Næringsinnhenting og -distribusjon integrerer insekters beitesøk og livshistorieegenskaper. For å kompensere for mangler på spesifikke næringsstoffer på ulike livsstadier, kan insekter få tak i disse næringsstoffene gjennom supplerende fôring, for eksempel ved å spise virveldyrsekresjoner i en prosess kjent som pytter. Myggen Anopheles arabiani ser ut til å være underernært og trenger derfor næringsstoffer for både metabolisme og reproduksjon. Målet med denne studien var å vurdere om An. arabiensis-agitasjon på ku-urin for næringsinnhenting forbedrer livshistorieegenskapene.
Sørg for at det er trygt. arabiensis ble tiltrukket av lukten av fersk, 24-timers, 72-timers og 168-timers gammel ku-urin, og vertssøkende og blodforede (48 timer etter blodmåltid) hunner ble målt i et Y-rørs olfaktometer, og drektige hunner ble vurdert for gytetest. En kombinert kjemisk og elektrofysiologisk analyse ble deretter brukt til å identifisere bioaktive forbindelser i ku-urin i alle fire aldersklasser. Syntetiske blandinger av bioaktive forbindelser ble evaluert i Y-rørs- og feltforsøk. For å undersøke ku-urin og dens viktigste nitrogenholdige forbindelse urea som potensielle supplerende dietter for malariavektorer, ble fôringsparametere og livshistorieegenskaper målt. Andelen hunnmygg og mengden ku-urin og urea som ble absorbert ble vurdert. Etter fôring ble hunnene vurdert for overlevelse, bundet flyging og reproduksjon.
Let etter vertens blod og næring. I laboratorie- og feltstudier ble arabere tiltrukket av den naturlige og syntetiske duften av fersk og lagret ku-urin. Drektige hunner var likegyldige til ku-urinresponser på gyteplasser. Vertssøkende og blodsugende hunner absorberer aktivt ku-urin og urea og fordeler disse ressursene i henhold til livshistorieavveininger som en funksjon av fysiologisk tilstand for flyging, overlevelse eller reproduksjon.
Anopheles arabinis innsamling og distribusjon av ku-urin for forbedrede livshistoriekarakteristikker. Supplerende fôring med ku-urin påvirker vektorkapasiteten direkte ved å øke daglig overlevelse og vektortetthet, og indirekte ved å endre flyaktivitet, og bør derfor vurderes i fremtidige modeller.
Næringsinnhenting og -distribusjon integrerer insekters beitesøk og livshistorieegenskaper [1,2,3]. Insekter er i stand til å velge og tilegne seg mat og utføre kompenserende fôring basert på mattilgjengelighet og næringsbehov [1, 3]. Fordelingen av næringsstoffer avhenger av livshistorieprosessen og kan føre til forskjellige krav til kostholdskvalitet og -mengde i forskjellige livsstadier hos insekter [1, 2]. For å kompensere for mangler på spesifikke næringsstoffer kan insekter få disse næringsstoffene gjennom supplerende fôring, for eksempel på gjørme, forskjellige ekskrementer og sekreter fra virveldyr, og åtsel, en prosess kjent som pytter [2]. Selv om en rekke sommerfugl- og møllarter primært er beskrevet, forekommer vannhull også i andre insektordener, og tiltrekning til og fôring på disse typene ressurser kan ha betydelige effekter på helse og andre livshistorieegenskaper [2, 4, 5, 6], 7]. Malariamyggen Anopheles gambiae sensu lato (sl) fremstår som en "underernært" voksen [8], så vanning kan spille en viktig rolle i dens livshistorieegenskaper, men denne oppførselen har så langt blitt neglisjert. Bruken av omrøring som et middel for å øke næringsinntaket i dette viktige vehiklet fortjener oppmerksomhet, da dette kan ha viktige epidemiologiske konsekvenser.
Nitrogeninntaket hos voksne hunnmygg av typen Anopheles er begrenset på grunn av lave kalorireserver som bæres fra larvestadiet og ineffektiv utnyttelse av blodmel [9]. Hunnmygg av typen Ann.gambiae sl kompenserer vanligvis for dette ved å supplere med supplerende blodmel [10, 11], og dermed sette flere mennesker i fare for å bli smittet av sykdommen og sette myggene i større fare for predasjon. Alternativt kan mygg bruke supplerende fôring av virveldyrekskrementer for å tilegne seg nitrogenholdige forbindelser som forbedrer tilpasning og manøvrerbarhet i flyet, som demonstrert av andre insekter [2]. I denne forbindelse er den sterke og distinkte tiltrekningen til en av søskenartene innen An. Det gambiske sl-artkomplekset, Anopheles arabinis, fersk og lagret ku-urin [12, 13, 14], interessant. Anopheles arabinis er opportunistisk i sine vertspreferanser og er kjent for å omgås og spise storfe. Ku-urin er en ressurs rik på nitrogenholdige forbindelser, med urea som står for 50–95 % av det totale nitrogenet i fersk urin [15, 16]. Som Med tiden bruker mikroorganismer disse ressursene til å redusere kompleksiteten til nitrogenholdige forbindelser innen 24 timer [15]. Med den raske økningen i ammoniakk, assosiert med en nedgang i organisk nitrogen, trives alkalofile mikroorganismer (hvorav mange produserer forbindelser som er giftige for mygg) [15], som kan være hunn-Ann. arabiensis, og som fortrinnsvis tiltrekkes av urin som er gammel i 24 timer eller mindre [13, 14].
I denne studien ble det sett etter verts- og blodforede Anis. I løpet av sin første gonadotropin-syklus ble arabiensis vurdert for tilegnelse av nitrogenholdige forbindelser, inkludert urea, ved urinblanding. Deretter ble det utført en serie eksperimenter for å vurdere hvordan hunnmygg allokerer denne potensielle næringsressursen for forbedret overlevelse, reproduksjon og videre beitesøking. Til slutt ble lukten av fersk og lagret ku-urin vurdert for å avgjøre om disse ga pålitelige ledetråder for verts- og blodforede Anis. I sitt søk etter denne potensielle næringsressursen oppdaget arabiensis kjemiske korrelasjoner bak den observerte differensielle attraktiviteten. Syntetiske luktblandinger av flyktige organiske forbindelser (VOC) identifisert i 24-timers lagret urin ble videre evaluert under feltforhold, og resultatene oppnådd under laboratorieforhold ble utvidet og effekten av lukt av bovin urin på forskjellige fysiologiske tilstander demonstrert. Myggatertrekning. Resultatene som ble oppnådd bekrefter at An. arabiensis tilegner seg og distribuerer nitrogenholdige forbindelser som finnes i virveldyrs urin for å påvirke livshistoriekarakteristikker. Disse resultatene diskuteres i sammenheng med potensielle epidemiologiske konsekvenser og hvordan de kan brukes til vektorovervåking og -kontroll.
Anopheles arabicans (Dongola-stammen) ble holdt ved 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RF og en lys:mørke-syklus på 12:12 timer. Larvene ble oppdrettet i plastbrett (20 cm × 18 cm × 7 cm) fylt med destillert vann og foret med Tetramin® fiskefôr (Tetra Werke, Melle, Tyskland). Pupper ble samlet i 30 ml-kopper (Nolato Hertila, Åstorp, SE) og deretter overført til Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) for å la voksne individer komme frem. Voksne individer fikk en 10 % sukroseløsning ad libitum inntil 4 dager etter fremvekst (dpe), hvoretter vertssøkende hunner ble tilbudt diett rett før eksperimentet, eller ble sultet over natten med destillert vann før eksperimentet, som beskrevet nedenfor. Hunner brukt til flyverørseksperimenter ble bare sultet i 4–6 timer. med vann ad libitum. For å forberede blodsugende mygg for påfølgende bioanalyser, ble 4 dpe-hunner gitt defibrotisk saueblod (Håtunalab, Bro, SE) ved hjelp av et membranfôringssystem (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Storbritannia). Fullt overfylte hunner ble deretter overført til individuelle bur og gitt diett direkte, som beskrevet nedenfor, eller 10 % sukrose ad libitum i 3 dager før eksperimentene beskrevet nedenfor. De sistnevnte hunnene ble brukt til flyverørsbioanalyser og overført til laboratoriet, og fikk deretter destillert vann ad libitum i 4–6 timer før eksperimentet.
Fôringsanalyser ble brukt til å kvantifisere urin- og ureaforbruk hos voksne An.Arabiske hunner. Vertssøkende og blodforede hunner fikk et kosthold som inneholdt 1 % fortynnet fersk og lagret ku-urin, forskjellige konsentrasjoner av urea og to kontroller (10 % sukrose og vann) i 48 timer. I tillegg ble konditorfarge (1 mg ml-1 xylencyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) tilsatt kostholdet og levert i en 4 × 4-matrise i 250 µl mikrosentrifugerør (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figur 1A). Fyll til kanten (~300 µl). For å unngå konkurranse mellom mygg og potensielle effekter av fargestoff, plasser 10 mygg i en stor petriskål (12 cm i diameter og 6 cm i høyden; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figur 1A) i fullstendig mørke ved 25 ± 2 cm °C og 65 ± 5 % relativ temperatur. fuktighet. Disse forsøkene ble gjentatt 5 til 10 ganger. Etter eksponering for diett ble myggene plassert ved -20 °C inntil videre analyse.
Se etter kvegurin og urea absorbert av verten og den blodsugende hunnmyggen Anopheles arabianus. I fôringsforsøket (A) fikk hunnmygg en diett bestående av fersk og lagret kuurin, forskjellige konsentrasjoner av urea, sukrose (10 %) og destillert vann (H2O). Vertssøkende (B) og blodforede (C) hunner absorberte mer sukrose enn noen annen diett som ble testet. Merk at vertssøkende hunner absorberte 72-timers kuurin mindre enn 168-timers kuurin (B). Gjennomsnittlig totalt nitrogeninnhold (± standardavvik) i urin er representert i innsettet. Vertssøkende (D, F) og blodsugende (E, G) hunner tar opp urea på en doseavhengig måte. Gjennomsnittlig inhalert volum (D, E) med forskjellige bokstavnavn var signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (BE). Den rette stiplede linjen representerer den loglineære regresjonslinjen (F, G)
For å frigjøre absorbert mat ble myggene individuelt plassert i 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 230 µl destillert vann, og vevet ble knust ved hjelp av en engangspistel og trådløs motor (VWR International, Lund, SE), etterfulgt av sentrifugering ved 10 krpm i 10 minutter. Supernatanten (200 µl) ble overført til en 96-brønns mikroplate (Sigma-Aldrich), og absorbansen (λ620) ble bestemt ved hjelp av en spektrofotometerbasert mikroplateleser (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativt ble myggene malt i 1 ml destillert vann, hvorav 900 µl ble overført til en kyvette for spektrofotometrisk analyse (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). For å kvantifisere kostinntaket ble en standardkurve utarbeidet ved seriefortynning for å gi 0,2 µl til 2,4 µl av 1 mg ml-1 xylen. cyanid. Deretter ble den optiske tettheten av kjente fargestoffkonsentrasjoner brukt til å bestemme mengden mat hver mygg inntok.
Volumdata ble analysert ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys post hoc parvise sammenligninger (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineære regresjonsanalyser beskrev konsentrasjonsavhengig ureainntak og sammenlignet responser mellom vertssøkende og blodsugende mygg (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Omtrent 20 µl urinprøver fra hver aldersgruppe ble bundet på Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) og innkapslet i blikkkapsler (8 mm × 5 mm). Kapslene ble satt inn i forbrenningskammeret til en CHNS/O-analysator (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) for å bestemme nitrogeninnholdet i fersk og lagret urin i henhold til produsentens protokoll. Totalt nitrogen (g N l-1) ble kvantifisert basert på kjente ureakonsentrasjoner brukt som standard.
For å vurdere effekten av diett på overlevelse hos hunner som søker vert og suger blod, ble myggene plassert individuelt i store petriskåler (12 cm i diameter og 6 cm i høyden; Semadeni) med et nettingdekket hull i lokket (3 cm i diameter) for ventilasjon og matforsyning. Dietter ble gitt direkte etter 4 dpe og inkluderte 1 % fortynnet fersk og lagret ku-urin, fire konsentrasjoner urea og to kontroller, 10 % sukrose og vann. Hver diett ble pipettert på en tanntampong (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) satt inn i en 5 ml sprøyte (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), stempelet ble fjernet og plassert på toppen av en petriskål (figur 1).1A). Endre dietten hver dag. Oppretthold laboratoriet som beskrevet ovenfor. Overlevende mygg ble telt to ganger om dagen, mens døde mygg ble kastet til den siste myggen døde (n = 40 per behandling). Overlevelse av mygg fôret på forskjellige dietter ble statistisk analysert ved hjelp av Kaplan-Meyer overlevelseskurver og log-rank-tester. for å sammenligne overlevelsesfordelingen mellom dietter (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
En spesialtilpasset myggflyvemølle basert på Attisano et al.[17], laget av 5 mm tykke klare akrylpaneler (10 cm brede x 10 cm lange x 10 cm høye) uten front- og bakpaneler (fig. 3: øverst). En dreieanordning med et vertikalt rør laget av en gasskromatografikolonne (0,25 mm i diameter; 7,5 cm lang) med ender limt til en insektnål opphengt mellom et par neodymmagneter 9 cm fra hverandre. Et horisontalt rør laget av samme materiale (6,5 cm lang) delte det vertikale røret i to for å danne en sammenbundet arm og en arm som bar et lite stykke aluminiumsfolie som et lysavbrytende signal.
Hunner som hadde sultet i 24 timer fikk dietten ovenfor i 30 minutter før de ble holdt fast. Fullt mette hunnmygg ble deretter bedøvet individuelt på is i 2–3 minutter og festet til insektnåler med bivoks (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) og deretter bundet til armene på de horisontale rørene. Flygemølle. Omdreininger per flytur ble registrert av en spesialbygd datalogger, deretter lagret og vist ved hjelp av PC-Lab 2000™-programvare (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Flyvemøllen ble plassert i et klimaregulert rom (12 t:12 t, lys:mørke, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RF).
For å visualisere mønsteret av flyaktivitet ble den totale fløyne distansen (m) og det totale antallet sammenhengende flyaktiviteter beregnet per time over en 24-timers periode. I tillegg ble de gjennomsnittlige distansene fløyet av individuelle kvinner sammenlignet på tvers av behandlinger og analysert ved hjelp av enveis ANOVA og Tukeys post hoc-analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), hvor gjennomsnittlig distanse ble ansett som en avhengig variabel, mens behandling er en uavhengig faktor. I tillegg beregnes det gjennomsnittlige antallet runder i intervaller på 10 minutter.
For å vurdere effekten av diett på reproduksjonsytelsen til An.arabiensis, ble seks hunner (4 dpe) overført direkte til Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm) etter blodinnsamling, og deretter gitt det eksperimentelle dietten i 48 timer som beskrevet ovenfor. Diettene ble deretter fjernet, og gytekopper (30 ml; Nolato Hertila) fylt med 20 ml destillert vann ble gitt på den tredje dagen i 48 timer, og byttet hver 24. time. Gjenta hvert diettregime 20–50 ganger. Egg ble telt og registrert for hvert eksperimentelle bur. Delprøver av egg ble brukt til å vurdere gjennomsnittlig størrelse og lengdevariasjon for individuelle egg (n ≥ 200 per diett) ved hjelp av et Dialux-20-mikroskop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Tyskland) utstyrt med et Leica-kamera (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Tyskland). De resterende eggene ble holdt i et klimakontrollert rom under standard oppdrettsforhold i 24 timer, og et delutvalg av nylig oppvokste larver i 1. instar (n ≥ 200 per diett) ble målt, som beskrevet ovenfor. Antall egg og størrelsen på egg og larver ble sammenlignet mellom behandlinger og ved bruk av enveis ANOVA og Tukeys post hoc-analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Flyktige stoffer i headspace-området fra fersk (1 time etter prøvetaking), 24-timers, 72-timers og 168-timers aldret urin ble samlet fra prøver samlet fra zebu-kveg, arsi-raser. For enkelhets skyld ble urinprøver samlet tidlig om morgenen mens kyrne fortsatt var i fjøset. Urinprøver ble samlet fra 10 individer, og 100–200 ml av hver prøve ble overført til individuelle polyamid-bakeposer (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Tyskland) i 3-liters polyamid med lokk i vinylkloridplastfat. Flyktige stoffer i headspace-området fra hver urinprøve fra bovin ble samlet enten direkte (fersk) eller etter modning ved romtemperatur i 24 timer, 72 timer og 168 timer, dvs. at hver urinprøve var representativ for hver aldersgruppe.
For innsamling av flyktige stoffer i topprommet ble det brukt et lukket system for å sirkulere en aktivt karbonfiltrert gasstrøm (100 ml min-1) gjennom en polyamidpose til adsorpsjonskolonnen i 2,5 timer ved hjelp av en membranvakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg, Tyskland). Som kontroll ble det utført innsamling av flyktige stoffer i topprommet fra en tom polyamidpose. Adsorpsjonskolonnen var laget av teflonrør (5,5 cm x 3 mm id) som inneholdt 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mellom glassullplugger. Før bruk ble kolonnen skylt med 1 ml redestillert n-heksan (Merck, Darmstadt, Tyskland) og 1 ml pentan (99,0 % rent løsemiddel GC-kvalitet, Sigma Aldrich). De adsorberte flyktige stoffene ble eluert med 400 μl pentan. Innsamlingene i topprommet ble samlet og deretter lagret ved -20 °C inntil de ble brukt til videre analyse.
Atferdsresponser hos vertssøkende og blodspisende An. Flyktige ekstrakter fra hoderommet samlet fra fersk, 24-timers, 72-timers og 168-timers gammel urin ble analysert for flyktige ekstrakter fra Arabidopsis-mygg ved hjelp av et rett glassrørsolfaktometer [18]. Eksperimentene ble utført i løpet av ZT 13-15, toppperioden for Ans hjemsøkende aktivitet. Arab [19]. Et glassrørsolfaktometer (80 cm × 9,5 cm id) ble belyst med 3 ± 1 lx rødt lys ovenfra. Kullfiltrert og fuktet luftstrøm (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativ fuktighet) passerte bioanalysen ved 30 cm s-1. Luft føres gjennom en serie nettingskjermer i rustfritt stål, noe som skaper en laminær strømning og en jevn fjærstruktur. Tanntampongdispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), opphengt fra en 5 cm spole på den vindende enden av olfaktometeret, med stimulatorbytte hvert 5. minutt. For analyse ble 10 μl av hvert headspace-ekstrakt, fortynnet 1:10, brukt som stimulus. En lik mengde pentan ble brukt som kontroll. Individuelle vertssøkende eller blodsugende mygg ble plassert i individuelle utløsningsbur 2-3 timer før eksperimentets start. Utløsningsburet ble plassert på nedvindssiden av olfaktometeret, og myggene fikk akklimatisere seg i 1 minutt, og deretter ble sommerfuglventilen på buret åpnet for å slippe ut. Tiltrekning til behandling eller kontroll ble analysert som andelen mygg som kom i kontakt med kilden innen 5 minutter etter utløsning. Hvert flyktig headspace-ekstrakt og kontroll ble replikert minst 30 ganger, og for å unngå effektene av en hvilken som helst dag ble samme antall behandlinger og kontroller testet på hver eksperimentell dag. Søkeresponser fra vert og blodforede Ans. Arabiske versus headspace-sett ble analysert ved hjelp av nominell logistisk regresjon etterfulgt av parvise sammenligninger for oddeforhold (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institutt AS).
Ans gyterespons. Headspace-ekstrakter fra fersk og lagret ku-urin ble analysert i Bugdorm-bur (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastkopper (30 ml; Nolato Hertila) fylt med 20 ml destillert vann utgjorde gytesubstratet og ble plassert i motsatte hjørner av buret, 24 cm fra hverandre. Behandlingskopper ble justert med 10 μl av hvert headspace-ekstrakt i en 1:10 fortynning. En lik mengde pentan ble brukt til å justere kontrollkoppen. Behandlings- og kontrollkopper ble byttet mellom hvert eksperiment for å kontrollere for posisjonseffekter. Ti blodforede hunner ble sluppet ut i eksperimentelle bur ved ZT 9-11, og egg i kopper ble telt 24 timer senere. Formelen for å beregne gyteindeksen er: (antall egg lagt i behandlingskoppen – antall egg lagt i kontrollkoppen)/(totalt antall egg lagt). Hver behandling ble gjentatt 8 ganger.
Gasskromatografisk analyse og elektronantennemønsterdeteksjonsanalyse (GC-EAD) av hunnarten An.arabiensis ble utført som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt ble ferske flyktige ekstrakter fra topprommet separert ved bruk av en Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) utstyrt med en HP-5-kolonne (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm filmtykkelse, Agilent Technologies). og aldrende urin. Hydrogen ble brukt som mobil fase med en gjennomsnittlig lineær strømningshastighet på 45 cm s-1. Hver prøve (2 μl) ble injisert i 30 sekunder i splittløs modus med en innløpstemperatur på 225 °C. GC-ovnstemperaturen ble programmert fra 35 °C (3 minutters hold) til 300 °C (10 minutters hold) ved 10 °C min-1. I GC-avløpssplitteren ble 4 psi nitrogen tilsatt og splittet 1:1 i et Gerstel 3D/2 lavt dødvolumkryss (Gerstel, Mülheim, Tyskland) mellom flammeioniseringsdetektoren og EAD. GC-avløpskapillæren for EAD ble ført gjennom en Gerstel ODP-2 overføringslinje, som sporer GC-ovnstemperaturen pluss 5 °C, inn i et glassrør (10 cm × 8 mm), hvor det ble blandet med karbonfiltrert, fuktet luft (1,5 l min-1). Antennen ble plassert 0,5 cm fra rørets utløp. Hver enkelt mygg utgjorde ett replikat, og for vertssøkende mygg ble det utført minst tre replikater på urinprøver av hver alder.
Identifisering av bioaktive forbindelser i headspace-samlinger av fersk og lagret bovin urin ved bruk av en kombinert GC- og massespektrometer (GC-MS; 6890 GC og 5975 MS; Agilent Technologies) for å fremkalle antennresponser i GC-EAD-analyse, som opererer i elektronstøtioniseringsmodus ved 70 eV. GC-en var utstyrt med en HP-5MS UI-belagt smeltet silikakapillærkolonne (60 m × 0,25 mm indre diameter, 0,25 μm filmtykkelse) ved bruk av helium som mobil fase med en gjennomsnittlig lineær strømningshastighet på 35 cm s-1. En 2 μl prøve ble injisert ved bruk av samme injektorinnstillinger og ovnstemperatur som for GC-EAD-analysen. Forbindelser ble identifisert basert på deres retensjonstid (Kovát-indeks) og massespektre sammenlignet med det tilpassede biblioteket og NIST14-biblioteket (Agilent). Identifiserte forbindelser ble bekreftet ved å injisere autentiske standarder (Tilleggsfil 1: Tabell S2). For kvantifisering ble heptylacetat (10 ng, 99,8 % kjemisk renhet, Aldrich) ble injisert som en ekstern standard.
Evaluering av effekten av en syntetisk luktblanding bestående av bioaktive forbindelser identifisert i fersk og lagret urin for å tiltrekke vertssøkende og blodsugende Ans.arabiensis, ved bruk av samme olfaktometer og protokoll som ovenfor. Syntetiske blandinger etterlignet sammensetningen og proporsjonene av forbindelser i blandede flyktige ekstrakter fra frisk, 24-timers, 48-timers, 72-timers og 168-timers lagret urin (figur 5D-G; tilleggsfil 1: tabell S2). For analyse, bruk 10 μl av en 1:100 fortynning av den fullsyntetiske blandingen, med en total frigjøringshastighet fra omtrent 140-2400 ng t-1, for å vurdere attraktivitet for verts- og blodsugende mygg. Deretter utføres testen på komplette blandinger, der subtraktive blandinger av enkeltforbindelser fra den komplette blandingen fjernes. Søkeresponser fra verts- og blodforede Ans. Arabiske vs. syntetiske og subtraktive blandinger ble analysert ved bruk av nominell logistisk regresjon etterfulgt av parvise sammenligninger for oddeforhold. (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
For å vurdere om ku-urin kunne tjene som et indikator på vertshabitat for malariamygg, ble fersk og lagret ku-urin, samlet som beskrevet ovenfor, og vann plassert i 3-liters bøtter (100 ml) med netting og plassert i agnfeller for vertsdyr. (BG-HDT-versjon; BioGents, Regensburg, Tyskland). Ti feller plassert 50 m fra hverandre på beite, 400 m fra landsbysamfunnet (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´Ø) og uten storfe, på permanente yngleplasser og landsbyer. Fem feller ble varmet opp for å simulere tilstedeværelsen av en vert, mens fem feller ble stående uoppvarmede. Hvert behandlingssted roteres hver natt i totalt fem netter. Myggtall fanget i feller agnet med urin av ulik alder ble sammenlignet ved hjelp av logistisk regresjon med en beta-binomialfordeling (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I en malaria-endemisk landsby nær byen Maki, Oromia-regionen, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ Ø; figur 6A). Studien ble utført mellom midten av august og midten av september før den årlige innendørs restsprøytingen, sammen med en lang regntid. Fem par hus (20–50 m fra hverandre) i utkanten av landsbyen ble valgt ut til studien (figur 6A). Kriteriene som ble brukt for å velge husene var: ingen dyr tillatt i huset, ingen matlaging innendørs (trekking av ved eller trekull) var tillatt (i hvert fall i prøveperioden), og hus med maksimalt to innbyggere, som sov i ikke-insektmidler. under det behandlede myggnettet. Etisk godkjenning er gitt av Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) ved Det naturvitenskapelige fakultet (CNS-IRB), Addis Abeba universitet, i samsvar med retningslinjene fastsatt av Verdens medisinske forenings erklæring fra Helsingfors. Samtykke fra hver husholdningsoverhode ble innhentet med bistand fra helsepersonell. Hele prosessen er godkjent av lokale administrasjoner på distrikts- og avdelingsnivå («kebele»). Det eksperimentelle designet fulgte et 2 × 2 latinsk kvadratdesign, der syntetiske blandinger og kontroller ble tildelt parvise hus den første natten og byttet mellom husene den neste eksperimentelle natten. Denne prosessen ble gjentatt ti ganger. I tillegg, for å estimere myggaktivitet i utvalgte hus, ble CDC-fellene satt til å kjøre fem påfølgende netter i begynnelsen, midten og slutten av feltforsøket på samme tid på dagen.
En syntetisk blanding som inneholdt seks bioaktive forbindelser ble løst opp i heptan (97,0 % løsemiddel GC-kvalitet, Sigma Aldrich) og frigjort ved 140 ng h-1 ved bruk av en bomullsveke-dispenser [20]. Veke-dispenseren tillot at alle forbindelser ble frigjort i konstante proporsjoner gjennom hele det 12 timer lange eksperimentet. Heptan ble brukt som kontroll. Ampullen ble hengt ved siden av inngangspunktet til Centers for Disease Control and Prevention (CDC) lysfelle (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; figur 6A). Fellene ble hengt 0,8–1 m over bakken, nær fotenden av sengen, og en frivillig sov under et ubehandlet myggnett og opererte mellom 18:00 og 06:30. Mygg fanget etter kjønn og fysiologisk status (ikke-matet, matet, halvgravid og drektig [21] ble deretter screenet ved hjelp av polymerasekjedereaksjonsanalyse (PCR) for å identifisere arten morfologisk identifisert som A. gambiae sl. Medlemmer av komplekset [23]. I I feltstudien ble fellefangst av parede hus analysert ved hjelp av en nominal logistisk tilpasningsmodell, der tiltrekning var den avhengige variabelen og behandling (syntetisk blanding vs. kontroll) var den faste effekten (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Her rapporterer vi χ²- og p-verdiene fra sannsynlighetsforholdstesten.
Vurder om det er trygt. arabiensis var i stand til å få tak i urin, dens viktigste nitrogenkilde, urea, ved direkte fôring, innen 48 timer etter administrering i 4 dager etter (dpe) fôringsforsøk med vertssøkende og blodforede hunner (fig. 1A). Både vertssøkende og blodsugende hunner absorberte betydelig mer sukrose enn noen annen diett eller vann (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 og F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, henholdsvis; fig. 1B, C). Videre spiste vertssøkende hunner mindre i urin etter 72 timer sammenlignet med urin etter 168 timer (fig. 1B). Når de ble tilbudt en diett som inneholdt urea, absorberte vertssøkende hunner en betydelig større mengde urea ved 2,69 mM sammenlignet med alle andre konsentrasjoner og vann, mens den ikke kunne skilles fra 10 % sukrose (F(10,813)). = 15,72, p < 0,0001; figur 1D). Dette sto i kontrast til responsen til blodforede hunner, som vanligvis absorberte betydelig mer ureaholdig diett enn vann, om enn betydelig mindre enn 10 % sukrose (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; figur 1).1E). Videre, når man sammenlignet mellom de to fysiologiske tilstandene, absorberte flebotomiserte hunner mer urea enn vertssøkende hunner ved de laveste konsentrasjonene, og disse hunnene absorberte lignende mengder urea ved høyere konsentrasjoner (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; figur 1F, G). Mens inntak fra en ureaholdig diett så ut til å ha optimale verdier (figur 1D, E), var hunner i begge fysiologiske tilstander i stand til å modulere mengden urea som ble absorbert over hele området av ureakonsentrasjoner på en log-lineær måte (figur 1F, G). ). På samme måte ser det ut til at mygg kontrollerer nitrogenopptaket sitt ved å regulere mengden urin som absorberes, ettersom mengden nitrogen i urinen gjenspeiles i den absorberte mengden (figur 1B, C og B innfelte bilder).
For å vurdere effekten av urin og urea på overlevelse hos vertssøkende og blodsugende mygg, ble hunnene matet med urin i alle fire aldre (fersk, 24 timer, 72 timer og 168 timer etter avsetning), og et utvalg av ureakonsentrasjoner, samt destillert vann og 10 % sukrose, fungerte som kontroll (figur 2A). Denne overlevelsesanalysen viste at kosthold hadde en signifikant effekt på total overlevelse hos vertssøkende hunner (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; fig. 2B, C) og blodforede hunner (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figur 2D, E). I alle forsøkene hadde hunner som ble fôret med en diett av urin, urea og vann betydelig lavere overlevelsesrater sammenlignet med hunner som ble fôret med en sukrosediett (figur 2B-E). Vertssøkende hunner fôret med fersk og gammel urin viste forskjellige overlevelsesrater, der de som ble fôret med 72 timers gammel urin (p = 0,016) hadde lavest sannsynlighet for overlevelse (figur 2B). Videre overlevde vertssøkende hunner som ble fôret med 135 mM urea lenger enn vannkontrollene (p < 0,04) (figur 2C). Sammenlignet med vann overlevde kvinner som ble fôret med fersk urin og 24-timers urin lenger (p = 0,001 og p = 0,012, henholdsvis; figur 2D), mens kvinner som ble fôret med 72-timers urin overlevde lenger enn de som ble fôret med kvinnelig kort fersk urin og 24-timers gammel urin (p < 0,0001 og p = 0,013, henholdsvis; figur 2D). Når de ble fôret med 135 mM urea, overlevde blodforede hunner. overlevde lenger enn alle andre konsentrasjoner av urea og vann (p < 0,013; figur 2E).
Overlevelse av verts- og blodsugende hunnmygg av typen Anopheles arabinis som spiser ku-urin og urea. I bioanalysen (A) fikk hunnmygg en diett bestående av fersk og lagret ku-urin, forskjellige konsentrasjoner av urea, sukrose (10 %) og destillert vann (H2O). Overlevelsen til vertssøkende (B, C) og blodsugende (D, E) mygg ble registrert hver 12. time inntil alle hunnmygg som spiste urin (B, D) og urea (C, E), og kontrollmygg, sukrose og vann, var døde.
Den totale avstanden og antall skudd bestemt i flight mill-testen over en 24-timers periode varierte mellom vertssøkende og blodsugende mygg, som viste mindre flyaktivitet totalt sett (fig. 3). Vertssøkende mygg som ga fersk og lagret urin eller sukrose og vann viste tydelige flymønstre (fig. 3), der hunner som spiste fersk urin var mer aktive ved daggry, mens de som fikk 24- og 168-timers gammel urin. Mygg som spiste urin viste forskjellige flymønstre og var primært dagaktive. Hunnmygg som ga sukrose eller 72-timers urin viste aktivitet gjennom hele 24-timersperioden, mens hunner som ga vann var mer aktive i løpet av midtperioden. Mygg fôret med sukrose viste de høyeste aktivitetsnivåene sent på kvelden og tidlig på morgenen, mens de som inntok 72-timers gammel urin opplevde en jevn nedgang i aktivitet over 24 timer (figur 3).
Flyveevnen til den jegersøkende, blodsugende hunnmyggen Anopheles arabinis som spiser ku-urin og urea. I flymølletesten ble hunnmygg som spiste fersk og lagret ku-urin, forskjellige konsentrasjoner av urea, sukrose (10 %) og destillert vann (H2O) festet til horisontale, fritt roterende armer (over). For vertssøkende (venstre) og blodsugende (høyre) hunner ble den totale avstanden og antall flyvninger per time for hver diett over en 24-timers periode registrert (mørk: grå; lys: hvit). Gjennomsnittlig avstand og gjennomsnittlig antall anfall vises til høyre for døgnaktivitetsgrafen. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet. Statistisk analyse, se tekst.
Generelt fulgte den totale flyaktiviteten til vertssøkende hunner et mønster som ligner på flyavstanden over en 24-timers periode. Gjennomsnittlig flyavstand ble signifikant påvirket av inntatt kosthold (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), og vertssøkende hunner som inntok 72 timer med urin fløy betydelig lengre avstander sammenlignet med alle andre dietter (p < 0,0001), og sukroseforede mygg fløy lenger enn ferske (p = 0,022) og 24-timers urinforede (p = 0,022) mygg. I motsetning til flyaktivitetsmønsteret beskrevet av urindietten, viste ureaforede vertssøkende hunner vedvarende flyaktivitet over en 24-timers periode, med en topp i andre halvdel av den mørke fasen (fig. 3). Selv om aktivitetsmønstrene var like, økte vertssøkende hunner matet med urea betydelig gjennomsnittlig flyavstand avhengig av den absorberte konsentrasjonen (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Vertssøkende hunner som fikk en hvilken som helst konsentrasjon av urea fløy lenger enn hunner som fikk enten vann eller sukrose (p < 0,03).
Den totale flyaktiviteten til blodsugende mygg var stabil og vedvarende over 24 timer på tvers av alle dietter, med økt urinaktivitet i løpet av andre halvdel av den mørke perioden for hunner fôret med vann, så vel som hos hunner fôret ferske og 24 timer gamle (bilde 3). Mens urindiett påvirket gjennomsnittlig flyavstand hos blodforede hunner betydelig (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), gjorde ikke ureasdietten det (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) med annen urin og kontrolldiett (fersk, p = 0,0091; 72 timer, p = 0,0022; 168 timer, p = 0,001; sukrose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Effektene av urin- og ureaføding på reproduksjonsparametre ble vurdert i eggleggingsbioanalyser (figur 4A) og ble undersøkt i henhold til antall egg lagt av hver hunn, eggstørrelse og nyklekkede larver i første stadium. Antall egg lagt. Urinforede arabiske hunner varierte etter diett (F(5 222) = 4,38, p = 0,0008; fig. 4B). Hunner som fikk urin- og blodmel døgnet rundt la betydelig flere egg enn hunner som fikk andre urindiettene, og de var lik de som fikk sukrose (fig. 4B). På samme måte varierte størrelsen på egg lagt av urinforede hunner etter diett (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), der hunner som fikk urin og sukrose døgnet rundt la betydelig større egg enn hunner som fikk vann, mens eggene til hunner som fikk 168 timer urin var betydelig mindre (fig. 4C). I tillegg påvirket urindietten larvestørrelsen betydelig. (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), med betydelig større larver som kom ut av egg lagt av 24- og 72-timers gamle urinforede hunner enn fra egg lagt fra egglarver. Vannforede hunner og 168-timers urinforede hunner (figur 4D).
Reproduksjonsevnen til hunnmygg av slekten Anopheles arabinis som spiser ku-urin og urea. Blodforede hunnmygg ble matet med dietter bestående av fersk og lagret ku-urin, forskjellige konsentrasjoner av urea, sukrose (10 %) og destillert vann (H2O) i 48 timer før de ble plassert i bioanalyser og fikk eggleggingssubstrater (A). Eggantall (B, E), eggstørrelse (C, F) og larvestørrelse (D, G) ble betydelig påvirket av dietten som ble gitt (ku-urin: BD; urea: EG). Gjennomsnittene for hver parameter målt ved hjelp av forskjellige bokstavnavn var signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Feilfeltene representerer standardfeilen for gjennomsnittet.
Urea, som er den viktigste nitrogenholdige komponenten i urin, påvirket reproduksjonsparametrene betydelig i alle studier når det ble gitt som diett til blodforede hunner. Antall egg lagt av hunner fôret med urea etter et blodmåltid, avhengig av ureakonsentrasjon (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), la hunner fôret med ureakonsentrasjoner mellom 134 µM og 1,34 mM flere egg (figur 4E). Hunner fôret med ureakonsentrasjoner på 134 µM eller høyere la større egg enn hunner fôret med vann (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; figur 4F), og larvestørrelsen, selv om den ble påvirket av lignende konsentrasjoner av urea hos mødrene (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), var mer variabel (figur 4G).
Generell tiltrekning til vertssøkende flyktige ekstrakter fra bovin urin i headspace. Arabiensis-en som ble vurdert i glassrørsolfaktometeret (fig. 5A) ble signifikant påvirket av urinens alder (χ² = 15,9, df = 4, p = 0,0032; fig. 5B). Post hoc-analyse viste at lukt av gammel urin etter 24 timer forårsaket betydelig høyere attraktivitet sammenlignet med alle andre behandlinger (72 timer: p = 0,0060, 168 timer: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), bortsett fra lukten av fersk urin (p = 0,13; figur 5B). Selv om den generelle tiltrekningen til blodsugende mygg til urinlukt ikke var signifikant forskjellig (χ² = 8,78, df = 4, p = 0,067; fig. 5C), ble disse hunnene funnet å være betydelig mer attraktive for flyktige ekstrakter fra headspace sammenlignet med 72 timer gammel urin sammenlignet med kontrollpersoner (p = 0,0066; figur 5C).
Atferdsresponser på naturlig og syntetisk ku-urinlukt i søket etter verts- og blodforet Anopheles arabianus. Skjematisk fremstilling av glassrørsolfaktometeret (A). Tiltrekning av flyktige ekstrakter i hoderommet fra fersk og lagret ku-urin til verts- (B) og blodsugende (C) mygg. Finn tentaklereaksjonen til Lord An. Ekstrakter i hoderommet isolert fra fersk (D), 24-timers (E), 72-timers (F) og 168-timers (G) lagret ku-urin er vist. Elektronantennedeteksjonsspor (EAD) viser spenningsendringer som respons på bioaktive forbindelser i hoderommet eluert fra gasskromatografen og detektert av en flammeioniseringsdetektor (FID). Målestokken representerer responsamplitude (mV) versus retensjonstid (s). Egenskapene og frigjøringshastighetene (µg h-1) for de biologisk aktive forbindelsene er vist. En enkelt stjerne (*) indikerer en konsistent respons med lav amplitude. Doble stjerner (**) indikerer ikke-reproduserbare responser. Finn verten (H) og Den blodsugende (I) An.arabiensis har ulik appell til syntetiske blandinger av frisk og lagret ku-urinlukt. Gjennomsnittsandelene av mygg tiltrukket av forskjellige bokstavnavn var signifikant forskjellige fra hverandre (enveis ANOVA ved bruk av Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Feilfeltene representerer standardfeilen på skalaen.
Hunnlig Ann.arabiensis, 72 timer og 120 timer etter blodmåltid, under gyting, ble det ikke vist noen preferanse for flyktige ekstrakter fra headspace fra fersk og lagret ku-urin sammenlignet med pentan-kontrollpersoner (χ2 = 3,07, p > 0,05; Tilleggsfil 1: Fig. S1).
For hunnlig Ann.arabiensis identifiserte GC-EAD- og GC-MS-analyser åtte, seks, tre og tre bioaktive forbindelser (figur 5D-G). Selv om det ble observert forskjeller i antall forbindelser som fremkaller elektrofysiologiske responser, var de fleste av disse forbindelsene tilstede i hvert flyktige ekstrakt fra headspace samlet fra frisk og lagret urin. Derfor ble for hvert ekstrakt bare forbindelser som produserte en fysiologisk respons fra hunnantennene over terskelen inkludert i videre analyser.
Den totale frigjøringshastigheten for flyktige forbindelser i headspace-samlingen økte fra 29 µg t⁻¹ i fersk urin til 242 µg t⁻¹ i 168 timer gammel urin, hovedsakelig på grunn av økninger i p-kresol og m-formaldehyd. Fenol samt fenol er derimot redusert med økende urinalder. Dette korrelerte med den observerte reduksjonen i signalintensitet (forekomst) i kromatogrammet (fig. 5D) (venstre panel) og fysiologiske responser på disse forbindelsene (fig. 5D) (høyre panel).
Totalt sett hadde den syntetiske blandingen et lignende naturlig forhold mellom bioaktive forbindelser identifisert i flyktige ekstrakter fra friske og lagrede urinhoder (fig. 5D–G), og den så ikke ut til å fremkalle betydelig appell i søket etter en vert (χ² = 8,15, df = 4, p = 0,083; fig. 5H) eller blodsugende mygg (χ² = 4,91, df = 4, p = 0,30; fig. 5I). Imidlertid viste post hoc parvise sammenligninger mellom behandlinger at vertssøkende mygg var betydelig attraktive for den syntetiske blandingen av 24 timer lagret urin sammenlignet med pentankontroller (p = 0,0086; figur 5H).
For å vurdere rollen til individuelle komponenter i syntetiske blandinger av 24 timer gammel urin, ble seks subtraktive blandinger evaluert mot komplette blandinger i Y-røranalysen, der individuelle forbindelser ble fjernet. For vertssøkende mygg hadde det å trekke fra individuelle forbindelser fra den komplette blandingen en signifikant effekt på atferdsresponser (χ² = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Tilleggsfil 1: Figur S2A). Alle subtraktive blandinger var mer attraktive enn Mindre enn fullstendig blandet. I motsetning til dette påvirket ikke fjerning av individuelle forbindelser fra den fullstendig syntetiske blandingen atferdsresponsene til blodsugende mygg (χ² = 11,38, df = 6, p = 0,077), med unntak av dekanal, som resulterte i lavere nivåer sammenlignet med den komplette blandingsattraksjonen (p = 0,022; Tilleggsfil 1: Figur S2B).
I en malaria-endemisk landsby i Etiopia ble effekten av en syntetisk blanding av 24-timers ku-urin for å tiltrekke mygg under feltforhold evaluert i ti netter (fig. 6A). Totalt 4861 mygg ble fanget og identifisert, hvorav 45,7 % var Anthropus.gambiae sl, 18,9 % var Anopheles pharoensis og 35,4 % var Culex spp. (Tilleggsfil 1: Tabell S1). Anopheles arabinis er det eneste medlemmet av An.Gambian-artskomplekset identifisert ved PCR-analyse. I gjennomsnitt ble 320 mygg fanget per natt, og i løpet av denne tiden fanget feller med syntetisk blanding av agn flere mygg enn parede feller uten blanding (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Feller uten agn ble satt opp hver av de fem kontrollnettene i begynnelsen, midten og slutten av forsøket. Lignende antall mygg ble fanget i hvert par av feller, noe som indikerer ingen skjevhet mellom hus (χ²(0, 1665) = 9 × 10⁻⁹⁰, p > 0,05) og ingen populasjonsnedgang i løpet av studieperioden. Sammenlignet med kontrollfeller var antallet mygg fanget i fellene som inneholdt den syntetiske blandingen betydelig økt: vertssøkende (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nylig blodsuging (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) og drektighet (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Tilleggsfil 1: Tabell S1). Dette gjenspeiles også i det totale antallet fangede mygg: vertssøkende > blodsugende > drektig > halvdrektig > hann.
Feltevaluering av effekten av en 24-timers syntetisk ku-urin-luktblanding. Feltforsøk ble utført i sør-sentrale Etiopia (kart), nær byen Maki (innsats), ved bruk av en lysfelle fra Centers for Disease Control (CDC) (høyre) i parvise hus, med et latinsk firkantdesign (luftbilde) (A). Syntetiske luktpåførte CDC-fotofeller tiltrekker og fanger hunnmygg av typen Anopheles arabesque (B), men ikke Anopheles farroes (C), på en annen måte, en fysiologisk tilstandsavhengig effekt. I tillegg fanget disse fellene betydelig økt antall vertsmygg av typen Culex. (D) Sammenlignet med kontroll. Stolpene til venstre representerer den gjennomsnittlige seleksjonsindeksen for mygg fanget i par av luktpåvirkende agnfeller (grønne) og kontrollfeller (åpne) (N = 10), mens stolpene til høyre representerer den gjennomsnittlige seleksjonsindeksen i par av kontrollfeller (åpne; N = 5). Stjerner indikerer statistiske signifikansnivåer (*p = 0,01 og ***p < 0,0001)
De tre artene ble fanget forskjellig i feller som inneholdt syntetiske blandinger. Ved leting etter vert (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blodføding (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) og drektighet (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) ble en .arabiensis fanget i fellen og frigjorde den syntetiske blandingen (fig. 6B), mens mengden An ikke var forskjellig. Pharoensis i forskjellige fysiologiske tilstander ble funnet (fig. 6C). For Culex ble det bare funnet en signifikant økning i antall mygg som søkte verter i feller med agn på den syntetiske blandingen (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; fig. 6D), sammenlignet med kontrollfeller.
Vertsfeller plassert utenfor potensielle verter mellom hekkeplasser og landlige samfunn i Etiopia ble brukt til å vurdere om malariamygg bruker ku-urinlukt som et signal for vertshabitat. I fravær av vertssignaler, varme, og med eller uten tilstedeværelse av ku-urinlukt, ble ingen mygg fanget (Tilleggsfil 1: Figur S3). Imidlertid, i nærvær av høy temperatur og ku-urinlukt, ble hunnmalariamygg tiltrukket og fanget, om enn i små antall, uavhengig av urinens alder (χ²(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Tilleggsfil 1: Figur S3). I motsetning til dette fanget ikke vannkontroller malariamygg ved høye temperaturer (Tilleggsfil 1: Figur S3).
Malariamygg tilegner seg og distribuerer nitrogenholdige forbindelser gjennom kompenserende fôring på ku-urin (dvs. pytter) for å forbedre livshistorieegenskaper, i likhet med andre insekter [2, 4, 24, 25, 26]. Ku-urin er en lett tilgjengelig fornybar ressurs som er nært knyttet til hvilesteder for malariavektorer, som fjøs og høy vegetasjon i nærheten av landlige hjem og gyteplasser. Hunnmygg lokaliserer denne ressursen ved hjelp av lukt og er i stand til å regulere opptaket av nitrogenholdige forbindelser i urin, inkludert urea, den viktigste nitrogenholdige komponenten i urin [15, 16]. Avhengig av hunnmyggens fysiologiske tilstand, tildeles næringsstoffer i urinen for å forbedre flyaktiviteten og overlevelsen til vertssøkende hunnmygg, samt overlevelses- og reproduksjonsegenskapene til blodforede individer i løpet av den første gonadotropiske syklusen. Derfor spiller urinblanding en viktig ernæringsmessig rolle for malariavektorer som er lukket som underernærte voksne [8], da det gir hunnmygg muligheten til å tilegne seg viktige nitrogenholdige forbindelser ved å delta i lavrisikofôring. Dette funnet har betydelige epidemiologiske konsekvenser, ettersom hunnene øker levetiden sin. forventet vekst, aktivitet og reproduksjonsutbytte, som alle påvirker vektorkapasiteten. Videre kan denne oppførselen være målet for fremtidige vektorforvaltningsprogrammer.