Việc thu nhận và phân phối chất dinh dưỡng tích hợp các đặc điểm kiếm ăn và vòng đời của côn trùng. Để bù đắp sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng cụ thể ở các giai đoạn sống khác nhau, côn trùng có thể thu nhận các chất dinh dưỡng này thông qua việc bổ sung thức ăn, ví dụ, bằng cách ăn chất tiết của động vật có xương sống trong một quá trình được gọi là "vũng nước". Muỗi Anopheles arabiani dường như bị suy dinh dưỡng và do đó, cần chất dinh dưỡng cho cả quá trình trao đổi chất và sinh sản. Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá xem việc khuấy động An. arabiani trên nước tiểu bò để thu nhận chất dinh dưỡng có cải thiện các đặc điểm vòng đời hay không.
Hãy đảm bảo an toàn. Muỗi Aedes arabiensis bị thu hút bởi mùi nước tiểu bò tươi, đã để 24 giờ, 72 giờ và 168 giờ. Muỗi cái tìm kiếm vật chủ và đã hút máu (48 giờ sau bữa ăn máu) được đo bằng máy đo khứu giác hình chữ Y, và muỗi cái mang thai được đánh giá khả năng sinh sản. Sau đó, phân tích hóa học và điện sinh lý kết hợp được sử dụng để xác định các hợp chất hoạt tính sinh học trong nước tiểu bò ở cả bốn nhóm tuổi. Hỗn hợp tổng hợp các hợp chất hoạt tính sinh học được đánh giá trong thử nghiệm ống chữ Y và thử nghiệm thực địa. Để nghiên cứu nước tiểu bò và hợp chất chứa nitơ chính của nó là urê như một chế độ ăn bổ sung tiềm năng cho muỗi truyền bệnh sốt rét, các thông số cho ăn và đặc điểm vòng đời đã được đo. Tỷ lệ muỗi cái và lượng nước tiểu bò và urê được hấp thụ đã được đánh giá. Sau khi ăn, muỗi cái được đánh giá về khả năng sống sót, khả năng bay khi bị buộc dây và khả năng sinh sản.
Tìm kiếm máu và chất dinh dưỡng từ vật chủ. Trong các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa, cá sấu Ả Rập bị thu hút bởi mùi hương tự nhiên và tổng hợp của nước tiểu bò tươi và cũ. Cá cái mang thai không bị ảnh hưởng bởi mùi nước tiểu bò tại các địa điểm sinh sản. Cá cái tìm kiếm vật chủ và hút máu chủ động hấp thụ nước tiểu bò và urê, đồng thời phân bổ các nguồn tài nguyên này theo sự đánh đổi trong vòng đời tùy thuộc vào trạng thái sinh lý để bay, sinh tồn hoặc sinh sản.
Muỗi Anopheles arabinis thu nhận và phân tán nước tiểu bò để cải thiện các đặc điểm vòng đời. Việc bổ sung nước tiểu bò ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng truyền bệnh bằng cách tăng tỷ lệ sống sót hàng ngày và mật độ muỗi, và gián tiếp bằng cách thay đổi hoạt động bay, do đó cần được xem xét trong các mô hình tương lai.
Việc thu nhận và phân phối chất dinh dưỡng tích hợp các đặc điểm kiếm ăn và vòng đời của côn trùng [1,2,3]. Côn trùng có khả năng lựa chọn và thu nhận thức ăn cũng như thực hiện việc ăn bù dựa trên sự sẵn có của thức ăn và nhu cầu dinh dưỡng [1, 3]. Sự phân phối chất dinh dưỡng phụ thuộc vào quá trình vòng đời và có thể dẫn đến các yêu cầu khác nhau về chất lượng và số lượng thức ăn ở các giai đoạn sống khác nhau của côn trùng [1, 2]. Để bù đắp sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng cụ thể, côn trùng có thể thu nhận các chất dinh dưỡng này thông qua việc ăn bổ sung, chẳng hạn như ăn bùn, các loại phân và chất tiết khác nhau của động vật có xương sống và xác chết, một quá trình được gọi là vũng nước [2]. Mặc dù chủ yếu mô tả nhiều loài bướm và ngài, nhưng các hố nước cũng xuất hiện ở các bộ côn trùng khác, và việc bị thu hút và ăn các loại tài nguyên này có thể có tác động đáng kể đến sức khỏe và các đặc điểm vòng đời khác [2, 4, 5, 6, 7]. Muỗi sốt rét Anopheles gambiae sensu lato (sl) nở ra như một con trưởng thành 'suy dinh dưỡng' [8], vì vậy việc uống nước có thể đóng một vai trò quan trọng trong các đặc điểm vòng đời của nó, nhưng hành vi này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Từ lâu đã bị bỏ quên. Việc sử dụng phương pháp khuấy trộn để tăng cường lượng chất dinh dưỡng hấp thụ trong phương tiện quan trọng này cần được chú ý vì điều này có thể có những hậu quả dịch tễ học quan trọng.
Lượng nitơ hấp thụ ở muỗi Anopheles cái trưởng thành bị hạn chế do lượng dự trữ calo thấp được mang từ giai đoạn ấu trùng và việc sử dụng bữa ăn máu không hiệu quả [9]. Muỗi cái Ann.gambiae sl thường bù đắp điều này bằng cách bổ sung thêm bữa ăn máu [10, 11], do đó làm tăng nguy cơ mắc bệnh cho nhiều người hơn và khiến muỗi có nguy cơ bị săn mồi cao hơn. Ngoài ra, muỗi có thể sử dụng thức ăn bổ sung từ chất thải của động vật có xương sống để thu được các hợp chất chứa nitơ giúp tăng cường khả năng thích nghi và khả năng điều khiển chuyến bay, như đã được chứng minh bởi các loài côn trùng khác [2]. Về vấn đề này, sự hấp dẫn mạnh mẽ và khác biệt của một trong những loài chị em trong phức hợp loài An.The Gambian sl, Anopheles arabinis, đối với nước tiểu bò tươi và đã để lâu [12, 13, 14] là điều thú vị. Anopheles arabinis là loài cơ hội trong sở thích vật chủ của nó và được biết là có liên quan và ăn thịt gia súc. Nước tiểu bò là một nguồn giàu hợp chất chứa nitơ, với urê chiếm 50-95% tổng lượng nitơ trong nước tiểu tươi [15, 16].Khi nước tiểu bò để lâu, vi sinh vật sử dụng các nguồn tài nguyên này để giảm độ phức tạp của các hợp chất nitơ trong vòng 24 giờ [15].Với sự gia tăng nhanh chóng của amoniac, liên quan đến sự suy giảm nitơ hữu cơ, các vi sinh vật ưa kiềm (nhiều trong số đó tạo ra các hợp chất độc hại đối với muỗi) phát triển mạnh [15], có thể là do muỗi cái Ann.arabiensis bị thu hút ưu tiên bởi nước tiểu có tuổi đời 24 giờ hoặc ít hơn [13, 14].
Trong nghiên cứu này, người ta đã tìm kiếm muỗi An. arabiensis sống ký sinh và hút máu. Trong chu kỳ sinh dục đầu tiên, muỗi An. arabiensis được đánh giá khả năng hấp thụ các hợp chất nitơ, bao gồm urê, thông qua việc trộn lẫn nước tiểu. Tiếp theo, một loạt các thí nghiệm đã được tiến hành để đánh giá cách muỗi cái phân bổ nguồn dinh dưỡng tiềm năng này nhằm cải thiện khả năng sống sót, sinh sản và tìm kiếm thức ăn. Cuối cùng, mùi nước tiểu bò tươi và nước tiểu bò để lâu ngày được đánh giá để xác định xem chúng có cung cấp manh mối đáng tin cậy cho muỗi An. arabiensis sống ký sinh và hút máu hay không. Trong quá trình tìm kiếm nguồn dinh dưỡng tiềm năng này, muỗi An. arabiensis đã phát hiện ra các mối tương quan hóa học đằng sau sự hấp dẫn khác biệt được quan sát. Các hỗn hợp mùi tổng hợp của các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOC) được xác định trong nước tiểu để lâu 24 giờ đã được đánh giá thêm trong điều kiện thực địa, mở rộng các kết quả thu được trong điều kiện phòng thí nghiệm và chứng minh tác động của mùi nước tiểu bò lên các trạng thái sinh lý khác nhau. Sự thu hút muỗi. Các kết quả thu được xác nhận rằng An. arabiensis hấp thụ và phân phối các hợp chất nitơ có trong nước tiểu động vật có xương sống để ảnh hưởng đến các đặc điểm vòng đời. Những kết quả này được thảo luận trong bối cảnh các hậu quả dịch tễ học tiềm tàng và cách chúng có thể được sử dụng để giám sát và kiểm soát vật trung gian truyền bệnh.
Muỗi Anopheles arabicans (chủng Dongola) được nuôi giữ ở nhiệt độ 25 ± 2 °C, độ ẩm tương đối 65 ± 5% và chu kỳ sáng tối 12:12 giờ. Ấu trùng được nuôi trong khay nhựa (20 cm × 18 cm × 7 cm) chứa đầy nước cất và được cho ăn thức ăn cá Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Đức). Nhộng được thu thập trong cốc 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Thụy Điển) và sau đó được chuyển đến lồng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Đài Trung, Đài Loan) để cho muỗi trưởng thành nở. Muỗi trưởng thành được cho ăn dung dịch sucrose 10% không giới hạn cho đến 4 ngày sau khi nở (dpe), tại thời điểm đó, muỗi cái tìm kiếm vật chủ được cho ăn ngay trước khi thí nghiệm, hoặc được nhịn đói qua đêm với nước cất trước khi thí nghiệm, như đã mô tả. Dưới đây là mô tả chi tiết: Muỗi cái được sử dụng cho thí nghiệm ống bay chỉ bị nhịn đói trong 4-6 giờ với nước uống tự do. Để chuẩn bị muỗi hút máu cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo, muỗi cái 4 ngày tuổi (4 dpe) được cho ăn máu cừu đã khử xơ (Håtunalab, Bro, SE) bằng hệ thống cho ăn qua màng (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Sau đó, muỗi cái đã no căng được chuyển vào lồng riêng và được cho ăn trực tiếp, như mô tả bên dưới, hoặc cho ăn dung dịch sucrose 10% tự do trong 3 ngày trước khi tiến hành các thí nghiệm được mô tả bên dưới. Những con muỗi cái này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh học ống bay và được chuyển đến phòng thí nghiệm, sau đó được cho uống nước cất tự do trong 4-6 giờ trước khi thí nghiệm.
Thí nghiệm cho ăn được sử dụng để định lượng lượng nước tiểu và urê tiêu thụ ở muỗi cái An.Arab trưởng thành. Muỗi cái tìm vật chủ và hút máu được cho ăn chế độ ăn chứa 1% nước tiểu bò tươi và đã để lâu ngày pha loãng, các nồng độ urê khác nhau và hai mẫu đối chứng (10% sucrose và nước) trong 48 giờ. Ngoài ra, chất tạo màu thực phẩm (1 mg ml-1 xylene cyanide FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) được thêm vào chế độ ăn và được cung cấp trong ma trận 4 × 4 trong ống ly tâm nhỏ 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Hình 1A). Đổ đầy đến miệng ống (~300 µl). Để tránh sự cạnh tranh giữa muỗi và các tác động tiềm tàng của màu thuốc nhuộm, hãy đặt 10 con muỗi vào một đĩa Petri lớn (đường kính 12 cm và chiều cao 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Hình 1A) trong bóng tối hoàn toàn ở 25 ± 2 cm °C và 65 Độ ẩm tương đối ± 5%. Các thí nghiệm này được lặp lại từ 5 đến 10 lần. Sau khi tiếp xúc với thức ăn, muỗi được đặt ở -20 °C cho đến khi phân tích tiếp theo.
Hãy tìm kiếm nước tiểu bò và urê được hấp thụ bởi vật chủ và muỗi cái Anopheles arabianus hút máu. Trong thử nghiệm cho ăn (A), muỗi cái được cung cấp chế độ ăn gồm nước tiểu bò tươi và đã để lâu, các nồng độ urê khác nhau, đường sucrose (10%) và nước cất (H2O). Muỗi cái tìm vật chủ (B) và hút máu (C) hấp thụ nhiều đường sucrose hơn bất kỳ chế độ ăn nào khác được thử nghiệm. Lưu ý rằng muỗi cái tìm vật chủ hấp thụ nước tiểu bò 72 giờ ít hơn nước tiểu bò 168 giờ (B). Hàm lượng nitơ tổng trung bình (± độ lệch chuẩn) của nước tiểu được thể hiện trong hình nhỏ. Muỗi cái tìm vật chủ (D, F) và hút máu (E, G) hấp thụ urê theo cách phụ thuộc vào liều lượng. Thể tích hít vào trung bình (D, E) với các tên chữ cái khác nhau khác biệt đáng kể với nhau (phân tích phương sai một chiều sử dụng phân tích hậu kiểm Tukey; p < 0,05). Thanh lỗi biểu thị sai số chuẩn của giá trị trung bình (BE). Đường thẳng đứt đoạn biểu thị đường hồi quy tuyến tính logarit (F, G).
Để giải phóng thức ăn đã hấp thụ, muỗi được đặt riêng lẻ vào các ống ly tâm nhỏ 1,5 ml chứa 230 µl nước cất và mô được nghiền nát bằng chày dùng một lần và động cơ không dây (VWR International, Lund, SE), sau đó ly tâm ở tốc độ 10 krpm trong 10 phút. Phần dịch nổi (200 µl) được chuyển sang đĩa vi giếng 96 giếng (Sigma-Aldrich) và độ hấp thụ (λ620) được xác định bằng máy đọc đĩa vi giếng dựa trên quang phổ kế (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE). Ngoài ra, muỗi cũng được nghiền trong 1 ml nước cất, 900 µl trong số đó được chuyển vào cuvette để phân tích quang phổ (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Để định lượng lượng thức ăn hấp thụ, một đường cong chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha loãng nối tiếp để thu được 0,2 µl. 2,4 µl xylene cyanide 1 mg ml-1. Sau đó, mật độ quang học của các nồng độ thuốc nhuộm đã biết được sử dụng để xác định lượng thức ăn mà mỗi con muỗi đã ăn vào.
Dữ liệu về thể tích được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA) tiếp theo là so sánh từng cặp sau đó bằng phương pháp Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Phân tích hồi quy tuyến tính mô tả sự hấp thụ urê phụ thuộc vào nồng độ và so sánh phản ứng giữa muỗi tìm vật chủ và muỗi hút máu (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Khoảng 20 µl mẫu nước tiểu từ mỗi nhóm tuổi được gắn lên Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) và đóng gói trong các viên nang thiếc (8 mm × 5 mm). Các viên nang được đưa vào buồng đốt của máy phân tích CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) để xác định hàm lượng nitơ trong nước tiểu tươi và nước tiểu để lâu theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tổng lượng nitơ (g N l-1) được định lượng dựa trên nồng độ urê đã biết được sử dụng làm chuẩn.
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ ăn đến khả năng sống sót của muỗi cái tìm kiếm vật chủ và hút máu, muỗi được đặt riêng lẻ trong các đĩa Petri lớn (đường kính 12 cm và chiều cao 6 cm; Semadeni) có lỗ thông hơi và cung cấp thức ăn được che bằng lưới trên nắp (đường kính 3 cm). Chế độ ăn được cung cấp ngay sau 4 ngày và bao gồm 1% nước tiểu bò tươi và nước tiểu bò để lâu ngày pha loãng, bốn nồng độ urê và hai nhóm đối chứng, 10% sucrose và nước. Mỗi chế độ ăn được nhỏ giọt lên một miếng bông nha khoa (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) được đưa vào một ống tiêm 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), tháo pít tông và đặt lên trên đĩa Petri (hình 1A). Thay đổi chế độ ăn mỗi ngày. Duy trì phòng thí nghiệm như mô tả ở trên. Muỗi sống sót được đếm hai lần một ngày, trong khi muỗi chết được loại bỏ cho đến khi con muỗi cuối cùng chết (n = 40 mỗi nhóm). Khả năng sống sót của muỗi được cho ăn các chế độ ăn khác nhau được phân tích thống kê bằng phương pháp Kaplan-Meyer. Đường cong sống sót và kiểm định log-rank được sử dụng để so sánh phân bố tỷ lệ sống sót giữa các chế độ ăn (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Một cối xay muỗi tùy chỉnh dựa trên Attisano et al.[17], được làm bằng các tấm acrylic trong suốt dày 5 mm (rộng 10 cm x dài 10 cm x cao 10 cm) không có tấm trước và sau (Hình 3: trên). Một cụm trục xoay với một ống thẳng đứng được làm bằng cột sắc ký khí (đường kính trong 0,25 mm; dài 7,5 cm) với các đầu được dán vào một kim côn trùng treo giữa một cặp nam châm neodymium cách nhau 9 cm. Một ống nằm ngang được làm bằng cùng vật liệu (dài 6,5 cm) chia đôi ống thẳng đứng để tạo thành một cánh tay được buộc dây và một cánh tay mang một mảnh giấy nhôm nhỏ làm tín hiệu ngắt ánh sáng.
Muỗi cái nhịn ăn 24 giờ được cho ăn chế độ ăn trên trong 30 phút trước khi cố định. Sau đó, muỗi cái đã ăn no được gây mê riêng lẻ trên đá trong 2-3 phút và gắn vào kim côn trùng bằng sáp ong (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) rồi buộc vào các nhánh của ống nằm ngang. Máy đo tốc độ bay. Số vòng quay mỗi chuyến bay được ghi lại bằng bộ ghi dữ liệu tự chế, sau đó được lưu trữ và hiển thị bằng phần mềm PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Máy đo tốc độ bay được đặt trong phòng điều hòa khí hậu (12 giờ:12 giờ, sáng: tối, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Để hình dung mô hình hoạt động bay, tổng quãng đường bay (m) và tổng số hoạt động bay liên tiếp được tính toán mỗi giờ trong khoảng thời gian 24 giờ. Ngoài ra, quãng đường bay trung bình của từng con cái được so sánh giữa các nhóm điều trị và được phân tích bằng phương pháp ANOVA một chiều và phân tích hậu kiểm Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), trong đó quãng đường trung bình được coi là biến phụ thuộc, trong khi phương pháp điều trị là yếu tố độc lập. Thêm vào đó, số vòng bay trung bình được tính theo từng khoảng thời gian 10 phút.
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ ăn đến khả năng sinh sản của muỗi An.arabiensis, sáu con muỗi cái (4 ngày tuổi) được chuyển trực tiếp vào lồng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) sau khi lấy máu và được cho ăn chế độ ăn thử nghiệm trong 48 giờ như mô tả ở trên. Sau đó, thức ăn được loại bỏ và cốc đẻ trứng (30 ml; Nolato Hertila) chứa 20 ml nước cất được cung cấp vào ngày thứ ba trong 48 giờ, thay nước mỗi 24 giờ. Lặp lại mỗi chế độ ăn 20-50 lần. Trứng được đếm và ghi lại cho mỗi lồng thí nghiệm. Các mẫu trứng nhỏ được sử dụng để đánh giá kích thước trung bình và sự biến đổi chiều dài của từng quả trứng (n ≥ 200 quả mỗi chế độ ăn) bằng kính hiển vi Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Đức) được trang bị máy ảnh Leica (DFC) 320 R2; (Công ty TNHH Leica Microsystems, Đức). Số trứng còn lại được giữ trong phòng điều hòa nhiệt độ dưới điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn trong 24 giờ, và một mẫu phụ gồm ấu trùng giai đoạn 1 mới nở (n ≥ 200 con mỗi chế độ ăn) được đo đạc như mô tả ở trên. Số lượng trứng và kích thước trứng và ấu trùng được so sánh giữa các nghiệm thức bằng phương pháp ANOVA một chiều và phân tích hậu kiểm Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Các hợp chất dễ bay hơi trong không gian phía trên mẫu nước tiểu tươi (1 giờ sau khi lấy mẫu), nước tiểu để lâu 24 giờ, 72 giờ và 168 giờ được thu thập từ các mẫu nước tiểu của bò Zebu, giống Arsi. Để thuận tiện, các mẫu nước tiểu được thu thập vào sáng sớm khi bò vẫn còn trong chuồng. Mẫu nước tiểu được thu thập từ 10 cá thể và 100-200 ml mỗi mẫu được chuyển vào các túi nướng polyamide riêng lẻ (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) trong các thùng nhựa vinyl clorua có nắp đậy bằng polyamide 3 lít. Các hợp chất dễ bay hơi trong không gian phía trên mỗi mẫu nước tiểu bò được thu thập trực tiếp (tươi) hoặc sau khi để lâu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, 72 giờ và 168 giờ, tức là mỗi mẫu nước tiểu đại diện cho mỗi nhóm tuổi.
Để thu thập các chất bay hơi trong không gian phía trên mẫu, một hệ thống khép kín được sử dụng để tuần hoàn dòng khí đã được lọc bằng than hoạt tính (100 ml/phút) qua túi polyamide đến cột hấp phụ trong 2,5 giờ bằng cách sử dụng bơm chân không màng (KNF Neuberger, Freiburg, Đức). Để đối chứng, việc thu thập không gian phía trên mẫu được thực hiện từ một túi polyamide rỗng. Cột hấp phụ được làm bằng ống Teflon (5,5 cm x 3 mm đường kính trong) chứa 35 mg Porapak Q (lưới 50/80; Waters Associates, Milford, MA, Mỹ) giữa các nút bông thủy tinh. Trước khi sử dụng, cột được rửa bằng 1 ml n-hexane chưng cất lại (Merck, Darmstadt, Đức) và 1 ml pentane (dung môi tinh khiết 99,0% loại GC, Sigma Aldrich). Các chất bay hơi được hấp phụ được rửa giải bằng 400 μl pentane. Các mẫu thu được từ không gian phía trên mẫu được gộp lại và sau đó được bảo quản ở -20°C cho đến khi được sử dụng để phân tích tiếp theo.
Phản ứng hành vi của muỗi An tìm kiếm vật chủ và hút máu. Các chất chiết xuất dễ bay hơi trong không gian đầu được thu thập từ nước tiểu tươi, 24 giờ, 72 giờ và 168 giờ đã được phân tích để tìm các chất chiết xuất dễ bay hơi từ muỗi Arabidopsis bằng cách sử dụng máy đo khứu giác ống thủy tinh thẳng [18]. Các thí nghiệm được tiến hành trong khoảng thời gian ZT 13-15, thời kỳ cao điểm của hoạt động tìm kiếm nhà của An. [19]. Một máy đo khứu giác ống thủy tinh (80 cm × 9,5 cm đường kính trong) được chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ 3 ± 1 lx từ phía trên. Luồng không khí được lọc bằng than hoạt tính và làm ẩm (25 ± 2 °C, độ ẩm tương đối 65 ± 2%) đi qua thiết bị thử nghiệm sinh học ở tốc độ 30 cm s-1. Không khí được dẫn qua một loạt các màn lưới thép không gỉ, tạo ra dòng chảy tầng và cấu trúc cột khói đồng nhất. Bộ phân phối tampon nha khoa (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), được treo từ một cuộn dây 5 cm trên Đầu đón gió của máy đo khứu giác, với chất kích thích được thay đổi sau mỗi 5 phút. Để phân tích, 10 μl mỗi chất chiết xuất trong không gian đầu, pha loãng 1:10, được sử dụng làm chất kích thích. Một lượng pentane tương đương được sử dụng làm chất đối chứng. Muỗi tìm vật chủ hoặc hút máu được đặt trong lồng thả riêng lẻ 2-3 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Lồng thả được đặt ở phía ngược gió của máy đo khứu giác, và muỗi được cho thích nghi trong 1 phút, sau đó van bướm của lồng được mở để thả. Sự thu hút đối với phương pháp xử lý hoặc đối chứng được phân tích bằng tỷ lệ muỗi tiếp xúc với nguồn trong vòng 5 phút sau khi thả. Mỗi chất chiết xuất dễ bay hơi trong không gian đầu và chất đối chứng được lặp lại ít nhất 30 lần, và để tránh ảnh hưởng của bất kỳ ngày nào, số lượng phương pháp xử lý và đối chứng được thử nghiệm trong mỗi ngày thí nghiệm là như nhau. Phản ứng tìm kiếm vật chủ và muỗi hút máu Ans. Arabic so với các bộ chất trong không gian đầu được phân tích bằng hồi quy logistic danh nghĩa, tiếp theo là so sánh từng cặp cho tỷ lệ chênh lệch (JMP). (Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Phản ứng sinh sản của An. Dịch chiết không gian đầu từ nước tiểu bò tươi và đã để lâu được phân tích trong lồng Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Cốc nhựa (30 mL; Nolato Hertila) chứa 20 mL nước cất được dùng làm chất nền sinh sản và được đặt ở hai góc đối diện của lồng, cách nhau 24 cm. Cốc thí nghiệm được điều chỉnh bằng 10 μl dịch chiết không gian đầu ở tỷ lệ pha loãng 1:10. Một lượng pentane tương đương được sử dụng để điều chỉnh cốc đối chứng. Cốc thí nghiệm và cốc đối chứng được hoán đổi giữa mỗi thí nghiệm để kiểm soát ảnh hưởng của vị trí. Mười con cái đã hút máu được thả vào lồng thí nghiệm ở ZT 9-11 và số trứng trong cốc được đếm sau 24 giờ. Công thức tính chỉ số sinh sản là: (số trứng đẻ trong cốc thí nghiệm – số trứng đẻ trong cốc đối chứng) / (tổng số trứng đẻ). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 8 lần.
Phân tích sắc ký khí và phát hiện mẫu ăng-ten điện tử (GC-EAD) của muỗi An.arabiensis cái được thực hiện như đã mô tả trước đây [20]. Tóm lại, các chất chiết xuất bay hơi trong không gian đầu tươi được tách bằng máy sắc ký khí Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, Hoa Kỳ) được trang bị cột HP-5 (30 m × 0,25 mm id, độ dày màng 0,25 μm, Agilent Technologies). và nước tiểu lão hóa. Hydro được sử dụng làm pha động với tốc độ dòng chảy tuyến tính trung bình là 45 cm s-1. Mỗi mẫu (2 μl) được tiêm trong 30 giây ở chế độ không chia tách với nhiệt độ đầu vào là 225 °C. Nhiệt độ lò GC được lập trình từ 35 °C (giữ trong 3 phút) đến 300 °C (giữ trong 10 phút) với tốc độ 10 °C min-1. Trong bộ chia dòng GC, 4 psi khí nitơ được thêm vào và chia tỷ lệ 1:1 trong bộ chia chéo thể tích chết thấp Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) giữa đầu dò ion hóa ngọn lửa và EAD. Mao quản dòng GC cho EAD được dẫn qua đường truyền Gerstel ODP-2, theo dõi nhiệt độ lò GC cộng thêm 5 °C, vào một ống thủy tinh (10 cm × 8 mm), nơi nó được trộn với không khí được lọc bằng than hoạt tính và làm ẩm (1,5 l min−1). Ăng-ten được đặt Cách miệng ống 0,5 cm. Mỗi con muỗi riêng lẻ được tính là một lần lặp lại, và đối với muỗi tìm vật chủ, ít nhất ba lần lặp lại được thực hiện trên các mẫu nước tiểu của mỗi độ tuổi.
Xác định các hợp chất hoạt tính sinh học trong mẫu khí thu được từ nước tiểu bò tươi và cũ bằng cách sử dụng máy sắc ký khí và phổ khối kết hợp (GC-MS; GC 6890 và MS 5975; Agilent Technologies) để tạo ra phản ứng ở râu trong phân tích GC-EAD, hoạt động ở chế độ ion hóa va chạm điện tử ở 70 eV. Máy GC được trang bị cột mao dẫn silica nung chảy phủ UI HP-5MS (60 m × đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng 0,25 μm) sử dụng heli làm pha động với tốc độ dòng chảy tuyến tính trung bình là 35 cm s-1. Mẫu 2 μl được tiêm bằng cùng cài đặt kim tiêm và nhiệt độ lò như đối với phân tích GC-EAD. Các hợp chất được xác định dựa trên thời gian lưu giữ (chỉ số Kovát) và phổ khối so với thư viện tùy chỉnh và thư viện NIST14 (Agilent). Các hợp chất được xác định đã được xác nhận bằng cách tiêm các chất chuẩn xác thực (Tệp bổ sung 1: Bảng S2). Để định lượng, heptyl axetat (10 ng, độ tinh khiết hóa học 99,8%, Aldrich) được tiêm vào làm chất chuẩn ngoại.
Đánh giá hiệu quả của hỗn hợp mùi tổng hợp bao gồm các hợp chất hoạt tính sinh học được xác định trong nước tiểu tươi và nước tiểu để lâu ngày để thu hút muỗi Ans.arabiensis tìm kiếm vật chủ và hút máu, sử dụng cùng một máy đo khứu giác và quy trình như trên. Các hỗn hợp tổng hợp mô phỏng thành phần và tỷ lệ các hợp chất trong chiết xuất chất bay hơi trong không gian đầu của nước tiểu tươi, để lâu 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 168 giờ (Hình 5D-G; Tệp bổ sung 1: Bảng S2). Để phân tích, sử dụng 10 μl dung dịch pha loãng 1:100 của hỗn hợp tổng hợp hoàn chỉnh, với tốc độ giải phóng tổng thể dao động từ khoảng 140-2400 ng h-1, để đánh giá khả năng thu hút muỗi tìm kiếm vật chủ và hút máu. Sau đó, thử nghiệm được thực hiện trên các hỗn hợp hoàn chỉnh, trong đó các hỗn hợp trừ đi của các hợp chất riêng lẻ của hỗn hợp hoàn chỉnh được loại bỏ. Phản ứng tìm kiếm vật chủ và muỗi Ans.Arab đã hút máu so với hỗn hợp tổng hợp và hỗn hợp trừ đi được phân tích bằng hồi quy logistic danh nghĩa, tiếp theo là so sánh từng cặp cho tỷ lệ chênh lệch. (JMP Pro, phiên bản 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Để đánh giá xem nước tiểu bò có thể đóng vai trò là tín hiệu môi trường sống cho muỗi sốt rét hay không, nước tiểu bò tươi và nước tiểu bò đã để lâu, được thu thập như mô tả ở trên, cùng với nước được cho vào các xô lưới 3 lít (100 ml) và đặt trong bẫy mồi vật chủ (phiên bản BG-HDT; BioGents, Regensburg, Đức). Mười bẫy được đặt cách nhau 50 m trên đồng cỏ, cách cộng đồng làng 400 m (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) và không có gia súc, trên các khu vực sinh sản cố định và các làng. Năm bẫy được làm nóng để mô phỏng sự hiện diện của vật chủ, trong khi năm bẫy còn lại không được làm nóng. Mỗi vị trí xử lý được luân phiên mỗi đêm trong tổng cộng năm đêm. Số lượng muỗi bắt được trong các bẫy có mồi là nước tiểu ở các độ tuổi khác nhau được so sánh bằng cách sử dụng hồi quy logistic với phân phối nhị thức beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Nghiên cứu được tiến hành tại một ngôi làng có dịch sốt rét gần thị trấn Maki, vùng Oromia, Ethiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Hình 6A). Nghiên cứu diễn ra từ giữa tháng 8 đến giữa tháng 9, trước khi phun thuốc diệt côn trùng tồn lưu trong nhà hàng năm, trùng với mùa mưa kéo dài. Năm cặp nhà (cách nhau 20–50 m) nằm ở ngoại ô làng được chọn cho nghiên cứu (Hình 6A). Tiêu chí lựa chọn nhà là: không được phép nuôi động vật trong nhà, không được phép nấu ăn trong nhà (sử dụng củi hoặc than) (ít nhất là trong thời gian thử nghiệm), và mỗi nhà chỉ có tối đa hai người ở, không sử dụng thuốc diệt côn trùng. dưới màn chống muỗi đã được xử lý. Sự chấp thuận về mặt đạo đức đã được cấp bởi Hội đồng Đánh giá Đạo đức Nghiên cứu (IRB/022/2016) của Khoa Khoa học Tự nhiên (CNS-IRB), Đại học Addis Ababa, phù hợp với các hướng dẫn được thiết lập bởi Tuyên bố Helsinki của Hiệp hội Y tế Thế giới. Sự đồng ý từ mỗi chủ hộ đã được thu thập với sự hỗ trợ của nhân viên y tế cộng đồng. Toàn bộ quy trình được chính quyền địa phương ở cấp huyện và phường ('kebele') xác nhận. Thiết kế thí nghiệm tuân theo thiết kế hình vuông Latin 2 × 2, trong đó hỗn hợp tổng hợp và nhóm đối chứng được chỉ định cho các cặp nhà vào đêm đầu tiên và được hoán đổi giữa các nhà vào đêm thí nghiệm tiếp theo. Quá trình này được lặp lại mười lần. Ngoài ra, để ước tính hoạt động của muỗi trong các nhà được chọn, bẫy CDC được đặt để hoạt động năm đêm liên tiếp vào đầu, giữa và cuối cuộc thử nghiệm thực địa vào cùng một thời điểm trong ngày.
Một hỗn hợp tổng hợp chứa sáu hợp chất hoạt tính sinh học được hòa tan trong heptane (dung môi 97,0% loại GC, Sigma Aldrich) và được giải phóng ở tốc độ 140 ng h-1 bằng cách sử dụng bộ phân phối bấc bông [20]. Bộ phân phối bấc cho phép tất cả các hợp chất được giải phóng với tỷ lệ không đổi trong suốt thí nghiệm 12 giờ. Heptane được sử dụng làm đối chứng. Lọ được treo cạnh điểm vào của bẫy đèn của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) (Công ty John W. Hock, Gainesville, FL, Hoa Kỳ; Hình 6A). Các bẫy được treo cách mặt đất 0,8 – 1 m, gần chân giường, và một tình nguyện viên ngủ dưới màn chống muỗi không được xử lý và vận hành từ 18:00 đến 06:30. Muỗi được bắt theo giới tính và trạng thái sinh lý (chưa ăn, đã ăn, bán mang thai và mang thai [21]) sau đó được sàng lọc bằng phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để xác định loài được xác định về mặt hình thái là A. gambiae sl. Thành viên của phức hợp [23]. Trong Nghiên cứu thực địa, việc bẫy chuột trong các cặp nhà được phân tích bằng mô hình hồi quy logistic danh nghĩa, trong đó sự thu hút là biến phụ thuộc và phương pháp xử lý (hỗn hợp tổng hợp so với đối chứng) là hiệu ứng cố định (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Ở đây, chúng tôi báo cáo giá trị χ2 và giá trị p từ kiểm định tỷ lệ khả năng.
Đánh giá xem nó có an toàn hay không. Loài arabiensis có thể thu được nước tiểu, nguồn nitơ chính của nó, urê, bằng cách cho ăn trực tiếp, trong vòng 48 giờ sau khi cho ăn trong 4 ngày sau (dpe) thử nghiệm cho ăn ở con cái tìm vật chủ và hút máu (Hình 1A). Cả con cái tìm vật chủ và hút máu đều hấp thụ lượng sucrose nhiều hơn đáng kể so với bất kỳ chế độ ăn hoặc nước nào khác (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 và F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, tương ứng; Hình 1B,C). Hơn nữa, con cái tìm vật chủ ăn ít nước tiểu hơn ở 72 giờ so với nước tiểu ở 168 giờ (Hình 1B). Khi được cho ăn chế độ ăn có chứa urê, con cái tìm vật chủ hấp thụ một lượng urê lớn hơn đáng kể ở nồng độ 2,69 mM so với tất cả các nồng độ khác và nước, trong khi không thể phân biệt được với sucrose 10% (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Hình 1D). Điều này trái ngược với phản ứng của những con cái được cho ăn máu, chúng thường hấp thụ lượng thức ăn chứa urê nhiều hơn đáng kể so với nước, mặc dù ít hơn đáng kể so với sucrose 10% (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Hình 1).1E). Hơn nữa, khi so sánh giữa hai trạng thái sinh lý, những con cái bị lấy máu hấp thụ nhiều urê hơn những con cái đang tìm kiếm vật chủ ở nồng độ thấp nhất, và những con cái này hấp thụ lượng urê tương tự ở nồng độ cao hơn (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Hình 1F, G). Trong khi lượng hấp thụ từ chế độ ăn chứa urê dường như có giá trị tối ưu (Hình 1D, E), những con cái ở cả hai trạng thái sinh lý đều có thể điều chỉnh lượng urê hấp thụ trên toàn bộ phạm vi nồng độ urê theo kiểu tuyến tính logarit (Hình 1F, G). Tương tự, muỗi dường như kiểm soát sự hấp thụ nitơ của chúng bằng cách điều chỉnh lượng nước tiểu được hấp thụ, vì lượng nitơ trong nước tiểu phản ánh lượng được hấp thụ (Hình 1B, C và B phần chèn).
Để đánh giá tác động của nước tiểu và urê lên khả năng sống sót của muỗi tìm kiếm vật chủ và hút máu, muỗi cái được cho ăn nước tiểu ở cả bốn độ tuổi (tươi, 24 giờ, 72 giờ và 168 giờ sau khi thải ra) và một loạt nồng độ urê, cũng như nước cất và dung dịch sucrose 10% được dùng làm đối chứng (Hình 2A). Phân tích khả năng sống sót này cho thấy chế độ ăn có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sống sót chung ở muỗi cái tìm kiếm vật chủ (nước tiểu: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urê: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Hình 2B, C) và muỗi cái hút máu (nước tiểu: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urê: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Hình 2B, C). 2D,E). Trong tất cả các thí nghiệm, con cái được cho ăn chế độ ăn gồm nước tiểu, urê và nước có tỷ lệ sống sót thấp hơn đáng kể so với con cái được cho ăn chế độ ăn sucrose (Hình 2B-E). Con cái tìm kiếm vật chủ được cho ăn nước tiểu tươi và nước tiểu cũ cho thấy tỷ lệ sống sót khác nhau, với những con được cho ăn nước tiểu cũ 72 giờ (p = 0,016) có xác suất sống sót thấp nhất (Hình 2B). Hơn nữa, con cái tìm kiếm vật chủ được cho ăn 135 mM urê sống sót lâu hơn so với nhóm đối chứng dùng nước (p < 0,04) (Hình 2C). So với nước, con cái được cho ăn nước tiểu tươi và nước tiểu 24 giờ sống sót lâu hơn (lần lượt p = 0,001 và p = 0,012; Hình 2D), trong khi con cái được cho ăn nước tiểu 72 giờ sống sót lâu hơn so với những con được cho ăn nước tiểu tươi và nước tiểu cũ 24 giờ (lần lượt p < 0,0001 và p = 0,013; Hình 2D). Khi được cho ăn 135 mM urê, Những con cái được cho uống máu sống lâu hơn so với tất cả các nồng độ urê và nước khác (p < 0,013; Hình 2E).
Khả năng sống sót của muỗi Anopheles arabini cái hút máu và tìm vật chủ khi ăn nước tiểu bò và urê. Trong thí nghiệm sinh học (A), muỗi cái được cho ăn nước tiểu bò tươi và đã để lâu, các nồng độ urê khác nhau, đường sucrose (10%) và nước cất (H2O). Khả năng sống sót của muỗi tìm vật chủ (B, C) và muỗi hút máu (D, E) được ghi nhận sau mỗi 12 giờ cho đến khi tất cả muỗi cái ăn nước tiểu (B, D) và urê (C, E), và nhóm đối chứng, đường sucrose và nước, đều chết.
Tổng quãng đường và số vòng bay được xác định trong thử nghiệm máy đo hoạt động bay trong khoảng thời gian 24 giờ khác nhau giữa muỗi tìm vật chủ và muỗi hút máu, cho thấy hoạt động bay tổng thể ít hơn (Hình 3). Muỗi tìm vật chủ được cung cấp nước tiểu tươi và nước tiểu để lâu hoặc đường sucrose và nước cho thấy các kiểu bay khác nhau (Hình 3), với muỗi cái ăn nước tiểu tươi hoạt động tích cực hơn vào lúc bình minh, trong khi những con được cho ăn nước tiểu để lâu 24 và 168 giờ thì hoạt động ít hơn. Muỗi ăn nước tiểu thể hiện các kiểu bay khác nhau và chủ yếu hoạt động vào ban ngày. Muỗi cái được cung cấp đường sucrose hoặc nước tiểu để lâu 72 giờ cho thấy hoạt động trong suốt 24 giờ, trong khi muỗi cái được cung cấp nước hoạt động tích cực hơn vào giữa kỳ. Muỗi ăn đường sucrose thể hiện mức độ hoạt động cao nhất vào cuối đêm và đầu sáng, trong khi những con ăn nước tiểu để lâu 72 giờ trải qua sự suy giảm hoạt động đều đặn trong 24 giờ (Hình 3).
Hiệu suất bay của muỗi cái Anopheles arabinis hút máu, tìm kiếm vật chủ, khi ăn nước tiểu bò và urê. Trong thử nghiệm máy bay, muỗi cái được cho ăn nước tiểu bò tươi và đã để lâu, các nồng độ urê khác nhau, sucrose (10%) và nước cất (H2O) được buộc vào các cánh tay nằm ngang, quay tự do (phía trên). Đối với muỗi cái tìm kiếm vật chủ (bên trái) và hút máu (bên phải), tổng quãng đường và số chuyến bay mỗi giờ cho mỗi chế độ ăn trong khoảng thời gian 24 giờ đã được ghi lại (màu tối: xám; màu sáng: trắng). Quãng đường trung bình và số lần bay trung bình được hiển thị ở bên phải biểu đồ hoạt động theo chu kỳ sinh học. Thanh lỗi biểu thị sai số chuẩn của giá trị trung bình. Phân tích thống kê xem trong văn bản.
Nhìn chung, hoạt động bay tổng thể của muỗi cái tìm kiếm vật chủ tuân theo một mô hình tương tự như khoảng cách bay trong khoảng thời gian 24 giờ. Khoảng cách bay trung bình bị ảnh hưởng đáng kể bởi chế độ ăn uống (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), và muỗi cái tìm kiếm vật chủ ăn nước tiểu trong 72 giờ bay xa hơn đáng kể so với tất cả các chế độ ăn khác (p < 0,0001), và muỗi ăn đường sucrose bay xa hơn muỗi ăn nước tiểu tươi (p = 0,022) và nước tiểu để 24 giờ (p = 0,022). Trái ngược với mô hình hoạt động bay được mô tả bởi chế độ ăn nước tiểu, muỗi cái tìm kiếm vật chủ ăn urê thể hiện hoạt động bay liên tục trong khoảng thời gian 24 giờ, đạt đỉnh điểm trong nửa sau của pha tối (Hình 3). Mặc dù mô hình hoạt động tương tự nhau, muỗi cái tìm kiếm vật chủ ăn urê làm tăng đáng kể khoảng cách bay trung bình tùy thuộc vào nồng độ hấp thụ (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Những con cái tìm kiếm vật chủ được cho ăn urê ở bất kỳ nồng độ nào đều bay lâu hơn những con cái được cho ăn nước hoặc sucrose (p < 0,03).
Nhìn chung, hoạt động bay của muỗi hút máu ổn định và duy trì trong 24 giờ đối với tất cả các chế độ ăn, với hoạt động bài tiết nước tiểu tăng lên trong nửa sau của thời kỳ tối đối với muỗi cái được cho ăn nước cũng như muỗi cái được cho ăn nước tiểu tươi và nước tiểu để 24 giờ (hình 3). Trong khi chế độ ăn nước tiểu ảnh hưởng đáng kể đến khoảng cách bay trung bình ở muỗi cái hút máu (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), chế độ ăn urê thì không (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) so ​​với các chế độ ăn nước tiểu và chế độ ăn đối chứng khác (tươi, p = 0,0091; 72 giờ, p = 0,0022; 168 giờ, p = 0,001; sucrose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Ảnh hưởng của việc cho ăn nước tiểu và urê đến các thông số sinh sản đã được đánh giá trong các thí nghiệm sinh học đẻ trứng (Hình 4A) và được nghiên cứu theo số lượng trứng do mỗi con cái đẻ ra, kích thước trứng và ấu trùng instar đầu tiên mới nở. Số lượng trứng được đẻ ra ở những con cái Ả Rập được cho ăn nước tiểu khác nhau tùy theo chế độ ăn (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Hình 4B). Những con cái được cho ăn bữa ăn gồm nước tiểu và máu trong 24 giờ đẻ ra nhiều trứng hơn đáng kể so với những con cái được cho ăn các chế độ ăn nước tiểu khác và tương tự như những con được cho ăn đường sucrose (Hình 4B). Tương tự, kích thước trứng do những con cái được cho ăn nước tiểu đẻ ra cũng khác nhau tùy theo chế độ ăn (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), với những con cái được cho ăn nước tiểu và đường sucrose trong 24 giờ đẻ ra trứng lớn hơn đáng kể so với những con cái được cho ăn nước, trong khi trứng của những con cái được cho ăn nước tiểu trong 168 giờ nhỏ hơn đáng kể (Hình 4C). Ngoài ra, chế độ ăn nước tiểu ảnh hưởng đáng kể đến kích thước ấu trùng. (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), với ấu trùng nở ra từ trứng do con cái ăn nước tiểu 24 và 72 giờ tuổi đẻ ra lớn hơn đáng kể so với ấu trùng nở ra từ trứng do con cái ăn nước và ăn nước tiểu 168 giờ tuổi đẻ ra (Hình 4D).
Hiệu suất sinh sản của muỗi cái Anopheles arabinis khi ăn nước tiểu bò và urê. Muỗi cái đã hút máu được cho ăn các chế độ ăn gồm nước tiểu bò tươi và đã để lâu, các nồng độ urê khác nhau, sucrose (10%) và nước cất (H2O) trong 48 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm sinh học và thu được chất nền đẻ trứng sau 48 giờ (A). Số lượng trứng (B, E), kích thước trứng (C, F) và kích thước ấu trùng (D, G) bị ảnh hưởng đáng kể bởi chế độ ăn được cung cấp (nước tiểu bò: BD; urê: EG). Giá trị trung bình của mỗi thông số được đo bằng các tên chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể so với nhau (phân tích phương sai một chiều sử dụng phân tích hậu kiểm Tukey; p < 0,05). Các thanh lỗi biểu thị sai số chuẩn của giá trị trung bình.
Là thành phần nitơ chính trong nước tiểu, urê, khi được cung cấp làm thức ăn cho con cái hút máu, đã ảnh hưởng đáng kể đến các thông số sinh sản trong tất cả các nghiên cứu. Số lượng trứng do con cái được cho ăn urê đẻ ra sau bữa ăn máu, tùy thuộc vào nồng độ urê (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), con cái được cho ăn urê với nồng độ từ 134 µM đến 1,34 mM đẻ nhiều trứng hơn (Hình 4E). Con cái được cho ăn urê với nồng độ từ 134 µM trở lên đẻ trứng lớn hơn so với con cái được cho ăn nước (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Hình 4F), và kích thước ấu trùng, mặc dù bị ảnh hưởng bởi nồng độ urê tương tự ở con mẹ (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) nhưng lại biến đổi nhiều hơn (Hình 4G).
Nhìn chung, sự hấp dẫn của muỗi Aedes arabiensis đối với các chất chiết xuất dễ bay hơi từ không gian đầu của nước tiểu bò tìm kiếm vật chủ đã được đánh giá trong máy đo khứu giác ống thủy tinh (Hình 5A). Sự hấp dẫn này bị ảnh hưởng đáng kể bởi tuổi của nước tiểu (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Hình 5B). Phân tích hậu kiểm cho thấy mùi nước tiểu cũ sau 24 giờ gây ra mức độ hấp dẫn cao hơn đáng kể so với tất cả các phương pháp xử lý khác (72 giờ: p = 0,0060, 168 giờ: p = 0,012, pentane: p = 0,00070), ngoại trừ mùi nước tiểu tươi (p = 0,13; Hình 5B). Mặc dù sự hấp dẫn tổng thể của muỗi hút máu đối với mùi nước tiểu không khác biệt đáng kể (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Hình 5C), nhưng những con muỗi cái này được phát hiện là hấp dẫn hơn đáng kể đối với các chất chiết xuất dễ bay hơi từ không gian đầu so với nước tiểu để lâu 72 giờ so với nhóm đối chứng. (p = 0,0066; Hình 5C).
Phản ứng hành vi đối với mùi nước tiểu bò tự nhiên và tổng hợp trong quá trình tìm kiếm vật chủ và muỗi Anopheles arabianus hút máu. Sơ đồ máy đo khứu giác ống thủy tinh (A). Sự thu hút của các chất chiết xuất dễ bay hơi từ không gian đầu của nước tiểu bò tươi và cũ đối với vật chủ (B) và muỗi hút máu (C). Tìm phản ứng xúc giác của muỗi Anopheles arabianus. Các chất chiết xuất từ ​​không gian đầu được phân lập từ nước tiểu bò tươi (D), cũ 24 giờ (E), 72 giờ (F) và 168 giờ (G) được hiển thị. Các đường biểu diễn phát hiện ăng-ten điện tử (EAD) cho thấy sự thay đổi điện áp đáp ứng với các hợp chất hoạt tính sinh học trong không gian đầu được tách ra từ máy sắc ký khí và được phát hiện bởi đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID). Thanh tỷ lệ biểu thị biên độ phản ứng (mV) so với thời gian lưu giữ (s). Các đặc tính và tốc độ giải phóng (µg h-1) của các hợp chất hoạt tính sinh học được hiển thị. Dấu hoa thị đơn (*) cho biết phản ứng biên độ thấp nhất quán. Dấu hoa thị kép (**) cho biết phản ứng không thể tái tạo. Tìm vật chủ (H) và... Muỗi hút máu (I) An.arabiensis có những phản ứng khác nhau đối với hỗn hợp tổng hợp mùi nước tiểu bò tươi và cũ. Tỷ lệ trung bình của muỗi bị thu hút bởi các tên chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể (phân tích phương sai một chiều sử dụng phân tích hậu kiểm Tukey; p < 0,05). Các thanh lỗi biểu thị sai số chuẩn của thang đo.
Ở cá thể cái Ann.arabiensis, 72 giờ và 120 giờ sau khi ăn máu, trong quá trình sinh sản, không có sự ưu tiên nào được thể hiện đối với các chất chiết xuất dễ bay hơi từ không gian phía trên của nước tiểu bò tươi và đã để lâu so với chất đối chứng pentane (χ2 = 3,07, p > 0,05; Tệp bổ sung 1: Hình S1).
Đối với con cái Ann.arabiensis, phân tích GC-EAD và GC-MS đã xác định được tám, sáu, ba và ba hợp chất hoạt tính sinh học (Hình 5D-G). Mặc dù có sự khác biệt về số lượng hợp chất gây ra phản ứng điện sinh lý, hầu hết các hợp chất này đều có mặt trong mỗi chất chiết xuất bay hơi thu được từ nước tiểu tươi và nước tiểu cũ. Do đó, đối với mỗi chất chiết xuất, chỉ những hợp chất tạo ra phản ứng sinh lý từ râu của con cái vượt quá ngưỡng mới được đưa vào phân tích tiếp theo.
Tốc độ giải phóng tổng lượng chất bay hơi của các hợp chất hoạt tính sinh học trong mẫu thu được ở không gian phía trên tăng từ 29 µg h-1 trong nước tiểu tươi lên 242 µg h-1 trong nước tiểu để lâu 168 giờ, chủ yếu là do sự gia tăng của p-cresol và m-formaldehyde phenol cũng như phenol nói chung. Ngược lại, tốc độ giải phóng của các hợp chất khác, chẳng hạn như 2-cyclohexen-1-one và decanal, giảm khi tuổi của nước tiểu tăng lên, điều này tương quan với sự giảm cường độ tín hiệu (mức độ phong phú) quan sát được trong sắc ký đồ (Hình 5D-G, bảng bên trái) và các phản ứng sinh lý đối với các hợp chất này (Hình 5D-G, bảng bên phải).
Nhìn chung, hỗn hợp tổng hợp có tỷ lệ các hợp chất hoạt tính sinh học tương tự như trong các chất chiết xuất dễ bay hơi từ không gian đầu của nước tiểu tươi và nước tiểu để lâu (Hình 5D–G) và dường như không gây ra sức hấp dẫn đáng kể trong việc tìm kiếm vật chủ (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Hình 5H) hoặc muỗi hút máu (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Hình 5I). Tuy nhiên, so sánh từng cặp sau đó giữa các phương pháp điều trị cho thấy muỗi tìm kiếm vật chủ bị thu hút đáng kể bởi hỗn hợp tổng hợp nước tiểu để lâu 24 giờ so với nhóm đối chứng pentane (p = 0,0086; Hình 5H).
Để đánh giá vai trò của từng thành phần trong hỗn hợp tổng hợp nước tiểu để 24 giờ, sáu hỗn hợp trừ được đánh giá so với hỗn hợp hoàn chỉnh trong thí nghiệm ống chữ Y, trong đó các hợp chất riêng lẻ đã được loại bỏ. Đối với muỗi tìm kiếm vật chủ, việc loại bỏ các hợp chất riêng lẻ khỏi hỗn hợp hoàn chỉnh có ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng hành vi (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Phụ lục 1: Hình S2A), tất cả các hỗn hợp trừ đều hấp dẫn hơn hỗn hợp hoàn chỉnh. Ngược lại, việc loại bỏ các hợp chất riêng lẻ khỏi hỗn hợp tổng hợp hoàn chỉnh không ảnh hưởng đến phản ứng hành vi của muỗi hút máu (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), ngoại trừ decanal, dẫn đến mức độ hấp dẫn thấp hơn so với hỗn hợp hoàn chỉnh (p = 0,022; Phụ lục 1: Hình S2B).
Tại một ngôi làng có dịch sốt rét ở Ethiopia, hiệu quả của hỗn hợp tổng hợp nước tiểu bò 24 giờ trong việc thu hút muỗi trong điều kiện thực địa đã được đánh giá trong mười đêm (Hình 6A). Tổng cộng 4.861 con muỗi đã được bắt và xác định, trong đó 45,7% là Anthropus gambiae sl, 18,9% là Anopheles pharoensis và 35,4% là Culex spp. (Tệp bổ sung 1: Bảng S1). Anopheles arabinis là thành viên duy nhất của phức hợp loài An.Gambian được xác định bằng phân tích PCR. Trung bình, 320 con muỗi được bắt mỗi đêm, trong thời gian đó, bẫy có mồi hỗn hợp tổng hợp bắt được nhiều muỗi hơn so với bẫy không có mồi (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Bẫy không có mồi được đặt trong mỗi đêm kiểm soát trong năm đêm đầu, giữa và cuối thử nghiệm. Số lượng muỗi bắt được trong mỗi cặp bẫy là tương đương nhau. các bẫy, cho thấy không có sự thiên vị giữa các ngôi nhà (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) và không có sự suy giảm quần thể trong suốt thời gian nghiên cứu. So với các bẫy đối chứng, số lượng muỗi bắt được trong các bẫy chứa hỗn hợp tổng hợp đã tăng lên đáng kể: tìm kiếm vật chủ (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), hút máu gần đây (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) và mang thai (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Phụ lục 1: Bảng S1). Điều này cũng được phản ánh trong tổng số muỗi bị bắt: tìm kiếm vật chủ > hút máu > mang thai > bán mang thai > muỗi đực.
Đánh giá thực địa hiệu quả của hỗn hợp mùi nước tiểu bò tổng hợp kéo dài 24 giờ. Các thử nghiệm thực địa được tiến hành ở miền nam trung tâm Ethiopia (bản đồ), gần thị trấn Maki (hình chèn), sử dụng bẫy đèn của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) (bên phải) trong các cặp nhà, với thiết kế hình vuông Latinh (hình ảnh trên không) (A). Bẫy ảnh CDC có mồi mùi tổng hợp thu hút và bắt giữ muỗi cái Anopheles arabesques (B), nhưng không bắt được Anopheles farroes (C), theo cách khác nhau, một hiệu ứng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý. Ngoài ra, những bẫy này đã bắt được số lượng muỗi Culex chủ thể tăng lên đáng kể. (D) So với nhóm đối chứng. Các cột bên trái biểu thị chỉ số chọn lọc trung bình của muỗi bị bắt trong các cặp bẫy có mồi mùi (màu xanh lá cây) và bẫy đối chứng (màu trắng) (N = 10), trong khi các cột bên phải biểu thị chỉ số chọn lọc trung bình trong các cặp bẫy đối chứng (màu trắng; N = 5). Dấu hoa thị biểu thị mức độ ý nghĩa thống kê (*p = 0,01 và ***p < 0,0001)
Ba loài muỗi được bắt giữ khác nhau trong các bẫy chứa hỗn hợp tổng hợp. Khi tìm kiếm vật chủ (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), hút máu (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) và mang thai (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), muỗi A. arabiensis bị bắt trong bẫy thả hỗn hợp tổng hợp (Hình 6B), trong khi số lượng muỗi An. Pharoensis ở các trạng thái sinh lý khác nhau được tìm thấy (Hình 6C). Đối với Culex, chỉ có sự gia tăng đáng kể về số lượng muỗi tìm kiếm vật chủ được tìm thấy trong các bẫy có mồi là hỗn hợp tổng hợp (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Hình 6D), so với các bẫy đối chứng.
Các bẫy mồi đặt bên ngoài các vật chủ tiềm năng, giữa các địa điểm sinh sản và cộng đồng nông thôn ở Ethiopia, được sử dụng để đánh giá xem muỗi sốt rét có sử dụng mùi nước tiểu bò làm tín hiệu nhận biết môi trường sống của vật chủ hay không. Trong trường hợp không có tín hiệu vật chủ, nhiệt độ cao, và có hoặc không có mùi nước tiểu bò, không có con muỗi nào bị bắt (Tệp bổ sung 1: Hình S3). Tuy nhiên, khi có nhiệt độ cao và mùi nước tiểu bò, muỗi cái sốt rét bị thu hút và bắt được, mặc dù với số lượng nhỏ, không phụ thuộc vào tuổi của nước tiểu (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Tệp bổ sung 1: Hình S3). Ngược lại, các mẫu đối chứng bằng nước không bắt được muỗi sốt rét ở nhiệt độ cao (Tệp bổ sung 1: Hình S3).
Muỗi truyền bệnh sốt rét thu nhận và phân phối các hợp chất chứa nitơ thông qua việc ăn bù nước tiểu bò (tức là vũng nước tiểu) để tăng cường các đặc điểm vòng đời, tương tự như các loài côn trùng khác [2, 4, 24, 25, 26]. Nước tiểu bò là một nguồn tài nguyên tái tạo sẵn có, gắn liền với nơi nghỉ ngơi của các vật chủ truyền bệnh sốt rét, chẳng hạn như chuồng bò và thảm thực vật cao gần nhà ở nông thôn và địa điểm sinh sản. Muỗi cái xác định vị trí nguồn tài nguyên này bằng khứu giác và có khả năng điều chỉnh việc hấp thụ các hợp chất nitơ trong nước tiểu, bao gồm urê, thành phần nitơ chính trong nước tiểu [15, 16]. Tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của muỗi cái, các chất dinh dưỡng trong nước tiểu được phân bổ để tăng cường hoạt động bay và khả năng sống sót của muỗi cái tìm kiếm vật chủ, cũng như khả năng sống sót và đặc điểm sinh sản của những cá thể đã hút máu trong chu kỳ sinh dục đầu tiên. Do đó, việc trộn nước tiểu đóng vai trò dinh dưỡng quan trọng đối với các vật chủ truyền bệnh sốt rét đang ở trạng thái khép kín như người lớn suy dinh dưỡng [8], vì nó cung cấp cho muỗi cái khả năng thu nhận các hợp chất nitơ quan trọng bằng cách tham gia vào hoạt động ăn uống ít rủi ro. Phát hiện này có những hậu quả dịch tễ học đáng kể, như Con cái tăng tuổi thọ, hoạt động và khả năng sinh sản, tất cả những yếu tố này đều ảnh hưởng đến khả năng truyền bệnh của côn trùng. Hơn nữa, hành vi này có thể là mục tiêu của các chương trình quản lý vật trung gian truyền bệnh trong tương lai.