A aquisição e distribuição de nutrientes integram a busca por alimento e as características do ciclo de vida dos insetos. Para compensar deficiências em nutrientes específicos em diferentes estágios da vida, os insetos podem obter esses nutrientes por meio de alimentação suplementar, por exemplo, alimentando-se de secreções de vertebrados em um processo conhecido como "poças". O mosquito Anopheles arabiensis parece ser subnutrido e, portanto, necessita de nutrientes tanto para o metabolismo quanto para a reprodução. O objetivo deste estudo foi avaliar se a agitação de An. arabiensis em urina de vaca para obtenção de nutrientes melhora as características do seu ciclo de vida.
Certifique-se de que seja seguro. A espécie Psilocybe arabiensis foi atraída pelo odor de urina de vaca fresca, com 24 horas, 72 horas e 168 horas de idade. Fêmeas em busca de hospedeiro e alimentadas com sangue (48 horas após a refeição sanguínea) foram medidas em um olfatômetro em Y, e fêmeas grávidas foram avaliadas quanto à desova. Uma análise química e eletrofisiológica combinada foi então usada para identificar compostos bioativos na urina de vaca em todas as quatro classes de idade. Misturas sintéticas de compostos bioativos foram avaliadas em testes em Y e em campo. Para investigar a urina de vaca e seu principal composto nitrogenado, a ureia, como potenciais suplementos alimentares para vetores da malária, parâmetros de alimentação e características do ciclo de vida foram medidos. A proporção de mosquitos fêmeas e a quantidade de urina de vaca e ureia absorvidas foram avaliadas. Após a alimentação, as fêmeas foram avaliadas quanto à sobrevivência, voo em cativeiro e reprodução.
Buscam o sangue e o alimento do hospedeiro. Em estudos de laboratório e de campo, os árabes foram atraídos pelo odor natural e sintético da urina de vaca fresca e envelhecida. Fêmeas grávidas mostraram-se indiferentes às reações à urina de vaca nos locais de desova. Fêmeas em busca de hospedeiros e que se alimentam de sangue absorvem ativamente a urina e a ureia da vaca e alocam esses recursos de acordo com as compensações do ciclo de vida, em função do estado fisiológico para fuga, sobrevivência ou reprodução.
A aquisição e distribuição de urina de vaca pelo mosquito Anopheles arabinis visam melhorar as características do seu ciclo de vida. A suplementação alimentar com urina de vaca afeta a capacidade vetorial diretamente, aumentando a sobrevivência diária e a densidade de vetores, e indiretamente, alterando a atividade de voo, devendo, portanto, ser considerada em modelos futuros.
A aquisição e distribuição de nutrientes integram as características de forrageamento e história de vida dos insetos [1,2,3]. Os insetos são capazes de selecionar e adquirir alimento e realizar alimentação compensatória com base na disponibilidade de alimento e nas necessidades nutricionais [1, 3]. A distribuição de nutrientes depende do processo da história de vida e pode levar a diferentes necessidades de qualidade e quantidade da dieta em diferentes estágios de vida dos insetos [1, 2]. Para compensar deficiências em nutrientes específicos, os insetos podem obtê-los por meio de alimentação suplementar, como lama, vários excrementos e secreções de vertebrados e carniça, um processo conhecido como poças [2]. Embora uma variedade de espécies de borboletas e mariposas sejam descritas principalmente, os bebedouros também ocorrem em outras ordens de insetos, e a atração e a alimentação nesses tipos de recursos podem ter efeitos significativos na saúde e em outras características da história de vida [2, 4, 5, 6], 7]. O mosquito da malária Anopheles gambiae sensu lato (sl) emerge como um adulto 'desnutrido' [8], portanto, a ingestão de água pode desempenhar um papel importante em suas características de história de vida, Mas esse comportamento tem sido negligenciado até o momento. O uso da agitação como meio de aumentar a ingestão de nutrientes nesse importante veículo merece atenção, pois pode ter consequências epidemiológicas importantes.
A ingestão de nitrogênio em fêmeas adultas de mosquitos Anopheles é limitada devido às baixas reservas calóricas provenientes do estágio larval e à utilização ineficiente do sangue ingerido [9]. Fêmeas de Ann. gambiae sl geralmente compensam essa limitação com refeições suplementares de sangue [10, 11], aumentando assim o risco de transmissão da doença para as pessoas e aumentando a vulnerabilidade dos mosquitos à predação. Alternativamente, os mosquitos podem utilizar a alimentação suplementar com excrementos de vertebrados para adquirir compostos nitrogenados que melhoram a adaptação e a capacidade de voo, como demonstrado por outros insetos [2]. Nesse sentido, a forte e distinta atração de uma das espécies irmãs do complexo de espécies An. gambiae sl, Anopheles arabinis, por urina de vaca fresca e envelhecida [12, 13, 14] é interessante. Anopheles arabinis é oportunista em suas preferências por hospedeiros e é conhecido por se associar e se alimentar de gado. A urina de vaca é um recurso rico em compostos nitrogenados, com a ureia representando de 50 a 95% do nitrogênio total na urina fresca. [15, 16].À medida que a urina da vaca envelhece, os microrganismos utilizam esses recursos para reduzir a complexidade dos compostos nitrogenados em 24 horas [15].Com o rápido aumento da amônia, associado a uma diminuição do nitrogênio orgânico, os microrganismos alcalofílicos (muitos dos quais produzem compostos tóxicos para mosquitos) prosperam [15], o que pode ser fêmea Ann. arabiensis é preferencialmente atraída por urina envelhecida por 24 horas ou menos [13, 14].
Neste estudo, buscou-se identificar hospedeiros e mosquitos Ans alimentados com sangue. Durante seu primeiro ciclo de gonadotrofinas, a espécie An. arabiensis foi avaliada quanto à aquisição de compostos nitrogenados, incluindo ureia, por meio da mistura de urina. Em seguida, uma série de experimentos foi conduzida para avaliar como as fêmeas de mosquito alocam esse potencial recurso nutricional para melhorar a sobrevivência, a reprodução e a busca por alimento. Finalmente, o odor da urina fresca e envelhecida de vaca foi avaliado para determinar se fornecia pistas confiáveis ​​para hospedeiros e mosquitos Ans alimentados com sangue. Em sua busca por esse potencial recurso nutricional, An. arabiensis descobriu correlações químicas por trás da atratividade diferencial observada. Misturas sintéticas de compostos orgânicos voláteis (COVs) identificados na urina envelhecida por 24 horas foram posteriormente avaliadas em condições de campo, ampliando os resultados obtidos em laboratório e demonstrando o efeito do odor da urina bovina em diferentes estados fisiológicos. Atração de mosquitos. Os resultados obtidos confirmam que An. A espécie Psilocybe arabiensis adquire e distribui compostos nitrogenados presentes na urina de vertebrados, influenciando características do seu ciclo de vida. Esses resultados são discutidos no contexto das potenciais consequências epidemiológicas e de como podem ser utilizados para a vigilância e o controle de vetores.
Os mosquitos Anopheles arabicans (cepa Dongola) foram mantidos a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% de umidade relativa e um ciclo claro/escuro de 12:12 h. As larvas foram criadas em bandejas de plástico (20 cm × 18 cm × 7 cm) preenchidas com água destilada e alimentadas com ração para peixes Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Alemanha). As pupas foram coletadas em copos de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Suécia) e transferidas para gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) para permitir a emergência dos adultos. Os adultos receberam uma solução de sacarose a 10% ad libitum até 4 dias após a emergência (dpe), momento em que as fêmeas em busca de hospedeiros receberam a dieta imediatamente antes do experimento ou foram mantidas em jejum durante a noite com água destilada antes do experimento, conforme descrito. As fêmeas utilizadas nos experimentos em tubo de voo foram mantidas em jejum por apenas 4 a 6 horas, com água à vontade. Para preparar mosquitos hematófagos para os bioensaios subsequentes, fêmeas com 4 dias pós-exposição (dpe) receberam sangue de ovelha desfibrótico (Håtunalab, Bro, Suécia) utilizando um sistema de alimentação por membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Reino Unido). As fêmeas totalmente congestionadas foram então transferidas para gaiolas individuais e alimentadas diretamente com a dieta descrita abaixo, ou com uma solução de sacarose a 10% à vontade, durante os 3 dias que antecederam os experimentos descritos abaixo. Essas últimas fêmeas foram utilizadas nos bioensaios em tubo de voo e transferidas para o laboratório, onde receberam água destilada à vontade por 4 a 6 horas antes do experimento.
Ensaios de alimentação foram utilizados para quantificar o consumo de urina e ureia em fêmeas adultas de An. arab. Fêmeas em busca de hospedeiros e alimentadas com sangue receberam uma dieta contendo 1% de urina de vaca fresca e envelhecida diluída, várias concentrações de ureia e dois controles (10% de sacarose e água) por 48 horas. Além disso, corante alimentar (1 mg ml-1 de xileno cianeto FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suécia) foi adicionado à dieta e fornecido em uma matriz 4 × 4 em tubos de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EUA; Figura 1A). Os tubos foram preenchidos até a borda (~300 µl). Para evitar a competição entre os mosquitos e os potenciais efeitos da cor do corante, 10 mosquitos foram colocados em uma placa de Petri grande (12 cm de diâmetro e 6 cm de altura; Semadeni, Ostermundigen, Suíça; Figura 1A) na completa escuridão. a 25 ± 2 cm °C e 65 ± 5% de umidade relativa. Esses experimentos foram repetidos de 5 a 10 vezes. Após a exposição à dieta, os mosquitos foram colocados a -20 °C até análises posteriores.
Procure por urina bovina e ureia absorvidas pelo hospedeiro e pela fêmea hematófaga de Anopheles arabianus. No teste de alimentação (A), mosquitos fêmeas receberam uma dieta composta por urina de vaca fresca e envelhecida, várias concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O). Fêmeas em busca de hospedeiro (B) e fêmeas alimentadas com sangue (C) absorveram mais sacarose do que qualquer outra dieta testada. Observe que as fêmeas em busca de hospedeiro absorveram menos urina de vaca de 72 horas do que urina de vaca de 168 horas (B). O teor médio de nitrogênio total (± desvio padrão) da urina é representado no gráfico inserido. Fêmeas em busca de hospedeiro (D, F) e fêmeas hematófagas (E, G) absorvem ureia de maneira dose-dependente. Os volumes médios inalados (D, E) com nomes de letras diferentes foram significativamente diferentes entre si (ANOVA de uma via com análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). A linha tracejada reta A linha representa a linha de regressão log-linear (F, G)
Para liberar o alimento absorvido, os mosquitos foram colocados individualmente em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 230 µl de água destilada e o tecido foi rompido utilizando um pistilo descartável e um motor sem fio (VWR International, Lund, Suécia), seguido de centrifugação a 10.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante (200 µl) foi transferido para uma microplaca de 96 poços (Sigma-Aldrich) e a absorbância (λ620 nm) foi determinada utilizando um leitor de microplacas baseado em espectrofotômetro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha). Alternativamente, os mosquitos foram macerados em 1 ml de água destilada, dos quais 900 µl foram transferidos para uma cubeta para análise espectrofotométrica (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, Suécia). Para quantificar a ingestão alimentar, uma curva padrão foi preparada por diluição seriada até Obteve-se um rendimento de 0,2 µl a 2,4 µl de cianeto de xileno a 1 mg ml-1. Em seguida, a densidade óptica de concentrações conhecidas do corante foi usada para determinar a quantidade de alimento ingerida por cada mosquito.
Os dados de volume foram analisados ​​usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida por comparações múltiplas post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA, 1989–2007). Análises de regressão linear descreveram a ingestão de ureia dependente da concentração e compararam as respostas entre mosquitos em busca de hospedeiros e mosquitos hematófagos (GraphPad Prism v8.0.0 para Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Aproximadamente 20 µl de amostras de urina de cada faixa etária foram fixadas em Chromosorb® W/AW (10 mg, 80/100 mesh, Sigma Aldrich) e encapsuladas em cápsulas de estanho (8 mm × 5 mm). As cápsulas foram inseridas na câmara de combustão de um analisador CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) para determinar o teor de nitrogênio na urina fresca e envelhecida, de acordo com o protocolo do fabricante. O nitrogênio total (g N l-1) foi quantificado com base em concentrações conhecidas de ureia, utilizadas como padrão.
Para avaliar o efeito da dieta na sobrevivência de fêmeas em busca de hospedeiros e durante a alimentação sanguínea, os mosquitos foram colocados individualmente em placas de Petri grandes (12 cm de diâmetro e 6 cm de altura; Semadeni) com um orifício na tampa (3 cm de diâmetro) coberto por uma tela para ventilação e fornecimento de alimento. As dietas foram fornecidas imediatamente após 4 dias pós-exposição (dpe) e incluíram urina de vaca fresca e envelhecida diluída a 1%, quatro concentrações de ureia e dois controles: sacarose a 10% e água. Cada dieta foi pipetada em um tampão dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, Suécia) inserido em uma seringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gotemburgo, Suécia), o êmbolo foi removido e colocado sobre uma placa de Petri (Figura 1). 1A). Troque a dieta diariamente. Mantenha o laboratório conforme descrito acima. Os mosquitos sobreviventes foram contados duas vezes ao dia, enquanto os mosquitos mortos foram descartados até que o último mosquito morresse (n = 40 por tratamento). A sobrevivência dos mosquitos alimentados com várias dietas foi avaliada. As dietas foram analisadas estatisticamente usando curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e testes de log-rank para comparar a distribuição de sobrevivência entre as dietas (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Um moinho voador personalizado para mosquitos, baseado em Attisano et al. [17], feito de painéis de acrílico transparente de 5 mm de espessura (10 cm de largura x 10 cm de comprimento x 10 cm de altura) sem painéis frontal e traseiro (Fig. 3: superior). Um conjunto de pivô com um tubo vertical feito de uma coluna de cromatografia gasosa (0,25 mm de diâmetro interno; 7,5 cm de comprimento) com extremidades coladas a uma agulha entomológica suspensa entre um par de ímãs de neodímio a 9 cm de distância. Um tubo horizontal feito do mesmo material (6,5 cm de comprimento) dividia o tubo vertical ao meio para formar um braço preso por um fio e um braço que carregava um pequeno pedaço de folha de alumínio como sinal de interrupção de luz.
Fêmeas em jejum de 24 horas receberam a dieta acima por 30 minutos antes da contenção. Mosquitos fêmeas totalmente alimentados foram então anestesiados individualmente em gelo por 2 a 3 minutos e fixados em alfinetes entomológicos com cera de abelha (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, Suécia) e, em seguida, amarrados aos braços dos tubos horizontais. Moinho de voo. As revoluções por voo foram registradas por um registrador de dados personalizado, armazenadas e exibidas usando o software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, Bélgica). O moinho de voo foi colocado em uma sala com temperatura controlada (12 h:12 h, claro:escuro, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% UR).
Para visualizar o padrão de atividade de voo, a distância total percorrida (m) e o número total de voos consecutivos foram calculados por hora, ao longo de um período de 24 horas. Além disso, as distâncias médias percorridas por cada fêmea foram comparadas entre os tratamentos e analisadas por meio de ANOVA de uma via e teste post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), onde a distância média foi considerada a variável dependente e o tratamento, o fator independente. Adicionalmente, o número médio de voos foi calculado em incrementos de 10 minutos.
Para avaliar o efeito da dieta no desempenho reprodutivo de An. arabiensis, seis fêmeas (4 dpe) foram transferidas diretamente para gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) após a coleta de sangue e, em seguida, receberam a dieta experimental por 48 h, conforme descrito acima. As dietas foram então removidas e copos de desova (30 ml; Nolato Hertila) preenchidos com 20 ml de água destilada foram fornecidos no terceiro dia por 48 horas, com troca a cada 24 horas. Cada regime alimentar foi repetido de 20 a 50 vezes. Os ovos foram contados e registrados para cada gaiola experimental. Subamostras de ovos foram utilizadas para avaliar o tamanho médio e a variação de comprimento de ovos individuais (n ≥ 200 por dieta) utilizando um microscópio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Alemanha) equipado com uma câmera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Os ovos restantes foram mantidos em uma sala com temperatura controlada, sob condições padrão de criação, por 24 horas, e uma subamostra de larvas de primeiro instar recém-emergidas (n ≥ 200 por dieta) foi medida, conforme descrito acima. O número de ovos e o tamanho dos ovos e larvas foram comparados entre os tratamentos usando ANOVA de uma via e análise post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Os compostos voláteis do espaço livre da urina fresca (1 hora após a coleta), bem como da urina maturada por 24, 72 e 168 horas, foram coletados de amostras de urina de bovinos zebu da raça Arsi. Para maior praticidade, as amostras de urina foram coletadas no início da manhã, enquanto as vacas ainda estavam no estábulo. As amostras de urina foram coletadas de 10 animais e 100-200 ml de cada amostra foram transferidos para sacos de poliamida individuais (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Alemanha) dentro de tambores de plástico de cloreto de vinila de 3 litros com tampa. Os compostos voláteis do espaço livre de cada amostra de urina bovina foram coletados diretamente (fresca) ou após maturação à temperatura ambiente por 24, 72 e 168 horas, ou seja, cada amostra de urina foi representativa de cada faixa etária.
Para a coleta de compostos voláteis no espaço livre, utilizou-se um sistema de circuito fechado para circular um fluxo de gás filtrado com carvão ativado (100 ml min⁻¹) através de um saco de poliamida até a coluna de adsorção por 2,5 h, utilizando uma bomba de vácuo de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, Alemanha). Como controle, a coleta do espaço livre foi realizada a partir de um saco de poliamida vazio. A coluna de adsorção era composta por um tubo de Teflon (5,5 cm x 3 mm de diâmetro interno) contendo 35 mg de Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, EUA) entre tampões de lã de vidro. Antes do uso, a coluna foi lavada com 1 ml de n-hexano redestilado (Merck, Darmstadt, Alemanha) e 1 ml de pentano (solvente com pureza de 99,0%, grau GC, Sigma Aldrich). Os compostos voláteis adsorvidos foram eluídos com 400 μl de pentano. As amostras coletadas do espaço livre foram reunidas e armazenadas a -20 °C. até ser utilizado para análises posteriores.
Respostas comportamentais de An em busca de hospedeiros e hematófagos. Extratos voláteis do espaço de cabeça coletados de urina fresca, envelhecida por 24 h, 72 h e 168 h foram analisados ​​para extratos voláteis de mosquitos Arabidopsis usando um olfatômetro de tubo de vidro reto [18]. Os experimentos foram conduzidos durante ZT 13-15, o período de pico da atividade de busca de hospedeiro de An. Arab [19]. Um olfatômetro de tubo de vidro (80 cm × 9,5 cm d.i.) foi iluminado com 3 ± 1 lx de luz vermelha por cima. Um fluxo de ar filtrado com carvão ativado e umidificado (25 ± 2 °C, 65 ± 2% de umidade relativa) passou pelo bioensaio a 30 cm s-1. O ar passa por uma série de telas de malha de aço inoxidável, criando um fluxo laminar e uma estrutura de pluma uniforme. Dispensador de tampão dental (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental) AB), suspenso por uma bobina de 5 cm na extremidade a favor do vento do olfatômetro, com trocas do estimulador a cada 5 minutos. Para análise, 10 μl de cada extrato do espaço de cabeça, diluído 1:10, foram usados ​​como estímulo. Uma quantidade igual de pentano foi usada como controle. Mosquitos individuais em busca de hospedeiro ou se alimentando de sangue foram colocados em gaiolas de liberação individuais 2 a 3 horas antes do início do experimento. A gaiola de liberação foi colocada no lado a favor do vento do olfatômetro, e os mosquitos foram aclimatados por 1 minuto. Em seguida, a válvula borboleta da gaiola foi aberta para a liberação. A atração pelo tratamento ou controle foi analisada como a proporção de mosquitos que entraram em contato com a fonte dentro de 5 minutos após a liberação. Cada extrato volátil do espaço de cabeça e controle foram replicados pelo menos 30 vezes e, para evitar os efeitos de um único dia, o mesmo número de tratamentos e controles foi testado em cada dia experimental. As respostas de busca de hospedeiro e de Ans. arabica alimentada com sangue versus conjuntos de espaço de cabeça foram Os dados foram analisados ​​utilizando regressão logística nominal, seguida de comparações aos pares para obtenção das razões de chances (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Resposta de desova de An. Extratos do espaço livre da urina fresca e envelhecida de vaca foram analisados ​​em gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Copos de plástico (30 mL; Nolato Hertila) preenchidos com 20 mL de água destilada forneceram o substrato de desova e foram colocados em cantos opostos da gaiola, a 24 cm de distância. Os copos de tratamento foram ajustados com 10 μL de cada extrato do espaço livre em uma diluição de 1:10. Uma quantidade igual de pentano foi usada para ajustar o copo de controle. Os copos de tratamento e controle foram trocados entre cada experimento para controlar os efeitos da posição. Dez fêmeas alimentadas com sangue foram liberadas nas gaiolas experimentais entre ZT 9 e 11, e os ovos nos copos foram contados 24 horas depois. A fórmula para calcular o índice de desova é: (número de ovos depositados no copo de tratamento – número de ovos depositados no copo de controle)/(número total de ovos depositados). Cada tratamento foi repetido 8 vezes.
A análise por cromatografia gasosa e detecção de padrão de antena de elétrons (GC-EAD) de fêmeas de An.arabiensis foi realizada conforme descrito anteriormente [20]. Resumidamente, extratos voláteis frescos do espaço de cabeça foram separados usando um GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, EUA) equipado com uma coluna HP-5 (30 m × 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espessura do filme, Agilent Technologies). e urina envelhecida. Hidrogênio foi usado como fase móvel com uma vazão linear média de 45 cm s-1. Cada amostra (2 μl) foi injetada por 30 segundos no modo sem divisão de fluxo (splitless) com uma temperatura de entrada de 225 °C. A temperatura do forno do GC foi programada de 35 °C (3 minutos de espera) a 300 °C (10 minutos de espera) a 10 °C min-1. No divisor de efluente do GC, 4 psi de nitrogênio foram adicionados e divididos 1:1 em uma cruzeta de baixo volume morto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, Alemanha) entre o detector de ionização de chama e o EAD. O capilar de efluente do GC para o EAD foi passado através de uma linha de transferência Gerstel ODP-2, que acompanha a temperatura do forno do GC mais 5 °C, para um tubo de vidro (10 cm × 8 mm), onde foi misturado com ar umidificado filtrado com carvão ativado (1,5 l min−1). A antena foi colocada a 0,5 cm da saída do tubo. Cada mosquito individual representou uma réplica e, para mosquitos em busca de hospedeiros, foram realizadas pelo menos três réplicas em amostras de urina de cada idade.
Identificação de compostos bioativos em amostras de headspace de urina bovina fresca e envelhecida utilizando um sistema combinado de cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) para obter respostas antenais na análise GC-EAD, operando no modo de ionização por impacto eletrônico a 70 eV. O GC foi equipado com uma coluna capilar de sílica fundida revestida com HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 μm de espessura do filme) utilizando hélio como fase móvel com uma vazão linear média de 35 cm s⁻¹. Uma amostra de 2 μL foi injetada utilizando as mesmas configurações de injetor e temperatura do forno da análise GC-EAD. Os compostos foram identificados com base em seu tempo de retenção (índice de Kovát) e espectros de massas comparados à biblioteca personalizada e à biblioteca NIST14 (Agilent). Os compostos identificados foram confirmados pela injeção de padrões autênticos (Arquivo Adicional 1: Tabela). S2). Para a quantificação, acetato de heptila (10 ng, pureza química de 99,8%, Aldrich) foi injetado como padrão externo.
Avaliar a eficácia de uma mistura sintética de odores, composta por compostos bioativos identificados em urina fresca e envelhecida, para atrair Ans. arabiensis em busca de hospedeiros e hematófagos, utilizando o mesmo olfatômetro e protocolo descritos anteriormente. As misturas sintéticas mimetizaram a composição e as proporções dos compostos presentes nos extratos voláteis do espaço de cabeça de urina fresca e urina envelhecida por 24, 48, 72 e 168 horas (Figura 5D-G; Arquivo Adicional 1: Tabela S2). Para a análise, utilizar 10 μl de uma diluição 1:100 da mistura totalmente sintética, com uma taxa de liberação geral variando de aproximadamente 140 a 2400 ng h⁻¹, para avaliar a atratividade para mosquitos hospedeiros e hematófagos. Posteriormente, o teste foi realizado com as misturas completas, das quais as misturas subtrativas de compostos individuais da mistura completa foram removidas. As respostas de busca de hospedeiros e Ans. arabiensis alimentados com sangue versus misturas sintéticas e subtrativas foram analisadas utilizando valores nominais. Regressão logística seguida de comparações aos pares para razões de chances (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Para avaliar se a urina de vaca poderia servir como um indicador de habitat para mosquitos da malária, urina fresca e envelhecida de vaca, coletada conforme descrito acima, e água foram colocadas em baldes telados de 3 litros (100 ml) e inseridas em armadilhas com isca para hospedeiros (versão BG-HDT; BioGents, Regensburg, Alemanha). Dez armadilhas foram colocadas a 50 m de distância umas das outras em pastagens, a 400 m da comunidade da aldeia (Silay, Etiópia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e sem gado, em criadouros permanentes e aldeias. Cinco armadilhas foram aquecidas para simular a presença de um hospedeiro, enquanto cinco armadilhas permaneceram sem aquecimento. Cada local de tratamento foi rotacionado todas as noites, por um total de cinco noites. O número de mosquitos capturados nas armadilhas com isca de urina de diferentes idades foi comparado usando regressão logística com distribuição beta binomial (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Em uma aldeia endêmica de malária perto da cidade de Maki, região de Oromia, Etiópia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A), o estudo foi conduzido entre meados de agosto e meados de setembro, antes da pulverização residual intradomiciliar anual, durante uma longa estação chuvosa. Cinco pares de casas (com distância entre 20 e 50 m) localizadas nos arredores da aldeia foram selecionadas para o estudo (Figura 6A). Os critérios utilizados para a seleção das casas foram: proibição de animais na residência, proibição de cozinhar dentro de casa (com lenha ou carvão) (pelo menos durante o período do estudo) e casas com no máximo dois habitantes, que não tivessem sido submetidos à aplicação de inseticidas. sob a rede mosquiteira tratada. A aprovação ética foi concedida pelo Comitê de Ética em Pesquisa Institucional (IRB/022/2016) da Faculdade de Ciências Naturais (CNS-IRB) da Universidade de Addis Abeba, em conformidade com as diretrizes estabelecidas pela Declaração de Helsinque da Associação Médica Mundial. O consentimento de cada chefe de família foi obtido com o auxílio de agentes comunitários de saúde. Todo o processo foi endossado pelas administrações locais nos níveis distrital e de bairro ('kebele'). O delineamento experimental seguiu um quadrado latino 2 × 2, no qual as misturas sintéticas e os controles foram alocados a pares de casas na primeira noite e trocados entre as casas na noite experimental seguinte. Esse processo foi repetido dez vezes. Além disso, para estimar a atividade dos mosquitos em casas selecionadas, as armadilhas CDC foram programadas para funcionar por cinco noites consecutivas no início, meio e fim do experimento de campo, sempre no mesmo horário.
Uma mistura sintética contendo seis compostos bioativos foi dissolvida em heptano (97,0% de solvente, grau GC, Sigma Aldrich) e liberada a 140 ng h-1 usando um dispensador de pavio de algodão [20]. O dispensador de pavio permitiu que todos os compostos fossem liberados em proporções constantes ao longo do experimento de 12 horas. O heptano foi usado como controle. O frasco foi suspenso próximo ao ponto de entrada da armadilha luminosa dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, EUA; Figura 6A). As armadilhas foram penduradas a 0,8–1 m do chão, perto dos pés da cama, e um voluntário dormiu sob um mosquiteiro não tratado, sendo operadas entre 18h00 e 6h30. Os mosquitos capturados, separados por sexo e estado fisiológico (não alimentados, alimentados, semi-grávidos e grávidos [21]), foram posteriormente triados usando a análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificar a espécie morfologicamente identificada como A. gambiae. sl. Membros do complexo [23]. No estudo de campo, a captura em pares de casas foi analisada usando um modelo de ajuste logístico nominal, onde a atração foi a variável dependente e o tratamento (mistura sintética vs controle) foi o efeito fixo (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Aqui, relatamos os valores de χ2 e p do teste da razão de verossimilhança.
Avalie se é seguro. A espécie *A. arabiensis* foi capaz de obter urina, sua principal fonte de nitrogênio, ureia, por alimentação direta, dentro de 48 horas após a administração, durante 4 dias após os testes de alimentação de fêmeas em busca de hospedeiro e alimentadas com sangue (Figura 1A). Tanto as fêmeas em busca de hospedeiro quanto as que se alimentavam de sangue absorveram significativamente mais sacarose do que qualquer outra dieta ou água (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 e F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectivamente; Figuras 1B e 1C). Além disso, as fêmeas em busca de hospedeiro ingeriram menos urina após 72 horas em comparação com a urina após 168 horas (Figura 1B). Quando oferecida uma dieta contendo ureia, as fêmeas em busca de hospedeiro absorveram uma quantidade significativamente maior de ureia a 2,69 mM em comparação com todas as outras concentrações e água, enquanto a absorção foi indistinguível da observada com 10% de sacarose. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Isso contrastou com a resposta das fêmeas alimentadas com sangue, que tipicamente absorveram significativamente mais dietas contendo ureia do que água, embora significativamente menos do que sacarose a 10% (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1E). Além disso, ao comparar os dois estados fisiológicos, as fêmeas flebotomizadas absorveram mais ureia do que as fêmeas em busca de hospedeiro nas concentrações mais baixas, e essas fêmeas absorveram quantidades semelhantes de ureia em concentrações mais altas (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Embora a ingestão de uma dieta contendo ureia parecesse ter valores ótimos (Fig. 1D, E), as fêmeas em ambos os estados fisiológicos foram capazes de modular a quantidade de ureia absorvida. em toda a gama de concentrações de ureia de forma log-linear (Fig. 1F,G). Da mesma forma, os mosquitos parecem controlar a absorção de nitrogênio regulando a quantidade de urina absorvida, uma vez que a quantidade de nitrogênio na urina se reflete na quantidade absorvida (Figura 1B, C e B, inserções).
Para avaliar os efeitos da urina e da ureia na sobrevivência de mosquitos em busca de hospedeiros e após se alimentarem de sangue, fêmeas foram alimentadas com urina de quatro idades (fresca, 24 h, 72 h e 168 h após a deposição) e com uma variedade de concentrações de ureia, além de água destilada e sacarose a 10% como controle (Figura 2A). Esta análise de sobrevivência mostrou que a dieta teve um efeito significativo na sobrevivência geral de fêmeas em busca de hospedeiros (urina: χ² = 108,5, gl = 5, p < 0,0001; ureia: χ² = 122,8, gl = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) e de fêmeas que se alimentaram de sangue (urina: χ² = 93,0, gl = 5, p < 0,0001; ureia: χ² = 137,9, gl = 5, p < 0,0001). 0,0001; Figura 2D,E). Em todos os experimentos, as fêmeas alimentadas com uma dieta de urina, ureia e água apresentaram taxas de sobrevivência significativamente menores em comparação com as fêmeas alimentadas com uma dieta de sacarose (Figura 2B-E). Fêmeas em busca de hospedeiros alimentadas com urina fresca e urina envelhecida exibiram diferentes taxas de sobrevivência, sendo que aquelas alimentadas com urina envelhecida por 72 horas (p = 0,016) apresentaram a menor probabilidade de sobrevivência (Fig. 2B). Além disso, fêmeas em busca de hospedeiros alimentadas com 135 mM de ureia sobreviveram por mais tempo do que os controles com água (p < 0,04) (Fig. 2C). Em comparação com a água, as mulheres alimentadas com urina fresca e urina de 24 horas sobreviveram por mais tempo (p = 0,001 e p = 0,012, respectivamente; Figura 2D), enquanto as mulheres alimentadas com urina de 72 horas sobreviveram por mais tempo do que aquelas alimentadas com urina fresca de curta duração e urina envelhecida por 24 horas (p < 0,0001 e p = 0,013, respectivamente; Figura 2D). Quando alimentadas com ureia a 135 mM, as fêmeas alimentadas com sangue sobreviveram por mais tempo do que em todas as outras concentrações de ureia e água (p < 0,013; Figura 2E).
Sobrevivência de fêmeas de Anopheles arabinis em busca de hospedeiro e hematófagas alimentadas com urina de vaca e ureia. No bioensaio (A), mosquitos fêmeas receberam uma dieta composta por urina de vaca fresca e envelhecida, diversas concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O). A sobrevivência dos mosquitos em busca de hospedeiro (B, C) e hematófagos (D, E) foi registrada a cada 12 horas até que todas as fêmeas alimentadas com urina (B, D) e ureia (C, E), e os controles (sacarose e água), estivessem mortas.
A distância total e o número de voltas determinados no teste de voo em moinho, ao longo de um período de 24 horas, diferiram entre os mosquitos em busca de hospedeiros e os hematófagos, que apresentaram menor atividade de voo no geral (Fig. 3). Os mosquitos em busca de hospedeiros que receberam urina fresca e envelhecida, ou sacarose e água, apresentaram padrões de voo distintos (Fig. 3), com as fêmeas alimentadas com urina fresca sendo mais ativas ao amanhecer, enquanto aquelas alimentadas com urina envelhecida por 24 e 168 horas apresentaram maior atividade. Os mosquitos que se alimentaram de urina exibiram padrões de voo diferentes e foram principalmente diurnos. As fêmeas que receberam sacarose ou urina envelhecida por 72 horas mostraram atividade ao longo do período de 24 horas, enquanto as fêmeas que receberam água foram mais ativas no período intermediário. Os mosquitos alimentados com sacarose exibiram os níveis mais altos de atividade no final da noite e início da manhã, enquanto aqueles que ingeriram urina envelhecida por 72 horas apresentaram um declínio constante na atividade ao longo de 24 horas (Figura 3).
Desempenho de voo de fêmeas de Anopheles arabinis em busca de hospedeiros e alimentadas com urina de vaca e ureia. No teste de voo em moinho, mosquitos fêmeas alimentados com urina de vaca fresca e envelhecida, várias concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O) foram presos a braços horizontais que giravam livremente (acima). Para fêmeas em busca de hospedeiros (esquerda) e em busca de sangue (direita), a distância total e o número de voos por hora para cada dieta ao longo de um período de 24 horas foram registrados (escuro: cinza; claro: branco). A distância média e o número médio de voos são mostrados à direita do gráfico de atividade circadiana. As barras de erro representam o erro padrão da média. Para a análise estatística, consulte o texto.
Em geral, a atividade de voo das fêmeas em busca de hospedeiros seguiu um padrão semelhante ao da distância de voo ao longo de um período de 24 horas. A distância média de voo foi significativamente afetada pela dieta ingerida (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e as fêmeas em busca de hospedeiros que ingeriram urina de 72 horas voaram distâncias significativamente maiores em comparação com todas as outras dietas (p < 0,0001), e os mosquitos alimentados com sacarose voaram mais longe do que os mosquitos alimentados com urina fresca (p = 0,022) e urina de 24 horas (p = 0,022). Em contraste com o padrão de atividade de voo descrito pela dieta de urina, as fêmeas em busca de hospedeiros alimentadas com ureia exibiram atividade de voo persistente ao longo de um período de 24 horas, atingindo o pico durante a segunda metade da fase escura (Fig. 3). Embora os padrões de atividade fossem semelhantes, as fêmeas em busca de hospedeiros alimentadas com ureia aumentaram significativamente a distância média de voo dependendo da concentração absorvida (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Fêmeas em busca de hospedeiros alimentadas com qualquer concentração de ureia voaram por mais tempo do que fêmeas alimentadas com água ou sacarose (p < 0,03).
A atividade de voo geral dos mosquitos hematófagos foi estável e sustentada ao longo de 24 horas em todas as dietas, com aumento da atividade urinária durante a segunda metade do período escuro para fêmeas alimentadas com água, bem como em fêmeas alimentadas com urina fresca e com urina de 24 horas (imagem 3). Enquanto a dieta com urina afetou significativamente a distância média de voo em fêmeas alimentadas com sangue (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), a dieta com ureia não apresentou efeito significativo (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). A dieta com urina e a dieta controle apresentaram resultados semelhantes (fresca, p = 0,0091; 72 horas, p = 0,0022; 168 horas, p = 0,001; sacarose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Os efeitos da alimentação com urina e ureia sobre os parâmetros reprodutivos foram avaliados em bioensaios de postura de ovos (Figura 4A) e investigados de acordo com o número de ovos postos por cada fêmea, o tamanho dos ovos e as larvas de primeiro instar recém-eclodidas. O número de ovos postos pelas fêmeas árabes alimentadas com urina variou de acordo com a dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Fêmeas alimentadas com urina de 24 horas e sangue puseram significativamente mais ovos do que fêmeas alimentadas com outras dietas à base de urina, sendo semelhantes às alimentadas com sacarose (Fig. 4B). Da mesma forma, o tamanho dos ovos postos pelas fêmeas alimentadas com urina variou de acordo com a dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), com fêmeas alimentadas com urina de 24 horas e sacarose pondo ovos significativamente maiores do que fêmeas alimentadas com água, enquanto os ovos de fêmeas alimentadas com urina de 168 horas foram significativamente menores (Fig. 4C). Além disso, a dieta de urina afetou significativamente o tamanho das larvas (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), com larvas significativamente maiores emergindo de ovos postos por fêmeas alimentadas com urina de 24 e 72 horas do que de ovos postos por larvas alimentadas com água e fêmeas alimentadas com urina de 168 horas (Figura 4D).
Desempenho reprodutivo de fêmeas de Anopheles arabinis alimentadas com urina de vaca e ureia. Mosquitos fêmeas alimentados com sangue foram submetidos a dietas compostas por urina de vaca fresca e envelhecida, diversas concentrações de ureia, sacarose (10%) e água destilada (H2O) durante 48 horas antes de serem colocados em bioensaios e os substratos para postura de ovos serem obtidos. O número de ovos (B, E), o tamanho dos ovos (C, F) e o tamanho das larvas (D, G) foram significativamente afetados pela dieta fornecida (urina de vaca: BD; ureia: EG). As médias para cada parâmetro medido usando diferentes nomes de letras foram significativamente diferentes entre si (ANOVA de uma via com análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da média.
Como principal componente nitrogenado da urina, a ureia, quando fornecida como dieta para fêmeas alimentadas com sangue, afetou significativamente os parâmetros reprodutivos em todos os estudos. O número de ovos postos por fêmeas alimentadas com ureia, após uma refeição de sangue, dependendo da concentração de ureia (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), fêmeas alimentadas com concentrações de ureia entre 134 µM e 1,34 mM puseram mais ovos (Figura 4E). Fêmeas alimentadas com concentrações de ureia de 134 µM ou superiores puseram ovos maiores do que fêmeas alimentadas com água (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), e o tamanho larval, embora afetado por concentrações semelhantes de ureia nas mães (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), foi mais variável (Figura 4G).
A atração geral por extratos voláteis do espaço livre da urina bovina em busca de hospedeiros. A espécie A. arabiensis avaliada no olfatômetro de tubo de vidro (Fig. 5A) foi significativamente afetada pela idade da urina (χ² = 15,9, gl = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). A análise post hoc mostrou que o odor de urina velha, após 24 horas, causou níveis de atratividade significativamente maiores em comparação com todos os outros tratamentos (72 horas: p = 0,0060; 168 horas: p = 0,012; pentano: p = 0,00070), com exceção do odor de urina fresca (p = 0,13; Fig. 5B). Embora a atração geral de mosquitos hematófagos pelo odor de urina não tenha sido significativamente diferente (χ² = 8,78, gl = 4, p = 0,067; Fig. 5C), essas fêmeas mostraram-se significativamente mais atraídas por extratos voláteis do espaço livre em comparação com... Urina envelhecida por 72 horas em comparação com os controles (p = 0,0066; Figura 5C).
Respostas comportamentais a odores naturais e sintéticos de urina de vaca na busca por hospedeiros e mosquitos Anopheles arabianus alimentados com sangue. Esquema do olfatômetro de tubo de vidro (A). Atração de extratos voláteis do espaço livre de urina de vaca fresca e envelhecida por mosquitos hospedeiros (B) e hematófagos (C). Encontre a reação do tentáculo do Anopheles arbianus. Extratos do espaço livre isolados de urina de vaca fresca (D), envelhecida por 24 horas (E), 72 horas (F) e 168 horas (G) são mostrados. Os traçados de detecção por antena eletrônica (EAD) mostram as mudanças de voltagem em resposta a compostos bioativos no espaço livre eluídos do cromatógrafo gasoso e detectados por um detector de ionização de chama (FID). A barra de escala representa a amplitude da resposta (mV) versus o tempo de retenção (s). As propriedades e taxas de liberação (µg h-1) dos compostos biologicamente ativos são mostradas. Um asterisco (*) indica uma resposta consistente de baixa amplitude. Dois asteriscos (**) indicam uma resposta não reprodutível. Respostas. Encontre o hospedeiro (H) e o sugador de sangue (I). An. arabiensis apresenta diferentes níveis de atratividade para misturas sintéticas de odores de urina de vaca fresca e envelhecida. As proporções médias de mosquitos atraídos por diferentes nomes de letras foram significativamente diferentes entre si (ANOVA de uma via com análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representam o erro padrão da escala.
Fêmeas de Ann. arabiensis, 72 h e 120 h após a alimentação sanguínea, durante a desova, não apresentaram preferência por extratos voláteis do espaço livre de urina fresca e envelhecida de vaca em comparação com os controles de pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; Arquivo adicional 1: Fig. S1).
Para fêmeas de Ann. arabiensis, as análises por GC-EAD e GC-MS identificaram oito, seis, três e três compostos bioativos (Figura 5D-G). Embora tenham sido observadas diferenças no número de compostos que provocaram respostas eletrofisiológicas, a maioria desses compostos estava presente em cada extrato volátil do espaço de cabeça coletado da urina fresca e envelhecida. Portanto, para cada extrato, apenas os compostos que produziram uma resposta fisiológica nas antenas da fêmea acima do limiar foram incluídos em análises posteriores.
A taxa total de liberação de compostos bioativos voláteis na coleta do espaço livre aumentou de 29 µg h-1 na urina fresca para 242 µg h-1 na urina envelhecida por 168 horas, principalmente devido ao aumento de p-cresol e m-formaldeído. Em contraste, as taxas de liberação de outros compostos, como 2-cicloexen-1-ona e decanal, diminuíram com o aumento da idade da urina, o que se correlacionou com a diminuição observada na intensidade do sinal (abundância) no cromatograma (Fig. 5D-G, painel esquerdo) e com as respostas fisiológicas a esses compostos (Fig. 5D-G, painel direito).
De modo geral, a mistura sintética apresentou uma proporção natural semelhante de compostos bioativos identificados em extratos voláteis de espaços de cabeça de urina fresca e envelhecida (Fig. 5D–G) e não pareceu despertar atração significativa na busca por um hospedeiro (χ² = 8,15, gl = 4, p = 0,083; Fig. 5H) ou por mosquitos hematófagos (χ² = 4,91, gl = 4, p = 0,30; Fig. 5I). No entanto, comparações pareadas post hoc entre os tratamentos mostraram que os mosquitos em busca de hospedeiros foram significativamente mais atraídos pela mistura sintética de urina envelhecida por 24 horas em comparação com os controles de pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Para avaliar o papel dos componentes individuais em misturas sintéticas de urina envelhecida por 24 horas, seis misturas subtrativas foram avaliadas em comparação com misturas completas no ensaio em Y, no qual os compostos individuais foram removidos. Para mosquitos em busca de hospedeiros, a subtração de compostos individuais da mistura completa teve um efeito significativo nas respostas comportamentais (χ² = 19,63, gl = 6, p = 0,0032; Arquivo adicional 1: Figura S2A), sendo todas as misturas subtrativas mais atrativas do que a mistura completa. Em contraste, a remoção de compostos individuais da mistura totalmente sintética não afetou as respostas comportamentais de mosquitos hematófagos (χ² = 11,38, gl = 6, p = 0,077), com exceção do decanal, que resultou em níveis de atração mais baixos em comparação com a mistura completa (p = 0,022; Arquivo adicional 1: Figura S2B).
Em uma aldeia endêmica de malária na Etiópia, a eficácia de uma mistura sintética de urina de vaca de 24 horas para atrair mosquitos em condições de campo foi avaliada durante dez noites (Fig. 6A). Um total de 4.861 mosquitos foram capturados e identificados, dos quais 45,7% eram Anthropus gambiae sl, 18,9% eram Anopheles pharoensis e 35,4% eram Culex spp. (Arquivo adicional 1: Tabela S1). Anopheles arabinis é o único membro do complexo de espécies An. gambiae identificado por análise de PCR. Em média, 320 mosquitos foram capturados por noite, período durante o qual as armadilhas com isca de mistura sintética capturaram mais mosquitos do que as armadilhas pareadas sem a mistura (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Armadilhas sem isca foram colocadas em cada uma das cinco noites de controle no início, meio e fim do experimento. Números semelhantes foram observados. Em cada par de armadilhas, foram capturados mosquitos, indicando ausência de viés entre as casas (χ²(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³, ​​p > 0,05) e nenhuma diminuição populacional durante o período do estudo. Comparado com as armadilhas de controle, o número de mosquitos capturados nas armadilhas contendo a mistura sintética aumentou significativamente: em busca de hospedeiro (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), alimentando-se recentemente de sangue (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e gestantes (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Arquivo adicional 1: Tabela S1). Isso também se reflete no número total de mosquitos capturados: em busca de hospedeiro > alimentando-se de sangue > gestantes > semigestantes > machos.
Avaliação em campo da eficácia de uma mistura sintética de odor de urina de vaca por 24 horas. Ensaios de campo foram conduzidos no centro-sul da Etiópia (mapa), próximo à cidade de Maki (inserção), utilizando uma armadilha luminosa dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) (à direita) em casas pareadas, com um delineamento em quadrado latino (imagem aérea) (A). As armadilhas luminosas do CDC com isca de odor sintético atraem e capturam fêmeas de Anopheles arabesques (B), mas não de Anopheles farroes (C), de maneira diferente, um efeito dependente do estado fisiológico. Além disso, essas armadilhas capturaram um número significativamente maior de mosquitos hospedeiros do gênero Culex (D). Comparado ao controle. As barras à esquerda representam o índice médio de seleção de mosquitos capturados em pares de armadilhas com isca de odor (verde) e controle (abertas) (N = 10), enquanto as barras à direita representam o índice médio de seleção em pares de armadilhas de controle (abertas; N = 5). Os asteriscos indicam níveis de significância estatística (*p = 0,01 e ***p < 0,0001).
As três espécies foram capturadas de forma diferente em armadilhas contendo misturas sintéticas. Em busca de hospedeiros (χ²(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), alimentação sanguínea (χ²(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e gestação (χ²(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), observou-se que *A. arabiensis* foi capturada na armadilha que liberou a mistura sintética (Fig. 6B), enquanto a quantidade de *A. pharoensis* não diferiu. Foram encontrados mosquitos em diferentes estados fisiológicos (Fig. 6C). Para *Culex*, apenas um aumento significativo no número de mosquitos em busca de hospedeiros foi encontrado em armadilhas com isca da mistura sintética (χ²(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), em comparação com as armadilhas de controle.
Armadilhas com isca para hospedeiros, localizadas fora de potenciais hospedeiros, entre criadouros e comunidades rurais na Etiópia, foram utilizadas para avaliar se os mosquitos da malária utilizam o odor de urina de vaca como sinal de habitat do hospedeiro. Na ausência de sinais de hospedeiro, calor e com ou sem a presença de odor de urina de vaca, nenhum mosquito foi capturado (Arquivo adicional 1: Figura S3). No entanto, na presença de alta temperatura e odor de urina de vaca, mosquitos fêmeas da malária foram atraídos e capturados, embora em pequeno número, independentemente da idade da urina (χ²(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Arquivo adicional 1: Figura S3). Em contraste, os controles com água não capturaram mosquitos da malária em altas temperaturas (Arquivo adicional 1: Figura S3).
Os mosquitos da malária adquirem e distribuem compostos nitrogenados através da alimentação compensatória em urina de vaca (ou seja, poças) para melhorar características do seu ciclo de vida, de forma semelhante a outros insetos [2, 4, 24, 25, 26]. A urina de vaca é um recurso renovável e prontamente disponível, intimamente associado a locais de repouso de vetores da malária, como currais e vegetação alta próxima a residências rurais e locais de desova. As fêmeas dos mosquitos localizam esse recurso pelo olfato e são capazes de regular a absorção de compostos nitrogenados na urina, incluindo a ureia, o principal componente nitrogenado da urina [15, 16]. Dependendo do estado fisiológico da fêmea do mosquito, os nutrientes da urina são alocados para melhorar a atividade de voo e a sobrevivência das fêmeas em busca de hospedeiros, bem como a sobrevivência e as características reprodutivas dos indivíduos alimentados com sangue durante o primeiro ciclo gonadotrópico. Portanto, a mistura de urina desempenha um importante papel nutricional para vetores da malária que se encontram em estado vegetativo, como adultos desnutridos [8], pois proporciona às fêmeas dos mosquitos a capacidade de adquirir importantes compostos nitrogenados ao se envolverem em comportamentos de baixo risco. alimentação. Essa descoberta tem consequências epidemiológicas significativas, pois as fêmeas aumentam sua expectativa de vida, atividade e produção reprodutiva, fatores que afetam a capacidade vetorial. Além disso, esse comportamento pode ser o alvo de futuros programas de controle de vetores.