Набыццё і размеркаванне пажыўных рэчываў аб'ядноўвае асаблівасці пошуку ежы насякомымі і жыццёвага цыклу. Каб кампенсаваць дэфіцыт пэўных пажыўных рэчываў на розных стадыях жыцця, насякомыя могуць атрымліваць гэтыя пажыўныя рэчывы праз дадатковае харчаванне, напрыклад, сілкуючыся вылучэннямі пазваночных у працэсе, вядомым як лужыны. Камар Anopheles arabiani, відаць, недаядае і таму мае патрэбу ў пажыўных рэчывах як для метабалізму, так і для размнажэння. Мэтай гэтага даследавання было ацаніць, ці паляпшае ўздзеянне An. arabiensis на каровіну мачу для атрымання пажыўных рэчываў характарыстыкі жыццёвага цыклу.
Пераканайцеся, што гэта бяспечна. arabiensis прыцягваў пах свежай, 24-гадзіннай, 72-гадзіннай і 168-гадзіннай каровінай мачы, і самак, якія шукалі гаспадара і сілкаваліся крывёю (праз 48 гадзін пасля трапезы з крывёю), вымяралі ў Y-вобразным ольфактометры, а цяжарных самак ацэньвалі на прадмет нерасту. Затым для ідэнтыфікацыі біялагічна актыўных злучэнняў у каровінай мачы ўсіх чатырох узроставых груп выкарыстоўвалі камбінаваны хімічны і электрафізіялагічны аналіз. Сінтэтычныя сумесі біялагічна актыўных злучэнняў ацэньвалі ў Y-вобразных і палявых выпрабаваннях. Каб даследаваць каровіну мачу і яе асноўнае азотазмяшчальнае злучэнне мачавіну ў якасці патэнцыйных дадатковых дыет для пераносчыкаў малярыі, вымяралі параметры харчавання і характарыстыкі жыццёвага цыклу. Ацэньвалі долю самак камароў і колькасць паглынутай каровінай мачы і мачавіны. Пасля кармлення самак ацэньвалі на выжывальнасць, прывязаны палёт і размнажэнне.
Шукаюць кроў і харчаванне гаспадара. У лабараторных і палявых даследаваннях арабаў прыцягваў натуральны і сінтэтычны пах свежай і вытрыманай каровінай мачы. Цяжарныя самкі былі абыякавыя да рэакцыі каровінай мачы ў месцах нерасту. Самкі, якія шукаюць гаспадара і смактаюць кроў, актыўна паглынаюць каровіну мачу і мачавіну і размяркоўваюць гэтыя рэсурсы ў адпаведнасці з жыццёвымі кампрамісамі ў залежнасці ад фізіялагічнага стану для палёту, выжывання або размнажэння.
Збор і распаўсюджванне каровінай мачы Anopheles arabinis для паляпшэння характарыстык жыццёвага цыклу. Дадатковае кармленне каровінай мачой непасрэдна ўплывае на здольнасць пераносчыкаў, павялічваючы сутачную выжывальнасць і шчыльнасць пераносчыкаў, і ўскосна, змяняючы актыўнасць палётаў, і таму гэта варта ўлічваць у будучых мадэлях.
Атрыманне і размеркаванне пажыўных рэчываў аб'ядноўвае характарыстыкі кармлення насякомымі і іх жыццёвага цыклу [1,2,3]. Насякомыя здольныя выбіраць і здабываць ежу, а таксама выконваць кампенсацыйнае харчаванне ў залежнасці ад наяўнасці ежы і патрэб у пажыўных рэчывах [1, 3]. Размеркаванне пажыўных рэчываў залежыць ад жыццёвага цыклу і можа прывесці да розных патрабаванняў да якасці і колькасці рацыёну на розных стадыях жыцця насякомых [1, 2]. Каб кампенсаваць дэфіцыт пэўных пажыўных рэчываў, насякомыя могуць атрымліваць гэтыя пажыўныя рэчывы праз дадатковае харчаванне, напрыклад, з гразі, розных экскрэментаў і вылучэнняў пазваночных, а таксама з падлы, працэс, вядомы як лужыны [2]. Нягледзячы на ​​тое, што ў асноўным апісаны розныя віды матылькоў і молі, вадапоі сустракаюцца і ў іншых атрадах насякомых, і прыцягненне да гэтых тыпаў рэсурсаў і харчаванне імі можа мець значны ўплыў на здароўе і іншыя рысы жыццёвага цыклу [2, 4, 5, 6],7]. Малярыйны камар Anopheles gambiae sensu lato (sl) з'яўляецца ў выглядзе «недакормленай» дарослай асобіны [8], таму паліў можа гуляць важную ролю ў яго жыццёвых характарыстыках, але гэтая паводзіны да гэтага часу ігнаравалася. Выкарыстанне ажыятажу як сродку павелічэння спажывання пажыўных рэчываў у гэтым важным трансфарматары заслугоўвае ўвагі, бо гэта можа мець важныя эпідэміялагічныя наступствы.
Спажыванне азоту дарослымі самак камароў Anopheles абмежавана з-за нізкіх каларыйных запасаў, якія захоўваюцца на лічынкавай стадыі, і неэфектыўнага выкарыстання крывавай мукі [9]. Самкі Ann.gambiae sl звычайна кампенсуюць гэта, дапаўняючы крывавую ежу [10, 11], тым самым падвяргаючы больш людзей рызыцы заражэння хваробай і павялічваючы рызыку драпежніцтва камароў. Акрамя таго, камары могуць выкарыстоўваць дадатковае харчаванне экскрэментамі пазваночных для атрымання азоцістых злучэнняў, якія паляпшаюць адаптацыю і манеўранасць палёту, як паказалі іншыя насякомыя [2]. У гэтым плане цікавая моцная і выразная прывабнасць аднаго з відаў-блізнят у межах комплексу відаў An.Gambian sl, Anopheles arabinis, да свежай і вытрыманай каровінай мачы [12,13,14]. Anopheles arabinis мае апартуністычныя перавагі ў дачыненні да гаспадара і, як вядома, асацыюецца з буйной рагатай жывёлай і сілкуецца ёю. Каровіна мача - гэта рэсурс, багаты азоцістымі злучэннямі, прычым мачавіна складае 50-95% ад агульнай колькасці азоту ў свежай мачы [15, 16]. Па меры старэння каровінай мачы, Мікраарганізмы выкарыстоўваюць гэтыя рэсурсы для памяншэння складанасці азоцістых злучэнняў на працягу 24 гадзін [15]. З хуткім павелічэннем аміяку, звязаным са зніжэннем арганічнага азоту, квітнеюць алкалафільныя мікраарганізмы (многія з якіх выпрацоўваюць злучэнні, таксічныя для камароў) [15], што можа быць прычынай таго, што самкі Ann.arabiensis пераважна прыцягвае мача ва ўзросце 24 гадзін або менш [13, 14].
У гэтым даследаванні праводзіўся пошук гаспадароў і жывёл, якія сілкуюцца крывёю. Падчас першага цыклу выпрацоўкі гонадатропіна arabiensis ацэньваўся на набыццё азоцістых злучэнняў, у тым ліку мачавіны, шляхам змешвання мачы. Далей была праведзена серыя эксперыментаў, каб ацаніць, як самкі камароў размяркоўваюць гэты патэнцыйны пажыўны рэсурс для паляпшэння выжывання, размнажэння і далейшага пошуку ежы. Нарэшце, быў ацэнены пах свежай і вытрыманай каровінай мачы, каб вызначыць, ці з'яўляюцца яны надзейнымі падказкамі для гаспадара і жывёл, якія сілкуюцца крывёю. У пошуках гэтага патэнцыйнага пажыўнага рэсурсу arabiensis выявіў хімічныя карэляцыі, якія ляжаць у аснове назіранай рознай прывабнасці. Сінтэтычныя пахавыя сумесі лятучых арганічных злучэнняў (ЛОС), выяўленыя ў 24-гадзіннай вытрыманай мачы, былі дадаткова ацэнены ў палявых умовах, пашыраючы вынікі, атрыманыя ў лабараторных умовах, і дэманструючы ўплыў паху бычынай мачы на ​​розныя фізіялагічныя станы. Прывабнасць камароў. Атрыманыя вынікі пацвярджаюць, што An. arabiensis набывае і размяркоўвае азоцістыя злучэнні, якія змяшчаюцца ў мачы пазваночных, каб паўплываць на характарыстыкі жыццёвага цыклу. Гэтыя вынікі абмяркоўваюцца ў кантэксце патэнцыйных эпідэміялагічных наступстваў і таго, як іх можна выкарыстоўваць для назірання і кантролю пераносчыкаў.
Аналфелеса арабіканскага (штам Dongola) утрымлівалі пры тэмпературы 25 ± 2 °C, адноснай вільготнасці 65 ± 5% і цыкле святло:цемра 12:12 гадзін. Лічынак вырошчвалі ў пластыкавых латках (20 см × 18 см × 7 см), напоўненых дыстыляванай вадой, і кармілі кормам для рыб Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Германія). Кукалак збіралі ў 30-мілілітровыя кубкі (Nolato Hertila, Åstorp, Швецыя), а затым пераносілі ў клеткі Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science, Тайчжун, Тайвань) для выхаду дарослых асобін. Дарослым асобінам давалі 10% раствор цукрозы ad libitum да 4 дзён пасля з'яўлення (dpe), пасля чаго самкам, якія шукалі гаспадара, прапаноўвалі дыету непасрэдна перад эксперыментам або галадалі на ноч з дыстыляванай вадой перад эксперыментам, як апісана ніжэй. Самкі, якія выкарыстоўваліся для эксперыментаў з палётнай трубкай, галадалі толькі 4-6 дзён. гадзін з вадой ad libitum. Для падрыхтоўкі крывасмактальных камароў да наступных біялагічных аналізаў 4 самак dpe атрымлівалі дэфіброзную авечую кроў (Håtunalab, Bro, SE) з выкарыстаннем мембраннай сістэмы кармлення (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Поўнасцю загушчаных самак затым пераводзілі ў асобныя клеткі і давалі ім рацыён непасрэдна, як апісана ніжэй, або 10% цукрозу ad libitum на працягу 3 дзён перад эксперыментамі, апісанымі ніжэй. Апошніх самак выкарыстоўвалі для біялагічных аналізаў у палётных трубках і перавозілі ў лабараторыю, а затым атрымлівалі дыстыляваную ваду ad libitum на працягу 4-6 гадзін перад эксперыментам.
Для колькаснай ацэнкі спажывання мачы і мачавіны дарослымі самкамі An.Arab выкарыстоўваліся аналізы харчавання. Самкам, якія шукалі гаспадара і атрымлівалі кроў, на працягу 48 гадзін давалі дыету, якая змяшчала 1% разведзенай свежай і вытрыманай каровінай мачы, розныя канцэнтрацыі мачавіны і дзве кантрольныя асобіны (10% цукрозы і вады). Акрамя таго, у дыету дадавалі харчовы фарбавальнік (1 мг мл-1 ксілолцыянід FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Стакгольм, Швецыя) і падавалі ў матрыцы 4 × 4 у мікрацэнтрыфужных прабірках аб'ёмам 250 мкл (Axygen Scientific, Юніён-Сіці, Каліфорнія, ЗША; Малюнак 1А). Напаўнялі да краю (~300 мкл). Каб пазбегнуць канкурэнцыі паміж камарамі і патэнцыйнага ўздзеяння колеру фарбавальніка, змясцілі 10 камароў у вялікую чашку Петры (дыяметрам 12 см і вышынёй 6 см; Семадэні, Остэрмундыген, Швейцарыя; Малюнак 1А) у поўнай цемры пры тэмпературы 25 ± 2 см °C і адноснай вільготнасці 65 ± 5%. Гэтыя эксперыменты... паўтаралі ад 5 да 10 разоў. Пасля ўздзеяння дыеты камароў змяшчалі пры тэмпературы -20 °C да далейшага аналізу.
Звярніце ўвагу на бычыну мачу і мачавіну, якія паглынаюцца гаспадаром і крывасмактальнымі самкамі Anopheles arabianus. У выпрабаванні кармлення (A) самкам камароў давалі дыету, якая складалася са свежай і вытрыманай каровінай мачы, розных канцэнтрацый мачавіны, цукрозы (10%) і дыстыляванай вады (H2O). Самкі, якія шукаюць гаспадара (B), і самкі, якія сілкуюцца крывёю (C), паглыналі больш цукрозы, чым любы іншы пратэставаны рацыён. Звярніце ўвагу, што самкі, якія шукаюць гаспадара, паглыналі 72-гадзінную каровіную мачу менш, чым 168-гадзінную каровіную мачу (B). Сярэдняе агульнае ўтрыманне азоту (± стандартнае адхіленне) мачы паказана на ўстаўцы. Самкі, якія шукаюць гаспадара (D, F), і самкі, якія смактаюць крывёю (E, G), паглынаюць мачавіну дозазалежным чынам. Сярэднія аб'ёмы ўдыхання (D, E) з рознымі літарнымі назвамі значна адрозніваліся адзін ад аднаго (аднабаковы ANOVA з выкарыстаннем post hoc аналізу Цьюкі; p < 0,05). Палоскі памылак прадстаўляюць стандартную памылку сярэдняга значэння (BE). Прамая пункцірная лінія прадстаўляе лагарыфмічную лінію рэгрэсіі (F, G).
Каб вызваліць паглынутую ежу, камароў паасобку змяшчалі ў 1,5-мл мікрацэнтрыфужныя прабіркі, якія змяшчалі 230 мкл дыстыляванай вады, і тканіну раздзіралі з дапамогай аднаразовага песціка і бесправаднога рухавіка (VWR International, Лунд, Швецыя), а затым цэнтрыфугавалі пры 10 кр/мін на працягу 10 хвілін. Супернатант (200 мкл) пераносілі ў 96-лункавы мікрапланшэт (Sigma-Aldrich), і паглынанне (λ620) вызначалі з дапамогай спектрафатометра для мікрапланшэтнага рыдэра (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ортэнберг, Германія) (2 нм). Акрамя таго, камароў здрабнялі ў 1 мл дыстыляванай вады, 900 мкл якой пераносілі ў кювету для спектрафатометрычнага аналізу (λ620 нм; УФ-1800, Shimadzu, Кіста, Швецыя). Для колькаснай ацэнкі спажывання ежы была пабудавана стандартная крывая шляхам серыйнага развядзення, каб атрымаць ад 0,2 мкл да 2,4 мкл ксілолу канцэнтрацыяй 1 мг/мл. цыянід. Затым аптычная шчыльнасць вядомых канцэнтрацый фарбавальніка выкарыстоўвалася для вызначэння колькасці ежы, якую з'еў кожны камар.
Дадзеныя аб аб'ёме былі прааналізаваны з дапамогай аднафактарнага дысперсійнага аналізу (ANOVA) з наступным парным параўнаннем па Цьюкі (JMP Pro, версія 14.0.0, SAS Institute Inc., Кэры, Паўночная Караліна, ЗША, 1989–2007). Лінейны рэгрэсійны аналіз апісваў залежнае ад канцэнтрацыі спажыванне мачавіны і параўноўваў рэакцыі камароў, якія шукаюць гаспадара, і камароў, якія смактаюць кроў (GraphPad Prism версіі 8.0.0 для Mac, GraphPad Software, Сан-Дыега, Каліфорнія, ЗША).
Прыкладна 20 мкл узораў мачы з кожнай узроставай групы былі звязаны з Chromosorb® W/AW (10 мг 80/100 меш, Sigma Aldrich) і інкапсуляваны ў бляшаныя капсулы (8 мм × 5 мм). Капсулы былі ўстаўлены ў камеру згарання аналізатара CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ЗША) для вызначэння ўтрымання азоту ў свежай і вытрыманай мачы ў адпаведнасці з пратаколам вытворцы. Агульны азот (г N л-1) быў колькасна вызначаны на аснове вядомых канцэнтрацый мачавіны, якія выкарыстоўваліся ў якасці стандарту.
Каб ацаніць уплыў дыеты на выжывальнасць самак, якія шукаюць гаспадара і смактаюць кроў, камароў паасобку змяшчалі ў вялікія чашкі Петры (12 см у дыяметры і 6 см у вышыню; Semadeni) з адтулінай у вечку, закрытай сеткай (3 см у дыяметры), з адтулінай для вентыляцыі і забеспячэння ежай. Дыета давалася адразу пасля 4 дзён пасля ежы і ўключала 1% разведзеную свежую і вытрыманую каровіну мачу, чатыры канцэнтрацыі мачавіны і два кантрольныя ўзоры: 10% цукрозу і ваду. Кожная дыета наносілася піпеткай на стаматалагічны тампон (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), устаўлены ў 5-мілілітровы шпрыц (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), поршань здымаўся і змяшчаўся на чашку Петры (малюнак 1).1A). Мяняйце дыету кожны дзень. Падтрымлівайце лабараторыю, як апісана вышэй. Выжыўшых камароў падлічвалі двойчы на ​​дзень, а мёртвых камароў выкідвалі, пакуль не памёр апошні камар (n = 40 на апрацоўку). Выжывальнасць камароў, якія харчаваліся рознымі дыетамі, статыстычна аналізавалася з выкарыстаннем крывых выжывальнасці Каплана-Мейера і лагарыфмічных рангавых тэстаў. параўнаць размеркаванне выжывальнасці паміж дыетамі (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Кастомны лятаючы млын для камароў, распрацаваны на заказ паводле працы Атысана і інш. [17], выраблены з празрыстых акрылавых панэляў таўшчынёй 5 мм (10 см у шырыню х 10 см у даўжыню х 10 см у вышыню) без пярэдняй і задняй панэляў (мал. 3: зверху). Шарнірны вузел з вертыкальнай трубкай, вырабленай з калоны газавай храматаграфіі (унутраны дыяметр 0,25 мм; даўжыня 7,5 см), канцы якой прылеплены да іголкі для насякомых, падвешанай паміж парай неадымавых магнітаў на адлегласці 9 см адзін ад аднаго. Гарызантальная трубка з таго ж матэрыялу (даўжыня 6,5 см) падзяляла вертыкальную трубку, утвараючы прывязаную руку і руку, якая нясла невялікі кавалак алюмініевай фальгі ў якасці сігналу, які перапыняе святло.
Самкам, якія галадалі 24 гадзіны, давалі вышэйзгаданую дыету на працягу 30 хвілін перад фіксацыяй. Затым цалкам адкормленых самак камароў індывідуальна анестэзавалі на лёдзе на працягу 2-3 хвілін і прымацоўвалі да шпілек для насякомых з дапамогай пчалінага воску (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), а затым прывязвалі да кранштэйнаў гарызантальных трубак. Лятучы млын. Абароты за палёт рэгістраваліся спецыяльна распрацаваным рэгістратарам дадзеных, затым захоўваліся і адлюстроўваліся з дапамогай праграмнага забеспячэння PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Лятучы млын быў размешчаны ў памяшканні з рэгуляваным кліматам (12 гадзін:12 гадзін, святло:цемра, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% адноснай вільготнасці).
Для візуалізацыі характару палётнай актыўнасці была разлічана агульная адлегласць палёту (м) і агульная колькасць паслядоўных палётаў за гадзіну на працягу 24-гадзіннага перыяду. Акрамя таго, сярэднія адлегласці палётаў асобных самак параўноўваліся паміж рознымі метадамі і аналізаваліся з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу (ANOVA) і постфактарнага аналізу Цьюкі (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), дзе сярэдняя адлегласць лічылася залежнай зменнай, а метад — незалежным фактарам. Акрамя таго, сярэдняя колькасць палётаў разлічвалася з крокам у 10 хвілін.
Каб ацаніць уплыў дыеты на рэпрадуктыўную здольнасць An.arabiensis, шэсць самак (4 дні на дзень) былі перамешчаны непасрэдна ў клеткі Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см) пасля збору крыві, а затым забяспечваліся эксперыментальным кормам на працягу 48 гадзін, як апісана вышэй. Затым корм быў выдалены, і на трэці дзень на 48 гадзін былі прадастаўлены нераставыя кубкі (30 мл; Nolato Hertila), напоўненыя 20 мл дыстыляванай вады, якія мяняліся кожныя 24 гадзіны. Кожны рэжым харчавання паўтарайце 20-50 разоў. Ікрынку падлічвалі і запісвалі для кожнай эксперыментальнай клеткі. Падвыбаркі ікрынкі выкарыстоўваліся для ацэнкі сярэдняга памеру і варыяцый даўжыні асобных ікрынак (n ≥ 200 на дыету) з выкарыстаннем мікраскопа Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Германія), абсталяванага камерай Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Германія). Астатнія яйкі захоўваліся ў памяшканні з кантраляваным кліматам у стандартных умовах вырошчвання на працягу 24 гадзін, і была вымерана падвыбарка нядаўна з'яўленых лічынак 1-га ўзросту (n ≥ 200 на рацыён), як апісана вышэй. Колькасць яек і памер яек і лічынак параўноўваліся паміж варыянтамі з выкарыстаннем аднафактарнага ANOVA і post hoc аналізу Цьюкі (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
З узораў, сабраных ад буйной рагатай жывёлы пароды зебу і арсі, былі сабраны лятучыя рэчывы з свежай (праз 1 гадзіну пасля адбору пробы), вытрыманай праз 24 гадзіны, 72 гадзіны і 168 гадзін. Для зручнасці ўзоры мачы збіраліся ранняй раніцай, пакуль каровы яшчэ знаходзіліся ў хляве. Узоры мачы былі сабраны ў 10 асобін, і 100-200 мл кожнага ўзору пераносілі ў індывідуальныя поліамідныя мяшкі для запякання (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Міндэн, Германія) у 3-літровых поліамідных бочках з вечкам у пластыкавых бочках з вінілхларыду. Лятучыя рэчывы з кожнага ўзору мачы буйной рагатай жывёлы збіралі альбо непасрэдна (свежай), альбо пасля выспявання пры пакаёвай тэмпературы на працягу 24 гадзін, 72 гадзін і 168 гадзін, г.зн. кожны ўзор мачы быў рэпрэзентатыўным для кожнай узроставай групы.
Для збору лятучых рэчываў у газавай прасторы выкарыстоўвалася замкнёная сістэма для цыркуляцыі патоку газу, адфільтраванага актываваным вуглём (100 мл/мін-1), праз поліамідны мяшок да адсарбцыйнай калоны на працягу 2,5 гадзін з выкарыстаннем дыяфрагмавага вакуумнага помпы (KNF Neuberger, Фрайбург, Германія). У якасці кантролю збор у газавай прасторы праводзіўся з пустога поліаміднага мяшка. Адсарбцыйная калона была выраблена з тэфлонавай трубкі (5,5 см х 3 мм унутры), якая змяшчала 35 мг Porapak Q (50/80 меш; Waters Associates, Мілфард, Масачусэтс, ЗША) паміж заглушкамі са шкловаты. Перад выкарыстаннем калону прамывалі 1 мл перадыстыляванага н-гексану (Merck, Дармштадт, Германія) і 1 мл пентану (чысты растваральнік 99,0%, клас ГХ, Sigma Aldrich). Адсарбаваныя лятучыя рэчывы элюявалі 400 мкл пентану. Зборы ў газавай прасторы аб'ядноўвалі і захоўвалі пры тэмпературы -20°C да выкарыстання для далейшага аналізу.
Паводніцкія рэакцыі насякомых An, якія шукаюць гаспадара і сілкуюцца крывёю. Лятучыя экстракты headspace, сабраныя са свежай, 24-гадзіннай, 72-гадзіннай і 168-гадзіннай мачы, былі прааналізаваны на наяўнасць лятучых экстрактаў камароў Arabidopsis з выкарыстаннем прамога шклянога ольфактометра [18]. Эксперыменты праводзіліся падчас ZT 13-15, пікавага перыяду актыўнасці An па пошуку гаспадара. Arab [19]. Шкляны ольфактометр (80 см × 9,5 см унутры) быў асветлены зверху 3 ± 1 лк чырвонага святла. Паветраны паток, адфільтраваны праз драўняны вугаль і ўвільготнены (25 ± 2 °C, 65 ± 2% адноснай вільготнасці), прайшоў біялагічны аналіз са хуткасцю 30 см/с. Паветра прапускаецца праз шэраг сетак з нержавеючай сталі, ствараючы ламінарны паток і аднастайную структуру шлейфа. Дыспенсер для стаматалагічных тампонаў (4 см × 1 см; L:D; DAB Dental AB), падвешаны на 5-см шпульцы на наветраным канцы. ольфактометр са зменай стымулятара кожныя 5 хвілін. Для аналізу ў якасці стымулу выкарыстоўвалася 10 мкл кожнага экстракта з прасторы над галавой, разведзенага ў суадносінах 1:10. У якасці кантролю выкарыстоўвалася такая ж колькасць пентану. Асобных камароў, якія шукалі гаспадара або смакталі кроў, змяшчалі ў асобныя клеткі для выпуску за 2-3 гадзіны да пачатку эксперыменту. Клетку для выпуску размяшчалі на наветраным баку ольфактометра, і камарам давалі акліматызавацца на працягу 1 хвіліны, а затым адкрывалі клапан клеткі для выпуску. Прыцягненне да апрацоўкі або кантролю аналізавалася як доля камароў, якія кантактавалі з крыніцай на працягу 5 хвілін пасля выпуску. Кожны лятучы экстракт з прасторы над галавой і кантроль паўтараліся не менш за 30 разоў, і каб пазбегнуць эфектаў любога аднаго дня, у кожны эксперыментальны дзень тэставалася аднолькавая колькасць апрацовак і кантролю. Рэакцыі пошуку ад гаспадара і тых, хто атрымліваў крывёю Ans. Наборы Arabic супраць прасторы над галавой аналізаваліся з выкарыстаннем намінальнай лагістычнай рэгрэсіі з наступным парным параўнаннем для суадносін няцотных лікаў (JMP Pro, версія 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Рэакцыя на нераст. Экстракты з мачы свежай і вытрыманай каровы аналізавалі ў клетках Bugdorm (30 см × 30 см × 30 см; MegaView Science). Пластыкавыя кубкі (30 мл; Nolato Hertila), напоўненыя 20 мл дыстыляванай вады, служылі нерастовым субстратам і размяшчаліся ў процілеглых кутах клеткі на адлегласці 24 см адзін ад аднаго. У апрацоўчыя кубкі дадавалі па 10 мкл кожнага экстракта з мачы ў развядзенні 1:10. Для рэгулявання кантрольнага кубка выкарыстоўвалі такую ​​ж колькасць пентану. Апрацоўчыя і кантрольныя кубкі мянялі месцамі паміж кожным эксперыментам для кантролю ўплыву пазіцыі. Дзесяць самак, якія атрымлівалі кроў, выпускалі ў эксперыментальныя клеткі ў ZT 9-11, і праз 24 гадзіны падлічвалі ікру ў кубках. Формула для разліку індэкса нерасту: (колькасць яек, адкладзеных у апрацоўчую кубак - колькасць яек, адкладзеных у кантрольную кубак) / (агульная колькасць адкладзеных яек). Кожную апрацоўку паўтаралі 8 разоў.
Газавая храматаграфія і аналіз з выкарыстаннем электронна-антэннай дыяграмы (GC-EAD) самак An.arabiensis былі праведзены, як апісана раней [20]. Карацей кажучы, свежыя лятучыя экстракты ў газавай прасторы былі аддзелены з дапамогай газавай хроматографіі Agilent Technologies 6890 GC (Санта-Клара, Каліфорнія, ЗША), абсталяванай калонкай HP-5 (30 м × 0,25 мм унутраны дыяметр, таўшчыня плёнкі 0,25 мкм, Agilent Technologies). і старэнне мачы. Вадарод выкарыстоўваўся ў якасці рухомай фазы са сярэдняй лінейнай хуткасцю патоку 45 см/с. Кожны ўзор (2 мкл) уводзіўся на працягу 30 секунд у рэжыме без падзелу пры тэмпературы на ўваходзе 225 °C. Тэмпература печы ГХ была запраграмавана ад 35 °C (3 хвіліны вытрымкі) да 300 °C (10 хвілін вытрымкі) пры 10 °C/мін-1. У раздзяляльнік сцёкавых вод ГХ дадавалі азот пад ціскам 4 фунты на квадратны дюйм і раздзялялі ў суадносінах 1:1 у крыжы Gerstel 3D/2 з нізкім мёртвым аб'ёмам (Gerstel, Мюльхайм, Германія) паміж дэтэктарам іанізацыі полымя і электронным дэтэктарам адтоку (ЭАД). Капіляр сцёкавых вод ГХ для ЭАД прапускалі праз перадаючую лінію Gerstel ODP-2, якая адсочвае тэмпературу печы ГХ плюс 5 °C, у шкляную трубку (10 см × 8 мм), дзе яна змешвалася з увільготненым паветрам, адфільтраваным вугляродным фільтрам (1,5 л/мін-1). Антэна была размешчана на адлегласці 0,5 см ад выхадзе з трубкі. Кожны асобны камар прыпадаў на адзін паўтаральны досвед, а для камароў, якія шукаюць гаспадара, было выканана не менш за тры паўтаральныя доследы на ўзорах мачы кожнага ўзросту.
Ідэнтыфікацыя біялагічна актыўных злучэнняў у спарных калекцыях свежай і вытрыманай бычынай мачы з выкарыстаннем камбінаванага ГХ і мас-спектрометра (ГХ-МС; 6890 ГХ і 5975 МС; Agilent Technologies) для атрымання антэнных рэакцый пры ГХ-ЭАД-аналізе, які працуе ў рэжыме іанізацыі электронным ударам пры 70 эВ. ГХ быў абсталяваны капілярнай калонкай з плаўленага крэмнію HP-5MS UI з пакрыццём (унутраны дыяметр 60 м × 0,25 мм, таўшчыня плёнкі 0,25 мкм) з выкарыстаннем гелія ў якасці рухомай фазы са сярэдняй лінейнай хуткасцю патоку 35 см/с. Узор аб'ёмам 2 мкл быў уведзены з выкарыстаннем тых жа налад інжэктара і тэмпературы печы, што і для ГХ-ЭАД-аналізу. Злучэнні былі ідэнтыфікаваны на аснове іх часу ўтрымання (індэкс Ковата) і мас-спектраў у параўнанні з карыстальніцкай бібліятэкай і бібліятэкай NIST14 (Agilent). Ідэнтыфікаваныя злучэнні былі пацверджаны шляхам увядзення аўтэнтычных стандартаў (Дадатковы файл 1: Табліца S2). Для колькаснага вызначэння выкарыстоўваўся гептылацэтат (10 нг, У якасці знешняга стандарту ўводзілі раствор хімічнай чысціні 99,8 % (Aldrich).
Ацэнка эфектыўнасці сінтэтычнай сумесі пахаў, якая складаецца з біялагічна актыўных злучэнняў, выяўленых у свежай і вытрыманай мачы Ans.arabiensis, для прыцягнення крывасмактальных і шукальных гаспадара Ans.arabiensis, з выкарыстаннем таго ж ольфактометра і пратакола, што і вышэй. Сінтэтычныя сумесі імітавалі склад і прапорцыі злучэнняў у змешаных лятучых экстрактах свежай, 24-гадзіннай, 48-гадзіннай, 72-гадзіннай і 168-гадзіннай вытрыманай мачы (малюнак 5D-G; дадатковы файл 1: табліца S2). Для аналізу выкарыстоўвайце 10 мкл развядзення 1:100 цалкам сінтэтычнай сумесі з агульнай хуткасцю вызвалення прыблізна ад 140 да 2400 нг/г для ацэнкі прывабнасці для гаспадара і крывасмактальных камароў. Пасля гэтага тэст праводзіцца на поўных сумесях, у якіх выдаляюцца субтрактыўныя сумесі асобных злучэнняў поўнай сумесі. Рэакцыі пошуку ад гаспадара і крывасмактальных Ans. Arab супраць сінтэтычных і субтрактыўных сумесяў аналізаваліся з выкарыстаннем намінальнай лагістычнай рэгрэсіі з наступным парным параўнаннем для суадносін няцотных лікаў (JMP Pro, версія 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Каб ацаніць, ці можа каровіна мача служыць сігналам для асяроддзя пражывання камароў-гаспадароў, свежую і вытрыманую каровіну мачу, сабраную, як апісана вышэй, і ваду змяшчалі ў сеткаватыя вёдры аб'ёмам 3 л (100 мл) і ўстаўлялі ў пасткі-прынады для гаспадароў (версія BG-HDT; BioGents, Рэгенсбург, Германія). Дзесяць пастак размяшчалі на адлегласці 50 м адна ад адной на пашы, за 400 м ад вясковай абшчыны (Сілай, Эфіопія, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) без буйной рагатай жывёлы, на пастаянных месцах размнажэння і ў вёсках. Пяць пастак награвалі, каб імітаваць прысутнасць гаспадара, а пяць пастак пакідалі без нагрэву. Кожнае месца апрацоўкі змянялі штоночы на ​​працягу пяці начэй. Колькасць камароў, злоўленых у пастках з прынадай з мачой рознага ўзросту, параўноўвалі з выкарыстаннем лагістычнай рэгрэсіі з бэта-бінамінальным размеркаваннем (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
У вёсцы, эндэмічнай па малярыі, недалёка ад горада Макі, рэгіён Аромія, Эфіопія (8° 11′ 08″ пн. ш., 38° 81′ 70″ у. д.; малюнак 6А). Даследаванне праводзілася з сярэдзіны жніўня па сярэдзіну верасня перад штогадовым апырскваннем памяшканняў рэшткавымі прэпаратамі, а таксама падчас працяглага сезона дажджоў. Для даследавання былі адабраны пяць пар дамоў (на адлегласці 20–50 м адзін ад аднаго), размешчаных на ўскраіне вёскі (мал. 6А). Крытэрыі адбору дамоў былі наступнымі: забарона на знаходжанне ў доме жывёл, забарона на прыгатаванне ежы ў памяшканні (прынамсі, падчас выпрабавальнага перыяду) і дамы з максімум двума жыхарамі, якія спяць у неінсектыцыдных памяшканнях. пад апрацаванай маскітнай сеткай. Этычнае адабрэнне было прадастаўлена Саветам па разглядзе этыкі інстытуцыйных даследаванняў (IRB/022/2016) факультэта прыродазнаўчых навук (CNS-IRB) Адыс-Абебскага ўніверсітэта ў адпаведнасці з рэкамендацыямі, устаноўленымі Хельсінкскай дэкларацыяй Сусветнай медыцынскай асацыяцыі. Згода ад кожнага кіраўніка сям'і была атрымана пры дапамозе персаналу па ахове здароўя. Увесь працэс ухвалены мясцовымі адміністрацыямі на ўзроўні раёна і аддзялення («кебеле»). Эксперыментальная схема адпавядала схеме лацінскага квадрата 2 × 2, у якой сінтэтычныя сумесі і кантрольныя ўзоры былі прызначаны парным дамам у першую ноч і абменьваліся паміж дамамі ў наступную эксперыментальную ноч. Гэты працэс паўтараўся дзесяць разоў. Акрамя таго, для ацэнкі актыўнасці камароў у асобных дамах пасткі CDC былі настроены на пяць начэй запар у пачатку, сярэдзіне і канцы палявых выпрабаванняў у адзін і той жа час сутак.
Сінтэтычную сумесь, якая змяшчала шэсць біялагічна актыўных злучэнняў, растваралі ў гептане (97,0% растваральнік, клас ГХ, Sigma Aldrich) і вызвалялі з хуткасцю 140 нг/г з дапамогай дазатара з баваўняным кнотам [20]. Дазатар з кнотам дазваляў вызваляць усе злучэнні ў пастаянных прапорцыях на працягу 12-гадзіннага эксперыменту. Гептан выкарыстоўваўся ў якасці кантролю. Флакон быў падвешаны побач з кропкай уваходу ў светлавую пастку Цэнтраў па кантролі і прафілактыцы захворванняў (CDC) (John W. Hock Company, Гейнсвіл, Фларыда, ЗША; Малюнак 6А). Пасткі былі падвешаныя на вышыні 0,8–1 м над зямлёй, каля падножжа ложка, і добраахвотнік спаў пад неапрацаванай маскітнай сеткай і працаваў з 18:00 да 06:30. Камары, злоўленыя па полу і фізіялагічным стане (ненакормленыя, накормленыя, напаўцяжарныя і цяжарныя [21]), пасля былі правераны з дапамогай аналізу палімеразнай ланцуговай рэакцыі (ПЛР) для ідэнтыфікацыі відаў, марфалагічна ідэнтыфікаваных як A. gambiae sl. Члены комплексу [23]. У палявых умовах У даследаванні фіксацыя парных дамоў у пасткі аналізавалася з выкарыстаннем намінальнай лагістычнай мадэлі падбору, дзе прыцягненне было залежнай зменнай, а апрацоўка (сінтэтычная сумесь супраць кантролю) — фіксаваным эфектам (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Тут мы паведамляем пра значэнні χ2 і p з тэсту адноснай верагоднасці.
Ацаніце бяспеку гэтага працэсу. arabiensis змог атрымаць мачу, сваю асноўную крыніцу азоту, мачавіну, шляхам непасрэднага кармлення на працягу 48 гадзін пасля ўвядзення на працягу 4 дзён пасля (dpe) выпрабаванняў кармлення самак, якія шукаюць гаспадара, і самак, якія сілкуюцца крывёю (мал. 1A). Як самкі, якія шукаюць гаспадара, так і крывасмактальныя самкі паглыналі значна больш цукрозы, чым любую іншую дыету або ваду (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 і F(5,299) = 56,00, p < 0,0001 адпаведна; мал. 1B,C). Акрамя таго, самкі, якія шукаюць гаспадара, елі менш мачы праз 72 гадзіны ў параўнанні з мачой праз 168 гадзін (мал. 1B). Калі ім прапаноўвалі дыету, якая змяшчае мачавіну, самкі, якія шукаюць гаспадара, паглыналі значна большую колькасць мачавіны пры 2,69 мМ у параўнанні з усімі іншымі канцэнтрацыямі і вадой, у той час як яна была неадрозная ад 10% цукрозы (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Малюнак 1D). Гэта кантраставала з рэакцыяй самак, якія атрымлівалі крывёю і звычайна паглыналі значна больш мачавіны, чым вады, хоць і значна менш за 10% цукрозы (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Малюнак 1).1E). Акрамя таго, пры параўнанні двух фізіялагічных станаў, самкі з флебатаміяй паглыналі больш мачавіны, чым самкі, якія шукалі гаспадара, пры самых нізкіх канцэнтрацыях, і гэтыя самкі паглыналі падобную колькасць мачавіны пры больш высокіх канцэнтрацыях (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Малюнак 1F, G). Хоць спажыванне з дыеты, якая змяшчае мачавіну, мела аптымальныя значэнні (Малюнак 1D, E), самкі ў абодвух фізіялагічных станах змаглі мадуляваць колькасць мачавіны, якая паглынаецца, ва ўсім дыяпазоне канцэнтрацый мачавіны лагарыфмічна (Малюнак 1F, G). ). Падобным чынам, камары, відаць, кантралююць паглынанне азоту, рэгулюючы колькасць паглынутай мачы, бо колькасць азоту ў мачы адлюстроўваецца ў колькасці паглынутай мачы (устаўкі на малюнку 1B, C і B).
Каб ацаніць уплыў мачы і мачавіны на выжывальнасць камароў, якія шукаюць гаспадара, і крывасмактальных камароў, самак кармілі мачой усіх чатырох узростаў (свежай, праз 24 гадзіны, 72 гадзіны і 168 гадзін пасля асаджэння), а ў якасці кантролю выкарыстоўвалі дыяпазон канцэнтрацый мачавіны, а таксама дыстыляваную ваду і 10% цукрозу (малюнак 2А). Гэты аналіз выжывальнасці паказаў, што дыета аказвае значны ўплыў на агульную выжывальнасць самак, якія шукаюць гаспадара (мача: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; мачавіна: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; мал. 2B, C), і самак, якія атрымлівалі кроў (мача: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; мачавіна: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Малюнак 2D,E). Ва ўсіх эксперыментах самкі, якія атрымлівалі дыету з мачы, мачавіны і вады, мелі значна ніжэйшыя паказчыкі выжывальнасці ў параўнанні з самкамі, якія атрымлівалі цукрозу (малюнак 2B-E). Самкі, якія шукалі гаспадара і атрымлівалі свежую і нясвежую мачу, прадэманстравалі розныя паказчыкі выжывальнасці, прычым тыя, якія атрымлівалі 72-гадзінную нясвежую мачу (p = 0,016), мелі найменшую верагоднасць выжывання (мал. 2B). Акрамя таго, самкі, якія шукалі гаспадара і атрымлівалі 135 мМ мачавіны, выжывалі даўжэй, чым кантрольная група з вадой (p < 0,04) (мал. 2C). У параўнанні з вадой, жанчыны, якія атрымлівалі свежую мачу і 24-гадзінную мачу, выжывалі даўжэй (p = 0,001 і p = 0,012 адпаведна; малюнак 2D), у той час як жанчыны, якія атрымлівалі 72-гадзінную мачу, выжывалі даўжэй, чым тыя, хто атрымліваў мала свежай мачы і 24-гадзінную мачу (p < 0,0001 і p = 0,013 адпаведна; малюнак 2D). Пры кармленні 135 мМ мачавіны, Самкі, якія атрымлівалі крывёю, выжывалі даўжэй, чым пры ўсіх астатніх канцэнтрацыях мачавіны і вады (p < 0,013; малюнак 2E).
Выжыванне гаспадара і крывасмактальных самак Anopheles arabinis, якія сілкаваліся каровінай мачой і мачавінай. У біялагічным аналізе (А) самкам камароў давалі рацыён, які складаўся са свежай і вытрыманай каровінай мачы, розных канцэнтрацый мачавіны, цукрозы (10%) і дыстыляванай вады (H2O). Выжыванне камароў, якія шукаюць гаспадара (B, C), і крывасмактальных (D, E), фіксавалася кожныя 12 гадзін, пакуль усе самкі, якія сілкаваліся мачой (B, D) і мачавінай (C, E), а таксама кантрольныя самкі, якія сілкаваліся цукрозай і вадой, не загінулі.
Агульная адлегласць і колькасць раўндаў, вызначаныя ў тэсце палётнага млына на працягу 24-гадзіннага перыяду, адрозніваліся ў камароў, якія шукалі гаспадара, і крывасмактальных камароў, якія ў цэлым прадэманстравалі меншую актыўнасць палёту (мал. 3). Камары, якія шукалі гаспадара і давалі свежую і вытрыманую мачу або цукрозу і ваду, прадэманстравалі розныя схемы палёту (мал. 3), прычым самкі, якія сілкаваліся свежай мачой, былі больш актыўнымі на світанні, у той час як тыя, што карміліся 24- і 168-гадзіннай мачой. Камары, якія сілкаваліся мачой, прадэманстравалі розныя схемы палёту і вялі ў асноўным дзённы лад жыцця. Самкі камароў, якія давалі цукрозу або 72-гадзінную мачу, праяўлялі актыўнасць на працягу 24-гадзіннага перыяду, у той час як самкі, якія давалі ваду, былі больш актыўнымі ў сярэдзіне перыяду. Камары, якія сілкаваліся цукрозай, праяўлялі найвышэйшы ўзровень актыўнасці позна ўвечары і ранняй раніцай, у той час як тыя, хто ўжываў 72-гадзінную мачу, адчувалі стабільнае зніжэнне актыўнасці на працягу 24 гадзін (малюнак 3).
Палётныя характарыстыкі самак Anopheles arabinis, якія імкнуцца знайсці гаспадара і сілкуюцца каровінай мачой і мачавінай. У тэсце «лятучы млын» самкі камароў, якія сілкаваліся свежай і вытрыманай каровінай мачой, рознымі канцэнтрацыямі мачавіны, цукрозы (10%) і дыстыляванай вадой (H2O), былі прывязаны да гарызантальных, свабодна круцячыхся кранштэйнаў (вышэй). Для самак, якія шукаюць гаспадара (злева) і якія імкнуцца знайсці крывасмактаць (справа), фіксаваліся агульная адлегласць і колькасць палётаў у гадзіну для кожнага рацыёну на працягу 24-гадзіннага перыяду (цёмны: шэры; светлы: белы). Сярэдняя адлегласць і сярэдняя колькасць палётаў паказаны справа ад графіка цыркаднай актыўнасці. Палоскі памылак прадстаўляюць стандартную памылку сярэдняга значэння. Статыстычны аналіз глядзіце ў тэксце.
У цэлым, агульная актыўнасць палёту самак, якія шукаюць гаспадара, адпавядала схеме, падобнай да далёкасці палёту на працягу 24-гадзіннага перыяду. Сярэдняя далёкасць палёту значна залежала ад спажыванай дыеты (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), і самкі, якія шукаюць гаспадара, якія з'елі 72 гадзіны мачы, праляталі значна большыя адлегласці ў параўнанні з усімі іншымі дыетамі (p < 0,0001), а камары, якія сілкаваліся цукрозай, ляталі даўжэй, чым камары, якія сілкаваліся свежай (p = 0,022) і 24-гадзіннай мачой (p = 0,022). У адрозненне ад схемы актыўнасці палёту, апісанай дыетай з мачой, самкі, якія шукаюць гаспадара, якія сілкаваліся мачавінай, праяўлялі ўстойлівую актыўнасць палёту на працягу 24-гадзіннага перыяду, дасягаючы піку ў другой палове цёмнай фазы (мал. 3). Нягледзячы на ​​тое, што схемы актыўнасці былі падобнымі, самкі, якія шукаюць гаспадара, якія сілкаваліся мачавінай, значна павялічвалі сярэднюю далёкасць палёту ў залежнасці ад паглынутай канцэнтрацыі (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Самкі, якія шукалі гаспадара і атрымлівалі любую канцэнтрацыю мачавіны, ляталі даўжэй, чым самкі, якія атрымлівалі ваду або цукрозу (p < 0,03).
Агульная актыўнасць палётаў крывасмактальных камароў была стабільнай і падтрымлівалася на працягу 24 гадзін ва ўсіх дыетах, з павышэннем актыўнасці мачы ў другой палове цёмнага перыяду ў самак, якія атрымлівалі ваду, а таксама ў самак, якія атрымлівалі свежую і 24-гадзінную ежу (малюнак 3). У той час як дыета з мачой значна паўплывала на сярэднюю адлегласць палёту ў самак, якія атрымлівалі кроў (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), дыета з мачавінай не паўплывала (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) пры выкарыстанні іншай мачы і кантрольнай дыеты (свежая, p = 0,0091; 72 гадзіны, p = 0,0022; 168 гадзін, p = 0,001; цукроза, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Уплыў кармлення мачой і мачавінай на рэпрадуктыўныя параметры ацэньваўся ў біялагічных аналізах на адкладку яек (малюнак 4А) і даследаваўся ў залежнасці ад колькасці яек, адкладзеных кожнай самкай, памеру яек і толькі што вылупіўшыхся лічынак першага ўзросту. Колькасць адкладзеных яек. Арабскія самкі, якія атрымлівалі мачу, адрозніваліся ў залежнасці ад дыеты (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; мал. 4B). Самкі, якія атрымлівалі 24-гадзінную мачу і крывяную муку, адкладалі значна больш яек, чым самкі, якія атрымлівалі іншыя дыеты з мачой, і былі падобныя да тых, якія атрымлівалі цукрозу (мал. 4B). Аналагічна, памер яек, адкладзеных самкамі, якія атрымлівалі мачу, адрозніваўся ў залежнасці ад дыеты (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), прычым самкі, якія атрымлівалі 24-гадзінную мачу і цукрозу, адкладалі значна большыя яйкі, чым самкі, якія атрымлівалі ваду, у той час як яйкі самак, якія атрымлівалі 168 гадзін мачы, былі значна меншымі (мал. 4C). Акрамя таго, дыета з мачой значна паўплывала на памер лічынак (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), прычым з яек, адкладзеных 24- і 72-гадзіннымі самкамі, якія атрымлівалі мачу, вылупляліся значна большыя лічынкі, чым з яек, адкладзеных лічынкамі яек. Самкі, якія атрымлівалі ваду і 168-гадзіннае мачавое харчаванне (малюнак 4D).
Рэпрадуктыўная здольнасць самак Anopheles arabinis, якія сілкуюцца каровінай мачой і мачавінай. Самкі камароў, якія харчаваліся крывёю, атрымлівалі рацыён, які складаўся са свежай і вытрыманай каровінай мачы, розных канцэнтрацый мачавіны, цукрозы (10%) і дыстыляванай вады (H2O) на працягу 48 гадзін перад тым, як змясціць іх у біялагічныя аналізы і атрымаць субстраты для адкладкі яек (A). Колькасць яек (B, E), памер яек (C, F) і памер лічынак (D, G) значна залежалі ад прапанаванага рацыёну (каровіна мача: BD; мачавіна: EG). Сярэднія значэнні для кожнага параметра, вымеранага з выкарыстаннем розных літарных назваў, значна адрозніваліся адзін ад аднаго (аднабаковы ANOVA з выкарыстаннем post hoc аналізу Цьюкі; p < 0,05). Палоскі памылак прадстаўляюць стандартную памылку сярэдняга значэння.
Мачавіна, як асноўны азоцісты кампанент мачы, пры ўжыванні ў якасці рацыёну самак, якія атрымлівалі крывёю, значна ўплывала на рэпрадуктыўныя параметры ва ўсіх даследаваннях. Колькасць яек, адкладзеных самкамі, якія атрымлівалі мачавіну, пасля ежы крывёю, у залежнасці ад канцэнтрацыі мачавіны (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), самкі, якія атрымлівалі мачавіну ў канцэнтрацыі ад 134 мкМ да 1,34 мМ, адкладалі больш яек (малюнак 4E). Самкі, якія атрымлівалі мачавіну ў канцэнтрацыі 134 мкМ або вышэй, адкладалі больш буйныя яйкі, чым самкі, якія атрымлівалі ваду (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; малюнак 4F), а памер лічынак, хоць і залежаў ад падобных канцэнтрацый мачавіны ў маці (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), быў больш зменлівым (мал. 4G).
Агульная прывабнасць да лятучых экстрактаў з мачы буйной рагатай жывёлы, якія шукаюць гаспадара. На Arabiensis, ацэнены ў шкляным ольфактометры (мал. 5A), значна паўплываў узрост мачы (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; мал. 5B). Post hoc аналіз паказаў, што пах нясвежай мачы праз 24 гадзіны выклікаў значна больш высокі ўзровень прывабнасці ў параўнанні з усімі іншымі метадамі лячэння (72 гадзіны: p = 0,0060, 168 гадзін: p = 0,012, пентан: p = 0,00070), за выключэннем паху свежай мачы (p = 0,13; мал. 5B). Нягледзячы на ​​тое, што агульная прывабнасць крывасмактальных камароў да паху мачы істотна не адрознівалася (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; мал. 5C), гэтыя самкі аказаліся значна больш прывабнымі да лятучых экстрактаў з мачы буйной рагатай жывёлы ў параўнанні з мачой, вытрыманай 72 гадзіны, у параўнанні з кантрольнай групай (p = 0,0066; малюнак 5C).
Паводніцкія рэакцыі на натуральныя і сінтэтычныя пахі каровінай мачы ў пошуках гаспадара і Anopheles arabianus, якія сілкуюцца крывёю. Схема шкляной трубкі ольфактометра (A). Прыцягненне лятучых экстрактаў з вонкавай прасторы свежай і вытрыманай каровінай мачы да гаспадара (B) і крывасмактальных (C) камароў. Знайдзіце рэакцыю шчупальцаў лорда Ан. Паказаны экстракты з вонкавай прасторы, вылучаныя са свежай (D), 24-гадзіннай (E), 72-гадзіннай (F) і 168-гадзіннай (G) каровінай мачы. Сляды дэтэкцыі электроннай антэны (EAD) паказваюць змены напружання ў адказ на біялагічна актыўныя злучэнні ў вонкавай прасторы, элюяваныя з газавага храматографа і выяўленыя полымяна-іянізацыйным дэтэктарам (FID). Маштабная лінейка прадстаўляе амплітуду водгуку (мВ) у залежнасці ад часу ўтрымання (с). Паказаны ўласцівасці і хуткасці вызвалення (мкг/г) біялагічна актыўных злучэнняў. Адна зорачка (*) паказвае паслядоўны водгук з нізкай амплітудай. Падвойныя зорачкі (**) паказваюць неўзнаўляльныя водгукі. Знайдзіце гаспадара (H) і крывасмактальнага камара. (I) An.arabiensis па-рознаму ўспрымае сінтэтычныя сумесі пахаў свежай і вытрыманай каровінай мачы. Сярэднія долі камароў, якіх прыцягваюць розныя літарныя назвы, значна адрозніваліся адзін ад аднаго (аднабаковы дысперсійны аналіз з выкарыстаннем постфактумнага аналізу Цьюкі; p < 0,05). Палоскі памылак прадстаўляюць стандартную памылку шкалы.
Самка Ann.arabiensis, праз 72 гадзіны і 120 гадзін пасля крывавага прыёму ежы, падчас нерасту, не прадэманстравала перавагі для лятучых экстрактаў з свежай і вытрыманай каровінай мачы ў параўнанні з кантрольнай групай з пентанам (χ2 = 3,07, p > 0,05; Дадатковы файл 1: Малюнак S1).
Для самак Ann.arabiensis аналізы з выкарыстаннем газавай хроматографіі з эластычнай дэфібрыляцыяй (ГХ-ЭАД) і ГХ-МС выявілі восем, шэсць, тры і тры біялагічна актыўныя злучэнні (малюнак 5D-G). Нягледзячы на ​​тое, што назіраліся адрозненні ў колькасці злучэнняў, якія выклікалі электрафізіялагічныя рэакцыі, большасць з гэтых злучэнняў прысутнічалі ў кожным лятучым экстракце, сабраным са свежай і вытрыманай мачы. Такім чынам, для кожнага экстракта ў далейшыя аналізы былі ўключаны толькі злучэнні, якія выклікалі фізіялагічную рэакцыю самак-вусікаў вышэй за парог.
Агульная хуткасць вызвалення лятучых біялагічна актыўных злучэнняў у калекцыі з парафазнай фазы павялічылася з 29 мкг/г у свежай мачы да 242 мкг/г у мачы, вытрыманай 168 гадзін, галоўным чынам з-за павелічэння ўтрымання п-крэзолу і м-фармальдэгіду. Фенол, а таксама фенол, павялічваюцца. Наадварот, хуткасць вызвалення іншых злучэнняў, такіх як 2-цыклагексен-1-он і дэканал, зніжалася са павелічэннем узросту мачы, што карэлявала з назіраным зніжэннем інтэнсіўнасці (колькасці) сігналу на храматаграме (мал. 5D)-G левая панэль) і фізіялагічнымі рэакцыямі на гэтыя злучэнні (мал. 5D-G правая панэль).
У цэлым, сінтэтычная сумесь мела падобнае натуральнае суадносіны біялагічна актыўных злучэнняў, выяўленых у лятучых экстрактах свежай і вытрыманай мачы (мал. 5D–G), і, відаць, не выклікала значнай прывабнасці ў пошуку гаспадара (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; мал. 5H) або крывасмактальных камароў (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; мал. 5I). Аднак постфактумныя парныя параўнанні паміж апрацоўкамі паказалі, што камары, якія шукаюць гаспадара, былі значна прывабнейшымі для сінтэтычнай сумесі 24-гадзіннай вытрыманай мачы ў параўнанні з кантрольнай групай з пентанам (p = 0,0086; мал. 5H).
Каб ацаніць ролю асобных кампанентаў у сінтэтычных сумесях мачы, вытрыманай 24 гадзіны, шэсць субтрактыўных сумесяў былі ацэнены ў параўнанні з поўнымі сумесямі ў Y-падобным аналізе, у якім асобныя злучэнні былі выдалены. Для камароў, якія шукаюць гаспадара, адніманне асобных злучэнняў з поўнай сумесі мела значны ўплыў на паводніцкія рэакцыі (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Дадатковы файл 1: Малюнак S2A), усе субтрактыўныя сумесі былі больш прывабнымі, чым цалкам змешаныя. Наадварот, выдаленне асобных злучэнняў з цалкам сінтэтычнай сумесі не паўплывала на паводніцкія рэакцыі крывасмактальных камароў (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), за выключэннем дэканалу, які прывёў да больш нізкіх узроўняў прывабнасці ў параўнанні з поўнай сумессю (p = 0,022; Дадатковы файл 1: Малюнак S2B).
У вёсцы Эфіопіі, дзе назіраецца эндэмія малярыі, эфектыўнасць сінтэтычнай сумесі каровінай мачы, якая выкарыстоўваецца за 24 гадзіны, у прыцягненні камароў у палявых умовах ацэньвалася на працягу дзесяці начэй (мал. 6А). Усяго было злоўлена і ідэнтыфікавана 4861 камар, з якіх 45,7% складалі Anthropus.gambiae sl, 18,9% — Anopheles pharoensis і 35,4% — Culex spp. (Дадатковы файл 1: Табліца S1). Anopheles arabinis — адзіны прадстаўнік відавага комплексу An.Gambian, ідэнтыфікаваны з дапамогай ПЛР-аналізу. У сярэднім за ноч злоўлівалася 320 камароў, і на працягу гэтага часу пасткі з сінтэтычнымі прынадамі з сумесі лавілі больш камароў, чым парныя пасткі без сумесі (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Пасткі без прынады ўсталёўваліся ў кожную з пяці кантрольных начэй у пачатку, сярэдзіне і ў канцы выпрабавання. У кожнай пары пастак было злоўлена аднолькавая колькасць камароў, што сведчыць пра... адсутнасць зрушэння паміж дамамі (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) і адсутнасць зніжэння папуляцыі на працягу перыяду даследавання. У параўнанні з кантрольнымі пасткамі, колькасць камароў, злоўленых у пастках, якія змяшчаюць сінтэтычную сумесь, значна павялічылася: пошук гаспадара (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), нядаўняе харчаванне крывёю (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) і цяжарнасць (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Дадатковы файл 1: Табліца S1). Гэта таксама адлюстравана ў агульнай колькасці злоўленых камароў: пошук гаспадара > крывасмактанне > цяжарныя > напаўцяжарныя > самцы.
Палявая ацэнка эфектыўнасці 24-гадзіннай сінтэтычнай сумесі паху каровінай мачы. Палявыя выпрабаванні былі праведзены ў паўднёва-цэнтральнай Эфіопіі (карта), недалёка ад горада Макі (устаўка), з выкарыстаннем светлавой пасткі Цэнтраў па кантролі і прафілактыцы захворванняў (CDC) (справа) у парных дамах, з лацінскай квадратнай схемай (аэрафотаздымак) (A). Сінтэтычныя фотапасткі CDC з прынадай для паху прыцягваюць і захопліваюць самак Anopheles arabesques (B), але не Anopheles farroes (C), па-іншаму, у залежнасці ад фізіялагічнага стану. Акрамя таго, гэтыя пасткі захоплівалі значна большую колькасць камароў-гаспадароў Culex. (D) У параўнанні з кантролем. Слупкі злева прадстаўляюць сярэдні індэкс селекцыі камароў, злоўленых у парах пасткаў з прынадай для паху (зялёная) і кантрольных (адкрытых) (N = 10), а слупкі справа прадстаўляюць сярэдні індэкс селекцыі ў парах кантрольных пастак (адкрытых; N = 5). Зорачкі паказваюць узроўні статыстычнай значнасці (*p = 0,01 і ***p < 0,0001).
Тры віды былі адлоўлены па-рознаму ў пастках, якія змяшчалі сінтэтычныя сумесі. У пастцы з прынадай з сінтэтычнай сумессю ў пастцы, якая змяшчала прынаду, назіралася рознае павелічэнне колькасці камароў, якія шукаюць гаспадара (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), харчаванне крывёю (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) і цяжарнасць (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134). .arabiensis быў злоўлены ў пастцы, вызваляючы сінтэтычную сумесь (мал. 6B), у той час як колькасць An не адрознівалася. Былі выяўлены камары Pharoensis у розных фізіялагічных станах (мал. 6C). Для Culex назіралася толькі значнае павелічэнне колькасці камароў, якія шукаюць гаспадара, у пастках з прынадай з сінтэтычнай сумессю (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; мал. 6D) у параўнанні з кантрольнымі пасткамі.
Для ацэнкі таго, ці выкарыстоўваюць малярыйныя камары пах каровінай мачы ў якасці сігналу пра асяроддзе пражывання гаспадара, выкарыстоўваліся пасткі-прынады, размешчаныя па-за межамі патэнцыйных гаспадароў паміж месцамі размнажэння і сельскімі абшчынамі ў Эфіопіі. Пры адсутнасці сігналаў пра гаспадара, спякоты і пры наяўнасці або адсутнасці паху каровінай мачы камары не былі злоўлены (Дадатковы файл 1: Малюнак S3). Аднак пры наяўнасці высокай тэмпературы і паху каровінай мачы самкі малярыйных камароў былі прыцягнуты і злоўлены, хоць і ў невялікай колькасці, незалежна ад узросту мачы (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Дадатковы файл 1: Малюнак S3). Наадварот, кантрольныя ўзоры з вадой не лавілі малярыйных камароў пры высокіх тэмпературах (Дадатковы файл 1: Малюнак S3).
Малярыйныя камары набываюць і распаўсюджваюць азотазмяшчальныя злучэнні шляхам кампенсацыйнага харчавання каровінай мачой (г.зн. лужынамі) для паляпшэння жыццёвых рыс, падобна іншым насякомым [2, 4, 24, 25, 26]. Каровіна мача — гэта лёгкадаступны аднаўляльны рэсурс, цесна звязаны з месцамі адпачынку пераносчыкаў малярыі, такімі як кароўнікі і высокая расліннасць паблізу сельскіх дамоў і месцаў нерасту. Самкі камароў знаходзяць гэты рэсурс па паху і здольныя рэгуляваць паглынанне азоцістых злучэнняў у мачы, у тым ліку мачавіны, асноўнага азоцістага кампанента ў мачы [15, 16]. У залежнасці ад фізіялагічнага стану самкі камара, пажыўныя рэчывы ў мачы выдзяляюцца для павышэння лётнай актыўнасці і выжывальнасці самак камароў, якія шукаюць гаспадара, а таксама для выжывальнасці і рэпрадуктыўных характарыстык асобін, якія сілкуюцца крывёю, падчас першага гонадатропнага цыклу. Такім чынам, змешванне мачы гуляе важную пажыўную ролю для пераносчыкаў малярыі, якія знаходзяцца ў закрытым стане, як і недаядаючыя дарослыя асобіны [8], паколькі гэта дае самкам камароў магчымасць набываць важныя азоцістыя злучэнні, займаючыся харчаваннем з нізкай рызыкай. Гэта адкрыццё мае значныя эпідэміялагічныя наступствы, паколькі самкі павялічваюць працягласць жыцця, актыўнасць і рэпрадуктыўная здольнасць, што ўплывае на здольнасць пераносчыкаў. Акрамя таго, такая паводзіны можа стаць мэтай будучых праграм барацьбы з пераносчыкамі.