La adquisición y distribución de nutrientes integra la búsqueda de alimento y los rasgos del ciclo de vida de los insectos. Para compensar las deficiencias de nutrientes específicos en diferentes etapas de su vida, los insectos pueden obtenerlos mediante alimentación suplementaria, por ejemplo, alimentándose de secreciones de vertebrados en un proceso conocido como formación de charcos. El mosquito Anopheles arabiani parece estar desnutrido y, por lo tanto, requiere nutrientes tanto para el metabolismo como para la reproducción. El objetivo de este estudio fue evaluar si la agitación de An. arabiensis sobre orina de vaca para la adquisición de nutrientes mejora las características del ciclo de vida.
Asegúrese de que sea seguro.arabiensis fue atraído por el olor de la orina de vaca fresca, de 24 horas, 72 horas y 168 horas de antigüedad, y las hembras que buscaban huéspedes y las alimentadas con sangre (48 horas después de la comida de sangre) se midieron en un olfatómetro de tubo en Y, y las hembras embarazadas fueron evaluadas para la prueba de desove. Luego se utilizó un análisis químico y electrofisiológico combinado para identificar compuestos bioactivos en la orina de vaca en las cuatro clases de edad. Las mezclas sintéticas de compuestos bioactivos se evaluaron en ensayos de tubo en Y y de campo. Para investigar la orina de vaca y su principal compuesto que contiene nitrógeno, la urea, como dietas suplementarias potenciales para los vectores de la malaria, se midieron los parámetros de alimentación y las características del ciclo de vida. Se evaluó la proporción de mosquitos hembra y la cantidad de orina de vaca y urea absorbida. Después de la alimentación, se evaluó la supervivencia, el vuelo atado y la reproducción de las hembras.
Buscan la sangre y el alimento del huésped. En estudios de laboratorio y de campo, los árabes se sintieron atraídos por el olor natural y sintético de la orina de vaca fresca y añeja. Las hembras preñadas fueron indiferentes a las respuestas a la orina de vaca en los lugares de desove. Las hembras que buscan huéspedes y chupan sangre absorben activamente la orina y la urea de vaca y asignan estos recursos de acuerdo con las compensaciones de la historia de vida en función del estado fisiológico para la huida, la supervivencia o la reproducción.
Adquisición y distribución de orina de vaca por Anopheles arabinis para mejorar las características de su ciclo de vida. La alimentación suplementaria con orina de vaca afecta la capacidad vectorial directamente al aumentar la supervivencia diaria y la densidad vectorial, e indirectamente al alterar la actividad de vuelo, por lo que debería considerarse en modelos futuros.
La adquisición y distribución de nutrientes integra las características de forrajeo y ciclo de vida de los insectos [1,2,3]. Los insectos son capaces de seleccionar y adquirir alimento y realizar alimentación compensatoria en función de la disponibilidad de alimento y los requerimientos nutricionales [1, 3]. La distribución de nutrientes depende del proceso del ciclo de vida y puede dar lugar a diferentes requerimientos de calidad y cantidad de dieta en las distintas etapas del ciclo de vida de los insectos [1, 2]. Para compensar las deficiencias de nutrientes específicos, los insectos pueden obtenerlos mediante alimentación suplementaria, como en el barro, diversos excrementos y secreciones de vertebrados y carroña, un proceso conocido como charcos [2]. Aunque se describen principalmente diversas especies de mariposas y polillas, los abrevaderos también se encuentran en otros órdenes de insectos, y la atracción y alimentación en este tipo de recursos puede tener efectos significativos en la salud y otros rasgos del ciclo de vida [2, 4, 5, 6],7]. El mosquito de la malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) emerge como un adulto "malnutrido" [8], por lo que el agua puede desempeñar un papel importante. en las características de su ciclo de vida, pero este comportamiento ha sido descuidado hasta ahora. El uso de la agitación como medio para aumentar la ingesta de nutrientes en este importante vehículo merece atención, ya que esto puede tener importantes consecuencias epidemiológicas.
La ingesta de nitrógeno en los mosquitos Anopheles hembra adultos es limitada debido a las bajas reservas calóricas provenientes de la etapa larvaria y la utilización ineficiente de la sangre [9]. Las hembras de Ann. gambiae sl suelen compensar esto complementando su dieta con ingestas suplementarias de sangre [10, 11], lo que aumenta el riesgo de que las personas contraigan la enfermedad y expone a los mosquitos a un mayor riesgo de depredación. Alternativamente, los mosquitos pueden utilizar la alimentación suplementaria con excrementos de vertebrados para adquirir compuestos nitrogenados que mejoran la adaptación y la maniobrabilidad del vuelo, como lo demuestran otros insectos [2]. En este sentido, resulta interesante la fuerte y distintiva atracción de una de las especies hermanas dentro del complejo de especies An. Gambian sl, Anopheles arabinis, por la orina de vaca fresca y envejecida [12,13,14]. Anopheles arabinis es oportunista en sus preferencias de hospedador y se sabe que se asocia con el ganado y se alimenta de él. La orina de vaca es un recurso rico en compuestos nitrogenados, con la urea representando entre el 50 y el 95 % del nitrógeno total en la orina fresca. [15, 16].A medida que la orina de vaca envejece, los microorganismos utilizan estos recursos para reducir la complejidad de los compuestos nitrogenados en 24 horas [15].Con el rápido aumento del amoníaco, asociado a una disminución del nitrógeno orgánico, los microorganismos alcalófilos (muchos de los cuales producen compuestos tóxicos para los mosquitos) proliferan [15], que pueden ser hembras de Ann. arabiensis, que se sienten atraídas preferentemente por la orina envejecida 24 horas o menos [13, 14].
En este estudio, se buscaron Ans hospedadores y alimentados con sangre. Durante su primer ciclo de gonadotropina, se evaluó a arabiensis para la adquisición de compuestos nitrogenados, incluida la urea, mediante la mezcla de orina. A continuación, se realizó una serie de experimentos para evaluar cómo las mosquitas hembra asignan este recurso nutricional potencial para mejorar la supervivencia, la reproducción y la búsqueda de alimento. Finalmente, se evaluó el olor de la orina de vaca fresca y envejecida para determinar si proporcionaban pistas fiables para An hospedador y alimentado con sangre. En su búsqueda de este recurso nutricional potencial, arabiensis descubrió correlaciones químicas detrás de la atracción diferencial observada. Las mezclas de olores sintéticos de compuestos orgánicos volátiles (COV) identificados en orina envejecida durante 24 horas se evaluaron más a fondo en condiciones de campo, extendiendo los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio y demostrando el efecto del olor de la orina bovina en diferentes estados fisiológicos. Atracción de mosquitos. Los resultados obtenidos confirman que An. A. arabiensis adquiere y distribuye compuestos nitrogenados presentes en la orina de los vertebrados para influir en las características de su ciclo de vida. Estos resultados se analizan en el contexto de las posibles consecuencias epidemiológicas y cómo pueden utilizarse para la vigilancia y el control de vectores.
Anopheles arabicans (cepa Dongola) se mantuvieron a 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % HR y un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Las larvas se criaron en bandejas de plástico (20 cm × 18 cm × 7 cm) llenas de agua destilada y alimentadas con alimento para peces Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Las pupas se recolectaron en vasos de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) y luego se transfirieron a jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwán) para permitir la emergencia de los adultos. A los adultos se les proporcionó una solución de sacarosa al 10 % ad libitum hasta 4 días después de la emergencia (dpe), momento en el que a las hembras que buscaban huéspedes se les ofreció dieta inmediatamente antes del experimento, o se las dejó en ayunas durante la noche con agua destilada antes del experimento, como se describe a continuación. Las hembras utilizadas para los experimentos en tubos de vuelo fueron sometidas a ayuno durante solo 4-6 horas con agua ad libitum. Para preparar mosquitos chupadores de sangre para los bioensayos posteriores, a las hembras de 4 dpe se les proporcionó sangre de oveja desfibrótica (Håtunalab, Bro, SE) utilizando un sistema de alimentación por membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Reino Unido). Las hembras completamente congestionadas fueron luego transferidas a jaulas individuales y se les proporcionó dieta directamente, como se describe a continuación, o sacarosa al 10% ad libitum durante 3 días antes de los experimentos descritos a continuación. Estas últimas hembras fueron utilizadas para los bioensayos en tubos de vuelo y transferidas al laboratorio, y luego tuvieron agua destilada ad libitum durante 4-6 horas antes del experimento.
Se utilizaron ensayos de alimentación para cuantificar el consumo de orina y urea en hembras adultas de An.Arab. A las hembras que buscaban huéspedes y a las que se alimentaban de sangre se les proporcionó una dieta que contenía 1 % de orina de vaca fresca y envejecida diluida, varias concentraciones de urea y dos controles (10 % de sacarosa y agua) durante 48 h. Además, se añadió colorante alimentario (1 mg ml-1 de xileno cianuro FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Estocolmo, SE) a la dieta y se suministró en una matriz de 4 × 4 en tubos de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EE. UU.; Figura 1A). Llenar hasta el borde (~300 µl). Para evitar la competencia entre los mosquitos y los posibles efectos del colorante, colocar 10 mosquitos en una placa de Petri grande (12 cm de diámetro y 6 cm de altura; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) en completa oscuridad a 25 ± 2 cm °C y 65 ± 5% de humedad relativa. Estos experimentos se repitieron de 5 a 10 veces. Después de la exposición a la dieta, los mosquitos se colocaron a -20 °C hasta su posterior análisis.
Busque orina bovina y urea absorbidas por la hembra huésped y hematófaga de Anopheles arabianus. En el ensayo de alimentación (A), a las mosquitas hembra se les proporcionó una dieta que consistía en orina de vaca fresca y envejecida, varias concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O). Las hembras que buscaban huéspedes (B) y las alimentadas con sangre (C) absorbieron más sacarosa que cualquier otra dieta probada. Tenga en cuenta que las hembras que buscaban huéspedes absorbieron menos orina de vaca de 72 horas que la orina de vaca de 168 horas (B). El contenido medio total de nitrógeno (± desviación estándar) de la orina se representa en el recuadro. Las hembras que buscaban huéspedes (D, F) y las hematófagas (E, G) absorben urea de manera dosis-dependiente. Los volúmenes inhalados medios (D, E) con diferentes nombres de letras fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional utilizando el análisis post hoc de Tukey; p < 0,05). Las barras de error representan el error estándar de la media (BE). La línea recta discontinua La línea representa la línea de regresión log-lineal (F, G).
Para liberar el alimento absorbido, los mosquitos se colocaron individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contenían 230 µl de agua destilada y el tejido se rompió utilizando un mortero desechable y un motor inalámbrico (VWR International, Lund, SE), seguido de centrifugación a 10 000 rpm durante 10 min. El sobrenadante (200 µl) se transfirió a una microplaca de 96 pocillos (Sigma-Aldrich) y la absorbancia (λ620) se determinó utilizando un lector de microplacas basado en espectrofotómetro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativamente, los mosquitos se trituraron en 1 ml de agua destilada, de la cual se transfirieron 900 µl a una cubeta para análisis espectrofotométrico (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Para cuantificar la ingesta dietética, se preparó una curva estándar mediante dilución en serie para obtener 0,2 de µl a 2,4 µl de cianuro de xileno de 1 mg ml-1. Luego, se utilizó la densidad óptica de concentraciones conocidas de colorante para determinar la cantidad de alimento que ingirió cada mosquito.
Los datos de volumen se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de comparaciones por pares post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU., 1989–2007). Los análisis de regresión lineal describieron la ingesta de urea dependiente de la concentración y compararon las respuestas entre mosquitos que buscan huéspedes y mosquitos que chupan sangre (GraphPad Prism v8.0.0 para Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).
Aproximadamente 20 µl de muestras de orina de cada grupo de edad se unieron a Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) y se encapsularon en cápsulas de estaño (8 mm × 5 mm). Las cápsulas se insertaron en la cámara de combustión de un analizador CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para determinar el contenido de nitrógeno en orina fresca y envejecida según el protocolo del fabricante. El nitrógeno total (g N l-1) se cuantificó en función de concentraciones conocidas de urea utilizadas como estándar.
Para evaluar el efecto de la dieta en la supervivencia de las hembras que buscan huéspedes y se alimentan de sangre, los mosquitos se colocaron individualmente en placas de Petri grandes (12 cm de diámetro y 6 cm de altura; Semadeni) con un orificio cubierto con malla en la tapa (3 cm de diámetro) para ventilación y suministro de alimento. Las dietas se proporcionaron inmediatamente después de 4 dpe e ​​incluyeron orina de vaca fresca y envejecida diluida al 1%, cuatro concentraciones de urea y dos controles, sacarosa al 10% y agua. Cada dieta se pipeteó en un tampón dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) insertado en una jeringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gotemburgo, SE), se retiró el émbolo y se colocó encima de una placa de Petri (figura 1). 1A). Cambie su dieta todos los días. Mantenga el laboratorio como se describió anteriormente. Los mosquitos supervivientes se contaron dos veces al día, mientras que los mosquitos muertos se desecharon hasta que murió el último mosquito (n = 40 por tratamiento). La supervivencia de los mosquitos alimentados con diversas dietas fue Se realizó un análisis estadístico utilizando curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer y pruebas de log-rank para comparar la distribución de supervivencia entre las dietas (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un molino volador de mosquitos personalizado basado en Attisano et al.[17], hecho de paneles acrílicos transparentes de 5 mm de espesor (10 cm de ancho x 10 cm de largo x 10 cm de alto) sin paneles frontales ni traseros (Fig. 3: arriba). Un conjunto pivotante con un tubo vertical hecho de una columna de cromatografía de gases (0,25 mm de diámetro interno; 7,5 cm de longitud) con extremos pegados a una aguja de insecto suspendida entre un par de imanes de neodimio separados 9 cm. Un tubo horizontal hecho del mismo material (6,5 cm de longitud) dividía el tubo vertical para formar un brazo sujeto y un brazo que llevaba un pequeño trozo de papel de aluminio como señal de interrupción de luz.
Las hembras que habían estado en ayunas durante 24 horas recibieron la dieta mencionada anteriormente durante 30 minutos antes de ser sujetadas. Las mosquitas hembras completamente alimentadas fueron anestesiadas individualmente en hielo durante 2-3 minutos y sujetadas a alfileres para insectos con cera de abejas (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) y luego atadas a los brazos de los tubos horizontales. Molino volador. Las revoluciones por vuelo fueron registradas por un registrador de datos hecho a medida, luego almacenadas y mostradas usando el software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). El molino volador se colocó en una sala con clima regulado (12 h:12 h, luz: oscuridad, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % HR).
Para visualizar el patrón de actividad de vuelo, se calculó la distancia total volada (m) y el número total de actividades de vuelo consecutivas por hora durante un período de 24 horas. Además, las distancias promedio voladas por hembras individuales se compararon entre tratamientos y se analizaron utilizando ANOVA unidireccional y análisis post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), donde la distancia promedio se consideró una variable dependiente, mientras que el tratamiento es un factor independiente. Adicionalmente, el número promedio de rondas se calcula en incrementos de 10 minutos.
Para evaluar el efecto de la dieta en el rendimiento reproductivo de An. arabiensis, seis hembras (4 dpe) fueron transferidas directamente a jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) después de la extracción de sangre y luego se les proporcionó la dieta experimental durante 48 h como se describió anteriormente. Luego se retiraron las dietas y se proporcionaron copas de desove (30 ml; Nolato Hertila) llenas con 20 ml de agua destilada el tercer día durante 48 horas, cambiándolas cada 24 horas. Repita cada régimen dietético 20-50 veces. Se contaron y registraron los huevos para cada jaula experimental. Se utilizaron submuestras de huevos para evaluar el tamaño medio y la variación de longitud de los huevos individuales (n ≥ 200 por dieta) utilizando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) equipado con una cámara Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Los huevos restantes se mantuvieron en una sala con clima controlado bajo condiciones de cría estándar durante 24 h, y se midió una submuestra de larvas de primer estadio recién emergidas (n ≥ 200 por dieta), como se describió anteriormente. El número de huevos y el tamaño de los huevos y las larvas se compararon entre tratamientos y utilizando ANOVA unidireccional y análisis post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Se recolectaron compuestos volátiles del espacio de cabeza de orina fresca (1 hora después del muestreo), 24 horas, 72 horas y 168 horas de orina envejecida de muestras recolectadas de ganado Cebú, raza Arsi. Para mayor comodidad, las muestras de orina se recolectaron temprano en la mañana mientras las vacas aún estaban en el establo. Se recolectaron muestras de orina de 10 individuos y se transfirieron 100-200 ml de cada muestra a bolsas individuales de poliamida para hornear (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) en bidones de plástico de cloruro de vinilo de 3 l con tapa de poliamida. Los compuestos volátiles del espacio de cabeza de cada muestra de orina bovina se recolectaron directamente (fresca) o después de la maduración a temperatura ambiente durante 24 h, 72 h y 168 h, es decir, cada muestra de orina fue representativa de cada grupo de edad.
Para la recolección de volátiles del espacio de cabeza, se utilizó un sistema de circuito cerrado para hacer circular una corriente de gas filtrada con carbón activado (100 ml min⁻¹) a través de una bolsa de poliamida hacia la columna de adsorción durante 2,5 h mediante una bomba de vacío de diafragma (KNF Neuberger, Friburgo, Alemania). Como control, se realizó la recolección del espacio de cabeza a partir de una bolsa de poliamida vacía. La columna de adsorción estaba hecha de un tubo de teflón (5,5 cm x 3 mm de diámetro interno) que contenía 35 mg de Porapak Q (malla 50/80; Waters Associates, Milford, MA, EE. UU.) entre tapones de lana de vidrio. Antes de su uso, la columna se lavó con 1 ml de n-hexano redestilado (Merck, Darmstadt, Alemania) y 1 ml de pentano (disolvente de grado GC con una pureza del 99,0 %, Sigma Aldrich). Los volátiles adsorbidos se eluyeron con 400 μl de pentano. Las muestras del espacio de cabeza se combinaron y luego se almacenaron. a -20°C hasta su uso para análisis posteriores.
Respuestas conductuales de An en búsqueda de hospedador y alimentación de sangre. Se analizaron extractos volátiles del espacio de cabeza recolectados de orina fresca, añejada durante 24 h, 72 h y 168 h para obtener extractos volátiles de mosquitos Arabidopsis utilizando un olfatómetro de tubo de vidrio recto [18]. Los experimentos se llevaron a cabo durante ZT 13-15, el período pico de la actividad de búsqueda de hospedador de An. Arab [19]. Un olfatómetro de tubo de vidrio (80 cm × 9,5 cm id) se iluminó con 3 ± 1 lx de luz roja desde arriba. Un flujo de aire filtrado con carbón y humidificado (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % de humedad relativa) pasó por el bioensayo a 30 cm s-1. El aire pasa a través de una serie de pantallas de malla de acero inoxidable, creando un flujo laminar y una estructura de pluma uniforme. Dispensador de tampones dentales (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspendido de una bobina de 5 cm en el extremo de barlovento del olfatómetro, con cambios de estimulador cada 5 minutos. Para el análisis, se utilizaron 10 μl de cada extracto de espacio de cabeza, diluido 1:10, como estímulo. Se utilizó una cantidad igual de pentano como control. Mosquitos individuales que buscaban huéspedes o chupaban sangre se colocaron en jaulas de liberación individuales 2-3 horas antes del inicio del experimento. La jaula de liberación se colocó en el lado de sotavento del olfatómetro, y se permitió que los mosquitos se aclimataran durante 1 minuto, y luego se abrió la válvula de mariposa de la jaula para liberarlos. La atracción al tratamiento o control se analizó como la proporción de mosquitos que entraron en contacto con la fuente dentro de los 5 minutos posteriores a la liberación. Cada extracto volátil de espacio de cabeza y control se replicó al menos 30 veces, y para evitar los efectos de un solo día, se probó el mismo número de tratamientos y controles en cada día experimental. Las respuestas de búsqueda de huéspedes y alimentados con sangre Ans.Arábica versus conjuntos de espacio de cabeza se analizaron utilizando Regresión logística nominal seguida de comparaciones por pares para razones de probabilidad (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Respuesta de desove de An. Se analizaron extractos del espacio de cabeza de orina de vaca fresca y envejecida en jaulas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Vasos de plástico (30 ml; Nolato Hertila) llenos con 20 ml de agua destilada proporcionaron el sustrato de desove y se colocaron en esquinas opuestas de la jaula, a 24 cm de distancia. Los vasos de tratamiento se ajustaron con 10 μl de cada extracto del espacio de cabeza a una dilución de 1:10. Se utilizó una cantidad igual de pentano para ajustar el vaso de control. Los vasos de tratamiento y control se intercambiaron entre cada experimento para controlar los efectos de la posición. Diez hembras alimentadas con sangre se liberaron en jaulas experimentales a las ZT 9-11 y los huevos en los vasos se contaron 24 horas después. La fórmula para calcular el índice de desove es: (número de huevos puestos en el vaso de tratamiento – número de huevos puestos en el vaso de control)/(número total de huevos colocado). Cada tratamiento se repitió 8 veces.
El análisis de cromatografía de gases y detección de patrones de antena electrónica (GC-EAD) de hembras de An. arabiensis se realizó como se describió previamente [20]. En resumen, los extractos volátiles frescos del espacio de cabeza se separaron utilizando un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con una columna HP-5 (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm de espesor de película, Agilent Technologies). y orina envejecida. Se utilizó hidrógeno como fase móvil con un caudal lineal promedio de 45 cm s-1. Cada muestra (2 μl) se inyectó durante 30 segundos en modo sin división con una temperatura de entrada de 225 °C. La temperatura del horno del GC se programó de 35 °C (mantenimiento de 3 minutos) a 300 °C (mantenimiento de 10 minutos) a 10 °C min-1. En el divisor de efluente del GC, se añadieron 4 psi de nitrógeno y se dividió 1:1 en una cruz de bajo volumen muerto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) entre el detector de ionización de llama y el EAD. El capilar de efluente del GC para el EAD se pasó a través de una línea de transferencia Gerstel ODP-2, que sigue la temperatura del horno del GC más 5 °C, a un tubo de vidrio (10 cm × 8 mm), donde se mezcló con aire humidificado filtrado con carbón (1,5 l min−1). La antena se colocó a 0,5 cm de la salida del tubo. Cada mosquito individual representó una réplica, y para los mosquitos que buscan huéspedes, se realizaron al menos tres réplicas en muestras de orina de cada edad.
Identificación de compuestos bioactivos en muestras de espacio de cabeza de orina bovina fresca y envejecida mediante un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (GC-MS; 6890 GC y 5975 MS; Agilent Technologies) para obtener respuestas antenales en el análisis GC-EAD, operando en modo de ionización por impacto electrónico a 70 eV. El GC estaba equipado con una columna capilar de sílice fundida recubierta con HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 μm de espesor de película) utilizando helio como fase móvil con un caudal lineal promedio de 35 cm s-1. Se inyectó una muestra de 2 μl utilizando los mismos ajustes del inyector y la misma temperatura del horno que para el análisis GC-EAD. Los compuestos se identificaron en función de su tiempo de retención (índice de Kovát) y espectros de masas comparados con la biblioteca personalizada y la biblioteca NIST14 (Agilent). Los compuestos identificados se confirmaron mediante la inyección de estándares auténticos (Archivo adicional 1: Tabla S2). Para la cuantificación, se inyectó acetato de heptilo (10 ng, 99,8 % de pureza química, Aldrich) como estándar externo.
Evaluar la eficacia de una mezcla de olores sintéticos compuesta por compuestos bioactivos identificados en orina fresca y envejecida para atraer a Ans. arabiensis que buscan huéspedes y se alimentan de sangre, utilizando el mismo olfatómetro y protocolo que se describió anteriormente. Las mezclas sintéticas imitaron la composición y las proporciones de los compuestos en los extractos volátiles del espacio de cabeza mixto de orina fresca, envejecida durante 24, 48, 72 y 168 horas (Figura 5D-G; Archivo adicional 1: Tabla S2). Para el análisis, utilice 10 μl de una dilución 1:100 de la mezcla totalmente sintética, con una tasa de liberación general que oscila entre aproximadamente 140 y 2400 ng h-1, para evaluar el atractivo para los mosquitos huéspedes y hematófagos. Posteriormente, la prueba se realiza en mezclas completas, en las que se eliminan las mezclas sustractivas de compuestos individuales de la mezcla completa. Las respuestas de búsqueda de Ans. Arabis huéspedes y alimentados con sangre frente a las mezclas sintéticas y sustractivas se analizaron utilizando un modelo logístico nominal. regresión seguida de comparaciones por pares para razones de probabilidad (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Para evaluar si la orina de vaca podría servir como señal de hábitat para los mosquitos de la malaria, se colocó orina de vaca fresca y envejecida, recolectada como se describió anteriormente, y agua en cubos de malla de 3 l (100 ml) y se colocaron en trampas de cebo para huéspedes. (Versión BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Se colocaron diez trampas a 50 m de distancia en un pastizal, a 400 m de la comunidad del pueblo (Silay, Etiopía, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) y sin ganado, en terrenos de cría permanentes y pueblos. Cinco trampas se calentaron para simular la presencia de un huésped, mientras que cinco trampas se dejaron sin calentar. Cada ubicación de tratamiento se rota cada noche durante un total de cinco noches. El número de mosquitos capturados en trampas cebadas con orina de diferentes edades se comparó utilizando regresión logística con una distribución beta binomial (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
En una aldea endémica de malaria cerca de la ciudad de Maki, región de Oromia, Etiopía (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). El estudio se llevó a cabo entre mediados de agosto y mediados de septiembre antes de la fumigación residual anual en interiores, junto con una larga temporada de lluvias. Se seleccionaron cinco pares de casas (separadas entre 20 y 50 m) ubicadas en las afueras de la aldea para el estudio (Fig. 6A). Los criterios utilizados para seleccionar las casas fueron: no se permitían animales en la casa, no se permitía cocinar en el interior (con leña o carbón) (al menos durante el período de prueba) y casas con un máximo de dos habitantes, durmiendo en habitaciones sin insecticidas. bajo la red antimosquitos tratada. La aprobación ética fue otorgada por la Junta de Revisión de Ética de Investigación Institucional (IRB/022/2016) de la Facultad de Ciencias Naturales (CNS-IRB), Universidad de Addis Abeba, de acuerdo con las directrices establecidas por la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. Se obtuvo el consentimiento de cada jefe de familia con la asistencia del personal de extensión de salud. Todo el proceso está respaldado por las administraciones locales a nivel de distrito y barrio ('kebele'). El diseño experimental siguió un diseño de cuadrado latino 2 × 2, en el que las mezclas sintéticas y los controles se asignaron a casas emparejadas en la primera noche y se intercambiaron entre casas en la siguiente noche experimental. Este proceso se repitió diez veces. Además, para estimar la actividad de los mosquitos en casas seleccionadas, las trampas CDC se colocaron para funcionar durante cinco noches consecutivas al principio, a la mitad y al final del ensayo de campo a la misma hora del día.
Una mezcla sintética que contenía seis compuestos bioactivos se disolvió en heptano (97,0 % de solvente grado GC, Sigma Aldrich) y se liberó a 140 ng h-1 utilizando un dispensador de mecha de algodón [20]. El dispensador de mecha permitió que todos los compuestos se liberaran en proporciones constantes durante el experimento de 12 horas. Se utilizó heptano como control. El vial se suspendió junto al punto de entrada de la trampa de luz de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, EE. UU.; Figura 6A). Las trampas se colgaron a 0,8-1 m del suelo, cerca de los pies de la cama, y ​​un voluntario durmió bajo un mosquitero sin tratar y se operaron entre las 18:00 y las 06:30. Los mosquitos capturados por sexo y estado fisiológico (sin alimentar, alimentados, semipreñados y preñados [21]) se analizaron posteriormente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar la especie identificada morfológicamente como A. gambiae. sl. Miembros del complejo [23]. En el estudio de campo, el trampeo de casas emparejadas se analizó utilizando un modelo de ajuste logístico nominal, donde la atracción fue la variable dependiente y el tratamiento (mezcla sintética vs. control) fue el efecto fijo (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Aquí, informamos los valores χ2 y p de la prueba de razón de verosimilitud.
Evaluar si es seguro. arabiensis pudo obtener orina, su principal fuente de nitrógeno, urea, mediante alimentación directa, dentro de las 48 h de administración durante 4 días después (dpe) de los ensayos de alimentación de hembras que buscaban huéspedes y se alimentaban de sangre (Fig. 1A). Tanto las hembras que buscaban huéspedes como las que se alimentaban de sangre absorbieron significativamente más sacarosa que cualquier otra dieta o agua (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 y F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectivamente; Fig. 1B,C). Además, las hembras que buscaban huéspedes comieron menos en la orina a las 72 horas en comparación con la orina a las 168 horas (Fig. 1B). Cuando se les ofreció una dieta que contenía urea, las hembras que buscaban huéspedes absorbieron una cantidad significativamente mayor de urea a 2,69 mM en comparación con todas las demás concentraciones y el agua, mientras que fue indistinguible de la sacarosa al 10%. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Esto contrastó con la respuesta de las hembras alimentadas con sangre, que típicamente absorbieron significativamente más dietas que contenían urea que agua, aunque significativamente menos que 10% de sacarosa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1E). Además, al comparar entre los dos estados fisiológicos, las hembras flebotomizadas absorbieron más urea que las hembras que buscaban huéspedes en las concentraciones más bajas, y estas hembras absorbieron cantidades similares de urea en concentraciones más altas (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Si bien la ingesta de una dieta que contenía urea pareció tener valores óptimos (Fig. 1D, E), las hembras en ambos estados fisiológicos pudieron modular la cantidad de urea absorbida en todo el rango de concentraciones de urea de forma logarítmica lineal (Fig. 1F,G). De manera similar, los mosquitos parecen controlar su absorción de nitrógeno regulando la cantidad de orina absorbida, ya que la cantidad de nitrógeno en la orina se refleja en la cantidad absorbida (Figura 1B, C y recuadros B).
Para evaluar los efectos de la orina y la urea en la supervivencia de los mosquitos que buscan huéspedes y se alimentan de sangre, se alimentó a las hembras con orina de las cuatro edades (fresca, 24 h, 72 h y 168 h después de la deposición) y un rango de concentraciones de urea, así como agua destilada y sacarosa al 10 % como control (Figura 2A). Este análisis de supervivencia mostró que la dieta tuvo un efecto significativo en la supervivencia general en las hembras que buscan huéspedes (orina: χ2 = 108,5, gl = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, gl = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) y en las hembras alimentadas con sangre (orina: χ2 = 93,0, gl = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, gl = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). En todos los experimentos, las hembras alimentadas con una dieta de orina, urea y agua tuvieron tasas de supervivencia significativamente más bajas en comparación con las hembras alimentadas con una dieta de sacarosa (Figura 2B-E). Las hembras que buscaban huéspedes alimentadas con orina fresca y orina rancia exhibieron diferentes tasas de supervivencia, siendo las alimentadas con orina rancia de 72 h (p = 0,016) las que tuvieron la menor probabilidad de supervivencia (Fig. 2B). Además, las hembras que buscaban huéspedes alimentadas con urea de 135 mM sobrevivieron más tiempo que los controles de agua (p < 0,04) (Fig. 2C). En comparación con el agua, las mujeres alimentadas con orina fresca y orina de 24 horas sobrevivieron más tiempo (p = 0,001 y p = 0,012, respectivamente; Figura 2D), mientras que las mujeres alimentadas con orina de 72 horas sobrevivieron más tiempo que las alimentadas con orina fresca corta de hembra y orina envejecida de 24 horas (p < 0,0001 y p = 0,013, respectivamente; Figura 2D). Cuando se les administró urea a 135 mM, las hembras alimentadas con sangre sobrevivieron más tiempo que todas las demás concentraciones de urea y agua (p < 0,013; Figura 2E).
Supervivencia de mosquitos Anopheles arabinis hembra, tanto hospedadores como hematófagos, alimentados con orina de vaca y urea. En el bioensayo (A), se proporcionó a mosquitos hembra una dieta compuesta de orina de vaca fresca y envejecida, diversas concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O). Se registró la supervivencia de los mosquitos hospedadores (B, C) y hematófagos (D, E) cada 12 horas hasta que todas las hembras alimentadas con orina (B, D) y urea (C, E), y los controles (sacarosa y agua), murieron.
La distancia total y el número de rondas determinadas en la prueba del molino de vuelo durante un período de 24 horas difirieron entre los mosquitos que buscan huéspedes y los que chupan sangre, que mostraron menos actividad de vuelo en general (Fig. 3). Los mosquitos que buscan huéspedes que proporcionaron orina fresca y envejecida o sacarosa y agua mostraron patrones de vuelo distintos (Fig. 3), con las hembras que se alimentaban de orina fresca siendo más activas al amanecer, mientras que las que se alimentaban de orina envejecida durante 24 y 168 horas Los mosquitos que se alimentaban de orina exhibieron diferentes patrones de vuelo y fueron principalmente diurnos. Las mosquitas que proporcionaron sacarosa u orina de 72 horas mostraron actividad durante todo el período de 24 horas, mientras que las hembras que proporcionaron agua fueron más activas durante el período medio. Los mosquitos alimentados con sacarosa exhibieron los niveles más altos de actividad a altas horas de la noche y temprano en la mañana, mientras que aquellos que ingirieron orina envejecida durante 72 horas experimentaron una disminución constante en la actividad durante 24 horas (Figura 3).
Rendimiento de vuelo de hembras de Anopheles arabinis hematófagas que buscan alimento y se alimentan de orina de vaca y urea. En la prueba del molino de vuelo, mosquitos hembra alimentados con orina de vaca fresca y envejecida, diversas concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O) se sujetaron a brazos horizontales que giraban libremente (arriba). Para las hembras que buscan huésped (izquierda) y las hematófagas (derecha), se registró la distancia total y el número de vuelos por hora para cada dieta durante un período de 24 horas (oscuro: gris; claro: blanco). La distancia promedio y el número promedio de vuelos se muestran a la derecha del gráfico de actividad circadiana. Las barras de error representan el error estándar de la media. Análisis estadístico: ver texto
En general, la actividad de vuelo general de las hembras que buscan huéspedes siguió un patrón similar al de la distancia de vuelo durante un período de 24 horas. La distancia media de vuelo se vio afectada significativamente por la dieta ingerida (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), y las hembras que buscan huéspedes ingirieron 72 horas de orina volaron distancias significativamente más largas en comparación con todas las demás dietas (p < 0,0001), y los mosquitos alimentados con sacarosa volaron más lejos que los mosquitos alimentados con orina fresca (p = 0,022) y orina envejecida durante 24 h (p = 0,022). En contraste con el patrón de actividad de vuelo descrito por la dieta de orina, las hembras que buscan huéspedes alimentadas con urea exhibieron una actividad de vuelo persistente durante un período de 24 h, alcanzando su punto máximo durante la segunda mitad de la fase oscura (Fig. 3). Aunque los patrones de actividad fueron similares, las hembras que buscan huéspedes alimentadas con urea aumentaron significativamente la distancia media de vuelo dependiendo de la concentración absorbida (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Las hembras que buscaban huéspedes y que fueron alimentadas con cualquier concentración de urea volaron durante más tiempo que las hembras alimentadas con agua o sacarosa (p < 0,03).
La actividad de vuelo general de los mosquitos chupadores de sangre fue estable y sostenida durante 24 horas en todas las dietas, con una mayor actividad de orina durante la segunda mitad del período oscuro para las hembras alimentadas con agua, así como en las hembras alimentadas con orina fresca y de 24 horas de antigüedad (imagen 3). Mientras que la dieta de orina afectó significativamente la distancia media de vuelo en las hembras alimentadas con sangre (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), la dieta de urea no lo hizo (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) con otras dietas de orina y de control (fresca, p = 0,0091; 72 horas, p = 0,0022; 168 horas, p = 0,001; sacarosa, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Los efectos de la alimentación con orina y urea sobre los parámetros reproductivos se evaluaron en bioensayos de puesta de huevos (Figura 4A) y se investigaron según el número de huevos puestos por cada hembra, el tamaño del huevo y las larvas de primer estadio recién eclosionadas. El número de huevos puestos. Las hembras árabes alimentadas con orina variaron según la dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Las hembras alimentadas con una comida de sangre y orina de 24 horas pusieron significativamente más huevos que las hembras alimentadas con otras dietas de orina y fueron similares a las alimentadas con sacarosa (Fig. 4B). Asimismo, el tamaño de los huevos puestos por las hembras alimentadas con orina varió según la dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), con las hembras alimentadas con orina de 24 horas y sacarosa poniendo huevos significativamente más grandes que las hembras alimentadas con agua, mientras que los huevos de las hembras alimentadas con 168 h de orina fueron significativamente más pequeños (Fig. 4C). Además, la dieta de orina afectó significativamente el tamaño de las larvas (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), con larvas significativamente más grandes emergiendo de los huevos puestos por hembras alimentadas con orina de 24 y 72 horas de edad que de los huevos puestos por hembras alimentadas con agua y alimentadas con orina de 168 horas (Figura 4D).
Rendimiento reproductivo de hembras de Anopheles arabinis alimentadas con orina de vaca y urea. Mosquitos hembra alimentados con sangre fueron alimentados con dietas que consistían en orina de vaca fresca y envejecida, diversas concentraciones de urea, sacarosa (10%) y agua destilada (H2O) durante 48 horas antes de ser colocados en bioensayos y obtener sustratos para la puesta de huevos (A). El número de huevos (B, E), el tamaño de los huevos (C, F) y el tamaño de las larvas (D, G) se vieron significativamente afectados por la dieta proporcionada (orina de vaca: BD; urea: EG). Las medias para cada parámetro medido usando diferentes nombres de letras fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey; p < 0,05). Las barras de error representan el error estándar de la media.
Como principal componente nitrogenado de la orina, la urea, cuando se proporciona como dieta a hembras alimentadas con sangre, afectó significativamente los parámetros reproductivos en todos los estudios. El número de huevos puestos por las hembras alimentadas con urea, después de una comida de sangre, dependiendo de la concentración de urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), las hembras alimentadas con concentraciones de urea entre 134 µM y 1,34 mM pusieron más huevos ( Figura 4E). Las hembras alimentadas con concentraciones de urea de 134 µM o más pusieron huevos más grandes que las hembras alimentadas con agua (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), y el tamaño larval, aunque afectado por concentraciones similares de urea en las madres (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) fue más variable (Fig. 4G).
Atracción general a los extractos volátiles del espacio de cabeza de orina bovina en busca de hospedadores. La arabiensis evaluada en el olfatómetro de tubo de vidrio (Fig. 5A) se vio significativamente afectada por la edad de la orina (χ2 = 15.9, gl = 4, p = 0.0032; Fig. 5B). El análisis post hoc mostró que el olor a orina rancia a las 24 horas causó niveles de atracción significativamente más altos en comparación con todos los demás tratamientos (72 horas: p = 0.0060, 168 horas: p = 0.012, pentano: p = 0.00070), excepto por el olor a orina fresca (p = 0.13; Figura 5B). Aunque la atracción general de los mosquitos chupadores de sangre al olor a orina no fue significativamente diferente (χ2 = 8.78, gl = 4, p = 0.067; Fig. 5C), se encontró que estas hembras eran significativamente más atractivas a los extractos volátiles del espacio de cabeza en comparación con las orinas de 72 horas de antigüedad. orina en comparación con los controles (p = 0,0066; Figura 5C).
Respuestas conductuales a olores de orina de vaca naturales y sintéticos en la búsqueda de mosquitos Anopheles arabianus huéspedes y alimentados con sangre. Esquema del olfatómetro de tubo de vidrio (A). Atracción de extractos volátiles del espacio de cabeza de orina de vaca fresca y envejecida hacia mosquitos huéspedes (B) y chupadores de sangre (C). Encontrar la reacción de tentáculos del Lord An. Se muestran extractos del espacio de cabeza aislados de orina de vaca fresca (D), envejecida durante 24 horas (E), 72 horas (F) y 168 horas (G). Las trazas de detección de antena electrónica (EAD) muestran cambios de voltaje en respuesta a compuestos bioactivos en el espacio de cabeza eluidos del cromatógrafo de gases y detectados por un detector de ionización de llama (FID). La barra de escala representa la amplitud de respuesta (mV) frente al tiempo de retención (s). Se muestran las propiedades y las tasas de liberación (µg h-1) de los compuestos biológicamente activos. Un solo asterisco (*) indica una respuesta consistente de baja amplitud. Los asteriscos dobles (**) indican una respuesta no reproducible. respuestas.Encuentre el huésped (H) y el chupador de sangre (I). An. arabiensis tiene diferentes atractivos para mezclas sintéticas de olores de orina de vaca fresca y añeja. Las proporciones medias de mosquitos atraídos por diferentes nombres de letras fueron significativamente diferentes entre sí (ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey; p < 0,05). Las barras de error representan el error estándar de la escala.
Hembras de Ann. arabiensis, 72 h y 120 h después de la ingesta de sangre, durante el desove, no mostraron preferencia por los extractos volátiles del espacio de cabeza de orina de vaca fresca y envejecida en comparación con los controles de pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; Archivo adicional 1: Fig. S1).
Para las hembras de Ann. arabiensis, los análisis GC-EAD y GC-MS identificaron ocho, seis, tres y tres compuestos bioactivos (Figura 5D-G). Aunque se observaron diferencias en el número de compuestos que provocaron respuestas electrofisiológicas, la mayoría de estos compuestos estaban presentes en cada extracto volátil del espacio de cabeza recolectado de orina fresca y envejecida. Por lo tanto, para cada extracto, solo se incluyeron en análisis posteriores los compuestos que produjeron una respuesta fisiológica de las antenas de las hembras por encima del umbral.
La tasa total de liberación volátil de compuestos bioactivos en la recolección del espacio de cabeza aumentó de 29 µg h-1 en orina fresca a 242 µg h-1 en orina envejecida durante 168 horas, principalmente debido a los aumentos de p-cresol y m-formaldehído. Por el contrario, las tasas de liberación de otros compuestos, como 2-ciclohexen-1-ona y decanal, disminuyeron con el aumento de la edad de la orina, lo que se correlacionó con la disminución observada en la intensidad de la señal (abundancia) en el cromatograma (Fig. 5D-G panel izquierdo) y las respuestas fisiológicas a estos compuestos (Fig. 5D-G panel derecho).
En general, la mezcla sintética tenía una proporción natural similar de compuestos bioactivos identificados en extractos volátiles de espacios de cabeza de orina fresca y envejecida (Fig. 5D–G) y no pareció generar un atractivo significativo en la búsqueda de un huésped (χ2 = 8,15, gl = 4, p = 0,083; Fig. 5H) o mosquitos chupadores de sangre (χ2 = 4,91, gl = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Sin embargo, las comparaciones por pares post hoc entre tratamientos mostraron que los mosquitos que buscan huéspedes fueron significativamente atractivos para la mezcla sintética de orina envejecida durante 24 h en comparación con los controles de pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Para evaluar el papel de los componentes individuales en mezclas sintéticas de orina envejecida durante 24 h, se evaluaron seis mezclas sustractivas frente a mezclas completas en el ensayo de tubo en Y, en el que se eliminaron compuestos individuales. Para los mosquitos que buscan huéspedes, la sustracción de compuestos individuales de la mezcla completa tuvo un efecto significativo en las respuestas conductuales (χ2 = 19,63, gl = 6, p = 0,0032; Archivo adicional 1: Figura S2A), todas las mezclas sustractivas fueron más atractivas que la mezcla completa. Por el contrario, la eliminación de compuestos individuales de la mezcla totalmente sintética no afectó las respuestas conductuales de los mosquitos chupadores de sangre (χ2 = 11,38, gl = 6, p = 0,077), con la excepción del decanal, que resultó en niveles más bajos en comparación con la mezcla completa (p = 0,022; Archivo adicional 1: Figura S2B).
En una aldea endémica de malaria en Etiopía, se evaluó la eficacia de una mezcla sintética de orina de vaca de 24 horas para atraer mosquitos en condiciones de campo durante diez noches (Fig. 6A). Se capturaron e identificaron un total de 4861 mosquitos, de los cuales el 45,7% eran Anthropus gambiae sl, el 18,9% eran Anopheles pharoensis y el 35,4% eran Culex spp. (Archivo adicional 1: Tabla S1). Anopheles arabinis es el único miembro del complejo de especies An. Gambian identificado mediante análisis de PCR. En promedio, se capturaron 320 mosquitos por noche, durante cuyo tiempo las trampas con cebos de mezcla sintética capturaron más mosquitos que las trampas emparejadas sin mezcla (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Se colocaron trampas sin cebo en cada una de las cinco noches de control al principio, a la mitad y al final del ensayo. Números similares Se capturaron mosquitos en cada par de trampas, lo que indica que no hubo sesgo entre las casas (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) y que no hubo disminución de la población durante el período de estudio. En comparación con las trampas de control, el número de mosquitos capturados en las trampas que contenían la mezcla sintética aumentó significativamente: búsqueda de huéspedes (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), alimentación reciente de sangre (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) y embarazo (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Archivo adicional 1: Tabla S1). Esto también se refleja en el número total de mosquitos capturados: búsqueda de huéspedes > chupadores de sangre > embarazo > semipreñados > machos.
Evaluación de campo de la eficacia de una mezcla sintética de olor a orina de vaca de 24 horas. Se realizaron ensayos de campo en el centro-sur de Etiopía (mapa), cerca de la ciudad de Maki (recuadro), utilizando una trampa de luz de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) (derecha) en casas emparejadas, con un diseño de cuadrado latino (imagen aérea) (A). Las fototrampas CDC con cebo de olor sintético atraen y capturan hembras de Anopheles arabesques (B), pero no de Anopheles farroes (C), de una manera diferente, un efecto dependiente del estado fisiológico. Además, estas trampas capturaron un número significativamente mayor de mosquitos Culex hospedadores. (D) Comparado con el control. Las barras de la izquierda representan el índice de selección promedio de mosquitos capturados en pares de trampas con cebo de olor (verde) y de control (abiertas) (N = 10), mientras que las barras de la derecha representan el índice de selección promedio en pares de trampas de control (abiertas; N = 5). Los asteriscos indican niveles de significación estadística (*p = 0,01 y ***p < 0,0001).
Las tres especies fueron capturadas de manera diferente en trampas que contenían mezclas sintéticas. Buscando huéspedes (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), alimentación de sangre (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) y embarazo (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) a .arabiensis fue atrapado en la trampa que liberaba la mezcla sintética (Fig. 6B), mientras que la cantidad de An no difirió. Pharoensis en diferentes estados fisiológicos fueron encontrados (Fig. 6C). Para Culex, solo se encontró un aumento significativo en el número de mosquitos que buscaban huéspedes en trampas cebadas con la mezcla sintética (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; Fig. 6D), en comparación con las trampas de control.
Se utilizaron trampas de cebo para huéspedes ubicadas fuera de los huéspedes potenciales entre los sitios de reproducción y las comunidades rurales en Etiopía para evaluar si los mosquitos de la malaria usan el olor a orina de vaca como señal de hábitat del huésped. En ausencia de señales de huésped, calor y con o sin la presencia de olor a orina de vaca, no se capturaron mosquitos (Archivo adicional 1: Figura S3). Sin embargo, en presencia de alta temperatura y olor a orina de vaca, los mosquitos hembra de la malaria fueron atraídos y capturados, aunque en pequeñas cantidades, independientemente de la antigüedad de la orina (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; Archivo adicional 1: Figura S3). Por el contrario, los controles de agua no capturaron mosquitos de la malaria a altas temperaturas (Archivo adicional 1: Figura S3).
Los mosquitos de la malaria adquieren y distribuyen compuestos nitrogenados mediante la alimentación compensatoria con orina de vaca (es decir, charcos) para mejorar rasgos de su ciclo vital, de forma similar a otros insectos [2, 4, 24, 25, 26]. La orina de vaca es un recurso renovable fácilmente disponible, estrechamente asociado con los lugares de descanso de los vectores de la malaria, como establos y vegetación alta cerca de viviendas rurales y lugares de desove. Las mosquitas hembra localizan este recurso por el olfato y pueden regular la absorción de compuestos nitrogenados en la orina, incluida la urea, el principal componente nitrogenado de la misma [15, 16]. Dependiendo del estado fisiológico de la mosquita hembra, los nutrientes de la orina se asignan para mejorar la actividad de vuelo y la supervivencia de las mosquitas hembra que buscan huéspedes, así como la supervivencia y las características reproductivas de los individuos alimentados con sangre durante el primer ciclo gonadotrópico. Por lo tanto, la mezcla de orina desempeña un papel nutricional importante para los vectores de la malaria que están cerrados, como los adultos desnutridos [8], ya que proporciona a las mosquitas hembra la capacidad de adquirir importantes compuestos nitrogenados mediante una alimentación de bajo riesgo. Este hallazgo ha Consecuencias epidemiológicas significativas, ya que las hembras aumentan su esperanza de vida, actividad y producción reproductiva, factores que afectan la capacidad del vector. Además, este comportamiento puede ser el objetivo de futuros programas de control de vectores.