การได้รับและการกระจายสารอาหารเป็นการผสมผสานระหว่างพฤติกรรมการหาอาหารและลักษณะทางชีวประวัติของแมลง เพื่อชดเชยการขาดแคลนสารอาหารเฉพาะในระยะต่างๆ ของชีวิต แมลงสามารถได้รับสารอาหารเหล่านี้ผ่านการกินอาหารเสริม เช่น การกินสารคัดหลั่งจากสัตว์มีกระดูกสันหลังในกระบวนการที่เรียกว่าการกินปัสสาวะ ยุง Anopheles arabiani ดูเหมือนจะขาดสารอาหาร ดังนั้นจึงต้องการสารอาหารทั้งสำหรับการเผาผลาญและการสืบพันธุ์ จุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อประเมินว่าการที่ยุง An. arabiensis คุ้ยเขี่ยปัสสาวะวัวเพื่อรับสารอาหารจะช่วยปรับปรุงลักษณะทางชีวประวัติหรือไม่
ตรวจสอบให้แน่ใจว่าปลอดภัย ยุงลาย Aus arabiensis ถูกดึงดูดด้วยกลิ่นของปัสสาวะวัวสด ปัสสาวะวัวอายุ 24 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมง และยุงตัวเมียที่กำลังหาอาหารหรือดูดเลือด (48 ชั่วโมงหลังดูดเลือด) ถูกวัดด้วยเครื่องวัดกลิ่นแบบ Y-tube และยุงตัวเมียที่ตั้งท้องถูกประเมินเพื่อทดสอบการวางไข่ จากนั้นจึงใช้การวิเคราะห์ทางเคมีและทางไฟฟ้าสรีรวิทยาแบบผสมผสานเพื่อระบุสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพในปัสสาวะวัวในทุกช่วงอายุทั้งสี่ช่วง มีการประเมินส่วนผสมสังเคราะห์ของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพใน Y-tube และการทดลองภาคสนาม เพื่อตรวจสอบปัสสาวะวัวและยูเรียซึ่งเป็นสารประกอบหลักที่มีไนโตรเจนเป็นส่วนประกอบ ในฐานะอาหารเสริมที่มีศักยภาพสำหรับยุงพาหะนำโรคมาลาเรีย จึงได้ทำการวัดพารามิเตอร์การกินอาหารและลักษณะทางชีวประวัติ มีการประเมินสัดส่วนของยุงตัวเมียและปริมาณปัสสาวะวัวและยูเรียที่ถูกดูดซึม หลังจากกินอาหารแล้ว ยุงตัวเมียถูกประเมินการอยู่รอด การบิน และการสืบพันธุ์
พวกมันแสวงหาเลือดและอาหารจากโฮสต์ ในการศึกษาในห้องปฏิบัติการและภาคสนาม พบว่าปลาอาหรับถูกดึงดูดด้วยกลิ่นธรรมชาติและกลิ่นสังเคราะห์ของปัสสาวะวัวสดและเก่า ปลาตัวเมียที่ตั้งท้องไม่แสดงปฏิกิริยาต่อปัสสาวะวัวในแหล่งวางไข่ ปลาตัวเมียที่แสวงหาโฮสต์และดูดเลือดจะดูดซับปัสสาวะวัวและยูเรียอย่างแข็งขัน และจัดสรรทรัพยากรเหล่านี้ตามความสมดุลของวงจรชีวิตตามสภาวะทางสรีรวิทยาเพื่อการบิน การอยู่รอด หรือการสืบพันธุ์
การรับและกระจายปัสสาวะวัวของยุง Anopheles arabinis เพื่อปรับปรุงลักษณะทางชีวประวัติ การให้อาหารเสริมด้วยปัสสาวะวัวส่งผลต่อความสามารถในการเป็นพาหะโดยตรงโดยการเพิ่มอัตราการรอดชีวิตรายวันและความหนาแน่นของพาหะ และส่งผลทางอ้อมโดยการเปลี่ยนแปลงกิจกรรมการบิน ดังนั้นจึงควรพิจารณาในแบบจำลองในอนาคต
การได้รับและการกระจายสารอาหารเป็นการบูรณาการลักษณะการหาอาหารและวงจรชีวิตของแมลง [1,2,3] แมลงสามารถเลือกและหาอาหารและทำการให้อาหารชดเชยตามความพร้อมของอาหารและความต้องการสารอาหาร [1, 3] การกระจายสารอาหารขึ้นอยู่กับกระบวนการวงจรชีวิตและอาจนำไปสู่ความต้องการคุณภาพและปริมาณอาหารที่แตกต่างกันในแต่ละช่วงชีวิตของแมลง [1, 2] เพื่อชดเชยการขาดแคลนสารอาหารเฉพาะ แมลงสามารถได้รับสารอาหารเหล่านี้ผ่านการกินอาหารเสริม เช่น โคลน มูลและสารคัดหลั่งต่างๆ ของสัตว์มีกระดูกสันหลัง และซากสัตว์ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่าแอ่งน้ำ [2] แม้ว่าจะมีการอธิบายถึงผีเสื้อและผีเสื้อกลางคืนหลายชนิดเป็นหลัก แต่แอ่งน้ำก็พบได้ในแมลงอันดับอื่นๆ ด้วย และการดึงดูดและการกินอาหารจากแหล่งน้ำเหล่านี้สามารถส่งผลกระทบอย่างมากต่อสุขภาพและลักษณะวงจรชีวิตอื่นๆ [2, 4, 5, 6, 7] ยุงมาลาเรีย Anopheles gambiae sensu lato (sl) ปรากฏขึ้นเป็น ผู้ใหญ่ที่ 'ขาดสารอาหาร' [8] ดังนั้นการให้น้ำอาจมีบทบาทสำคัญในลักษณะประวัติชีวิต แต่พฤติกรรมนี้ถูกละเลยมาจนถึงปัจจุบัน การใช้การกวนเป็นวิธีการเพิ่มปริมาณสารอาหารในยานพาหนะที่สำคัญนี้สมควรได้รับความสนใจ เนื่องจากอาจมีผลทางระบาดวิทยาที่สำคัญ
การรับไนโตรเจนในยุงตัวเมีย Anopheles ที่โตเต็มวัยนั้นมีจำกัดเนื่องจากมีแคลอรีสำรองต่ำที่สะสมมาจากระยะตัวอ่อนและการใช้เลือดเป็นอาหารที่ไม่ eficiente [9] ยุงตัวเมีย Ann.gambiae sl มักจะชดเชยสิ่งนี้โดยการเสริมด้วยการกินเลือดเพิ่มเติม [10, 11] ซึ่งทำให้ผู้คนมีความเสี่ยงต่อการติดเชื้อโรคมากขึ้นและทำให้ยุงมีความเสี่ยงต่อการถูกล่ามากขึ้น ในทางกลับกัน ยุงสามารถใช้การกินมูลสัตว์มีกระดูกสันหลังเป็นอาหารเสริมเพื่อรับสารประกอบไนโตรเจนที่ช่วยเพิ่มการปรับตัวและความคล่องตัวในการบิน ดังที่แสดงให้เห็นโดยแมลงชนิดอื่น [2] ในเรื่องนี้ ความดึงดูดที่แข็งแกร่งและชัดเจนของหนึ่งในสายพันธุ์พี่น้องภายในกลุ่มสายพันธุ์ An.Gambiae sl คือ Anopheles arabinis ต่อปัสสาวะวัวสดและเก่า [12,13,14] นั้นน่าสนใจ Anopheles arabinis มีพฤติกรรมเลือกโฮสต์แบบฉวยโอกาสและเป็นที่ทราบกันดีว่ามักเกี่ยวข้องและกินเลือดวัว ปัสสาวะวัวเป็นแหล่งทรัพยากรที่อุดมไปด้วยสารประกอบไนโตรเจน โดยมียูเรียเป็นส่วนประกอบหลัก 50-95% ของไนโตรเจนทั้งหมดในปัสสาวะสด [15, 16] เมื่อปัสสาวะของวัวมีอายุมากขึ้น จุลินทรีย์จะใช้ทรัพยากรเหล่านี้เพื่อลดความซับซ้อนของสารประกอบไนโตรเจนภายใน 24 ชั่วโมง [15] ด้วยการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของแอมโมเนีย ซึ่งสัมพันธ์กับการลดลงของไนโตรเจนอินทรีย์ จุลินทรีย์ที่ชอบด่าง (ซึ่งหลายชนิดผลิตสารประกอบที่เป็นพิษต่อยุง) จะเจริญเติบโต [15] ซึ่งอาจเป็นยุงตัวเมีย Ann.arabiensis ที่ถูกดึงดูดให้มาหาปัสสาวะที่มีอายุ 24 ชั่วโมงหรือน้อยกว่าเป็นพิเศษ [13, 14]
ในการศึกษาครั้งนี้ ได้มีการค้นหายุง Anopheles ที่กินเลือดและยุงที่อาศัยโฮสต์ ในช่วงวงจรโกนาโดโทรปินรอบแรก ยุง Anopheles arabiensis ได้รับการประเมินการดูดซึมสารประกอบไนโตรเจน รวมถึงยูเรีย โดยการผสมปัสสาวะ ต่อมา ได้มีการทดลองหลายชุดเพื่อประเมินว่ายุงตัวเมียจัดสรรทรัพยากรสารอาหารที่มีศักยภาพนี้อย่างไรเพื่อเพิ่มโอกาสในการอยู่รอด การสืบพันธุ์ และการหาอาหารต่อไป สุดท้าย ได้มีการประเมินกลิ่นของปัสสาวะวัวสดและปัสสาวะวัวที่เก็บไว้นาน เพื่อตรวจสอบว่ากลิ่นเหล่านี้ให้เบาะแสที่เชื่อถือได้สำหรับยุง Anopheles ที่กินเลือดและยุงที่อาศัยโฮสต์หรือไม่ ในการค้นหาแหล่งอาหารที่มีศักยภาพนี้ ยุง Anopheles arabiensis ได้ค้นพบความสัมพันธ์ทางเคมีที่อยู่เบื้องหลังความดึงดูดที่แตกต่างกันที่สังเกตได้ ส่วนผสมของกลิ่นสังเคราะห์ของสารประกอบอินทรีย์ระเหยง่าย (VOCs) ที่ระบุในปัสสาวะที่เก็บไว้นาน 24 ชั่วโมง ได้รับการประเมินเพิ่มเติมภายใต้สภาพสนามจริง ซึ่งเป็นการขยายผลลัพธ์ที่ได้รับภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการ และแสดงให้เห็นถึงผลกระทบของกลิ่นปัสสาวะวัวต่อสภาวะทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกันของการดึงดูดยุง ผลลัพธ์ที่ได้ยืนยันว่า Anopheles Arabiensis ดูดซับและกระจายสารประกอบไนโตรเจนที่พบในปัสสาวะของสัตว์มีกระดูกสันหลังเพื่อส่งผลต่อลักษณะทางชีววิทยา ผลลัพธ์เหล่านี้จะถูกนำมาอภิปรายในบริบทของผลกระทบทางระบาดวิทยาที่อาจเกิดขึ้น และวิธีการนำไปใช้ในการเฝ้าระวังและควบคุมพาหะนำโรค
ยุง Anopheles arabicans (สายพันธุ์ Dongola) ถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C ความชื้นสัมสัมพัทธ์ 65 ± 5% และวงจรแสงสว่างและมืด 12:12 ชั่วโมง ตัวอ่อนถูกเลี้ยงในถาดพลาสติก (20 ซม. × 18 ซม. × 7 ซม.) ที่บรรจุน้ำกลั่นและให้อาหารปลา Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE) ดักแด้ถูกเก็บรวบรวมในถ้วยขนาด 30 มล. (Nolato Hertila, Åstorp, SE) จากนั้นย้ายไปยังกรง Bugdorm (30 ซม. × 30 ซม. × 30 ซม.; MegaView Science, Taichung, Taiwan) เพื่อให้ยุงตัวเต็มวัยฟักออกมา ยุงตัวเต็มวัยได้รับสารละลายซูโครส 10% อย่างไม่จำกัดจนถึง 4 วันหลังฟัก (dpe) ณ จุดนั้น ยุงตัวเมียที่ออกหาเหยื่อจะได้รับอาหารทันทีก่อนการทดลอง หรือถูกอดอาหารข้ามคืนโดยให้กินเฉพาะน้ำกลั่นก่อนการทดลอง ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ยุงตัวเมียที่ใช้ในการทดลองบิน ในการทดลองในหลอดทดลอง ยุงจะอดอาหารเพียง 4-6 ชั่วโมง โดยมีน้ำให้ดื่มอย่างไม่จำกัด เพื่อเตรียมยุงดูดเลือดสำหรับการทดสอบทางชีวภาพในภายหลัง ยุงตัวเมียอายุ 4 วันหลังฟักไข่จะได้รับเลือดแกะที่ผ่านการกำจัดไฟบรินแล้ว (Håtunalab, Bro, SE) โดยใช้ระบบการให้อาหารผ่านเยื่อ (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK) จากนั้นยุงตัวเมียที่ดูดเลือดจนอิ่มแล้วจะถูกย้ายไปยังกรงเดี่ยวและได้รับอาหารโดยตรงตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง หรือได้รับน้ำตาลซูโครส 10% อย่างไม่จำกัดเป็นเวลา 3 วันก่อนการทดลองที่อธิบายไว้ด้านล่าง ยุงตัวเมียกลุ่มหลังนี้ถูกนำมาใช้สำหรับการทดสอบทางชีวภาพในหลอดทดลอง และถูกย้ายไปยังห้องปฏิบัติการ จากนั้นจะได้รับน้ำกลั่นอย่างไม่จำกัดเป็นเวลา 4-6 ชั่วโมงก่อนการทดลอง
การทดสอบการกินอาหารถูกนำมาใช้เพื่อหาปริมาณการบริโภคปัสสาวะและยูเรียในยุงลาย An.Arab เพศเมียที่โตเต็มวัย ยุงเพศเมียที่กำลังหาอาหารหรือดูดเลือดจะได้รับอาหารที่มีส่วนผสมของปัสสาวะวัวสดและเก่าเจือจาง 1% ยูเรียในความเข้มข้นต่างๆ และสารควบคุมสองชนิด (ซูโครส 10% และน้ำ) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง นอกจากนี้ ยังมีการเติมสีผสมอาหาร (ไซลีนไซยาไนด์ FF 1 มก./มล.; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ลงในอาหาร และจัดใส่ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; ภาพที่ 1A) ในรูปแบบเมทริกซ์ 4 × 4 เติมให้เต็มขอบ (~300 µl) เพื่อหลีกเลี่ยงการแข่งขันระหว่างยุงและผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากสีของสีย้อม ให้วางยุง 10 ตัวในจานเพาะเชื้อขนาดใหญ่ (เส้นผ่านศูนย์กลาง 12 ซม. และสูง 6 ซม.; Semadeni, Ostermundigen, CH; ภาพที่ 1A) ในอาหารที่สมบูรณ์ ในที่มืดที่อุณหภูมิ 25 ± 2 ซม. และความชื้นสัมพัทธ์ 65 ± 5% การทดลองเหล่านี้ทำซ้ำ 5 ถึง 10 ครั้ง หลังจากได้รับอาหารแล้ว ยุงจะถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส จนกว่าจะทำการวิเคราะห์ต่อไป
สังเกตการดูดซึมปัสสาวะวัวและยูเรียโดยยุงตัวเมีย Anopheles arabianus ทั้งที่เป็นพาหะและดูดเลือด ในการทดลองการให้อาหาร (A) ยุงตัวเมียได้รับอาหารที่ประกอบด้วยปัสสาวะวัวสดและเก่า ยูเรียความเข้มข้นต่างๆ ซูโครส (10%) และน้ำกลั่น (H2O) ยุงตัวเมียที่กำลังหาพาหะ (B) และยุงตัวเมียที่ดูดเลือด (C) ดูดซึมซูโครสได้มากกว่าอาหารอื่นๆ ที่ทดสอบ โปรดสังเกตว่ายุงตัวเมียที่กำลังหาพาหะดูดซึมปัสสาวะวัว 72 ชั่วโมงน้อยกว่าปัสสาวะวัว 168 ชั่วโมง (B) ปริมาณไนโตรเจนทั้งหมดเฉลี่ย (± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ของปัสสาวะแสดงอยู่ในภาพแทรก ยุงตัวเมียที่กำลังหาพาหะ (D, F) และยุงตัวเมียที่ดูดเลือด (E, G) ดูดซึมยูเรียในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ ปริมาตรการหายใจเข้าเฉลี่ย (D, E) ที่มีชื่อตัวอักษรต่างกันมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวโดยใช้การวิเคราะห์หลังการทดสอบของ Tukey; p < 0.05) แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึง ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (BE) เส้นประตรงแสดงถึงเส้นการถดถอยเชิงเส้นแบบลอการิทึม (F, G)
เพื่อปลดปล่อยอาหารที่ดูดซึมเข้าไป ยุงแต่ละตัวถูกวางลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่บรรจุน้ำกลั่น 230 ไมโครลิตร จากนั้นเนื้อเยื่อถูกบดด้วยครกบดแบบใช้แล้วทิ้งและมอเตอร์ไร้สาย (VWR International, Lund, SE) ตามด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ส่วนของเหลวใส (200 ไมโครลิตร) ถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลท 96 หลุม (Sigma-Aldrich) และวัดค่าการดูดกลืนแสง (λ620) โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทแบบสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) หรืออีกวิธีหนึ่ง ยุงถูกบดในน้ำกลั่น 1 มล. จากนั้นถ่ายโอน 900 ไมโครลิตรไปยังคิวเวตต์สำหรับการวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (λ 620 นาโนเมตร; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE) เพื่อหาปริมาณการบริโภคอาหาร ได้มีการสร้างกราฟมาตรฐานขึ้น โดยการเจือจางแบบอนุกรมเพื่อให้ได้ไซลีนไซยาไนด์ความเข้มข้น 1 มก./มล. ปริมาตร 0.2 ไมโครลิตร ถึง 2.4 ไมโครลิตร จากนั้นจึงใช้ค่าความหนาแน่นเชิงแสงของความเข้มข้นของสีย้อมที่ทราบแล้ว เพื่อกำหนดปริมาณอาหารที่ยุงแต่ละตัวกินเข้าไป
ข้อมูลปริมาตรได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการเปรียบเทียบแบบจับคู่หลังการทดสอบของ Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007) การวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นอธิบายปริมาณการบริโภคยูเรียที่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น และเปรียบเทียบการตอบสนองระหว่างยุงที่หาโฮสต์และยุงที่ดูดเลือด (GraphPad Prism v8.0.0 สำหรับ Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US)
ตัวอย่างปัสสาวะประมาณ 20 ไมโครลิตรจากแต่ละกลุ่มอายุถูกจับยึดด้วย Chromosorb® W/AW (10 มก. 80/100 เมช, Sigma Aldrich) และบรรจุในแคปซูลดีบุก (8 มม. × 5 มม.) จากนั้นใส่แคปซูลเข้าไปในห้องเผาไหม้ของเครื่องวิเคราะห์ CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, สหรัฐอเมริกา) เพื่อหาปริมาณไนโตรเจนในปัสสาวะสดและปัสสาวะที่เก็บไว้นานตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ปริมาณไนโตรเจนทั้งหมด (กรัม N ต่อลิตร) ถูกหาปริมาณโดยอ้างอิงจากความเข้มข้นของยูเรียที่ทราบค่าซึ่งใช้เป็นมาตรฐาน
เพื่อประเมินผลของอาหารต่อการอยู่รอดของยุงตัวเมียที่กำลังหาเหยื่อและดูดเลือด ยุงแต่ละตัวถูกวางแยกกันในจานเพาะเชื้อขนาดใหญ่ (เส้นผ่านศูนย์กลาง 12 ซม. และสูง 6 ซม.; Semadeni) ที่มีรูที่ฝาปิดเป็นตาข่าย (เส้นผ่านศูนย์กลาง 3 ซม.) สำหรับการระบายอากาศและการให้อาหาร อาหารจะถูกให้ทันทีหลังจาก 4 วันหลังสัมผัสอาหาร และประกอบด้วยปัสสาวะวัวสดและเก่าเจือจาง 1%, ยูเรียสี่ความเข้มข้น และตัวควบคุมสองอย่าง คือ ซูโครส 10% และน้ำ อาหารแต่ละชนิดถูกปิเป็ตลงบนผ้าอนามัยแบบสอด (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) ที่ใส่ไว้ในกระบอกฉีดยาขนาด 5 มล. (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE) ถอดลูกสูบออก และวางไว้บนจานเพาะเชื้อ (ภาพที่ 1) 1A) เปลี่ยนอาหารทุกวัน ดูแลห้องปฏิบัติการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น นับจำนวนยุงที่รอดชีวิตวันละสองครั้ง ในขณะที่ยุงที่ตายแล้วจะถูกทิ้งไปจนกว่ายุงตัวสุดท้ายจะตาย (n = 40 ต่อ (การรักษา) อัตราการรอดชีวิตของยุงที่ได้รับอาหารต่าง ๆ ได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้เส้นโค้งการรอดชีวิตของ Kaplan-Meyer และการทดสอบ log-rank เพื่อเปรียบเทียบการกระจายการรอดชีวิตระหว่างอาหารแต่ละชนิด (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0)
เครื่องปั่นยุงแบบกำหนดเองตามแบบของ Attisano et al.[17] ทำจากแผ่นอะคริลิกใสหนา 5 มม. (กว้าง 10 ซม. x ยาว 10 ซม. x สูง 10 ซม.) โดยไม่มีแผ่นหน้าและแผ่นหลัง (รูปที่ 3: ด้านบน) ชุดประกอบแกนหมุนที่มีท่อแนวตั้งทำจากคอลัมน์โครมาโทกราฟีแก๊ส (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.25 มม.; ยาว 7.5 ซม.) โดยปลายทั้งสองข้างติดกาวกับเข็มแมลงที่แขวนอยู่ระหว่างแม่เหล็กนีโอไดเมียมคู่หนึ่งซึ่งห่างกัน 9 ซม. ท่อแนวนอนที่ทำจากวัสดุเดียวกัน (ยาว 6.5 ซม.) แบ่งครึ่งท่อแนวตั้งเพื่อสร้างแขนที่ยึดไว้และแขนที่ถือแผ่นฟอยล์อลูมิเนียมชิ้นเล็กๆ เป็นสัญญาณขัดขวางแสง
ยุงตัวเมียที่อดอาหาร 24 ชั่วโมง จะได้รับอาหารตามที่กล่าวมาข้างต้นเป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะถูกจับ ยุงตัวเมียที่กินอิ่มแล้วจะถูกทำให้สลบทีละตัวบนน้ำแข็งเป็นเวลา 2-3 นาที แล้วติดเข้ากับเข็มปักแมลงด้วยขี้ผึ้ง (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) จากนั้นจึงผูกติดกับแขนของท่อแนวนอน เครื่องวัดการบิน (Flying Mill) บันทึกจำนวนรอบต่อการบินโดยใช้เครื่องบันทึกข้อมูลที่สร้างขึ้นเอง จากนั้นจัดเก็บและแสดงผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE) เครื่องวัดการบินถูกวางไว้ในห้องควบคุมอุณหภูมิ (12 ชั่วโมง:12 ชั่วโมง, แสง:ความมืด, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH)
เพื่อแสดงภาพรูปแบบกิจกรรมการบิน ระยะทางรวมที่บินได้ (เมตร) และจำนวนครั้งของการบินต่อเนื่องทั้งหมดต่อชั่วโมงถูกคำนวณในช่วงเวลา 24 ชั่วโมง นอกจากนี้ ระยะทางเฉลี่ยที่บินได้โดยตัวเมียแต่ละตัวถูกนำมาเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มทดลอง และวิเคราะห์โดยใช้ ANOVA แบบทางเดียวและการวิเคราะห์หลังการทดสอบของ Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) โดยที่ระยะทางเฉลี่ยถือเป็นตัวแปรตาม ในขณะที่กลุ่มทดลองเป็นตัวแปรอิสระ นอกจากนี้ จำนวนรอบเฉลี่ยยังถูกคำนวณเป็นช่วงเวลา 10 นาที
เพื่อประเมินผลของอาหารต่อประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ของ An.arabiensis ตัวเมีย 6 ตัว (อายุ 4 วันหลังฟัก) ถูกย้ายไปยังกรง Bugdorm (30 ซม. × 30 ซม. × 30 ซม.) โดยตรงหลังจากเก็บตัวอย่างเลือดแล้ว จากนั้นจึงให้อาหารทดลองเป็นเวลา 48 ชั่วโมงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในวันที่สามจึงนำอาหารออกและใส่ถ้วยวางไข่ (30 มล.; Nolato Hertila) ที่บรรจุน้ำกลั่น 20 มล. เป็นเวลา 48 ชั่วโมง โดยเปลี่ยนทุก 24 ชั่วโมง ทำซ้ำแต่ละสูตรอาหาร 20-50 ครั้ง นับและบันทึกจำนวนไข่ในแต่ละกรงทดลอง นำตัวอย่างย่อยของไข่มาประเมินขนาดเฉลี่ยและความแปรปรวนของความยาวของไข่แต่ละฟอง (n ≥ 200 ต่อสูตรอาหาร) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) ที่ติดตั้งกล้อง Leica (DFC) 320 R2 (Leica Microsystems Ltd., DE) ไข่ที่เหลือถูกเก็บไว้ในห้องควบคุมอุณหภูมิภายใต้สภาวะการเลี้ยงมาตรฐานเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และตัวอย่างย่อยของตัวอ่อนระยะที่ 1 ที่เพิ่งฟักออกมา (n ≥ 200 ต่ออาหาร) ถูกวัดขนาดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น จำนวนไข่ ขนาดของไข่ และขนาดของตัวอ่อนถูกเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มทดลองโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) และการวิเคราะห์หลังการทดสอบของ Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)
สารระเหยในช่องว่างเหนือของเหลว (Headspace volatiles) จากปัสสาวะสด (1 ชั่วโมงหลังการเก็บตัวอย่าง), ปัสสาวะที่บ่มไว้ 24 ชั่วโมง, 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมง ถูกเก็บรวบรวมจากตัวอย่างปัสสาวะของโคพันธุ์ซีบู สายพันธุ์อาร์ซี เพื่อความสะดวก ตัวอย่างปัสสาวะถูกเก็บในตอนเช้าตรู่ขณะที่โคยังอยู่ในคอก ตัวอย่างปัสสาวะถูกเก็บจากโค 10 ตัว และแต่ละตัวอย่าง 100-200 มิลลิลิตร ถูกถ่ายโอนไปยังถุงอบโพลีอะไมด์ (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) ในถังพลาสติกไวนิลคลอไรด์ขนาด 3 ลิตรที่มีฝาปิด สารระเหยในช่องว่างเหนือของเหลวจากตัวอย่างปัสสาวะของโคแต่ละตัวถูกเก็บรวบรวมโดยตรง (สด) หรือหลังจากบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมง กล่าวคือ ตัวอย่างปัสสาวะแต่ละตัวเป็นตัวแทนของกลุ่มอายุแต่ละกลุ่ม
สำหรับการเก็บสารระเหยในพื้นที่เหนือของเหลว (headspace volatiles) ใช้ระบบวงปิดในการหมุนเวียนกระแสแก๊สที่กรองด้วยถ่านกัมมันต์ (100 มล./นาที) ผ่านถุงโพลีอะไมด์ไปยังคอลัมน์ดูดซับเป็นเวลา 2.5 ชั่วโมง โดยใช้ปั๊มสุญญากาศแบบไดอะแฟรม (KNF Neuberger, Freiburg, DE) สำหรับการควบคุม การเก็บสารระเหยในพื้นที่เหนือของเหลวทำจากถุงโพลีอะไมด์เปล่า คอลัมน์ดูดซับทำจากท่อเทฟลอน (5.5 ซม. x 3 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) บรรจุ Porapak Q 35 มก. (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) ระหว่างปลั๊กใยแก้ว ก่อนใช้งาน คอลัมน์จะถูกล้างด้วย n-hexane ที่กลั่นซ้ำ 1 มล. (Merck, Darmstadt, DE) และเพนเทน 1 มล. (ตัวทำละลายบริสุทธิ์ 99.0% เกรด GC, Sigma Aldrich) สารระเหยที่ถูกดูดซับจะถูกชะออกมาด้วยเพนเทน 400 ไมโครลิตร การเก็บสารระเหยในพื้นที่เหนือของเหลวถูกดำเนินการดังนี้ รวบรวมตัวอย่างแล้วเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ -20°C จนกว่าจะนำไปใช้ในการวิเคราะห์เพิ่มเติม
การตอบสนองทางพฤติกรรมของยุง An ที่ออกหาโฮสต์และดูดเลือด สารสกัดระเหยจากพื้นที่เหนือของเหลวที่เก็บรวบรวมจากปัสสาวะสด ปัสสาวะที่เก็บไว้ 24 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมง ได้รับการวิเคราะห์หาสารสกัดระเหยจากยุง Arabidopsis โดยใช้เครื่องวัดกลิ่นแบบหลอดแก้วตรง [18] การทดลองดำเนินการในช่วง ZT 13-15 ซึ่งเป็นช่วงเวลาสูงสุดของกิจกรรมการหาบ้านของยุง An [19] เครื่องวัดกลิ่นแบบหลอดแก้ว (80 ซม. × 9.5 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ได้รับแสงสีแดง 3 ± 1 ลักซ์จากด้านบน กระแสลมที่กรองด้วยถ่านและทำให้ชื้น (25 ± 2 °C, ความชื้นสัมพัทธ์ 65 ± 2%) ผ่านเครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพที่ 30 ซม. s-1 อากาศผ่านตะแกรงสแตนเลสหลายชุด ทำให้เกิดการไหลแบบราบเรียบและโครงสร้างควันสม่ำเสมอ เครื่องจ่ายผ้าอนามัยแบบสอด (4 ซม. × 1 ซม.; L:D; DAB Dental) สารสกัดระเหย (AB) แขวนไว้กับขดลวดขนาด 5 ซม. ที่ปลายด้านรับลมของเครื่องดมกลิ่น โดยเปลี่ยนตัวกระตุ้นทุก 5 นาที สำหรับการวิเคราะห์ ใช้สารสกัดระเหยแต่ละชนิด 10 ไมโครลิตร เจือจาง 1:10 เป็นตัวกระตุ้น ใช้เพนเทนในปริมาณเท่ากันเป็นตัวควบคุม ยุงที่กำลังหาโฮสต์หรือดูดเลือดแต่ละตัวถูกวางไว้ในกรงปล่อยแต่ละตัว 2-3 ชั่วโมงก่อนเริ่มการทดลอง กรงปล่อยถูกวางไว้ด้านใต้ลมของเครื่องดมกลิ่น และปล่อยให้ยุงปรับตัวเป็นเวลา 1 นาที จากนั้นจึงเปิดวาล์วผีเสื้อของกรงเพื่อปล่อย การดึงดูดต่อตัวกระตุ้นหรือตัวควบคุมถูกวิเคราะห์โดยคิดเป็นสัดส่วนของยุงที่สัมผัสกับแหล่งกำเนิดภายใน 5 นาทีหลังจากปล่อย สารสกัดระเหยแต่ละชนิดและตัวควบคุมถูกทำซ้ำอย่างน้อย 30 ครั้ง และเพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบจากวันใดวันหนึ่ง จึงทดสอบจำนวนตัวกระตุ้นและตัวควบคุมเท่ากันในแต่ละวันของการทดลอง การตอบสนองในการหาโฮสต์และดูดเลือดจากยุงที่ดูดเลือด คำตอบ: ชุดข้อมูลภาษาอาหรับเทียบกับชุดข้อมูล headspace ถูกวิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกเชิงนาม ตามด้วยการเปรียบเทียบแบบจับคู่สำหรับอัตราส่วนความน่าจะเป็น (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)
การตอบสนองการวางไข่ของวัว สารสกัดจากปัสสาวะวัวสดและปัสสาวะวัวที่เก็บไว้นานถูกวิเคราะห์ในกรง Bugdorm (30 ซม. × 30 ซม. × 30 ซม.; MegaView Science) ถ้วยพลาสติก (30 มล.; Nolato Hertila) ที่บรรจุน้ำกลั่น 20 มล. ใช้เป็นวัสดุสำหรับวางไข่ และวางไว้ที่มุมตรงข้ามของกรง ห่างกัน 24 ซม. ถ้วยทดลองถูกปรับด้วยสารสกัดจากปัสสาวะแต่ละชนิด 10 ไมโครลิตร ในอัตราส่วน 1:10 ใช้เพนเทนในปริมาณเท่ากันเพื่อปรับถ้วยควบคุม สลับถ้วยทดลองและถ้วยควบคุมระหว่างการทดลองแต่ละครั้งเพื่อควบคุมผลกระทบจากตำแหน่ง ปล่อยวัวตัวเมียที่กินเลือดแล้ว 10 ตัวลงในกรงทดลองที่ ZT 9-11 และนับจำนวนไข่ในถ้วย 24 ชั่วโมงต่อมา สูตรในการคำนวณดัชนีการวางไข่คือ: (จำนวนไข่ที่วางในถ้วยทดลอง – จำนวนไข่ที่วางในถ้วยควบคุม) / (จำนวนไข่ทั้งหมดที่วาง) แต่ละการทดลองทำซ้ำ 8 ครั้ง ครั้ง
การวิเคราะห์โครมาโทกราฟีแก๊สและการตรวจจับรูปแบบเสาอากาศอิเล็กตรอน (GC-EAD) ของ An.arabiensis เพศเมีย ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [20] โดยสรุป สารสกัดระเหยจากเฮดสเปซสดถูกแยกโดยใช้ Agilent Technologies 6890 GC (ซานตาคลารา รัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ที่ติดตั้งคอลัมน์ HP-5 (30 ม. × 0.25 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.25 ไมโครเมตร ความหนาของฟิล์ม Agilent Technologies) และปัสสาวะที่เสื่อมสภาพตามอายุ ใช้ไฮโดรเจนเป็นเฟสเคลื่อนที่ด้วยอัตราการไหลเชิงเส้นเฉลี่ย 45 ซม./วินาที ฉีดตัวอย่างแต่ละตัว (2 ไมโครลิตร) เป็นเวลา 30 วินาทีในโหมดไร้การแยก (splitless mode) ด้วยอุณหภูมิทางเข้า 225 °C ตั้งโปรแกรมอุณหภูมิเตาอบ GC จาก 35 °C (คงที่ 3 นาที) ถึง 300 °C (คงที่ 10 นาที) ที่อัตรา 10 °C/นาที ในตัวแยกสารไหลออกของ GC เติมไนโตรเจน 4 psi และแยก 1:1 ในตัวกรองแบบกากบาทปริมาตรต่ำ Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) ระหว่างเครื่องตรวจจับเปลวไฟไอออนไนเซชัน (flame ionization detector) และ EAD ท่อแคปิลลารีของสารไหลออก GC สำหรับ EAD ถูกส่งผ่านสายส่ง Gerstel ODP-2 ซึ่งติดตามอุณหภูมิเตาอบ GC บวก 5 °C เข้าไปในหลอดแก้ว (10 ซม. × 8 มม.) ซึ่งจะผสมกับอากาศชื้นที่กรองด้วยคาร์บอน (1.5 ลิตร) (นาที−1) วางเสาอากาศห่างจากปากท่อ 0.5 ซม. ยุงแต่ละตัวนับเป็นหนึ่งตัวอย่าง และสำหรับยุงที่ออกหาโฮสต์ จะทำการทดลองซ้ำอย่างน้อยสามครั้งกับตัวอย่างปัสสาวะของแต่ละช่วงอายุ
การระบุสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพในตัวอย่างไอระเหยจากปัสสาวะวัวสดและเก่าโดยใช้เครื่อง GC และแมสสเปกโทรเมตรีแบบผสม (GC-MS; 6890 GC และ 5975 MS; Agilent Technologies) เพื่อกระตุ้นการตอบสนองของหนวดในการวิเคราะห์ GC-EAD โดยทำงานในโหมดการแตกตัวเป็นไอออนด้วยอิเล็กตรอนที่ 70 eV เครื่อง GC ติดตั้งคอลัมน์แคปิลลารีซิลิกาหลอมรวมเคลือบ HP-5MS UI (60 ม. × 0.25 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.25 ไมโครเมตร ความหนาของฟิล์ม) โดยใช้ฮีเลียมเป็นเฟสเคลื่อนที่ด้วยอัตราการไหลเชิงเส้นเฉลี่ย 35 ซม. s-1 ฉีดตัวอย่าง 2 ไมโครลิตรโดยใช้การตั้งค่าหัวฉีดและอุณหภูมิเตาอบเดียวกันกับการวิเคราะห์ GC-EAD ระบุสารประกอบโดยพิจารณาจากเวลาการคงตัว (ดัชนี Kovát) และสเปกตรัมมวลเปรียบเทียบกับไลบรารีที่กำหนดเองและไลบรารี NIST14 (Agilent) ยืนยันสารประกอบที่ระบุได้โดยการฉีดสารมาตรฐานแท้ (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S2) สำหรับการหาปริมาณ เฮปทิลอะซิเตต (10 นาโนกรัม ความบริสุทธิ์ทางเคมี 99.8% อัลดริช) ถูกฉีดเข้าไปเป็นสารมาตรฐานภายนอก
การประเมินประสิทธิภาพของส่วนผสมกลิ่นสังเคราะห์ที่ประกอบด้วยสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ระบุในปัสสาวะสดและปัสสาวะที่เก็บไว้นาน เพื่อดึงดูด Ans.arabiensis ที่กำลังมองหาโฮสต์และดูดเลือด โดยใช้เครื่องวัดกลิ่นและขั้นตอนเดียวกันกับข้างต้น ส่วนผสมสังเคราะห์เลียนแบบองค์ประกอบและสัดส่วนของสารประกอบในสารสกัดระเหยจากปัสสาวะสด ปัสสาวะที่เก็บไว้นาน 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมง (รูปที่ 5D-G; ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S2) สำหรับการวิเคราะห์ ให้ใช้ 10 ไมโครลิตรของสารละลายเจือจาง 1:100 ของส่วนผสมสังเคราะห์ทั้งหมด โดยมีอัตราการปลดปล่อยโดยรวมอยู่ระหว่างประมาณ 140-2400 นาโนกรัมต่อชั่วโมง เพื่อประเมินความดึงดูดใจต่อโฮสต์และยุงดูดเลือด หลังจากนั้น จะทำการทดสอบกับส่วนผสมที่สมบูรณ์ โดยนำส่วนผสมย่อยของสารประกอบเดี่ยวออกจากส่วนผสมที่สมบูรณ์ ค้นหาการตอบสนองจาก Ans.arabiensis ที่หาโฮสต์และดูดเลือดแล้ว เทียบกับส่วนผสมสังเคราะห์และ ส่วนผสมแบบลบได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกเชิงนาม ตามด้วยการเปรียบเทียบแบบจับคู่สำหรับอัตราส่วนความน่าจะเป็น (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)
เพื่อประเมินว่าปัสสาวะวัวสามารถใช้เป็นตัวบ่งชี้แหล่งที่อยู่อาศัยของยุงที่เป็นพาหะของโรคมาลาเรียได้หรือไม่ จึงได้นำปัสสาวะวัวสดและปัสสาวะวัวที่เก็บไว้นาน ซึ่งเก็บรวบรวมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และน้ำ มาใส่ในถังตาข่ายขนาด 3 ลิตร (100 มล.) แล้วนำไปวางไว้ในกับดักล่อยุง (BG-HDT รุ่น; BioGents, Regensburg, DE) วางกับดัก 10 อัน ห่างกัน 50 เมตร ในทุ่งหญ้า ห่างจากชุมชน (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) 400 เมตร ในบริเวณที่ไม่มีวัวอาศัยอยู่ ในพื้นที่เพาะพันธุ์ถาวรและหมู่บ้าน กับดัก 5 อันถูกทำให้ร้อนเพื่อจำลองการมีอยู่ของพาหะ ในขณะที่กับดักอีก 5 อันไม่ได้ให้ความร้อน แต่ละสถานที่ทดลองจะถูกสลับเปลี่ยนทุกคืนเป็นเวลาทั้งหมด 5 คืน จำนวนยุงที่จับได้ในกับดักที่ใช้ปัสสาวะที่มีอายุต่างกันเป็นเหยื่อล่อ จะถูกนำมาเปรียบเทียบโดยใช้การถดถอยโลจิสติกส์ด้วยการกระจายแบบเบตาไบโนเมียล (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.)
การศึกษานี้ดำเนินการในหมู่บ้านที่มีโรคมาลาเรียระบาดใกล้เมืองมากิ เขตโอโรเมีย ประเทศเอธิโอเปีย (8° 11′ 08″ เหนือ, 38° 81′ 70″ ตะวันออก; ภาพที่ 6A) การศึกษานี้ดำเนินการระหว่างกลางเดือนสิงหาคมถึงกลางเดือนกันยายน ก่อนการพ่นยาฆ่าแมลงภายในบ้านประจำปี พร้อมกับช่วงฤดูฝนที่ยาวนาน ได้เลือกบ้านห้าคู่ (ห่างกัน 20–50 เมตร) ที่ตั้งอยู่ชานหมู่บ้านสำหรับการศึกษา (ภาพที่ 6A) เกณฑ์ที่ใช้ในการเลือกบ้าน ได้แก่ ไม่อนุญาตให้เลี้ยงสัตว์ในบ้าน ไม่อนุญาตให้ปรุงอาหารในบ้าน (โดยใช้ฟืนหรือถ่าน) (อย่างน้อยในช่วงระยะเวลาทดลอง) และบ้านมีผู้อยู่อาศัยไม่เกินสองคน นอนในที่นอนที่ไม่ใช้ยาฆ่าแมลง ภายใต้ตาข่ายกันยุงที่ผ่านการบำบัดแล้ว ได้รับการอนุมัติทางจริยธรรมจากคณะกรรมการพิจารณาจริยธรรมการวิจัยของสถาบัน (IRB/022/2016) คณะวิทยาศาสตร์ธรรมชาติ (CNS-IRB) มหาวิทยาลัยแอดดิสอาบาบา ตามแนวทางที่กำหนดโดยปฏิญญาเฮลซิงกิของสมาคมแพทย์โลก ได้รับความยินยอมจากหัวหน้าครัวเรือนแต่ละคนโดยความช่วยเหลือจากเจ้าหน้าที่ส่งเสริมสุขภาพ กระบวนการทั้งหมดได้รับการรับรองจากหน่วยงานบริหารส่วนท้องถิ่นในระดับอำเภอและตำบล ('kebele') การออกแบบการทดลองเป็นไปตามแบบแผนลาตินสแควร์ 2 × 2 โดยที่สารผสมสังเคราะห์และกลุ่มควบคุมถูกกำหนดให้กับบ้านคู่หนึ่งในคืนแรกและสลับกันระหว่างบ้านในคืนทดลองถัดไป กระบวนการนี้ทำซ้ำสิบครั้ง นอกจากนี้ เพื่อประเมินกิจกรรมของยุงในบ้านที่เลือกไว้ กับดัก CDC ถูกตั้งให้ทำงานติดต่อกันห้าคืนในช่วงเริ่มต้น กลาง และสิ้นสุดของการทดลองภาคสนามในเวลาเดียวกันของวัน
สารผสมสังเคราะห์ที่มีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ 6 ชนิดถูกละลายในเฮปเทน (ตัวทำละลาย 97.0% เกรด GC, Sigma Aldrich) และปล่อยออกมาในอัตรา 140 ng h-1 โดยใช้ตัวจ่ายแบบไส้ฝ้าย [20] ตัวจ่ายแบบไส้ฝ้ายช่วยให้สารประกอบทั้งหมดถูกปล่อยออกมาในสัดส่วนคงที่ตลอดการทดลอง 12 ชั่วโมง เฮปเทนถูกใช้เป็นตัวควบคุม ขวดทดลองถูกแขวนไว้ข้างจุดเข้าของกับดักแสงของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, US; รูปที่ 6A) กับดักถูกแขวนไว้สูงจากพื้น 0.8 – 1 เมตร ใกล้กับปลายเตียง และอาสาสมัครนอนใต้ตาข่ายกันยุงที่ไม่ได้ผ่านการบำบัด และดำเนินการระหว่างเวลา 18:00 ถึง 06:30 น. ยุงที่จับได้ตามเพศและสถานะทางสรีรวิทยา (ไม่ได้กินอาหาร กินอาหารแล้ว ท้องแก่ และท้องแก่ [21]) จะถูกคัดกรองโดยใช้การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) เพื่อระบุชนิด ระบุทางสัณฐานวิทยาว่าเป็น A. gambiae sl. สมาชิกของกลุ่ม [23] ในการศึกษาภาคสนาม การดักจับด้วยกับดักของบ้านคู่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แบบจำลองความเหมาะสมเชิงลอจิสติกแบบนาม โดยที่การดึงดูดเป็นตัวแปรตาม และการรักษา (ส่วนผสมสังเคราะห์เทียบกับกลุ่มควบคุม) เป็นผลกระทบคงที่ (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.) ในที่นี้ เราจะรายงานค่า χ2 และค่า p จากการทดสอบอัตราส่วนความน่าจะเป็น
ประเมินว่าปลอดภัยหรือไม่ หนูตะเภาสามารถดูดซึมปัสสาวะและยูเรีย ซึ่งเป็นแหล่งไนโตรเจนหลัก โดยการให้อาหารโดยตรง ภายใน 48 ชั่วโมงหลังการให้ยา เป็นเวลา 4 วัน (dpe) ในการทดลองให้อาหารหนูตัวเมียที่ออกหาอาหารและดูดเลือด (รูปที่ 1A) ทั้งหนูตัวเมียที่ออกหาอาหารและดูดเลือดดูดซึมซูโครสได้มากกว่าอาหารชนิดอื่นหรือน้ำอย่างมีนัยสำคัญ (F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 และ F(5,299) = 56.00, p < 0.0001 ตามลำดับ; รูปที่ 1B,C) นอกจากนี้ หนูตัวเมียที่ออกหาอาหารกินปัสสาวะน้อยลงที่ 72 ชั่วโมง เมื่อเทียบกับปัสสาวะที่ 168 ชั่วโมง (รูปที่ 1B) เมื่อได้รับอาหารที่มียูเรีย หนูตัวเมียที่ออกหาอาหารดูดซึมยูเรียที่ความเข้มข้น 2.69 mM ได้มากกว่าความเข้มข้นอื่นๆ และน้ำอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ไม่แตกต่างจากความเข้มข้นอื่นๆ ซูโครส 10% (F(10,813) = 15.72, p < 0.0001; รูปที่ 1D) ซึ่งแตกต่างจากการตอบสนองของตัวเมียที่กินเลือด ซึ่งโดยทั่วไปจะดูดซึมอาหารที่มียูเรียมากกว่าน้ำอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าจะน้อยกว่าซูโครส 10% อย่างมีนัยสำคัญ (F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; รูปที่ 1E) นอกจากนี้ เมื่อเปรียบเทียบระหว่างสองสภาวะทางสรีรวิทยา ตัวเมียที่ถูกดูดเลือดดูดซึมยูเรียได้มากกว่าตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ที่ความเข้มข้นต่ำสุด และตัวเมียเหล่านี้ดูดซึมยูเรียในปริมาณที่ใกล้เคียงกันที่ความเข้มข้นสูงกว่า (F(1,953)= 78.82, p < 0.0001; รูปที่ 1F, G) ในขณะที่การบริโภคจากอาหารที่มียูเรียดูเหมือนจะมีค่าที่เหมาะสมที่สุด (รูปที่ 1E) 1D,E) ตัวเมียในทั้งสองสภาวะทางสรีรวิทยา สามารถปรับปริมาณยูเรียที่ดูดซึมได้ตลอดช่วงความเข้มข้นของยูเรียในลักษณะเชิงเส้นลอการิทึม (รูปที่ 1F,G) ในทำนองเดียวกัน ยุงดูเหมือนจะควบคุมการดูดซึมไนโตรเจนโดยการควบคุมปริมาณปัสสาวะที่ดูดซึม เนื่องจากปริมาณไนโตรเจนในปัสสาวะสะท้อนให้เห็นในปริมาณที่ดูดซึม (รูปที่ 1B, C และภาพแทรกในรูปที่ B)
เพื่อประเมินผลกระทบของปัสสาวะและยูเรียต่อการอยู่รอดของยุงที่กำลังหาเหยื่อและดูดเลือด ยุงตัวเมียถูกเลี้ยงด้วยปัสสาวะที่มีอายุต่างกัน 4 ช่วง (สด, 24 ชั่วโมง, 72 ชั่วโมง และ 168 ชั่วโมงหลังการตกตะกอน) และยูเรียที่มีความเข้มข้นต่างกัน รวมถึงน้ำกลั่นและซูโครส 10% ซึ่งใช้เป็นกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2A) การวิเคราะห์การอยู่รอดนี้แสดงให้เห็นว่าอาหารมีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการอยู่รอดโดยรวมของยุงตัวเมียที่กำลังหาเหยื่อ (ปัสสาวะ: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; ยูเรีย: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; รูปที่ 2B, C) และยุงตัวเมียที่ดูดเลือด (ปัสสาวะ: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; ยูเรีย: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0.0001; รูปที่ 2D,E) ในทุกการทดลอง ตัวเมียที่กินปัสสาวะ ยูเรีย และน้ำ มีอัตราการรอดชีวิตต่ำกว่าตัวเมียที่กินน้ำตาลซูโครสอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2B-E) ตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ที่กินปัสสาวะสดและปัสสาวะเก่ามีอัตราการรอดชีวิตที่แตกต่างกัน โดยตัวเมียที่กินปัสสาวะเก่า 72 ชั่วโมง (p = 0.016) มีโอกาสรอดชีวิตต่ำที่สุด (รูปที่ 2B) นอกจากนี้ ตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ที่กินยูเรีย 135 mM มีชีวิตรอดนานกว่ากลุ่มควบคุมที่กินน้ำ (p < 0.04) (รูปที่ 2C) เมื่อเทียบกับน้ำ ตัวเมียที่กินปัสสาวะสดและปัสสาวะเก่า 24 ชั่วโมงมีชีวิตรอดนานกว่า (p = 0.001 และ p = 0.012 ตามลำดับ; รูปที่ 2D) ในขณะที่ตัวเมียที่กินปัสสาวะเก่า 72 ชั่วโมงมีชีวิตรอดนานกว่าตัวเมียที่กินปัสสาวะสดและปัสสาวะเก่า 24 ชั่วโมง ปัสสาวะที่เก็บไว้นาน (p < 0.0001 และ p = 0.013 ตามลำดับ; รูปที่ 2D) เมื่อได้รับยูเรียความเข้มข้น 135 mM ตัวเมียที่กินเลือดจะมีชีวิตอยู่ได้นานกว่ายูเรียความเข้มข้นอื่นๆ และน้ำ (p < 0.013; รูปที่ 2E)
การอยู่รอดของยุงตัวเมีย Anopheles arabinis ที่หาโฮสต์และดูดเลือด โดยกินปัสสาวะวัวและยูเรีย ในการทดสอบทางชีวภาพ (A) ยุงตัวเมียได้รับอาหารที่ประกอบด้วยปัสสาวะวัวสดและเก่า ยูเรียความเข้มข้นต่างๆ ซูโครส (10%) และน้ำกลั่น (H2O) บันทึกการอยู่รอดของยุงที่หาโฮสต์ (B, C) และดูดเลือด (D, E) ทุก 12 ชั่วโมง จนกระทั่งยุงตัวเมียทั้งหมดที่กินปัสสาวะ (B, D) และยูเรีย (C, E) และกลุ่มควบคุม ซูโครสและน้ำ ตายหมด
ระยะทางรวมและจำนวนรอบที่วัดได้ในการทดสอบการบินตลอด 24 ชั่วโมงนั้นแตกต่างกันระหว่างยุงที่หาเหยื่อและยุงที่ดูดเลือด ซึ่งแสดงให้เห็นกิจกรรมการบินโดยรวมที่น้อยกว่า (รูปที่ 3) ยุงที่หาเหยื่อซึ่งให้ปัสสาวะสดและปัสสาวะเก่า หรือน้ำตาลซูโครสและน้ำ แสดงรูปแบบการบินที่แตกต่างกัน (รูปที่ 3) โดยยุงตัวเมียที่กินปัสสาวะสดจะมีความกระตือรือร้นมากขึ้นในช่วงรุ่งเช้า ในขณะที่ยุงที่กินปัสสาวะเก่า 24 และ 168 ชั่วโมงจะมีความกระตือรือร้นมากกว่า ยุงที่กินปัสสาวะแสดงรูปแบบการบินที่แตกต่างกันและส่วนใหญ่จะออกหากินในเวลากลางวัน ยุงตัวเมียที่ให้น้ำตาลซูโครสหรือปัสสาวะเก่า 72 ชั่วโมงแสดงกิจกรรมตลอด 24 ชั่วโมง ในขณะที่ยุงตัวเมียที่ให้น้ำจะมีความกระตือรือร้นมากขึ้นในช่วงกลางของช่วงเวลา ยุงที่กินน้ำตาลซูโครสแสดงระดับกิจกรรมสูงสุดในช่วงดึกและเช้าตรู่ ในขณะที่ยุงที่กินปัสสาวะเก่า 72 ชั่วโมงมีกิจกรรมลดลงอย่างต่อเนื่องตลอด 24 ชั่วโมง (รูปที่ 3)
ประสิทธิภาพการบินของยุงลาย Anopheles arabinis เพศเมียที่ออกล่าเหยื่อและดูดเลือด โดยกินปัสสาวะวัวและยูเรีย ในการทดสอบด้วยเครื่องหมุนบิน ยุงเพศเมียที่กินปัสสาวะวัวสดและเก่า ยูเรียความเข้มข้นต่างๆ ซูโครส (10%) และน้ำกลั่น (H2O) ถูกผูกติดกับแขนแนวนอนที่หมุนได้อย่างอิสระ (ด้านบน) สำหรับยุงเพศเมียที่ออกล่าเหยื่อ (ซ้าย) และดูดเลือด (ขวา) ระยะทางรวมและจำนวนเที่ยวบินต่อชั่วโมงสำหรับอาหารแต่ละชนิดตลอด 24 ชั่วโมงถูกบันทึกไว้ (สีเข้ม: สีเทา; สีอ่อน: สีขาว) ระยะทางเฉลี่ยและจำนวนเที่ยวบินเฉลี่ยแสดงอยู่ทางด้านขวาของกราฟกิจกรรมตามรอบวัน แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย การวิเคราะห์ทางสถิติดูได้ในเนื้อหา
โดยทั่วไป กิจกรรมการบินโดยรวมของยุงตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์มีรูปแบบคล้ายคลึงกับระยะทางการบินในช่วง 24 ชั่วโมง ระยะทางการบินเฉลี่ยได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากอาหารที่กินเข้าไป (F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001) และยุงตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ซึ่งกินปัสสาวะที่เก็บไว้ 72 ชั่วโมงจะบินได้ไกลกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับอาหารอื่นๆ ทั้งหมด (p < 0.0001) และยุงที่กินซูโครสจะบินได้ไกลกว่ายุงที่กินปัสสาวะสด (p = 0.022) และยุงที่กินปัสสาวะที่เก็บไว้ 24 ชั่วโมง (p = 0.022) ในทางตรงกันข้ามกับรูปแบบกิจกรรมการบินที่อธิบายโดยอาหารปัสสาวะ ยุงตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ซึ่งกินยูเรียแสดงกิจกรรมการบินอย่างต่อเนื่องในช่วง 24 ชั่วโมง โดยมีกิจกรรมสูงสุดในช่วงครึ่งหลังของช่วงเวลามืด (รูปที่ 3) แม้ว่ารูปแบบกิจกรรมจะคล้ายกัน แต่ยุงตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ซึ่งกินยูเรียจะเพิ่มระยะทางการบินเฉลี่ยอย่างมีนัยสำคัญขึ้นอยู่กับความเข้มข้นที่ดูดซึม (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001) ตัวเมียที่ออกหาโฮสต์ที่ได้รับยูเรียในความเข้มข้นใดๆ จะบินได้นานกว่าตัวเมียที่ได้รับน้ำหรือซูโครส (p < 0.03)
โดยรวมแล้ว กิจกรรมการบินของยุงดูดเลือดมีความคงที่และต่อเนื่องตลอด 24 ชั่วโมงในทุกอาหาร โดยมีกิจกรรมการขับปัสสาวะเพิ่มขึ้นในช่วงครึ่งหลังของช่วงเวลามืดสำหรับยุงตัวเมียที่กินน้ำ เช่นเดียวกับยุงตัวเมียที่กินปัสสาวะสดและปัสสาวะที่เก็บไว้ 24 ชั่วโมง (ภาพที่ 3) ในขณะที่อาหารที่มีส่วนผสมของปัสสาวะส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อระยะทางการบินเฉลี่ยของยุงตัวเมียที่กินเลือด (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004) แต่อาหารที่มีส่วนผสมของยูเรียไม่มีผลกระทบ (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) เมื่อเทียบกับปัสสาวะชนิดอื่นและอาหารควบคุม (สด, p = 0.0091; 72 ชั่วโมง, p = 0.0022; 168 ชั่วโมง, p = 0.001; ซูโครส, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036)
ผลกระทบของการให้อาหารด้วยปัสสาวะและยูเรียต่อพารามิเตอร์การสืบพันธุ์ได้รับการประเมินในการทดสอบทางชีวภาพการวางไข่ (รูปที่ 4A) และได้รับการตรวจสอบตามจำนวนไข่ที่วางโดยตัวเมียแต่ละตัว ขนาดไข่ และตัวอ่อนระยะแรกที่ฟักออกมาใหม่ จำนวนไข่ที่วางของตัวเมียพันธุ์อาราบที่กินปัสสาวะแตกต่างกันไปตามชนิดของอาหาร (F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; รูปที่ 4B) ตัวเมียที่กินปัสสาวะ 24 ชั่วโมงและเลือดวางไข่มากกว่าตัวเมียที่กินปัสสาวะชนิดอื่นอย่างมีนัยสำคัญ และมีจำนวนไข่ใกล้เคียงกับตัวเมียที่กินซูโครส (รูปที่ 4B) ในทำนองเดียวกัน ขนาดของไข่ที่วางโดยตัวเมียที่กินปัสสาวะแตกต่างกันไปตามชนิดของอาหาร (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001) โดยตัวเมียที่กินปัสสาวะ 24 ชั่วโมงและซูโครสวางไข่ขนาดใหญ่กว่าตัวเมียที่กินน้ำอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ไข่ของตัวเมียที่กิน... ตัวอ่อนที่กินปัสสาวะเป็นเวลา 168 ชั่วโมงมีขนาดเล็กกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4C) นอกจากนี้ อาหารที่เป็นปัสสาวะยังส่งผลต่อขนาดของตัวอ่อนอย่างมีนัยสำคัญ (F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001) โดยตัวอ่อนที่ฟักออกจากไข่ที่วางโดยตัวเมียที่กินปัสสาวะอายุ 24 และ 72 ชั่วโมงมีขนาดใหญ่กว่าตัวอ่อนที่ฟักออกจากไข่ที่วางโดยตัวเมียที่กินปัสสาวะเป็นเวลา 168 ชั่วโมงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4D)
ประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ของยุงลาย Anopheles arabinis เพศเมียที่กินปัสสาวะวัวและยูเรีย ยุงเพศเมียที่ดูดเลือดแล้วถูกเลี้ยงด้วยอาหารที่ประกอบด้วยปัสสาวะวัวสดและปัสสาวะวัวเก่า ยูเรียความเข้มข้นต่างๆ ซูโครส (10%) และน้ำกลั่น (H2O) เป็นเวลา 48 ชั่วโมงก่อนนำไปทดสอบทางชีวภาพและเก็บตัวอย่างเพื่อวางไข่ (A) จำนวนไข่ (B, E) ขนาดไข่ (C, F) และขนาดตัวอ่อน (D, G) ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากอาหารที่ให้ (ปัสสาวะวัว: BD; ยูเรีย: EG) ค่าเฉลี่ยของแต่ละพารามิเตอร์ที่วัดโดยใช้ชื่อตัวอักษรที่แตกต่างกันนั้นแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวโดยใช้การวิเคราะห์หลังการทดสอบของ Tukey; p < 0.05) แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย
ยูเรียซึ่งเป็นส่วนประกอบไนโตรเจนหลักของปัสสาวะ เมื่อให้เป็นอาหารแก่ตัวเมียที่กินเลือดแล้ว ส่งผลต่อพารามิเตอร์การสืบพันธุ์อย่างมีนัยสำคัญในทุกการศึกษา จำนวนไข่ที่ตัวเมียวางหลังจากกินเลือดแล้ว ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของยูเรีย (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001) โดยตัวเมียที่ได้รับยูเรียความเข้มข้นระหว่าง 134 µM ถึง 1.34 mM จะวางไข่มากกว่า (รูปที่ 4E) ตัวเมียที่ได้รับยูเรียความเข้มข้น 134 µM ขึ้นไปจะวางไข่ขนาดใหญ่กว่าตัวเมียที่กินน้ำ (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; รูปที่ 4F) และขนาดของตัวอ่อน แม้ว่าจะได้รับผลกระทบจากความเข้มข้นของยูเรียที่คล้ายกันในแม่ (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001) ก็มีความแปรปรวนมากกว่า (รูปที่ 4E) 4G)
โดยรวมแล้ว ยุงลายสายพันธุ์ Arabiensis มีความดึงดูดต่อสารสกัดระเหยจากปัสสาวะวัวที่ดึงดูดยุงชนิดอื่น โดยประเมินด้วยเครื่องวัดกลิ่นแบบหลอดแก้ว (รูปที่ 5A) พบว่าอายุของปัสสาวะมีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อยุง (χ² = 15.9, df = 4, p = 0.0032; รูปที่ 5B) การวิเคราะห์เพิ่มเติมพบว่า กลิ่นปัสสาวะเก่าที่ 24 ชั่วโมง ทำให้ยุงมีความดึงดูดมากกว่ากลิ่นอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ (72 ชั่วโมง: p = 0.0060, 168 ชั่วโมง: p = 0.012, เพนเทน: p = 0.00070) ยกเว้นกลิ่นปัสสาวะสด (p = 0.13; รูปที่ 5B) แม้ว่าโดยรวมแล้วยุงดูดเลือดจะมีความดึงดูดต่อกลิ่นปัสสาวะไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (χ² = 8.78, df = 4, p = 0.067; รูปที่ 5C) แต่พบว่ายุงตัวเมียเหล่านี้มีความดึงดูดต่อสารสกัดระเหยจากปัสสาวะมากกว่าอย่างมีนัยสำคัญ สารสกัดระเหยเมื่อเปรียบเทียบกับปัสสาวะที่เก็บไว้ 72 ชั่วโมงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (p = 0.0066; รูปที่ 5C)
การตอบสนองทางพฤติกรรมต่อกลิ่นปัสสาวะวัวธรรมชาติและสังเคราะห์ในการค้นหาโฮสต์และยุง Anopheles arabianus ที่ดูดเลือด แผนภาพของเครื่องวัดกลิ่นแบบหลอดแก้ว (A) การดึงดูดของสารสกัดระเหยจากปัสสาวะวัวสดและที่เก็บไว้นานต่อโฮสต์ (B) และยุงดูดเลือด (C) ค้นหาปฏิกิริยาของหนวดของยุง Anopheles arabianus สารสกัดระเหยที่แยกได้จากปัสสาวะวัวสด (D) เก็บไว้ 24 ชั่วโมง (E) เก็บไว้ 72 ชั่วโมง (F) และ 168 ชั่วโมง (G) แสดงไว้ในภาพ ร่องรอยการตรวจจับเสาอากาศอิเล็กตรอน (EAD) แสดงการเปลี่ยนแปลงแรงดันไฟฟ้าในการตอบสนองต่อสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพในไอระเหยที่ถูกชะล้างออกจากเครื่องโครมาโทกราฟแก๊สและตรวจจับโดยเครื่องตรวจจับการแตกตัวเป็นไอออนด้วยเปลวไฟ (FID) แถบมาตราส่วนแสดงถึงแอมพลิจูดการตอบสนอง (mV) เทียบกับเวลาการคงอยู่ (s) คุณสมบัติและอัตราการปลดปล่อย (µg h-1) ของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพแสดงไว้ในภาพ เครื่องหมายดอกจันเดี่ยว (*) แสดงถึงการตอบสนองแอมพลิจูดต่ำที่สม่ำเสมอ เครื่องหมายดอกจันคู่ (*) แสดงถึงการตอบสนองแอมพลิจูดต่ำ เครื่องหมายดอกจัน (**) แสดงถึงการตอบสนองที่ไม่สามารถทำซ้ำได้ พบว่ายุง An.arabiensis ซึ่งเป็นโฮสต์ (H) และยุงดูดเลือด (I) มีความชอบที่แตกต่างกันต่อกลิ่นผสมสังเคราะห์ของปัสสาวะวัวสดและเก่า สัดส่วนเฉลี่ยของยุงที่ถูกดึงดูดด้วยชื่อตัวอักษรที่แตกต่างกันนั้นแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวโดยใช้การวิเคราะห์แบบ post hoc ของ Tukey; p < 0.05) แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของมาตราส่วน
ในปลา Ann.arabiensis เพศเมีย 72 ชั่วโมงและ 120 ชั่วโมงหลังจากการกินเลือด ในช่วงวางไข่ ไม่พบความชอบสารสกัดระเหยจากปัสสาวะวัวสดและปัสสาวะวัวที่เก็บไว้นานเมื่อเทียบกับสารควบคุมเพนเทน (χ2 = 3.07, p > 0.05; ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S1)
สำหรับการวิเคราะห์ Ann.arabiensis เพศเมียด้วย GC-EAD และ GC-MS พบสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพแปด หก สาม และสามชนิดตามลำดับ (รูปที่ 5D-G) แม้ว่าจะพบความแตกต่างในจำนวนสารประกอบที่กระตุ้นการตอบสนองทางไฟฟ้าสรีรวิทยา แต่สารประกอบส่วนใหญ่เหล่านี้มีอยู่ในสารสกัดระเหยจากปัสสาวะสดและปัสสาวะเก่า ดังนั้น สำหรับสารสกัดแต่ละชนิด จึงมีเพียงสารประกอบที่ทำให้เกิดการตอบสนองทางสรีรวิทยาจากหนวดของเพศเมียที่สูงกว่าเกณฑ์เท่านั้นที่จะถูกนำไปวิเคราะห์เพิ่มเติม
อัตราการปลดปล่อยสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพระเหยได้ทั้งหมดในส่วนที่เก็บรวบรวมจากพื้นที่เหนือของเหลวเพิ่มขึ้นจาก 29 µg h-1 ในปัสสาวะสดเป็น 242 µg h-1 ในปัสสาวะที่เก็บไว้ 168 ชั่วโมง ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจาก p-cresol และ m-formaldehyde นอกจากนี้ปริมาณฟีนอลก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน ในทางตรงกันข้าม อัตราการปลดปล่อยสารประกอบอื่นๆ เช่น 2-cyclohexen-1-one และ decanal ลดลงเมื่ออายุของปัสสาวะเพิ่มขึ้น ซึ่งสอดคล้องกับการลดลงของความเข้มของสัญญาณ (ปริมาณ) ที่สังเกตได้ในโครมาโตแกรม (รูปที่ 5D-G แผงด้านซ้าย) และการตอบสนองทางสรีรวิทยาต่อสารประกอบเหล่านี้ (รูปที่ 5D-G แผงด้านขวา)
โดยรวมแล้ว สารผสมสังเคราะห์มีอัตราส่วนของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่คล้ายคลึงกันกับที่พบในสารสกัดระเหยจากปัสสาวะสดและปัสสาวะที่เก็บไว้นาน (รูปที่ 5D–G) และดูเหมือนว่าจะไม่ดึงดูดความสนใจอย่างมีนัยสำคัญในการค้นหาโฮสต์ (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; รูปที่ 5H) หรือยุงดูดเลือด (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; รูปที่ 5I) อย่างไรก็ตาม การเปรียบเทียบแบบจับคู่หลังการทดลองแสดงให้เห็นว่ายุงที่กำลังหาโฮสต์นั้นดึงดูดใจอย่างมีนัยสำคัญต่อสารผสมสังเคราะห์ของปัสสาวะที่เก็บไว้นาน 24 ชั่วโมงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเพนเทน (p = 0.0086; รูปที่ 5H)
เพื่อประเมินบทบาทของส่วนประกอบแต่ละชนิดในสารผสมสังเคราะห์ของปัสสาวะที่บ่มไว้ 24 ชั่วโมง ได้มีการประเมินสารผสมแบบหักลบ 6 ชนิดเทียบกับสารผสมแบบสมบูรณ์ในการทดสอบแบบ Y-tube ซึ่งมีการนำสารประกอบแต่ละชนิดออกไป สำหรับยุงที่หาเหยื่อ การหักลบสารประกอบแต่ละชนิดออกจากสารผสมแบบสมบูรณ์มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการตอบสนองทางพฤติกรรม (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S2A) สารผสมแบบหักลบทั้งหมดดึงดูดยุงได้มากกว่าสารผสมแบบสมบูรณ์ ในทางตรงกันข้าม การนำสารประกอบแต่ละชนิดออกจากสารผสมสังเคราะห์แบบสมบูรณ์ไม่มีผลต่อการตอบสนองทางพฤติกรรมของยุงดูดเลือด (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077) ยกเว้นเดคาแนล ซึ่งมีระดับการดึงดูดต่ำกว่าเมื่อเทียบกับสารผสมแบบสมบูรณ์ (p = 0.022; ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S2B)
ในหมู่บ้านที่มีโรคมาลาเรียระบาดในประเทศเอธิโอเปีย ได้มีการประเมินประสิทธิภาพของสารผสมสังเคราะห์จากปัสสาวะวัวที่ทิ้งไว้ 24 ชั่วโมง ในการดึงดูดยุงภายใต้สภาพแวดล้อมจริงเป็นเวลาสิบคืน (รูปที่ 6A) จับและระบุชนิดของยุงได้ทั้งหมด 4,861 ตัว โดย 45.7% เป็น Anthropus gambiae sl, 18.9% เป็น Anopheles pharoensis และ 35.4% เป็น Culex spp. (ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S1) Anopheles arabinis เป็นสมาชิกเพียงชนิดเดียวของกลุ่มสายพันธุ์ An.Gambian ที่ระบุได้ด้วยการวิเคราะห์ PCR โดยเฉลี่ยแล้วจับยุงได้ 320 ตัวต่อคืน ในช่วงเวลาดังกล่าวกับดักที่มีเหยื่อผสมสังเคราะห์จับยุงได้มากกว่ากับดักที่ไม่มีเหยื่อผสม (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001) กับดักที่ไม่มีเหยื่อถูกวางไว้ในคืนควบคุมห้าคืนแรก ช่วงกลางและช่วงท้ายของการทดลอง จำนวนยุงที่จับได้ในกับดักแต่ละคู่มีจำนวนใกล้เคียงกัน แสดงให้เห็นว่าไม่มีความลำเอียงระหว่างบ้าน (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0.05) และไม่มีการลดลงของประชากรยุงในช่วงระยะเวลาการศึกษา เมื่อเปรียบเทียบกับกับดักควบคุม จำนวนยุงที่จับได้ในกับดักที่มีส่วนผสมของสารสังเคราะห์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ได้แก่ ยุงที่กำลังหาเหยื่อ (χ2(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), ยุงที่เพิ่งดูดเลือด (χ2(0, 650) = 32.2, p < 0.0001) และยุงที่กำลังตั้งท้อง (χ2(0, 228) = 6.27, p = 0.0123; ไฟล์เพิ่มเติม 1: ตาราง S1) ซึ่งสะท้อนให้เห็นในจำนวนยุงทั้งหมดที่ถูกจับได้เช่นกัน คือ ยุงที่กำลังหาเหยื่อ > ยุงที่กำลังดูดเลือด > ยุงที่กำลังตั้งท้อง > ยุงที่กำลังตั้งท้องบางส่วน > ยุงตัวผู้
การประเมินภาคสนามเกี่ยวกับประสิทธิภาพของส่วนผสมกลิ่นปัสสาวะวัวสังเคราะห์ 24 ชั่วโมง การทดลองภาคสนามดำเนินการในภาคกลางตอนใต้ของเอธิโอเปีย (แผนที่) ใกล้เมืองมากิ (ภาพแทรก) โดยใช้กับดักแสงของศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค (CDC) (ด้านขวา) ในบ้านคู่ที่มีการออกแบบแบบลาตินสแควร์ (ภาพถ่ายทางอากาศ) (A) กับดักแสง CDC ที่ใช้กลิ่นล่อสังเคราะห์ดึงดูดและจับยุงตัวเมีย Anopheles arabesques (B) แต่ไม่สามารถจับ Anopheles farroes (C) ได้ในลักษณะที่แตกต่างกัน ซึ่งเป็นผลที่ขึ้นอยู่กับสภาวะทางสรีรวิทยา นอกจากนี้ กับดักเหล่านี้ยังจับยุงพาหะ Culex ได้ในจำนวนที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (D) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม แท่งกราฟด้านซ้ายแสดงถึงดัชนีการเลือกเฉลี่ยของยุงที่จับได้ในกับดักคู่ที่มีกลิ่นล่อ (สีเขียว) และกับดักควบคุม (เปิด) (N = 10) ในขณะที่แท่งกราฟด้านขวาแสดงถึงดัชนีการเลือกเฉลี่ยในกับดักคู่ควบคุม (เปิด; N = 5) เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงระดับนัยสำคัญทางสถิติ (*p = 0.01 และ ***p < 0.0001)
ยุงทั้งสามชนิดถูกจับได้แตกต่างกันในกับดักที่บรรจุสารผสมสังเคราะห์ โดยยุงชนิด a.arabiensis ที่กำลังมองหาโฮสต์ (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), การดูดเลือด (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) และการตั้งครรภ์ (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) ถูกดักจับได้ในกับดักที่ปล่อยสารผสมสังเคราะห์ (รูปที่ 6B) ในขณะที่ปริมาณของยุงชนิด An.Pharoensis ไม่แตกต่างกัน ส่วนยุงชนิด Culex พบว่ามีจำนวนยุงที่กำลังมองหาโฮสต์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกับดักที่ล่อด้วยสารผสมสังเคราะห์ (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; รูปที่ 6D) เมื่อเทียบกับกับดักควบคุม
กับดักล่อเหยื่อที่วางไว้นอกพื้นที่ที่มีโฮสต์ที่เป็นไปได้ ระหว่างแหล่งเพาะพันธุ์และชุมชนชนบทในเอธิโอเปีย ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินว่ายุงมาลาเรียใช้กลิ่นปัสสาวะวัวเป็นสัญญาณบ่งชี้แหล่งที่อยู่อาศัยของโฮสต์หรือไม่ ในกรณีที่ไม่มีสัญญาณบ่งชี้โฮสต์ ความร้อน และมีหรือไม่มีกลิ่นปัสสาวะวัว ก็ไม่พบยุงเลย (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3) อย่างไรก็ตาม ในกรณีที่มีอุณหภูมิสูงและกลิ่นปัสสาวะวัว ยุงมาลาเรียตัวเมียจะถูกดึงดูดและจับได้ แม้ว่าจะในจำนวนน้อยก็ตาม โดยไม่ขึ้นอยู่กับอายุของปัสสาวะ (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3) ในทางตรงกันข้าม การควบคุมด้วยน้ำไม่ได้ดักจับยุงมาลาเรียที่อุณหภูมิสูง (ไฟล์เพิ่มเติม 1: รูปที่ S3)
ยุงมาลาเรียได้รับและกระจายสารประกอบที่มีไนโตรเจนผ่านการกินปัสสาวะวัว (เช่น แอ่งน้ำ) เพื่อเสริมสร้างลักษณะทางชีววิทยาคล้ายกับแมลงชนิดอื่น [2, 4, 24, 25, 26] ปัสสาวะวัวเป็นทรัพยากรหมุนเวียนที่หาได้ง่ายและเกี่ยวข้องกับแหล่งพักของพาหะนำโรคมาลาเรีย เช่น คอกวัวและพืชพรรณสูงใกล้บ้านเรือนในชนบทและแหล่งวางไข่ ยุงตัวเมียจะหาแหล่งทรัพยากรนี้โดยใช้กลิ่นและสามารถควบคุมการดูดซึมสารประกอบไนโตรเจนในปัสสาวะ รวมถึงยูเรีย ซึ่งเป็นส่วนประกอบไนโตรเจนหลักในปัสสาวะ [15, 16] ขึ้นอยู่กับสภาวะทางสรีรวิทยาของยุงตัวเมีย สารอาหารในปัสสาวะจะถูกจัดสรรเพื่อเพิ่มกิจกรรมการบินและการอยู่รอดของยุงตัวเมียที่กำลังหาโฮสต์ ตลอดจนการอยู่รอดและลักษณะการสืบพันธุ์ของยุงที่ดูดเลือดในช่วงวงจรโกนาโดโทรปิกแรก ดังนั้น การผสมปัสสาวะจึงมีบทบาททางโภชนาการที่สำคัญสำหรับพาหะนำโรคมาลาเรียที่อยู่ในสภาวะปิด เช่น ยุงตัวเต็มวัยที่ขาดสารอาหาร [8] เนื่องจากให้สารอาหารแก่ยุงตัวเมีย ยุงที่มีความสามารถในการได้รับสารประกอบไนโตรเจนที่สำคัญโดยการดูดเลือดที่มีความเสี่ยงต่ำ การค้นพบนี้มีผลกระทบทางระบาดวิทยาอย่างมาก เนื่องจากยุงตัวเมียมีอายุขัย กิจกรรม และผลผลิตทางการสืบพันธุ์เพิ่มขึ้น ซึ่งทั้งหมดนี้ส่งผลต่อความสามารถในการเป็นพาหะนำโรค นอกจากนี้ พฤติกรรมนี้อาจเป็นเป้าหมายของโครงการจัดการพาหะนำโรคในอนาคต