A aquisição e distribuição de nutrientes integra o forrageamento do inseto e as características da história de vida.arabiensis agitação na urina de vaca para aquisição de nutrientes melhora as características da história de vida.
Certifique-se de que é seguro. arabiensis foi atraído pelo odor de urina de vaca fresca, de 24 horas, 72 horas e 168 horas, e as fêmeas em busca de hospedeiro e alimentadas com sangue (48 horas após a refeição de sangue) foram medidas em um olfatômetro de tubo Y e as fêmeas grávidas foram avaliadas para teste de desova. Uma análise química e eletrofisiológica combinada foi usada para identificar compostos bioativos na urina de vaca em todas as quatro classes de idade. Misturas sintéticas de bio os compostos ativos foram avaliados em testes de tubo Y e de campo. Para investigar a urina de vaca e seu principal composto contendo nitrogênio, a ureia, como potenciais dietas suplementares para vetores da malária, foram medidos os parâmetros de alimentação e as características da história de vida.
Procure o sangue e a nutrição do hospedeiro.Em estudos de laboratório e de campo, os árabes foram atraídos pelo cheiro natural e sintético da urina de vaca fresca e envelhecida.As fêmeas grávidas eram indiferentes às respostas da urina de vaca nos locais de desova.
Aquisição e distribuição de urina de vaca por Anopheles arabinis para melhorar as características da história de vida. A alimentação suplementar de urina de vaca afeta diretamente a capacidade do vetor aumentando a sobrevivência diária e a densidade do vetor e indiretamente alterando a atividade de voo e deve, portanto, ser considerada em modelos futuros.
A aquisição e distribuição de nutrientes integra o forrageamento do inseto e as características da história de vida [1,2,3]. Os insetos são capazes de selecionar e adquirir alimentos e realizar alimentação compensatória com base na disponibilidade de alimentos e requisitos de nutrientes [1, 3]. carniça, um processo conhecido como poças [2]. Embora uma variedade de espécies de borboletas e mariposas sejam descritas principalmente, bebedouros também ocorrem em outras ordens de insetos, e a atração e a alimentação desses tipos de recursos podem ter efeitos significativos na saúde e em outras características da história de vida [2, 4, 5, 6], 7]. , mas até agora esse comportamento tem sido negligenciado. O uso da agitação como meio de aumentar a ingestão de nutrientes nesse importante veículo merece atenção, pois pode ter consequências epidemiológicas importantes.
A ingestão de nitrogênio em mosquitos fêmeas adultas Anopheles é limitada devido às baixas reservas calóricas transportadas desde o estágio larval e à utilização ineficiente da refeição de sangue [9].A fêmea Ann.gambiae sl normalmente compensa isso suplementando com refeições suplementares de sangue [10, 11], colocando assim mais pessoas em risco de contrair a doença e colocando os mosquitos em maior risco de predação. como demonstrado por outros insetos [2]. A este respeito, a atração forte e distinta de uma das espécies irmãs dentro de An. O complexo de espécies sl da Gâmbia, Anopheles arabinis, urina de vaca fresca e envelhecida [12,13,14], é interessante. Anopheles arabinis é oportunista em suas preferências de hospedeiro e é conhecido por se associar e se alimentar de gado. [15, 16]. À medida que a urina da vaca envelhece, os microorganismos utilizam esses recursos para reduzir a complexidade dos compostos nitrogenados em 24 horas [15].
Neste estudo, Ans hospedeiro e alimentado com sangue foram procurados.Durante seu primeiro ciclo de gonadotropina, o arabiensis foi avaliado quanto à aquisição de compostos nitrogenados, incluindo ureia, por mistura de urina.Em seguida, uma série de experimentos foram conduzidos para avaliar como os mosquitos fêmeas alocam esse recurso potencial de nutrientes para melhorar a sobrevivência, reprodução e alimentação posterior. arabiensis descobriu correlações químicas por trás da atratividade diferencial observada.Misturas sintéticas de compostos orgânicos voláteis (VOCs) identificadas em urina envelhecida por 24 horas foram avaliadas em condições de campo, estendendo os resultados obtidos em condições de laboratório e demonstrando o efeito do odor de urina bovina em diferentes estados fisiológicos.Atração de mosquitos. Os resultados obtidos confirmam que An.arabiensis adquire e distribui compostos nitrogenados encontrados na urina de vertebrados para influenciar as características da história de vida. Esses resultados são discutidos no contexto de possíveis consequências epidemiológicas e como eles podem ser usados ​​para vigilância e controle de vetores.
Anopheles arabicans (estirpe Dongola) foram mantidos a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% UR e um ciclo claro:escuro de 12:12 h. As larvas foram criadas em bandejas plásticas (20 cm × 18 cm × 7 cm) cheias de água destilada e alimentadas com ração Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). As pupas foram coletadas em copos de 30 ml (Nolato Hertila, Ås torp, SE) e, em seguida, transferidos para gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) para permitir a emergência dos adultos. Os adultos receberam uma solução de sacarose a 10% ad libitum até 4 dias após a emergência (dpe), momento em que as fêmeas em busca de hospedeiro receberam dieta imediatamente antes do experimento, ou foram deixadas sem comer durante a noite com água destilada antes do experimento, conforme descrito abaixo. As fêmeas usadas para experimentos de tubo de voo passaram fome por apenas 4-6 horas com água ad libitum. Para preparar mosquitos sugadores de sangue para bioensaios subsequentes, 4 fêmeas dpe receberam sangue desfibrótico de ovelha (Håtunalab, Bro, SE) usando um sistema de alimentação por membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Reino Unido). as últimas fêmeas foram usadas para bioensaios de tubo de voo e transferidas para o laboratório, e então tiveram água destilada ad libitum por 4-6 horas antes do experimento.
Ensaios de alimentação foram usados ​​para quantificar o consumo de urina e ureia em fêmeas An.Arab adultas. Fêmeas em busca de hospedeiros e alimentadas com sangue receberam uma dieta contendo 1% de urina de vaca fresca e envelhecida diluída, várias concentrações de ureia e dois controles (10% de sacarose e água) por 48 h. adicionado à dieta e fornecido em uma matriz 4 × 4 em tubos de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EUA; Figura 1A) Preencher até a borda (~300 µl). cm °C e 65 ± 5% de umidade relativa. Esses experimentos foram repetidos de 5 a 10 vezes. Após a exposição à dieta, os mosquitos foram colocados a -20 °C até análise posterior.
Procure urina bovina e ureia absorvida pelo hospedeiro e pela fêmea sugadora de sangue Anopheles arabianus. No ensaio de alimentação (A), mosquitos fêmeas receberam uma dieta composta de urina de vaca fresca e envelhecida, várias concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O). Urina de vaca de 68 horas (B). O conteúdo médio de nitrogênio total (± desvio padrão) da urina é representado na inserção. Fêmeas em busca de hospedeiro (D, F) e sugadoras de sangue (E, G) absorvem uréia de maneira dependente da dose. Os volumes médios inalados (D, E) com nomes de letras diferentes foram significativamente diferentes uns dos outros (ANOVA unidirecional usando a análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da média (BE). As retas linha tracejada representa a linha de regressão log-linear (F, G)
Para liberar o alimento absorvido, os mosquitos foram colocados individualmente em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 230 µl de água destilada e o tecido foi rompido usando um pilão descartável e motor sem fio (VWR International, Lund, SE), seguido de centrifugação a 10 krpm por 10 min. O sobrenadante (200 µl) foi transferido para uma microplaca de 96 poços (Sigma-Aldrich) e a absorbância (λ620) foi determinada usando um leitor de microplacas baseado em espectrofotômetro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativamente, os mosquitos foram moídos em 1 ml de água destilada, 900 µl dos quais foram transferidos para uma cubeta para análise espectrofotométrica (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Para quantificar a ingestão alimentar, uma curva padrão foi preparada por diluição em série para produzir 0. 2 µl a 2,4 µl de 1 mg ml-1 de cianeto de xileno. Em seguida, a densidade óptica de concentrações conhecidas de corantes foi usada para determinar a quantidade de alimento que cada mosquito ingeriu.
Os dados de volume foram analisados ​​usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida por comparações pareadas post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA, 1989–2007). As análises de regressão linear descreveram a ingestão de ureia dependente da concentração e compararam as respostas entre mosquitos que procuram hospedeiros e sugadores de sangue (GraphPad Prism v8.0.0 para Mac, GraphPad Software, San Diego , CA, EUA).
Aproximadamente 20 µl de amostras de urina de cada faixa etária foram ligadas em Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) e encapsuladas em cápsulas de estanho (8 mm × 5 mm). -1) foi quantificado com base em concentrações conhecidas de ureia usadas como padrão.
Para avaliar o efeito da dieta na sobrevivência de fêmeas sugadoras de sangue e em busca de hospedeiro, os mosquitos foram colocados individualmente em grandes placas de Petri (12 cm de diâmetro e 6 cm de altura; Semadeni) com um orifício coberto de malha na tampa (3 cm de diâmetro) com ventilação e fornecimento de alimentos. tampão dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserido em uma seringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), o êmbolo removido e colocado em cima de uma placa de Petri (figura 1). ly analisados ​​usando curvas de sobrevivência de Kaplan-Meyer e testes de log-rank para comparar comparações de distribuição de sobrevivência entre dietas (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Um moinho voador de mosquitos personalizado baseado em Attisano et al. [17], feito de painéis de acrílico transparente de 5 mm de espessura (10 cm de largura x 10 cm de comprimento x 10 cm de altura) sem painéis frontal e traseiro (Fig. 3: superior). 0,5 cm L) dividiu o tubo vertical para formar um braço amarrado e um braço que carregava um pequeno pedaço de folha de alumínio como um sinal de interrupção de luz.
Fêmeas famintas por 24 horas receberam a dieta acima por 30 minutos antes da contenção. Os mosquitos fêmeas totalmente alimentados foram então anestesiados individualmente em gelo por 2-3 min e presos a alfinetes de insetos com cera de abelha (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) e então amarrados aos braços dos tubos horizontais. Moinho voador. b Software 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). O moinho de vôo foi colocado em uma sala climatizada (12 h:12 h, claro: escuro, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% UR).
Para visualizar o padrão de atividade de voo, a distância total voada (m) e o número total de atividades de voo consecutivas foram calculados por hora durante um período de 24 horas. Além disso, as distâncias médias voadas por mulheres individuais foram comparadas entre tratamentos e analisadas usando ANOVA unidirecional e análise post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), onde a distância média foi considerada uma variável dependente, enquanto o tratamento é um fator independente. Além disso, o número médio de rodadas é calculado em 1 incrementos de 0 minutos.
Para avaliar o efeito da dieta no desempenho reprodutivo de An.arabiensis, seis fêmeas (4 dpe) foram transferidas diretamente para gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) após a coleta de sangue e, em seguida, forneceram a dieta experimental por 48 h conforme descrito acima. regime dietético 20-50 vezes. Os ovos foram contados e registrados para cada gaiola experimental. Subamostras de ovos foram usadas para avaliar o tamanho médio e variação de comprimento de ovos individuais (n ≥ 200 por dieta) usando um microscópio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) equipado com uma câmera Leica (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Os ovos restantes foram mantidos em uma sala climatizada sob condições de criação padrão por 24 h, e uma subamostra de larvas de 1º instar recentemente emergidas (n ≥ 200 por dieta) foi medida, conforme descrito acima.
Os voláteis do headspace de urina fresca (1 hora após a amostragem), 24 horas, 72 horas e 168 horas foram coletados de amostras coletadas de gado Zebu, raças Arsi. Por conveniência, amostras de urina foram coletadas no início da manhã, enquanto as vacas ainda estavam no estábulo. ., Minden, DE) em 3 l de poliamida com tampa Em tambores de plástico de cloreto de vinil. Os voláteis do headspace de cada amostra de urina bovina foram coletados diretamente (frescos) ou após maturação em temperatura ambiente por 24 h, 72 h e 168 h, ou seja, cada amostra de urina foi representativa de cada faixa etária.
Para coleta de voláteis no headspace, um sistema de circuito fechado foi usado para circular um fluxo de gás filtrado por carvão ativado (100 ml min-1) através de uma bolsa de poliamida para a coluna de adsorção por 2,5 h usando uma bomba de vácuo de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). /80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, EUA) entre tampões de lã de vidro. Antes do uso, a coluna foi lavada com 1 ml de n-hexano redestilado (Merck, Darmstadt, DE) e 1 ml de pentano (solvente 99,0% puro grau GC, Sigma Aldrich). usado para análises posteriores.
Respostas comportamentais de An em busca de hospedeiro e ingestão de sangue. Extratos voláteis de headspace coletados de urina fresca, 24 h, 72 h e 168 h foram analisados ​​para extratos voláteis de mosquitos Arabidopsis usando um olfatômetro de tubo de vidro reto [18]. 5 cm id) foi iluminado com 3 ± 1 lx de luz vermelha de cima. Carvão filtrado e fluxo de ar umidificado (25 ± 2 °C, 65 ± 2% de umidade relativa) passou no bioensaio a 30 cm s-1. O ar é passado através de uma série de telas de malha de aço inoxidável, criando um fluxo laminar e uma estrutura de pluma uniforme. Dispensador de tampões dentários (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspenso de uma bobina de 5 cm em a extremidade de barlavento do olfatômetro, com trocas de estimulador a cada 5 minutos. Para análise, 10 μl de cada extrato de headspace, diluído 1:10, foi usado como estímulo. Uma quantidade igual de pentano foi usada como controle. Mosquitos individuais em busca de hospedeiro ou sugadores de sangue foram colocados em gaiolas de liberação individuais 2-3 horas antes do início do experimento. A gaiola de liberação foi colocada no lado do vento do olfatômetro e os mosquitos foram deixados agir clima por 1 min e, em seguida, a válvula borboleta da gaiola foi aberta para liberar. A atração para o tratamento ou controle foi analisada como a proporção de mosquitos que entraram em contato com a fonte dentro de 5 minutos após a liberação. Cada extrato volátil e controle de headspace foram replicados pelo menos 30 vezes e, para evitar os efeitos de qualquer dia, o mesmo número de tratamentos e controles foram testados em cada dia experimental. Procurar respostas de Ans hospedeiro e alimentado com sangue. proporções ímpares (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Resposta de desova de An. Extratos de headspace de urina de vaca fresca e envelhecida foram analisados ​​em gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Copos de plástico (30 mL; Nolato Hertila) preenchidos com 20 mL de água destilada forneceram o substrato de desova e foram colocados em cantos opostos da gaiola, separados por 24 cm. Os copos de tratamento foram ajustados com 10 μl de cada extrato de headspace a uma diluição de 1:10 ção. Uma quantidade igual de pentano foi usada para ajustar o copo de controle. Os copos de tratamento e de controle foram trocados entre cada experimento para controlar os efeitos de posição. Dez fêmeas alimentadas com sangue foram liberadas em gaiolas experimentais em ZT 9-11 e os ovos nos copos foram contados 24 horas depois. A fórmula para calcular o índice de desova é: (o número de ovos postos no copo de tratamento - o número de ovos postos no copo de controle)/(o número total de ovos postos). Cada tratamento foi repetido 8 vezes.
A análise por cromatografia gasosa e detecção de padrão de antena eletrônica (GC-EAD) de fêmeas de An.arabiensis foi realizada conforme descrito anteriormente [20]. Resumidamente, extratos voláteis de headspace frescos foram separados usando um Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, EUA) equipado com uma coluna HP-5 (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm de espessura de filme, Agilent Technologies).e urina envelhecida. O hidrogênio foi usado como a fase móvel com uma taxa de fluxo linear média de 45 cm s-1. Cada amostra (2 μl) foi injetada por 30 segundos no modo splitless com uma temperatura de entrada de 225 °C. A temperatura do forno GC foi programada de 35 °C (3 minutos de espera) a 300 °C (10 minutos de espera) a 10 °C min-1. No divisor de efluente GC, 4 psi de nitrogênio foi adicionado e dividido 1:1 em um cruzamento de baixo volume morto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) entre o detector de ionização de chama e o EAD. O capilar efluente GC para EAD foi passado por uma linha de transferência Gerstel ODP-2, que rastreia a temperatura do forno GC mais 5 °C, em um tubo de vidro (10 cm × 8 mm), onde foi misturado com ar umidificado filtrado por carbono (1,5 l min-1). A antena foi colocados a 0,5 cm da saída do tubo. Cada mosquito individual representou uma repetição e, para mosquitos em busca de hospedeiro, pelo menos três réplicas foram realizadas em amostras de urina de cada idade.
Identificação de compostos bioativos em coleções de headspace de urina bovina fresca e envelhecida usando um GC combinado e espectrômetro de massa (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) para obter respostas antenais na análise GC-EAD, operando no modo de ionização por impacto de elétrons a 70 eV. O GC foi equipado com uma coluna capilar de sílica fundida revestida com HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm de diâmetro interno, 0 Espessura de filme de 0,25 μm) usando hélio como fase móvel com uma taxa de fluxo linear média de 35 cm s-1. Uma amostra de 2 μl foi injetada usando as mesmas configurações do injetor e temperatura do forno da análise GC-EAD. Os compostos foram identificados com base em seu tempo de retenção (índice Kovát) e espectros de massa em comparação com a biblioteca personalizada e a biblioteca NIST14 (Agilent). Os compostos identificados foram confirmados pela injeção de padrões autênticos (Arquivo Adicional 1: Tabela S2). Para quantificação, acetato de heptila (10 ng, 99,8% de pureza química, Aldrich) foi injetado como padrão externo.
Avaliando a eficácia de uma mistura de odor sintético consistindo de compostos bioativos identificados em urina fresca e envelhecida para atrair Ans.arabiensis que procuram hospedeiros e sugadores de sangue, usando o mesmo olfatômetro e protocolo acima. ). Para análise, use 10 μl de uma diluição de 1:100 da mistura totalmente sintética, com uma taxa de liberação geral variando de aproximadamente 140-2400 ng h-1, para avaliar a atratividade para hospedeiros e mosquitos sugadores de sangue. Depois disso, o teste é realizado em misturas completas, nas quais misturas subtrativas de compostos únicos da mistura completa são removidas. Procurar respostas do hospedeiro e Ans.Arab alimentado com sangue vs misturas sintéticas e subtrativas foram analisadas usando regressão logística nominal seguido por comparações pareadas para proporções ímpares (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Para avaliar se a urina de vaca poderia servir como uma sugestão de habitat hospedeiro para mosquitos da malária, urina de vaca fresca e envelhecida, coletada conforme descrito acima, e água foram colocados em baldes de 3 litros (100 ml) e colocados em armadilhas de isca para hospedeiros.(versão BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dez armadilhas colocadas a 50 m uma da outra em pastagens, a 400 m da comunidade da aldeia (Silay, Etiópia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e sem gado, em criadouros permanentes e aldeias. Cinco armadilhas foram aquecidas para simular a presença de um hospedeiro, enquanto cinco armadilhas foram deixadas sem aquecimento. Cada local de tratamento é alternado todas as noites para um total de cinco noites. O número de mosquitos capturados em armadilhas iscadas com urina de diferentes idades foi comparado usando regressão logística com distribuição beta binomial (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Em uma vila endêmica de malária perto da cidade de Maki, região de Oromia, Etiópia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). O estudo foi conduzido entre meados de agosto e meados de setembro antes da pulverização residual interna anual, juntamente com uma longa estação chuvosa. 6A). Os critérios utilizados para selecionar as casas foram: nenhum animal permitido na casa, não foi permitido cozinhar dentro de casa (tirar lenha ou carvão) (pelo menos durante o período experimental) e casas com no máximo dois habitantes, dormindo em inseticidas.sob o mosquiteiro tratado. A aprovação ética foi concedida pelo Conselho de Revisão de Ética em Pesquisa Institucional (IRB/022/2016) da Faculdade de Ciências Naturais (CNS-IRB), Universidade de Addis Abeba, de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinque. × 2 quadrado latino, no qual misturas sintéticas e controles foram atribuídos a casas emparelhadas na primeira noite e trocadas entre casas na próxima noite experimental. Esse processo foi repetido dez vezes.
Uma mistura sintética contendo seis compostos bioativos foi dissolvida em heptano (97,0% de solvente grau GC, Sigma Aldrich) e liberada a 140 ng h-1 usando um dispensador de pavio de algodão [20]. O dispensador de pavio permitiu que todos os compostos fossem liberados em proporções constantes ao longo do experimento de 12 horas. , FL, EUA; Figura 6A).As armadilhas foram penduradas 0,8 – 1 m acima do solo, perto do pé da cama, e um voluntário dormiu sob um mosquiteiro não tratado e operado entre 18:00 e 06:30. l. Membros do complexo [23]. No estudo de campo, as armadilhas de casas emparelhadas foram analisadas usando um modelo de ajuste logístico nominal, onde a atração era a variável dependente e o tratamento (mistura sintética vs controle) era o efeito fixo (JMP® 14.0.0. Instituto SAS Inc.).Aqui, relatamos os valores de χ2 e p do teste de razão de verossimilhança.
Avalie se é seguro. arabiensis foi capaz de obter urina, sua principal fonte de nitrogênio, ureia, por alimentação direta, dentro de 48 h após a administração por 4 dias após (dpe) tentativas de alimentação de fêmeas alimentadas com sangue e em busca de hospedeiro (Fig. 1A). Fêmeas em busca de hospedeiro e sugadoras de sangue absorveram significativamente mais sacarose do que qualquer outra dieta ou água (F(5.426) = 20,15, p < 0,0001 e F(5, 299) = 56,00, p < 0,0001, respectivamente; Fig. 1B,C). Além disso, as fêmeas em busca de hospedeiro comeram menos na urina em 72 horas em comparação com a urina em 168 horas (Fig. 1B). F(10.813) = 15,72, p <0,0001; Figura 1D). Isso contrastava com a resposta de fêmeas alimentadas com sangue, que normalmente absorviam significativamente mais dietas contendo ureia do que água, embora significativamente menos que 10% de sacarose (F(10.557) = 78,35, p <0,0001; Figura 1).1E). Além disso, ao comparar entre os dois estados fisiológicos, as fêmeas flebotomizadas absorveram mais uréia do que as fêmeas em busca de hospedeiro nas concentrações mais baixas, e essas fêmeas absorveram quantidades semelhantes de uréia nas concentrações mais altas (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001;Fig. 1F, G). Embora a ingestão de uma dieta contendo ureia parecesse ter valores ótimos (Fig. 1D,E), as fêmeas em ambos os estados fisiológicos foram capazes de modular a quantidade de ureia absorvida em toda a faixa de concentrações de ureia de maneira log-linear (Fig. 1F,G).). Da mesma forma, os mosquitos parecem controlar sua absorção de nitrogênio regulando a quantidade de urina absorvida, pois a quantidade de nitrogênio na urina é refletida na quantidade absorvida (Figura 1B, inserções C e B).
Para avaliar os efeitos da urina e da ureia na sobrevivência dos mosquitos sugadores de sangue e em busca de hospedeiro, as fêmeas foram alimentadas com urina de todas as quatro idades (fresca, 24 h, 72 h e 168 h após a deposição) e uma variedade de concentrações de ureia, bem como água destilada e 10% de sacarose serviram como controle (Figura 2A). 108,5, df = 5, p < 0,0001; uréia: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) e fêmeas alimentadas com sangue (urina: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; uréia: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). Em todos os experimentos, as fêmeas alimentadas com uma dieta de urina, ureia e água tiveram taxas de sobrevivência significativamente mais baixas em comparação com as fêmeas alimentadas com uma dieta de sacarose (Figura 2B-E). A uréia 5 mM sobreviveu por mais tempo do que os controles de água (p < 0,04) (Fig.2C). Em comparação com a água, as mulheres alimentadas com urina fresca e urina de 24 horas sobreviveram mais tempo (p = 0,001 ep = 0,012, respectivamente; Figura 2D), enquanto as mulheres alimentadas com urina de 72 horas sobreviveram mais do que aquelas alimentadas com urina fresca curta e urina envelhecida de 24 horas (p < 0,0001 ep = 0,013, respectivamente; Figura 2D). Quando alimentadas com ureia 135 mM, fêmeas alimentadas com sangue sobreviveram mais do que todas as outras concentrações de uréia e água (p < 0,013; Figura 2E).
Sobrevivência do hospedeiro e da fêmea sugadora de sangue Anopheles arabinis alimentando-se de urina de vaca e uréia. a (C, E), e controles, Sacarose e água, estão mortos
A distância total e o número de voltas determinadas no teste de voo durante um período de 24 horas diferiram entre os mosquitos sugadores de sangue e buscadores de hospedeiro, que mostraram menos atividade de voo em geral (Fig. 3). principalmente diurna.Mosquitos fêmeas que forneceram sacarose ou urina de 72 horas mostraram atividade durante todo o período de 24 horas, enquanto as fêmeas que forneceram água foram mais ativas durante o período intermediário.Mosquitos alimentados com sacarose exibiram os níveis mais altos de atividade tarde da noite e no início da manhã, enquanto aqueles que ingeriram urina envelhecida de 72 horas experimentaram um declínio constante na atividade ao longo de 24 horas (Figura 3).
Desempenho de voo da fêmea sugadora de sangue caçadora Anopheles arabinis alimentando-se de urina de vaca e ureia. Foram registrados períodos de -hora (escuro: cinza; claro: branco). A distância média e o número médio de sessões são mostrados à direita do gráfico de atividade circadiana. As barras de erro representam o erro padrão da média. Análise estatística, consulte o texto
Em geral, a atividade geral de voo das fêmeas em busca de hospedeiro seguiu um padrão semelhante ao da distância de voo em um período de 24 horas. A distância média de voo foi significativamente afetada pela dieta ingerida (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e fêmeas em busca de hospedeiro que ingeriram 72 horas de urina voaram distâncias significativamente maiores em comparação com todas as outras dietas (p < 0,0001), e mosquitos alimentados com sacarose voaram mais do que frescos ( p = 0,022) e mosquitos alimentados com urina por 24 horas (p = 0,022). 138) = 1310,91, p < 0,0001). Fêmeas em busca de hospedeiro alimentadas com qualquer concentração de uréia voaram mais tempo do que as alimentadas com água ou sacarose (p < 0,03).
A atividade geral de voo dos mosquitos sugadores de sangue foi estável e sustentada por 24 horas em todas as dietas, com aumento da atividade de urina durante a segunda metade do período escuro para fêmeas alimentadas com água, bem como em fêmeas alimentadas frescas e com 24 horas de idade (imagem 3). Embora a dieta com urina tenha afetado significativamente a distância média de voo em fêmeas alimentadas com sangue (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), a dieta com ureia não (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) .com outra urina e dieta controle (fresca, p = 0,0091; 72 horas, p = 0,0022; 168 horas, p = 0,001; sacarose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Os efeitos da alimentação com urina e ureia nos parâmetros reprodutivos foram avaliados em bioensaios de postura (Figura 4A) e foram investigados de acordo com o número de ovos postos por cada fêmea, tamanho do ovo e larvas de primeiro ínstar recém-eclodidas. O número de ovos postos. mais ovos do que as fêmeas alimentadas com outras dietas de urina e foram semelhantes aos alimentados com sacarose (Fig. 4B). C). Além disso, a dieta com urina afetou significativamente o tamanho das larvas (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), com larvas significativamente maiores emergindo de ovos postos por fêmeas alimentadas com urina de 24 e 72 horas de idade do que de ovos postos por larvas de ovos. Fêmeas alimentadas com água e alimentadas com urina por 168 horas (Figura 4D).
Desempenho reprodutivo de fêmeas de Anopheles arabinis alimentadas com urina de vaca e ureia. Mosquitos fêmeas alimentados com sangue foram alimentados com dietas consistindo de urina de vaca fresca e envelhecida, várias concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O) por 48 horas antes de colocar em bioensaios e obter substratos para postura de ovos 48 horas (A). Número de ovos (B, E), tamanho do ovo (C, F) e tamanho das larvas (D, G) foram significativamente afetados a dieta fornecida (urina de vaca: BD; uréia: EG). As médias para cada parâmetro medido usando nomes de letras diferentes foram significativamente diferentes umas das outras (ANOVA de uma via usando a análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da média
Como o principal componente nitrogenado da urina, a uréia, quando fornecida como dieta para fêmeas alimentadas com sangue, afetou significativamente os parâmetros reprodutivos em todos os estudos. em concentrações de ureia de 134 µM ou acima colocam ovos maiores do que as fêmeas alimentadas com água (F(10, 4245) = 36,7; p <0,0001; Figura 4F), e o tamanho das larvas, embora afetado por concentrações semelhantes de ureia nas mães (F(10, 3305) = 37,9; p <0,0001) foi mais variável (Fig. 4G).
Atração geral para extratos voláteis de headspace de urina bovina em busca de hospedeiro. O arabiensis avaliado no olfatômetro de tubo de vidro (Fig. 5A) foi significativamente afetado pela idade da urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). A análise post hoc mostrou que o odor de urina rançosa em 24 horas causou níveis significativamente mais altos de atratividade em comparação com todos os outros tratamentos (72 horas: p = 0,0060, 16 8 horas: p = 0,012, pentano: p = 0,00070), Exceto pelo cheiro de urina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Embora a atração geral de mosquitos sugadores de sangue pelo odor da urina não tenha sido significativamente diferente (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), essas fêmeas foram significativamente mais atraentes para extratos voláteis de headspace em comparação com 72 horas urina envelhecida comparada aos controles (p = 0,0066; Figura 5C).
Respostas comportamentais a odores naturais e sintéticos de urina de vaca na busca por Anopheles arabianus hospedeiro e alimentado com sangue. Esquema do olfatômetro de tubo de vidro (A). Atração de extratos voláteis de headspace de urina de vaca fresca e envelhecida para hospedeiro (B) e mosquitos sugadores de sangue (C). Encontre a reação tentáculo do Lord An. Extratos de headspace isolados de frescos (D), 24 horas (E), 72 horas (F) e 168 horas (G) urina de vaca envelhecida são mostradas.Traços de detecção de antena eletrônica (EAD) mostram mudanças de voltagem em resposta a compostos bioativos no headspace eluídos do cromatógrafo a gás e detectados por um detector de ionização de chama (FID).A barra de escala representa a amplitude da resposta (mV) versus o tempo de retenção (s).As propriedades e taxas de liberação (µg h-1) dos compostos biologicamente ativos são mostradas. nd o hospedeiro (H) e o sugador de sangue (I) An.arabiensis tem apelos diferentes para misturas sintéticas de odores de urina de vaca fresca e envelhecida.p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da escala
Fêmea Ann.arabiensis, 72 he 120 h após a refeição de sangue, durante a desova, nenhuma preferência foi demonstrada por extratos voláteis de headspace de urina de vaca fresca e envelhecida em comparação com controles de pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; Arquivo adicional 1: Fig. S1).
Para fêmeas de Ann.arabiensis, as análises GC-EAD e GC-MS identificaram oito, seis, três e três compostos bioativos (Figura 5D-G). Embora tenham sido observadas diferenças no número de compostos que provocaram respostas eletrofisiológicas, a maioria desses compostos estava presente em cada extrato volátil de headspace coletado de urina fresca e envelhecida. Portanto, para cada extrato, apenas os compostos que produziram uma resposta fisiológica das antenas femininas acima do limite foram incluídos em análises posteriores.
A taxa total de liberação volátil de compostos bioativos na coleta de headspace aumentou de 29 µg h-1 em urina fresca para 242 µg h-1 em urina envelhecida por 168 horas, principalmente devido ao p-cresol e m-formaldeído Fenol aumenta, bem como fenol. o cromatograma (Fig. 5D)-G painel esquerdo) e respostas fisiológicas a esses compostos (Fig. 5D-G painel direito).
No geral, a mistura sintética tinha uma proporção natural semelhante de compostos bioativos identificados em extratos voláteis de espaços vazios de urina fresca e envelhecida (Fig. 5D-G) e não pareceu provocar apelo significativo na busca por um hospedeiro (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) ou mosquitos sugadores de sangue (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I ). No entanto, comparações post hoc aos pares entre os tratamentos mostraram que os mosquitos em busca de hospedeiro foram significativamente atraentes para a mistura sintética de urina envelhecida por 24 horas em comparação com os controles de pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Para avaliar o papel dos componentes individuais em misturas sintéticas de urina envelhecida por 24 horas, seis misturas subtrativas foram avaliadas contra misturas completas no ensaio do tubo Y, no qual os compostos individuais foram removidos. Menor do que totalmente misturado. Em contraste, a remoção de compostos individuais da mistura totalmente sintética não afetou as respostas comportamentais de mosquitos sugadores de sangue (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), com exceção do decanal, que resultou em níveis mais baixos em comparação com a mistura completa Atração (p = 0,022; Arquivo Adicional 1: Figura S2B).
Em uma vila endêmica de malária na Etiópia, a eficácia de uma mistura sintética de urina de vaca de 24 horas em atrair mosquitos em condições de campo foi avaliada por dez noites (Fig. 6A). Um total de 4.861 mosquitos foi capturado e identificado, dos quais 45,7% eram Anthropus.gambiae sl, 18,9% eram Anopheles pharoensis e 35,4% eram Culex spp. (Arquivo adicional 1: Tabela S1).A nopheles arabinis é o único membro do complexo de espécies An.Gambian identificado por análise de PCR. Em média, 320 mosquitos foram capturados por noite, durante o qual armadilhas com iscas de mistura sintética capturaram mais mosquitos do que armadilhas pareadas sem mistura (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). o número de mosquitos foi capturado em cada par de armadilhas, indicando que não houve viés entre as casas (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) e nenhum declínio populacional durante o período de estudo. χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e gravidez (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;Arquivo adicional 1: Tabela S1). Isso também se reflete no número total de mosquitos capturados: busca de hospedeiro > sugador de sangue > grávida > semi-grávida > macho.
Avaliação de campo da eficácia de uma mistura de odor de urina de vaca sintética de 24 horas. Testes de campo foram conduzidos no centro-sul da Etiópia (mapa), perto da cidade de Maki (inserir), usando uma armadilha de luz do Centro de Controle de Doenças (CDC) (à direita) em casas emparelhadas, com um desenho de quadrado latino (imagem aérea) (A). efeito dependente do estado. Além disso, essas armadilhas capturaram um número significativamente maior de mosquitos Culex hospedeiros. (D) Em comparação com o controle. As barras à esquerda representam o índice médio de seleção de mosquitos capturados em pares de iscas odoríferas (verde) e armadilhas de controle (abertas) (N = 10), enquanto as barras à direita representam o índice médio de seleção em pares de armadilhas de controle (abertas; N = 5).). Os asteriscos indicam níveis de significância estatística (*p = 0,01 e ***p < 0,0001)
As três espécies foram capturadas de forma diferente em armadilhas contendo misturas sintéticas. Procurando hospedeiro (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), alimentação sanguínea (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e gravidez (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) um .arabiensis foi capturado na armadilha liberando a mistura sintética (Fig. 6B), enquanto a quantidade de An não diferiu. Pharoensis em diferentes estados fisiológicos foram encontrados (Fig. 6C). Para Culex, apenas um aumento significativo no número de mosquitos em busca de hospedeiros foi encontrado em armadilhas com iscas com a mistura sintética (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), em comparação com as armadilhas de controle.
Armadilhas de iscas de hospedeiros localizadas fora de hospedeiros potenciais entre locais de reprodução e comunidades rurais na Etiópia foram usadas para avaliar se os mosquitos da malária usam odor de urina de vaca como uma sugestão de habitat do hospedeiro. 9, p = 0,13;Arquivo adicional 1: Figura S3). Em contraste, os controles de água não capturaram mosquitos da malária em altas temperaturas (Arquivo Adicional 1: Figura S3).
Os mosquitos da malária adquirem e distribuem compostos contendo nitrogênio por meio da alimentação compensatória com urina de vaca (isto é, poças) para melhorar as características da história de vida, semelhantes a outros insetos [2, 4, 24, 25, 26]. uréia, o principal componente nitrogenado da urina [15, 16]. Esse achado tem consequências epidemiológicas significativas, pois as fêmeas aumentam sua expectativa de vida, atividade e produção reprodutiva, o que afeta a capacidade do vetor. Além disso, esse comportamento pode ser alvo de futuros programas de manejo de vetores.