Perolehan dan distribusi nutrisi mengintegrasikan perilaku mencari makan serangga dan sifat-sifat siklus hidupnya. Untuk mengkompensasi kekurangan nutrisi tertentu pada berbagai tahap kehidupan, serangga dapat memperoleh nutrisi ini melalui pemberian makan tambahan, misalnya, dengan memakan sekresi vertebrata dalam proses yang dikenal sebagai genangan air. Nyamuk Anopheles arabiensis tampaknya kekurangan gizi dan, oleh karena itu, membutuhkan nutrisi untuk metabolisme dan reproduksi. Tujuan penelitian ini adalah untuk menilai apakah pengadukan An. arabiensis pada urin sapi untuk memperoleh nutrisi dapat meningkatkan karakteristik siklus hidupnya.
Pastikan aman. Nyamuk Arabiensis tertarik pada bau urin sapi segar, berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam, dan nyamuk betina yang mencari inang dan telah menghisap darah (48 jam setelah menghisap darah) diukur menggunakan olfaktometer tabung-Y, dan nyamuk betina hamil dinilai untuk uji pemijahan. Analisis kimia dan elektrofisiologi gabungan kemudian digunakan untuk mengidentifikasi senyawa bioaktif dalam urin sapi pada keempat kelas umur tersebut. Campuran sintetis senyawa bioaktif dievaluasi dalam uji tabung-Y dan lapangan. Untuk menyelidiki urin sapi dan senyawa utama yang mengandung nitrogen, urea, sebagai potensi makanan tambahan untuk vektor malaria, parameter pemberian makan dan karakteristik siklus hidup diukur. Proporsi nyamuk betina dan jumlah urin sapi dan urea yang diserap dinilai. Setelah makan, nyamuk betina dinilai untuk kelangsungan hidup, penerbangan terikat, dan reproduksi.
Mencari darah dan nutrisi dari inang. Dalam studi laboratorium dan lapangan, ikan Arab tertarik pada aroma alami dan sintetis dari urin sapi segar dan yang sudah lama. Betina yang hamil tidak terpengaruh oleh respons urin sapi di tempat pemijahan. Betina pencari inang dan penghisap darah secara aktif menyerap urin sapi dan urea dan mengalokasikan sumber daya ini sesuai dengan pertimbangan siklus hidup sebagai fungsi keadaan fisiologis untuk melarikan diri, bertahan hidup, atau bereproduksi.
Akuisisi dan distribusi urin sapi oleh Anopheles arabinis untuk meningkatkan karakteristik siklus hidup. Pemberian pakan tambahan berupa urin sapi memengaruhi kapasitas vektor secara langsung dengan meningkatkan kelangsungan hidup harian dan kepadatan vektor, dan secara tidak langsung dengan mengubah aktivitas terbang, sehingga perlu dipertimbangkan dalam model di masa mendatang.
Perolehan dan distribusi nutrisi mengintegrasikan perilaku mencari makan serangga dan karakteristik siklus hidup [1,2,3]. Serangga mampu memilih dan memperoleh makanan serta melakukan pemberian makan kompensasi berdasarkan ketersediaan makanan dan kebutuhan nutrisi [1, 3]. Distribusi nutrisi bergantung pada proses siklus hidup dan dapat menyebabkan kebutuhan yang berbeda untuk kualitas dan kuantitas makanan pada berbagai tahap kehidupan serangga [1, 2]. Untuk mengkompensasi kekurangan nutrisi tertentu, serangga dapat memperoleh nutrisi ini melalui pemberian makan tambahan, seperti pada lumpur, berbagai kotoran dan sekresi vertebrata, dan bangkai, suatu proses yang dikenal sebagai genangan air [2]. Meskipun berbagai spesies kupu-kupu dan ngengat terutama dideskripsikan, lubang air juga terjadi pada ordo serangga lainnya, dan ketertarikan serta pemberian makan pada jenis sumber daya ini dapat memiliki efek signifikan pada kesehatan dan sifat siklus hidup lainnya [2, 4, 5, 6], 7]. Nyamuk malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) muncul sebagai nyamuk dewasa yang 'kurang gizi' [8], sehingga pemberian air dapat memainkan peran penting dalam karakteristik siklus hidupnya. Namun, perilaku ini sejauh ini telah diabaikan. Penggunaan pengadukan sebagai cara untuk meningkatkan asupan nutrisi pada kendaraan penting ini perlu mendapat perhatian karena hal ini dapat memiliki konsekuensi epidemiologis yang penting.
Asupan nitrogen pada nyamuk Anopheles betina dewasa terbatas karena cadangan kalori yang rendah yang dibawa dari tahap larva dan pemanfaatan makanan darah yang tidak efisien [9]. Nyamuk betina Ann.gambiae sl biasanya mengkompensasi hal ini dengan menambah makanan darah [10, 11], sehingga menempatkan lebih banyak orang pada risiko tertular penyakit dan menempatkan nyamuk pada risiko predasi yang lebih besar. Sebagai alternatif, nyamuk dapat menggunakan makanan tambahan berupa kotoran vertebrata untuk memperoleh senyawa nitrogen yang meningkatkan adaptasi dan kemampuan manuver terbang, seperti yang ditunjukkan oleh serangga lain [2]. Dalam hal ini, daya tarik yang kuat dan berbeda dari salah satu spesies saudara dalam kompleks spesies An. Gambian sl, Anopheles arabinis, terhadap urin sapi segar dan tua [12,13,14], sangat menarik. Anopheles arabinis bersifat oportunistik dalam preferensi inangnya dan diketahui berasosiasi dengan dan memakan sapi. Urin sapi merupakan sumber daya yang kaya akan senyawa nitrogen, dengan urea menyumbang 50-95% dari total nitrogen dalam urin segar [15, 16]. Seiring bertambahnya usia urin sapi, mikroorganisme memanfaatkan sumber daya ini untuk mengurangi kompleksitas senyawa nitrogen dalam waktu 24 jam [15]. Dengan peningkatan amonia yang cepat, yang dikaitkan dengan penurunan nitrogen organik, mikroorganisme alkalofilik (banyak di antaranya menghasilkan senyawa yang beracun bagi nyamuk) berkembang biak [15], yang mungkin menyebabkan nyamuk betina Ann.arabiensis lebih tertarik pada urin yang berumur 24 jam atau kurang [13, 14].
Dalam penelitian ini, nyamuk Ans yang menghisap darah inang dan yang telah menghisap darah dicari. Selama siklus gonadotropin pertamanya, arabiensis dinilai untuk memperoleh senyawa nitrogen, termasuk urea, melalui pencampuran urin. Selanjutnya, serangkaian percobaan dilakukan untuk menilai bagaimana nyamuk betina mengalokasikan sumber nutrisi potensial ini untuk meningkatkan kelangsungan hidup, reproduksi, dan pencarian makanan lebih lanjut. Akhirnya, bau urin sapi segar dan yang telah lama diendapkan dinilai untuk menentukan apakah ini memberikan petunjuk yang dapat diandalkan bagi nyamuk Ans yang menghisap darah inang dan yang telah menghisap darah. Dalam pencarian mereka akan sumber nutrisi potensial ini, arabiensis menemukan korelasi kimia di balik daya tarik diferensial yang diamati. Campuran bau sintetis senyawa organik volatil (VOC) yang diidentifikasi dalam urin yang telah diendapkan selama 24 jam selanjutnya dievaluasi dalam kondisi lapangan, memperluas hasil yang diperoleh dalam kondisi laboratorium dan menunjukkan efek bau urin sapi pada berbagai keadaan fisiologis. Daya tarik nyamuk. Hasil yang diperoleh mengkonfirmasi bahwa An. Arabiensis memperoleh dan mendistribusikan senyawa nitrogen yang ditemukan dalam urin vertebrata untuk memengaruhi karakteristik siklus hidup. Hasil ini dibahas dalam konteks potensi konsekuensi epidemiologis dan bagaimana hal tersebut dapat digunakan untuk pengawasan dan pengendalian vektor.
Nyamuk Anopheles arabicans (galur Dongola) dipelihara pada suhu 25 ± 2 °C, kelembapan relatif 65 ± 5%, dan siklus terang:gelap 12:12 jam. Larva dipelihara dalam nampan plastik (20 cm × 18 cm × 7 cm) yang diisi dengan air suling dan diberi makan makanan ikan Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Pupa dikumpulkan dalam cangkir 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) dan kemudian dipindahkan ke kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) untuk memungkinkan kemunculan nyamuk dewasa. Nyamuk dewasa diberi larutan sukrosa 10% secara ad libitum hingga 4 hari pasca-kemunculan (dpe), di mana nyamuk betina yang mencari inang diberi makanan segera sebelum percobaan, atau dibiarkan kelaparan semalaman dengan air suling sebelum percobaan. dijelaskan di bawah ini. Nyamuk betina yang digunakan untuk percobaan tabung terbang hanya dipuasakan selama 4-6 jam dengan air minum sepuasnya. Untuk mempersiapkan nyamuk penghisap darah untuk bioassay selanjutnya, nyamuk betina 4 dpe diberi darah domba defibrotik (Håtunalab, Bro, SE) menggunakan sistem pemberian makan membran (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Nyamuk betina yang sepenuhnya mengalami kongesti kemudian dipindahkan ke kandang individu dan diberi makanan langsung, seperti yang dijelaskan di bawah ini, atau 10% sukrosa sepuasnya selama 3 hari sebelum percobaan yang dijelaskan di bawah ini. Nyamuk betina yang terakhir digunakan untuk bioassay tabung terbang dan dipindahkan ke laboratorium, dan kemudian diberi air suling sepuasnya selama 4-6 jam sebelum percobaan.
Pengujian pemberian makan digunakan untuk mengukur konsumsi urin dan urea pada nyamuk betina dewasa An. Arab. Nyamuk betina yang mencari inang dan yang telah menghisap darah diberi diet yang mengandung 1% urin sapi segar dan yang telah lama disimpan yang diencerkan, berbagai konsentrasi urea, dan dua kontrol (10% sukrosa dan air) selama 48 jam. Selain itu, pewarna makanan (1 mg ml-1 xylene cyanide FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ditambahkan ke dalam diet dan diberikan dalam matriks 4 × 4 dalam tabung mikrosentrifuga 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, AS; Gambar 1A) Isi hingga tepi (~300 µl). Untuk menghindari persaingan antar nyamuk dan potensi efek warna pewarna, tempatkan 10 nyamuk dalam cawan Petri besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Gambar 1A) dalam kegelapan total pada suhu 25°C. ± 2 cm °C dan kelembapan relatif 65 ± 5%. Percobaan ini diulang 5 hingga 10 kali. Setelah terpapar makanan, nyamuk ditempatkan pada suhu -20 °C hingga analisis lebih lanjut.
Carilah urin sapi dan urea yang diserap oleh inang dan nyamuk betina penghisap darah Anopheles arabianus. Dalam uji coba pemberian makan (A), nyamuk betina diberi makanan yang terdiri dari urin sapi segar dan yang sudah lama, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O). Nyamuk betina pencari inang (B) dan yang telah menghisap darah (C) menyerap lebih banyak sukrosa daripada makanan lain yang diuji. Perhatikan bahwa nyamuk betina pencari inang menyerap urin sapi 72 jam lebih sedikit daripada urin sapi 168 jam (B). Kandungan nitrogen total rata-rata (± deviasi standar) urin diwakili dalam sisipan. Nyamuk betina pencari inang (D, F) dan penghisap darah (E, G) menyerap urea secara bergantung pada dosis. Volume inhalasi rata-rata (D, E) dengan nama huruf yang berbeda secara signifikan berbeda satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05). Batang kesalahan mewakili kesalahan standar rata-rata (BE). Garis putus-putus lurus mewakili garis regresi log-linier (F, G)
Untuk melepaskan makanan yang diserap, nyamuk ditempatkan satu per satu ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang berisi 230 µl air suling dan jaringan dihancurkan menggunakan alu sekali pakai dan motor tanpa kabel (VWR International, Lund, SE), diikuti dengan sentrifugasi pada 10 krpm selama 10 menit. Supernatan (200 µl) dipindahkan ke mikroplat 96 sumur (Sigma-Aldrich) dan absorbansi (λ620) ditentukan menggunakan pembaca mikroplat berbasis spektrofotometer (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Sebagai alternatif, nyamuk digiling dalam 1 ml air suling, 900 µl di antaranya dipindahkan ke kuvet untuk analisis spektrofotometri (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Untuk mengukur asupan makanan, kurva standar disiapkan dengan pengenceran serial untuk menghasilkan 0,2 µl hingga 2,4 µl xylene cyanide 1 mg ml-1. Kemudian, kerapatan optik dari konsentrasi pewarna yang diketahui digunakan untuk menentukan jumlah makanan yang dimakan setiap nyamuk.
Data volume dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti oleh perbandingan berpasangan post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, AS, 1989–2007). Analisis regresi linier menggambarkan asupan urea yang bergantung pada konsentrasi dan membandingkan respons antara nyamuk pencari inang dan nyamuk penghisap darah (GraphPad Prism v8.0.0 untuk Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, AS).
Sekitar 20 µl sampel urin dari setiap kelompok umur diikat pada Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) dan dikapsulkan dalam kapsul timah (8 mm × 5 mm). Kapsul dimasukkan ke dalam ruang pembakaran alat analisis CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) untuk menentukan kandungan nitrogen dalam urin segar dan urin yang telah lama disimpan sesuai dengan protokol pabrikan. Total nitrogen (g N l-1) diukur berdasarkan konsentrasi urea yang diketahui yang digunakan sebagai standar.
Untuk menilai pengaruh diet terhadap kelangsungan hidup nyamuk betina yang mencari inang dan menghisap darah, nyamuk ditempatkan secara individual dalam cawan Petri besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni) dengan lubang berjaring di tutupnya (diameter 3 cm) untuk ventilasi dan pasokan makanan. Diet diberikan langsung setelah 4 hari pasca-infeksi (dpe) dan meliputi 1% urin sapi segar dan tua yang diencerkan, empat konsentrasi urea, dan dua kontrol, 10% sukrosa dan air. Setiap diet dipipet ke tampon gigi (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) yang dimasukkan ke dalam jarum suntik 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), pendorongnya dilepas, dan diletakkan di atas cawan Petri (gambar 1).1A). Ubah diet Anda setiap hari. Pertahankan laboratorium seperti yang dijelaskan di atas. Nyamuk yang bertahan hidup dihitung dua kali sehari, sedangkan nyamuk yang mati dibuang sampai nyamuk terakhir mati (n = 40 per perlakuan). Kelangsungan hidup nyamuk yang diberi makan berbagai diet dianalisis secara statistik. menggunakan kurva kelangsungan hidup Kaplan-Meyer dan uji log-rank untuk membandingkan distribusi kelangsungan hidup antar diet (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Kincir terbang nyamuk kustom berdasarkan Attisano et al.[17], terbuat dari panel akrilik bening setebal 5 mm (lebar 10 cm x panjang 10 cm x tinggi 10 cm) tanpa panel depan dan belakang (Gambar 3: atas). Rakitan poros dengan tabung vertikal yang terbuat dari kolom kromatografi gas (diameter dalam 0,25 mm; panjang 7,5 cm) dengan ujung yang direkatkan ke jarum serangga yang digantung di antara sepasang magnet neodymium dengan jarak 9 cm. Tabung horizontal yang terbuat dari bahan yang sama (panjang 6,5 cm) membelah tabung vertikal untuk membentuk lengan yang diikat dan lengan yang membawa sepotong kecil aluminium foil sebagai sinyal pengganggu cahaya.
Nyamuk betina yang telah berpuasa selama 24 jam diberi makanan di atas selama 30 menit sebelum ditahan. Nyamuk betina yang telah kenyang kemudian dibius satu per satu di atas es selama 2-3 menit dan ditempelkan pada jarum serangga dengan lilin lebah (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) dan kemudian diikat ke lengan tabung horizontal. Mesin Penghitung Penerbangan. Putaran per penerbangan dicatat oleh pencatat data yang dibuat khusus, kemudian disimpan dan ditampilkan menggunakan perangkat lunak PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Mesin penghitung penerbangan ditempatkan di ruangan yang diatur iklimnya (12 jam:12 jam, terang: gelap, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Untuk memvisualisasikan pola aktivitas terbang, total jarak terbang (m) dan total jumlah aktivitas terbang beruntun dihitung per jam selama periode 24 jam. Selain itu, jarak terbang rata-rata oleh masing-masing betina dibandingkan antar perlakuan dan dianalisis menggunakan ANOVA satu arah dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), di mana jarak rata-rata dianggap sebagai variabel dependen, sedangkan perlakuan adalah faktor independen. Selain itu, jumlah putaran rata-rata dihitung dalam interval 10 menit.
Untuk menilai pengaruh diet terhadap kinerja reproduksi An.arabiensis, enam betina (4 dpe) dipindahkan langsung ke kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) setelah pengambilan darah dan kemudian diberi diet eksperimental selama 48 jam seperti yang dijelaskan di atas. Diet kemudian dihilangkan dan cawan pemijahan (30 ml; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 ml air suling diberikan pada hari ketiga selama 48 jam, diganti setiap 24 jam. Ulangi setiap regimen diet 20-50 kali. Telur dihitung dan dicatat untuk setiap kandang eksperimental. Subsampel telur digunakan untuk menilai ukuran rata-rata dan variasi panjang telur individu (n ≥ 200 per diet) menggunakan mikroskop Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) yang dilengkapi dengan Kamera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Telur yang tersisa disimpan di ruangan beriklim terkontrol di bawah kondisi pemeliharaan standar selama 24 jam, dan sub-sampel larva instar ke-1 yang baru menetas (n ≥ 200 per diet) diukur, seperti yang dijelaskan di atas. Jumlah telur dan ukuran telur serta larva dibandingkan antar perlakuan dan menggunakan ANOVA satu arah dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Senyawa volatil ruang kepala dari urin segar (1 jam setelah pengambilan sampel), 24 jam, 72 jam, dan 168 jam dikumpulkan dari sampel yang diambil dari sapi Zebu, ras Arsi. Untuk kemudahan, sampel urin dikumpulkan pada pagi hari saat sapi masih berada di kandang. Sampel urin dikumpulkan dari 10 individu dan 100-200 ml dari setiap sampel dipindahkan ke kantong kue poliamida individual (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) dalam drum plastik vinil klorida 3 liter dengan tutup poliamida. Senyawa volatil ruang kepala dari setiap sampel urin sapi dikumpulkan secara langsung (segar) atau setelah pematangan pada suhu kamar selama 24 jam, 72 jam, dan 168 jam, yaitu setiap sampel urin mewakili setiap kelompok umur.
Untuk pengumpulan senyawa volatil di ruang kepala (headspace), sistem tertutup digunakan untuk mengalirkan aliran gas yang disaring karbon aktif (100 ml min-1) melalui kantung poliamida ke kolom adsorpsi selama 2,5 jam menggunakan pompa vakum diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Sebagai kontrol, pengumpulan ruang kepala dilakukan dari kantung poliamida kosong. Kolom adsorpsi terbuat dari tabung Teflon (5,5 cm x 3 mm id) yang berisi 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) di antara sumbat wol kaca. Sebelum digunakan, kolom dibilas dengan 1 ml n-heksana hasil distilasi ulang (Merck, Darmstadt, DE) dan 1 ml pentana (pelarut murni 99,0% kualitas GC, Sigma Aldrich). Senyawa volatil yang teradsorpsi dieluasi dengan 400 μl pentana. Pengumpulan ruang kepala dikumpulkan dan kemudian disimpan pada suhu -20°C sampai digunakan untuk analisis lebih lanjut. analisis.
Respons perilaku An yang mencari inang dan menghisap darah. Ekstrak volatil ruang kepala yang dikumpulkan dari urin segar, berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam dianalisis untuk ekstrak volatil dari nyamuk Arabidopsis menggunakan olfaktometer tabung kaca lurus [18]. Percobaan dilakukan selama ZT 13-15, periode puncak aktivitas pencarian rumah An. Arab [19]. Olfaktometer tabung kaca (80 cm × 9,5 cm id) diterangi dengan cahaya merah 3 ± 1 lx dari atas. Aliran udara yang disaring arang dan dilembabkan (25 ± 2 °C, 65 ± 2% kelembaban relatif) melewati bioassay pada 30 cm s-1. Udara dilewatkan melalui serangkaian saringan jaring baja tahan karat, menciptakan aliran laminar dan struktur gumpalan yang seragam. Dispenser tampon gigi (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), digantung dari kumparan 5 cm di ujung olfaktometer yang menghadap angin, dengan penggantian stimulator setiap 5 menit. Untuk analisis, 10 μl dari setiap ekstrak ruang kepala, diencerkan 1:10, digunakan sebagai stimulus. Jumlah pentana yang sama digunakan sebagai kontrol. Nyamuk pencari inang atau penghisap darah ditempatkan dalam sangkar pelepasan individu 2-3 jam sebelum dimulainya percobaan. Sangkar pelepasan ditempatkan di sisi hilir olfaktometer, dan nyamuk dibiarkan beradaptasi selama 1 menit, kemudian katup kupu-kupu sangkar dibuka untuk melepaskan. Ketertarikan terhadap perlakuan atau kontrol dianalisis sebagai proporsi nyamuk yang bersentuhan dengan sumber dalam waktu 5 menit setelah pelepasan. Setiap ekstrak volatil ruang kepala dan kontrol direplikasi setidaknya 30 kali, dan untuk menghindari efek dari satu hari tertentu, jumlah perlakuan dan kontrol yang sama diuji pada setiap hari percobaan. Respons pencarian dari inang dan nyamuk penghisap darah dianalisis menggunakan set Arab versus ruang kepala. Regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk rasio odds (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Respons pemijahan An. Ekstrak ruang kepala dari urin sapi segar dan yang sudah lama dianalisis dalam kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Cangkir plastik (30 mL; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 mL air suling menyediakan substrat pemijahan dan ditempatkan di sudut berlawanan kandang, dengan jarak 24 cm. Cangkir perlakuan disesuaikan dengan 10 μl setiap ekstrak ruang kepala dengan pengenceran 1:10. Jumlah pentana yang sama digunakan untuk menyesuaikan cangkir kontrol. Cangkir perlakuan dan kontrol ditukar di antara setiap percobaan untuk mengontrol efek posisi. Sepuluh betina yang telah menghisap darah dilepaskan ke dalam kandang percobaan pada ZT 9-11 dan telur dalam cangkir dihitung 24 jam kemudian. Rumus untuk menghitung indeks pemijahan adalah: (jumlah telur yang diletakkan di cangkir perlakuan – jumlah telur yang diletakkan di cangkir kontrol)/(jumlah total telur yang diletakkan). Setiap perlakuan diulang 8 kali.
Analisis kromatografi gas dan deteksi pola antena elektron (GC-EAD) pada An.arabiensis betina dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [20]. Singkatnya, ekstrak volatil headspace segar dipisahkan menggunakan Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, AS) yang dilengkapi dengan kolom HP-5 (30 m × 0,25 mm id, ketebalan film 0,25 μm, Agilent Technologies). dan urin yang menua. Hidrogen digunakan sebagai fase gerak dengan laju aliran linier rata-rata 45 cm s-1. Setiap sampel (2 μl) diinjeksikan selama 30 detik dalam mode tanpa pemisahan dengan suhu masuk 225 °C. Suhu oven GC diprogram dari 35 °C (ditahan selama 3 menit) hingga 300 °C (ditahan selama 10 menit) dengan laju 10 °C min-1. Dalam pemisah efluen GC, ditambahkan nitrogen 4 psi dan dibagi 1:1 dalam Gerstel 3D/2 low dead volume cross (Gerstel, Mülheim, DE) antara detektor ionisasi nyala dan EAD. Kapiler efluen GC untuk EAD dilewatkan melalui saluran transfer Gerstel ODP-2, yang melacak suhu oven GC ditambah 5 °C, ke dalam tabung kaca (10 cm × 8 mm), di mana ia dicampur dengan udara lembap yang disaring karbon. (1,5 l min−1). Antena ditempatkan 0,5 cm dari ujung tabung. Setiap nyamuk individu dihitung sebagai satu replikasi, dan untuk nyamuk pencari inang, setidaknya tiga replikasi dilakukan pada sampel urin dari setiap umur.
Identifikasi senyawa bioaktif dalam koleksi ruang kepala urin sapi segar dan tua menggunakan GC dan spektrometer massa gabungan (GC-MS; 6890 GC dan 5975 MS; Agilent Technologies) untuk memicu respons antena dalam analisis GC-EAD, beroperasi dalam mode ionisasi tumbukan elektron pada 70 eV. GC dilengkapi dengan kolom kapiler silika leburan berlapis HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm diameter dalam, ketebalan film 0,25 μm) menggunakan helium sebagai fase gerak dengan laju aliran linier rata-rata 35 cm s-1. Sampel 2 μl diinjeksikan menggunakan pengaturan injektor dan suhu oven yang sama seperti untuk analisis GC-EAD. Senyawa diidentifikasi berdasarkan waktu retensinya (indeks Kovát) dan spektrum massa dibandingkan dengan pustaka khusus dan pustaka NIST14 (Agilent). Senyawa yang teridentifikasi dikonfirmasi dengan menginjeksikan standar otentik (Berkas Tambahan 1: Tabel S2). Untuk kuantifikasi, heptil asetat (10 ng, kemurnian kimia 99,8%, Aldrich) disuntikkan sebagai standar eksternal.
Mengevaluasi kemanjuran campuran bau sintetis yang terdiri dari senyawa bioaktif yang diidentifikasi dalam urin segar dan urin yang telah disimpan untuk menarik nyamuk Ans. arabiensis pencari inang dan penghisap darah, menggunakan olfaktometer dan protokol yang sama seperti di atas. Campuran sintetis meniru komposisi dan proporsi senyawa dalam ekstrak volatil ruang kepala campuran dari urin segar, urin yang telah disimpan selama 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 168 jam (Gambar 5D-G; File Tambahan 1: Tabel S2). Untuk analisis, gunakan 10 μl pengenceran 1:100 dari campuran sintetis sepenuhnya, dengan laju pelepasan keseluruhan berkisar antara sekitar 140-2400 ng h-1, untuk menilai daya tarik terhadap nyamuk inang dan penghisap darah. Setelah itu, pengujian dilakukan pada campuran lengkap, di mana campuran subtraktif dari senyawa tunggal dari campuran lengkap dihilangkan. Respons pencarian dari nyamuk Ans. Arab yang telah menghisap darah terhadap campuran sintetis dan subtraktif dianalisis menggunakan Regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk rasio odds (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Untuk menilai apakah urin sapi dapat berfungsi sebagai isyarat habitat inang bagi nyamuk malaria, urin sapi segar dan yang sudah lama, yang dikumpulkan seperti yang dijelaskan di atas, dan air ditempatkan dalam ember 3 liter (100 ml) yang diberi jaring dan dipasang di perangkap umpan inang. (Versi BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Sepuluh perangkap ditempatkan dengan jarak 50 m di padang rumput, 400 m dari komunitas desa (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) dan tanpa ternak, di tempat perkembangbiakan permanen dan desa. Lima perangkap dipanaskan untuk mensimulasikan keberadaan inang, sementara lima perangkap dibiarkan tanpa pemanasan. Setiap lokasi perlakuan dirotasi setiap malam selama total lima malam. Jumlah nyamuk yang tertangkap dalam perangkap yang diberi umpan urin dengan usia berbeda dibandingkan menggunakan regresi logistik dengan distribusi beta binomial (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Di sebuah desa endemik malaria dekat kota Maki, wilayah Oromia, Ethiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Gambar 6A). Studi ini dilakukan antara pertengahan Agustus dan pertengahan September sebelum penyemprotan residu dalam ruangan tahunan, bersamaan dengan musim hujan yang panjang. Lima pasang rumah (berjarak 20–50 m) yang terletak di pinggiran desa dipilih untuk penelitian ini (Gambar 6A). Kriteria yang digunakan untuk memilih rumah adalah: tidak diperbolehkan memelihara hewan di dalam rumah, tidak diperbolehkan memasak di dalam ruangan (menggunakan kayu bakar atau arang) (setidaknya selama periode percobaan), dan rumah dengan maksimal dua penghuni, tidur tanpa insektisida. di bawah kelambu yang telah diberi perlakuan. Persetujuan etika telah diberikan oleh Dewan Peninjauan Etika Penelitian Institusional (IRB/022/2016) Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam (CNS-IRB), Universitas Addis Ababa, sesuai dengan pedoman yang ditetapkan oleh Deklarasi Helsinki Asosiasi Medis Dunia. Persetujuan dari setiap kepala rumah tangga diperoleh dengan bantuan staf penyuluh kesehatan. Seluruh proses didukung oleh administrasi lokal di tingkat distrik dan kelurahan ('kebele'). Desain eksperimental mengikuti desain bujur sangkar Latin 2 × 2, di mana campuran sintetis dan kontrol ditugaskan ke rumah-rumah berpasangan pada malam pertama dan ditukar antar rumah pada malam percobaan berikutnya. Proses ini diulang sepuluh kali. Selain itu, untuk memperkirakan aktivitas nyamuk di rumah-rumah terpilih, perangkap CDC diatur untuk berjalan selama lima malam berturut-turut di awal, tengah, dan akhir uji coba lapangan pada waktu yang sama setiap harinya.
Campuran sintetis yang mengandung enam senyawa bioaktif dilarutkan dalam heptana (97,0% pelarut kelas GC, Sigma Aldrich) dan dilepaskan pada 140 ng h-1 menggunakan dispenser sumbu kapas [20]. Dispenser sumbu memungkinkan semua senyawa dilepaskan dalam proporsi konstan sepanjang percobaan 12 jam. Heptana digunakan sebagai kontrol. Vial digantung di sebelah titik masuk perangkap cahaya Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, AS; Gambar 6A). Perangkap digantung 0,8 – 1 m di atas tanah, dekat kaki tempat tidur, dan seorang sukarelawan tidur di bawah kelambu yang tidak diolah dan dioperasikan antara pukul 18:00 dan 06:30. Nyamuk yang ditangkap berdasarkan jenis kelamin dan status fisiologis (belum makan, sudah makan, setengah hamil, dan hamil [21] kemudian disaring menggunakan analisis reaksi berantai polimerase (PCR) untuk mengidentifikasi spesies yang secara morfologis diidentifikasi sebagai A. gambiae sl. Anggota kompleks [23]. Dalam studi lapangan, perangkap rumah berpasangan dianalisis menggunakan model kecocokan logistik nominal, di mana daya tarik adalah variabel dependen dan perlakuan (campuran sintetis vs kontrol) adalah efek tetap (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Di sini, kami melaporkan nilai χ2 dan p dari uji rasio kemungkinan.
Evaluasi apakah aman. arabiensis mampu memperoleh urin, sumber nitrogen utamanya, urea, melalui pemberian makan langsung, dalam waktu 48 jam setelah pemberian selama 4 hari pasca (dpe) percobaan pemberian makan betina pencari inang dan pengisap darah (Gambar 1A). Baik betina pencari inang maupun pengisap darah menyerap sukrosa secara signifikan lebih banyak daripada diet atau air lainnya (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 dan F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, masing-masing; Gambar 1B,C). Lebih lanjut, betina pencari inang makan lebih sedikit urin pada 72 jam dibandingkan urin pada 168 jam (Gambar 1B). Ketika diberi diet yang mengandung urea, betina pencari inang menyerap urea dalam jumlah yang jauh lebih besar pada 2,69 mM dibandingkan dengan semua konsentrasi lain dan air, sementara tidak dapat dibedakan dari sukrosa 10%. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Gambar 1D). Hal ini berbeda dengan respons betina yang diberi makan darah, yang biasanya menyerap lebih banyak diet yang mengandung urea daripada air, meskipun secara signifikan kurang dari 10% sukrosa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Gambar 1E). Lebih lanjut, ketika membandingkan antara dua keadaan fisiologis, betina yang di-flebotomi menyerap lebih banyak urea daripada betina yang mencari inang pada konsentrasi terendah, dan betina ini menyerap jumlah urea yang serupa pada konsentrasi yang lebih tinggi (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Gambar 1F, G). Meskipun asupan dari diet yang mengandung urea tampaknya memiliki nilai optimal (Gambar 1D,E), betina dalam kedua keadaan fisiologis mampu memodulasi jumlah urea yang diserap di seluruh rentang konsentrasi urea. secara log-linear (Gambar 1F,G). Demikian pula, nyamuk tampaknya mengontrol penyerapan nitrogen mereka dengan mengatur jumlah urin yang diserap, karena jumlah nitrogen dalam urin tercermin dalam jumlah yang diserap (Gambar 1B, C dan B sisipan).
Untuk menilai efek urin dan urea pada kelangsungan hidup nyamuk pencari inang dan penghisap darah, nyamuk betina diberi makan urin dari keempat usia (segar, 24 jam, 72 jam, dan 168 jam setelah pengendapan) dan berbagai konsentrasi urea, serta air suling dan sukrosa 10% yang berfungsi sebagai kontrol (Gambar 2A). Analisis kelangsungan hidup ini menunjukkan bahwa diet memiliki efek signifikan pada kelangsungan hidup keseluruhan pada nyamuk betina pencari inang (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Gambar 2B, C) dan nyamuk betina penghisap darah (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Gambar 2B, C) 2D,E). Dalam semua percobaan, betina yang diberi makan diet urin, urea, dan air memiliki tingkat kelangsungan hidup yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan betina yang diberi makan diet sukrosa (Gambar 2B-E). Betina pencari inang yang diberi makan urin segar dan basi menunjukkan tingkat kelangsungan hidup yang berbeda, dengan betina yang diberi makan urin basi 72 jam (p = 0,016) memiliki probabilitas kelangsungan hidup terendah (Gambar 2B). Selanjutnya, betina pencari inang yang diberi makan urea 135 mM bertahan hidup lebih lama daripada kontrol air (p < 0,04) (Gambar 2C). Dibandingkan dengan air, betina yang diberi makan urin segar dan urin 24 jam bertahan hidup lebih lama (p = 0,001 dan p = 0,012, masing-masing; Gambar 2D), sedangkan betina yang diberi makan urin 72 jam bertahan hidup lebih lama daripada betina yang diberi makan urin segar dan urin basi 24 jam (p < 0,0001 dan p = 0,013, masing-masing; Gambar 2D). Ketika diberi makan 135 mM Pada konsentrasi urea yang tinggi, betina yang diberi makan darah bertahan hidup lebih lama dibandingkan dengan semua konsentrasi urea dan air lainnya (p < 0,013; Gambar 2E).
Kelangsungan hidup inang dan nyamuk betina penghisap darah Anopheles arabinis yang diberi makan urin sapi dan urea. Dalam bioassay (A), nyamuk betina diberi makanan yang terdiri dari urin sapi segar dan yang sudah lama, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O). Kelangsungan hidup nyamuk pencari inang (B, C) dan penghisap darah (D, E) dicatat setiap 12 jam hingga semua nyamuk betina yang diberi makan urin (B, D) dan urea (C, E), serta kontrol, sukrosa dan air, mati.
Jarak total dan jumlah putaran yang ditentukan dalam uji kincir terbang selama periode 24 jam berbeda antara nyamuk pencari inang dan nyamuk penghisap darah, yang menunjukkan aktivitas terbang yang lebih rendah secara keseluruhan (Gambar 3). Nyamuk pencari inang yang diberi urin segar dan urin lama atau sukrosa dan air menunjukkan pola terbang yang berbeda (Gambar 3), dengan nyamuk betina yang memakan urin segar lebih aktif saat fajar, sementara nyamuk yang diberi urin lama 24 dan 168 jam. Nyamuk yang memakan urin menunjukkan pola terbang yang berbeda dan terutama aktif di siang hari. Nyamuk betina yang diberi sukrosa atau urin lama 72 jam menunjukkan aktivitas sepanjang periode 24 jam, sementara nyamuk betina yang diberi air lebih aktif selama periode pertengahan. Nyamuk yang diberi sukrosa menunjukkan tingkat aktivitas tertinggi pada larut malam dan pagi hari, sementara nyamuk yang mengonsumsi urin lama 72 jam mengalami penurunan aktivitas yang stabil selama 24 jam (Gambar 3).
Performa terbang nyamuk betina Anopheles arabinis yang mencari inang dan menghisap darah dengan memakan urin sapi dan urea. Dalam uji penggilingan penerbangan, nyamuk betina yang diberi makan urin sapi segar dan yang sudah lama, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) diikatkan ke lengan horizontal yang berputar bebas (di atas). Untuk nyamuk betina yang mencari inang (kiri) dan menghisap darah (kanan), jarak total dan jumlah penerbangan per jam untuk setiap diet selama periode 24 jam dicatat (gelap: abu-abu; terang: putih). Jarak rata-rata dan jumlah rata-rata penerbangan ditunjukkan di sebelah kanan grafik aktivitas sirkadian. Batang kesalahan mewakili kesalahan standar rata-rata. Analisis statistik lihat teks.
Secara umum, aktivitas terbang keseluruhan nyamuk betina pencari inang mengikuti pola yang mirip dengan jarak terbang selama periode 24 jam. Jarak terbang rata-rata dipengaruhi secara signifikan oleh makanan yang dikonsumsi (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), dan nyamuk betina pencari inang yang mengonsumsi urin selama 72 jam terbang dengan jarak yang jauh lebih signifikan dibandingkan dengan semua makanan lainnya (p < 0,0001), dan nyamuk yang diberi makan sukrosa terbang lebih jauh daripada nyamuk yang diberi makan urin segar (p = 0,022) dan urin yang telah disimpan selama 24 jam (p = 0,022). Berbeda dengan pola aktivitas terbang yang dijelaskan oleh makanan urin, nyamuk betina pencari inang yang diberi makan urea menunjukkan aktivitas terbang yang terus-menerus selama periode 24 jam, mencapai puncaknya selama paruh kedua fase gelap (Gambar 3). Meskipun pola aktivitasnya serupa, nyamuk betina pencari inang yang diberi makan urea secara signifikan meningkatkan jarak terbang rata-rata tergantung pada konsentrasi yang diserap (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Betina pencari inang yang diberi makan urea dengan konsentrasi berapa pun terbang lebih lama daripada betina yang diberi makan air atau sukrosa (p < 0,03).
Secara keseluruhan, aktivitas terbang nyamuk penghisap darah stabil dan berkelanjutan selama 24 jam di semua jenis makanan, dengan peningkatan aktivitas urin selama paruh kedua periode gelap untuk nyamuk betina yang diberi makan air serta pada nyamuk betina yang diberi makan urin segar dan berumur 24 jam (gambar 3). Sementara diet urin secara signifikan memengaruhi jarak terbang rata-rata pada nyamuk betina yang diberi makan darah (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), diet urea tidak (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) dengan diet urin dan kontrol lainnya (segar, p = 0,0091; 72 jam, p = 0,0022; 168 jam, p = 0,001; sukrosa, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Pengaruh pemberian urin dan urea terhadap parameter reproduksi dinilai dalam bioassay peletakan telur (Gambar 4A) dan diselidiki berdasarkan jumlah telur yang diletakkan oleh setiap betina, ukuran telur, dan larva instar pertama yang baru menetas. Jumlah telur yang diletakkan. Betina Arab yang diberi makan urin bervariasi berdasarkan diet (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Gambar 4B). Betina yang diberi makan urin dan darah selama 24 jam meletakkan telur secara signifikan lebih banyak daripada betina yang diberi makan diet urin lainnya dan mirip dengan yang diberi makan sukrosa (Gambar 4B). Demikian pula, ukuran telur yang diletakkan oleh betina yang diberi makan urin bervariasi berdasarkan diet (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), dengan betina yang diberi makan urin dan sukrosa selama 24 jam meletakkan telur yang secara signifikan lebih besar daripada betina yang diberi makan air, sedangkan telur betina yang diberi makan urin selama 168 jam secara signifikan lebih kecil (Gambar 4C). Selain itu, diet urin secara signifikan mempengaruhi ukuran larva (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), dengan larva yang muncul dari telur yang diletakkan oleh betina yang diberi makan urin selama 24 dan 72 jam jauh lebih besar dibandingkan dengan larva yang diletakkan oleh betina yang diberi makan air dan betina yang diberi makan urin selama 168 jam (Gambar 4D).
Kinerja reproduksi nyamuk betina Anopheles arabinis yang diberi makan urin sapi dan urea. Nyamuk betina yang telah menghisap darah diberi makan diet yang terdiri dari urin sapi segar dan yang telah disimpan, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) selama 48 jam sebelum ditempatkan dalam bioassay dan mendapatkan substrat bertelur (A). Jumlah telur (B, E), ukuran telur (C, F) dan ukuran larva (D, G) dipengaruhi secara signifikan oleh diet yang diberikan (urin sapi: BD; urea: EG). Rata-rata untuk setiap parameter yang diukur menggunakan nama huruf yang berbeda berbeda secara signifikan satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05). Batang kesalahan mewakili kesalahan standar rata-rata.
Sebagai komponen nitrogen utama dalam urin, urea, ketika diberikan sebagai makanan kepada betina yang telah menghisap darah, secara signifikan memengaruhi parameter reproduksi dalam semua penelitian. Jumlah telur yang diletakkan oleh betina yang diberi makan urea, setelah menghisap darah, bergantung pada konsentrasi urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), betina yang diberi makan urea dengan konsentrasi antara 134 µM dan 1,34 mM meletakkan lebih banyak telur (Gambar 4E). Betina yang diberi makan urea dengan konsentrasi 134 µM atau lebih tinggi meletakkan telur yang lebih besar daripada betina yang diberi makan air (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Gambar 4F), dan ukuran larva, meskipun dipengaruhi oleh konsentrasi urea yang serupa pada induk (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) lebih bervariasi (Gambar 4G).
Daya tarik keseluruhan nyamuk penghisap darah terhadap ekstrak volatil ruang kepala urin sapi yang mencari inang. Nyamuk Arabiensis yang dinilai dalam olfaktometer tabung kaca (Gambar 5A) secara signifikan dipengaruhi oleh usia urin (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Gambar 5B). Analisis post hoc menunjukkan bahwa bau urin basi pada 24 jam menyebabkan tingkat daya tarik yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan semua perlakuan lainnya (72 jam: p = 0,0060, 168 jam: p = 0,012, pentana: p = 0,00070), kecuali untuk bau urin segar (p = 0,13; Gambar 5B). Meskipun daya tarik keseluruhan nyamuk penghisap darah terhadap bau urin tidak berbeda secara signifikan (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Gambar 5C), nyamuk betina ini ditemukan secara signifikan lebih tertarik pada ekstrak volatil ruang kepala dibandingkan dengan urin berusia 72 jam. dibandingkan dengan kelompok kontrol (p = 0,0066; Gambar 5C).
Respons perilaku terhadap bau urin sapi alami dan sintetis dalam pencarian inang dan nyamuk Anopheles arabianus penghisap darah. Skema olfaktometer tabung kaca (A). Daya tarik ekstrak volatil ruang kepala dari urin sapi segar dan yang telah lama disimpan terhadap inang (B) dan nyamuk penghisap darah (C). Temukan reaksi tentakel dari Lord An. Ekstrak ruang kepala yang diisolasi dari urin sapi segar (D), 24 jam (E), 72 jam (F), dan 168 jam (G) yang telah lama disimpan ditunjukkan. Jejak deteksi antena elektron (EAD) menunjukkan perubahan tegangan sebagai respons terhadap senyawa bioaktif di ruang kepala yang dielusi dari kromatograf gas dan dideteksi oleh detektor ionisasi nyala (FID). Skala batang mewakili amplitudo respons (mV) versus waktu retensi (s). Sifat dan laju pelepasan (µg h-1) dari senyawa aktif biologis ditunjukkan. Tanda bintang tunggal (*) menunjukkan respons amplitudo rendah yang konsisten. Tanda bintang ganda (**) menunjukkan respons yang tidak dapat direproduksi. Respons. Temukan inang (H) dan penghisap darah (I). An.arabiensis memiliki daya tarik yang berbeda terhadap campuran sintetis bau urin sapi segar dan tua. Proporsi rata-rata nyamuk yang tertarik pada nama huruf yang berbeda secara signifikan berbeda satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05). Batang kesalahan mewakili kesalahan standar skala.
Ikan betina Ann.arabiensis, 72 jam dan 120 jam setelah makan darah, selama pemijahan, tidak menunjukkan preferensi terhadap ekstrak volatil ruang kepala dari urin sapi segar dan yang telah lama disimpan dibandingkan dengan kontrol pentana (χ2 = 3,07, p > 0,05; File tambahan 1: Gambar S1).
Untuk Ann.arabiensis betina, analisis GC-EAD dan GC-MS mengidentifikasi delapan, enam, tiga, dan tiga senyawa bioaktif (Gambar 5D-G). Meskipun terdapat perbedaan jumlah senyawa yang memicu respons elektrofisiologis, sebagian besar senyawa ini terdapat dalam setiap ekstrak volatil ruang kepala yang dikumpulkan dari urin segar dan urin yang telah lama disimpan. Oleh karena itu, untuk setiap ekstrak, hanya senyawa yang menghasilkan respons fisiologis dari antena betina di atas ambang batas yang dimasukkan dalam analisis lebih lanjut.
Total laju pelepasan senyawa bioaktif volatil dalam pengumpulan ruang kepala meningkat dari 29 µg h-1 pada urin segar menjadi 242 µg h-1 pada urin yang telah disimpan selama 168 jam, terutama karena peningkatan p-kresol dan m-formaldehida serta fenol. Sebaliknya, laju pelepasan senyawa lain, seperti 2-sikloheksen-1-on dan dekanal, menurun seiring bertambahnya usia urin, yang berkorelasi dengan penurunan intensitas sinyal (kelimpahan) yang diamati dalam kromatogram (Gambar 5D-G panel kiri) dan respons fisiologis terhadap senyawa-senyawa ini (Gambar 5D-G panel kanan).
Secara keseluruhan, campuran sintetis memiliki rasio alami senyawa bioaktif yang serupa yang diidentifikasi dalam ekstrak volatil dari ruang kepala urin segar dan yang telah disimpan (Gambar 5D–G) dan tampaknya tidak menimbulkan daya tarik yang signifikan dalam pencarian inang (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Gambar 5H) atau nyamuk penghisap darah (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Gambar 5I). Namun, perbandingan berpasangan post hoc antar perlakuan menunjukkan bahwa nyamuk pencari inang secara signifikan tertarik pada campuran sintetis urin yang telah disimpan selama 24 jam dibandingkan dengan kontrol pentana (p = 0,0086; Gambar 5H).
Untuk menilai peran masing-masing komponen dalam campuran sintetis urin berusia 24 jam, enam campuran subtraktif dievaluasi terhadap campuran lengkap dalam uji tabung-Y, di mana senyawa individual dihilangkan. Untuk nyamuk pencari inang, pengurangan senyawa individual dari campuran lengkap memiliki efek signifikan pada respons perilaku (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; File Tambahan 1: Gambar S2A), semua campuran subtraktif lebih menarik daripada campuran lengkap. Sebaliknya, penghapusan senyawa individual dari campuran sintetis lengkap tidak memengaruhi respons perilaku nyamuk penghisap darah (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), kecuali dekanal, yang menghasilkan tingkat daya tarik yang lebih rendah dibandingkan dengan campuran lengkap (p = 0,022; File Tambahan 1: Gambar S2B).
Di sebuah desa endemik malaria di Ethiopia, kemanjuran campuran sintetis urin sapi 24 jam dalam menarik nyamuk di bawah kondisi lapangan dievaluasi selama sepuluh malam (Gambar 6A). Sebanyak 4.861 nyamuk ditangkap dan diidentifikasi, di mana 45,7% adalah Anthropus gambiae sl, 18,9% adalah Anopheles pharoensis dan 35,4% adalah Culex spp. (Lampiran 1: Tabel S1). Anopheles arabinis adalah satu-satunya anggota kompleks spesies An. Gambiae yang diidentifikasi melalui analisis PCR. Rata-rata, 320 nyamuk ditangkap per malam, di mana perangkap dengan umpan campuran sintetis menangkap lebih banyak nyamuk daripada perangkap berpasangan tanpa campuran (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Perangkap tanpa umpan dipasang pada masing-masing dari lima malam kontrol di awal, tengah, dan akhir. Percobaan. Jumlah nyamuk yang tertangkap di setiap pasang perangkap hampir sama, menunjukkan tidak ada bias antar rumah (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) dan tidak ada penurunan populasi selama periode penelitian. Dibandingkan dengan perangkap kontrol, jumlah nyamuk yang tertangkap di perangkap yang berisi campuran sintetis meningkat secara signifikan: mencari inang (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), baru saja menghisap darah (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) dan kehamilan (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Lampiran Tambahan 1: Tabel S1). Hal ini juga tercermin dalam jumlah total nyamuk yang tertangkap: mencari inang > penghisap darah > hamil > setengah hamil > jantan.
Evaluasi lapangan terhadap kemanjuran campuran bau urin sapi sintetis selama 24 jam. Uji coba lapangan dilakukan di Ethiopia bagian selatan-tengah (peta), dekat kota Maki (sisipan), menggunakan perangkap cahaya Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) (kanan) di rumah-rumah berpasangan, dengan desain bujur sangkar Latin (gambar udara) (A). Perangkap foto CDC yang diberi umpan bau sintetis menarik dan menangkap nyamuk betina Anopheles arabesques (B), tetapi tidak Anopheles farroes (C), dengan cara yang berbeda, efek yang bergantung pada keadaan fisiologis. Selain itu, perangkap ini menangkap jumlah nyamuk inang Culex yang meningkat secara signifikan. (D) Dibandingkan dengan kontrol. Batang di sebelah kiri mewakili indeks seleksi rata-rata nyamuk yang tertangkap dalam pasangan perangkap umpan bau (hijau) dan kontrol (terbuka) (N = 10), sedangkan batang di sebelah kanan mewakili indeks seleksi rata-rata dalam pasangan perangkap kontrol (terbuka; N = 5). Tanda bintang menunjukkan tingkat signifikansi statistik (*p = 0,01 dan ***p < 0,0001)
Ketiga spesies tersebut ditangkap secara berbeda dalam perangkap yang berisi campuran sintetis. Mencari inang (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), menghisap darah (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) dan kehamilan (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), A. arabiensis terperangkap dalam perangkap yang melepaskan campuran sintetis (Gambar 6B), sedangkan jumlah An. arabiensis tidak berbeda. Pharoensis ditemukan dalam keadaan fisiologis yang berbeda (Gambar 6C). Untuk Culex, hanya peningkatan signifikan jumlah nyamuk yang mencari inang yang ditemukan dalam perangkap yang diberi umpan campuran sintetis (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Gambar 6D), dibandingkan dengan perangkap kontrol.
Perangkap umpan inang yang ditempatkan di luar inang potensial antara tempat berkembang biak dan komunitas pedesaan di Ethiopia digunakan untuk menilai apakah nyamuk malaria menggunakan bau urin sapi sebagai isyarat habitat inang. Tanpa adanya isyarat inang, panas, dan dengan atau tanpa adanya bau urin sapi, tidak ada nyamuk yang tertangkap (Lampiran 1: Gambar S3). Namun, dengan adanya suhu tinggi dan bau urin sapi, nyamuk malaria betina tertarik dan tertangkap, meskipun dalam jumlah kecil, terlepas dari usia urin (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Lampiran 1: Gambar S3). Sebaliknya, kontrol air tidak menangkap nyamuk malaria pada suhu tinggi (Lampiran 1: Gambar S3).
Nyamuk malaria memperoleh dan mendistribusikan senyawa yang mengandung nitrogen melalui pemberian makan kompensasi pada urin sapi (yaitu, genangan air) untuk meningkatkan sifat-sifat siklus hidup, mirip dengan serangga lain [2, 4, 24, 25, 26]. Urin sapi merupakan sumber daya terbarukan yang mudah didapat dan terkait erat dengan tempat istirahat vektor malaria, seperti kandang sapi dan vegetasi tinggi di dekat rumah-rumah pedesaan dan tempat pemijahan. Nyamuk betina menemukan sumber daya ini melalui penciuman dan mampu mengatur penyerapan senyawa nitrogen dalam urin, termasuk urea, komponen nitrogen utama dalam urin [15, 16]. Tergantung pada keadaan fisiologis nyamuk betina, nutrisi dalam urin dialokasikan untuk meningkatkan aktivitas terbang dan kelangsungan hidup nyamuk betina yang mencari inang, serta kelangsungan hidup dan karakteristik reproduksi individu yang telah menghisap darah selama siklus gonadotropik pertama. Oleh karena itu, pencampuran urin memainkan peran nutrisi penting bagi vektor malaria yang tertutup seperti orang dewasa yang kekurangan gizi [8], karena memberikan kemampuan kepada nyamuk betina untuk memperoleh senyawa nitrogen penting dengan melakukan pemberian makan berisiko rendah. Temuan ini Hal ini memiliki konsekuensi epidemiologis yang signifikan, karena betina meningkatkan harapan hidup, aktivitas, dan hasil reproduksinya, yang semuanya memengaruhi kapasitas vektor. Selain itu, perilaku ini dapat menjadi target program pengelolaan vektor di masa mendatang.