Toitainete omandamine ja jaotamine integreerib putukate toiduotsingu ja elukäigu omadused. Teatud toitainete puuduse kompenseerimiseks eri eluetappidel saavad putukad neid toitaineid lisasööda kaudu, näiteks toitudes selgroogsete eritistest protsessis, mida nimetatakse lompideks. Sääsk Anopheles arabiani näib olevat alatoidetud ja vajab seetõttu toitaineid nii ainevahetuseks kui ka paljunemiseks. Selle uuringu eesmärk oli hinnata, kas An. arabiensis'e segamine lehma uriiniga toitainete omandamiseks parandab elukäigu omadusi.
Veenduge, et see on ohutu. arabiensis tõmbas ligi värske, 24-, 72- ja 168-tunnise lehma uriini lõhn ning peremeest otsivaid ja verega toidetud (48 tundi pärast vere söömist) emaseid mõõdeti Y-toru olfaktomeetriga ja tiineid emaseid hinnati kudemistesti jaoks. Seejärel kasutati kombineeritud keemilist ja elektrofüsioloogilist analüüsi, et tuvastada bioaktiivseid ühendeid lehma uriinis kõigis neljas vanuseklassis. Bioaktiivsete ühendite sünteetilisi segusid hinnati Y-toru ja välikatsetes. Lehma uriini ja selle peamise lämmastikku sisaldava ühendi karbamiidi uurimiseks malaaria vektorite potentsiaalsete lisadieetidena mõõdeti toitumisparameetreid ja elukäigu omadusi. Hinnati emaste sääskede osakaalu ning imendunud lehma uriini ja karbamiidi hulka. Pärast toitmist hinnati emaste ellujäämist, kinnise lendamise võimet ja paljunemist.
Otsige peremeesorganismi verd ja toitaineid. Laboratoorsetes ja väliuuringutes köitis araablasi värske ja laagerdunud lehma uriini looduslik ja sünteetiline lõhn. Tiined emased ei reageerinud lehma uriini reaktsioonidele kudemispaikades. Peremeesorganismi otsivad ja verd imevad emased imavad aktiivselt lehma uriini ja uureat ning jaotavad neid ressursse vastavalt elutsükli kompromissidele, mis on seotud füsioloogilise seisundiga lendamise, ellujäämise või paljunemise osas.
Anopheles arabinis'e abil lehma uriini kogumine ja jaotamine parandab elukäigu omadusi. Lehma uriini lisasöötmine mõjutab vektorite kandevõimet otseselt, suurendades igapäevast ellujäämist ja vektorite tihedust, ning kaudselt, muutes lennuaktiivsust, mistõttu tuleks seda tulevastes mudelites arvesse võtta.
Toitainete omandamine ja jaotamine integreerib putukate toiduotsingu ja elukäigu omadused [1,2,3]. Putukad on võimelised toitu valima ja hankima ning teostama kompenseerivat toitumist, lähtudes toidu kättesaadavusest ja toitainevajadusest [1, 3]. Toitainete jaotus sõltub elukäigu protsessist ja võib putukate erinevates eluetappides kaasa tuua erinevad nõuded toidu kvaliteedile ja kvantiteedile [1, 2]. Teatud toitainete puuduse kompenseerimiseks saavad putukad neid toitaineid täiendava toitumise kaudu, näiteks muda, selgroogsete erinevate väljaheidete ja eritiste ning raipe abil, seda protsessi nimetatakse lompideks [2]. Kuigi peamiselt on kirjeldatud mitmesuguseid liblika- ja koiliike, esineb jootmisauke ka teistes putukate seltsides ning nende ressursside ligitõmbamine ja neist toitumine võib avaldada olulist mõju tervisele ja teistele elukäigu omadustele [2, 4, 5, 6],7]. Malaariasääsk Anopheles gambiae sensu lato (sl) ilmub "alatoidetud" täiskasvanuna [8], seega võib jootmine mängida olulist rolli tema elukäigu omadustes, kuid seda käitumist on seni unarusse jäetud. Selle olulise kandja toitainete tarbimise suurendamiseks agiteerimise kasutamine väärib tähelepanu, kuna sellel võivad olla olulised epidemioloogilised tagajärjed.
Täiskasvanud emaste Anopheles sääskede lämmastikutarbimine on piiratud vastse staadiumist pärit madalate kalorivarude ja verejahu ebaefektiivse kasutamise tõttu [9]. Emased Ann.gambiae sl sääsed kompenseerivad seda tavaliselt täiendava verejahuga [10, 11], pannes seeläbi rohkem inimesi haigusesse nakatumise ohtu ja sääsed suuremasse kiskjate ohtu. Teise võimalusena saavad sääsed kasutada selgroogsete väljaheidete täiendavat söötmist, et omandada lämmastikühendeid, mis parandavad kohanemisvõimet ja lennumanööverdusvõimet, nagu on näidanud teised putukad [2]. Sellega seoses on huvitav ühe sugulasliigi tugev ja eristuv külgetõmme A. Gambia sl liikide kompleksi, Anopheles arabinis'e, värske ja laagerdunud lehma uriin [12, 13, 14]. Anopheles arabinis on oma peremeesorganismi eelistustes oportunistlik ja on teadaolevalt seotud veistega ja toitub neil. Lehma uriin on lämmastikühenditerikas ressurss, kusjuures karbamiid moodustab 50–95% värske uriini lämmastikust [15, 16]. Kuna lehma uriin Vanuse järgi kasutavad mikroorganismid neid ressursse lämmastikühendite keerukuse vähendamiseks 24 tunni jooksul [15]. Ammoniaagi kiire suurenemisega, mis on seotud orgaanilise lämmastiku vähenemisega, õitsevad leeliselised mikroorganismid (kellest paljud toodavad sääskedele mürgiseid ühendeid) [15], mis võivad olla emased. Ann. arabiensis eelistab 24 tundi või vähem vana uriin [13, 14].
Selles uuringus otsiti peremeesorganismist ja verega toidetavaid An-e. Esimese gonadotropiinitsükli ajal hinnati arabiensise uriiniga segamise teel lämmastikühendite, sealhulgas uurea, omastamist. Seejärel viidi läbi rida katseid, et hinnata, kuidas emased sääsed jaotavad seda potentsiaalset toitaineressurssi parema ellujäämise, paljunemise ja edasise toiduotsingu jaoks. Lõpuks hinnati värske ja laagerdunud lehma uriini lõhna, et teha kindlaks, kas see annab usaldusväärseid vihjeid peremeesorganismi ja verega toidetava An-i kohta. Selle potentsiaalse toitaineressursi otsinguil avastasid arabiensis'e täheldatud erineva atraktiivsuse taga keemilised korrelatsioonid. 24-tunnise laagerdunud uriinis tuvastatud lenduvate orgaaniliste ühendite (VOC) sünteetilisi lõhnasegusid hinnati edasi välitingimustes, laiendades laboritingimustes saadud tulemusi ja näidates veise uriini lõhna mõju erinevatele füsioloogilistele seisunditele. Sääskede ligitõmbavus. Saadud tulemused kinnitavad, et An. arabiensis omandab ja levitab selgroogsete uriinis leiduvaid lämmastikühendeid, et mõjutada elukäigu omadusi. Neid tulemusi arutatakse võimalike epidemioloogiliste tagajärgede kontekstis ja selle kontekstis, kuidas neid saab kasutada vektorite jälgimiseks ja tõrjeks.
Anopheles arabicans'i (Dongola tüvi) hoiti temperatuuril 25 ± 2 °C, suhtelise õhuniiskuse juures 65 ± 5% ja 12:12-tunnise valguse ja pimeduse tsükliga. Vastseid kasvatati destilleeritud veega täidetud plastkandikutel (20 cm × 18 cm × 7 cm) ja neile söödeti Tetramin® kalatoitu (Tetra Werke, Melle, Saksamaa). Nukud koguti 30 ml tassidesse (Nolato Hertila, Åstorp, Rootsi) ja seejärel viidi Bugdormi puuridesse (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan), et võimaldada täiskasvanud isendite tärkamist. Täiskasvanutele anti 10% sahharoosilahust ad libitum kuni 4 päeva pärast tärkamist (dpe), mille järel pakuti peremeest otsivatele emasloomadele vahetult enne katset toitu või näljutati neid enne katset üleöö destilleeritud veega, nagu allpool kirjeldatud. Lennutoru katsetes kasutatud emasloomi näljutati ainult 4-6 tundi vesi ad libitum. Vereimevate sääskede ettevalmistamiseks järgnevateks biotestideks anti 4-le dpe emasele defibrootilist lambaverd (Håtunalab, Bro, SE), kasutades membraansöötmissüsteemi (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Ühendkuningriik). Täielikult ummistunud emased viidi seejärel üksikutesse puuridesse ja neile anti otse allpool kirjeldatud viisil toitu või 10% sahharoosi ad libitum 3 päeva enne allpool kirjeldatud katseid. Viimaseid emaseid kasutati lennutoru biotestides ja viidi laborisse ning seejärel said nad enne katset 4-6 tundi ad libitum destilleeritud vett.
Täiskasvanud An.Arabi emaste uriini ja uurea tarbimise kvantifitseerimiseks kasutati söötmisanalüüse. Peremeest otsivatele ja verega toidetud emastele anti 48 tunni jooksul dieeti, mis sisaldas 1% lahjendatud värsket ja laagerdunud lehma uriini, erineva kontsentratsiooniga uureat ja kahte kontrollrühma (10% sahharoosi ja vett). Lisaks lisati dieedile toiduvärvi (1 mg ml-1 ksüleentsüaniid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ja seda tarniti 4 × 4 maatriksis 250 µl mikrotsentrifuugituubides (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; joonis 1A). Täideti ääreni (~300 µl). Sääskedevahelise konkurentsi ja värvaine võimaliku mõju vältimiseks asetati 10 sääske suurde Petri tassi (12 cm läbimõõduga ja 6 cm kõrge; Semadeni, Ostermundigen, CH; joonis 1A) täielikus pimeduses temperatuuril 25 ± 2 cm °C ja suhtelise õhuniiskuse juures 65 ± 5%. Neid katseid korrati 5–10 korda päevas. Pärast toiduga kokkupuudet paigutati sääsed edasiseks analüüsiks temperatuurini -20 °C.
Otsige veise uriini ja karbamiidi, mida peremees ja verd imev emane Anopheles arabianus omastavad. Söötmiskatses (A) anti emastele sääskedele toitu, mis koosnes värskest ja laagerdunud lehma uriinist, erinevates kontsentratsioonides karbamiidist, sahharoosist (10%) ja destilleeritud veest (H2O). Peremeest otsivad (B) ja verega toidetud (C) emased omastasid rohkem sahharoosi kui ükski teine ​​testitud toit. Pange tähele, et peremeest otsivad emased omastasid 72-tunnise lehma uriini vähem kui 168-tunnise lehma uriini (B). Uriini keskmine lämmastikusisaldus (± standardhälve) on esitatud lisal. Peremeest otsivad (D, F) ja verd imevad (E, G) emased omastavad karbamiidi annusest sõltuval viisil. Erinevate tähtnimetustega keskmised sissehingatud mahud (D, E) erinesid üksteisest oluliselt (ühesuunaline ANOVA, kasutades Tukey post hoc analüüsi; p < 0,05). Vearibad tähistavad keskmise standardviga (BE). Katkendlik sirge joon tähistab log-lineaarset regressioonijoont (F, G).
Imendunud toidu vabastamiseks paigutati sääsed ükshaaval 1,5 ml mikrotsentrifuugituubidesse, mis sisaldasid 230 µl destilleeritud vett, ja kude purustati ühekordse nuia ja juhtmeta mootoriga (VWR International, Lund, SE), millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 10 krpm 10 minutit. Supernatant (200 µl) viidi 96-süvendilisele mikroplaadile (Sigma-Aldrich) ja neeldumist (λ620) määrati spektrofotomeetril põhineva mikroplaadilugejaga (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Teise võimalusena jahvatati sääsed 1 ml destilleeritud vees, millest 900 µl viidi spektrofotomeetriliseks analüüsiks küvetti (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Toidu tarbimise kvantifitseerimiseks valmistati standardkõver seeriaviisilise lahjendamise teel, saades 0,2 µl kuni 2,4 µl 1 mg ml-1 ksüleentsüaniidi. Seejärel määrati teadaoleva värvaine optiline tihedus. kontsentratsioone kasutati iga sääse poolt alla neelatud toidu koguse määramiseks.
Mahuandmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey post hoc paarikaupa võrdlus (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineaarsed regressioonanalüüsid kirjeldasid kontsentratsioonist sõltuvat uurea tarbimist ja võrdlesid peremeesorganismi otsivate ja verd imevate sääskede reaktsioone (GraphPad Prism v8.0.0 Macile, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Ligikaudu 20 µl igast vanuserühmast võetud uriiniproove seoti Chromosorb® W/AW-ga (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) ja kapseldati tinakapslitesse (8 mm × 5 mm). Kapslid sisestati CHNS/O analüsaatori (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) põlemiskambrisse, et määrata värske ja vanandatud uriini lämmastikusisaldus vastavalt tootja juhistele. Kogulämmastik (g N l-1) kvantifitseeriti teadaolevate uurea kontsentratsioonide põhjal, mida kasutati standardina.
Et hinnata toitumise mõju peremeest otsivate ja verd imevate emaste ellujäämisele, paigutati sääsed individuaalselt suurtesse Petri tassidesse (12 cm läbimõõduga ja 6 cm kõrged; Semadeni), mille kaanes oli võrguga kaetud auk (3 cm läbimõõduga) ventilatsiooni ja toiduga varustamiseks. Toitu anti kohe pärast 4 päeva möödumist ja see sisaldas 1% lahjendatud värsket ja laagerdunud lehma uriini, nelja kontsentratsiooni uureat ja kahte kontrollproovi, 10% sahharoosi ja vett. Iga toit pipeteeriti hambatampoonile (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), mis oli sisestatud 5 ml süstlasse (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), kolb eemaldati ja asetati Petri tassi peale (joonis 1). 1A). Muutke oma toitumist iga päev. Hoidke laborit ülalkirjeldatud viisil. Ellujäänud sääski loendati kaks korda päevas, surnud sääsed visati ära kuni viimase sääse surmani (n = 40 ravikuuri kohta). Erinevatel dieetidel söödetud sääskede ellujäämist analüüsiti statistiliselt Kaplan-Meyeri ellujäämiskõverate ja log-rank testide abil, et võrrelda ellujäämisjaotust. toitumiste võrdlused (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Attisano jt. [17] põhjal loodud eritellimusel valmistatud sääsetõrjevahend, mis on valmistatud 5 mm paksustest läbipaistvatest akrüülpaneelidest (10 cm laiad x 10 cm pikad x 10 cm kõrged) ilma esi- ja tagapaneelideta (joonis 3: ülemine osa). Pöördmehhanism vertikaalse toruga, mis on valmistatud gaasikromatograafia kolonnist (0,25 mm sisediameeter; 7,5 cm pikkus), mille otsad on liimitud putukanõela külge, mis on riputatud 9 cm kaugusel asuvate neodüümmagnetite vahele. Samast materjalist valmistatud horisontaalne toru (6,5 cm pikk) poolitas vertikaalse toru, moodustades kinnitatud haru ja haru, mis kandis väikest alumiiniumfooliumitükki valgust katkestava signaalina.
24 tundi näljutatud emastele anti ülaltoodud dieeti 30 minutit enne nende liikumist piiramist. Seejärel tuimestati täielikult toidetud emased sääsed individuaalselt 2-3 minutiks jääle ja kinnitati putukanõelte külge mesilasvahaga (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) ning seejärel seoti horisontaalsete torude harude külge. Lendav veski. Pöörete arv lennu kohta registreeriti spetsiaalselt ehitatud andmelogijaga ning seejärel salvestati ja kuvati PC-Lab 2000™ tarkvara abil (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Lendav veski paigutati kliimaga reguleeritud ruumi (12 h:12 h, valgus:pime, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% suhteline õhuniiskus).
Lennutegevuse mustri visualiseerimiseks arvutati 24-tunnise perioodi jooksul läbitud kogukaugus (m) ja järjestikuste lennutegevuste koguarv tunnis. Lisaks võrreldi üksikute emaste keskmisi lennukaugusi erinevate ravirühmade vahel ja analüüsiti neid ühesuunalise ANOVA ja Tukey post hoc analüüsi abil (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kus keskmist vahemaad peeti sõltuvaks muutujaks, samas kui ravirühma peeti sõltumatuks teguriks. Lisaks arvutatakse keskmine lendude arv 10-minutiliste sammudega.
An.arabiensis'e paljunemisvõime hindamiseks viidi kuus emast (4 dpe) pärast vere võtmist otse Bugdormi puuridesse (30 cm × 30 cm × 30 cm) ja neile anti 48 tundi eksperimentaalset toitu, nagu eespool kirjeldatud. Seejärel eemaldati toit ja kolmandal päeval anti 48 tunniks 20 ml destilleeritud veega täidetud kudemistopsid (30 ml; Nolato Hertila), mida vahetati iga 24 tunni järel. Iga toitumisrežiimi korrati 20–50 korda. Iga eksperimentaalse puuri munad loendati ja registreeriti. Munade osaproove kasutati üksikute munade keskmise suuruse ja pikkuse varieeruvuse hindamiseks (n ≥ 200 toidu kohta), kasutades Dialux-20 mikroskoopi (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Saksamaa), mis oli varustatud Leica kaameraga (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Saksamaa). Ülejäänud mune hoiti 24 tundi kliimaseadmega ruumis standardsetes kasvatustingimustes ja mõõdeti hiljuti ilmunud esimese staadiumi vastsete alamproovi (n ≥ 200 toidukorra kohta), nagu eespool kirjeldatud. Munade arvu ning munade ja vastsete suurust võrreldi töötluste vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d ja Tukey post hoc analüüsi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Zebu veiste ja Arsi tõugude proovidest koguti värske (1 tund pärast proovi võtmist), 24 tunni, 72 tunni ja 168 tunni möödudes laagerdunud uriini pearuumi lenduvad ühendid. Mugavuse huvides koguti uriiniproovid varahommikul, kui lehmad olid veel laudas. Uriiniproovid koguti 10 isendilt ja 100–200 ml igast proovist viidi individuaalsetesse polüamiidist küpsetuskottidesse (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Saksamaa) 3-liitristesse polüamiidist kaanega vinüülkloriidist plasttünnidesse. Iga veise uriiniproovi pearuumi lenduvad ühendid koguti kas otse (värskelt) või pärast toatemperatuuril laagerdumist 24 tundi, 72 tundi ja 168 tundi, st iga uriiniproov oli iga vanuserühma esindaja.
Lenduvate ainete kogumiseks õhuruumis kasutati suletud ahelaga süsteemi, mis tsirkuleeris aktiivsöega filtreeritud gaasivoolu (100 ml min-1) läbi polüamiidkoti adsorptsioonikolonni 2,5 tunni jooksul, kasutades diafragmavaakumpumpa (KNF Neuberger, Freiburg, Saksamaa). Kontrollina koguti õhuruumis ained tühjast polüamiidkotist. Adsorptsioonikolonn oli valmistatud teflontorust (5,5 cm x 3 mm sisediameeter), mis sisaldas klaasvillast korkide vahel 35 mg Porapak Q-d (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA). Enne kasutamist loputati kolonni 1 ml redestilleeritud n-heksaaniga (Merck, Darmstadt, Saksamaa) ja 1 ml pentaaniga (99,0% puhas lahusti GC klass, Sigma Aldrich). Adsorbeeritud lenduvad ained elueeriti 400 μl pentaaniga. Õhuruumi kogumid ühendati ja seejärel säilitati temperatuuril -20 °C kuni edasise analüüsini.
Peremeest otsiva ja verd sööva An käitumuslikud reaktsioonid. Värskest, 24-, 72- ja 168-tunnise laagerdunud uriinist kogutud pearuumi lenduvaid ekstrakte analüüsiti Arabidopsis sääskede lenduvate ekstraktide suhtes sirge klaastoruga olfaktomeetri abil [18]. Katsed viidi läbi ZT 13-15 ajal, mis on Ani koduotsingu aktiivsuse tippperiood. Arab [19]. Klaastoruga olfaktomeetrit (80 cm × 9,5 cm sisediameeter) valgustati ülaltpoolt 3 ± 1 lx punase valgusega. Süsifiltreeritud ja niisutatud õhuvool (25 ± 2 °C, 65 ± 2% suhteline õhuniiskus) läbis biotesti kiirusel 30 cm s-1. Õhk juhitakse läbi roostevabast terasest võrgust sõelte seeria, luues laminaarse voolu ja ühtlase suitsustruktuuri. Hambatampooni dosaator (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), mis on riputatud olfaktomeetri tuulepoolses otsas olevale 5 cm pikkusele mähisele, stimulaatoriga. muutub iga 5 minuti järel. Analüüsiks kasutati stiimulina 10 μl igast pearuumi ekstraktist, mis oli lahjendatud vahekorras 1:10. Kontrollina kasutati võrdset kogust pentaani. Üksikud peremeest otsivad või verd imevad sääsed paigutati individuaalsetesse vabastuspuuridesse 2-3 tundi enne katse algust. Vabastuspuur asetati olfaktomeetri tuulepoolsele küljele ja sääskedel lasti 1 minut aklimatiseeruda ning seejärel avati puuri liblikklapp vabakslaskmiseks. Ligitõmbust ravi või kontrollrühma poole analüüsiti sääskede osakaaluna, kes puutusid allikaga kokku 5 minuti jooksul pärast vabastamist. Iga pearuumi lenduva ekstrakti ja kontrollrühma replikeeriti vähemalt 30 korda ning mis tahes päeva mõjude vältimiseks testiti igal katsepäeval sama arvu ravi- ja kontrollrühmi. Peremeesorganismi ja verega toidetud Ans.Arabic versus pearuumi komplektide otsingureaktsioone analüüsiti nominaalse logistilise regressiooni abil, millele järgnesid paarikaupa võrdlused paaritute suhete jaoks (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An'i kudemisreaktsioon. Värske ja laagerdunud lehma uriini pearuumi ekstrakte analüüsiti Bugdormi puurides (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Kudemissubstraadiks olid 20 ml destilleeritud veega täidetud plasttopsid (30 ml; Nolato Hertila) ja need asetati puuri vastasnurkadesse 24 cm kaugusele teineteisest. Töötlemistopsidele lisati 10 μl iga pearuumi ekstrakti lahjenduses 1:10. Kontrolltopsi reguleerimiseks kasutati võrdset kogust pentaani. Töötlemis- ja kontrolltopse vahetati iga katse vahel, et kontrollida positsiooniefekte. Kümme verega toidetud emast lasti katsepuuridesse kell 9-11 ja topsides olevad munad loendati 24 tundi hiljem. Kudemisindeksi arvutamise valem on: (töötlustopsi munetud munade arv – kontrolltopsi munetud munade arv) / (munetud munade koguarv). Iga töötlust korrati 8 korda.
Emase An.arabiensis'e gaasikromatograafiline ja elektronantenni mustrite tuvastamise (GC-EAD) analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [20]. Lühidalt, värsked pearuumi lenduvad ekstraktid eraldati Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) abil, mis oli varustatud HP-5 kolonniga (30 m × 0,25 mm sisediameeter, 0,25 μm kile paksus, Agilent Technologies). ja vananev uriin. Liikuv faas oli vesinik keskmise lineaarse voolukiirusega 45 cm s-1. Iga proovi (2 μl) süstiti 30 sekundiks jagamata režiimis sisselasketemperatuuril 225 °C. GC ahju temperatuur programmeeriti vahemikus 35 °C (3 minutit hoidmist) kuni 300 °C (10 minutit hoidmist) kiirusel 10 °C min-1. GC väljavoolujaoturisse lisati 4 psi lämmastikku ja jagati see Gerstel 3D/2 väikese surnud mahuga ristseadmes (Gerstel, Mülheim, Saksamaa) suhtega 1:1 leekionisatsioonidetektori ja EAD vahel. EAD jaoks mõeldud GC väljavoolukapillaar juhiti läbi Gerstel ODP-2 ülekandeliini, mis jälgib GC ahju temperatuuri pluss 5 °C, klaastorusse (10 cm × 8 mm), kus see segati süsinikfiltreeritud niisutatud õhuga (1,5 l min-1). Antenn paigutati toru väljundist 0,5 cm kaugusele. Iga üksik sääsk arvestati ühe korduse puhul ja peremeesorganismi otsivate sääskede puhul tehti igast vanusest uriiniproovidega vähemalt kolm kordust.
Värske ja laagerdunud veise uriini pearuumi kogudes leiduvate bioaktiivsete ühendite identifitseerimine kombineeritud GC ja massispektromeetri (GC-MS; 6890 GC ja 5975 MS; Agilent Technologies) abil, et esile kutsuda antennireaktsioone GC-EAD analüüsis, töötades elektronlöögi-ionisatsioonirežiimis 70 eV juures. GC oli varustatud HP-5MS UI-kattega sulatatud ränidioksiidist kapillaarkolonniga (siseläbimõõt 60 m × 0,25 mm, kile paksus 0,25 μm), kasutades liikuva faasina heeliumi keskmise lineaarse voolukiirusega 35 cm s-1. 2 μl proovi süstiti samade injektori sätete ja ahju temperatuuriga nagu GC-EAD analüüsi puhul. Ühendid identifitseeriti nende retentsiooniaja (Kováti indeks) ja massispektrite põhjal, võrreldes kohandatud teeki ja NIST14 teeki (Agilent). Identifitseeritud ühendid kinnitati autentsete standardite süstimisega (lisafail 1: tabel S2). Kvantifitseerimiseks kasutati heptüülatsetaati (10 ng, 99,8% keemiline puhtus, Aldrich). süstitakse välise standardina.
Värskes ja laagerdunud uriinis tuvastatud bioaktiivsetest ühenditest koosneva sünteetilise lõhnasegu efektiivsuse hindamine peremeesorganismi otsivate ja verd imevate Ans.arabiensis'e ligimeelitamiseks, kasutades sama olfaktomeetrit ja protokolli nagu eespool. Sünteetilised segud jäljendasid värske, 24-tunnise, 48-tunnise, 72-tunnise ja 168-tunnise laagerdunud uriini segatud pearuumi lenduvate ekstraktide ühendite koostist ja proportsioone (joonis 5D-G; lisafail 1: tabel S2). Analüüsiks kasutage 10 μl täissünteetilise segu 1:100 lahjendust, mille üldine vabanemiskiirus on vahemikus ligikaudu 140–2400 ng h-1, et hinnata peremeesorganismi ja verd imevate sääskede atraktiivsust. Seejärel tehakse test täissegudega, millest eemaldatakse terviksegu üksikute ühendite lahutavad segud. Peremeesorganismi ja verd toidetud Ans.Arabi vs sünteetiliste ja lahutavate segude otsingureaktsioone analüüsiti nominaalse logistilise regressiooni abil, millele järgnesid paarikaupa võrdlused paaritute suhete jaoks (JMP Pro, v14.0.0, SAS Instituut Inc.).
Selleks, et hinnata, kas lehma uriin võiks olla malaariasääskede peremeesorganismi elupaiga vihjeks, pandi ülalkirjeldatud viisil kogutud värske ja laagerdunud lehma uriin koos veega 3-liitristesse võrguga ämbritesse (100 ml) ja asetati peremeesorganismi söödapüünistesse (BG-HDT versioon; BioGents, Regensburg, Saksamaa). Kümme lõksu paigutati 50 m kaugusele teineteisest karjamaale, 400 m kaugusele külakodust (Silay, Etioopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) ja ilma veisteta, püsivatele sigimisaladele ja küladesse. Viit lõksu kuumutati peremeesorganismi olemasolu simuleerimiseks, samas kui viis lõksu jäeti kütmata. Iga töötluskohta vahetatakse igal õhtul kokku viie öö jooksul. Erineva vanusega uriiniga söödaks söödetud lõksudes püütud sääskede arvu võrreldi beeta-binomiaaljaotusega logistilise regressiooni abil (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Malaaria endeemilises külas Maki linna lähedal Oromia piirkonnas Etioopias (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; joonis 6A). Uuring viidi läbi augusti keskpaigast septembri keskpaigani enne iga-aastast siseruumides jääkide pritsimist koos pika vihmaperioodiga. Uuringuks valiti küla äärealadel asuv viis paari maju (20–50 m kaugusel teineteisest) (joonis 6A). Majade valiku kriteeriumid olid järgmised: majja ei lubatud loomi, siseruumides toiduvalmistamine (küttepuude või söe kasutamine) ei olnud lubatud (vähemalt katseperioodil) ja majad, kus on maksimaalselt kaks elanikku, kes magavad putukamürgita ruumides. töödeldud sääsevõrgu all. Eetilise heakskiidu on andnud Addis Abeba ülikooli loodusteaduste teaduskonna (CNS-IRB) institutsionaalne uurimiseetika läbivaatamise nõukogu (IRB/022/2016) vastavalt Maailma Meditsiiniassotsiatsiooni Helsingi deklaratsiooni kehtestatud suunistele. Igalt leibkonnapealt saadi nõusolek tervishoiutöötajate abiga. Kogu protsessi toetavad kohalikud omavalitsused ringkonna ja koguduse („kebele“) tasandil. Katsekujundus järgis 2 × 2 ladina ruudu kujundust, kus sünteetilised segud ja kontrollrühmad määrati paarismajadesse esimesel ööl ja vahetati majade vahel järgmisel katseööl. Seda protsessi korrati kümme korda. Lisaks, et hinnata sääskede aktiivsust valitud majades, seati CDC püünised tööle viis järjestikust ööd välikatse alguses, keskel ja lõpus samal kellaajal.
Kuus bioaktiivset ühendit sisaldav sünteetiline segu lahustati heptaanis (97,0% lahusti GC puhtusastmega, Sigma Aldrich) ja vabastati puuvillase tahi dosaatori abil kiirusel 140 ng h-1. Tahi dosaator võimaldas kõigil ühenditel vabaneda konstantsetes proportsioonides kogu 12-tunnise katse jooksul. Kontrollina kasutati heptaani. Viaal riputati haiguste tõrje ja ennetamise keskuste (CDC) valguslõksu (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; joonis 6A) sisenemispunkti kõrvale. Lõksud riputati maapinnast 0,8–1 m kõrgusele voodi jalutsi lähedale ning vabatahtlik magas töötlemata sääsevõrgu all ja opereeris neid kella 18.00 ja 06.30 vahel. Seejärel skriiniti soo ja füsioloogilise staatuse järgi püütud sääski (söömata, söötunud, pooltiined ja tiined [21]) polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüsi abil, et tuvastada morfoloogiliselt A. gambiae sl.-na identifitseeritud liik. Kompleksi liikmed [23]. Väliuuringus lõks Paarismajade püünisjahi analüüsiti nominaalse logistilise sobivusmudeli abil, kus ligitõmbavus oli sõltuv muutuja ja töötlemine (sünteetiline segu vs kontroll) oli fikseeritud efekt (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Siin esitame χ2 ja p-väärtused tõenäosussuhte testist.
Hinnake, kas see on ohutu. arabiensis suutis oma peamist lämmastikuallikat, uureat, otse söötmise teel kätte saada 48 tunni jooksul pärast manustamist 4 päeva jooksul pärast peremeest otsivate ja verega toidetud emaste söötmiskatseid (joonis 1A). Nii peremeest otsivad kui ka verd imevad emased omastasid oluliselt rohkem sahharoosi kui ükski teine ​​dieet või vesi (vastavalt F(5426) = 20,15, p < 0,0001 ja F(5299) = 56,00, p < 0,0001; joonis 1B, C). Lisaks sõid peremeest otsivad emased 72 tunni möödudes vähem uriini kui 168 tunni möödudes (joonis 1B). Uureat sisaldava dieedi pakkumisel omastasid peremeest otsivad emased oluliselt suurema koguse uureat 2,69 mM kontsentratsioonil võrreldes kõigi teiste kontsentratsioonide ja veega, samas kui see oli eristamatu 10% sahharoosist (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; joonis 1D). See oli vastupidine verega toidetud emaste reaktsioonile, kes omastasid tavaliselt oluliselt rohkem uureat sisaldavat toitu kui vett, ehkki oluliselt vähem kui 10% sahharoosi (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; joonis 1).1E). Lisaks, kui võrrelda kahte füsioloogilist seisundit, omastasid flebotomiseeritud emased madalaima kontsentratsiooni korral rohkem uureat kui peremeest otsivad emased ning need emased omastasid kõrgema kontsentratsiooni korral sarnases koguses uureat (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; joonis 1F, G). Kuigi uureat sisaldava toidu tarbimine näis olevat optimaalsete väärtustega (joonis 1D, E), suutsid emased mõlemas füsioloogilises seisundis moduleerida imendunud uurea hulka kogu uurea kontsentratsioonide vahemikus log-lineaarselt (joonis 1F, G). Samamoodi näivad sääsed kontrollivat lämmastiku omastamist, reguleerides imenduva uriini hulka, kuna uriinis sisalduva lämmastiku hulk kajastub imendunud koguses (joonis 1B, C ja B).
Uriini ja uurea mõju hindamiseks peremeest otsivate ja verd imevate sääskede ellujäämisele söödeti emastele kõigi nelja vanuserühma uriiniga (värske, 24 tundi, 72 tundi ja 168 tundi pärast ladestumist) ning kontrollina kasutati erineva kontsentratsiooniga uureat, samuti destilleeritud vett ja 10% sahharoosi (joonis 2A). See ellujäämisanalüüs näitas, et dieedil oli oluline mõju üldisele ellujäämisele peremeest otsivatel emasloomadel (uriin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; uurea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; joonis 2B, C) ja verega toidetud emasloomadel (uriin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; uurea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; joonis 2D, E). Kõigis katsetes oli uriini, uurea ja vee dieediga toidetud emastel oluliselt madalam ellujäämismäär võrreldes sahharoosi dieediga toidetud emastega (joonis 2B-E). Värske ja seisnud uriiniga toidetud peremeest otsivatel emastel olid erinevad ellujäämismäärad, kusjuures 72-tunnise seisnud uriiniga toidetud emastel (p = 0,016) oli madalaim ellujäämistõenäosus (joonis 2B). Lisaks elasid 135 mM uureaga toidetud peremeest otsivad emased kauem kui veega kontrollitud kontrollrühma emased (p < 0,04) (joonis 2C). Võrreldes veega elasid värske uriini ja 24-tunnise uriiniga toidetud naised kauem (vastavalt p = 0,001 ja p = 0,012; joonis 2D), samas kui 72-tunnise uriiniga toidetud naised elasid kauem kui lühikese värske uriini ja 24-tunnise laagerdunud uriiniga toidetud naised (vastavalt p < 0,0001 ja p = 0,013; joonis 2D). 135 mM uureaga toidetud verega toidetud emased elasid kauem kui kõik muud uurea ja vee kontsentratsioonid. (p < 0,013; joonis 2E).
Lehma uriini ja karbamiidiga toituvate peremees- ja verd imevate emaste Anopheles arabinis'e ellujäämine. Biotestis (A) anti emastele sääskedele toitu, mis koosnes värskest ja laagerdunud lehma uriinist, erinevates kontsentratsioonides karbamiidist, sahharoosist (10%) ja destilleeritud veest (H2O). Peremeest otsivate (B, C) ja verd imevate (D, E) sääskede ellujäämist registreeriti iga 12 tunni järel, kuni kõik uriini (B, D) ja karbamiidi (C, E) ning kontrollrühma (sahharoos ja vesi) emased olid surnud.
Lennuveski testis 24-tunnise perioodi jooksul määratud kogukaugus ja lendude arv erines peremeest otsivate ja verd imevate sääskede vahel, kusjuures viimased näitasid üldiselt vähem lennuaktiivsust (joonis 3). Peremeest otsivad sääsed, kes pakkusid värsket ja laagerdunud uriini või sahharoosi ja vett, näitasid erinevaid lennumustreid (joonis 3), kusjuures värsket uriini söövad emased olid aktiivsemad koidikul, samas kui 24- ja 168-tunnise vanusega sääsed, kes toitusid uriinist, näitasid erinevaid lennumustreid ja tegutsesid peamiselt päevasel ajal. Emased sääsed, kes pakkusid sahharoosi või 72-tunnise uriini, näitasid aktiivsust kogu 24-tunnise perioodi jooksul, samas kui vett pakkuvad emased olid aktiivsemad perioodi keskel. Sahharoosi söövad sääsed näitasid kõrgeimat aktiivsust hilisõhtul ja varahommikul, samas kui 72-tunnise vanusega uriini söövate sääskede aktiivsus langes 24 tunni jooksul pidevalt (joonis 3).
Jahimeest otsiva verd imeva emase Anopheles arabinis'e lennusooritus, kes toitus lehma uriinist ja uureast. Lennuveski testis kinnitati värske ja laagerdunud lehma uriiniga, erineva kontsentratsiooniga uurea, sahharoosi (10%) ja destilleeritud veega (H2O) toitunud emased sääsed horisontaalsete, vabalt pöörlevate käte külge (ülal). Peremeest otsiva (vasakul) ja verd imeva (paremal) emase puhul registreeriti iga toidukorra kogupikkus ja lendude arv tunnis 24-tunnise perioodi jooksul (tume: hall; hele: valge). Keskmine kaugus ja keskmine lendude arv on näidatud ööpäevase aktiivsuse graafiku paremal pool. Vearibad tähistavad keskmise standardviga. Statistiline analüüs on esitatud tekstis.
Üldiselt järgis peremeest otsivate emaste üldine lennuaktiivsus 24-tunnise perioodi jooksul sarnast mustrit lennudistantsi omaga. Keskmist lennudistantsi mõjutas oluliselt tarbitud toit (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001) ja 72 tundi uriini tarbinud peremeest otsivad emased lendasid oluliselt pikemaid vahemaid võrreldes kõigi teiste dieetidega (p < 0,0001) ning sahharoosiga toidetud sääsed lendasid kauem kui värske (p = 0,022) ja 24 tundi laagerdunud uriiniga (p = 0,022) toidetud sääsed. Erinevalt uriinidieediga kirjeldatud lennuaktiivsuse mustrist näitasid karbamiidiga toidetud peremeest otsivad emased 24-tunnise perioodi jooksul püsivat lennuaktiivsust, saavutades haripunkti pimeda faasi teises pooles (joonis 3). Kuigi aktiivsuse mustrid olid sarnased, suurendasid karbamiidiga toidetud peremeest otsivad emased keskmist lennudistantsi oluliselt sõltuvalt neeldunud kontsentratsioonist (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Peremeest otsivad emased, keda toideti mis tahes kontsentratsiooniga uureaga, lendasid kauem kui emased, keda toideti kas veega või sahharoosiga (p < 0,03).
Vereimevate sääskede üldine lennuaktiivsus oli stabiilne ja püsis 24 tunni jooksul kõigi dieetide puhul, kusjuures uriini aktiivsus suurenes pimeda perioodi teisel poolel nii veega toidetud emasloomadel kui ka värskelt ja 24 tundi vanustel emasloomadel (pilt 3). Kuigi uriinidieet mõjutas oluliselt verega toidetud emasloomade keskmist lennudistantsi (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), ei mõjutanud uureadieet seda (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) võrreldes muu uriini ja kontrolldieediga (värske, p = 0,0091; 72 tundi, p = 0,0022; 168 tundi, p = 0,001; sahharoos, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Uriini ja karbamiidi söömise mõju reproduktiivparameetritele hinnati munade munemise biotestides (joonis 4A) ning uuriti iga emase munetud munade arvu, muna suuruse ja äsja koorunud esimese staadiumi vastsete järgi. Munetud munade arv. Uriiniga toidetud araabia emased varieerusid toitumise lõikes (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; joonis 4B). 24-tunnise uriini- ja verejahuga toidetud emased munesid oluliselt rohkem mune kui muud uriinidieeti saanud emased ning munad olid sarnased sahharoosiga toidetud emastega (joonis 4B). Samamoodi varieerus uriiniga toidetud emaste munetud munade suurus toitumise lõikes (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), kusjuures 24-tunnise uriini- ja sahharoosiga toidetud emased munesid oluliselt suuremaid mune kui veega toidetud emased, samas kui 168 tundi uriiniga toidetud emaste munad olid oluliselt väiksemad (joonis 4C). Lisaks mõjutas uriinidieet oluliselt vastsete suurust (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), kusjuures 24- ja 72-tunnise uriiniga toitunud emasloomade munetud munadest ilmusid oluliselt suuremad vastsed kui munadest, mis olid munetud vastsete poolt. Veega toitunud ja 168-tunnise uriiniga toitunud emasloomad (joonis 4D).
Lehma uriini ja karbamiidiga toituvate emaste Anopheles arabinis'e paljunemisvõime. Verega toidetud emastele sääskedele söödeti 48 tundi värsket ja laagerdunud lehma uriini, erineva kontsentratsiooniga karbamiidi, sahharoosi (10%) ja destilleeritud vett (H2O) sisaldavat dieeti, enne kui nad biotestidesse paigutati ja munemissubstraadid saadi 48 tunni jooksul (A). Munade arvu (B, E), muna suurust (C, F) ja vastsete suurust (D, G) mõjutas oluliselt pakutav toit (lehma uriin: BD; karbamiid: EG). Iga parameetri keskmised, mida mõõdeti erinevate tähtnimetustega, erinesid üksteisest oluliselt (ühesuunaline ANOVA, kasutades Tukey post hoc analüüsi; p < 0,05). Vearibad tähistavad keskmise standardviga.
Uriini peamise lämmastikkomponendina mõjutas karbamiid, kui seda manustati verega toidetud emasloomadele toiduna, kõigis uuringutes oluliselt reproduktiivparameetreid. Pärast verejahu söömist karbamiidiga söödetud emasloomade munetud munade arv sõltus karbamiidi kontsentratsioonist (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Emased, keda söödeti karbamiidi kontsentratsiooniga vahemikus 134 µM kuni 1,34 mM, munesid rohkem mune (joonis 4E). Emased, keda söödeti karbamiidi kontsentratsiooniga 134 µM või rohkem, munesid suuremaid mune kui emased, keda söödeti veega (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; joonis 4F). Vastse suurus, kuigi emasloomadel sarnane karbamiidi kontsentratsioon mõjutas seda (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), oli varieeruvam (joonis 4G).
Üldine ligitõmbavus peremeesorganismi otsivate veise uriini pearuumi lenduvate ekstraktide suhtes. Klaasist olfaktomeetriga (joonis 5A) hinnatud arabiensis'e puhul oli uriini vanus oluline mõju (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; joonis 5B). Post hoc analüüs näitas, et 24 tunni möödudes vana uriini lõhn põhjustas oluliselt suuremat ligitõmbavusastet võrreldes kõigi teiste töötlustega (72 tundi: p = 0,0060, 168 tundi: p = 0,012, pentaan: p = 0,00070), välja arvatud värske uriini lõhn (p = 0,13; joonis 5B). Kuigi verd imevate sääskede üldine ligitõmbavus uriini lõhna suhtes ei olnud oluliselt erinev (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; joonis 5C), leiti, et need emased olid pearuumi lenduvate ekstraktide suhtes oluliselt atraktiivsemad võrreldes 72 tundi vanandatud uriiniga võrreldes kontrollrühmaga (p = 0,0066; joonis 5C).
Käitumuslikud reaktsioonid looduslikele ja sünteetilistele lehma uriini lõhnadele peremeesorganismi ja verega toidetud Anopheles arabianuse otsingul. Klaasist olfaktomeetri skeem (A). Värske ja laagerdunud lehma uriini lenduvate ekstraktide ligitõmbavus peremeesorganismi (B) ja verd imevate (C) sääskede külge. Leidke Lord Ani kombitsreaktsioon. Näidatud on värskest (D), 24-tunnisest (E), 72-tunnisest (F) ja 168-tunnisest (G) laagerdunud lehma uriinist eraldatud pea ruumi ekstraktid. Elektronantenni detekteerimise (EAD) jäljed näitavad pinge muutusi vastusena gaasikromatograafist elueeritud ja leekionisatsioonidetektoriga (FID) tuvastatud pea ruumi bioaktiivsetele ühenditele. Skaalariba tähistab vastuse amplituudi (mV) retentsiooniaja (s) suhtes. Näidatud on bioloogiliselt aktiivsete ühendite omadused ja vabanemiskiirused (µg h-1). Üks tärn (*) tähistab järjepidevat madala amplituudiga vastust. Topelt tärnid (**) näitavad reprodutseerimatuid vastuseid. Leidke peremeesorganism (H) ja verd imev (I) sääskede rühm. An.arabiensis'el on värske ja vanandatud lehma uriini lõhnade sünteetiliste segude suhtes erinev ligitõmbavus. Erinevate tähtede nimede poolt ligitõmbavate sääskede keskmine osakaal oli üksteisest oluliselt erinev (ühesuunaline ANOVA, kasutades Tukey post hoc analüüsi; p < 0,05). Vearibad tähistavad skaala standardviga.
Emastel Ann.arabiensis'el kudemise ajal 72 ja 120 tundi pärast verejahu ei täheldatud värske ja laagerdunud lehma uriini pearuumi lenduvate ekstraktide eelistust võrreldes pentaankontrollrühmaga (χ2 = 3,07, p > 0,05; lisafail 1: joonis S1).
Emasloomade Ann.arabiensis puhul tuvastati GC-EAD ja GC-MS analüüsidega kaheksa, kuus, kolm ja kolm bioaktiivset ühendit (joonis 5D-G). Kuigi elektrofüsioloogilisi reaktsioone esile kutsunud ühendite arvus täheldati erinevusi, esines enamik neist ühenditest igas värskest ja laagerdunud uriinist kogutud pearuumi lenduvas ekstraktis. Seetõttu kaasati iga ekstrakti puhul edasistesse analüüsidesse ainult need ühendid, mis tekitasid emasloomade antennidelt läviväärtust ületava füsioloogilise reaktsiooni.
Bioaktiivsete ühendite kogu lenduvate ühendite vabanemiskiirus pearuumi kogumis suurenes värske uriini 29 µg h-1-lt 242 µg h-1-le 168-tunnise laagerdumisega uriinis, peamiselt p-kresooli ja m-formaldehüüdi tõttu. Fenooli ja fenooli sisalduse suurenemise tõttu seevastu teiste ühendite, näiteks 2-tsüklohekseen-1-ooni ja dekanaali vabanemiskiirus vähenes uriini vanuse kasvades, mis korreleerus kromatogrammil täheldatud signaali intensiivsuse (arvukuse) vähenemisega (joonis 5D-G, vasak paneel) ja füsioloogiliste reaktsioonidega nendele ühenditele (joonis 5D-G, parem paneel).
Üldiselt oli sünteetilisel segul sarnane bioaktiivsete ühendite loomulik suhe, mida tuvastati värske ja laagerdunud uriini peamahu lenduvates ekstraktides (joonis 5D–G), ning see ei paistnud tekitavat olulist huvi peremeesorganismi (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; joonis 5H) ega verd imevate sääskede (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; joonis 5I) otsingul. Siiski näitasid töötlustevahelised post hoc paarikaupa võrdlused, et peremeesorganismi otsivad sääsed olid 24 tundi laagerdunud uriini sünteetilise segu jaoks oluliselt atraktiivsemad võrreldes pentaankontrollrühmadega (p = 0,0086; joonis 5H).
Üksikute komponentide rolli hindamiseks 24 tundi laagerdunud uriini sünteetilistes segudes hinnati Y-toru testis kuut lahutavat segu võrreldes täisseguga, millest üksikud ühendid eemaldati. Peremeest otsivate sääskede puhul oli üksikute ühendite lahutamisel täissegust oluline mõju käitumuslikele reaktsioonidele (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; lisafail 1: joonis S2A), kõik lahutavad segud olid atraktiivsemad kui väiksemad kui täielikult segatud. Seevastu üksikute ühendite eemaldamine täissünteetilisest segust ei mõjutanud verd imevate sääskede käitumuslikke reaktsioone (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), välja arvatud dekanal, mille tulemuseks oli madalamad tasemed võrreldes täisseguga (atraktsioon) (p = 0,022; lisafail 1: joonis S2B).
Etioopia malaariaendeemilises külas hinnati kümne öö jooksul 24-tunnise lehma uriini sünteetilise segu efektiivsust sääskede ligimeelitamisel välitingimustes (joonis 6A). Kokku püüti kinni ja identifitseeriti 4861 sääske, kellest 45,7% olid Anthropus.gambiae sl, 18,9% olid Anopheles pharoensis ja 35,4% olid Culex spp. (Lisafail 1: tabel S1). Anopheles arabinis on ainus PCR-analüüsi abil identifitseeritud A.Gambia liikide kompleksi liige. Keskmiselt püüti öö kohta kinni 320 sääske, mille jooksul püüdsid sünteetilise seguga söödaga püünised rohkem sääski kui seguta paarislõksud (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Söödata püünised paigutati igal viiel kontrollööl katse alguses, keskel ja lõpus. Igas püünisepaaris püüti kinni sarnane arv sääski. mis näitab, et majapidamiste vahel ei täheldatud eelarvamust (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) ega populatsiooni vähenemist uuringuperioodil. Võrreldes kontrolllõksudega oli sünteetilise seguga püütud sääskede arv oluliselt suurenenud: peremeest otsivad sääsed (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), hiljutine verega toitmine (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) ja tiinus (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; lisafail 1: tabel S1). See kajastub ka püütud sääskede koguarvus: peremeest otsivad sääsed > verd imevad sääsed > tiine > pooltiined > isane.
24-tunnise sünteetilise lehma uriini lõhnasegu efektiivsuse välihindamine. Välikatsed viidi läbi Etioopia lõunaosas (kaart), Maki linna lähedal (lisa), kasutades haiguste tõrje ja ennetamise keskuste (CDC) valguslõksu (paremal) paarismajades, kasutades ladina ruudukujulist kujundust (õhust tehtud pilt) (A). Sünteetilised lõhnasöödaga varustatud CDC fotolõksud meelitavad ligi ja püüavad kinni emaseid Anopheles arabesques sääski (B), kuid mitte Anopheles farroes sääski (C), erinevalt, mis on füsioloogilisest seisundist sõltuv efekt. Lisaks püüdsid need püünised kinni oluliselt suurema arvu peremees-Culex sääski. (D) Võrreldes kontrollrühmaga. Vasakpoolsed tulbad tähistavad lõhnasööda (roheline) ja kontrollrühma (avatud) püüniste paarides püütud sääskede keskmist valikuindeksit (N = 10), parempoolsed tulbad aga tähistavad keskmist valikuindeksit kontrollpüüniste paarides (avatud; N = 5). Tärnid näitavad statistilise olulisuse taset (*p = 0,01 ja ***p < 0,0001).
Sünteetilisi segusid sisaldavates püünistes püüti kolme liiki erinevalt. Peremeest otsides (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), verega toimetades (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) ja tiinust otsides (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), jäi .arabiensis lõksu sünteetilist segu vabastavasse püünisesse (joonis 6B), samas kui aniini kogus ei erinenud. Leiti erinevates füsioloogilistes seisundites Pharoensis't (joonis 6C). Culexi puhul leiti sünteetilise seguga söödaks söödetud püünistes ainult olulist peremeest otsivate sääskede arvu suurenemist (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; joonis 6D) võrreldes kontrollpüünistega.
Etioopias kasutati potentsiaalsetest peremeestest väljaspool pesitsuspaikade ja maapiirkondade vahel asuvaid peremeesloomade söödapüüniseid, et hinnata, kas malaariasääsed kasutavad peremeesorganismi elupaiga vihjetena lehma uriini lõhna. Peremeesorganismi vihjete ja kuumuse puudumisel ning lehma uriini lõhna olemasolul või puudumisel ei püütud ühtegi sääske (lisafail 1: joonis S3). Kõrge temperatuuri ja lehma uriini lõhna korral meelitati emased malaariasääsed ligi ja püüti kinni, ehkki vähesel arvul, olenemata uriini vanusest (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; lisafail 1: joonis S3). Seevastu veekontrollid ei püüdnud malaariasääski kõrgel temperatuuril kinni (lisafail 1: joonis S3).
Malaariasääsed omandavad ja levitavad lämmastikku sisaldavaid ühendeid lehma uriiniga (st lompidega) kompenseeriva toitumise kaudu, et parandada elulookirjelduse omadusi, sarnaselt teiste putukatega [2, 4, 24, 25, 26]. Lehma uriin on kergesti kättesaadav taastuv ressurss, mis on tihedalt seotud malaaria vektorite puhkepaikadega, nagu lehmalaudad ja kõrge taimestik maapiirkondade kodude ja kudemispaikade lähedal. Emased sääsed leiavad selle ressursi lõhna järgi ja suudavad reguleerida lämmastikühendite omastamist uriinis, sealhulgas uurea, mis on uriini peamine lämmastikkomponent [15, 16]. Sõltuvalt emase sääse füsioloogilisest seisundist jaotuvad uriinis olevad toitained peremeest otsivate emaste sääskede lennuaktiivsuse ja ellujäämise suurendamiseks, samuti verega toidetud isendite ellujäämise ja paljunemisvõime parandamiseks esimese gonadotroopse tsükli ajal. Seetõttu mängib uriini segamine olulist toitumisalast rolli malaaria vektorite jaoks, kes on alatoitunud täiskasvanute sarnaselt suletud [8], kuna see annab emastele sääskedele võimaluse omandada olulisi lämmastikühendeid madala riskiga toitumise kaudu. Sellel leiul on olulised epidemioloogilised tagajärjed, kuna emaste eluiga, aktiivsus ja paljunemisvõime pikenevad. väljundit, mis kõik mõjutavad vektori mahtu. Lisaks võib see käitumine olla tulevaste vektorite haldamise programmide sihtmärgiks.