Voedingstofverkryging en -verspreiding integreer insekte se voedingssoektogte en lewensgeskiedeniskenmerke. Om te vergoed vir tekorte aan spesifieke voedingstowwe in verskillende lewensfases, kan insekte hierdie voedingstowwe verkry deur aanvullende voeding, byvoorbeeld deur te voed op gewerwelde afskeidings in 'n proses wat bekend staan ​​as plasse. Die muskiet Anopheles arabiani blyk ondervoed te wees en benodig dus voedingstowwe vir beide metabolisme en voortplanting. Die doel van hierdie studie was om te bepaal of An. arabiensis se roering op koei-urine vir voedingstofverkryging lewensgeskiedeniskenmerke verbeter.
Maak seker dis veilig. arabiensis is aangetrokke tot die reuk van vars, 24-uur, 72-uur en 168-uur oue koei-urine, en gasheersoekende en bloedgevoerde (48 uur na bloedmaaltyd) wyfies is gemeet in 'n Y-buis olfaktometer, en dragtige wyfies is geassesseer vir paaitoets. 'n Gekombineerde chemiese en elektrofisiologiese analise is toe gebruik om bioaktiewe verbindings in koei-urine in al vier ouderdomsklasse te identifiseer. Sintetiese mengsels van bioaktiewe verbindings is geëvalueer in Y-buis- en veldproewe. Om koei-urine en die hoof stikstofbevattende verbinding ureum as potensiële aanvullende diëte vir malariavektore te ondersoek, is voedingsparameters en lewensgeskiedeniskenmerke gemeet. Die proporsie vroulike muskiete en die hoeveelheid koei-urine en ureum wat geabsorbeer is, is geassesseer. Na voeding is wyfies geassesseer vir oorlewing, vasgebonde vlug en voortplanting.
Soek na die gasheer se bloed en voeding. In laboratorium- en veldstudies is Arabiere aangetrokke tot die natuurlike en sintetiese geur van vars en verouderde koei-urine. Dragtige wyfies was onverskillig teenoor koei-urine-reaksies by paaiplekke. Gasheer-soekende en bloedsuiende wyfies absorbeer aktief koei-urine en ureum en ken hierdie hulpbronne toe volgens lewensgeskiedenis-afwegings as 'n funksie van fisiologiese toestand vir vlug, oorlewing of voortplanting.
Anopheles arabinis verkryging en verspreiding van koei-urine vir verbeterde lewensgeskiedeniskenmerke. Aanvullende voeding van koei-urine beïnvloed vektorkapasiteit direk deur daaglikse oorlewing en vektordigtheid te verhoog, en indirek deur vlugaktiwiteit te verander en moet dus in toekomstige modelle oorweeg word.
Voedingstofverkryging en -verspreiding integreer insekte se voedselsoektog en lewensgeskiedeniskenmerke [1,2,3]. Insekte is in staat om voedsel te selekteer en te verkry en kompenserende voeding uit te voer gebaseer op voedselbeskikbaarheid en voedingstofvereistes [1, 3]. Die verspreiding van voedingstowwe hang af van die lewensgeskiedenisproses en kan lei tot verskillende vereistes vir dieetkwaliteit en -kwantiteit in verskillende lewensfases van insekte [1, 2]. Om te kompenseer vir tekorte aan spesifieke voedingstowwe, kan insekte hierdie voedingstowwe verkry deur aanvullende voeding, soos op modder, verskeie ontlasting en afskeidings van gewerweldes, en aas, 'n proses wat bekend staan ​​as plasse [2]. Alhoewel 'n verskeidenheid skoenlapper- en motspesies hoofsaaklik beskryf word, kom watergate ook in ander insekordes voor, en aantrekkingskrag tot en voeding op hierdie tipe hulpbronne kan beduidende gevolge hê vir gesondheid en ander lewensgeskiedeniskenmerke [2, 4, 5, 6], 7]. Die malariamuskiet Anopheles gambiae sensu lato (sl) kom na vore as 'n 'ondervoede' volwassene [8], dus kan water 'n belangrike rol speel in sy lewensgeskiedeniskenmerke, maar hierdie gedrag is tot dusver verwaarloos. Die gebruik van roering as 'n manier om voedingstofinname in hierdie belangrike voertuig te verhoog, verdien aandag, aangesien dit belangrike epidemiologiese gevolge kan hê.
Stikstofinname in volwasse vroulike Anopheles-muskiete is beperk as gevolg van lae kalorie-reserwes wat vanaf die larfstadium oorgedra word en ondoeltreffende benutting van bloedmeel [9]. Vroulike Ann.gambiae sl vergoed tipies hiervoor deur aanvulling met aanvullende bloedmaaltye [10, 11], waardeur meer mense die risiko loop om die siekte op te doen en muskiete 'n groter risiko van predasie loop. Alternatiewelik kan muskiete aanvullende voeding van gewerwelde uitskeidings gebruik om stikstofhoudende verbindings te verkry wat aanpassing en vlugmanoeuvreerbaarheid verbeter, soos deur ander insekte gedemonstreer [2]. In hierdie verband is die sterk en duidelike aantrekkingskrag van een van die sibbespesies binne Anopheles arabinis interessant. Die Gambiese sl-spesiekompleks, Anopheles arabinis, vars en verouderde koei-urine [12,13,14], is interessant. Anopheles arabinis is opportunisties in sy gasheervoorkeure en is bekend daarvoor dat dit met beeste assosieer en daarvan voed. Koei-urine is 'n hulpbron ryk aan stikstofhoudende verbindings, met ureum wat 50-95% van die totale stikstof in vars urine uitmaak [15, 16]. Soos Met bee-urine-ouderdomme gebruik mikroörganismes hierdie hulpbronne om die kompleksiteit van stikstofverbindings binne 24 uur te verminder [15]. Met die vinnige toename in ammoniak, geassosieer met 'n afname in organiese stikstof, floreer alkalofiele mikroörganismes (waarvan baie verbindings produseer wat giftig is vir muskiete) [15], wat vroulike Ann.arabiensis kan wees, word verkieslik aangetrokke tot urine wat 24 uur of minder oud is [13, 14].
In hierdie studie is daar gesoek na gasheer- en bloedgevoerde Ans. Gedurende sy eerste gonadotropiensiklus is arabiensis geassesseer vir die verkryging van stikstofhoudende verbindings, insluitend ureum, deur urienmenging. Vervolgens is 'n reeks eksperimente uitgevoer om te bepaal hoe vroulike muskiete hierdie potensiële voedingsbron toewys vir verbeterde oorlewing, voortplanting en verdere voedselsoek. Laastens is die reuk van vars en verouderde koei-urine geassesseer om te bepaal of dit betroubare leidrade vir gasheer- en bloedgevoerde An verskaf. In hul soeke na hierdie potensiële voedingsbron het arabiensis chemiese korrelasies agter die waargenome differensiële aantreklikheid ontdek. Sintetiese reukmengsels van vlugtige organiese verbindings (VOS'e) wat in 24-uur verouderde urine geïdentifiseer is, is verder onder veldtoestande geëvalueer, wat die resultate wat onder laboratoriumtoestande verkry is, uitgebrei het en die effek van beesurine-reuk op verskillende fisiologiese toestande gedemonstreer het. Muskiet-aantrekkingskrag. Die resultate wat verkry is, bevestig dat An. arabiensis stikstofhoudende verbindings wat in gewerwelde urine voorkom, verkry en versprei om lewensgeskiedeniskenmerke te beïnvloed. Hierdie resultate word bespreek in die konteks van potensiële epidemiologiese gevolge en hoe dit gebruik kan word vir vektormonitering en -beheer.
Anopheles arabicans (Dongola-stam) is gehou by 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH en 'n 12:12 uur lig:donker siklus. Larwes is grootgemaak in plastiekbakke (20 cm × 18 cm × 7 cm) gevul met gedistilleerde water en gevoer met Tetramin® visvoer (Tetra Werke, Melle, DE). Papies is versamel in 30 ml-koppies (Nolato Hertila, Åstorp, SE) en toe oorgeplaas na Bugdorm-hokke (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) om volwassenes toe te laat om te verskyn. Volwassenes is ad libitum voorsien van 'n 10% sukrose-oplossing tot 4 dae na opkoms (dpe), waarna gasheersoekende wyfies 'n dieet aangebied is onmiddellik voor die eksperiment, of oornag uitgehonger is met gedistilleerde water voor die eksperiment, soos hieronder beskryf. Wyfies wat vir vlugbuis-eksperimente gebruik is, is slegs vir 4-6 uur uitgehonger. met water ad libitum. Om bloedsuiende muskiete voor te berei vir daaropvolgende bio-assays, is 4 dpe-wyfies voorsien van defibrotiese skaapbloed (Håtunalab, Bro, SE) met behulp van 'n membraanvoedingstelsel (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, VK). Volledig gekongeseerde wyfies is toe na individuele hokke oorgeplaas en direk dieet ontvang, soos hieronder beskryf, of 10% sukrose ad libitum vir 3 dae voor die eksperimente wat hieronder beskryf word. Laasgenoemde wyfies is gebruik vir vlugbuis-bio-assays en na die laboratorium oorgeplaas, en het toe ad libitum gedistilleerde water vir 4-6 uur voor die eksperiment ontvang.
Voedingstoetse is gebruik om urine- en ureumverbruik in volwasse An.Arabiese wyfies te kwantifiseer. Gasheersoekende en bloedgevoerde wyfies is 'n dieet voorsien wat 1% verdunde vars en verouderde koei-urine, verskillende konsentrasies ureum en twee kontroles (10% sukrose en water) vir 48 uur bevat. Daarbenewens is voedselkleursel (1 mg ml-1 xyleensianied FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) by die dieet gevoeg en in 'n 4 × 4 matriks in 250 µl mikrosentrifugebuise (Axygen Scientific, Union City, CA, VSA; Figuur 1A) voorsien. Vul tot by die rand (~300 µl). Om kompetisie tussen muskiete en potensiële effekte van kleurstof te vermy, plaas 10 muskiete in 'n groot Petri-bakkie (12 cm in deursnee en 6 cm in hoogte; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figuur 1A) in algehele donkerte by 25 ± 2 cm °C en 65 ± 5% relatiewe temperatuur. humiditeit. Hierdie eksperimente is 5 tot 10 keer herhaal. Na blootstelling aan dieet is muskiete by -20 °C geplaas tot verdere analise.
Soek vir beesurine en ureum wat deur die gasheer en bloedsuiende wyfie Anopheles arabianus geabsorbeer word. In voedingsproef (A) is wyfiemuskiete voorsien van 'n dieet wat bestaan ​​uit vars en verouderde koei-urine, verskillende konsentrasies ureum, sukrose (10%) en gedistilleerde water (H2O). Gasheersoekende (B) en bloedgevoerde (C) wyfies het meer sukrose geabsorbeer as enige ander dieet wat getoets is. Let daarop dat gasheersoekende wyfies 72-uur koei-urine minder as 168-uur koei-urine (B) geabsorbeer het. Die gemiddelde totale stikstofinhoud (± standaardafwyking) van urine word in die insetsel voorgestel. Gasheersoekende (D, F) en bloedsuiende (E, G) wyfies neem ureum op 'n dosisafhanklike wyse op. Gemiddelde ingeasemde volumes (D, E) met verskillende lettername was beduidend van mekaar verskillend (eenrigting ANOVA met behulp van Tukey se post hoc-analise; p < 0.05). Foutbalke verteenwoordig standaardfout van die gemiddelde (BE). Die reguit stippellyn verteenwoordig die log-lineêre regressielyn (F, G)
Om geabsorbeerde voedsel vry te stel, is muskiete individueel in 1.5 ml mikrosentrifugebuise geplaas wat 230 µl gedistilleerde water bevat, en die weefsel is ontwrig met behulp van 'n weggooibare stamper en koordlose motor (VWR International, Lund, SE), gevolg deur sentrifugering teen 10 krpm vir 10 min. Die supernatant (200 µl) is oorgedra na 'n 96-put mikroplaat (Sigma-Aldrich) en absorbansie (λ620) is bepaal met behulp van 'n spektrofotometer-gebaseerde mikroplaatleser (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternatiewelik is die muskiete gemaal in 1 ml gedistilleerde water, waarvan 900 µl na 'n kuvet oorgedra is vir spektrofotometriese analise (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Om dieetinname te kwantifiseer, is 'n standaardkurwe voorberei deur reeksverdunning om 0.2 µl tot 2.4 µl van 1 mg ml-1 xyleen te lewer. sianied. Toe is die optiese digtheid van bekende kleurstofkonsentrasies gebruik om die hoeveelheid voedsel wat elke muskiet ingeneem het, te bepaal.
Volumedata is geanaliseer met behulp van eenrigting-variansie-analise (ANOVA) gevolg deur Tukey se post hoc paarsgewyse vergelykings (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, VSA, 1989–2007). Lineêre regressie-analises het konsentrasie-afhanklike ureuminname beskryf en reaksies tussen gasheersoekende en bloedsuiende muskiete vergelyk (GraphPad Prism v8.0.0 vir Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, VSA).
Ongeveer 20 µl urienmonsters van elke ouderdomsgroep is op Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 maas, Sigma Aldrich) gebind en in blikkapsules (8 mm × 5 mm) ingekapsuleer. Kapsules is in die verbrandingskamer van 'n CHNS/O-analiseerder (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA) geplaas om die stikstofinhoud in vars en verouderde urine volgens die vervaardiger se protokol te bepaal. Totale stikstof (g N l-1) is gekwantifiseer op grond van bekende ureumkonsentrasies wat as standaard gebruik word.
Om die effek van dieet op die oorlewing van gasheersoekende en bloedsuiende wyfies te bepaal, is muskiete individueel in groot Petri-skottels (12 cm in deursnee en 6 cm in hoogte; Semadeni) geplaas met 'n gaasbedekte gat in die deksel (3 cm in deursnee) vir ventilasie en voedselvoorsiening. Dieet is direk na 4 dpe verskaf en het 1% verdunde vars en verouderde koei-urine, vier konsentrasies ureum, en twee kontroles, 10% sukrose en water, ingesluit. Elke dieet is op 'n tandheelkundige tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) gepipetteer wat in 'n 5 ml spuit (Thermo Fisher Scientific, Gotenburg, SE) geplaas is, die suier verwyder en bo-op 'n petri-skottel geplaas (figuur 1).1A). Verander jou dieet elke dag. Onderhou die laboratorium soos hierbo beskryf. Oorlewende muskiete is twee keer per dag getel, terwyl dooie muskiete weggegooi is totdat die laaste muskiet dood is (n = 40 per behandeling). Oorlewing van muskiete wat op verskillende diëte gevoer is, is statisties geanaliseer met behulp van Kaplan-Meyer-oorlewingskurwes en log-rang-toetse. om oorlewingsverspreidingsvergelykings tussen diëte te vergelyk (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
'n Pasgemaakte muskietvliegmeul gebaseer op Attisano et al.[17], gemaak van 5 mm dik deursigtige akrielpanele (10 cm breed x 10 cm lank x 10 cm hoog) sonder voor- en agterpanele (Fig. 3: bo). 'n Draaipunt-samestelling met 'n vertikale buis gemaak van 'n gaschromatografiekolom (0.25 mm binnediameter; 7.5 cm L) met punte vasgeplak aan 'n inseknaald wat tussen 'n paar neodymiummagnete 9 cm uitmekaar hang. 'n Horisontale buis gemaak van dieselfde materiaal (6.5 cm L) het die vertikale buis in twee gedeel om 'n vasgemaakte arm te vorm en 'n arm wat 'n klein stukkie aluminiumfoelie as 'n ligonderbrekende sein gedra het.
24-uur-uitgehongerde wyfies het die bogenoemde dieet vir 30 minute voor inperking ontvang. Volgevoede wyfiemuskiete is toe individueel vir 2-3 minute op ys verdoof en met byewas (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) aan insekpennetjies vasgemaak en toe aan die arms van die horisontale buise vasgemaak. Vlieënde Meul. Omwentelings per vlug is deur 'n pasgemaakte datalogger aangeteken, en toe gestoor en vertoon met behulp van PC-Lab 2000™ sagteware (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Die vlugmeul is in 'n klimaatgereguleerde kamer geplaas (12 h:12 h, lig:donker, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Om die patroon van vlugaktiwiteit te visualiseer, is die totale afstand wat gevlieg is (m) en die totale aantal opeenvolgende vlugaktiwiteite per uur oor 'n 24-uur-periode bereken. Daarbenewens is die gemiddelde afstande wat deur individuele vroue gevlieg is, oor behandelings vergelyk en geanaliseer met behulp van eenrigting-ANOVA en Tukey se post hoc-analise (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), waar gemiddelde afstand as 'n afhanklike veranderlike beskou is, terwyl behandeling 'n onafhanklike faktor is. Daarbenewens word die gemiddelde aantal rondtes in 10-minuut-inkremente bereken.
Om die effek van dieet op die voortplantingsprestasie van An.arabiensis te bepaal, is ses wyfies (4 dpe) direk na Bugdorm-hokke (30 cm × 30 cm × 30 cm) oorgeplaas na bloedinsameling en toe die eksperimentele dieet vir 48 uur soos hierbo beskryf, voorsien. Die diëte is toe verwyder en paaibekers (30 ml; Nolato Hertila) gevul met 20 ml gedistilleerde water is op die derde dag vir 48 uur voorsien, elke 24 uur vervang. Herhaal elke dieetregime 20-50 keer. Eiers is vir elke eksperimentele hok getel en aangeteken. Submonsters van eiers is gebruik om die gemiddelde grootte en lengtevariasie van individuele eiers (n ≥ 200 per dieet) te bepaal met behulp van 'n Dialux-20-mikroskoop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) toegerus met 'n Leica-kamera (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Die oorblywende eiers is vir 24 uur in 'n klimaatbeheerde kamer onder standaard grootmaaktoestande gehou, en 'n submonster van onlangs ontluikende 1ste instarlarwes (n ≥ 200 per dieet) is gemeet, soos hierbo beskryf. Die aantal eiers en die grootte van eiers en larwes is tussen behandelings vergelyk en met behulp van eenrigting-ANOVA en Tukey se post hoc-analise (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Vlugtige stowwe in die kopruimte van vars (1 uur na monsterneming), 24 uur, 72 uur en 168 uur verouderde urine is versamel uit monsters wat van Zebu-beeste en Arsi-rasse versamel is. Vir gerief is urinemonsters vroegoggend versamel terwyl die koeie nog in die stal was. Urienmonsters is van 10 individue versamel en 100-200 ml van elke monster is oorgedra na individuele poliamied-baksakke (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH en Co., Minden, DE) in 3 l poliamied met deksel in vinielchloriedplastiekdromme. Vlugtige stowwe in die kopruimte van elke beesurinemonster is óf direk (vars) óf na rypwording by kamertemperatuur vir 24 uur, 72 uur en 168 uur versamel, d.w.s. elke urinemonster was verteenwoordigend van elke ouderdomsgroep.
Vir die versameling van vlugtige stowwe in die kopruimte is 'n geslote-lus-stelsel gebruik om 'n geaktiveerde koolstof-gefiltreerde gasstroom (100 ml min-1) deur 'n poliamiedsak na die adsorpsiekolom vir 2.5 uur te sirkuleer met behulp van 'n diafragma-vakuumpomp (KNF Neuberger, Freiburg, DE). As 'n kontrole is die versameling van vlugtige stowwe in die kopruimte vanuit 'n leë poliamiedsak uitgevoer. Die adsorpsiekolom is gemaak van Teflon-buise (5.5 cm x 3 mm binnediameter) wat 35 mg Porapak Q (50/80 maas; Waters Associates, Milford, MA, VSA) tussen glaswolproppe bevat het. Voor gebruik is die kolom gespoel met 1 ml hergedistilleerde n-heksaan (Merck, Darmstadt, DE) en 1 ml pentaan (99.0% suiwer oplosmiddel GC-graad, Sigma Aldrich). Die geadsorbeerde vlugtige stowwe is geëlueer met 400 μl pentaan. Die versamelings in die kopruimte is saamgevoeg en dan by -20°C gestoor totdat dit vir verdere analise gebruik is.
Gedragsreaksies van gasheersoekende en bloedetende An. Vlugtige uittreksels in die kopruimte, versamel van vars, 24-uur, 72-uur en 168-uur-verouderde urine, is geanaliseer vir vlugtige uittreksels van Arabidopsis-muskiete met behulp van 'n reguit glasbuis-olfaktometer [18]. Die eksperimente is uitgevoer gedurende ZT 13-15, die piekperiode van An se huissoekende aktiwiteit. Arab [19]. 'n Glasbuis-olfaktometer (80 cm × 9.5 cm id) is verlig met 3 ± 1 lx rooi lig van bo. Houtskoolgefiltreerde en bevogtigde lugvloei (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relatiewe humiditeit) het die bio-assay teen 30 cm s-1 geslaag. Lug word deur 'n reeks vlekvrye staal gaasskerms gelei, wat 'n laminêre vloei en 'n eenvormige pluimstruktuur skep. Tandheelkundige tampon-uitdeelstuk (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), opgehang aan 'n 5 cm-spoel aan die windwaartse punt van die olfaktometer, met stimulatorveranderinge elke 5 minute. Vir analise is 10 μl van elke kopruimte-ekstrak, verdun 1:10, as 'n stimulus gebruik. 'n Gelyke hoeveelheid pentaan is as 'n kontrole gebruik. Individuele gasheer-soekende of bloedsuiende muskiete is 2-3 uur voor die aanvang van die eksperiment in individuele vrylatingskooie geplaas. Die vrylatingskooi is aan die afwaartse kant van die olfaktometer geplaas, en die muskiete is toegelaat om vir 1 minuut te akklimatiseer, en toe is die vlinderklep van die kooi oopgemaak om vry te stel. Aantrekkingskrag tot behandeling of kontrole is geanaliseer as die proporsie muskiete wat binne 5 minute na vrystelling met die bron in aanraking gekom het. Elke kopruimte-vlugtige ekstrak en kontrole is ten minste 30 keer herhaal, en om die effekte van enige een dag te vermy, is dieselfde aantal behandelings en kontroles op elke eksperimentele dag getoets. Soek reaksies van gasheer en bloedgevoerde Antwoorde. Arabies versus kopruimte-stelle is geanaliseer met behulp van nominale logistiese regressie gevolg deur paargewyse vergelykings vir onewe verhoudings (JMP Pro, v14.0.0, SAS Instituut Bpk.).
An se kuitsproei-reaksie. Kopruimte-ekstrakte van vars en verouderde koei-urine is in Bugdorm-hokke (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) geanaliseer. Plastiekbekers (30 mL; Nolato Hertila) gevul met 20 mL gedistilleerde water het die kuitsproei-substraat verskaf en is in teenoorgestelde hoeke van die hok geplaas, 24 cm uitmekaar. Behandelingsbekers is aangepas met 10 μl van elke kopruimte-ekstrak teen 'n 1:10 verdunning. 'n Gelyke hoeveelheid pentaan is gebruik om die kontrolebeker aan te pas. Behandelings- en kontrolebekers is tussen elke eksperiment uitgeruil om vir posisie-effekte te beheer. Tien bloedgevoerde wyfies is in eksperimentele hokke by ZT 9-11 vrygelaat en eiers in bekers is 24 uur later getel. Die formule vir die berekening van die kuitsproei-indeks is: (die aantal eiers wat in die behandelingsbeker gelê is – die aantal eiers wat in die kontrolebeker gelê is)/(die totale aantal eiers wat gelê is). Elke behandeling is 8 keer herhaal.
Gaschromatografiese en elektronantennepatroondeteksie (GC-EAD) analise van vroulike An.arabiensis is uitgevoer soos voorheen beskryf [20]. Kortliks, vars vlugtige uittreksels in die kopruimte is geskei met behulp van 'n Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, VSA) toegerus met 'n HP-5 kolom (30 m × 0.25 mm id, 0.25 μm filmdikte, Agilent Technologies). en verouderende urine. Waterstof is as die mobiele fase gebruik met 'n gemiddelde lineêre vloeitempo van 45 cm s-1. Elke monster (2 μl) is vir 30 sekondes in splitlose modus ingespuit met 'n inlaattemperatuur van 225 °C. Die GC-oondtemperatuur is geprogrammeer van 35 °C (3 minute hou) tot 300 °C (10 minute hou) teen 10 °C min-1. In die GC-uitvloeiselsplitser is 4 psi stikstof bygevoeg en 1:1 in 'n Gerstel 3D/2 lae dooie volume kruis (Gerstel, Mülheim, DE) tussen die vlamionisasiedetektor en die EAD gesplit. Die GC-uitvloeiselkapillêr vir EAD is deur 'n Gerstel ODP-2-oordraglyn, wat die GC-oondtemperatuur plus 5 °C dophou, in 'n glasbuis (10 cm × 8 mm) gelei, waar dit met koolstofgefiltreerde, bevogtigde lug (1.5 l min-1) gemeng is. Die antenna is geplaas 0.5 cm vanaf die uitlaat van die buis. Elke individuele muskiet het vir een replikaat verantwoordelik gehou, en vir gasheersoekende muskiete is ten minste drie replikate op urienmonsters van elke ouderdom uitgevoer.
Identifikasie van bioaktiewe verbindings in kopruimte-versamelings van vars en verouderde beesurine met behulp van 'n gekombineerde GC- en massaspektrometer (GC-MS; 6890 GC en 5975 MS; Agilent Technologies) om antennale reaksies in GC-EAD-analise te ontlok, wat in elektron-impak-ionisasiemodus teen 70 eV werk. Die GC was toegerus met 'n HP-5MS UI-bedekte gesmelte silika-kapillêre kolom (60 m × 0.25 mm binnediameter, 0.25 μm filmdikte) met helium as die mobiele fase met 'n gemiddelde lineêre vloeitempo van 35 cm s-1. 'n 2 μl monster is ingespuit met dieselfde inspuiterinstellings en oondtemperatuur as vir die GC-EAD-analise. Verbindings is geïdentifiseer op grond van hul retensietyd (Kovát-indeks) en massaspektra in vergelyking met die persoonlike biblioteek en die NIST14-biblioteek (Agilent). Geïdentifiseerde verbindings is bevestig deur outentieke standaarde in te spuit (Bykomende Lêer 1: Tabel S2). Vir kwantifisering is heptielasetaat (10 ng, 99.8% chemiese suiwerheid, Aldrich) is as 'n eksterne standaard ingespuit.
Evaluering van die doeltreffendheid van 'n sintetiese reukmengsel wat bestaan ​​uit bioaktiewe verbindings wat in vars en verouderde urine geïdentifiseer is om gasheersoekende en bloedsuiende Ans.arabiensis te lok, met behulp van dieselfde olfaktometer en protokol as hierbo. Sintetiese mengsels het die samestelling en verhoudings van verbindings in gemengde vlugtige uittreksels in die kopruimte van vars, 24-uur, 48-uur, 72-uur en 168-uur verouderde urine nageboots (Figuur 5D-G; Bykomende Lêer 1: Tabel S2). Vir analise, gebruik 10 μl van 'n 1:100 verdunning van die volledig sintetiese mengsel, met 'n algehele vrystellingstempo wat wissel van ongeveer 140-2400 ng h-1, om aantreklikheid vir gasheer- en bloedsuiende muskiete te bepaal. Daarna word die toets op volledige mengsels uitgevoer, waarin subtraktiewe mengsels van enkele verbindings van die volledige mengsel verwyder word. Soek reaksies van gasheer- en bloedgevoerde Ans. Arabiese teenoor sintetiese en subtraktiewe mengsels is geanaliseer met behulp van nominale logistiese regressie gevolg deur paarsgewyse vergelykings vir onewe verhoudings. (JMP Pro, v14.0.0, SAS Instituut Bpk.).
Om te bepaal of koei-urine as 'n gasheerhabitat-leidraad vir malariamuskiete kan dien, is vars en verouderde koei-urine, versamel soos hierbo beskryf, en water in 3 liter-emmers (100 ml) geplaas en in gasheer-aasvalle geplaas. (BG-HDT-weergawe; BioGents, Regensburg, DE). Tien lokvalle is 50 m uitmekaar in weiveld geplaas, 400 m van die dorpsgemeenskap (Silay, Ethiopië, 5°53´24´´N, 37°29´24´´O) en geen beeste nie, op permanente teelplekke en dorpe. Vyf lokvalle is verhit om die teenwoordigheid van 'n gasheer te simuleer, terwyl vyf lokvalle onverhit gelaat is. Elke behandelingslokasie word elke aand vir 'n totaal van vyf nagte geroteer. Muskietgetalle wat gevang is in lokvalle wat met urine van verskillende ouderdomme gelok is, is vergelyk met behulp van logistiese regressie met 'n beta-binomiale verspreiding (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
In 'n malaria-endemiese dorpie naby die dorp Maki, Oromia-streek, Ethiopië (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ O; Figuur 6A). Die studie is uitgevoer tussen middel Augustus en middel September voor die jaarlikse binnenshuise residuele bespuiting, tesame met 'n lang reënseisoen. Vyf pare huise (20–50 m uitmekaar) aan die buitewyke van die dorpie is vir die studie gekies (Fig. 6A). Die kriteria wat gebruik is om die huise te kies, was: geen diere toegelaat in die huis nie, geen binnenshuise kook (brandhout of houtskool trek) is toegelaat nie (ten minste gedurende die proeftydperk), en huise met 'n maksimum van twee inwoners, wat in nie-insekdoders slaap. onder die behandelde muskietnet. Etiese goedkeuring is verleen deur die Institusionele Navorsingsetiek Hersieningsraad (IRB/022/2016) van die Fakulteit Natuurwetenskappe (CNS-IRB), Addis Abeba Universiteit, in ooreenstemming met die riglyne wat deur die Wêreld Mediese Vereniging se Verklaring van Helsinki vasgestel is. Toestemming van elke huishoudelike hoof is verkry met die hulp van gesondheidsvoorligtingspersoneel. Die hele proses word onderskryf deur plaaslike administrasies op distrik- en wyksvlak ('kebele'). Die eksperimentele ontwerp het 'n 2 × 2 Latynse vierkantontwerp gevolg, waarin sintetiese mengsels en kontroles op die eerste nag aan gepaarde huise toegeken is en op die volgende eksperimentele nag tussen huise omgeruil is. Hierdie proses is tien keer herhaal. Daarbenewens, om muskietaktiwiteit in geselekteerde huise te skat, is die CDC-lokvalle ingestel om vyf opeenvolgende nagte aan die begin, middel en einde van die veldproef op dieselfde tyd van die dag te loop.
'n Sintetiese mengsel wat ses bioaktiewe verbindings bevat, is in heptaan (97.0% oplosmiddel GC-graad, Sigma Aldrich) opgelos en vrygestel teen 140 ng h-1 met behulp van 'n katoenlont-dispenser [20]. Die lont-dispenser het toegelaat dat alle verbindings in konstante verhoudings vrygestel word dwarsdeur die 12-uur eksperiment. Heptaan is as 'n kontrole gebruik. Die flessie is langs die ingangspunt van die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ligval (John W. Hock Company, Gainesville, FL, VSA; Figuur 6A) opgehang. Die lokvalle is 0.8 - 1 m bo die grond, naby die voet van die bed, gehang, en 'n vrywilliger het onder 'n onbehandelde muskietnet geslaap en tussen 18:00 en 06:30 geopereer. Muskiete wat volgens geslag en fisiologiese status gevang is (ongevoed, gevoed, semi-swanger en dragtig [21] is daarna gekeur met behulp van polimerase-kettingreaksie (PCR) analise om die spesie wat morfologies geïdentifiseer is as A. gambiae sl. Lede van die kompleks [23] te identifiseer. In In die veldstudie is die lokval-vasvang van gepaarde huise geanaliseer met behulp van 'n nominale logistiese passingsmodel, waar aantrekkingskrag die afhanklike veranderlike was en behandeling (sintetiese mengsel teenoor kontrole) die vaste effek was (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hier rapporteer ons die χ2- en p-waardes van die waarskynlikheidsverhoudingstoets.
Evalueer of dit veilig is. arabiensis kon urine, sy hoof stikstofbron, ureum, verkry deur direkte voeding, binne 48 uur na toediening vir 4 dae na (dpe) gasheersoekende en bloedgevoerde wyfie-voedingsproewe (Fig. 1A). Beide gasheersoekende en bloedsuiende wyfies het aansienlik meer sukrose geabsorbeer as enige ander dieet of water (F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 en F(5,299) = 56.00, p < 0.0001, onderskeidelik; Fig. 1B,C). Verder het gasheersoekende wyfies minder in urine geëet na 72 uur in vergelyking met urine na 168 uur (Fig. 1B). Toe 'n dieet wat ureum bevat, aangebied is, het gasheersoekende wyfies 'n aansienlik groter hoeveelheid ureum geabsorbeer teen 2.69 mM in vergelyking met alle ander konsentrasies en water, terwyl dit nie onderskeibaar was van 10% sukrose (F(10,813) nie). = 15.72, p < 0.0001; Figuur 1D). Dit was in teenstelling met die reaksie van bloedgevoerde wyfies, wat tipies beduidend meer ureumbevattende diëte as water geabsorbeer het, alhoewel beduidend minder as 10% sukrose (F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; Figuur 1).1E). Verder, wanneer tussen die twee fisiologiese toestande vergelyk word, het flebotomiseerde wyfies meer ureum geabsorbeer as gasheersoekende wyfies teen die laagste konsentrasies, en hierdie wyfies het soortgelyke hoeveelhede ureum teen hoër konsentrasies geabsorbeer (F(1,953) = 78.82, p < 0.0001; Fig. 1F, G). Terwyl inname van 'n ureumbevattende dieet optimale waardes blyk te hê (Fig. 1D,E), kon wyfies in beide fisiologiese toestande die hoeveelheid ureum wat oor die hele reeks ureumkonsentrasies geabsorbeer is, op 'n log-lineêre wyse moduleer (Fig. 1F,G). ).Net so beheer muskiete blykbaar hul stikstofopname deur die hoeveelheid urine wat geabsorbeer word, te reguleer, aangesien die hoeveelheid stikstof in urine weerspieël word in die hoeveelheid wat geabsorbeer word (Figuur 1B, C en B insetsels).
Om die effekte van urine en ureum op die oorlewing van gasheersoekende en bloedsuiende muskiete te bepaal, is wyfies urine van al vier ouderdomme (vars, 24 uur, 72 uur en 168 uur na afsetting) gevoer, en 'n reeks ureumkonsentrasies, sowel as gedistilleerde water en 10% sukrose, het as 'n kontrole gedien (Figuur 2A). Hierdie oorlewingsanalise het getoon dat dieet 'n beduidende effek op algehele oorlewing in gasheersoekende wyfies gehad het (urine: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; ureum: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; Fig. 2B, C) en bloedgevoerde wyfies (urine: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; ureum: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0.0001; Figuur 2D,E). In alle eksperimente het wyfies wat 'n dieet van urine, ureum en water gevoer is, beduidend laer oorlewingsyfers gehad in vergelyking met wyfies wat 'n sukrose-dieet gevoer is (Figuur 2B-E). Gasheersoekende wyfies wat vars en ou urine gevoer is, het verskillende oorlewingsyfers getoon, met diegene wat 72 uur ou urine gevoer is (p = 0.016) wat die laagste oorlewingswaarskynlikheid gehad het (Fig. 2B). Verder het gasheersoekende wyfies wat 135 mM ureum gevoer is, langer oorleef as waterkontroles (p < 0.04) (Fig. 2C). In vergelyking met water het vroue wat met vars urine en 24-uur urine gevoer is, langer oorleef (p = 0.001 en p = 0.012, onderskeidelik; Figuur 2D), terwyl vroue wat met 72-uur urine gevoer is, langer oorleef het as diegene wat met vars urine en 24-uur verouderde urine gevoer is (p < 0.0001 en p = 0.013, onderskeidelik; Figuur 2D). Wanneer hulle 135 mM ureum gevoer is, het bloedgevoerde wyfies... het langer oorleef as alle ander konsentrasies van ureum en water (p < 0.013; Figuur 2E).
Oorlewing van gasheer- en bloedsuiende wyfie Anopheles arabinis wat op koei-urine en ureum voed. In die bio-toets (A) is wyfiemuskiete 'n dieet voorsien wat bestaan ​​uit vars en verouderde koei-urine, verskillende konsentrasies ureum, sukrose (10%) en gedistilleerde water (H2O). Die oorlewing van gasheersoekende (B, C) en bloedsuiende (D, E) muskiete is elke 12 uur aangeteken totdat alle wyfies wat op urine (B, D) en ureum (C, E) gevoed is, en kontroles, sukrose en water, dood is.
Die totale afstand en aantal rondtes wat in die vlugmeultoets oor 'n 24-uur-periode bepaal is, het verskil tussen gasheersoekende en bloedsuiende muskiete, wat oor die algemeen minder vlugaktiwiteit getoon het (Fig. 3). Gasheersoekende muskiete wat vars en verouderde urine of sukrose en water verskaf het, het duidelike vlugpatrone getoon (Fig. 3), met wyfies wat op vars urine voed wat meer aktief is met dagbreek, terwyl dié wat 24- en 168-uur-verouderde urine gevoer is. Muskiete wat op urine gevoed het, het verskillende vlugpatrone getoon en was hoofsaaklik daagliks. Wyfiemuskiete wat sukrose of 72-uur-urine verskaf het, het aktiwiteit dwarsdeur die 24-uur-periode getoon, terwyl wyfies wat water verskaf het, meer aktief was gedurende die middelperiode. Muskiete wat op sukrose gevoer is, het die hoogste vlakke van aktiwiteit laat in die nag en vroeg in die oggend getoon, terwyl dié wat 72-uur-verouderde urine ingeneem het, 'n bestendige afname in aktiwiteit oor 24 uur ervaar het (Figuur 3).
Vlugprestasie van jagter-soekende bloedsuiende wyfie Anopheles arabinis wat op koei-urine en ureum voed. In die vlugmeultoets is wyfiemuskiete wat op vars en verouderde koei-urine gevoer is, verskillende konsentrasies ureum, sukrose (10%) en gedistilleerde water (H2O) vasgemaak aan horisontale, vrylik roterende arms (hierbo). Vir gasheer-soekende (links) en bloedsuiende (regs) wyfies is die totale afstand en aantal vlugte per uur vir elke dieet oor 'n 24-uur-periode aangeteken (donker: grys; lig: wit). Gemiddelde afstand en gemiddelde aantal aanvalle word regs van die sirkadiese aktiwiteitsgrafiek getoon. Foutbalke verteenwoordig standaardfout van die gemiddelde. Statistiese analise sien teks.
Oor die algemeen het die algehele vlugaktiwiteit van gasheersoekende wyfies 'n patroon gevolg soortgelyk aan dié van vlugafstand oor 'n 24-uur periode. Gemiddelde vlugafstand is beduidend beïnvloed deur dieet wat ingeneem is (F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001), en gasheersoekende wyfies wat 72 uur urine ingeneem het, het beduidend langer afstande gevlieg in vergelyking met alle ander diëte (p < 0.0001), en muskiete wat met sukrose gevoed is, het langer gevlieg as muskiete wat met vars (p = 0.022) en 24 uur verouderde urine (p = 0.022) gevoed is. In teenstelling met die vlugaktiwiteitspatroon wat deur die urine-dieet beskryf word, het ureumgevoede gasheersoekende wyfies volgehoue ​​vlugaktiwiteit oor 'n 24-uur periode getoon, met 'n piek gedurende die tweede helfte van die donker fase (Fig. 3). Alhoewel aktiwiteitspatrone soortgelyk was, het gasheersoekende wyfies wat met ureum gevoer is, die gemiddelde vlugafstand beduidend verhoog, afhangende van die geabsorbeerde konsentrasie (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001). Gasheersoekende wyfies wat enige konsentrasie ureum gevoer is, het langer gevlieg as wyfies wat óf water óf sukrose gevoer is (p < 0.03).
Die algehele vlugaktiwiteit van bloedsuiende muskiete was stabiel en het oor 24 uur oor alle diëte volgehou, met verhoogde urienaktiwiteit gedurende die tweede helfte van die donker periode vir wyfies wat op water gevoer is, sowel as in wyfies wat vars en 24 uur oud gevoer is (beeld 3). Terwyl die uriendieet die gemiddelde vlugafstand in bloedgevoerde wyfies beduidend beïnvloed het (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), het die ureumdieet nie (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) met ander urien en kontroledieet (vars, p = 0.0091; 72 uur, p = 0.0022; 168 uur, p = 0.001; sukrose, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036) beïnvloed nie.
Die effekte van urine- en ureumvoeding op reproduktiewe parameters is in eierlêende bio-assays geassesseer (Figuur 4A) en is ondersoek volgens die aantal eiers wat deur elke wyfie gelê is, eiergrootte en nuut uitgebroeide eerste instarlarwes. Die aantal eiers wat gelê is. Uriengevoerde Arabiese wyfies het gewissel volgens dieet (F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; Fig. 4B). Wyfies wat 'n 24-uur urine- en bloedmeel gevoer is, het aansienlik meer eiers gelê as wyfies wat ander urine-diëte gevoer is en was soortgelyk aan dié wat sukrose gevoer is (Fig. 4B). Net so het die grootte van eiers wat deur urinegevoerde wyfies gelê is, gewissel volgens dieet (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001), met 24-uur urine- en sukrose-gevoerde wyfies wat aansienlik groter eiers gelê het as watergevoerde wyfies, terwyl die eiers van wyfies wat met 168 uur urine gevoer is, aansienlik kleiner was (Fig. 4C). Daarbenewens het die urine-dieet die larwale grootte aansienlik beïnvloed. (F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001), met beduidend groter larwes wat uit eiers te voorskyn kom wat deur 24- en 72-uur oue urinegevoerde wyfies gelê is as uit eiers wat van eierslarwes gelê is. Watergevoerde en 168-uur urinegevoerde wyfies (Figuur 4D).
Voortplantingsprestasie van vroulike Anopheles arabinis wat op koei-urine en ureum voed. Bloedgevoerde vroulike muskiete is vir 48 uur diëte gevoer wat bestaan ​​uit vars en verouderde koei-urine, verskillende konsentrasies ureum, sukrose (10%) en gedistilleerde water (H2O) voordat hulle in bio-assays geplaas is en eierlêsubstrate verkry is (A). Eiernommer (B, E), eiergrootte (C, F) en larwegrootte (D, G) is beduidend beïnvloed deur die dieet wat verskaf is (koei-urine: BD; ureum: EG). Gemiddeldes vir elke parameter gemeet met verskillende lettername was beduidend van mekaar verskillend (eenrigting-ANOVA met behulp van Tukey se post hoc-analise; p < 0.05). Foutbalke verteenwoordig standaardfout van die gemiddelde.
As die belangrikste stikstofhoudende komponent van urine, het ureum, wanneer dit as 'n dieet aan bloedgevoerde wyfies verskaf word, reproduktiewe parameters in alle studies beduidend beïnvloed. Die aantal eiers wat deur wyfies gelê is wat ureum gevoer is, na 'n bloedmaaltyd, afhangende van die ureumkonsentrasie (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001), het wyfies wat ureumkonsentrasies tussen 134 µM en 1.34 mM gevoer is, meer eiers gelê (Figuur 4E). Wyfies wat gevoer is met ureumkonsentrasies van 134 µM of hoër, het groter eiers gelê as wyfies wat met water gevoer is (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; Figuur 4F), en larfgrootte, hoewel beïnvloed deur soortgelyke konsentrasies ureum in moeders (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001), was meer veranderlik (Fig. 4G).
Algehele aantrekkingskrag tot gasheersoekende beesurine-kopruimte-vlugtige uittreksels. Die arabiensis wat in die glasbuis-olfaktometer (Fig. 5A) beoordeel is, is beduidend beïnvloed deur urienouderdom (χ2 = 15.9, df = 4, p = 0.0032; Fig. 5B). Post hoc-analise het getoon dat muwwe urienreuk na 24 uur beduidend hoër vlakke van aantreklikheid veroorsaak het in vergelyking met alle ander behandelings (72 uur: p = 0.0060, 168 uur: p = 0.012, pentaan: p = 0.00070), behalwe vir die reuk van vars urine (p = 0.13; Fig. 5B). Alhoewel die algehele aantrekkingskrag van bloedsuiende muskiete tot urienreuk nie beduidend verskil het nie (χ2 = 8.78, df = 4, p = 0.067; Fig. 5C), is gevind dat hierdie wyfies beduidend meer aantreklik was vir kopruimte-vlugtige uittreksels in vergelyking met 72-uur-verouderde urine in vergelyking met kontroles (p = 0.0066; Figuur 5C).
Gedragsreaksies op natuurlike en sintetiese koei-urine reuke in die soektog na gasheer en bloedgevoerde Anopheles arabianus. Skematiese voorstelling van die glasbuis-olfaktometer (A). Aantrekking van kopruimte-vlugtige uittreksels van vars en verouderde koei-urine na gasheer (B) en bloedsuiende (C) muskiete. Vind die tentakelreaksie van die Lord An. Kopruimte-uittreksels geïsoleer van vars (D), 24-uur (E), 72-uur (F) en 168-uur (G) verouderde koei-urine word getoon. Elektronantenne-opsporing (EAD) spore toon spanningsveranderinge in reaksie op bioaktiewe verbindings in die kopruimte wat uit die gaschromatograaf geëlueer is en deur 'n vlamionisasiedetektor (FID) opgespoor word. Die skaalbalk verteenwoordig reaksie-amplitude (mV) teenoor retensietyd (s). Die eienskappe en vrystellingsnelhede (µg h-1) van die biologies aktiewe verbindings word getoon. 'n Enkele asterisk (*) dui op 'n konsekwente lae-amplitude reaksie. Dubbele asterisks (**) dui onreproduceerbare reaksies aan. Vind die gasheer (H) en Die bloedsuiende (I) An.arabiensis het verskillende aantrekkingskragte teenoor sintetiese mengsels van vars en verouderde koei-urine-reuke. Die gemiddelde proporsies muskiete wat aangetrokke is tot verskillende lettername het beduidend van mekaar verskil (eenrigting-ANOVA met behulp van Tukey se post hoc-analise; p < 0.05). Foutbalke verteenwoordig standaardfout van die skaal.
Vroulike Ann.arabiensis, 72 uur en 120 uur na bloedmaaltyd, tydens paaityd, is geen voorkeur getoon vir vlugtige uittreksels in die kopruimte van vars en verouderde koei-urine in vergelyking met pentaankontroles nie (χ2 = 3.07, p > 0.05; Bykomende lêer 1: Fig. S1).
Vir vroulike Ann.arabiensis het GC-EAD- en GC-MS-ontledings agt, ses, drie en drie bioaktiewe verbindings geïdentifiseer (Figuur 5D-G). Alhoewel verskille in die aantal verbindings wat elektrofisiologiese reaksies ontlok het, waargeneem is, was die meeste van hierdie verbindings teenwoordig in elke vlugtige uittreksel in die kopruimte wat uit vars en verouderde urine versamel is. Daarom is vir elke uittreksel slegs verbindings wat 'n fisiologiese reaksie van die vroulike antennas bo die drempel veroorsaak het, in verdere ontledings ingesluit.
Die totale vlugtige vrystellingstempo van bioaktiewe verbindings in die kopruimte-versameling het toegeneem van 29 µg h-1 in vars urine tot 242 µg h-1 in 168-uur verouderde urine, hoofsaaklik as gevolg van p-kresol en m-formaldehied fenol-toenames sowel as fenol. In teenstelling hiermee het die vrystellingstempo's van ander verbindings, soos 2-siklohekseen-1-oon en dekanal, afgeneem met toenemende urine-ouderdom, wat gekorreleer het met die waargenome afname in seinintensiteit (oorvloed) in die chromatogram (Fig. 5D)-G linkerpaneel) en fisiologiese reaksies op hierdie verbindings (Fig. 5D-G regterpaneel).
Oor die algemeen het die sintetiese mengsel 'n soortgelyke natuurlike verhouding van bioaktiewe verbindings gehad wat in vlugtige uittreksels van vars en verouderde urienkopruimtes geïdentifiseer is (Fig. 5D–G) en het dit nie beduidende aantrekkingskrag in die soektog na 'n gasheer (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; Fig. 5H) of bloedsuiende muskiete (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; Fig. 5I) uitgelok nie. Post-hoc paarsgewyse vergelykings tussen behandelings het egter getoon dat gasheersoekende muskiete beduidend aantreklik was vir die sintetiese mengsel van 24-uur verouderde urien in vergelyking met pentaankontroles (p = 0.0086; Figuur 5H).
Om die rol van individuele komponente in sintetiese mengsels van 24 uur verouderde urine te bepaal, is ses subtraktiewe mengsels geëvalueer teenoor volledige mengsels in die Y-buistoets, waarin individuele verbindings verwyder is. Vir gasheersoekende muskiete het die aftrekking van individuele verbindings uit die volledige mengsel 'n beduidende effek op gedragsreaksies gehad (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; Bykomende lêer 1: Figuur S2A), alle subtraktiewe mengsels was aantrekliker as Kleiner as volledig gemeng. In teenstelling hiermee het die verwydering van individuele verbindings uit die volledig sintetiese mengsel nie die gedragsreaksies van bloedsuiende muskiete beïnvloed nie (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), met die uitsondering van dekanal, wat laer vlakke tot gevolg gehad het in vergelyking met die volledige mengsel se Aantrekkingskrag (p = 0.022; Bykomende lêer 1: Figuur S2B).
In 'n malaria-endemiese dorpie in Ethiopië is die doeltreffendheid van 'n sintetiese mengsel van 24-uur koei-urine om muskiete onder veldtoestande te lok, vir tien nagte geëvalueer (Fig. 6A). 'n Totaal van 4 861 muskiete is gevang en geïdentifiseer, waarvan 45,7% Anthropus.gambiae sl was, 18,9% Anopheles pharoensis en 35,4% Culex spp. (Bykomende lêer 1: Tabel S1). Anopheles arabinis is die enigste lid van die An.Gambiaanse spesiekompleks wat deur PCR-analise geïdentifiseer is. Gemiddeld is 320 muskiete per nag gevang, waartydens lokvalle met sintetiese mengsellokaas meer muskiete gevang het as gepaarde lokvalle sonder mengsel (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Lokvalle sonder lokaas is op elk van die vyf kontrole-aande aan die begin, middel en einde van die proef opgestel. Soortgelyke getalle muskiete is in elke paar gevang. lokvalle, wat geen vooroordeel tussen huise aandui nie (χ²(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0.05) en geen bevolkingsafname gedurende die studietydperk nie. In vergelyking met kontrolelokvalle, was die aantal muskiete wat in die lokvalle wat die sintetiese mengsel bevat, gevang is, beduidend verhoog: gasheersoektog (χ²(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), onlangse bloedvoeding (χ²(0, 650) = 32.2, p < 0.0001) en dragtigheid (χ²(0, 228) = 6.27, p = 0.0123; Bykomende lêer 1: Tabel S1). Dit word ook weerspieël in die totale aantal muskiete wat gevang is: gasheersoektog > bloedsuiend > dragtig > semi-swanger > mannetjie.
Veldevaluering van die doeltreffendheid van 'n 24-uur sintetiese koei-urine reukmengsel. Veldproewe is in suid-sentraal Ethiopië (kaart), naby die dorp Maki (insetsel), uitgevoer met behulp van 'n Centers for Disease Control (CDC) ligval (regs) in gepaarde huise, met 'n Latynse vierkantige ontwerp (lugfoto) (A). Sintetiese reuk-aas CDC fotovalle lok en vang vroulike Anopheles arabesques (B), maar nie Anopheles farroes (C) nie, op 'n ander manier, 'n fisiologiese toestand-afhanklike effek. Daarbenewens het hierdie lokvalle aansienlik verhoogde getalle van die gasheer Culex muskiete gevang. (D) In ​​vergelyking met kontrole. Die stawe aan die linkerkant verteenwoordig die gemiddelde seleksie-indeks van muskiete wat gevang is in pare reuk-aas (groen) en kontrole (oop) lokvalle (N = 10), terwyl die stawe aan die regterkant die gemiddelde seleksie-indeks in pare kontrole lokvalle (oop; N = 5) verteenwoordig. ). Sterretjies dui statistiese betekenisvlakke aan (*p = 0.01 en ***p < 0.0001)
Die drie spesies is verskillend gevang in lokvalle wat sintetiese mengsels bevat. Op soek na gasheer (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), bloedvoeding (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) en dragtigheid (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) is 'n .arabiensis in die lokval vasgevang wat die sintetiese mengsel vrygestel het (Fig. 6B), terwyl die hoeveelheid An nie verskil het nie. Pharoensis in verskillende fisiologiese toestande is gevind (Fig. 6C). Vir Culex is slegs 'n beduidende toename in die aantal muskiete wat gashere soek, gevind in lokvalle wat met die sintetiese mengsel gelok is (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; Fig. 6D), in vergelyking met kontrolelokvalle.
Gasheer-aasvalle wat buite potensiële gashere tussen broeiplekke en landelike gemeenskappe in Ethiopië geleë is, is gebruik om te bepaal of malariamuskiete koei-urine-reuk as 'n gasheerhabitat-leidraad gebruik. In die afwesigheid van gasheerleidrade, hitte, en met of sonder die teenwoordigheid van koei-urine-reuk, is geen muskiete gevang nie (Bykomende lêer 1: Figuur S3). In die teenwoordigheid van hoë temperatuur en koei-urine-reuk is vroulike malariamuskiete egter gelok en gevang, alhoewel in klein getalle, onafhanklik van urienouderdom (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; Bykomende lêer 1: Figuur S3). In teenstelling hiermee het waterkontroles nie malariamuskiete by hoë temperature gevang nie (Bykomende lêer 1: Figuur S3).
Malariamuskiete verkry en versprei stikstofbevattende verbindings deur kompenserende voeding op koei-urine (d.w.s. plasse) om lewensgeskiedenis-eienskappe te verbeter, soortgelyk aan ander insekte [2, 4, 24, 25, 26]. Koei-urine is 'n geredelik beskikbare hernubare hulpbron wat nou verband hou met rusplekke vir malaria-vektore, soos koeistale en hoë plantegroei naby landelike huise en paaiplekke. Vroulike muskiete vind hierdie hulpbron deur reuk op en kan die opname van stikstofverbindings in urine reguleer, insluitend ureum, die belangrikste stikstofkomponent in urine [15, 16]. Afhangende van die vroulike muskiet se fisiologiese toestand, word voedingstowwe in die urine toegeken om die vlugaktiwiteit en oorlewing van gasheer-soekende vroulike muskiete te verbeter, sowel as die oorlewing en voortplantingseienskappe van bloedgevoerde individue gedurende die eerste gonadotropiese siklus. Daarom speel urienmenging 'n belangrike voedingsrol vir malaria-vektore wat geslote is soos ondervoede volwassenes [8], aangesien dit vroulike muskiete die vermoë bied om belangrike stikstofverbindings te verkry deur lae-risiko-voeding te doen. Hierdie bevinding het beduidende epidemiologiese gevolge, aangesien wyfies hul lewensduur verhoog. verwagting, aktiwiteit en voortplantingsuitset, wat alles vektorkapasiteit beïnvloed. Verder kan hierdie gedrag die teiken van toekomstige vektorbestuursprogramme wees.