ 200 per dieta), tal com s'ha descrit anteriorment. El nombre d'ous i la mida dels ous i les larves es van comparar entre els tractaments i mitjançant ANOVA unidireccional i anàlisi post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Es van recollir compostos volàtils de l'espai de cap d'orina fresca (1 hora després del mostreig), orina envellida de 24 hores, 72 hores i 168 hores a partir de mostres recollides de bestiar Zebú i races Arsi. Per comoditat, les mostres d'orina es van recollir a primera hora del matí mentre les vaques encara eren a l'estable. Es van recollir mostres d'orina de 10 individus i es van transferir de 100 a 200 ml de cada mostra a bosses de forn de poliamida individuals (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) en bidons de plàstic de clorur de vinil de 3 l amb tapa. Els compostos volàtils de l'espai de cap de cada mostra d'orina bovina es van recollir directament (fresca) o després de la maduració a temperatura ambient durant 24 hores, 72 hores i 168 hores, és a dir, cada mostra d'orina era representativa de cada grup d'edat.
Per a la recollida de volàtils de l'espai de cap, es va utilitzar un sistema de circuit tancat per fer circular un corrent de gas filtrat amb carbó activat (100 ml min-1) a través d'una bossa de poliamida fins a la columna d'adsorció durant 2,5 h mitjançant una bomba de buit de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Com a control, la recollida de l'espai de cap es va realitzar des d'una bossa de poliamida buida. La columna d'adsorció estava feta de tubs de tefló (5,5 cm x 3 mm de diàmetre interior) que contenien 35 mg de Porapak Q (malla 50/80; Waters Associates, Milford, MA, EUA) entre taps de llana de vidre. Abans d'utilitzar-la, la columna es va esbandir amb 1 ml de n-hexà redestil·lat (Merck, Darmstadt, DE) i 1 ml de pentà (solvent pur al 99,0% de grau GC, Sigma Aldrich). Els volàtils adsorbits es van eluir amb 400 μl de pentà. Les recollides de l'espai de cap es van agrupar i després es van emmagatzemar a -20 °C fins que es van utilitzar per a anàlisis posteriors.
Respostes conductuals d'An que busca hoste i que menja sang. Es van analitzar extractes volàtils de Headspace recollits d'orina fresca de 24 h, 72 h i 168 h per a extractes volàtils de mosquits Arabidopsis mitjançant un olfactòmetre de tub de vidre recte [18]. Els experiments es van dur a terme durant els períodes ZT 13-15, el període màxim de l'activitat de cerca d'habitatge d'An. Arab [19]. Es va il·luminar un olfactòmetre de tub de vidre (80 cm × 9,5 cm di) amb 3 ± 1 lx de llum vermella des de dalt. El flux d'aire filtrat amb carbó vegetal i humidificat (25 ± 2 °C, 65 ± 2% d'humitat relativa) va passar pel bioassaig a 30 cm s-1. L'aire es passa a través d'una sèrie de pantalles de malla d'acer inoxidable, creant un flux laminar i una estructura uniforme de plomes. Dispensador de tampons dentals (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspès d'una bobina de 5 cm a l'extrem de sobrevent del olfactòmetre, amb canvis d'estimulador cada 5 minuts. Per a l'anàlisi, es van utilitzar 10 μl de cada extracte de l'espai de cap, diluït 1:10, com a estímul. Es va utilitzar una quantitat igual de pentà com a control. Els mosquits individuals que buscaven hostes o xuclaven sang es van col·locar en gàbies d'alliberament individuals 2-3 hores abans de l'inici de l'experiment. La gàbia d'alliberament es va col·locar al costat a sotavent de l'olfactòmetre i es va deixar que els mosquits s'aclimatessin durant 1 minut, i després es va obrir la vàlvula de papallona de la gàbia per alliberar-los. L'atracció al tractament o al control es va analitzar com la proporció de mosquits que van entrar en contacte amb la font en els 5 minuts posteriors a l'alliberament. Cada extracte volàtil de l'espai de cap i el control es van replicar almenys 30 vegades i, per evitar els efectes de qualsevol dia, es va provar el mateix nombre de tractaments i controls cada dia experimental. Les respostes de cerca de l'hoste i dels alimentats amb sang. Resp. Els conjunts aràbic versus espai de cap es van analitzar mitjançant una regressió logística nominal seguida de comparacions per parells per a les proporcions de probabilitat (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Resposta de desova d'An. Es van analitzar extractes d'espai cap a l'orina de vaca fresca i envellida en gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Es van utilitzar gots de plàstic (30 mL; Nolato Hertila) plens de 20 mL d'aigua destil·lada com a substrat de desova, que es van col·locar a les cantonades oposades de la gàbia, separats per 24 cm. Els gots de tractament es van ajustar amb 10 μl de cada extracte d'espai cap a l'orella a una dilució d'1:10. Es va utilitzar una quantitat igual de pentà per ajustar el got de control. Els gots de tractament i de control es van intercanviar entre cada experiment per controlar els efectes de posició. Es van alliberar deu femelles alimentades amb sang a les gàbies experimentals a ZT 9-11 i es van comptar els ous dels gots 24 hores després. La fórmula per calcular l'índex de desova és: (el nombre d'ous postos al got de tractament - el nombre d'ous postos al got de control)/(el nombre total d'ous postos). Cada tractament es va repetir 8 vegades.
L'anàlisi cromatogràfica de gasos i de detecció de patrons d'antenes electròniques (GC-EAD) de la femella d'An. arabiensis es va dur a terme tal com s'ha descrit anteriorment [20]. Breument, els extractes volàtils frescos de l'espai de capçalera es van separar mitjançant un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, EUA) equipat amb una columna HP-5 (30 m × 0,25 mm de diàmetre interior, 0,25 μm de gruix de pel·lícula, Agilent Technologies). i orina envellida. Es va utilitzar hidrogen com a fase mòbil amb un cabal lineal mitjà de 45 cm s-1. Cada mostra (2 μl) es va injectar durant 30 segons en mode sense divisió amb una temperatura d'entrada de 225 °C. La temperatura del forn GC es va programar de 35 °C (manteniment de 3 minuts) a 300 °C (manteniment de 10 minuts) a 10 °C min-1. Al divisor d'efluents de GC, es van afegir 4 psi de nitrogen i es van dividir 1:1 en una creu de baix volum mort Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) entre el detector d'ionització de flama i l'EAD. El capil·lar d'efluent de GC per a l'EAD es va passar a través d'una línia de transferència Gerstel ODP-2, que rastreja la temperatura del forn GC més 5 °C, a un tub de vidre (10 cm × 8 mm), on es va barrejar amb aire humidificat filtrat amb carboni (1,5 l min-1). L'antena es va col·locar 0,5 cm de la sortida del tub. Cada mosquit individual representava una rèplica, i per als mosquits que buscaven hoste, es van realitzar almenys tres rèpliques amb mostres d'orina de cada edat.
Identificació de compostos bioactius en col·leccions d'espai de cap d'orina bovina fresca i envellida mitjançant un espectròmetre combinat de GC i masses (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) per obtenir respostes antenals en l'anàlisi GC-EAD, operant en mode d'ionització per impacte electrònic a 70 eV. El GC estava equipat amb una columna capil·lar de sílice fosa recoberta amb UI HP-5MS (60 m × 0,25 mm de diàmetre interior, 0,25 μm de gruix de pel·lícula) utilitzant heli com a fase mòbil amb un cabal lineal mitjà de 35 cm s-1. Es va injectar una mostra de 2 μl utilitzant la mateixa configuració de l'injector i la mateixa temperatura del forn que per a l'anàlisi GC-EAD. Els compostos es van identificar en funció del seu temps de retenció (índex Kovát) i espectres de masses en comparació amb la biblioteca personalitzada i la biblioteca NIST14 (Agilent). Els compostos identificats es van confirmar injectant estàndards autèntics (Fitxer addicional 1: Taula S2). Per a la quantificació, es va utilitzar acetat d'heptil (10 ng, puresa química del 99,8%, Aldrich) es va injectar com a estàndard extern.
Avaluació de l'eficàcia d'una barreja d'olors sintètiques que consisteix en compostos bioactius identificats en orina fresca i envellida per atraure Ans. arabiensis, que busca hostes i xucla sang, utilitzant el mateix olfactòmetre i protocol que l'anterior. Les mescles sintètiques imitaven la composició i les proporcions dels compostos en extractes volàtils mixtos de l'espai de cap d'orina fresca, envellida de 24 hores, 48 ​​hores, 72 hores i 168 hores (Figura 5D-G; Fitxer addicional 1: Taula S2). Per a l'anàlisi, utilitzeu 10 μl d'una dilució 1:100 de la barreja totalment sintètica, amb una taxa d'alliberament global que oscil·la aproximadament entre 140 i 2400 ng h-1, per avaluar l'atractiu per als mosquits hostes i xucla sang. Posteriorment, la prova es realitza en mescles completes, en què s'eliminen les mescles subtractives de compostos individuals de la barreja completa. Respostes de cerca de l'hoste i de l'Ans alimentat amb sang. Les mescles arabs i sintètiques i subtractives es van analitzar mitjançant una regressió logística nominal seguida de comparacions per parells per a les parelles. ràtios (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Per avaluar si l'orina de vaca podia servir com a indici d'hàbitat per als mosquits de la malària, es va col·locar orina de vaca fresca i vella, recollida tal com s'ha descrit anteriorment, i aigua en galledes de malla de 3 l (100 ml) i es van col·locar en trampes d'esquer per a hostes. (versió BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Deu trampes col·locades a 50 m de distància en pastures, a 400 m de la comunitat del poble (Silay, Etiòpia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i sense bestiar, en zones de cria permanents i pobles. Es van escalfar cinc trampes per simular la presència d'un hoste, mentre que cinc trampes es van deixar sense escalfar. Cada ubicació de tractament es rota cada nit durant un total de cinc nits. El nombre de mosquits capturats en trampes amb esquer amb orina de diferents edats es va comparar mitjançant una regressió logística amb una distribució binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
En un poble on la malària és endèmica, a prop de la ciutat de Maki, a la regió d'Oromia, Etiòpia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). L'estudi es va dur a terme entre mitjans d'agost i mitjans de setembre, abans de la fumigació residual anual a l'interior, juntament amb una llarga temporada de pluges. Es van seleccionar per a l'estudi cinc parells de cases (separades entre 20 i 50 m) situades als afores del poble (Fig. 6A). Els criteris utilitzats per seleccionar les cases van ser: no es permetien animals a la casa, no es permetia cuinar a l'interior (treure llenya o carbó vegetal) (almenys durant el període de prova) i cases amb un màxim de dos habitants, dormint sense insecticides. sota la mosquitera tractada. L'aprovació ètica ha estat atorgada pel Consell de Revisió d'Ètica de la Recerca Institucional (IRB/022/2016) de la Facultat de Ciències Naturals (CNS-IRB) de la Universitat d'Addis Abeba, d'acord amb les directrius establertes per la Declaració d'Hèlsinki de l'Associació Mèdica Mundial. Es va obtenir el consentiment de cada cap de família amb l'assistència del personal d'extensió sanitària. Tot el procés està avalat per les administracions locals a nivell de districte i de sala ("kebele"). El disseny experimental va seguir un disseny quadrat llatí de 2 × 2, en què les mescles sintètiques i els controls es van assignar a cases aparellades la primera nit i es van intercanviar entre cases la nit experimental següent. Aquest procés es va repetir deu vegades. A més, per estimar l'activitat dels mosquits a les cases seleccionades, es van configurar les trampes dels CDC per funcionar cinc nits consecutives al principi, a la meitat i al final de la prova de camp a la mateixa hora del dia.
Una barreja sintètica que contenia sis compostos bioactius es va dissoldre en heptà (dissolvent de grau GC al 97,0%, Sigma Aldrich) i es va alliberar a 140 ng h-1 mitjançant un dispensador de metxa de cotó [20]. El dispensador de metxa va permetre que tots els compostos s'alliberessin en proporcions constants durant les 12 hores d'experiment. Es va utilitzar heptà com a control. El vial es va suspendre al costat del punt d'entrada de la trampa de llum dels Centres per al Control i la Prevenció de Malalties (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, EUA; Figura 6A). Les trampes es van penjar entre 0,8 i 1 m per sobre del terra, a prop dels peus del llit, i un voluntari dormia sota una mosquitera sense tractar i operava entre les 18:00 i les 06:30. Els mosquits capturats per sexe i estat fisiològic (no alimentats, alimentats, semiembarassades i embarassades [21] es van analitzar posteriorment mitjançant anàlisi de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) per identificar les espècies identificades morfològicament com a A. gambiae sl. Membres del complex [23]. En A l'estudi de camp, la captura de cases aparellades es va analitzar mitjançant un model d'ajust logístic nominal, on l'atracció era la variable dependent i el tractament (barreja sintètica vs. control) era l'efecte fix (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Aquí, informem dels valors de χ2 i p de la prova de raó de probabilitat.
Avaluar si és segur. L'espècie arabiensis va poder obtenir orina, la seva principal font de nitrogen, la urea, mitjançant alimentació directa, dins de les 48 hores posteriors a l'administració durant 4 dies després (dpe) dels assaigs d'alimentació amb femelles que buscaven hoste i alimentades amb sang (Fig. 1A). Tant les femelles que buscaven hoste com les que xuclaven sang van absorbir significativament més sacarosa que qualsevol altra dieta o aigua (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectivament; Fig. 1B,C). A més, les femelles que buscaven hoste van menjar menys en orina a les 72 hores en comparació amb l'orina a les 168 hores (Fig. 1B). Quan se'ls va oferir una dieta que contenia urea, les femelles que buscaven hoste van absorbir una quantitat significativament més gran d'urea a 2,69 mM en comparació amb totes les altres concentracions i aigua, tot i que era indistingible del 10% de sacarosa. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Això contrastava amb la resposta de les femelles alimentades amb sang, que normalment absorbien significativament més dietes que contenien urea que aigua, tot i que significativament menys del 10% de sacarosa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). A més, en comparar els dos estats fisiològics, les femelles flebotomitzades van absorbir més urea que les femelles que buscaven hoste a les concentracions més baixes, i aquestes femelles van absorbir quantitats similars d'urea a concentracions més altes (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Mentre que la ingesta d'una dieta que conté urea semblava tenir valors òptims (Fig. 1D, E), les femelles en ambdós estats fisiològics van poder modular la quantitat d'urea absorbida en tot el rang de concentracions d'urea de manera log-lineal (Fig. 1F,G). De la mateixa manera, sembla que els mosquits controlen la seva absorció de nitrogen regulant la quantitat d'orina absorbida, ja que la quantitat de nitrogen a l'orina es reflecteix en la quantitat absorbida (figura 1B, C i B inserits).
Per avaluar els efectes de l'orina i la urea en la supervivència dels mosquits que busquen hoste i xuclen sang, es va alimentar femelles amb orina de les quatre edats (fresca, 24 h, 72 h i 168 h després de la deposició) i es va administrar una gamma de concentracions d'urea, així com aigua destil·lada i sacarosa al 10% com a control (Figura 2A). Aquesta anàlisi de supervivència va mostrar que la dieta tenia un efecte significatiu en la supervivència global de les femelles que buscaven hoste (orina: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) i femelles alimentades amb sang (orina: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2). 2D,E). En tots els experiments, les femelles alimentades amb una dieta d'orina, urea i aigua van tenir taxes de supervivència significativament més baixes en comparació amb les femelles alimentades amb una dieta de sacarosa (Figura 2B-E). Les femelles que buscaven hoste i que van ser alimentades amb orina fresca i rància van mostrar diferents taxes de supervivència, i les que van ser alimentades amb orina rància de 72 hores (p = 0,016) van tenir la probabilitat de supervivència més baixa (Fig. 2B). A més, les femelles que buscaven hoste i que van ser alimentades amb 135 mM d'urea van sobreviure més temps que els controls amb aigua (p < 0,04) (Fig. 2C). En comparació amb l'aigua, les dones alimentades amb orina fresca i orina de 24 hores van sobreviure més temps (p = 0,001 i p = 0,012, respectivament; Figura 2D), mentre que les dones alimentades amb orina de 72 hores van sobreviure més temps que les que van ser alimentades amb orina fresca curta de femelles i orina envellida de 24 hores (p < 0,0001 i p = 0,013, respectivament; Figura 2D). Quan es van alimentar amb 135 mM urea, les femelles alimentades amb sang van sobreviure més temps que totes les altres concentracions d'urea i aigua (p < 0,013; Figura 2E).
Supervivència de femelles hostes i xucladores de sang d'Anopheles arabinis que s'alimenten d'orina de vaca i urea. En el bioassaig (A), es va proporcionar als mosquits femelles una dieta que consistia en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O). Es va registrar la supervivència dels mosquits que buscaven hostes (B, C) i xucladors de sang (D, E) cada 12 hores fins que totes les femelles s'alimentaven d'orina (B, D) i urea (C, E), i els controls, sacarosa i aigua, morien.
La distància total i el nombre de rondes determinades a la prova del molí de vol durant un període de 24 hores van diferir entre els mosquits que buscaven hostes i els que xuclaven sang, que van mostrar menys activitat de vol en general (Fig. 3). Els mosquits que buscaven hostes i que van proporcionar orina fresca i envellida o sacarosa i aigua van mostrar patrons de vol diferents (Fig. 3), i les femelles que s'alimentaven d'orina fresca van ser més actives a l'alba, mentre que les que es van alimentar amb orina de 24 i 168 hores d'edat. Els mosquits que s'alimentaven d'orina van mostrar patrons de vol diferents i eren principalment diürns. Les femelles de mosquits que van proporcionar sacarosa o orina de 72 hores van mostrar activitat durant el període de 24 hores, mentre que les femelles que van proporcionar aigua van ser més actives durant el període mitjà. Els mosquits alimentats amb sacarosa van mostrar els nivells més alts d'activitat a última hora de la nit i a primera hora del matí, mentre que els que van ingerir orina de 72 hores d'edat van experimentar una disminució constant de l'activitat durant les 24 hores (Figura 3).
Rendiment de vol de femelles Anopheles arabinis xucladores de sang que s'alimenten d'orina de vaca i urea. A la prova del molí de vol, les femelles de mosquit s'alimentaven d'orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O) es van lligar a braços horitzontals i giratoris lliurement (a dalt). Per a les femelles que busquen hostes (esquerra) i xucladores de sang (dreta), es va registrar la distància total i el nombre de vols per hora per a cada dieta durant un període de 24 hores (fosc: gris; clar: blanc). La distància mitjana i el nombre mitjà de combats es mostren a la dreta del gràfic d'activitat circadiana. Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana. Anàlisi estadística, vegeu el text.
En general, l'activitat de vol global de les femelles que buscaven hostes va seguir un patró similar al de la distància de vol durant un període de 24 hores. La distància mitjana de vol es va veure afectada significativament per la dieta ingerida (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), i les femelles que buscaven hostes van ingerir 72 hores d'orina van volar distàncies significativament més llargues en comparació amb totes les altres dietes (p < 0,0001), i els mosquits alimentats amb sacarosa van volar més temps que els mosquits frescos (p = 0,022) i els alimentats amb orina de 24 hores (p = 0,022). En contrast amb el patró d'activitat de vol descrit per la dieta d'orina, les femelles que buscaven hostes alimentades amb urea van mostrar una activitat de vol persistent durant un període de 24 hores, amb un pic durant la segona meitat de la fase fosca (Fig. 3). Tot i que els patrons d'activitat eren similars, les femelles que buscaven hostes alimentades amb urea van augmentar significativament la distància mitjana de vol en funció de la concentració absorbida (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Les femelles que buscaven hoste i que van ser alimentades amb qualsevol concentració d'urea van volar més temps que les femelles alimentades amb aigua o sacarosa (p < 0,03).
L'activitat de vol general dels mosquits xucladors de sang va ser estable i es va mantenir durant 24 hores en totes les dietes, amb un augment de l'activitat urinaria durant la segona meitat del període fosc per a les femelles alimentades amb aigua, així com en les femelles alimentades amb aigua fresca i de 24 hores de vida (imatge 3). Mentre que la dieta amb orina va afectar significativament la distància mitjana de vol en les femelles alimentades amb sang (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), la dieta amb urea no ho va fer (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) amb altra orina i la dieta de control (fresca, p = 0,0091; 72 hores, p = 0,0022; 168 hores, p = 0,001; sacarosa, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Els efectes de l'alimentació amb orina i urea sobre els paràmetres reproductius es van avaluar en bioassajos de posta d'ous (Figura 4A) i es van investigar segons el nombre d'ous postos per cada femella, la mida de l'ou i les larves de primer estadi recentment ecloses. El nombre d'ous postos. Les femelles àrabs alimentades amb orina van variar segons la dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Les femelles alimentades amb orina de 24 hores i farina de sang van pondre significativament més ous que les femelles alimentades amb altres dietes d'orina i van ser similars a les alimentades amb sacarosa (Fig. 4B). De la mateixa manera, la mida dels ous postos per les femelles alimentades amb orina va variar segons la dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), amb femelles alimentades amb orina de 24 hores i sacarosa que van pondre ous significativament més grans que les femelles alimentades amb aigua, mentre que els ous de les femelles alimentades amb 168 h d'orina van ser significativament més petits (Fig. 4C). A més, la dieta d'orina... va afectar significativament la mida larvària (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), amb larves significativament més grans emergint dels ous postos per femelles alimentades amb orina de 24 i 72 hores d'edat que dels ous postos per larves d'ous. Femelles alimentades amb aigua i femelles alimentades amb orina de 168 hores d'edat (Figura 4D).
Rendiment reproductiu de les femelles d'Anopheles arabinis que s'alimenten d'orina de vaca i urea. Les femelles de mosquit alimentades amb sang van rebre dietes que consistien en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O) durant 48 hores abans de col·locar-les en bioassajos i obtenir substrats per a la posta d'ous 48 hores (A). El nombre d'ous (B, E), la mida dels ous (C, F) i la mida de les larves (D, G) es van veure afectats significativament per la dieta proporcionada (orina de vaca: BD; urea: EG). Les mitjanes per a cada paràmetre mesurat utilitzant diferents noms de lletres van ser significativament diferents entre si (ANOVA unidireccional utilitzant l'anàlisi post hoc de Tukey; p < 0,05). Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana.
Com a principal component nitrogenat de l'orina, la urea, quan es proporciona com a dieta a femelles alimentades amb sang, va afectar significativament els paràmetres reproductius en tots els estudis. El nombre d'ous postos per les femelles alimentades amb urea, després d'un àpat de sang, depenent de la concentració d'urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), les femelles alimentades amb concentracions d'urea entre 134 µM i 1,34 mM van pondre més ous (Figura 4E). Les femelles alimentades amb concentracions d'urea de 134 µM o superiors van pondre ous més grans que les femelles alimentades amb aigua (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), i la mida de les larves, tot i que es va veure afectada per concentracions similars d'urea en les mares (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) va ser més variable (Fig. 4G).
Atracció general pels extractes volàtils de l'espai de cap d'orina bovina que busquen hostes. L'arabiensis avaluada a l'olfactòmetre de tub de vidre (Fig. 5A) es va veure afectada significativament per l'edat de l'orina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). L'anàlisi post hoc va mostrar que l'olor d'orina rancia a les 24 hores va causar nivells d'atractiu significativament més alts en comparació amb tots els altres tractaments (72 hores: p = 0,0060, 168 hores: p = 0,012, pentà: p = 0,00070), excepte per l'olor d'orina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Tot i que l'atracció general dels mosquits xucladors de sang per l'olor d'orina no va ser significativament diferent (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), es va trobar que aquestes femelles eren significativament més atractives pels extractes volàtils de l'espai de cap en comparació amb l'orina envellida de 72 hores en comparació amb els controls (p = 0,0066; Figura 5C).
Respostes conductuals a olors d'orina de vaca naturals i sintètiques en la recerca d'Anopheles arabianus, hostes i alimentats amb sang. Esquema de l'olfactòmetre de tub de vidre (A). Atracció d'extractes volàtils de l'espai de cap d'orina de vaca fresca i envellida als mosquits hostes (B) i xucladors de sang (C). Trobeu la reacció del tentacle del Lord An. Es mostren extractes de l'espai de cap aïllats d'orina de vaca fresca (D), de 24 hores (E), de 72 hores (F) i de 168 hores (G). Les traces de detecció d'antena electrònica (EAD) mostren canvis de voltatge en resposta a compostos bioactius a l'espai de cap eluïts del cromatògraf de gasos i detectats per un detector d'ionització de flama (FID). La barra d'escala representa l'amplitud de resposta (mV) en funció del temps de retenció (s). Es mostren les propietats i les taxes d'alliberament (µg h-1) dels compostos biològicament actius. Un asterisc simple (*) indica una resposta consistent de baixa amplitud. Els asteriscs dobles (**) indiquen respostes no reproduïbles. Trobeu l'hoste (H) i el xucladora de sang (I) An. arabiensis té diferents atractius a les mescles sintètiques d'olors d'orina de vaca fresca i envellida. Les proporcions mitjanes de mosquits atrets per diferents noms de lletres eren significativament diferents entre si (ANOVA unidireccional utilitzant l'anàlisi post hoc de Tukey; p < 0,05). Les barres d'error representen l'error estàndard de l'escala
Femella d'Ann.arabiensis, 72 h i 120 h després de l'àpat de sang, durant la fresa, no es va mostrar preferència pels extractes volàtils de l'espai superior d'orina de vaca fresca i envellida en comparació amb els controls de pentà (χ2 = 3,07, p > 0,05; Fitxer addicional 1: Fig. S1).
Per a l'Ann. arabiensis femella, les anàlisis GC-EAD i GC-MS van identificar vuit, sis, tres i tres compostos bioactius (Figura 5D-G). Tot i que es van observar diferències en el nombre de compostos que van provocar respostes electrofisiològiques, la majoria d'aquests compostos eren presents a cada extracte volàtil de l'espai de cap recollit d'orina fresca i envellida. Per tant, per a cada extracte, només es van incloure en anàlisis posteriors els compostos que van produir una resposta fisiològica de les antenes femenines per sobre del llindar.
La taxa d'alliberament total de volàtils de compostos bioactius a la recollida de l'espai de cap va augmentar de 29 µg h-1 en orina fresca a 242 µg h-1 en orina envellida de 168 hores, principalment a causa dels augments de p-cresol i m-formaldehid del fenol, així com del fenol. En canvi, les taxes d'alliberament d'altres compostos, com la 2-ciclohexen-1-ona i el decanal, van disminuir amb l'augment de l'edat de l'orina, la qual cosa es va correlacionar amb la disminució observada en la intensitat del senyal (abundància) al cromatograma (Fig. 5D)-G panell esquerre) i les respostes fisiològiques a aquests compostos (Fig. 5D-G panell dret).
En general, la barreja sintètica tenia una proporció natural similar de compostos bioactius identificats en extractes volàtils d'espais superiors d'orina fresca i envellida (Fig. 5D-G) i no semblava generar un atractiu significatiu en la cerca d'un hoste (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) o mosquits xucladors de sang (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Tanmateix, les comparacions post hoc per parells entre tractaments van mostrar que els mosquits que buscaven hostes eren significativament atractius per a la barreja sintètica d'orina envellida de 24 hores en comparació amb els controls de pentà (p = 0,0086; Figura 5H).
Per avaluar el paper dels components individuals en mescles sintètiques d'orina envellida durant 24 hores, es van avaluar sis mescles subtractives enfront de mescles completes en l'assaig de tub en Y, en què es van eliminar compostos individuals. Per als mosquits que busquen hostes, la resta de compostos individuals de la mescla completa va tenir un efecte significatiu en les respostes conductuals (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Fitxer addicional 1: Figura S2A), totes les mescles subtractives van ser més petites que completament barrejades. En canvi, l'eliminació de compostos individuals de la mescla totalment sintètica no va afectar les respostes conductuals dels mosquits xucladors de sang (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), amb l'excepció del decanal, que va resultar en nivells més baixos en comparació amb la mescla completa d'atracció (p = 0,022; Fitxer addicional 1: Figura S2B).
En un poble endèmic de la malària a Etiòpia, es va avaluar l'eficàcia d'una barreja sintètica d'orina de vaca de 24 hores per atraure mosquits en condicions de camp durant deu nits (Fig. 6A). Es van capturar i identificar un total de 4.861 mosquits, dels quals el 45,7% eren Anthropus.gambiae sl, el 18,9% eren Anopheles pharoensis i el 35,4% eren Culex spp. (Fitxer addicional 1: Taula S1). Anopheles arabinis és l'únic membre del complex d'espècies An.Gambian identificat mitjançant anàlisi PCR. De mitjana, es van capturar 320 mosquits per nit, temps durant el qual les trampes amb esquers de barreja sintètica van capturar més mosquits que les trampes aparellades sense barreja (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Es van col·locar trampes sense esquer en cadascuna de les cinc nits de control al principi, a la meitat i al final de l'assaig. Es va capturar un nombre similar de mosquits a cada parell de trampes, cosa que indica que no hi ha biaix entre les cases (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i que no hi ha disminució de la població durant el període d'estudi. En comparació amb les trampes de control, el nombre de mosquits capturats a les trampes que contenien la barreja sintètica va augmentar significativament: cerca d'hoste (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), alimentació recent de sang (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i embaràs (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Fitxer addicional 1: Taula S1). Això també es reflecteix en el nombre total de mosquits capturats: cerca d'hoste > xucladors de sang > embarassades > semiembarassades > mascles.
Avaluació de camp de l'eficàcia d'una barreja sintètica d'olor d'orina de vaca de 24 hores. Es van dur a terme assaigs de camp al centre-sud d'Etiòpia (mapa), prop de la ciutat de Maki (inserir), utilitzant una trampa de llum dels Centres per al Control i la Prevenció de Malalties (CDC) (dreta) en cases aparellades, amb un disseny quadrat llatí (imatge aèria) (A). Les fototrampes CDC amb esquer sintètic atrauen i capturen femelles d'Anopheles arabesques (B), però no Anopheles farroes (C), d'una manera diferent, un efecte fisiològic dependent de l'estat. A més, aquestes trampes van capturar un nombre significativament més gran de mosquits hostes Culex. (D) En comparació amb el control. Les barres de l'esquerra representen l'índex de selecció mitjà de mosquits capturats en parells d'esquer odorant (verd) i trampes de control (obertes) (N = 10), mentre que les barres de la dreta representen l'índex de selecció mitjà en parells de trampes de control (obertes; N = 5). Els asteriscs indiquen nivells de significació estadística (*p = 0,01 i ***p < 0,0001)
Les tres espècies es van capturar de manera diferent en trampes que contenien mescles sintètiques. Buscant hostes (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), ingerint sang (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i embaràs (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), es va trobar *.arabiensis* atrapat a la trampa alliberant la mescla sintètica (Fig. 6B), mentre que la quantitat d'*An* no va diferir. Es van trobar *Pharoensis* en diferents estats fisiològics (Fig. 6C). En el cas de *Culex*, només es va trobar un augment significatiu en el nombre de mosquits que buscaven hostes en trampes amb esquers amb la mescla sintètica (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), en comparació amb les trampes de control.
Es van utilitzar trampes d'esquer per a hostes situades fora dels hostes potencials entre els llocs de cria i les comunitats rurals a Etiòpia per avaluar si els mosquits de la malària utilitzen l'olor d'orina de vaca com a senyal d'hàbitat de l'hoste. En absència de senyals d'hoste, calor i amb o sense la presència d'olor d'orina de vaca, no es van capturar mosquits (Fitxer addicional 1: Figura S3). Tanmateix, en presència d'alta temperatura i olor d'orina de vaca, els mosquits femelles de la malària van ser atrets i capturats, encara que en petit nombre, independentment de l'edat de l'orina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Fitxer addicional 1: Figura S3). En canvi, els controls d'aigua no van capturar mosquits de la malària a altes temperatures (Fitxer addicional 1: Figura S3).
Els mosquits de la malària adquireixen i distribueixen compostos que contenen nitrogen mitjançant l'alimentació compensatòria d'orina de vaca (és a dir, tolls) per millorar els trets del cicle vital, de manera similar a altres insectes [2, 4, 24, 25, 26]. L'orina de vaca és un recurs renovable fàcilment disponible estretament associat amb els llocs de descans dels vectors de la malària, com ara les cobertures de vaques i la vegetació alta propera a les cases rurals i els llocs de desova. Els mosquits femelles localitzen aquest recurs per l'olfacte i són capaços de regular l'absorció de compostos nitrogenats a l'orina, inclosa la urea, el principal component nitrogenat de l'orina [15, 16]. Depenent de l'estat fisiològic del mosquit femella, els nutrients de l'orina s'assignen per millorar l'activitat de vol i la supervivència dels mosquits femelles que busquen hostes, així com la supervivència i les característiques reproductives dels individus alimentats amb sang durant el primer cicle gonadotròpic. Per tant, la barreja d'orina juga un paper nutricional important per als vectors de la malària que estan tancats com els adults desnodrits [8], ja que proporciona als mosquits femelles la capacitat d'adquirir importants compostos nitrogenats mitjançant una alimentació de baix risc. Aquesta troballa té conseqüències epidemiològiques significatives, ja que les femelles augmenten la seva l'esperança de vida, l'activitat i el rendiment reproductiu, tots els quals afecten la capacitat del vector. A més, aquest comportament pot ser l'objectiu de futurs programes de gestió de vectors.