영양소 획득 및 분배는 곤충의 먹이 찾기 행동과 생활사 특성을 통합합니다. 곤충은 생애 주기별로 특정 영양소의 결핍을 보충하기 위해, 예를 들어 척추동물의 분비물을 섭취하는 '웅덩이 섭식(puddles)'과 같은 과정을 통해 이러한 영양소를 얻을 수 있습니다. 아노펠레스 아라비아 모기는 영양실조 상태인 것으로 보이며, 따라서 신진대사와 번식을 위해 영양소가 필요합니다. 본 연구의 목적은 소변을 이용한 아노펠레스 아라비아 모기의 영양 획득이 생활사 특성 개선에 도움이 되는지 평가하는 것입니다.
안전성을 확인하십시오. 모기(Asmodium arabiensis)는 신선한 소변, 24시간, 72시간, 168시간 된 소변 냄새에 끌렸으며, 숙주를 찾아다니는 암컷과 흡혈한 암컷(흡혈 후 48시간)을 Y자형 후각측정기로 측정하고, 임신한 암컷을 대상으로 산란 시험을 실시했습니다. 이후 화학적 및 전기생리학적 분석을 병행하여 네 연령대의 소변에서 생리활성 화합물을 확인했습니다. 합성 생리활성 화합물 혼합물을 Y자형 후각측정기와 야외 시험에서 평가했습니다. 말라리아 매개 모기의 잠재적 보충 사료로서 소변과 주요 질소 함유 화합물인 요소를 조사하기 위해 섭식 매개변수와 생활사 특성을 측정했습니다. 암컷 모기의 비율과 흡수된 소변 및 요소의 양을 평가했습니다. 섭식 후 암컷의 생존율, 고정 비행 능력, 번식 능력을 평가했습니다.
숙주의 피와 영양분을 찾아 헤매는 것이다. 실험실 및 야외 연구에서 아랍뱀은 신선하고 오래된 소변의 천연 및 합성 향에 이끌렸다. 임신한 암컷은 산란 장소에서 소변에 대한 반응에 무관심했다. 숙주를 찾아 피를 빨아먹는 암컷은 소변과 요소를 적극적으로 흡수하고, 도피, 생존 또는 번식과 같은 생리적 상태에 따른 생활사적 상충관계에 따라 이러한 자원을 배분한다.
아노펠레스 아라비니스 모기의 소변 섭취 및 분포를 통한 생활사 특성 개선. 소변 보충 섭취는 일일 생존율과 모기 밀도를 증가시켜 매개체 능력을 직접적으로 향상시키고, 비행 활동을 변화시켜 간접적으로도 영향을 미치므로 향후 모델에 포함되어야 한다.
곤충의 먹이 섭취와 분배는 곤충의 먹이 찾기 및 생활사 특성을 통합적으로 고려합니다[1,2,3]. 곤충은 먹이의 가용성과 영양 요구량에 따라 먹이를 선택하고 획득하며 보충 섭식을 할 수 있습니다[1, 3]. 영양소 분배는 생활사 과정에 따라 달라지며, 곤충의 각기 다른 생활 단계에서 식단의 질과 양에 대한 요구량이 달라질 수 있습니다[1, 2]. 특정 영양소의 결핍을 보충하기 위해 곤충은 진흙, 척추동물의 다양한 배설물과 분비물, 썩은 고기 등을 섭취하는 보충 섭식을 통해 이러한 영양소를 얻을 수 있는데, 이를 '물웅덩이 섭식'이라고 합니다[2]. 나비와 나방을 비롯한 다양한 곤충 종에서 물웅덩이 섭식이 주로 연구되지만, 다른 곤충 목에서도 물웅덩이 섭식이 나타나며, 이러한 자원에 대한 유인과 섭식은 건강 및 기타 생활사 특성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다[2, 4, 5, 6, 7]. 말라리아 모기인 Anopheles gambiae sensu lato(sl)는 '영양실조' 상태의 성충으로 나타납니다. [8] 따라서 물주기는 생활사 특성에 중요한 역할을 할 수 있지만 지금까지 이러한 행동은 무시되었습니다. 이 중요한 운반체에서 영양 섭취를 증가시키는 수단으로서 교반의 사용은 중요한 역학적 결과를 가져올 수 있으므로 주목할 가치가 있습니다.
성체 암컷 아노펠레스 모기의 질소 섭취는 유충 단계에서 축적된 낮은 칼로리 저장량과 혈액의 비효율적인 이용으로 인해 제한적입니다[9]. 암컷 Ann.gambiae sl은 일반적으로 추가적인 혈액 섭취를 통해 이를 보완하는데[10, 11], 이로 인해 더 많은 사람들이 질병에 감염될 위험이 높아지고 모기는 포식자에게 잡아먹힐 위험이 커집니다. 대안으로, 모기는 다른 곤충에서처럼 척추동물의 배설물을 섭취하여 적응력과 비행 기동성을 향상시키는 질소 화합물을 얻을 수 있습니다[2]. 이와 관련하여 An.gambiae sl 종 복합체 내의 자매종 중 하나인 Anopheles arabinis가 신선하고 오래된 소변에 강하게 끌리는 현상은 흥미롭습니다[12, 13, 14]. Anopheles arabinis는 숙주 선호도에 있어 기회주의적이며 소와 함께 생활하고 소를 먹이로 삼는 것으로 알려져 있습니다. 소변은 질소 화합물이 풍부한 자원이며, 그중 요소가 주요 성분입니다. 신선한 소변에 있는 총 질소의 50-95%[15, 16]. 소변이 오래되면 미생물은 이러한 자원을 이용하여 24시간 이내에 질소 화합물의 복잡성을 줄입니다[15]. 유기 질소의 감소와 관련된 암모니아의 급격한 증가로 인해 호알칼리성 미생물(이들 중 다수는 모기에 유독한 화합물을 생성함)이 번성합니다[15]. 암컷 Ann.arabiensis는 24시간 이내의 소변에 특히 끌립니다[13, 14].
본 연구에서는 숙주와 흡혈한 Ans 모기를 조사했습니다. 첫 번째 생식선자극호르몬 주기 동안, Ans arabiensis 모기가 소변과 혼합하여 요소(urea)를 포함한 질소 화합물을 획득하는지 평가했습니다. 다음으로, 암컷 모기가 생존, 번식 및 추가 먹이 활동에 있어 이러한 잠재적 영양 자원을 어떻게 활용하는지 평가하기 위한 일련의 실험을 수행했습니다. 마지막으로, 신선한 소변과 숙성된 소변의 냄새를 평가하여 숙주와 흡혈한 Ans 모기에게 신뢰할 만한 단서를 제공하는지 확인했습니다. Ans arabiensis 모기는 이러한 잠재적 영양 자원을 찾는 과정에서 관찰된 차별적인 매력 뒤에 숨겨진 화학적 상관관계를 발견했습니다. 24시간 숙성된 소변에서 확인된 휘발성 유기 화합물(VOC)의 합성 냄새 혼합물을 야외 조건에서 추가로 평가하여 실험실 조건에서 얻은 결과를 확장하고 소변 냄새가 다양한 생리적 상태, 즉 모기 유인에 미치는 영향을 입증했습니다. 얻어진 결과는 Ans arabiensis 모기가 소변 냄새를 통해 다양한 생리적 상태를 경험할 수 있음을 확인시켜 줍니다. 아라비엔시스는 척추동물의 소변에서 발견되는 질소 화합물을 획득하고 분배하여 생활사 특성에 영향을 미칩니다. 이러한 결과는 잠재적인 역학적 영향과 매개체 감시 및 통제에 어떻게 활용될 수 있는지에 대한 맥락에서 논의됩니다.
아노펠레스 아라비칸스(동골라 계통)는 25 ± 2 °C, 상대습도 65 ± 5%, 12:12시간 명암 주기 조건에서 사육하였다. 유충은 증류수가 담긴 플라스틱 트레이(20cm × 18cm × 7cm)에서 사육하였고, 테트라민® 어류 사료(Tetra Werke, Melle, DE)를 공급하였다. 번데기는 30ml 컵(Nolato Hertila, Åstorp, SE)에 담아 수집한 후, 성충 우화를 위해 Bugdorm 케이지(30cm × 30cm × 30cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan)로 옮겼다. 성충에게는 우화 후 4일(dpe)까지 10% 자당 용액을 자유롭게 공급하였고, 이후 숙주를 찾는 암컷에게는 실험 직전에 먹이를 제공하거나, 실험 전날 밤에는 증류수만 공급하여 금식시켰다(아래 설명 참조). 비행관 실험에 사용된 암컷은 다음과 같다. 흡혈 모기를 이후 생물 검정에 사용하기 위해 4일령 암컷에게 막 공급 시스템(Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK)을 이용하여 탈섬유화된 양혈(Håtunalab, Bro, SE)을 공급했습니다. 혈액이 완전히 충혈된 암컷은 개별 케이지로 옮겨 아래에 설명된 대로 직접 사료를 제공하거나, 아래에 설명된 실험 3일 전부터 10% 자당 용액을 자유롭게 제공했습니다. 후자의 암컷은 비행관 생물 검정에 사용되었으며 실험실로 옮겨진 후 실험 전 4~6시간 동안 증류수를 자유롭게 제공했습니다.
성체 아나 아랍 암컷 모기의 소변 및 요소 섭취량을 정량화하기 위해 섭식 실험을 수행했습니다. 숙주를 찾아다니며 혈액을 섭취한 암컷 모기에게 48시간 동안 1% 희석된 신선한 소변과 숙성된 소변, 다양한 농도의 요소, 그리고 두 가지 대조군(10% 자당 용액과 물)을 포함하는 사료를 제공했습니다. 또한, 식용 색소(1 mg ml⁻¹ 자일렌 시아나이드 FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE)를 사료에 첨가하고 250 µl 마이크로원심분리 튜브(Axygen Scientific, Union City, CA, US; 그림 1A)에 4 × 4 매트릭스 형태로 채워 넣었습니다. 모기 간의 경쟁과 염료 색상의 잠재적 영향을 피하기 위해, 10마리의 모기를 큰 페트리 접시(지름 12cm, 높이 6cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; 그림 1A)에 넣었습니다. 25 ± 2 cm °C의 온도와 65 ± 5%의 상대 습도에서 완전한 암흑 상태를 유지했습니다. 이 실험은 5~10회 반복되었습니다. 먹이를 투여한 후, 모기는 추가 분석을 위해 -20 °C에서 보관했습니다.
숙주와 흡혈하는 암컷 아라비아 모기(Anopheles arabianus)가 흡수한 소변과 요소를 조사했습니다. 먹이 실험(A)에서 암컷 모기에게 신선한 소변과 숙성된 소변, 다양한 농도의 요소, 자당(10%), 증류수(H2O)로 구성된 먹이를 제공했습니다. 숙주를 찾는 암컷(B)과 흡혈하는 암컷(C)은 다른 어떤 먹이보다 자당을 더 많이 흡수했습니다. 숙주를 찾는 암컷은 72시간 소변을 168시간 소변보다 적게 흡수했습니다(B). 소변의 평균 총 질소 함량(± 표준 편차)은 삽입 그림에 나타냈습니다. 숙주를 찾는 암컷(D, F)과 흡혈하는 암컷(E, G)은 용량 의존적으로 요소를 흡수합니다. 서로 다른 알파벳으로 표시된 평균 흡입량(D, E)은 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다(Tukey 사후 분석을 사용한 일원 분산 분석; p < 0.05). 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 평균값(BE). 직선 점선은 로그선형 회귀선(F, G)을 나타냅니다.
흡수된 음식을 방출시키기 위해 모기를 증류수 230µl가 들어 있는 1.5ml 마이크로원심분리 튜브에 각각 넣고 일회용 막자사발과 무선 모터(VWR International, Lund, SE)를 사용하여 조직을 파쇄한 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리했습니다. 상층액(200µl)을 96웰 마이크로플레이트(Sigma-Aldrich)로 옮기고 분광광도계 기반 마이크로플레이트 리더(SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE)를 사용하여 흡광도(λ620nm)를 측정했습니다. 또는 모기를 증류수 1ml에 넣고 갈아서 900µl를 큐벳에 옮겨 분광광도계 분석(λ 620nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE)을 수행했습니다. 식이 섭취량을 정량화하기 위해 연속 희석을 통해 표준 곡선을 작성했습니다. 0.2µl에서 2.4µl의 1mg/ml 농도의 자일렌 시아나이드 용액을 모기에 첨가했습니다. 그런 다음, 알려진 염료 농도의 광학 밀도를 이용하여 각 모기가 섭취한 먹이의 양을 측정했습니다.
부피 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA) 후 Tukey 사후 검정을 사용하여 분석했습니다(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). 선형 회귀 분석을 통해 농도에 따른 요소 섭취량을 설명하고 숙주를 찾는 모기와 흡혈하는 모기 간의 반응을 비교했습니다(GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
각 연령 그룹에서 약 20 µl의 소변 샘플을 Chromosorb® W/AW(10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich)에 흡착시킨 후 주석 캡슐(8 mm × 5 mm)에 넣었습니다. 캡슐을 CHNS/O 분석기(Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US)의 연소실에 넣어 제조사 프로토콜에 따라 신선한 소변과 숙성된 소변의 질소 함량을 측정했습니다. 총 질소량(g N l-1)은 표준으로 사용된 알려진 요소 농도를 기준으로 정량화했습니다.
숙주 탐색 및 흡혈 암컷 모기의 생존에 미치는 식이의 영향을 평가하기 위해 모기를 각각 뚜껑에 망으로 덮인 구멍(지름 3cm)이 있는 큰 페트리 접시(지름 12cm, 높이 6cm; Semadeni)에 넣었습니다. 환기 및 먹이 공급을 위해 구멍을 뚫었습니다. 먹이는 접종 후 4일째 되는 날 제공되었으며, 1% 희석된 신선한 소변과 숙성된 소변, 네 가지 농도의 요소, 그리고 두 가지 대조군인 10% 자당 용액과 물을 포함했습니다. 각 먹이는 5ml 주사기(Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE)에 삽입된 치과용 탐폰(DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE)에 피펫으로 옮겨 담고, 피스톤을 제거한 후 페트리 접시 위에 놓았습니다(그림 1.1A). 먹이는 매일 교체했습니다. 실험실은 위에서 설명한 대로 유지했습니다. 생존한 모기는 하루에 두 번씩 세었고, 죽은 모기는 마지막 모기가 죽을 때까지 제거했습니다(n = 40). 각 처리군별로). 다양한 먹이를 섭취한 모기의 생존율은 Kaplan-Meyer 생존 곡선과 로그 순위 검정을 사용하여 통계적으로 분석하고, 먹이 종류별 생존 분포를 비교하였다(IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Attisano et al.[17]을 기반으로 한 맞춤형 모기 유인 장치는 앞면과 뒷면 패널이 없는 5mm 두께의 투명 아크릴 패널(폭 10cm x 길이 10cm x 높이 10cm)로 만들어졌습니다(그림 3: 상단). 가스 크로마토그래피 컬럼(내경 0.25mm, 길이 7.5cm)으로 만들어진 수직 튜브가 있는 회전축 어셈블리의 양 끝은 9cm 간격으로 떨어진 한 쌍의 네오디뮴 자석 사이에 매달린 곤충 바늘에 접착되어 있습니다. 동일한 재질로 만들어진 수평 튜브(길이 6.5cm)는 수직 튜브를 이등분하여 연결된 팔과 빛을 차단하는 신호로 작은 알루미늄 호일 조각을 운반하는 팔을 형성합니다.
24시간 동안 금식시킨 암컷 모기에게 구속하기 30분 전에 위의 먹이를 제공했습니다. 충분히 먹이를 섭취한 암컷 모기는 각각 얼음 위에서 2~3분간 마취시킨 후 밀랍(Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE)을 사용하여 곤충 핀에 고정하고 수평 튜브의 팔에 묶었습니다. 비행 밀(Flying Mill)을 사용하여 비행당 회전수를 맞춤 제작된 데이터 로거로 기록하고 PC-Lab 2000™ 소프트웨어(v4.01; Velleman, Gavere, BE)를 사용하여 저장 및 표시했습니다. 비행 밀은 온도와 습도가 조절되는 방(12시간 명암, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH)에 설치했습니다.
비행 활동 패턴을 시각화하기 위해 24시간 동안 시간당 총 비행 거리(m)와 연속 비행 횟수를 계산했습니다. 또한, 개별 암컷의 평균 비행 거리를 처리군별로 비교하고 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey 사후 분석(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)을 사용하여 분석했습니다. 여기서 평균 비행 거리는 종속 변수이고 처리군은 독립 변수입니다. 추가적으로, 평균 비행 횟수는 10분 간격으로 계산했습니다.
An.arabiensis의 생식 능력에 대한 식이의 영향을 평가하기 위해, 혈액 채취 후 암컷 6마리(수정 후 4일)를 Bugdorm 케이지(30cm × 30cm × 30cm)로 직접 옮긴 후, 위에서 설명한 대로 실험 사료를 48시간 동안 제공했습니다. 셋째 날 사료를 제거하고 증류수 20ml가 담긴 산란컵(30ml; Nolato Hertila)을 48시간 동안 제공했으며, 24시간마다 물을 교체했습니다. 각 식이 요법을 20~50회 반복했습니다. 각 실험 케이지에서 산란된 알의 수를 세어 기록했습니다. 알의 일부(식이 요법당 n ≥ 200개)를 Dialux-20 현미경(DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE)과 Leica Camera(DFC) 320 R2를 사용하여 개별 알의 평균 크기와 길이 변이를 평가했습니다. Leica Microsystems Ltd., DE). 나머지 알은 표준 사육 조건 하에 항온항습실에서 24시간 동안 보관하였고, 최근 부화한 1령 유충의 일부 표본(사료당 n ≥ 200)을 위에서 설명한 대로 측정하였다. 알의 개수, 알과 유충의 크기는 처리 간에 비교하였으며, 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey 사후 분석(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)을 사용하였다.
아르시 품종 제부 소에서 채취한 신선한(채취 후 1시간), 24시간, 72시간 및 168시간 숙성된 소변의 헤드스페이스 휘발성 물질을 수집했습니다. 편의상 소들이 축사에 있는 이른 아침에 소변 샘플을 채취했습니다. 10마리의 소에서 소변 샘플을 채취하고 각 샘플 100-200ml를 3리터 용량의 뚜껑이 있는 폴리아미드 용기(Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE)에 담아 개별적으로 포장했습니다. 각 소변 샘플의 헤드스페이스 휘발성 물질은 채취 직후(신선한 상태) 또는 실온에서 24시간, 72시간, 168시간 숙성시킨 후 수집했으며, 즉 각 소변 샘플은 각 연령대를 대표합니다.
헤드스페이스 휘발성 물질 수집을 위해, 활성탄으로 여과된 가스 흐름(100 ml min⁻¹)을 다이어프램 진공 펌프(KNF Neuberger, Freiburg, DE)를 이용하여 폴리아미드 백을 통해 흡착 컬럼으로 2.5시간 동안 순환시키는 폐쇄 루프 시스템을 사용했습니다. 대조군으로 빈 폴리아미드 백에서 헤드스페이스를 수집했습니다. 흡착 컬럼은 유리솜 마개 사이에 35 mg의 Porapak Q(50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US)가 들어 있는 테프론 튜브(5.5 cm x 3 mm 내경)로 제작했습니다. 사용 전, 컬럼을 재증류된 n-헥산(Merck, Darmstadt, DE) 1 ml와 펜탄(순도 99.0%, GC 등급, Sigma Aldrich) 1 ml로 세척했습니다. 흡착된 휘발성 물질은 펜탄 400 μl로 용출했습니다. 헤드스페이스 수집액은 모아서 보관했습니다. 추가 분석에 사용될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
숙주 탐색 및 흡혈하는 아라비돕시스 모기의 행동 반응. 신선한 소변, 24시간, 72시간, 168시간 숙성된 소변에서 채취한 휘발성 추출물을 직선 유리관 후각계를 사용하여 분석했습니다[18]. 실험은 아라비돕시스 모기의 숙주 탐색 활동이 가장 활발한 ZT 13-15 기간 동안 수행되었습니다[19]. 유리관 후각계(80cm × 9.5cm 내경)에 위에서 3 ± 1 lx의 적색광을 비추었습니다. 숯 필터로 여과하고 가습한 공기 흐름(25 ± 2°C, 상대 습도 65 ± 2%)이 30cm s⁻¹의 속도로 생물 검사를 통과했습니다. 공기는 일련의 스테인리스 스틸 메쉬 스크린을 통과하여 층류와 균일한 연기 구조를 생성합니다. 치과용 탐폰 디스펜서(4cm × 1cm; L:D; DAB Dental) AB)는 후각측정기의 바람이 불어오는 쪽에 있는 5cm 코일에 매달아 놓았으며, 자극제는 5분마다 교체했습니다. 분석을 위해 각 헤드스페이스 추출물 10μl를 1:10으로 희석하여 자극제로 사용했습니다. 동일한 양의 펜탄을 대조군으로 사용했습니다. 숙주를 찾거나 흡혈하는 모기를 실험 시작 2~3시간 전에 개별 방출 케이지에 넣었습니다. 방출 케이지는 후각측정기의 바람이 불어가는 쪽에 놓고 모기가 1분 동안 적응하도록 한 후 케이지의 버터플라이 밸브를 열어 방출했습니다. 처리군 또는 대조군에 대한 유인도는 방출 후 5분 이내에 자극원에 접촉한 모기의 비율로 분석했습니다. 각 헤드스페이스 휘발성 추출물과 대조군은 최소 30회 반복했으며, 특정 날짜의 영향을 방지하기 위해 매 실험일마다 동일한 수의 처리군과 대조군을 사용했습니다. 숙주와 흡혈 모기의 탐색 반응을 분석했습니다. 답. 아랍어 데이터셋과 헤드스페이스 데이터셋은 명목 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 분석한 후, 쌍별 비교를 통해 오즈비를 계산했습니다(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
안의 산란 반응. 신선한 소변과 숙성된 소변의 헤드스페이스 추출물을 Bugdorm 케이지(30cm × 30cm × 30cm; MegaView Science)에서 분석하였다. 증류수 20mL를 채운 플라스틱 컵(30mL; Nolato Hertila)을 산란 기질로 사용하고 케이지의 마주보는 모서리에 24cm 간격으로 배치하였다. 처리 컵에는 각 헤드스페이스 추출물 10μl를 1:10으로 희석하여 첨가하였고, 대조 컵에는 동일한 양의 펜탄을 첨가하였다. 위치 효과를 제어하기 위해 각 실험마다 처리 컵과 대조 컵을 교체하였다. 흡혈한 암컷 10마리를 ZT 9-11에 실험 케이지에 넣고 24시간 후 컵에 있는 알의 수를 세었다. 산란 지수 계산 공식은 다음과 같다: (처리 컵에 산란된 알의 수 - 대조 컵에 산란된 알의 수) / (총 산란된 알의 수). 각 처리는 8회 반복하였다.
암컷 An.arabiensis의 가스 크로마토그래피 및 전자 안테나 패턴 검출(GC-EAD) 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[20]. 간단히 말하면, 신선한 헤드스페이스 휘발성 추출물은 HP-5 컬럼(30m × 0.25mm 내경, 0.25μm 필름 두께, Agilent Technologies)이 장착된 Agilent Technologies 6890 GC(Santa Clara, CA, US)를 사용하여 분리되었습니다. 그리고 노화된 소변. 이동상으로는 수소를 사용했으며 평균 선형 유속은 45 cm s⁻¹였다. 각 시료(2 μl)는 225 °C의 주입구 온도에서 스플릿리스 모드로 30초 동안 주입했다. GC 오븐 온도는 35 °C(3분 유지)에서 300 °C(10분 유지)까지 10 °C min⁻¹의 속도로 프로그래밍했다. GC 유출액 분배기에는 4 psi의 질소를 주입하고 Gerstel 3D/2 저데드 볼륨 크로스(Gerstel, Mülheim, DE)를 사용하여 불꽃 이온화 검출기와 EAD 사이에 1:1로 분배했다. EAD용 GC 유출액 모세관은 GC 오븐 온도에 5 °C를 더한 온도를 유지하는 Gerstel ODP-2 전달 라인을 통해 유리관(10 cm × 8 mm)으로 통과시켰고, 여기서 탄소 필터로 여과된 가습 공기(1.5 l min⁻¹)와 혼합되었다. 안테나는 튜브 출구에서 0.5cm 떨어진 곳에 배치했습니다. 각 모기 개체는 하나의 반복 실험에 해당하며, 숙주를 찾는 모기의 경우 각 연령대의 소변 샘플에 대해 최소 3개의 반복 실험을 수행했습니다.
GC-EAD 분석에서 더듬이 반응을 유도하기 위해 GC-MS(6890 GC 및 5975 MS; Agilent Technologies)를 사용하여 신선한 소변과 숙성된 소변의 헤드스페이스 컬렉션에서 생리활성 화합물을 확인했습니다. GC는 70 eV의 전자 충격 이온화 모드에서 작동했습니다. GC에는 HP-5MS UI 코팅 융합 실리카 모세관 컬럼(60 m × 0.25 mm 내경, 0.25 μm 필름 두께)이 장착되었으며, 이동상으로는 헬륨을 사용했고 평균 선형 유속은 35 cm s⁻¹였습니다. GC-EAD 분석과 동일한 주입기 설정 및 오븐 온도로 2 μl의 시료를 주입했습니다. 화합물은 유지 시간(코바트 지수)과 질량 스펙트럼을 사용자 지정 라이브러리 및 NIST14 라이브러리(Agilent)와 비교하여 확인했습니다. 확인된 화합물은 표준 물질을 주입하여 재확인했습니다(추가 파일 1: 표 S2). 정량 분석을 위해 헵틸 아세테이트(10 ng, 화학적 순도 99.8%, Aldrich)를 외부 표준 물질로 주입하였다.
신선한 소변과 숙성된 소변에서 확인된 생리활성 화합물로 구성된 합성 냄새 혼합물의 효능을 숙주를 찾아 흡혈하는 Ans. arabiensis 모기를 유인하는 데 있어 위와 동일한 후각측정기와 프로토콜을 사용하여 평가하였다. 합성 혼합물은 신선한 소변, 24시간, 48시간, 72시간, 168시간 숙성된 소변의 혼합 휘발성 추출물에 포함된 화합물의 조성 및 비율을 모방하였다(그림 5D-G; 추가 파일 1: 표 S2). 분석을 위해, 전체 방출 속도가 약 140-2400 ng h⁻¹ 범위인 완전 합성 혼합물의 1:100 희석액 10 μl를 사용하여 숙주 및 흡혈 모기에 대한 유인성을 평가하였다. 이후, 완전 혼합물에서 단일 화합물의 차감 혼합물을 제거한 완전 혼합물에 대해 시험을 수행하였다. 합성 혼합물과 차감 혼합물에 대한 숙주 및 흡혈한 Ans. arabiensis 모기의 반응을 관찰하였다. 명목 로지스틱 회귀 분석을 사용한 후, 오즈비에 대한 쌍별 비교를 통해 분석하였다(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
소변이 말라리아 모기의 숙주 서식지 신호 역할을 할 수 있는지 평가하기 위해, 앞서 설명한 방법으로 수집한 신선한 소변과 숙성된 소변, 그리고 물을 망사 처리된 3리터 양동이(100ml)에 담아 숙주 유인 트랩(BG-HDT 버전; BioGents, Regensburg, DE)에 설치했습니다. 트랩 10개를 마을에서 400m 떨어진 목초지(에티오피아 실라이, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E)에 50m 간격으로 설치했으며, 소는 없고 모기의 영구 번식지와 마을에 위치하도록 했습니다. 트랩 5개는 숙주가 있는 것처럼 보이도록 가열했고, 나머지 5개는 가열하지 않았습니다. 각 처리 위치는 총 5일 밤 동안 매일 밤 교체했습니다. 숙주가 있는 소변을 미끼로 사용한 트랩에서 포획된 모기의 수를 베타 이항 분포를 적용한 로지스틱 회귀 분석(JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)을 이용하여 비교했습니다.
에티오피아 오로미아 지역 마키 마을 근처의 말라리아 유행 지역 마을(북위 8° 11′ 08″, 동경 38° 81′ 70″; 그림 6A)에서 연구를 진행했습니다. 연구는 연례 실내 잔류 살충제 살포 전인 8월 중순부터 9월 중순까지, 그리고 긴 우기 기간 동안 실시되었습니다. 마을 외곽에 위치한 5쌍의 가옥(20~50m 간격)을 연구 대상으로 선정했습니다(그림 6A). 가옥 선정 기준은 다음과 같습니다. 집에 동물을 들일 수 없고, 실내에서 장작이나 숯을 사용하여 요리하는 것이 금지되어 있으며(최소한 연구 기간 동안), 최대 두 명의 거주자가 살충제가 없는 곳에서 잠을 자는 곳입니다. 처리된 모기장 아래에서 실험을 진행했습니다. 본 연구는 세계의사회 헬싱키 선언의 지침에 따라 아디스아바바 대학교 자연과학대학 기관연구윤리심의위원회(CNS-IRB, IRB/022/2016)의 윤리적 승인을 받았습니다. 각 가구주의 동의는 보건소 직원의 도움을 받아 얻었습니다. 전체 과정은 지역 행정기관(구 및 동, '케벨레')의 승인을 받았습니다. 실험 설계는 2×2 라틴방격법을 따랐으며, 합성 혼합물과 대조군을 첫날 밤에 짝을 이룬 가구에 배치하고 다음 날 밤에 가구 간에 교환했습니다. 이 과정을 10회 반복했습니다. 또한, 선정된 가구의 모기 활동을 측정하기 위해 CDC 트랩을 현장 실험의 시작, 중간, 끝 부분에 걸쳐 5일 밤 동안 같은 시간대에 설치하여 작동시켰습니다.
6가지 생리활성 화합물을 포함하는 합성 혼합물을 헵탄(97.0% 용매 GC 등급, Sigma Aldrich)에 용해시키고 면심지 분배기를 사용하여 140 ng h-1의 속도로 방출시켰습니다[20]. 면심지 분배기를 통해 12시간 실험 동안 모든 화합물이 일정한 비율로 방출되었습니다. 헵탄은 대조군으로 사용되었습니다. 바이알은 미국 질병통제예방센터(CDC) 라이트 트랩(John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; 그림 6A)의 입구 옆에 매달았습니다. 트랩은 침대 발치 근처 지면에서 0.8~1m 높이에 매달았고, 자원봉사자는 처리되지 않은 모기장 아래에서 잠을 잤으며, 18:00부터 06:30까지 작동했습니다. 성별과 생리적 상태(미섭식, 섭식, 반임신, 임신[21])에 따라 포획된 모기는 이후 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석을 사용하여 형태학적으로 A.로 식별된 종을 확인했습니다. gambiae sl. 복합체의 구성원[23]. 현장 연구에서 쌍을 이룬 집의 덫 포획은 명목 로지스틱 적합 모델을 사용하여 분석되었으며, 여기서 유인은 종속 변수이고 처리(합성 혼합물 대 대조군)는 고정 효과였습니다(JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). 여기서는 우도비 검정에서 얻은 χ2 및 p 값을 보고합니다.
안전성을 평가하기 위해, 아라비아거스(Amazona arabiensis)는 4일 후(dpe) 숙주 탐색 및 흡혈 암컷 먹이 섭취 실험에서 직접 섭취를 통해 주요 질소 공급원인 요소(urea)인 소변을 48시간 이내에 섭취할 수 있었습니다(그림 1A). 숙주 탐색 및 흡혈 암컷 모두 다른 어떤 먹이나 물보다 설탕(sucrose)을 유의미하게 더 많이 흡수했습니다(F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 및 F(5,299) = 56.00, p < 0.0001, 각각; 그림 1B,C). 또한, 숙주 탐색 암컷은 72시간 후의 소변 섭취량이 168시간 후의 소변 섭취량보다 적었습니다(그림 1B). 요소를 함유한 먹이를 제공했을 때, 숙주 탐색 암컷은 2.69 mM 농도에서 다른 모든 농도 및 물보다 유의미하게 더 많은 양의 요소를 흡수했으며, 10% 농도와는 차이가 없었습니다. 수크로오스(F(10,813) = 15.72, p < 0.0001; 그림 1D)의 경우, 혈액을 섭취한 암컷은 일반적으로 물보다 요소 함유 사료를 유의미하게 더 많이 흡수했지만, 10% 수크로오스보다는 유의미하게 적게 흡수한 것과는 대조적이었습니다(F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; 그림 1E). 또한, 두 생리적 상태를 비교했을 때, 혈액을 섭취한 암컷은 가장 낮은 농도에서 숙주를 찾는 암컷보다 더 많은 요소를 흡수했고, 더 높은 농도에서는 비슷한 양의 요소를 흡수했습니다(F(1,953) = 78.82, p < 0.0001; 그림 1F, G). 요소 함유 사료로부터의 섭취량은 최적값을 가지는 것으로 보였지만(그림 1D, E), 두 생리적 상태의 암컷 모두 섭취량을 조절할 수 있었습니다. 요소 농도의 전체 범위에 걸쳐 요소 흡수량은 로그 선형 방식으로 나타납니다(그림 1F,G). 마찬가지로 모기는 소변의 질소량이 흡수량에 반영되는 것으로 보아 소변 흡수량을 조절함으로써 질소 흡수를 제어하는 ​​것으로 보입니다(그림 1B, C 및 B 삽입 그림).
숙주 탐색 및 흡혈 모기의 생존에 대한 소변과 요소의 영향을 평가하기 위해 암컷 모기에게 네 가지 연령대(신선한 소변, 배설 후 24시간, 72시간, 168시간)의 소변과 다양한 농도의 요소 용액을 먹였으며, 대조군으로는 증류수와 10% 자당 용액을 제공했습니다(그림 2A). 생존 분석 결과, 먹이는 숙주 탐색 암컷(소변: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; 요소: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; 그림 2B, C)과 흡혈 암컷(소변: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; 요소: χ2 = 137.9, df = 0.0001) 모두에서 전체 생존에 유의미한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 5, p < 0.0001; 그림 2D,E). 모든 실험에서 소변, 요소, 물을 섭취한 암컷은 설탕물을 섭취한 암컷에 비해 생존율이 유의하게 낮았습니다(그림 2B-E). 숙주를 찾는 암컷은 신선한 소변과 오래된 소변을 섭취했을 때 서로 다른 생존율을 보였으며, 72시간 오래된 소변을 섭취한 암컷(p = 0.016)의 생존 확률이 가장 낮았습니다(그림 2B). 또한, 숙주를 찾는 암컷은 135mM 요소를 섭취했을 때 물을 섭취한 대조군보다 더 오래 생존했습니다(p < 0.04)(그림 2C). 물과 비교했을 때, 신선한 소변과 24시간 소변을 섭취한 암컷은 더 오래 생존했으며(각각 p = 0.001 및 p = 0.012; 그림 2D), 72시간 소변을 섭취한 암컷은 신선한 소변과 24시간 오래된 소변을 섭취한 암컷보다 더 오래 생존했습니다(p < 0.0001 및 p = 0.012; 그림 2D). 각각 0.013이었습니다(그림 2D). 135mM의 요소를 공급했을 때, 혈액을 섭취한 암컷은 다른 모든 농도의 요소와 물을 공급했을 때보다 더 오래 생존했습니다(p < 0.013; 그림 2E).
소변과 요소를 섭취한 숙주 및 흡혈 암컷 아로펠레스 아라비니스 모기의 생존율. 생물 검정(A)에서 암컷 모기에게 신선한 소변과 숙성된 소변, 다양한 농도의 요소, 자당(10%), 증류수(H2O)로 구성된 먹이를 제공했다. 숙주를 찾는 모기(B, C)와 흡혈하는 모기(D, E)의 생존율은 소변(B, D)과 요소(C, E)를 섭취한 모든 암컷과 대조군인 자당과 물을 섭취한 모든 암컷이 죽을 때까지 12시간마다 기록했다.
24시간 동안 비행 밀 테스트에서 측정된 총 비행 거리와 회전 횟수는 숙주를 찾는 모기와 흡혈하는 모기 간에 차이가 있었으며, 흡혈하는 모기는 전반적으로 비행 활동이 더 적었습니다(그림 3). 신선한 소변과 오래된 소변, 또는 설탕과 물을 제공받은 숙주를 찾는 모기는 뚜렷한 비행 패턴을 보였습니다(그림 3). 신선한 소변을 섭취한 암컷은 새벽에 더 활발하게 활동한 반면, 24시간 및 168시간 숙성된 소변을 섭취한 암컷은 다른 비행 패턴을 보였고 주로 주행성이었습니다. 설탕이나 72시간 숙성된 소변을 제공받은 암컷 모기는 24시간 내내 활동적이었지만, 물을 제공받은 암컷은 중간에 더 활발하게 활동했습니다. 설탕을 섭취한 모기는 늦은 밤과 이른 아침에 가장 높은 활동 수준을 보인 반면, 72시간 숙성된 소변을 섭취한 모기는 24시간 동안 활동이 꾸준히 감소했습니다(그림 3).
소변과 요소를 먹이로 삼은 흡혈성 암컷 아노펠레스 아라비니스 모기의 비행 성능. 비행 밀 테스트에서, 신선한 소변과 숙성된 소변, 다양한 농도의 요소, 10% 자당, 그리고 증류수(H2O)를 먹이로 삼은 암컷 모기들을 수평으로 자유롭게 회전하는 팔(위 그림)에 고정시켰다. 숙주를 찾는 암컷(왼쪽)과 흡혈하는 암컷(오른쪽)에 대해 24시간 동안 각 먹이에 대한 총 비행 거리와 시간당 비행 횟수를 기록했다(어두운 색: 회색; 밝은 색: 흰색). 평균 비행 거리와 평균 비행 횟수는 일주기 활동 그래프 오른쪽에 표시되어 있다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계 분석은 본문을 참조하라.
일반적으로 숙주를 찾는 암컷의 전반적인 비행 활동은 24시간 동안의 비행 거리와 유사한 패턴을 보였습니다. 평균 비행 거리는 섭취한 먹이에 의해 유의미한 영향을 받았으며(F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001), 72시간 동안의 소변을 섭취한 암컷은 다른 모든 먹이를 섭취한 암컷에 비해 유의미하게 더 먼 거리를 비행했습니다(p < 0.0001). 또한, 설탕을 섭취한 모기는 신선한 소변(p = 0.022)과 24시간 숙성된 소변(p = 0.022)을 섭취한 모기보다 더 오래 비행했습니다. 소변을 섭취한 경우와 달리, 요소를 섭취한 암컷은 24시간 동안 지속적인 비행 활동을 보였으며, 어두운 시간대의 후반부에 최고조에 달했습니다(그림 3). 활동 패턴은 유사했지만, 요소를 섭취한 암컷은 흡수된 농도에 따라 평균 비행 거리가 유의미하게 증가했습니다. (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001). 어떤 농도의 요소라도 섭취한 숙주 탐색 암컷은 물이나 자당을 섭취한 암컷보다 더 오래 날았습니다(p < 0.03).
흡혈 모기의 전반적인 비행 활동은 모든 먹이에서 24시간 동안 안정적이고 지속되었으며, 물을 섭취한 암컷과 신선한 소변 및 24시간 지난 소변을 섭취한 암컷 모두에서 어두운 기간의 후반부에 소변 활동이 증가했습니다(그림 3). 소변을 섭취한 암컷은 혈액을 섭취한 암컷의 평균 비행 거리에 유의미한 영향을 미쳤지만(F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), 요소(urea)를 섭취한 암컷은 영향을 미치지 않았습니다(F(5, 138) = 1.36, p = 0.24). 다른 소변 및 대조군 먹이(신선한 소변, p = 0.0091; 72시간 지난 소변, p = 0.0022; 168시간 지난 소변, p = 0.001; 자당, p = 0.0017; 증류수, p = 0.036)와 비교했을 때도 마찬가지였습니다.
소변과 요소 섭취가 생식 매개변수에 미치는 영향은 산란 생물검정(그림 4A)을 통해 평가되었으며, 각 암컷이 낳은 알의 수, 알의 크기, 그리고 갓 부화한 1령 유충의 수를 기준으로 조사되었습니다. 소변을 섭취한 아랍 암컷의 산란량은 식단에 따라 차이가 있었습니다(F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; 그림 4B). 24시간 소변과 혈액을 섭취한 암컷은 다른 소변 식단을 섭취한 암컷보다 유의하게 많은 알을 낳았으며, 설탕을 섭취한 암컷과 비슷한 산란량을 보였습니다(그림 4B). 마찬가지로, 소변을 섭취한 암컷이 낳은 알의 크기도 식단에 따라 차이가 있었습니다(F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001). 24시간 소변과 설탕을 섭취한 암컷은 물을 섭취한 암컷보다 유의하게 큰 알을 낳았지만, 168시간 소변을 섭취한 암컷의 알은 유의하게 작았습니다. (그림 4C).또한, 소변 섭취는 유충 크기에 유의한 영향을 미쳤으며(F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001), 24시간 및 72시간 동안 소변을 섭취한 암컷이 낳은 알에서 나온 유충이 물을 섭취한 암컷과 168시간 동안 소변을 섭취한 암컷이 낳은 알에서 나온 유충보다 유의하게 더 컸습니다(그림 4D).
소변과 요소를 섭취한 암컷 아노펠레스 아라비니 모기의 번식 성능. 흡혈한 암컷 모기에게 신선한 소변과 숙성된 소변, 다양한 농도의 요소, 10% 자당, 증류수(H2O)로 구성된 먹이를 48시간 동안 제공한 후 생물 검정에 투입하여 산란 기질을 얻었다(A). 산란 수(B, E), 산란 크기(C, F), 유충 크기(D, G)는 제공된 먹이(소변: BD; 요소: EG)에 의해 유의하게 영향을 받았다. 서로 다른 문자 이름을 사용하여 측정한 각 매개변수의 평균값은 서로 유의한 차이를 보였다(Tukey 사후 분석을 사용한 일원 분산 분석; p < 0.05). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
소변의 주요 질소 성분인 요소는 혈액을 섭취한 암컷에게 공급되었을 때 모든 연구에서 생식 매개변수에 유의미한 영향을 미쳤습니다. 혈액 섭취 후 요소를 섭취한 암컷의 산란량은 요소 농도에 따라 달라졌으며(F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001), 134 µM에서 1.34 mM 사이의 요소 농도를 섭취한 암컷이 더 많은 알을 낳았습니다(그림 4E). 134 µM 이상의 요소 농도를 섭취한 암컷은 물을 섭취한 암컷보다 더 큰 알을 낳았으며(F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; 그림 4F), 유충의 크기는 어미의 요소 농도가 유사함에도 불구하고(F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001) 더 큰 변동성을 보였습니다(그림 4G).
숙주를 찾는 소변의 기체 휘발성 추출물에 대한 전반적인 유인력을 유리관 후각계(그림 5A)로 평가한 결과, 아라비엔시스 모기의 유인력은 소변의 숙성 기간에 따라 유의미한 영향을 받았습니다(χ2 = 15.9, df = 4, p = 0.0032; 그림 5B). 사후 분석 결과, 24시간 된 소변 냄새는 다른 모든 처리(72시간: p = 0.0060, 168시간: p = 0.012, 펜탄: p = 0.00070)에 비해 유의미하게 높은 유인력을 나타냈습니다. 신선한 소변 냄새는 예외였습니다(p = 0.13; 그림 5B). 흡혈 모기의 소변 냄새에 대한 전반적인 유인력은 유의미한 차이가 없었지만(χ2 = 8.78, df = 4, p = 0.067; 그림 5C), 암컷 모기는 기체 휘발성 추출물에 대해 다른 처리보다 유의미하게 더 높은 유인력을 보였습니다. 72시간 숙성된 소변은 대조군에 비해 유의미한 차이를 보였다(p = 0.0066; 그림 5C).
숙주와 흡혈한 아라비아 모기를 찾는 과정에서 천연 및 합성 소변 냄새에 대한 행동 반응. 유리관 후각측정기 개략도(A). 신선한 소변과 숙성된 소변의 휘발성 추출물이 숙주(B)와 흡혈(C) 모기를 유인하는 모습. 아라비아 모기의 촉수 반응을 찾아보세요. 신선한(D), 24시간(E), 72시간(F), 168시간(G) 숙성된 소변에서 분리한 휘발성 추출물을 보여줍니다. 전자 안테나 검출(EAD) 파형은 가스 크로마토그래프에서 용출되어 불꽃 이온화 검출기(FID)로 검출된 휘발성 화합물에 대한 전압 변화를 나타냅니다. 스케일 바는 반응 진폭(mV) 대 유지 시간(s)을 나타냅니다. 생물학적 활성 화합물의 특성과 방출 속도(µg h⁻¹)를 보여줍니다. 별표 하나(*)는 일관된 낮은 진폭 반응을 나타냅니다. 별표 두 개(*)는 (**)는 재현 불가능한 반응을 나타냅니다. 숙주(H)와 흡혈 곤충(I)을 찾으십시오. An. arabiensis는 신선한 소변과 오래된 소변 냄새의 합성 혼합물에 대해 서로 다른 유인력을 보입니다. 서로 다른 문자 이름에 유인된 모기의 평균 비율은 서로 유의미하게 달랐습니다(Tukey 사후 분석을 사용한 일원 분산 분석; p < 0.05). 오차 막대는 척도의 표준 오차를 나타냅니다.
산란기 동안 혈액 섭취 후 72시간 및 120시간이 지난 암컷 Ann.arabiensis는 펜탄 대조군과 비교했을 때 신선한 소변과 오래된 소변의 휘발성 추출물에 대한 선호도를 나타내지 않았습니다(χ2 = 3.07, p > 0.05; 추가 파일 1: 그림 S1).
암컷 Ann.arabiensis의 경우, GC-EAD 및 GC-MS 분석을 통해 각각 8개, 6개, 3개, 3개의 생리활성 화합물이 확인되었습니다(그림 5D-G). 전기생리학적 반응을 유발하는 화합물의 수는 차이가 있었지만, 이러한 화합물 대부분은 신선한 소변과 오래된 소변에서 채취한 휘발성 추출물에 모두 존재했습니다. 따라서 각 추출물에서 암컷 더듬이에서 역치 이상의 생리학적 반응을 유발하는 화합물만 추가 분석에 포함했습니다.
헤드스페이스 수집에서 생리활성 화합물의 총 휘발성 방출 속도는 신선한 소변의 29 µg h⁻¹에서 168시간 숙성된 소변의 242 µg h⁻¹로 증가했는데, 이는 주로 p-크레졸과 m-포름알데히드, 페놀의 증가에 기인합니다. 반면, 2-시클로헥센-1-온 및 데카날과 같은 다른 화합물의 방출 속도는 소변 숙성 기간이 증가함에 따라 감소했으며, 이는 크로마토그램(그림 5D-G 왼쪽 패널)에서 관찰된 신호 강도(풍부도)의 감소 및 이러한 화합물에 대한 생리적 반응(그림 5D-G 오른쪽 패널)과 상관관계가 있습니다.
전반적으로, 합성 혼합물은 신선한 소변과 숙성된 소변의 휘발성 추출물에서 확인된 생리활성 화합물의 천연 비율과 유사했으며(그림 5D–G), 숙주 탐색(χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; 그림 5H)이나 흡혈 모기 탐색(χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; 그림 5I)에 유의미한 매력을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 사후 쌍별 비교 결과, 숙주를 찾는 모기는 펜탄 대조군에 비해 24시간 숙성된 소변의 합성 혼합물에 유의미하게 더 끌리는 것으로 나타났습니다(p = 0.0086; 그림 5H).
24시간 숙성된 소변의 합성 혼합물에서 개별 성분의 역할을 평가하기 위해, 개별 화합물을 제거한 6가지 차감 혼합물을 Y자형 튜브 분석법을 이용하여 완전 혼합물과 비교 평가했습니다. 숙주를 찾는 모기의 경우, 완전 혼합물에서 개별 화합물을 제거하면 행동 반응에 유의미한 영향을 미쳤습니다(χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; 추가 파일 1: 그림 S2A). 모든 차감 혼합물은 완전 혼합물보다 더 매력적이었습니다. 반면, 완전 합성 혼합물에서 개별 화합물을 제거해도 흡혈 모기의 행동 반응에는 영향을 미치지 않았습니다(χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077). 다만 데카날의 경우 완전 혼합물에 비해 매력도가 낮았습니다(p = 0.022; 추가 파일 1: 그림 S2B).
에티오피아의 말라리아 유행 지역 마을에서 24시간 소변 합성 혼합물의 모기 유인 효과를 야외 조건에서 10일 밤 동안 평가했습니다(그림 6A). 총 4,861마리의 모기가 포획되어 동정되었으며, 그중 45.7%는 Anthropus gambiae sl, 18.9%는 Anopheles pharoensis, 35.4%는 Culex spp.였습니다(추가 파일 1: 표 S1). PCR 분석을 통해 Anopheles arabinis는 An.gambian 종 복합체의 유일한 구성원으로 확인되었습니다. 평균적으로 하룻밤에 320마리의 모기가 포획되었으며, 합성 혼합물 미끼를 사용한 트랩이 혼합물이 없는 트랩보다 더 많은 모기를 포획했습니다(χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). 미끼가 없는 트랩은 각 지역에 설치되었습니다. 실험 시작, 중간, 끝 부분의 5일 밤 동안 대조군을 설정했습니다. 각 쌍의 트랩에서 포획된 모기의 수는 유사했으며, 이는 집들 간에 편향이 없음을 나타냅니다(χ2(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³, ​​p > 0.05). 또한 연구 기간 동안 개체 수 감소도 없었습니다. 대조군 트랩과 비교했을 때, 합성 혼합물이 들어 있는 트랩에서 포획된 모기의 수는 유의미하게 증가했습니다. 숙주 탐색 중인 모기(χ2(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), 최근 흡혈한 모기(χ2(0, 650) = 32.2, p < 0.0001), 임신한 모기(χ2(0, 228) = 6.27, p = 0.0123)의 수가 모두 증가했습니다(추가 파일 1: 표 S1). 이는 포획된 총 모기 수에도 반영되었습니다: 숙주 탐색 중인 모기 > 흡혈 중인 모기 > 임신한 모기 > 반임신한 모기 > 수컷 모기 순으로 나타났습니다.
24시간 지속되는 합성 소변 냄새 혼합물의 효능에 대한 현장 평가. 현장 시험은 에티오피아 남중부(지도), 마키 마을(삽입 그림) 근처에서 라틴방격 설계(항공 사진)를 적용한 쌍을 이루는 가옥에 미국 질병통제센터(CDC) 광트랩(오른쪽)을 설치하여 수행하였다(A). 합성 냄새를 미끼로 사용한 CDC 광트랩은 암컷 아로펠레스 아라베스크 모기(B)를 유인 및 포획했지만, 아로펠레스 파로에스 모기(C)는 다른 방식으로 유인 및 포획하지 못했는데, 이는 생리적 상태에 따라 달라지는 효과였다. 또한, 이 트랩은 숙주인 큐렉스 모기의 포획 수를 유의미하게 증가시켰다(D). 대조군과 비교했을 때, 왼쪽 막대는 냄새 미끼(녹색) 트랩과 대조군(빈칸) 트랩 쌍에서 포획된 모기의 평균 선택 지수를 나타내고(N=10), 오른쪽 막대는 대조군 트랩(빈칸) 쌍에서 포획된 모기의 평균 선택 지수를 나타낸다(N=5). 별표는 통계적 유의 수준을 나타냅니다(*p = 0.01 및 ***p < 0.0001).
세 종은 합성 혼합물이 들어 있는 트랩에서 서로 다른 방식으로 포획되었습니다. 숙주 탐색(χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), 흡혈(χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) 및 임신(χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134)과 관련하여, .arabiensis는 합성 혼합물을 방출하는 트랩에 포획되었지만(그림 6B), An의 양은 차이가 없었습니다. Pharoensis는 다양한 생리적 상태에서 발견되었습니다(그림 6C). Culex의 경우, 합성 혼합물로 유인한 트랩에서 숙주를 찾는 모기의 수만 대조군 트랩에 비해 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다(χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; 그림 6D).
에티오피아의 번식지와 농촌 지역 사회 사이에 잠재적 숙주 외부에 설치된 숙주 미끼 트랩을 사용하여 말라리아 모기가 소변 냄새를 숙주 서식지 신호로 이용하는지 평가했습니다. 숙주 신호가 없고, 열이 있으며, 소변 냄새가 있거나 없는 경우 모기가 전혀 포획되지 않았습니다(추가 파일 1: 그림 S3). 그러나 고온과 소변 냄새가 있는 경우, 암컷 말라리아 모기가 유인되어 포획되었으며, 그 수는 적었지만 소변의 숙성 기간과는 무관했습니다(χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; 추가 파일 1: 그림 S3). 대조적으로, 물을 대조군으로 사용한 경우에는 고온에서 말라리아 모기가 포획되지 않았습니다(추가 파일 1: 그림 S3).
말라리아 모기는 다른 곤충과 마찬가지로 소변(즉, 웅덩이)을 섭취하여 질소 함유 화합물을 획득하고 분배함으로써 생활사 특성을 향상시킵니다[2, 4, 24, 25, 26]. 소변은 축사, 시골집 근처의 키 큰 초목, 산란지 등 말라리아 매개체의 휴식처와 밀접하게 관련된 쉽게 구할 수 있는 재생 가능한 자원입니다. 암컷 모기는 냄새로 이 자원을 찾아내고 소변의 주요 질소 성분인 요소를 포함한 질소 화합물의 섭취를 조절할 수 있습니다[15, 16]. 암컷 모기의 생리적 상태에 따라 소변의 영양분은 숙주를 찾는 암컷 모기의 비행 활동과 생존을 향상시키고, 첫 번째 생식선 자극 호르몬 주기 동안 혈액을 섭취한 개체의 생존과 번식 특성을 향상시키는 데 사용됩니다. 따라서 소변 섭취는 영양실조에 걸린 성체와 같이 폐쇄적인 말라리아 매개체에게 중요한 영양학적 역할을 합니다[8]. 이 발견은 암컷 모기가 위험도가 낮은 섭식 활동을 통해 중요한 질소 화합물을 획득할 수 있도록 해줍니다. 이는 암컷 모기의 수명, 활동성 및 번식력을 증가시켜 매개체로서의 역할을 강화하기 때문에 역학적으로 중요한 의미를 갖습니다. 또한, 이러한 행동은 향후 매개체 관리 프로그램의 목표가 될 수 있습니다.