Stjecanje i distribucija hranjivih tvari integrira traganje za hranom i značajke životne povijesti kukaca. Kako bi nadoknadili nedostatke specifičnih hranjivih tvari u različitim životnim fazama, insekti mogu dobiti te hranjive tvari dodatnom ishranom, na primjer, hraneći se izlučevinama kralježnjaka u procesu poznatom kao lokve. Čini se da je komarac Anopheles arabiani pothranjen i stoga su mu potrebne hranjive tvari za metabolizam i reprodukciju ion.Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti je li An.arabiensis agitacija na kravlji urin za stjecanje hranjivih tvari poboljšava karakteristike životne povijesti.
Uvjerite se da je sigurno.arabiensis je privukao miris svježeg, 24-satnog, 72-satnog i 168-satnog urina stare krave, a ženke koje su tražile domaćina i hranjene krvlju (48 sati nakon krvnog obroka) mjerene su olfaktometrom u Y-cijevi, a gravidne ženke procijenjene su za test mriještenja. Kombinirana kemijska i elektrofiziološka analiza zatim je korištena za identifikaciju bio aktivnih spojeva u kravljem urinu u sva četiri dobna razreda. Sintetičke mješavine bioaktivnih spojeva procijenjene su u Y-epruveti i terenskim ispitivanjima. Kako bi se istražio kravlji urin i njegov glavni spoj uree koji sadrži dušik kao potencijalna dodatna prehrana za vektore malarije, mjereni su parametri hranjenja i karakteristike životne povijesti. Procijenjen je udio ženki komaraca i količina apsorbiranog kravljeg urina i uree. Nakon hranjenja, ženke procijenjeno je preživljavanje, privezani let i reprodukcija.
Tražite krv domaćina i hranu. U laboratorijskim i terenskim studijama, Arape je privukao prirodni i sintetski miris svježeg i odležanog kravljeg urina. Trudne ženke bile su ravnodušne prema reakcijama kravljeg urina na mjestima mrijesta. Ženke koje traže domaćina i ženke koje sišu krv aktivno upijaju kravlji urin i ureu i raspoređuju te resurse prema životnoj povijesti kao funkciji fiziološkog stanja za let, preživljavanje val, odnosno reprodukcija.
Anopheles arabinis prikupljanje i distribucija kravljeg urina za poboljšane životne karakteristike. Dopunsko hranjenje kravljim urinom utječe izravno na kapacitet vektora povećanjem dnevnog preživljavanja i gustoće vektora, a neizravno mijenjanjem aktivnosti leta i stoga ga treba razmotriti u budućim modelima.
Prikupljanje i distribucija hranjivih tvari integrira traženje hrane i značajke životne povijesti kukaca [1,2,3]. Insekti su u stanju odabrati i nabaviti hranu i obavljati kompenzacijsko hranjenje na temelju dostupnosti hrane i potreba za hranjivim tvarima [1, 3]. Distribucija hranjivih tvari ovisi o životnom procesu i može dovesti do različitih zahtjeva za kvalitetom i količinom prehrane u različitim životnim fazama insekata [1, 2]. Nadoknaditi nedostatke u određenim hranjivim tvarima. Kukci mogu dobiti ove hranjive tvari dodatnom ishranom, kao što je blato, različiti izlučevine i izlučevine kralježnjaka i strvina, proces poznat kao lokve [2]. Iako su prvenstveno opisane različite vrste leptira i moljaca, pojila se također pojavljuju u drugim redovima kukaca, a privlačnost i hranjenje ovim vrstama resursa može imati značajne učinke na zdravlje i druge značajke životne dobi [2, 4, 5, 6 ] ,7]. Malarični komarac Anopheles gambiae sensu lato (sl) pojavljuje se kao 'pothranjena' odrasla osoba [8], tako da navodnjavanje može igrati važnu ulogu u karakteristikama njegove životne povijesti, ali ovo ponašanje je do sada bilo zanemareno. Korištenje agitacije kao sredstva povećanja unosa hranjivih tvari u ovom važnom prijenosniku zahtijeva pozornost jer može imati važne epidemiološke posljedice.
Unos dušika kod odraslih ženki Anopheles komaraca ograničen je zbog niskih kalorijskih rezervi koje se prenose iz stadija ličinke i neučinkovitog iskorištavanja krvnog obroka [9]. Ženke Ann.gambiae sl to obično kompenziraju dodavanjem dodatnih krvnih obroka [10, 11], čime više ljudi izlaže riziku od zaraze bolešću, a komarci izlažu većem riziku od grabežljivaca. Alternativno, mos quitoes mogu koristiti dopunsko hranjenje izlučevinama kralježnjaka za dobivanje dušikovih spojeva koji poboljšavaju prilagodbu i manevriranje leta, kao što pokazuju drugi kukci [2]. U tom smislu, zanimljiva je snažna i jasna privlačnost jedne od srodnih vrsta unutar An. Gambijski kompleks sl vrsta, Anopheles arabinis, svježi i stari kravlji urin [12,13,14], zanimljiv je. Anopheles arabinis je oportunistički u preferencijama domaćina i poznato je da se povezuje sa stokom i hrani se njome. Kravlji urin je izvor bogat dušikovim spojevima, pri čemu urea čini 50-95% ukupnog dušika u svježem urinu [15, 16]. Kako kravlji urin stari, mikroorganizmi koriste te resurse za smanjenje kompleksnosti dušikovih spojeva unutar 24 sata [15]. S brzim porastom amonijaka, povezanog s smanjenjem organskog dušika, bujaju alkalofilni mikroorganizmi (od kojih mnogi proizvode spojeve toksične za komarce) [15], što može biti da ženke Ann.arabiensis preferirano privlači urin star 24 sata ili manje [13, 14].
U ovoj studiji traženi su domaćini i Ans hranjeni krvlju. Tijekom svog prvog ciklusa gonadotropina, arabiensis je procijenjen na stjecanje dušikovih spojeva, uključujući ureu, miješanjem urina. Zatim je proveden niz eksperimenata kako bi se procijenilo kako ženke komaraca raspoređuju ovaj potencijalni izvor hranjivih tvari za poboljšano preživljavanje, reprodukciju i daljnje traženje hrane. Konačno, miris svježeg i komarca procijenjen je kravlji urin kako bi se utvrdilo pružaju li pouzdane tragove za domaćina i krvlju hranjene An. U svojoj potrazi za ovim potencijalnim nutritivnim izvorom, arabiensis je otkrio kemijske korelacije iza uočene različite privlačnosti. Sintetičke mirisne mješavine hlapljivih organskih spojeva (VOC) identificirane u 24-satnom urinu dalje su procijenjene u terenskim uvjetima, proširujući rezultate dobivene u laboratorijskim uvjetima i pokazujući učinak goveđeg urina iz ili na različitim fiziološkim stanjima.Privlačnost komaraca. Dobiveni rezultati potvrđuju da An.arabiensis preuzima i distribuira dušične spojeve pronađene u urinu kralješnjaka kako bi utjecao na značajke životne povijesti. O ovim se rezultatima raspravlja u kontekstu potencijalnih epidemioloških posljedica i načina na koji se mogu koristiti za nadzor i kontrolu vektora.
Anopheles arabicans (soj Dongola) održavani su na 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH i ciklusu svjetlo:tama 12:12 h. Ličinke su uzgajane u plastičnim posudama (20 cm × 18 cm × 7 cm) napunjenim destiliranom vodom i hranjene ribljom hranom Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Kukuljice su sakupljene u čašicu od 30 ml s (Nolato Hertila, Åstorp, SE) i zatim prebačeni u kaveze Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajvan) kako bi se omogućilo pojavljivanje odraslih. Odraslim jedinkama davana je 10% otopina saharoze ad libitum do 4 dana nakon nicanja (dpe), kada je ženkama koje su tražile domaćina ponuđena prehrana neposredno prije eksperimenta ili su izgladnjele preko noći s destiliranom vodom prije eksperimenta, kao što je opisano u nastavku. Ženke koje su korištene za pokuse s letećim cijevima izgladnjivane su samo 4-6 sati s vodom ad libitum. Kako bi se komarci koji sišu krv pripremili za naredne biološke testove, 4 dpe ženke su opskrbljene defibrotičnom ovčjom krvlju (Håtunalab, Bro, SE) korištenjem membranskog sustava hranjenja (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Potpuno zagušene ženke su zatim prebačene u pojedinačne kavezima i izravno su im davali ishranu, kao što je dolje opisano, ili 10% saharoze ad libitum 3 dana prije dolje opisanih eksperimenata. Potonje ženke korištene su za biološke testove u letećim cijevima i prebačene u laboratorij, a zatim su imale destiliranu vodu ad libitum 4-6 sati prije eksperimenta.
Ispitivanja hranjenja korištena su za kvantificiranje urina i potrošnje uree kod odraslih An.Arap ženki. Ženke koje su tražile domaćina i koje su bile hranjene krvlju dobile su dijetu koja je sadržavala 1% razrijeđenog svježeg i starog kravljeg urina, različite koncentracije uree i dvije kontrole (10% saharoze i vode) tijekom 48 sati. Osim toga, boja za hranu (1 mg ml-1 ksilen cijanid FF; CAS 2650-17- 1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) dodan je u ishranu i isporučen u matrici 4 × 4 u mikrocentrifugalnim epruvetama od 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, SAD; Slika 1A) Napunite do ruba (~300 µl). Kako biste izbjegli kompeticiju između komaraca i potencijalne učinke boje boje, stavite 10 komaraca u veliku Petrijevu zdjelicu (12 cm u promjeru i 6 cm u visinu; Semadeni, Ostermundigen, CH; Slika 1A) u potpunom mraku na 25 ± 2 cm °C i 65 ± 5% relativne vlažnosti. Ovi su eksperimenti ponovljeni 5 do 10 puta. Nakon izlaganja prehrani, komarci su stavljeni na -20 °C do daljnje analize.
Potražite goveđi urin i ureu koje su apsorbirali domaćin i ženka Anopheles arabianus koja siše krv. U pokusu hranjenja (A), ženke komaraca su dobile hranu koja se sastojala od svježeg i odležanog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O). Ženke koje su tražile domaćina (B) i ženke hranjene krvlju (C) apsorbirale su više saharoze nego bilo koja druga testirana prehrana. ženke koje traže apsorbiraju 72-satni kravlji urin manje od 168-satnog kravljeg urina (B). Srednji ukupni sadržaj dušika (± standardna devijacija) u urinu predstavljen je u umetku. Ženke koje traže domaćina (D, F) i ženke koje sišu krv (E, G) uzimaju ureu na način ovisan o dozi. Srednji inhalirani volumeni (D, E) s različitim nazivima slova značajno su se razlikovali jedni od drugih (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyeva post hoc analiza; p < 0,05). Stupci pogrešaka predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti (BE). Ravna isprekidana linija predstavlja logaritamsku linearnu regresijsku liniju (F, G)
Za oslobađanje apsorbirane hrane, komarci su pojedinačno stavljeni u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 ml koje su sadržavale 230 µl destilirane vode, a tkivo je razbijeno jednokratnim tučkom i bežičnim motorom (VWR International, Lund, SE), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 10 kg/min tijekom 10 minuta. Supernatant (200 µl) je prebačen u mikroploču s 96 jažica (Sigma -Aldrich) i apsorbancija (λ620) određena je korištenjem čitača mikropločica na bazi spektrofotometra (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativno, komarci su samljeveni u 1 ml destilirane vode, od čega je 900 µl prebačeno u kivetu za spektrofotometrijsku analizu (λ 620 nm; UV 1800, Shimad zu, Kista, SE). Za kvantificiranje unosa hranom, standardna krivulja je pripremljena serijskim razrjeđivanjem da bi se dobilo 0,2 µl do 2,4 µl 1 mg ml-1 ksilen cijanida. Zatim je korištena optička gustoća poznatih koncentracija boje za određivanje količine hrane koju je svaki komarac progutao.
Podaci o volumenu analizirani su korištenjem jednosmjerne analize varijance (ANOVA) praćene Tukeyjevim post hoc parnim usporedbama (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD, 1989. – 2007.). Analize linearne regresije opisale su unos uree ovisan o koncentraciji i uspoređivale odgovore između komaraca koji traže domaćina i komaraca koji sišu krv (GraphPad Prism v8 .0.0 za Mac, softver GraphPad, San Diego, CA, SAD).
Približno 20 µl uzoraka urina iz svake dobne skupine vezano je na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i inkapsulirano u limene kapsule (8 mm × 5 mm). Kapsule su umetnute u komoru za izgaranje CHNS/O analizatora (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) za određivanje sadržaja dušika u svježem i starom urinu u skladu s protokolom proizvođača. Ukupni dušik (g N l-1) kvantificiran je na temelju poznate koncentracije uree koja se koristi kao standard.
Kako bi se procijenio učinak prehrane na preživljavanje ženki koje traže domaćina i koje sišu krv, komarci su pojedinačno stavljeni u velike Petrijeve zdjelice (12 cm u promjeru i 6 cm u visinu; Semadeni) s rupom prekrivenom mrežicom na poklopcu (3 cm u promjeru) s Za ventilaciju i opskrbu hranom. Dijete su davane neposredno nakon 4 dpe i uključivale su 1% razrijeđenog svježeg i starog kravljeg urina, četiri koncentracije uree i dvije kontrole, 10% saharoze i vode. Svaka dijeta pipetirana je na zubarski tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) umetnut u štrcaljku od 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), klip je uklonjen i stavljen na vrh petrijeve zdjelice (slika 1). 1A). Promijenite svoju prehranu svaki dan. Održavajte laboratorij kako je gore opisano. Preživjeli komarci brojeni su dva puta dnevno, dok su mrtvi komarci odbačeni sve dok posljednji komarac nije uginuo (n = 40 po tretmanu). Preživljavanje komaraca hranjenih različitim dijetama statistički je analizirano korištenjem Kaplan-Meyerovih krivulja preživljavanja i log-rank testova za usporedbu distribucije preživljavanja između dijeta (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Prilagođeni mlin za leteće komarce temeljen na Attisano et al. [17], izrađen od 5 mm debelih prozirnih akrilnih ploča (10 cm širine x 10 cm dužine x 10 cm visine) bez prednje i stražnje ploče (Sl. 3: gore). Okretni sklop s okomitom cijevi izrađenom od stupca za plinsku kromatografiju (0,25 mm id; 7,5 cm L) s krajevima zalijepljenim na iglu za insekte obješenu između para neodimijskih magneta međusobno udaljenih 9 cm. Horizontalna cijev izrađena od istog materijala (6,5 cm L) prepolovila je okomitu cijev da bi oblikovala privezanu ruku i ruku koja je nosila mali komad aluminijske folije kao svjetlosni signal.
Ženke koje su gladovale 24 sata dobile su gornju dijetu 30 minuta prije obuzdavanja. Potpuno hranjene ženke komaraca zatim su pojedinačno anestezirane na ledu 2-3 minute i pričvršćene na igle za kukce pomoću pčelinjeg voska (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) i zatim vezane za krakove vodoravnih cijevi. Leteći mlin. Zabilježeni su okretaji po letu prilagođenim uređajem za bilježenje podataka, zatim pohranjenim i prikazanim pomoću softvera PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Mlin za letenje postavljen je u prostoriju s reguliranom klimom (12 h:12 h, svjetlo: tamno, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Kako bi se vizualizirao obrazac aktivnosti leta, ukupna prijeđena udaljenost (m) i ukupan broj uzastopnih aktivnosti leta izračunati su po satu tijekom razdoblja od 24 sata. Osim toga, prosječne udaljenosti koje su preletjele pojedinačne ženke uspoređivane su kroz tretmane i analizirane pomoću jednosmjerne ANOVA-e i Tukeyeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdje se prosječna udaljenost smatrala ovisnom varijablom, dok je tretman neovisnim faktorom. dodatno se izračunava prosječan broj rundi u koracima od 10 minuta.
Kako bi se procijenio učinak prehrane na reproduktivnu izvedbu An.arabiensis, šest ženki (4 dpe) prebačeno je izravno u kaveze Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) nakon prikupljanja krvi, a zatim im je dana eksperimentalna prehrana tijekom 48 sati, kao što je gore opisano. Dijete su zatim uklonjene i trećeg dana na 48 sati dane su posude za mrijest (30 ml; Nolato Hertila) napunjene s 20 ml destilirane vode, mijenjajući se svakih 48 sati. 24 sata. Ponovite svaki režim ishrane 20-50 puta. Jaja su izbrojana i zabilježena za svaki pokusni kavez. Poduzorci jaja korišteni su za procjenu prosječne varijacije veličine i duljine pojedinačnih jaja (n ≥ 200 po obroku) pomoću mikroskopa Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) opremljenog Leica kamerom (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Preostala su jaja držana u prostoriji s kontroliranom klimom u standardnim uvjetima uzgoja 24 sata, a poduzorak nedavno izniklih ličinki 1. stupnja (n ≥ 200 po obroku) mjeren je, kao što je gore opisano. Broj jaja i veličina jaja i ličinki uspoređeni su između tretmana i korištenjem jednosmjerne ANOVA-e i Tukeyeve post hoc analize (JMP Pro, v. 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Hlapljive tvari iz svježeg (1 sat nakon uzorkovanja), urina starog 24 sata, 72 sata i 168 sati prikupljene su iz uzoraka prikupljenih od goveda Zebu, rase Arsi. Radi praktičnosti, uzorci urina prikupljeni su rano ujutro dok su krave još bile u staji. Uzorci urina prikupljeni su od 10 pojedinaca i 100-200 ml svakog uzorka prebačeno je u pojedinačne poliamidne vrećice za pečenje ( Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) u poliamidu od 3 l s poklopcem u plastičnim bačvama od vinil klorida. Isparljive tvari iz svakog uzorka goveđeg urina sakupljene su izravno (svježe) ili nakon sazrijevanja na sobnoj temperaturi 24 h, 72 h i 168 h, tj. svaki je uzorak urina bio reprezentativan za svaku dobnu skupinu.
Za skupljanje hlapljivih tvari iz gornjeg prostora korišten je sustav zatvorene petlje za cirkuliranje struje plina filtriranog aktivnim ugljenom (100 ml min-1) kroz poliamidnu vrećicu do adsorpcijske kolone tijekom 2,5 h pomoću vakuumske pumpe s dijafragmom (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Kao kontrola, prikupljanje iz gornjeg prostora provedeno je iz prazne poliamidne vrećice. Adsorpcijska kolona bila je izrađena od teflonske cijevi ( 5,5 cm x 3 mm id) koji sadrži 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) između čepova od staklene vune. Prije upotrebe, kolona je isprana s 1 ml redestiliranog n-heksana (Merck, Darmstadt, DE) i 1 ml pentana (99,0% čisto otapalo GC stupnja, Sigma Aldrich). Adsor hlapljive tvari u sloju su eluirane s 400 μl pentana. Kolekcije iz prostora iznad glave su skupljene i zatim pohranjene na -20°C do upotrebe za daljnju analizu.
Reakcije ponašanja hlapljivih ekstrakata An.Headspace koji traže domaćina i koji jedu krv prikupljenih iz svježeg urina starog 24 h, 72 h i 168 h analizirani su na hlapljive ekstrakte komaraca vrste Arabidopsis pomoću olfaktometra s ravnom staklenom cijevi [18]. Eksperimenti su provedeni tijekom ZT 13-15, vrhunca An-ovog razdoblja aktivnosti traženja doma. rab [19]. Olfaktometar od staklene cijevi (80 cm × 9,5 cm unutarnjeg promjera) osvijetljen je s 3 ± 1 lx crvenog svjetla odozgo. Protok zraka filtriran ugljenom i ovlažen (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relativna vlažnost) prošao je biotest na 30 cm s-1. Zrak prolazi kroz niz mrežastih sita od nehrđajućeg čelika, stvarajući laminarno protok i ujednačenu strukturu oblaka. Dozator zubnog tampona (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), obješen na zavojnicu od 5 cm na kraju olfaktometra usmjerenom prema vjetru, sa stimulatorom koji se mijenja svakih 5 minuta. Za analizu je korišteno 10 μl svakog ekstrakta prostora glave, razrijeđenog 1:10, kao stimulus. Jednaka količina pentana korištena je kao kontrola. Individualno traženje domaćina ili krv- komarci koji sisaju stavljeni su u pojedinačne kaveze za ispuštanje 2-3 sata prije početka pokusa. Kavez za ispuštanje postavljen je na stranu olfaktometra niz vjetar i komarcima je ostavljeno da se prilagode 1 minutu, a zatim je leptir ventil kaveza otvoren za ispuštanje. Privlačenje tretmanu ili kontroli analizirano je kao udio komaraca koji su došli u kontakt s izvorom unutar 5 minuta od puštanja. le ekstrakt i kontrola replicirani su najmanje 30 puta, a kako bi se izbjegli učinci bilo kojeg dana, isti broj tretmana i kontrola testiran je svakog eksperimentalnog dana. Tražite odgovore od domaćina i krvlju hranjenih Ans.Arabic naspram headspace skupova analizirani su korištenjem nominalne logističke regresije praćene usporedbama parova za neparne omjere (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Anin odgovor na mrijest. Ekstrakti iz svježeg i starog kravljeg urina analizirani su u kavezima Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastične čaše (30 mL; Nolato Hertila) napunjene s 20 mL destilirane vode davale su supstrat za mrijest i postavljene su u suprotne kutove kaveza, udaljene 24 cm. 10 μl svakog ekstrakta glavnog prostora u razrjeđenju 1:10. Jednaka količina pentana upotrijebljena je za podešavanje kontrolne čaše. Tretman i kontrolne čaše zamijenjene su između svakog eksperimenta kako bi se kontrolirali učinci položaja. Deset ženki hranjenih krvlju pušteno je u pokusne kaveze na ZT 9-11, a jaja u čašama su brojana 24 sata kasnije. Formula za izračunavanje indeksa mrijesta je: (broj položenih jaja u čašici za tretiranje – broj jaja položenih u kontrolnu čašicu)/(ukupan broj položenih jaja). Svaki tretman je ponovljen 8 puta.
Analiza plinskom kromatografijom i detekcijom uzorka elektronske antene (GC-EAD) ženke An.arabiensis provedena je kao što je prethodno opisano [20]. Ukratko, svježi hlapljivi ekstrakti iz glavnog prostora odvojeni su korištenjem Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, SAD) opremljenog HP-5 kolonom (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm debljine filma, Agilent Tehnologije).i starenje urina. Vodik je korišten kao mobilna faza s prosječnom linearnom brzinom protoka od 45 cm s-1. Svaki uzorak (2 μl) ubrizgan je 30 sekundi u načinu rada bez cijepanja s ulaznom temperaturom od 225 °C. Temperatura GC pećnice programirana je od 35 °C (3 minute zadržavanja) do 300 °C (10 minuta zadržavanja) pri 10 °C min-1. U GC efluentu razdjelniku, dodano je 4 psi dušika i podijeljeno 1:1 u Gerstel 3D/2 niskom mrtvom volumenu križanja (Gerstel, Mülheim, DE) između detektora plamene ionizacije i EAD-a. Kapilara GC efluenta za EAD je propuštena kroz Gerstel ODP-2 prijenosnu liniju, koja prati temperaturu GC pećnice plus 5 °C, u staklenu cijev (10 cm × 8 mm), gdje je pomiješana s ugljikom -filtrirani, ovlaženi zrak (1,5 l min−1). Antena je postavljena 0,5 cm od izlaza cijevi. Svaki pojedini komarac bio je jedan replikat, a za komarce koji traže domaćina, najmanje tri replikata su obavljena na uzorcima urina svake dobi.
Identifikacija bioaktivnih spojeva u kolekcijama svježeg i odležanog goveđeg urina u headspaceu korištenjem kombiniranog GC i masenog spektrometra (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) za izazivanje antenskih odgovora u GC-EAD analizi, radeći u načinu ionizacije udarom elektrona pri 70 eV. GC je opremljen HP-5MS UI-obloženom stopljenom silicijevom kapilarnom kolonom ( 60 m × 0,25 mm unutarnji promjer, 0,25 μm debljina filma) koristeći helij kao mobilnu fazu s prosječnom linearnom brzinom protoka od 35 cm s-1. Uzorak od 2 μl ubrizgan je korištenjem istih postavki injektora i temperature pećnice kao za GC-EAD analizu. Spojevi su identificirani na temelju njihovog vremena zadržavanja (Kovátov indeks) i spektra mase u usporedbi s prilagođenom bibliotekom i bibliotekom NIST14 (Agi lent). Identificirani spojevi potvrđeni su ubrizgavanjem autentičnih standarda (Dodatna datoteka 1: Tablica S2). Za kvantifikaciju je ubrizgan heptil acetat (10 ng, 99,8% kemijske čistoće, Aldrich) kao vanjski standard.
Procjena učinkovitosti sintetičke mješavine mirisa koja se sastoji od bioaktivnih spojeva identificiranih u svježem i starom urinu za privlačenje Ans.arabiensis koji traže domaćina i krvopije, koristeći isti olfaktometar i protokol kao gore. Sintetske mješavine oponašale su sastav i udjele spojeva u miješanim hlapljivim ekstraktima svježeg, 24-satnog, 48-satnog, 72-satnog i 1 68-satni urin (Slika 5D-G; Dodatna datoteka 1: Tablica S2). Za analizu upotrijebite 10 μl 1:100 razrijeđene potpuno sintetičke smjese, s ukupnom brzinom otpuštanja u rasponu od približno 140-2400 ng h-1, za procjenu privlačnosti domaćinu i komarcima koji sišu krv. Nakon toga, test se provodi na potpunim smjesama, u kojima subtraktivne smjese pojedinačnih spojeva kompletne smjese se uklanjaju. Tražite odgovore od domaćina i krvi hranjenih Ans.Arap u odnosu na sintetičke i subtraktivne smjese analizirane su korištenjem nominalne logističke regresije praćene usporedbama parova za neparne omjere (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Kako bi se procijenilo može li kravlji urin poslužiti kao znak staništa za malarične komarce, svježi i stari kravlji urin, sakupljen kako je gore opisano, i voda stavljeni su u mrežaste kante od 3 l (100 ml) i postavljeni u zamke za mamce domaćina.(BG-HDT verzija; BioGents, Regensburg, DE). Deset zamki postavljenih 50 m jedna od druge na pašnjaku, 400 m od seoske zajednice (Silay, Etiopija, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i bez stoke, na stalnim uzgajalištima i selima. Pet zamki je grijano da simulira prisutnost domaćina, dok je pet tra ps su ostavljeni nezagrijani. Svako mjesto tretmana se izmjenjuje svake noći ukupno pet noći. Broj komaraca uhvaćenih u zamke s mamcima urinom različite starosti uspoređen je pomoću logističke regresije s beta binomnom distribucijom (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
U selu endemičnom malarijom u blizini grada Makija, regija Oromia, Etiopija (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Slika 6A). Studija je provedena između sredine kolovoza i sredine rujna prije godišnjeg raspršivanja rezidua u zatvorenom prostoru, uz dugu kišnu sezonu. Pet pari kuća (20-50 m udaljenih jedna od druge ) smještene na rubu sela odabrane su za istraživanje (Sl. 6A). Kriteriji korišteni za odabir kuća bili su: životinje nisu dopuštene u kući, nije dopušteno kuhanje u zatvorenom prostoru (vađenje drva za ogrjev ili ugljen) (barem tijekom probnog razdoblja) i kuće s najviše dva stanovnika, spavanje u neinsekticidima.Prema Odboru za preispitivanje institucionalnog istraživačkog etike (IRB/022/2016), prema fakultetu prirodnih znanosti (CNS-IRB), prema Mosquito Net. Razina Ward ('Kebele'). Eksperimentalni dizajn slijedio je 2 × 2 latinski kvadratni dizajn, u kojem su sintetičke smjese i kontrole dodijeljene uparenim kućama prve noći i zamijenjene između kuća u sljedećoj eksperimentalnoj noći. Ovaj je proces ponovljen u odnosu na to da su se u sredini, a provodili su se u izbora, a gradači, a CDC je proveo, a promatranje je u poglavljem, a na odabranim kućama, a na odabranim kućama, a na odabranim kućama, a na odabranim kućama, a na odabranim kućama, u iznimkama, propuštenim je konzumiranjem, u iznimkama, u iznimci, u CDC -u. .
Sintetička smjesa koja je sadržavala šest bioaktivnih spojeva otopljena je u heptanu (97,0% otapalo GC stupnja, Sigma Aldrich) i ispuštena pri 140 ng h-1 pomoću dozatora od pamučnog fitilja [20]. Dozator od fitilja omogućio je otpuštanje svih spojeva u konstantnim omjerima tijekom 12-satnog eksperimenta. Heptan je korišten kao kontrola. Bočica je obješena pored ulazne točke Centres for Dise ase Control and Prevention (CDC) svjetlosna zamka (John W. Hock Company, Gainesville, FL, SAD; slika 6A). Zamke su bile obješene 0,8 – 1 m iznad tla, u blizini podnožja kreveta, a volonter je spavao ispod netretirane mreže protiv komaraca i djelovao između 18:00 i 06:30. Komarci uhvaćeni prema spolu i fiziološkom statusu (nehranjeni) , hranjene, polu-gravidne i gravidne [21] naknadno su pregledane analizom lančane reakcije polimerazom (PCR) kako bi se identificirale vrste morfološki identificirane kao A. gambiae sl. Članovi kompleksa [23]. U terenskoj studiji, hvatanje parnih kućica u zamke analizirano je pomoću modela nominalne logističke prilagodbe, gdje je privlačnost bila zavisna varijabla, a tretman (sintetička smjesa naspram kontrole) bio je fiksni učinak (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.).Ovdje prikazujemo χ2 i p-vrijednosti iz testa omjera vjerojatnosti.
Procijenite je li sigurno.arabiensis je uspio dobiti urin, svoj glavni izvor dušika, ureu, izravnim hranjenjem unutar 48 h od primjene tijekom 4 dana nakon (dpe) ispitivanja hranjenja ženki koje su tražile domaćina i hranjene krvlju (Slika 1A). I ​​ženke koje su tražile domaćina i ženke koje su sisale krv apsorbirale su značajno više saharoze od bilo koje druge hrane ili vode (F(5,426) = 20,15, p < 0). 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, redom; Slika 1B,C). Nadalje, ženke koje su tražile domaćina jele su manje u urinu nakon 72 sata u usporedbi s urinom nakon 168 sati (Slika 1B). Kada im je ponuđena prehrana koja je sadržavala ureu, ženke koje su tražile domaćina apsorbirale su značajno veću količinu uree od 2,69 mM u usporedbi sa svim ostalima. koncentracije i vode, dok se ne razlikuje od 10% saharoze (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; slika 1D). To je bilo u suprotnosti s odgovorom ženki hranjenih krvlju, koje su tipično apsorbirale značajno više hrane koja sadrži ureu nego vode, iako značajno manje od 10% saharoze (F(10,557) = 78,35, p < 0,00). 01; Slika 1).1E). Nadalje, kada se uspoređuju dva fiziološka stanja, flebotomizirane ženke apsorbirale su više uree nego ženke koje traže domaćina pri najnižim koncentracijama, a te su ženke apsorbirale slične količine uree pri višim koncentracijama (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001;Slika 1F, G). Dok se činilo da unos iz prehrane koja sadrži ureu ima optimalne vrijednosti (Slika 1D,E), ženke u oba fiziološka stanja mogle su modulirati količinu apsorbirane uree u cijelom rasponu koncentracija uree na log-linearni način (Slika 1F,G).). Slično tome, čini se da komarci kontroliraju svoj unos dušika reguliranjem količine apsorbiranog urina, jer se količina dušika u urinu odražava na apsorbiranu količinu (Slika 1B, C i B umetci).
Kako bi se procijenili učinci urina i uree na preživljavanje komaraca koji traže domaćina i komarca koji siše krv, ženke su hranjene urinom sve četiri dobi (svježi, 24 h, 72 h i 168 h nakon taloženja) i nizom koncentracija uree, kao i destilirana voda i 10 % saharoza koji su služili kao kontrola (Slika 2A). Ova analiza preživljavanja pokazala je da je prehrana imala značajan učinak na ukupni učinak. preživljavanje u ženki koje traže domaćina (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; slika 2B, C) i ženki hranjenih krvlju (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea : χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Slika 2D,E). U svim eksperimentima, ženke hranjene urinom, ureom i vodom imale su značajno niže stope preživljavanja u usporedbi sa ženkama hranjenim saharozom (Slika 2B-E). Ženke koje su tražile domaćina hranjene svježim i ustajalim urinom pokazale su različite stope preživljavanja, s onima hranjenim 72-h ustajalim urinom. urin (p = 0,016) s najnižom vjerojatnošću preživljavanja (Slika 2B). Nadalje, ženke koje su tražile domaćina hranjene 135 mM ureje preživjele su dulje od kontrola u vodi (p <0,04) (Slika2C). U usporedbi s vodom, žene hranjene svježim urinom i 24-satnim urinom preživjele su dulje (p = 0,001 i p = 0,012, respektivno; slika 2D), dok su žene hranjene 72-satnim urinom preživjele dulje od onih koje su hranjene ženskim kratkim svježim urinom i 24-satnim urinom (p < 0,0001 i p = 0,013, respektivno; slika 2D). Kad su hranjene 135 mM ureje, ženke hranjene krvlju preživjele su dulje od svih ostalih koncentracija uree i vode (p < 0,013; Slika 2E).
Preživljavanje domaćina i ženke Anopheles arabinis koja siše krv hraneći se kravljim urinom i ureom. U biološkom ispitivanju (A), ženke komaraca dobile su hranu koja se sastojala od svježeg i starog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O). Preživljavanje komaraca koji traže domaćina (B, C) i komarca koji sišu krv (D, E) zabilježeno je svakih 12 sati dok sve ženke hranjene urinom (B, D) i ureom (C, E), te kontrole, saharozom i vodom, ne budu mrtve
Ukupna udaljenost i broj krugova određeni u testu letjelice tijekom 24-satnog razdoblja razlikovali su se između komaraca koji traže domaćina i onih koji sišu krv, koji su pokazali manju aktivnost leta (Slika 3). Komarci koji traže domaćina koji su davali svježi i stari urin ili saharozu i vodu pokazali su različite obrasce leta (Slika 3), pri čemu su ženke koje su se hranile svježim urinom bile aktivnije u zoru, dok su one hranjene 24- i Komarci stari 168 sati koji su se hranili urinom pokazali su različite obrasce leta i prvenstveno su bili dnevni. Ženke komaraca koje su davale saharozu ili 72-satni urin pokazale su aktivnost tijekom cijelog 24-satnog razdoblja, dok su ženke koje su davale vodu bile aktivnije tijekom srednjeg razdoblja. Komarci hranjeni saharozom pokazali su najviše razine aktivnosti kasno noću i rano ujutro, dok su oni koji su jeli Urin star 72 sata doživio je stalan pad aktivnosti tijekom 24 sata (Slika 3).
Uspješnost leta ženke Anopheles arabinis koja sisa krv u potrazi za lovcem i hrani se kravljim urinom i ureom. U testu letenja, ženke komaraca hranjene svježim i starim kravljim urinom, različitim koncentracijama uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O) bile su privezane za horizontalne, slobodno rotirajuće ruke (gore). Za ženke koje traže domaćina (lijevo) i ženke koje sisaju krv (desno). s, zabilježena je ukupna udaljenost i broj letova po satu za svaku dijetu tijekom razdoblja od 24 sata (tamno: sivo; svijetlo: bijelo). Prosječna udaljenost i prosječan broj napada prikazani su desno od grafikona cirkadijalne aktivnosti. Trake pogrešaka predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti. Statistička analiza vidi tekst
Općenito, ukupna letna aktivnost ženki koje traže domaćina slijedila je obrazac sličan onom udaljenosti leta tijekom 24-satnog razdoblja. Na srednju udaljenost leta značajno je utjecala prehrana (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a ženke koje su tražile domaćina unijele su 72 sata urina letjele znatno duže udaljenosti u usporedbi sa svim drugim načinima prehrane (p < 0,0001) i hranjene saharozom komarci su letjeli dulje od komaraca hranjenih svježim (p = 0,022) i 24 sata starim urinom (p = 0,022). Za razliku od obrasca aktivnosti leta opisanog prehranom urinom, ženke koje su tražile domaćine hranjene ureom pokazale su postojanu aktivnost leta tijekom 24 sata, s vrhuncem tijekom druge polovice mračne faze (Slika 3). Iako su obrasci aktivnosti bili slični, domaćin - ženke koje su tražile domaćine hranjene ureom značajno su povećale srednju udaljenost leta ovisno o apsorbiranoj koncentraciji (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Ženke koje su tražile domaćina hranjene bilo kojom koncentracijom ureje letjele su dulje od ženki hranjenih vodom ili saharozom (p < 0,03).
Ukupna aktivnost leta komaraca koji sišu krv bila je stabilna i održavala se tijekom 24 sata na svim načinima ishrane, s povećanom aktivnošću urina tijekom druge polovice mračnog razdoblja za ženke hranjene vodom, kao i za ženke hranjene svježom i stare 24 sata (slika 3). Dok je prehrana urinom značajno utjecala na srednju udaljenost leta kod ženki hranjenih krvlju (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), urea dijeta nije (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) .s drugim urinom i kontrolnom dijetom (svježi, p = 0,0091; 72 sata, p = 0,0022; 168 sati, p = 0,001; saharoza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Učinci hranjenja urinom i ureom na reproduktivne parametre procijenjeni su u biološkim testovima polaganja jaja (Slika 4A) i ispitivani su prema broju jaja koje je položila svaka ženka, veličini jaja i novoizleženim ličinkama prvog stadija. Broj položenih jaja. Arapske ženke hranjene urinom varirale su prema prehrani (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fi g. 4B). Ženke hranjene 24-satnim urinom, krvnim obrokom snijele su značajno više jaja nego ženke hranjene drugim urinom i bile su slične onima koje su hranjene saharozom (Slika 4B). Isto tako, veličina jaja koje su položile ženke hranjene urinom varirala je ovisno o prehrani (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), s 24-satnim urinom i ženke hranjene saharozom polažu znatno veća jaja od ženki hranjenih vodom, dok su jaja ženki hranjenih 168 sati urina bila znatno manja (Slika 4C). Osim toga, prehrana urinom značajno je utjecala na veličinu ličinki (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), sa značajno većim ličinkama koje izlaze iz jaja položenih od 24- i 7 2 sata stare ženke hranjene urinom nego iz jaja položenih iz jaja ličinke.Ženke hranjene vodom i 168 sati hranjene urinom (Slika 4D).
Reproduktivni učinak ženki vrste Anopheles arabinis koje se hrane kravljim urinom i ureom. Ženke komaraca hranjene krvlju hranjene su hranom koja se sastojala od svježeg i starog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O) 48 sati prije stavljanja u biološke testove i dobivanja supstrata za polaganje jaja 48 sati (A). Broj jaja (B, E), veličina jaja (C, F). ) i veličina ličinki (D, G) bili su značajno pod utjecajem pružene prehrane (kravlji urin: BD; urea: EG). Srednje vrijednosti za svaki parametar izmjeren korištenjem različitih naziva slova značajno su se razlikovale jedna od druge (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyeve post hoc analize; p < 0,05). Trake pogrešaka predstavljaju standardnu ​​pogrešku srednje vrijednosti
Kao glavna dušična komponenta urina, urea, kada je davana kao hrana ženkama hranjenim krvlju, značajno je utjecala na reproduktivne parametre u svim studijama. Broj jaja koje su položile ženke hranjene ureom, nakon krvnog obroka, ovisno o koncentraciji uree (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), ženke hranjene koncentracijama uree između 134 µM i 1,34 mM položile su više jaja (Slika 4E). Ženke hranjene koncentracijama uree od 134 µM ili više polažu veća jaja nego ženke hranjene vodom (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Slika 4F), a veličina ličinki, iako na nju utječu slične koncentracije uree u majki (F(10, 3305) = 37,9; p < 0 .0001) bio je varijabilniji (Sl. 4G).
Na sveukupnu privlačnost hlapljivih ekstrakata iz urina goveda koji traže domaćina. Arabiensis procijenjen u olfaktometru sa staklenom cijevi (Slika 5A) bio je značajno pod utjecajem starosti urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Slika 5B). Post hoc analiza pokazala je da je ustajali miris urina nakon 24 sata uzrokovao značajno više razine privlačnosti u usporedbi sa svim ostalima. tretmana (72 sata: p = 0,0060, 168 sati: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), osim mirisa svježeg urina (p = 0,13; slika 5B). Iako ukupna privlačnost komaraca krvopiju prema mirisu urina nije značajno različita (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067), ; Slika 5C), pokazalo se da su ove ženke značajno privlačnije hlapljivim ekstraktima iz prostora u usporedbi s 72-satnim urinom u usporedbi s kontrolama (p = 0,0066; Slika 5C).
Reakcije ponašanja na prirodne i sintetičke mirise kravljeg urina u potrazi za domaćinom i Anopheles arabianus hranjen krvlju. Shema olfaktometra sa staklenom cijevi (A). Privlačenje hlapljivih ekstrakata iz svježeg i starog kravljeg urina domaćinu (B) i komarcima koji sišu krv (C). Pronađite reakciju ticala Gospodina An. Ekstrakti iz prostora glave izolirani iz svježeg (D), 24-satni Prikazan je (E), 72-satni (F) i 168-satni (G) urin krava. Tragovi detekcije elektronske antene (EAD) pokazuju promjene napona kao odgovor na bioaktivne spojeve u gornjem prostoru eluirane iz plinskog kromatografa i otkrivene detektorom plamene ionizacije (FID). Traka na ljestvici predstavlja amplitudu odgovora (mV) u odnosu na vrijeme zadržavanja (s). Svojstva i stope otpuštanja (µg). h-1) biološki aktivnih spojeva prikazani su. Jedna zvjezdica (*) označava konzistentan odgovor niske amplitude. Dvostruke zvjezdice (**) označavaju neponovljive odgovore. Pronađite domaćina (H) i krvopiju (I) An.arabiensis ima različite privlačnosti prema sintetskim mješavinama mirisa svježeg i starog kravljeg urina. Srednji udjeli komaraca privučenih različitim slovnim imenima značajno su se razlikovali jedni od drugih ( jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyeve post hoc analize;p < 0,05). Stupci pogrešaka predstavljaju standardnu ​​pogrešku ljestvice
Ženka Ann.arabiensis, 72 h i 120 h nakon krvnog obroka, tijekom mrijesta, nije pokazana sklonost isparljivim ekstraktima iz svježeg i starog kravljeg urina u usporedbi s pentanskim kontrolama (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatna datoteka 1: Slika S1).
Za ženski Ann.arabiensis, GC-EAD i GC-MS analize identificirale su osam, šest, tri i tri bioaktivna spoja (slika 5D-G). Iako su primijećene razlike u broju spojeva koji su izazvali elektrofiziološke odgovore, većina tih spojeva bila je prisutna u svakom hlapljivom ekstraktu prikupljenom iz svježeg i starog urina. Stoga, za svaki ekstrakt, samo spojevi koji su proizveli fiziološki odgovor ženskih antena iznad prag uključeni su u daljnje analize.
Ukupna hlapljiva stopa otpuštanja bioaktivnih spojeva u kolekciji headspace povećala se s 29 µg h-1 u svježem urinu na 242 µg h-1 u 168-satnom urinu, uglavnom zbog povećanja p-krezola i m-formaldehida, kao i fenola. Nasuprot tome, stope otpuštanja drugih spojeva, kao što su 2-cikloheksen-1-on i dekanal, opadaju d s povećanjem starosti urina, što je u korelaciji s uočenim smanjenjem intenziteta signala (obilja) u kromatogramu (Slika 5D)-G lijevi panel) i fiziološkim odgovorima na ove spojeve (Slika 5D-G desni panel).
Sve u svemu, sintetička smjesa imala je sličan prirodni omjer bioaktivnih spojeva identificiranih u hlapljivim ekstraktima svježeg i starog urina (Slika 5D–G) i čini se da nije izazvala značajnu privlačnost u potrazi za domaćinom (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Slika 5H) ili komarcima koji sišu krv (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; slika 5I). Međutim, post hoc usporedbe parova između tretmana pokazale su da su komarci koji traže domaćina bili značajno privlačni sintetskoj mješavini urina starog 24 sata u usporedbi s pentanskim kontrolama (p = 0,0086; slika 5H).
Kako bi se procijenila uloga pojedinačnih komponenti u sintetskim smjesama urina odležanog 24 sata, šest suptraktivnih smjesa procijenjeno je u odnosu na potpune smjese u analizi Y-cijevi, u kojoj su pojedinačni spojevi uklonjeni. Za komarce koji traže domaćina, oduzimanje pojedinačnih spojeva iz cijele smjese imalo je značajan učinak na bihevioralne reakcije (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; dodatna datoteka 1: Slika S2A), sve subtraktivne smjese bile su privlačnije od Manje od potpuno izmiješanih. Nasuprot tome, uklanjanje pojedinačnih spojeva iz potpuno sintetičke smjese nije utjecalo na bihevioralne reakcije komaraca koji sišu krv (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s izuzetkom dekanala, što je rezultiralo nižim razinama u usporedbi s cjelokupnom mješavinom Privlačnost (p = 0,022; Dodatna datoteka 1: Slika 1). S2B).
U selu endemičnom malarijom u Etiopiji, učinkovitost sintetičke mješavine 24-satnog kravljeg urina u privlačenju komaraca u terenskim uvjetima procijenjena je deset noći (slika 6A). Ukupno je uhvaćen i identificiran 4861 komarac, od kojih je 45,7% bilo Anthropus.gambiae sl, 18,9% bilo je Anopheles pharo ensis, a 35,4% bili su Culex spp. (Dodatna datoteka 1: Tablica S1). Anopheles arabinis jedini je član kompleksa vrsta An.Gambian identificiran PCR analizom. U prosjeku je uhvaćeno 320 komaraca po noći, a tijekom tog vremena zamke sa sintetičkim mješavinama mamaca uhvatile su više komaraca nego uparene zamke bez mješavine (χ2(0, 3196) = 170,0 , p < 0,0001). Zamke bez mamaca postavljene su svake od pet kontrolnih noći na početku, u sredini i na kraju pokusa. Sličan broj komaraca uhvaćen je u svaki par zamki, što ukazuje da nema odstupanja između kuća (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i da nije došlo do pada populacije tijekom razdoblja studije. Usporedno s Kontrolne zamke, broj komaraca uhvaćenih u zamke koje sadrže sintetičku smjesu značajno je povećan: traženje domaćina (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedavno hranjenje krvlju (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i trudnoća (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0). .0123;Dodatna datoteka 1: Tablica S1). To se također odražava u ukupnom broju uhvaćenih komaraca: domaćin koji traži > krvopija > gravidan > polugravidan > mužjak.
Terenska procjena učinkovitosti 24-satne mješavine s mirisom kravljeg urina. Terenska ispitivanja provedena su u južnoj središnjoj Etiopiji (karta), u blizini grada Maki (umetnuti), korištenjem svjetlosne zamke Centra za kontrolu bolesti (CDC) (desno) u uparenim kućama, s latinskim kvadratom (slika iz zraka) (A). CDC fotozamke s mamacima na mirise privlače i hvataju ženke Anopheles arabesques (B), ali ne i Anopheles farroes (C), na drugačiji način, učinak ovisan o fiziološkom stanju. Osim toga, ove su zamke uhvatile značajno povećan broj domaćina Culex komaraca. (D) U usporedbi s kontrolom. Trake s lijeve strane predstavljaju prosječni selekcijski indeks komaraca uhvaćenih u parove mirisnih mamaca (zelena) i kontrolnih (otvorenih) zamki (N = 1 0), dok trake s desne strane predstavljaju prosječni indeks selekcije u parovima kontrolnih zamki (otvoreno; N = 5).).Zvjezdice označavaju razine statističke značajnosti (*p = 0,01 i ***p < 0,0001)
Tri su vrste različito uhvaćene u zamkama koje sadrže sintetičke mješavine. Traženje domaćina (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), hranjenje krvlju (χ2 (1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i trudnoća (χ2 (1, 180) = 6,11, p = 0,0134) a .ara biensis je bio zarobljen u zamci ispuštajući sintetičku smjesu (Slika 6B), dok se količina An nije razlikovala. Pharoensis je pronađen u različitim fiziološkim stanjima (Slika 6C). Za Culex, samo značajan porast u broju komaraca koji traže domaćine nađen je u zamkama mamcima sa sintetičkom smjesom (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Slika 6D), u usporedbi s kontrolnim zamkama.
Zamke za mamce za domaćine smještene izvan potencijalnih domaćina između mjesta razmnožavanja i ruralnih zajednica u Etiopiji korištene su za procjenu koriste li komarci malaričari miris kravlje mokraće kao znak staništa domaćina. U nedostatku signala domaćina, vrućine i sa ili bez prisutnosti mirisa kravlje mokraće, komarci nisu uhvaćeni (Dodatna datoteka 1: Slika S3). Međutim, u prisutnosti visoke temperature i mirisa kravlje mokraće, ženka malarični komarci su bili privučeni i uhvaćeni, iako u malom broju, neovisno o starosti urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Dodatna datoteka 1: Slika S3). Nasuprot tome, vodene kontrole nisu uhvatile malarične komarce na visokim temperaturama (Dodatna datoteka 1: Slika S3).
Komarci malaričari dobivaju i distribuiraju spojeve koji sadrže dušik kompenzacijskim hranjenjem kravljim urinom (tj. lokvama) kako bi poboljšali značajke životne dobi, slično drugim kukcima [2, 4, 24, 25, 26]. Kravlji urin je lako dostupan obnovljivi izvor usko povezan s odmorištima prijenosnika malarije, kao što su štale za krave i visoka vegetacija u blizini seoskih kuća i mrijestilišta. Ženke komaraca lociraju ovaj izvor pomoću mirisa i sposobne su regulirati unos dušikovih spojeva u urinu, uključujući ureu, glavnu dušikovu komponentu u urinu [15, 16]. Ovisno o fiziološkom stanju ženke komarca, hranjive tvari u urinu raspoređuju se kako bi poboljšale aktivnost leta i preživljavanje ženki komaraca koje traže domaćina, kao i preživljavanje i reproduktivne značajke jedinki hranjenih krvlju tijekom prvog gonadotropnog ciklusa. Stoga miješanje urina igra važnu nutritivnu ulogu za vektore malarije koji su zatvoreni poput pothranjenih odraslih [8], budući da ženkama komaraca daje mogućnost stjecanja važnih dušikovih spojeva uključivanjem u hranjenje s niskim rizikom. Ovo otkriće ima značajne epidemiološke posljedice jer ženke produžuju očekivani životni vijek, aktivnost i reproduktivni učinak, sve od koji utječu na kapacitet vektora. Nadalje, ovo ponašanje može biti cilj budućih programa upravljanja vektorima.