A adquisición e distribución de nutrientes integran a busca de alimento dos insectos e os trazos do ciclo vital. Para compensar as deficiencias de nutrientes específicos en diferentes etapas da vida, os insectos poden obtelos mediante alimentación suplementaria, por exemplo, alimentándose de secrecións de vertebrados nun proceso coñecido como charcos. O mosquito Anopheles arabiani parece estar desnutrido e, polo tanto, require nutrientes tanto para o metabolismo como para a reprodución. O obxectivo deste estudo foi avaliar se a axitación de An. arabiensis na urina de vaca para a adquisición de nutrientes mellora as características do ciclo vital.
Asegúrate de que sexa seguro. O *Arabiensis* sentiuse atraído polo cheiro da urina fresca de vaca de 24, 72 e 168 horas de idade, e as femias que buscaban hóspedes e as alimentadas con sangue (48 horas despois da inxesta de sangue) medíronse nun olfatómetro de tubo en Y e as femias preñadas avaliáronse para a proba de desova. A continuación, utilizouse unha análise química e electrofisiolóxica combinada para identificar compostos bioactivos na urina de vaca nas catro clases de idade. Avaliáronse mesturas sintéticas de compostos bioactivos en ensaios de campo e en tubos en Y. Para investigar a urina de vaca e o seu principal composto nitroxenado, a urea, como posibles dietas suplementarias para os vectores da malaria, medíronse os parámetros de alimentación e as características do ciclo vital. Avaliouse a proporción de mosquitos femias e a cantidade de urina de vaca e urea absorbida. Despois da alimentación, avaliáronse as femias para a supervivencia, o voo atado e a reprodución.
Busca o sangue e os alimentos do hóspede. En estudos de laboratorio e de campo, os árabes sentíronse atraídos polo aroma natural e sintético da urina de vaca fresca e envellecida. As femias preñadas eran indiferentes ás respostas da urina de vaca nos lugares de desova. As femias que buscan hóspedes e chupan sangue absorben activamente a urina e a urea de vaca e asignan estes recursos segundo as compensacións do ciclo vital en función do estado fisiolóxico para o voo, a supervivencia ou a reprodución.
Adquisición e distribución de urina de vaca por *Anopheles arabinis* para mellorar as características do ciclo vital. A alimentación suplementaria con urina de vaca afecta á capacidade do vector directamente ao aumentar a supervivencia diaria e a densidade do vector, e indirectamente ao alterar a actividade de voo, polo que debería considerarse en modelos futuros.
A adquisición e distribución de nutrientes integran as características da busca de alimento e do ciclo vital dos insectos [1,2,3]. Os insectos son capaces de seleccionar e adquirir alimento e realizar unha alimentación compensatoria baseada na dispoñibilidade de alimento e nos requisitos de nutrientes [1, 3]. A distribución de nutrientes depende do proceso do ciclo vital e pode levar a diferentes requisitos de calidade e cantidade da dieta nas diferentes etapas da vida dos insectos [1, 2]. Para compensar as deficiencias en nutrientes específicos, os insectos poden obtelos a través dunha alimentación suplementaria, como lama, diversos excrementos e secrecións de vertebrados e carroña, un proceso coñecido como charcos [2]. Aínda que se describe principalmente unha variedade de especies de bolboretas e avelaíñas, os pozos de auga tamén se producen noutras ordes de insectos, e a atracción e a alimentación con estes tipos de recursos poden ter efectos significativos na saúde e outros trazos do ciclo vital [2, 4, 5, 6],7]. O mosquito da malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) emerxe como un adulto "desnutrido" [8], polo que o rego pode desempeñar un papel importante nas súas características do ciclo vital, pero este comportamento ten tantas... descoidado ata o de agora. O uso da axitación como medio para aumentar a inxesta de nutrientes neste importante vehículo merece atención, xa que pode ter importantes consecuencias epidemiolóxicas.
A inxesta de nitróxeno nas femias adultas de mosquitos Anopheles é limitada debido ás baixas reservas calóricas que levan desde a fase larvaria e á utilización ineficiente da fariña de sangue [9]. As femias de Ann.gambiae sl normalmente compensan isto complementando con fariñas de sangue suplementarias [10, 11], o que pon a máis persoas en risco de contraer a enfermidade e poñendo aos mosquitos en maior risco de depredación. Alternativamente, os mosquitos poden usar a alimentación suplementaria de excrementos de vertebrados para adquirir compostos nitroxenados que melloran a adaptación e a manobrabilidade de voo, como demostraron outros insectos [2]. Neste sentido, é interesante a forte e distinta atracción dunha das especies irmás dentro do complexo de especies de An. O complexo de especies de Gambian sl, Anopheles arabinis, ouriños de vaca frescos e envellecidos [12, 13, 14]. Anopheles arabinis é oportunista nas súas preferencias de hóspede e sábese que se asocia e se alimenta de gando. A ouriños de vaca son un recurso rico en compostos nitroxenados, sendo a urea a responsable do 50-95 % do nitróxeno total na ouriños frescos [15, 16]. A medida que a urina de vaca envellece, os microorganismos utilizan estes recursos para reducir a complexidade dos compostos nitroxenados en 24 horas [15]. Co rápido aumento do amoníaco, asociado a unha diminución do nitróxeno orgánico, prosperan os microorganismos alcalófilos (moitos dos cales producen compostos tóxicos para os mosquitos) [15], que poden ser As femias de Ann. arabiensis son atraídas preferentemente pola urina de 24 horas ou menos [13, 14].
Neste estudo, buscáronse An hóspedes e alimentados con sangue. Durante o seu primeiro ciclo de gonadotropina, avaliouse o An. arabiensis para a adquisición de compostos nitroxenados, incluída a urea, mediante a mestura de ouriños. A continuación, realizouse unha serie de experimentos para avaliar como as femias dos mosquitos asignan este recurso potencial de nutrientes para mellorar a supervivencia, a reprodución e a posterior busca de alimento. Finalmente, avaliouse o cheiro dos ouriños de vaca frescos e envellecidos para determinar se estes proporcionaban pistas fiables para os An hóspedes e os alimentados con sangue. Na súa busca deste posible recurso nutricional, o An. arabiensis descubriu correlacións químicas detrás do atractivo diferencial observado. As mesturas de cheiros sintéticos de compostos orgánicos volátiles (COV) identificados en ouriños envellecidos de 24 horas avaliáronse máis a fondo en condicións de campo, ampliando os resultados obtidos en condicións de laboratorio e demostrando o efecto do cheiro dos ouriños bovinos en diferentes estados fisiolóxicos. Atracción de mosquitos. Os resultados obtidos confirman que o An. arabiensis adquire e distribúe compostos nitroxenados que se atopan na ouriña dos vertebrados para influír nas características do ciclo vital. Estes resultados discútense no contexto das posibles consecuencias epidemiolóxicas e de como se poden usar para a vixilancia e o control de vectores.
Os *Anopheles arabicans* (cepa Dongola) mantivéronse a 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % de HR e un ciclo de luz:escuridade de 12:12 h. As larvas criáronse en bandexas de plástico (20 cm × 18 cm × 7 cm) cheas de auga destilada e alimentáronse con alimento para peixes Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Alemaña). As pupas recolléronse en vasos de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Suíza) e logo transferíronse a gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwán) para permitir a emerxencia dos adultos. Os adultos recibiron unha solución de sacarosa ao 10 % ad libitum ata 4 días despois da emerxencia (dpe), momento no que ás femias que buscaban hóspedes ofrecéuselles dieta inmediatamente antes do experimento ou deixáronlles de alimentarse con auga destilada durante a noite antes do experimento, como se describe a continuación. As femias utilizadas para os experimentos con tubos de voo deixáronlles de alimentarse durante só 4-6 horas con auga ad libitum. Para preparar os mosquitos chupadores de sangue para bioensaios posteriores, proporcionóuselles sangue de ovella desfibrótico (Håtunalab, Bro, SE) a 4 femias dpe mediante un sistema de alimentación por membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Reino Unido). As femias totalmente conxestionadas foron transferidas a gaiolas individuais e proporcionóuselles dieta directamente, como se describe a continuación, ou sacarosa ao 10 % ad libitum durante 3 días antes dos experimentos descritos a continuación. Estas últimas femias utilizáronse para bioensaios con tubos de voo e transferíronse ao laboratorio, e despois recibiron auga destilada ad libitum durante 4-6 horas antes do experimento.
Utilizáronse ensaios de alimentación para cuantificar o consumo de urina e urea en femias adultas de An.Arab. As femias que buscaban hóspedes e as alimentadas con sangue recibiron unha dieta que contiña un 1 % de urina de vaca fresca e curada diluída, varias concentracións de urea e dous controis (10 % de sacarosa e auga) durante 48 h. Ademais, engadiuse colorante alimentario (1 mg ml-1 de cianuro de xileno FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Estocolmo, SE) á dieta e subministrado nunha matriz de 4 × 4 en tubos de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EUA; Figura 1A). Encher ata o bordo (~300 µl). Para evitar a competencia entre os mosquitos e os posibles efectos da cor do tinte, coloque 10 mosquitos nunha placa de Petri grande (12 cm de diámetro e 6 cm de altura; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) en completa escuridade a 25 ± 2 cm °C e 65 ± 5 %. humidade relativa. Estes experimentos repetíronse de 5 a 10 veces. Despois da exposición á dieta, os mosquitos colocáronse a -20 °C ata a súa análise posterior.
Busca urina bovina e urea absorbidas polo hóspede e a femia chupadora de sangue *Anopheles arabianus*. No ensaio de alimentación (A), proporcionouse ás femias de mosquitos unha dieta que consistía en urina de vaca fresca e curada, varias concentracións de urea, sacarosa (10 %) e auga destilada (H2O). As femias que buscan hóspede (B) e as alimentadas con sangue (C) absorberon máis sacarosa que calquera outra dieta probada. Obsérvese que as femias que buscan hóspede absorberon urina de vaca de 72 horas menos que urina de vaca de 168 horas (B). O contido total medio de nitróxeno (± desviación estándar) da urina represéntase no gráfico inserido. As femias que buscan hóspede (D, F) e as chupadoras de sangue (E, G) absorben urea dun xeito dependente da dose. Os volumes medios inhalados (D, E) con diferentes nomes de letras foron significativamente diferentes entre si (ANOVA unidireccional usando a análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representan o erro estándar da media (BE). A liña recta discontinua representa a liña de regresión log-lineal. (F, G)
Para liberar o alimento absorbido, os mosquitos colocáronse individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contiñan 230 µl de auga destilada e o tecido foi desintegrado usando un manoplo desbotable e un motor sen fíos (VWR International, Lund, SE), seguido dunha centrifugación a 10 krpm durante 10 min. O sobrenadante (200 µl) transferiuse a unha microplaca de 96 pozos (Sigma-Aldrich) e a absorbancia (λ620) determinouse usando un lector de microplacas baseado en espectrofotómetro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativamente, os mosquitos foron moídos en 1 ml de auga destilada, 900 µl dos cales foron transferidos a unha cubeta para análise espectrofotométrica (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Para cuantificar a inxesta dietética, preparouse unha curva estándar por dilución seriada para obter de 0,2 µl a 2,4 µl de 1 mg ml-1 de cianuro de xileno. Despois, utilizouse a densidade óptica das concentracións de colorante coñecidas para determinar a cantidade de alimento que inxeriu cada mosquito.
Os datos de volume analizáronse mediante unha análise unidireccional da varianza (ANOVA) seguida de comparacións por pares post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA, 1989–2007). As análises de regresión lineal describiron a inxesta de urea dependente da concentración e compararon as respostas entre os mosquitos que buscan hóspedes e os que chupan sangue (GraphPad Prism v8.0.0 para Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Aproximadamente 20 µl de mostras de urina de cada grupo de idade uníronse a Chromosorb® W/AW (10 mg de malla 80/100, Sigma Aldrich) e encapsuláronse en cápsulas de estaño (8 mm × 5 mm). As cápsulas inseríronse na cámara de combustión dun analizador CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) para determinar o contido de nitróxeno na urina fresca e envellecida segundo o protocolo do fabricante. O nitróxeno total (g N l-1) cuantificouse en función das concentracións de urea coñecidas empregadas como estándar.
Para avaliar o efecto da dieta na supervivencia das femias que buscan hóspedes e chupan sangue, os mosquitos colocáronse individualmente en placas de Petri grandes (12 cm de diámetro e 6 cm de altura; Semadeni) cun orificio cuberto de malla na tapa (3 cm de diámetro) para ventilación e subministración de alimento. As dietas proporcionáronse directamente despois de 4 dpe e ​​incluían ouriños de vaca frescos e vellos diluídos ao 1 %, catro concentracións de urea e dous controis, sacarosa ao 10 % e auga. Cada dieta pipeteouse nun tampón dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserido nunha xiringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gotemburgo, SE), retirouse o émbolo e colocouse enriba dunha placa de Petri (figura 1).1A). Cambie a súa dieta todos os días. Manteña o laboratorio como se describiu anteriormente. Os mosquitos superviventes contáronse dúas veces ao día, mentres que os mosquitos mortos descartáronse ata que morreu o último mosquito (n = 40 por tratamento). A supervivencia dos mosquitos alimentados con diversas dietas analizouse estatisticamente mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer. e probas de rango logarítmico para comparar as distribucións de supervivencia entre dietas (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un muíño voador de mosquitos personalizado baseado en Attisano et al.[17], feito de paneis acrílicos transparentes de 5 mm de grosor (10 cm de ancho x 10 cm de longo x 10 cm de alto) sen paneis dianteiro nin traseiro (Fig. 3: arriba). Un conxunto pivotante cun tubo vertical feito dunha columna de cromatografía de gases (0,25 mm de diámetro interior; 7,5 cm de longo) con extremos pegados a unha agulla de insecto suspendida entre un par de imáns de neodimio separados por 9 cm. Un tubo horizontal feito do mesmo material (6,5 cm de longo) bisecaba o tubo vertical para formar un brazo amarrado e un brazo que levaba un pequeno anaco de papel de aluminio como sinal de interrupción da luz.
Déuselles a femias que estiveron inanidas durante 24 horas coa dieta anterior durante 30 minutos antes de suxeitalas. As femias de mosquito completamente alimentadas anestesiáronse individualmente en xeo durante 2-3 minutos e uníronse a alfinetes de insectos con cera de abella (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) e logo ataronse aos brazos dos tubos horizontais. Muíño voador. As revolucións por voo rexistráronse mediante un rexistrador de datos feito á medida, almacenáronse e mostráronse usando o software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). O muíño voador colocouse nunha sala climatizada (12 h:12 h, luz: escuridade, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % de HR).
Para visualizar o patrón da actividade de voo, calculouse a distancia total percorrida (m) e o número total de actividades de voo consecutivas por hora durante un período de 24 horas. Ademais, comparáronse as distancias medias percorridas por femias individuais entre os tratamentos e analizáronse mediante ANOVA unidireccional e análise post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), onde a distancia media se considerou unha variable dependente, mentres que o tratamento é un factor independente. Ademais, o número medio de roldas calcúlase en incrementos de 10 minutos.
Para avaliar o efecto da dieta no rendemento reprodutivo de An.arabiensis, seis femias (4 dpe) foron transferidas directamente a gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) despois da recollida de sangue e, a continuación, proporcionáronlles a dieta experimental durante 48 h como se describeu anteriormente. Despois, retiráronse as dietas e proporcionáronse copas de desova (30 ml; Nolato Hertila) cheas de 20 ml de auga destilada ao terceiro día durante 48 horas, cambiándose cada 24 horas. Repetir cada réxime dietético de 20 a 50 veces. Contáronse e rexistráronse os ovos para cada gaiola experimental. Utilizáronse submostras de ovos para avaliar o tamaño medio e a variación da lonxitude dos ovos individuais (n ≥ 200 por dieta) utilizando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) equipado cunha cámara Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Alemaña). Os ovos restantes mantivéronse nunha sala con climatización en condicións de cría estándar durante 24 horas e mediuse unha submostra de larvas de primeiro estadio recentemente emerxidas (n ≥ 200 por dieta), como se describiu anteriormente. O número de ovos e o tamaño dos ovos e as larvas comparáronse entre os tratamentos mediante ANOVA unidireccional e análise post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Recolléronse compostos volátiles do espazo de cabeza de ouriña fresca (1 hora despois da mostraxe), envellecida de 24 horas, 72 horas e 168 horas a partir de mostras recollidas de gando cebú e razas arsi. Para maior comodidade, as mostras de ouriña recolléronse a primeira hora da mañá mentres as vacas aínda estaban no estabulo. Recolléronse mostras de ouriña de 10 individuos e transferíronse de 100 a 200 ml de cada mostra a bolsas de cocción individuais de poliamida (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Alemaña) en poliamida de 3 l con tapa en bidóns de plástico de cloruro de vinilo. Os compostos volátiles do espazo de cabeza de cada mostra de ouriña bovina recolléronse directamente (fresca) ou despois da maduración a temperatura ambiente durante 24 horas, 72 horas e 168 horas, é dicir, cada mostra de ouriña era representativa de cada grupo de idade.
Para a recollida de volátiles no espazo de cabeza, utilizouse un sistema de circuíto pechado para facer circular unha corrente de gas filtrada con carbón activado (100 ml min-1) a través dunha bolsa de poliamida ata a columna de adsorción durante 2,5 h mediante unha bomba de baleiro de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, Alemaña). Como control, a recollida no espazo de cabeza realizouse a partir dunha bolsa de poliamida baleira. A columna de adsorción estaba feita de tubos de teflón (5,5 cm x 3 mm de diámetro interior) que contiñan 35 mg de Porapak Q (malla 50/80; Waters Associates, Milford, MA, EUA) entre tapóns de la de vidro. Antes do seu uso, a columna foi lavada con 1 ml de n-hexano redestilado (Merck, Darmstadt, Alemaña) e 1 ml de pentano (solvente de grao GC ao 99,0 % puro, Sigma Aldrich). Os volátiles adsorbidos foron eluídos con 400 μl de pentano. As coleccións do espazo de cabeza agrupáronse e despois almacenáronse a -20 °C ata o seu uso para análises posteriores.
Respostas comportamentais de An que busca hóspedes e come sangue. Analizáronse extractos volátiles de Headspace recollidos de urina fresca de 24 h, 72 h e 168 h para detectar extractos volátiles de mosquitos Arabidopsis usando un olfatómetro de tubo de vidro recto [18]. Os experimentos realizáronse durante as horas ZT 13-15, o período máximo da actividade de busca de fogar de An. Arab [19]. Iluminouse un olfatómetro de tubo de vidro (80 cm × 9,5 cm de diámetro interior) con 3 ± 1 lx de luz vermella desde arriba. O fluxo de aire filtrado con carbón vexetal e humidificado (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % de humidade relativa) pasou polo bioensaio a 30 cm s-1. O aire pásase a través dunha serie de mallas de aceiro inoxidable, creando un fluxo laminar e unha estrutura uniforme de plumas. Dispensador de tampóns dentais (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspendido dunha espiral de 5 cm no extremo de barlovento do... olfatómetro, con cambios de estimulador cada 5 minutos. Para a análise, utilizáronse 10 μl de cada extracto de espazo de cabeza, diluído 1:10, como estímulo. Utilizouse unha cantidade igual de pentano como control. Os mosquitos individuais que buscaban hóspedes ou chuparon sangue colocáronse en gaiolas de liberación individuais 2-3 horas antes do comezo do experimento. A gaiola de liberación colocouse no lado a sotavento do olfatómetro e deixouse que os mosquitos se aclimatasen durante 1 minuto, e despois abriuse a válvula de bolboreta da gaiola para liberar. A atracción ao tratamento ou control analizouse como a proporción de mosquitos que entraron en contacto coa fonte dentro dos 5 minutos posteriores á liberación. Cada extracto volátil e control do espazo de cabeza replicáronse polo menos 30 veces e, para evitar os efectos de calquera día, probouse o mesmo número de tratamentos e controis en cada día experimental. As respostas de busca do hóspede e dos alimentados con sangue. Resp. Os conxuntos árabes fronte aos conxuntos de espazo de cabeza analizáronse mediante regresión loxística nominal seguida de comparacións por pares para as razóns de probabilidades (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Resposta de desova de An. Analizáronse extractos de espazo de cabeza de ouriños de vacas frescas e vellas en gaiolas Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). O substrato de desova utilizouse en esquinas opostas da gaiola, separadas por 24 cm, cuncas de plástico (30 mL; Nolato Hertila) cheas de 20 mL de auga destilada. As cuncas de tratamento axustáronse con 10 μl de cada extracto de espazo de cabeza a unha dilución de 1:10. Utilizouse unha cantidade igual de pentano para axustar a cunca de control. As cuncas de tratamento e de control intercambiáronse entre cada experimento para controlar os efectos da posición. Liberáronse dez femias alimentadas con sangue en gaiolas experimentais a ZT 9-11 e os ovos nas cuncas contáronse 24 horas despois. A fórmula para calcular o índice de desova é: (o número de ovos postos na cunca de tratamento - o número de ovos postos na cunca de control)/(o número total de ovos postos). Cada tratamento repetiuse 8 veces.
A análise por cromatografía de gases e detección de patróns de antena electrónica (GC-EAD) das femias de An. arabiensis realizouse como se describiu previamente [20]. En resumo, os extractos volátiles frescos do espazo de cabeza separáronse usando un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, EUA) equipado cunha columna HP-5 (30 m × 0,25 mm de diámetro interior, 0,25 μm de grosor da película, Agilent Technologies). e urina envellecida. Empregouse hidróxeno como fase móbil cun caudal lineal medio de 45 cm s-1. Cada mostra (2 μl) inxectouse durante 30 segundos en modo sen división cunha temperatura de entrada de 225 °C. A temperatura do forno GC programouse de 35 °C (mantención de 3 minutos) a 300 °C (mantención de 10 minutos) a 10 °C min-1. No divisor de efluentes de GC, engadíronse 4 psi de nitróxeno e dividiuse 1:1 nunha cruz de baixo volume morto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, Alemaña) entre o detector de ionización de chama e o EAD. O capilar de efluentes de GC para EAD pasou a través dunha liña de transferencia Gerstel ODP-2, que rastrexa a temperatura do forno GC máis 5 °C, a un tubo de vidro (10 cm × 8 mm), onde se mesturou con aire humidificado filtrado con carbono (1,5 l min-1). A antena colocouse 0,5 cm da saída do tubo. Cada mosquito individual representou unha réplica e, para os mosquitos que buscaban hóspede, realizáronse polo menos tres réplicas en mostras de ouriña de cada idade.
Identificación de compostos bioactivos en coleccións de espazo de cabeza de urina bovina fresca e envellecida usando un espectrómetro de masas e GC combinado (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) para obter respostas antenais na análise GC-EAD, operando en modo de ionización por impacto electrónico a 70 eV. O GC estaba equipado cunha columna capilar de sílice fundida revestida con UI HP-5MS (60 m × 0,25 mm de diámetro interior, 0,25 μm de grosor de película) usando helio como fase móbil cun caudal lineal medio de 35 cm s-1. Inxectouse unha mostra de 2 μl usando a mesma configuración do inxector e temperatura do forno que para a análise GC-EAD. Os compostos identificáronse en función do seu tempo de retención (índice Kovát) e espectros de masas en comparación coa biblioteca personalizada e a biblioteca NIST14 (Agilent). Os compostos identificados confirmáronse inxectando estándares auténticos (Ficheiro adicional 1: Táboa S2). Para a cuantificación, utilizouse acetato de heptilo (10 ng, pureza química do 99,8 %, Aldrich) inxectouse como estándar externo.
Avaliación da eficacia dunha mestura de cheiros sintéticos que consiste en compostos bioactivos identificados en ouriños frescos e envellecidos para atraer Ans. arabiensis, que busca hóspedes e chupadores de sangue, utilizando o mesmo olfatómetro e protocolo que os anteriores. As mesturas sintéticas imitaron a composición e as proporcións dos compostos en extractos volátiles mixtos de espazo de cabeza de ouriños frescos, envellecidos de 24 horas, 48 ​​horas, 72 horas e 168 horas (Figura 5D-G; Ficheiro adicional 1: Táboa S2). Para a análise, utilízanse 10 μl dunha dilución 1:100 da mestura totalmente sintética, cunha taxa de liberación global que oscila entre aproximadamente 140 e 2400 ng h-1, para avaliar o atractivo para os mosquitos hóspedes e chupadores de sangue. Posteriormente, a proba realízase en mesturas completas, nas que se eliminan as mesturas subtractivas de compostos individuais da mestura completa. As respostas de busca de Ans. arabienses e mesturas sintéticas e subtractivas analizáronse mediante regresión loxística nominal seguida de comparacións por pares para os mosquitos impares. proporcións (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Para avaliar se a urina de vaca podería servir como sinal de hábitat para os mosquitos da malaria, colocáronse urina de vaca fresca e vella, recollida como se describiu anteriormente, e auga en baldes de malla de 3 l (100 ml) e colocáronse en trampas de cebo para hóspedes. (Versión BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dez trampas colocadas a 50 m de distancia en pastos, a 400 m da comunidade da aldea (Silay, Etiopía, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e sen gando, en zonas de reprodución permanentes e aldeas. Quentáronse cinco trampas para simular a presenza dun hóspede, mentres que cinco trampas deixáronse sen quentar. Cada lugar de tratamento rótase todas as noites durante un total de cinco noites. Comparouse o número de mosquitos capturados en trampas con cebo con urina de diferentes idades mediante regresión loxística cunha distribución binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Nunha aldea onde a malaria é endémica preto da cidade de Maki, rexión de Oromia, Etiopía (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). O estudo realizouse entre mediados de agosto e mediados de setembro antes da fumigación residual anual en interiores, xunto cunha longa tempada de chuvias. Seleccionáronse para o estudo cinco pares de casas (separadas entre 20 e 50 m) situadas nos arredores da aldea (Fig. 6A). Os criterios empregados para seleccionar as casas foron: non se permitían animais na casa, non se permitía cociñar no interior (leña ou carbón vexetal) (polo menos durante o período de proba) e casas cun máximo de dous habitantes, durmindo sen insecticidas. baixo a mosquiteira tratada. A aprobación ética foi outorgada polo Consello de Revisión de Ética da Investigación Institucional (IRB/022/2016) da Facultade de Ciencias Naturais (CNS-IRB) da Universidade de Addis Abeba, de acordo coas directrices establecidas pola Declaración de Helsinqui da Asociación Médica Mundial. Obtivose o consentimento de cada cabeza de familia coa axuda do persoal de extensión sanitaria. Todo o proceso está avalado polas administracións locais a nivel de distrito e sala ("kebele"). O deseño experimental seguiu un deseño de cadrado latino de 2 × 2, no que as mesturas sintéticas e os controis se asignaron a casas emparelladas na primeira noite e se intercambiaron entre casas na seguinte noite experimental. Este proceso repetiuse dez veces. Ademais, para estimar a actividade dos mosquitos nas casas seleccionadas, as trampas dos CDC configuráronse para funcionar cinco noites consecutivas ao comezo, na metade e ao final do ensaio de campo á mesma hora do día.
Unha mestura sintética que contiña seis compostos bioactivos disolveuse en heptano (solvente de grao GC ao 97,0 %, Sigma Aldrich) e liberouse a 140 ng h-1 usando un dispensador de mecha de algodón [20]. O dispensador de mecha permitiu que todos os compostos se liberasen en proporcións constantes ao longo do experimento de 12 horas. O heptano utilizouse como control. O vial suspendeuse xunto ao punto de entrada da trampa de luz dos Centros para o Control e a Prevención de Enfermidades (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, EUA; Figura 6A). As trampas colgáronse a 0,8-1 m do chan, preto dos pés da cama, e un voluntario durmiu baixo unha mosquiteira sen tratar e operou entre as 18:00 e as 06:30. Os mosquitos capturados por sexo e estado fisiolóxico (non alimentados, alimentados, semipreñados e preñados [21]) foron posteriormente examinados mediante análise de reacción en cadea da polimerase (PCR) para identificar as especies identificadas morfoloxicamente como A. gambiae sl. Membros do complexo [23]. En No estudo de campo, analizouse a captura con trampas en casas emparelladas mediante un modelo de axuste loxístico nominal, onde a atracción era a variable dependente e o tratamento (mestura sintética fronte a control) era o efecto fixo (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Aquí, presentamos os valores χ2 e p da proba de razón de verosimilitude.
Avaliar se é seguro. *Arabiensis* puido obter urina, a súa principal fonte de nitróxeno, a urea, mediante alimentación directa, dentro das 48 horas posteriores á administración durante 4 días despois (dpe) das probas de alimentación con femias que buscan hóspedes e alimentadas con sangue (Fig. 1A). Tanto as femias que buscan hóspedes como as que chupan sangue absorberon significativamente máis sacarosa que calquera outra dieta ou auga (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 e F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectivamente; Fig. 1B,C). Ademais, as femias que buscan hóspedes comeron menos na urina ás 72 horas en comparación coa urina ás 168 horas (Fig. 1B). Cando se lles ofreceu unha dieta que contiña urea, as femias que buscan hóspedes absorberon unha cantidade significativamente maior de urea a 2,69 mM en comparación con todas as outras concentracións e auga, aínda que indistinguible da sacarosa ao 10 %. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Isto contrastaba coa resposta das femias alimentadas con sangue, que normalmente absorbían significativamente máis dietas que contiñan urea que auga, aínda que significativamente menos do 10 % de sacarosa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). Ademais, ao comparar entre os dous estados fisiolóxicos, as femias flebotomizadas absorbían máis urea que as femias que buscaban hóspedes nas concentracións máis baixas, e estas femias absorbían cantidades similares de urea nas concentracións máis altas (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Aínda que a inxesta dunha dieta que contiña urea parecía ter valores óptimos (Fig. 1D, E), as femias en ambos os estados fisiolóxicos puideron modular a cantidade de urea absorbida en todo o rango de concentracións de urea de forma log-lineal (Fig. 1F,G). ).Do mesmo xeito, os mosquitos parecen controlar a súa absorción de nitróxeno regulando a cantidade de urina absorbida, xa que a cantidade de nitróxeno na urina reflíctese na cantidade absorbida (figuras 1B, C e B inseridas).
Para avaliar os efectos da urina e da urea na supervivencia dos mosquitos que buscan hóspedes e que chupan sangue, alimentáronse femias con urina de todas as catro idades (fresca, 24 h, 72 h e 168 h despois da deposición) e unha gama de concentracións de urea, así como auga destilada e sacarosa ao 10 %, serviron como control (Figura 2A). Esta análise de supervivencia mostrou que a dieta tiña un efecto significativo na supervivencia global nas femias que buscaban hóspedes (urina: χ2 = 108,5, dl = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, dl = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) e nas femias alimentadas con sangue (urina: χ2 = 93,0, dl = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, dl = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). En todos os experimentos, as femias alimentadas cunha dieta de urina, urea e auga tiveron taxas de supervivencia significativamente máis baixas en comparación coas femias alimentadas cunha dieta de sacarosa (Figura 2B-E). As femias que buscaban hóspedes alimentadas con urina fresca e vella mostraron diferentes taxas de supervivencia, e as alimentadas con urina vella de 72 horas (p = 0,016) tiveron a menor probabilidade de supervivencia (Fig. 2B). Ademais, as femias que buscaban hóspedes alimentadas con 135 mM de urea sobreviviron máis tempo que os controis con auga (p < 0,04) (Fig. 2C). En comparación coa auga, as mulleres alimentadas con urina fresca e urina de 24 horas sobreviviron máis tempo (p = 0,001 e p = 0,012, respectivamente; Figura 2D), mentres que as mulleres alimentadas con urina de 72 horas sobreviviron máis tempo que as alimentadas con urina fresca curta de femias e urina envellecida de 24 horas (p < 0,0001 e p = 0,013, respectivamente; Figura 2D). Cando se lles alimentou con 135 mM urea, as femias alimentadas con sangue sobreviviron máis tempo que todas as outras concentracións de urea e auga (p < 0,013; Figura 2E).
Supervivencia das femias hóspedes e chupadoras de sangue de *Anopheles arabinis* que se alimentan de ouriños de vaca e urea. No bioensaio (A), as femias dos mosquitos recibiron unha dieta que consistía en ouriños de vaca frescos e curados, varias concentracións de urea, sacarosa (10 %) e auga destilada (H2O). A supervivencia dos mosquitos que buscan hóspedes (B, C) e chupadores de sangue (D, E) rexistrouse cada 12 horas ata que todas as femias se alimentaron de ouriños (B, D) e urea (C, E), e os controis, sacarosa e auga, morreron.
A distancia total e o número de roldas determinados na proba do muíño de voo durante un período de 24 horas diferiron entre os mosquitos que buscaban hóspedes e os que chupaba sangue, que mostraron menos actividade de voo en xeral (Fig. 3). Os mosquitos que buscaban hóspedes e que proporcionaron urina fresca e envellecida ou sacarosa e auga mostraron patróns de voo distintos (Fig. 3), sendo as femias que se alimentaban de urina fresca máis activas ao amencer, mentres que os alimentados con 24 e 168 horas de idade. Os mosquitos que se alimentaban de urina mostraron diferentes patróns de voo e foron principalmente diúrnos. As femias de mosquitos que proporcionaron sacarosa ou urina de 72 horas mostraron actividade durante todo o período de 24 horas, mentres que as femias que proporcionaron auga foron máis activas durante o período medio. Os mosquitos alimentados con sacarosa mostraron os niveis máis altos de actividade a altas horas da noite e a primeira hora da mañá, mentres que os que inxeriron urina de 72 horas de idade experimentaron un descenso constante da actividade durante 24 horas (Figura 3).
Rendemento de voo de femias de *Anopheles arabinis* chupasangues e cazadoras que se alimentan de ouriños de vaca e urea. Na proba do muíño de voo, as femias de mosquito alimentáronse de ouriños de vaca frescos e vellos, varias concentracións de urea, sacarosa (10 %) e auga destilada (H2O) foron atadas a brazos horizontais e de rotación libre (arriba). Para as femias que buscan hóspedes (esquerda) e chupasangues (dereita), rexistráronse a distancia total e o número de voos por hora para cada dieta durante un período de 24 horas (escuro: gris; claro: branco). A distancia media e o número medio de episodios móstranse á dereita do gráfico de actividade circadiana. As barras de erro representan o erro estándar da media. Análise estatística, ver texto.
En xeral, a actividade de voo global das femias que buscaban hóspedes seguiu un patrón similar ao da distancia de voo durante un período de 24 horas. A distancia media de voo viuse significativamente afectada pola dieta inxerida (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e as femias que buscaban hóspedes que inxeriron 72 horas de urina voaron distancias significativamente máis longas en comparación con todas as outras dietas (p < 0,0001), e os mosquitos alimentados con sacarosa voaron máis tempo que os mosquitos frescos (p = 0,022) e os alimentados con urina de 24 horas (p = 0,022). En contraste co patrón de actividade de voo descrito pola dieta de urina, as femias que buscaban hóspedes alimentadas con urea mostraron unha actividade de voo persistente durante un período de 24 horas, alcanzando o seu máximo durante a segunda metade da fase escura (Fig. 3). Aínda que os patróns de actividade foron similares, as femias que buscaban hóspedes alimentadas con urea aumentaron significativamente a distancia media de voo dependendo da concentración absorbida (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). As femias que buscaban hóspedes alimentadas con calquera concentración de urea voaron máis tempo que as femias alimentadas con auga ou sacarosa (p < 0,03).
A actividade de voo xeral dos mosquitos chupadores de sangue foi estable e mantívose durante 24 horas en todas as dietas, cun aumento da actividade urinaria durante a segunda metade do período escuro para as femias alimentadas con auga, así como nas femias alimentadas con auga fresca e de 24 horas de idade (imaxe 3). Aínda que a dieta con urina afectou significativamente a distancia media de voo nas femias alimentadas con sangue (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), a dieta con urea non o fixo (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) con outra urina e a dieta de control (fresca, p = 0,0091; 72 horas, p = 0,0022; 168 horas, p = 0,001; sacarosa, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Os efectos da alimentación con urina e urea nos parámetros reprodutivos avaliáronse en bioensaios de posta de ovos (Figura 4A) e investigáronse segundo o número de ovos postos por cada femia, o tamaño do ovo e as larvas do primeiro estadio recentemente eclosionadas. O número de ovos postos. As femias árabes alimentadas con urina variaron segundo a dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). As femias alimentadas con urina de 24 horas e fariña de sangue puxeron significativamente máis ovos que as femias alimentadas con outras dietas de urina e foron similares ás alimentadas con sacarosa (Fig. 4B). Do mesmo xeito, o tamaño dos ovos postos polas femias alimentadas con urina variou segundo a dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), con femias alimentadas con urina de 24 horas e sacarosa pondo ovos significativamente máis grandes que as femias alimentadas con auga, mentres que os ovos das femias alimentadas con 168 h de urina foron significativamente máis pequenos (Fig. 4C). Ademais, a dieta con urina... afectou significativamente o tamaño larvario (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), con larvas significativamente máis grandes emerxendo de ovos postos por femias alimentadas con urina de 24 e 72 horas de idade que de ovos postos por larvas de ovos. Femias alimentadas con auga e femias alimentadas con urina de 168 horas de idade (Figura 4D).
Desempeño reprodutivo das femias de *Anopheles arabinis* que se alimentan de ouriños de vaca e urea. As femias de mosquito alimentadas con sangue recibiron dietas que consistían en ouriños de vaca frescos e envellecidos, diversas concentracións de urea, sacarosa (10 %) e auga destilada (H2O) durante 48 horas antes de colocalas en bioensaios e obter substratos para a posta de ovos 48 horas despois (A). O número de ovos (B, E), o tamaño dos ovos (C, F) e o tamaño das larvas (D, G) víronse significativamente afectados pola dieta proporcionada (ouriños de vaca: BD; urea: EG). As medias para cada parámetro medido utilizando diferentes nomes de letras foron significativamente diferentes entre si (ANOVA unidireccional usando a análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representan o erro estándar da media.
Como principal compoñente nitroxenado da urina, a urea, cando se lles proporciona como dieta ás femias alimentadas con sangue, afectou significativamente os parámetros reprodutivos en todos os estudos. O número de ovos postos polas femias alimentadas con urea, despois dunha inxesta de sangue, dependendo da concentración de urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), as femias alimentadas con concentracións de urea entre 134 µM e 1,34 mM puxeron máis ovos (Figura 4E). As femias alimentadas con concentracións de urea de 134 µM ou superiores puxeron ovos máis grandes que as femias alimentadas con auga (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), e o tamaño das larvas, aínda que afectado por concentracións similares de urea nas nais (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) foi máis variable (Fig. 4G).
Atracción xeral polos extractos volátiles do espazo de cabeza de ouriña bovina que buscan hóspedes. O *Arabiensis* avaliado no olfatómetro de tubo de vidro (Fig. 5A) viuse significativamente afectado pola idade da ouriña (χ2 = 15,9, dl = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). A análise post hoc mostrou que o cheiro a ouriña rancia ás 24 horas causou niveis significativamente máis altos de atractivo en comparación con todos os outros tratamentos (72 horas: p = 0,0060, 168 horas: p = 0,012, pentano: p = 0,00070), agás o cheiro a ouriña fresca (p = 0,13; Figura 5B). Aínda que a atracción xeral dos mosquitos chupadores de sangue polo cheiro da ouriña non foi significativamente diferente (χ2 = 8,78, dl = 4, p = 0,067; Fig. 5C), descubriuse que estas femias eran significativamente máis atractivas polos extractos volátiles do espazo de cabeza en comparación coa ouriña envellecida ás 72 horas en comparación cos controis (p = 0,0066; Figura 5C).
Respostas comportamentais a cheiros de ouriños de vaca naturais e sintéticos na procura de *Anopheles arabianus* hóspedes e alimentados con sangue. Esquema do olfatómetro de tubo de vidro (A). Atracción de extractos volátiles do espazo de cabeza de ouriños de vaca frescos e envellecidos cara aos mosquitos hóspedes (B) e chupadores de sangue (C). Atopa a reacción dos tentáculos do *Lord An*. Móstranse extractos do espazo de cabeza illados de ouriños de vaca frescos (D), de 24 horas (E), de 72 horas (F) e de 168 horas (G) envellecidos. As trazas de detección de antena electrónica (EAD) mostran cambios de voltaxe en resposta a compostos bioactivos no espazo de cabeza eluídos do cromatógrafo de gases e detectados por un detector de ionización de chama (FID). A barra de escala representa a amplitude de resposta (mV) fronte ao tempo de retención (s). Móstranse as propiedades e as taxas de liberación (µg h-1) dos compostos bioloxicamente activos. Un asterisco simple (*) indica unha resposta consistente de baixa amplitude. Os asteriscos dobres (**) indican respostas non reproducibles. Atopa o hóspede (H) e o O *An. arabiensis* chupa-sangre (I) ten diferentes atractivos para as mesturas sintéticas de cheiros de ouriños de vaca frescos e curados. As proporcións medias de mosquitos atraídos por diferentes nomes de letras foron significativamente diferentes entre si (ANOVA unidireccional usando a análise post hoc de Tukey; p < 0,05). As barras de erro representan o erro estándar da escala.
Femias de Ann.arabiensis, 72 h e 120 h despois da inxestión de sangue, durante a desova, non se mostrou preferencia polos extractos volátiles do espazo de cabeza de ouriños de vaca frescos e curados en comparación cos controis de pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; Ficheiro adicional 1: Fig. S1).
Para as femias de Ann. arabiensis, as análises de GC-EAD e GC-MS identificaron oito, seis, tres e tres compostos bioactivos (Figura 5D-G). Aínda que se observaron diferenzas no número de compostos que provocaron respostas electrofisiolóxicas, a maioría destes compostos estaban presentes en cada extracto volátil do espazo de cabeza recollido de urina fresca e envellecida. Polo tanto, para cada extracto, só se incluíron en análises posteriores os compostos que produciron unha resposta fisiolóxica das antenas femias por riba do limiar.
A taxa de liberación total de volátiles de compostos bioactivos na recollida do espazo de cabeza aumentou de 29 µg h-1 en urina fresca a 242 µg h-1 en urina envellecida de 168 horas, principalmente debido aos aumentos de p-cresol e m-formaldehido no fenol, así como no fenol. Pola contra, as taxas de liberación doutros compostos, como a 2-ciclohexen-1-ona e o decanal, diminuíron co aumento da idade da urina, o que se correlacionou coa diminución observada na intensidade do sinal (abundancia) no cromatograma (Fig. 5D)-G panel esquerdo) e nas respostas fisiolóxicas a estes compostos (Fig. 5D-G panel dereito).
En xeral, a mestura sintética tiña unha proporción natural similar de compostos bioactivos identificados en extractos volátiles de espazos de cabeza de urina fresca e envellecida (Fig. 5D–G) e non pareceu suscitar un atractivo significativo na busca dun hóspede (χ2 = 8,15, dl = 4, p = 0,083; Fig. 5H) ou mosquitos chupadores de sangue (χ2 = 4,91, dl = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Non obstante, as comparacións post hoc por pares entre os tratamentos mostraron que os mosquitos que buscaban hóspedes eran significativamente atractivos para a mestura sintética de urina envellecida de 24 horas en comparación cos controis con pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Para avaliar o papel dos compoñentes individuais en mesturas sintéticas de urina envellecida durante 24 horas, avaliáronse seis mesturas subtractivas fronte a mesturas completas no ensaio de tubo en Y, no que se eliminaron os compostos individuais. Para os mosquitos que buscan hóspedes, a subtracción de compostos individuais da mestura completa tivo un efecto significativo nas respostas de comportamento (χ2 = 19,63, dl = 6, p = 0,0032; Ficheiro adicional 1: Figura S2A), todas as mesturas subtractivas foron máis atractivas que as totalmente mesturadas. Pola contra, a eliminación de compostos individuais da mestura totalmente sintética non afectou as respostas de comportamento dos mosquitos chupadores de sangue (χ2 = 11,38, dl = 6, p = 0,077), coa excepción do decanal, que resultou en niveis máis baixos en comparación coa mestura completa de Atracción (p = 0,022; Ficheiro adicional 1: Figura S2B).
Nunha aldea endémica da malaria en Etiopía, avaliouse a eficacia dunha mestura sintética de ouriños de vaca de 24 horas para atraer mosquitos en condicións de campo durante dez noites (Fig. 6A). Capturáronse e identificáronse un total de 4.861 mosquitos, dos cales o 45,7 % eran Anthropus.gambiae sl, o 18,9 % eran Anopheles pharoensis e o 35,4 % eran Culex spp. (Ficheiro adicional 1: Táboa S1). Anopheles arabinis é o único membro do complexo de especies An.Gambian identificado mediante análise PCR. De media, capturáronse 320 mosquitos por noite, tempo durante o cal as trampas con cebos de mestura sintética capturaron máis mosquitos que as trampas emparelladas sen mestura (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Colocáronse trampas sen cebo en cada unha das cinco noites de control ao comezo, medio e final do ensaio. Capturáronse números similares de mosquitos en cada par de trampas, o que indica que non houbo sesgo entre as casas (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) nin declive da poboación durante o período de estudo. En comparación coas trampas de control, o número de mosquitos capturados nas trampas que contiñan a mestura sintética aumentou significativamente: busca de hóspede (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), inxestión recente de sangue (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e preñez (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Ficheiro adicional 1: Táboa S1). Isto tamén se reflicte no número total de mosquitos capturados: busca de hóspede > chupadores de sangue > preñadas > semipreñadas > machos.
Avaliación de campo da eficacia dunha mestura sintética de olor a ouriña de vaca durante 24 horas. Realizáronse ensaios de campo no centro-sur de Etiopía (mapa), preto da cidade de Maki (inserir), utilizando unha trampa de luz dos Centros para o Control de Enfermidades (CDC) (dereita) en casas emparelladas, cun deseño cadrado latino (imaxe aérea) (A). As fototrampas CDC con cebo de cheiro sintético atraen e capturan femias de *Anopheles arabesques* (B), pero non *Anopheles farroes* (C), dun xeito diferente, un efecto fisiolóxico dependente do estado. Ademais, estas trampas capturaron un número significativamente maior de mosquitos Culex hóspedes. (D) En comparación co control. As barras da esquerda representan o índice de selección medio de mosquitos capturados en pares de trampas de cebo de cheiro (verde) e de control (abertas) (N = 10), mentres que as barras da dereita representan o índice de selección medio en pares de trampas de control (abertas; N = 5). Os asteriscos indican niveis de significación estatística (*p = 0,01 e ***p < 0,0001).
As tres especies foron capturadas de xeito diferente en trampas que contiñan mesturas sintéticas. Na procura de hóspedes (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), na alimentación con sangue (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e na preñez (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), atopáronse . arabiensis atrapada na trampa que liberou a mestura sintética (Fig. 6B), mentres que a cantidade de An non difería. Atopáronse . Pharoensis en diferentes estados fisiolóxicos (Fig. 6C). No caso de Culex, só se atopou un aumento significativo no número de mosquitos que buscaban hóspedes nas trampas con cebo coa mestura sintética (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), en comparación coas trampas de control.
Usáronse trampas de cebo para hóspedes situadas fóra dos hóspedes potenciais entre os lugares de reprodución e as comunidades rurais en Etiopía para avaliar se os mosquitos da malaria usan o cheiro a ouriños de vaca como sinal de hábitat do hóspede. En ausencia de sinais de hóspede, calor e con ou sen a presenza de cheiro a ouriños de vaca, non se capturaron mosquitos (Ficheiro adicional 1: Figura S3). Non obstante, en presenza de altas temperaturas e cheiro a ouriños de vaca, as femias dos mosquitos da malaria foron atraídas e capturadas, aínda que en pequenas cantidades, independentemente da idade dos ouriños (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Ficheiro adicional 1: Figura S3). En contraste, os controis de auga non capturaron mosquitos da malaria a altas temperaturas (Ficheiro adicional 1: Figura S3).
Os mosquitos da malaria adquiren e distribúen compostos que conteñen nitróxeno a través da alimentación compensatoria de ouriños de vaca (é dicir, charcos) para mellorar os trazos do ciclo vital, de xeito similar a outros insectos [2, 4, 24, 25, 26]. Os ouriños de vaca son un recurso renovable dispoñible e estreitamente asociado cos lugares de descanso dos vectores da malaria, como os cortes das vacas e a vexetación alta preto das casas rurais e os lugares de desova. As femias de mosquito localizan este recurso polo olfacto e son capaces de regular a absorción de compostos nitroxenados nos ouriños, incluída a urea, o principal compoñente nitroxenado dos ouriños [15, 16]. Dependendo do estado fisiolóxico da femia de mosquito, os nutrientes dos ouriños asígnanse para mellorar a actividade de voo e a supervivencia dos mosquitos femias que buscan hóspedes, así como as características de supervivencia e reprodución dos individuos alimentados con sangue durante o primeiro ciclo gonadotrópico. Polo tanto, a mestura de ouriños xoga un papel nutricional importante para os vectores da malaria que están pechados como os adultos desnutridos [8], xa que lles proporciona aos mosquitos femias a capacidade de adquirir importantes compostos nitroxenados mediante unha alimentación de baixo risco. Este achado ten consecuencias epidemiolóxicas significativas, xa que as femias aumentan a súa a esperanza de vida, a actividade e o rendemento reprodutivo, todos os cales afectan á capacidade do vector. Ademais, este comportamento pode ser o obxectivo de futuros programas de xestión de vectores.