تتكامل عملية الحصول على العناصر الغذائية وتوزيعها بين سلوك البحث عن الطعام لدى الحشرات وخصائص دورة حياتها. وللتعويض عن نقص عناصر غذائية محددة في مراحل حياتها المختلفة، تستطيع الحشرات الحصول على هذه العناصر من خلال التغذية التكميلية، على سبيل المثال، عن طريق التغذي على إفرازات الفقاريات في عملية تُعرف باسم "التغذية على البول". ويبدو أن بعوضة الأنوفيلس العربية تعاني من سوء التغذية، وبالتالي فهي تحتاج إلى عناصر غذائية لكل من عمليات الأيض والتكاثر. وكان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم ما إذا كان تحريك بعوضة الأنوفيلس العربية على بول الأبقار للحصول على العناصر الغذائية يُحسّن من خصائص دورة حياتها.
تأكد من سلامته. انجذبت بعوضة Arabiensis إلى رائحة بول الأبقار الطازج، وبول الأبقار الذي مضى عليه 24 ساعة، و72 ساعة، و168 ساعة. وتم قياس الإناث الباحثة عن العائل والمتغذية على الدم (بعد 48 ساعة من التغذية) باستخدام جهاز قياس الشم ذي الأنبوب Y، كما تم تقييم الإناث الحوامل لاختبار التبويض. ثم استُخدم تحليل كيميائي وكهربائي فيزيولوجي مشترك لتحديد المركبات النشطة بيولوجيًا في بول الأبقار في جميع الفئات العمرية الأربع. وتم تقييم الخلائط الاصطناعية من المركبات النشطة بيولوجيًا في تجارب الأنبوب Y والتجارب الميدانية. وللتحقق من بول الأبقار ومركبه الرئيسي المحتوي على النيتروجين، اليوريا، كغذاء تكميلي محتمل لنواقل الملاريا، تم قياس معايير التغذية وخصائص دورة الحياة. وتم تقييم نسبة إناث البعوض وكمية بول الأبقار واليوريا الممتصة. وبعد التغذية، تم تقييم الإناث من حيث البقاء على قيد الحياة، والطيران المقيد، والتكاثر.
تسعى هذه الحشرات إلى الحصول على دم العائل وغذائه. في الدراسات المخبرية والميدانية، انجذبت الحشرات العربية إلى الرائحة الطبيعية والاصطناعية لبول الأبقار الطازج والقديم. لم تُبدِ الإناث الحوامل أي تأثر برائحة بول الأبقار في مواقع التكاثر. تمتص الإناث الباحثة عن العائل والماصة للدم بول الأبقار واليوريا بنشاط، وتُوزّع هذه الموارد وفقًا لمقايضات دورة حياتها، كدالة للحالة الفسيولوجية، من أجل الطيران أو البقاء أو التكاثر.
اكتساب وتوزيع بعوضة الأنوفيلة العربية لبول الأبقار لتحسين خصائص دورة حياتها. يؤثر التغذية التكميلية ببول الأبقار على قدرة الناقل بشكل مباشر عن طريق زيادة معدل البقاء اليومي وكثافة الناقل، وبشكل غير مباشر عن طريق تغيير نشاط الطيران، ولذلك ينبغي أخذ ذلك في الاعتبار في النماذج المستقبلية.
تتكامل عملية الحصول على العناصر الغذائية وتوزيعها مع خصائص البحث عن الطعام ودورة حياة الحشرات [1، 2، 3]. تستطيع الحشرات اختيار الطعام والحصول عليه، كما أنها تلجأ إلى التغذية التعويضية بناءً على توافر الغذاء واحتياجاتها من العناصر الغذائية [1، 3]. يعتمد توزيع العناصر الغذائية على دورة حياة الحشرة، وقد يؤدي إلى اختلاف متطلبات نوعية وكمية النظام الغذائي في مراحل حياتها المختلفة [1، 2]. ولتعويض نقص عناصر غذائية محددة، يمكن للحشرات الحصول عليها من خلال التغذية التكميلية، مثل التغذي على الطين، وفضلات وإفرازات الفقاريات المختلفة، والجيف، وهي عملية تُعرف باسم "البرك" [2]. على الرغم من أن أنواعًا عديدة من الفراشات والعث موصوفة بشكل أساسي، إلا أن البرك المائية موجودة أيضًا في رتب حشرية أخرى، وقد يكون للانجذاب إلى هذه الموارد والتغذي عليها آثار كبيرة على الصحة وخصائص دورة الحياة الأخرى [2، 4، 5، 6، 7]. تخرج بعوضة الملاريا، الأنوفيلس الغامبية (بالمعنى الواسع)، كحشرة بالغة تعاني من سوء التغذية [8]، لذا قد يلعب الماء دورًا مهمًا في ذلك. يلعب هذا السلوك دورًا مهمًا في خصائص دورة حياته، لكنه أُهمل حتى الآن. إن استخدام التحريك كوسيلة لزيادة تناول العناصر الغذائية في هذه الوسيلة المهمة يستحق الاهتمام، حيث قد يكون لذلك عواقب وبائية مهمة.
يُعدّ تناول النيتروجين لدى إناث بعوض الأنوفيلس البالغة محدودًا نظرًا لانخفاض مخزونها من السعرات الحرارية المُكتسبة من مرحلة اليرقة وعدم كفاءة استغلالها لوجبات الدم [9]. وعادةً ما تُعوّض إناث بعوضة الأنوفيلس الغامبية (Ann. gambiae sl) هذا النقص بتناول وجبات دم إضافية [10، 11]، مما يُعرّض المزيد من الناس لخطر الإصابة بالمرض ويُعرّض البعوض لخطر الافتراس. وبدلاً من ذلك، يُمكن للبعوض استخدام التغذية التكميلية على فضلات الفقاريات للحصول على مركبات نيتروجينية تُحسّن من قدرتها على التكيف والمناورة أثناء الطيران، كما هو مُبيّن في حشرات أخرى [2]. وفي هذا الصدد، يُعدّ الانجذاب القوي والمُميّز لأحد الأنواع الشقيقة ضمن مُركّب أنواع الأنوفيلس الغامبية (An. the Gambian sl)، وهو الأنوفيلس العربي (Anopheles arabinis)، لبول الأبقار الطازج والقديم [12، 13، 14]، أمرًا مثيرًا للاهتمام. يُعرف عن الأنوفيلس العربي (Anopheles arabinis) انتهازيته في اختيار عوائله، ومن المعروف أنه يرتبط بالماشية ويتغذى عليها. ويُعدّ بول الأبقار مصدرًا غنيًا بالمركبات النيتروجينية، حيث تُشكّل اليوريا النسبة الأكبر منه. يشكل النيتروجين ما بين 50 و95% من إجمالي النيتروجين في البول الطازج [15، 16]. ومع تقدم عمر بول الأبقار، تستخدم الكائنات الدقيقة هذه الموارد لتقليل تعقيد المركبات النيتروجينية خلال 24 ساعة [15]. ومع الزيادة السريعة في الأمونيا، المرتبطة بانخفاض النيتروجين العضوي، تزدهر الكائنات الدقيقة المحبة للقلويات (التي ينتج العديد منها مركبات سامة للبعوض) [15]، والتي قد تكون إناث بعوضة Ann.arabiensis تنجذب بشكل تفضيلي إلى البول الذي يبلغ عمره 24 ساعة أو أقل [13، 14].
في هذه الدراسة، تم البحث عن بعوضة الأنوفيلة (An. arabiensis) التي تغذت على دم مضيفها. خلال دورة الغدد التناسلية الأولى، تم تقييم قدرة الأنوفيلة على امتصاص المركبات النيتروجينية، بما في ذلك اليوريا، عن طريق مزج البول. بعد ذلك، أُجريت سلسلة من التجارب لتقييم كيفية توزيع إناث البعوض لهذا المورد الغذائي المحتمل لتحسين فرص البقاء والتكاثر ومواصلة البحث عن الطعام. أخيرًا، تم تقييم رائحة بول الأبقار الطازج والقديم لتحديد ما إذا كانت هذه الروائح توفر أدلة موثوقة لجذب الأنوفيلة التي تغذت على دم مضيفها. في بحثها عن هذا المورد الغذائي المحتمل، اكتشفت الأنوفيلة ارتباطات كيميائية وراء اختلاف جاذبيتها الملحوظ. تم تقييم مخاليط الروائح الاصطناعية للمركبات العضوية المتطايرة (VOCs) التي تم تحديدها في بول عمره 24 ساعة في ظروف ميدانية، مما وسّع النتائج التي تم الحصول عليها في ظروف المختبر وأظهر تأثير رائحة بول الأبقار على مختلف الحالات الفسيولوجية. تؤكد النتائج التي تم الحصول عليها أن الأنوفيلة... يكتسب البعوض من نوع Arabiensis ويوزع المركبات النيتروجينية الموجودة في بول الفقاريات للتأثير على خصائص دورة حياته. وتتم مناقشة هذه النتائج في سياق العواقب الوبائية المحتملة وكيفية استخدامها في مراقبة النواقل ومكافحتها.
تمت تربية بعوضة الأنوفيلة العربية (سلالة دونغولا) عند درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 65 ± 5%، ودورة ضوئية/مظلمة 12:12 ساعة. رُبّيت اليرقات في صوانٍ بلاستيكية (20 سم × 18 سم × 7 سم) مملوءة بالماء المقطر، وغُذيت بعلف أسماك Tetramin® (شركة Tetra Werke، ميل، ألمانيا). جُمعت العذارى في أكواب سعة 30 مل (شركة Nolato Hertila، أستورب، السويد)، ثم نُقلت إلى أقفاص Bugdorm (30 سم × 30 سم × 30 سم؛ شركة MegaView Science، تايتشونغ، تايوان) للسماح بظهور الحشرات البالغة. وُفرت للحشرات البالغة محلول سكروز بنسبة 10% حسب الحاجة حتى 4 أيام بعد الظهور، وعندها قُدم الغذاء للإناث الباحثة عن العائل مباشرة قبل التجربة، أو جُوّعت طوال الليل بالماء المقطر قبل التجربة، كما هو موضح أدناه. في تجارب أنابيب الطيران، تم تجويع البعوض لمدة 4-6 ساعات فقط مع توفير الماء له بحرية. ولتحضير البعوض الماص للدم للاختبارات البيولوجية اللاحقة، تم تزويد إناث عمرها 4 أيام بعد الإخصاب بدم أغنام منزوع التليف (Håtunalab، برو، السويد) باستخدام نظام تغذية غشائي (Hemotek Discovery Workshops، أكرينغتون، المملكة المتحدة). ثم نُقلت الإناث المحتقنة بالكامل إلى أقفاص فردية ووُفر لها الغذاء مباشرة، كما هو موضح أدناه، أو محلول سكروز بنسبة 10% بحرية لمدة 3 أيام قبل التجارب الموضحة أدناه. استُخدمت الإناث الأخيرة في اختبارات أنابيب الطيران البيولوجية ونُقلت إلى المختبر، ثم أُتيح لها الماء المقطر بحرية لمدة 4-6 ساعات قبل التجربة.
استُخدمت اختبارات التغذية لتحديد كمية استهلاك البول واليوريا لدى إناث البعوضة العربية البالغة. تم تزويد الإناث الباحثة عن العائل والمتغذية على الدم بنظام غذائي يحتوي على 1% من بول البقر الطازج والمُعتق المخفف، وتركيزات مختلفة من اليوريا، وعينتين ضابطتين (10% سكروز وماء) لمدة 48 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، أُضيف مُلوّن غذائي (1 ملغم/مل من سيانيد الزيلين FF؛ CAS 2650-17-1؛ سيغما-ألدريتش، ستوكهولم، السويد) إلى النظام الغذائي ووُضع في مصفوفة 4 × 4 في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 250 ميكرولتر (أكسجين ساينتيفيك، يونيون سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة؛ الشكل 1أ). املأ الأنابيب حتى الحافة (~300 ميكرولتر). لتجنب التنافس بين البعوض والتأثيرات المحتملة للون الصبغة، وُضع 10 بعوضات في طبق بتري كبير (قطره 12 سم وارتفاعه 6 سم؛ سيماديني، أوسترمونديجن، سويسرا؛ الشكل 1أ) في وعاء كامل تم وضع البعوض في الظلام عند درجة حرارة 25 ± 2 سم ورطوبة نسبية 65 ± 5%. تم تكرار هذه التجارب من 5 إلى 10 مرات. بعد تعريض البعوض للنظام الغذائي، تم وضعه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى إجراء المزيد من التحليلات.
ابحث عن بول الأبقار واليوريا التي امتصتها أنثى بعوضة الأنوفيلة العربية (Anopheles arabianus) المضيفة والماصة للدم. في تجربة التغذية (أ)، تم تزويد إناث البعوض بنظام غذائي يتكون من بول أبقار طازج وقديم، وتركيزات مختلفة من اليوريا، والسكروز (10%)، والماء المقطر (H2O). امتصت الإناث الباحثة عن المضيف (ب) والمتغذية على الدم (ج) كمية أكبر من السكروز مقارنة بأي نظام غذائي آخر تم اختباره. لاحظ أن الإناث الباحثة عن المضيف امتصت بول الأبقار لمدة 72 ساعة أقل من بول الأبقار لمدة 168 ساعة (ب). يُمثل الشكل المُدرج متوسط ​​محتوى النيتروجين الكلي (± الانحراف المعياري) في البول. تمتص الإناث الباحثة عن المضيف (د، و) والماصة للدم (هـ، ز) اليوريا بطريقة تعتمد على الجرعة. كان متوسط ​​أحجام الاستنشاق (د، هـ) ذات الأسماء الحرفية المختلفة مختلفًا بشكل كبير عن بعضها البعض (تحليل التباين أحادي الاتجاه باستخدام تحليل Tukey اللاحق؛ p < 0.05). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري لـ المتوسط ​​(BE). يمثل الخط المتقطع المستقيم خط الانحدار اللوغاريتمي الخطي (F، G)
لتحرير الغذاء الممتص، وُضعت البعوضات بشكل فردي في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مل تحتوي على 230 ميكرولتر من الماء المقطر، ثم فُتِّت النسيج باستخدام مدقة ومحرك لاسلكي للاستخدام مرة واحدة (VWR International، لوند، السويد)، تلاها الطرد المركزي بسرعة 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. نُقل 200 ميكرولتر من السائل الطافي إلى صفيحة ميكروية ذات 96 بئرًا (Sigma-Aldrich)، وحُدِّد الامتصاص (λ620) باستخدام قارئ صفائح ميكروية قائم على مطياف ضوئي (SPECTROStar® Nano، BMG Labtech، أورتنبرغ، ألمانيا). بدلاً من ذلك، طُحنت البعوضات في 1 مل من الماء المقطر، ونُقل 900 ميكرولتر منها إلى خلية قياس للتحليل الطيفي الضوئي (λ620 نانومتر؛ UV 1800، Shimadzu، كيستا، السويد). ولتحديد كمية الغذاء المتناول، أُعدَّ منحنى قياسي من خلال سلسلة من التجارب. تم تخفيف المحلول للحصول على 0.2 ميكرولتر إلى 2.4 ميكرولتر من سيانيد الزيلين بتركيز 1 ملغم/مل. ثم تم استخدام الكثافة الضوئية لتركيزات الصبغة المعروفة لتحديد كمية الطعام التي تناولتها كل بعوضة.
تم تحليل بيانات الحجم باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعًا بمقارنات Tukey الزوجية اللاحقة (JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS، كاري، كارولاينا الشمالية، الولايات المتحدة الأمريكية، 1989-2007). وصفت تحليلات الانحدار الخطي تناول اليوريا المعتمد على التركيز وقارنت الاستجابات بين البعوض الباحث عن المضيف والبعوض الماص للدم (GraphPad Prism الإصدار 8.0.0 لنظام التشغيل Mac، GraphPad Software، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم ربط ما يقارب 20 ميكرولتر من عينات البول من كل فئة عمرية بمادة كروموسورب® W/AW (10 ملغ، 80/100 مش، سيجما ألدريتش) وتغليفها في كبسولات قصديرية (8 مم × 5 مم). أُدخلت الكبسولات في غرفة احتراق محلل CHNS/O (فلاش 2000، ثيرمو فيشر ساينتيفيك، والتهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد محتوى النيتروجين في البول الطازج والقديم وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد كمية النيتروجين الكلي (غ نيتروجين/لتر) بناءً على تركيزات اليوريا المعروفة المستخدمة كمعيار.
لتقييم تأثير النظام الغذائي على بقاء إناث البعوض الباحثة عن العائل والماصة للدم، وُضعت كل أنثى على حدة في أطباق بتري كبيرة (قطرها 12 سم وارتفاعها 6 سم؛ سيماديني) مزودة بفتحة مغطاة بشبكة في الغطاء (قطرها 3 سم) للتهوية وتوفير الغذاء. قُدّمت الأنظمة الغذائية مباشرة بعد 4 أيام من التعرض، وشملت 1% من بول البقر الطازج والقديم المخفف، وأربعة تراكيز من اليوريا، وعينتين ضابطتين: 10% من السكروز والماء. وُضعت كل وجبة غذائية على سدادة أسنان (DAB Dental AB، أوبلاندس فازبي، السويد) مُدخلة في محقنة سعة 5 مل (Thermo Fisher Scientific، غوتنبرغ، السويد)، ثم أُزيل المكبس ووُضعت فوق طبق بتري (الشكل 1). 1أ) غيّر نظامك الغذائي يوميًا. حافظ على المختبر كما هو موضح أعلاه. تم عدّ البعوض الناجي مرتين يوميًا، بينما تم التخلص من البعوض الميت حتى نفوق آخر بعوضة (ن = 40 لكل تم تحليل معدل بقاء البعوض الذي تغذى على أنظمة غذائية مختلفة إحصائيًا باستخدام منحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة واختبارات الرتبة اللوغاريتمية لمقارنة توزيع البقاء على قيد الحياة بين الأنظمة الغذائية (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
مطحنة حشرات طائرة مصممة خصيصًا، مستوحاة من تصميم أتيسانو وآخرون [17]، مصنوعة من ألواح أكريليك شفافة بسماكة 5 مم (عرض 10 سم × طول 10 سم × ارتفاع 10 سم) بدون ألواح أمامية وخلفية (الشكل 3: أعلى). تتكون من محور دوران مزود بأنبوب رأسي مصنوع من عمود كروماتوغرافيا غازية (قطر داخلي 0.25 مم؛ طول 7.5 سم) مثبت طرفاه بإبرة حشرات معلقة بين مغناطيسين من النيوديميوم يفصل بينهما 9 سم. يقسم أنبوب أفقي مصنوع من نفس المادة (طول 6.5 سم) الأنبوب الرأسي إلى نصفين، ويشكل ذراعًا مربوطًا وذراعًا آخر يحمل قطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم كإشارة لقطع الضوء.
تم إعطاء إناث البعوض التي جُوعت لمدة 24 ساعة النظام الغذائي المذكور أعلاه لمدة 30 دقيقة قبل تقييدها. بعد ذلك، تم تخدير إناث البعوض التي تغذت بالكامل بشكل فردي على الجليد لمدة 2-3 دقائق، ثم تم تثبيتها على دبابيس حشرات باستخدام شمع العسل (Joel Svenssons Vaxfabrik AB، مونكا ليونغبي، السويد)، ثم تم ربطها بأذرع الأنابيب الأفقية. تم تسجيل عدد الدورات لكل رحلة بواسطة مسجل بيانات مصمم خصيصًا، ثم تم تخزينها وعرضها باستخدام برنامج PC-Lab 2000™ (الإصدار 4.01؛ Velleman، غافير، بلجيكا). وُضع جهاز الطيران في غرفة مُنظمة المناخ (12 ساعة ضوء: 12 ساعة ظلام، 25 ± 2 درجة مئوية، 65 ± 5% رطوبة نسبية).
لتوضيح نمط نشاط الطيران، حُسبت المسافة الإجمالية المقطوعة (بالمتر) وإجمالي عدد مرات الطيران المتتالية في الساعة على مدار 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، قُورنت متوسطات المسافات التي قطعتها الإناث بين المعاملات المختلفة، وحُللت باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) وتحليل توكي اللاحق (JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS)، حيث اعتُبر متوسط ​​المسافة متغيرًا تابعًا، بينما كانت المعاملة عاملًا مستقلًا. علاوة على ذلك، حُسب متوسط ​​عدد الدورات بزيادات قدرها 10 دقائق.
لتقييم تأثير النظام الغذائي على الأداء التناسلي لبعوضة الأنوفيلة العربية، تم نقل ست إناث (4 أيام بعد التفقيس) مباشرة إلى أقفاص Bugdorm (30 سم × 30 سم × 30 سم) بعد جمع الدم، ثم تم تزويدها بالنظام الغذائي التجريبي لمدة 48 ساعة كما هو موضح أعلاه. بعد ذلك، تم إزالة الأنظمة الغذائية، وتم توفير أكواب التفقيس (30 مل؛ نولاتو هيرتيلا) مملوءة بـ 20 مل من الماء المقطر في اليوم الثالث لمدة 48 ساعة، مع تغييرها كل 24 ساعة. كرر كل نظام غذائي من 20 إلى 50 مرة. تم عد البيض وتسجيله لكل قفص تجريبي. تم استخدام عينات فرعية من البيض لتقييم متوسط ​​حجم وطول البيض الفردي (n ≥ 200 لكل نظام غذائي) باستخدام مجهر Dialux-20 (DM1000؛ إرنست لايتز ويتزلار، ويتزلار، ألمانيا) مزود بكاميرا لايكا (DFC) 320 R2؛ (شركة لايكا مايكروسيستمز المحدودة، ألمانيا). تم الاحتفاظ بالبيض المتبقي في غرفة يتم التحكم في مناخها في ظل ظروف تربية قياسية لمدة 24 ساعة، وتم قياس عينة فرعية من يرقات الطور الأول حديثة الظهور (عددها 200 يرقة أو أكثر لكل نظام غذائي)، كما هو موضح أعلاه. تمت مقارنة عدد البيض وحجم البيض واليرقات بين المعاملات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه وتحليل توكي اللاحق (JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS).
تم جمع المركبات العضوية المتطايرة من الهواء العلوي لعينات بول طازجة (بعد ساعة واحدة من أخذ العينة)، وعينات بول مُعتّقة لمدة 24 ساعة، و72 ساعة، و168 ساعة، من أبقار الزيبو من سلالة أرسي. ولتسهيل العملية، جُمعت عينات البول في الصباح الباكر بينما كانت الأبقار لا تزال في الحظيرة. جُمعت عينات البول من 10 أبقار، ونُقل 100-200 مل من كل عينة إلى أكياس خبز فردية من البولي أميد (Toppits Cofresco، Frischhalteprodukte GmbH and Co.، ميندن، ألمانيا) في براميل بلاستيكية من البولي أميد سعة 3 لترات مزودة بغطاء، داخل براميل بلاستيكية من كلوريد الفينيل. جُمعت المركبات العضوية المتطايرة من الهواء العلوي لكل عينة بول من الأبقار إما مباشرة (طازجة) أو بعد نضجها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، و72 ساعة، و168 ساعة، أي أن كل عينة بول كانت تمثل كل فئة عمرية.
لجمع المواد المتطايرة في الحيز العلوي، استُخدم نظام ذو حلقة مغلقة لتدوير تيار غاز مُرشَّح بالكربون المنشط (100 مل/دقيقة) عبر كيس من البولي أميد إلى عمود الامتزاز لمدة ساعتين ونصف باستخدام مضخة تفريغ غشائية (KNF Neuberger، فرايبورغ، ألمانيا). وللمقارنة، جُمعت المواد المتطايرة من الحيز العلوي من كيس بولي أميد فارغ. صُنع عمود الامتزاز من أنبوب تفلون (5.5 سم × 3 مم قطر داخلي) يحتوي على 35 ملغ من مادة Porapak Q (50/80 مش؛ Waters Associates، ميلفورد، ماساتشوستس، الولايات المتحدة) بين سدادات من الصوف الزجاجي. قبل الاستخدام، غُسل العمود بـ 1 مل من الهكسان العادي المُعاد تقطيره (Merck، دارمشتات، ألمانيا) و1 مل من البنتان (مذيب نقي بنسبة 99.0%، درجة GC، Sigma Aldrich). جرى استخلاص المواد المتطايرة الممتزة باستخدام 400 ميكرولتر من البنتان. تم تجميع عينات الفراغ العلوي ثم تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى استخدامها لمزيد من التحليل.
تم تحليل الاستجابات السلوكية لبعوضة الأنوفيلس الباحثة عن العائل والمتغذية على الدم. تم جمع مستخلصات المركبات العضوية المتطايرة من الهواء العلوي من بول طازج، وبول مُعتق لمدة 24 ساعة، و72 ساعة، و168 ساعة، وذلك باستخدام جهاز قياس الشم الأنبوبي الزجاجي المستقيم [18]. أُجريت التجارب خلال الفترة ZT 13-15، وهي ذروة نشاط البحث عن العائل لدى بعوضة الأنوفيلس [19]. تم إضاءة جهاز قياس الشم الأنبوبي الزجاجي (80 سم × 9.5 سم قطر داخلي) بضوء أحمر بقوة 3 ± 1 لوكس من الأعلى. مر تيار هواء مُرشح بالفحم ومرطب (25 ± 2 درجة مئوية، 65 ± 2% رطوبة نسبية) عبر جهاز القياس الحيوي بسرعة 30 سم/ثانية. يمر الهواء عبر سلسلة من الشاشات الشبكية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، مما يُنشئ تدفقًا صفائحيًا وبنية دخان موحدة. موزع سدادات الأسنان (4 سم × تم تعليق جهاز قياس الشم (DAB Dental AB) من ملف طوله 5 سم في الطرف المواجه للريح، مع تغيير المحفز كل 5 دقائق. وللتحليل، استُخدم 10 ميكرولتر من كل مستخلص فراغي، مخفف بنسبة 1:10، كمحفز. واستُخدمت كمية مماثلة من البنتان كعنصر تحكم. وُضعت البعوضات الباحثة عن العائل أو الماصة للدم بشكل فردي في أقفاص إطلاق فردية قبل 2-3 ساعات من بدء التجربة. وُضع قفص الإطلاق على الجانب المواجه للريح من جهاز قياس الشم، وسُمح للبعوض بالتأقلم لمدة دقيقة واحدة، ثم فُتح صمام الفراشة في القفص للإطلاق. تم تحليل الانجذاب إلى المعالجة أو عنصر التحكم كنسبة البعوض الذي لامس المصدر في غضون 5 دقائق من الإطلاق. تم تكرار كل مستخلص متطاير فراغي وعنصر تحكم 30 مرة على الأقل، ولتجنب تأثيرات أي يوم واحد، تم اختبار نفس عدد المعالجات وعناصر التحكم في كل يوم تجريبي. تم تحليل الاستجابات من المضيف والمتغذّي على الدم Ans.Arabic مقابل مجموعات headspace باستخدام الانحدار اللوجستي الاسمي متبوعًا بمقارنات زوجية لنسب الأرجحية (JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS).
استجابة التكاثر لدى أنثى الضفدع. تم تحليل مستخلصات الفراغ العلوي من بول الأبقار الطازج والقديم في أقفاص Bugdorm (30 سم × 30 سم × 30 سم؛ MegaView Science). وُضعت أكواب بلاستيكية (30 مل؛ Nolato Hertila) مملوءة بـ 20 مل من الماء المقطر كركيزة للتكاثر، في زاويتين متقابلتين من القفص، بمسافة 24 سم بينهما. تم تعديل أكواب المعالجة بإضافة 10 ميكرولتر من كل مستخلص فراغ علوي بتخفيف 1:10. استُخدمت كمية مماثلة من البنتان لتعديل كوب التحكم. تم تبديل أكواب المعالجة والتحكم بين كل تجربة للتحكم في تأثيرات الموقع. تم إطلاق عشر إناث مُغذّاة بالدم في أقفاص التجارب في الفترة الزمنية ZT 9-11، وتم عدّ البيض في الأكواب بعد 24 ساعة. صيغة حساب مؤشر التكاثر هي: (عدد البيض الموضوع في كوب المعالجة - عدد البيض الموضوع في كوب التحكم) / (إجمالي عدد البيض الموضوع). تم تكرار كل معالجة. 8 مرات.
تم إجراء تحليل كروماتوغرافي الغاز والكشف عن نمط هوائي الإلكترون (GC-EAD) لإناث البعوضة An.arabiensis كما هو موضح سابقًا [20]. باختصار، تم فصل مستخلصات الهواء المتطايرة الطازجة باستخدام جهاز Agilent Technologies 6890 GC (سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة) المزود بعمود HP-5 (30 م × 0.25 مم قطر داخلي، 0.25 ميكرومتر سمك الغشاء، Agilent Technologies). وتم استخدام الهيدروجين كمرحلة متحركة بمعدل تدفق خطي متوسط ​​قدره 45 سم/ثانية. حُقنت كل عينة (2 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية في وضع الحقن بدون تجزئة عند درجة حرارة مدخل تبلغ 225 درجة مئوية. تمت برمجة درجة حرارة فرن جهاز كروماتوغرافيا الغاز من 35 درجة مئوية (مع تثبيت لمدة 3 دقائق) إلى 300 درجة مئوية (مع تثبيت لمدة 10 دقائق) بمعدل 10 درجات مئوية/دقيقة. في مقسم ناتج جهاز كروماتوغرافيا الغاز، أُضيف 4 رطل/بوصة مربعة من النيتروجين وقُسم بنسبة 1:1 في وصلة Gerstel 3D/2 ذات الحجم الميت المنخفض (Gerstel، مولهايم، ألمانيا) بين كاشف التأين اللهبي وجهاز الكشف الكهروكيميائي. مُرِّر أنبوب الشعيرة الخارج من جهاز كروماتوغرافيا الغاز لجهاز الكشف الكهروكيميائي عبر خط نقل Gerstel ODP-2، الذي يتتبع درجة حرارة فرن جهاز كروماتوغرافيا الغاز زائد 5 درجات مئوية، إلى أنبوب زجاجي (10 سم × 8 مم)، حيث مُزج مع هواء مُرطب مُرشَّح بالكربون (1.5 لتر). min−1). تم وضع الهوائي على بعد 0.5 سم من مخرج الأنبوب. كل بعوضة فردية مثلت تكرارًا واحدًا، وبالنسبة للبعوض الباحث عن المضيف، تم إجراء ثلاثة تكرارات على الأقل على عينات البول لكل عمر.
تم تحديد المركبات النشطة بيولوجيًا في عينات بول الأبقار الطازجة والقديمة باستخدام جهاز كروماتوغرافيا الغاز ومطياف الكتلة (GC-MS؛ 6890 GC و5975 MS؛ من شركة Agilent Technologies) لاستثارة استجابات قرون الاستشعار في تحليل GC-EAD، وذلك باستخدام وضع التأين بالصدم الإلكتروني عند 70 إلكترون فولت. زُوّد جهاز GC بعمود شعري من السيليكا المنصهرة المطلي بـ HP-5MS UI (طول 60 مترًا × قطر داخلي 0.25 ملم، وسماكة طبقة 0.25 ميكرومتر) باستخدام الهيليوم كمرحلة متحركة بمعدل تدفق خطي متوسط ​​قدره 35 سم/ثانية. حُقنت عينة بحجم 2 ميكرولتر باستخدام نفس إعدادات الحاقن ودرجة حرارة الفرن المستخدمة في تحليل GC-EAD. تم تحديد المركبات بناءً على زمن احتجازها (مؤشر كوفات) وأطياف كتلتها مقارنةً بالمكتبة المخصصة ومكتبة NIST14 (من شركة Agilent). تم تأكيد المركبات المحددة بحقن معايير أصلية. (الملف الإضافي 1: الجدول S2). لأغراض التحديد الكمي، تم حقن أسيتات الهيبتيل (10 نانوغرام، 99.8% نقاء كيميائي، Aldrich) كمعيار خارجي.
تم تقييم فعالية مزيج رائحة اصطناعي يتكون من مركبات نشطة بيولوجيًا تم تحديدها في البول الطازج والقديم لجذب بعوضة الأنوفيلة العربية (Ans. arabiensis) الباحثة عن العائل والماصة للدم، باستخدام نفس جهاز قياس الشم والبروتوكول المذكور أعلاه. حاكت الخلائط الاصطناعية تركيب ونسب المركبات في مستخلصات المركبات المتطايرة من الفراغ العلوي المختلط للبول الطازج، والبول القديم لمدة 24 ساعة، و48 ساعة، و72 ساعة، و168 ساعة (الشكل 5D-G؛ الملف الإضافي 1: الجدول S2). للتحليل، استخدم 10 ميكرولتر من تخفيف 1:100 للمزيج الاصطناعي بالكامل، بمعدل إطلاق إجمالي يتراوح من 140 إلى 2400 نانوغرام/ساعة تقريبًا، لتقييم جاذبيته للعائل والبعوض الماص للدم. بعد ذلك، يتم إجراء الاختبار على الخلائط الكاملة، حيث تتم إزالة الخلائط الطرحية للمركبات الفردية من المزيج الكامل. يتم البحث عن استجابات من بعوضة الأنوفيلة العربية (Ans. arabiensis) المضيفة والمتغذية على الدم مقابل المزيج الاصطناعي. تم تحليل الخلائط الطرحية باستخدام الانحدار اللوجستي الاسمي متبوعًا بمقارنات زوجية لنسب الأرجحية (JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS).
لتقييم ما إذا كان بول الأبقار يُمكن أن يُشير إلى وجود عائل للبعوض الناقل للملاريا، تم جمع بول أبقار طازج وقديم، كما هو موضح سابقًا، مع الماء، ووضعت هذه العينات في دلاء شبكية سعة 3 لترات (100 مل) ووضعت في مصائد طُعم مُخصصة للعائل. (إصدار BG-HDT؛ شركة BioGents، ريغنسبورغ، ألمانيا). وُضعت عشر مصائد على بُعد 50 مترًا من بعضها في مرعى، على بُعد 400 متر من قرية (سيلاي، إثيوبيا، 5°53´24´´ شمالًا، 37°29´24´´ شرقًا) خالية من الماشية، في مناطق تكاثر دائمة وقرى. ​​تم تسخين خمس مصائد لمحاكاة وجود عائل، بينما تُركت الخمس الأخرى دون تسخين. يتم تغيير موقع كل معالجة ليلًا لمدة خمس ليالٍ. تمت مقارنة أعداد البعوض التي تم اصطيادها في المصائد المُطعّمة ببول من أعمار مختلفة باستخدام الانحدار اللوجستي مع توزيع بيتا ذي الحدين (برنامج JMP Pro، الإصدار 14.0.0، معهد SAS).
في قرية موبوءة بالملاريا بالقرب من مدينة ماكي، في إقليم أوروميا، إثيوبيا (8° 11′ 08″ شمالاً، 38° 81′ 70″ شرقاً؛ الشكل 6أ). أُجريت الدراسة بين منتصف أغسطس ومنتصف سبتمبر قبل الرش المتبقي السنوي داخل المنازل، بالتزامن مع موسم أمطار طويل. تم اختيار خمسة أزواج من المنازل (بمسافة 20-50 متراً بينها) تقع على أطراف القرية للدراسة (الشكل 6أ). شملت معايير اختيار المنازل ما يلي: عدم السماح بدخول الحيوانات إلى المنزل، وعدم السماح بالطهي داخل المنزل (باستخدام الحطب أو الفحم) (على الأقل خلال فترة التجربة)، وأن لا يزيد عدد سكان المنزل عن شخصين، وأن يناموا في منازل غير معالجة بالمبيدات الحشرية. تحت الناموسية المعالجة. تمت الموافقة الأخلاقية من قبل مجلس مراجعة أخلاقيات البحث المؤسسي (IRB/022/2016) التابع لكلية العلوم الطبيعية (CNS-IRB) بجامعة أديس أبابا، وفقًا للمبادئ التوجيهية التي وضعها إعلان هلسنكي الصادر عن الجمعية الطبية العالمية. تم الحصول على موافقة كل رب أسرة بمساعدة موظفي التوعية الصحية. العملية برمتها معتمدة من قبل الإدارات المحلية على مستوى المقاطعة والحي (الكيبيل). اتبع التصميم التجريبي تصميم المربع اللاتيني 2 × 2، حيث تم تخصيص الخلطات الاصطناعية ومجموعات التحكم للمنازل المزدوجة في الليلة الأولى، ثم تم تبديلها بين المنازل في الليلة التجريبية التالية. تكررت هذه العملية عشر مرات. بالإضافة إلى ذلك، ولتقدير نشاط البعوض في منازل مختارة، تم ضبط مصائد مركز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) للعمل لمدة خمس ليالٍ متتالية في بداية ومنتصف ونهاية التجربة الميدانية في نفس الوقت من اليوم.
تم إذابة مزيج اصطناعي يحتوي على ستة مركبات نشطة بيولوجيًا في الهبتان (97.0% مذيب من الدرجة المستخدمة في كروماتوغرافيا الغاز، من شركة سيجما ألدريتش) وإطلاقه بمعدل 140 نانوغرام/ساعة باستخدام موزع فتيل قطني [20]. سمح موزع الفتيل بإطلاق جميع المركبات بنسب ثابتة طوال فترة التجربة التي استمرت 12 ساعة. استُخدم الهبتان كعنصر تحكم. عُلّقت القارورة بجوار نقطة دخول مصيدة الضوء التابعة لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) (شركة جون دبليو هوك، غينزفيل، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية؛ الشكل 6أ). عُلّقت المصائد على ارتفاع 0.8 - 1 متر فوق سطح الأرض، بالقرب من أسفل السرير، ونام متطوع تحت ناموسية غير معالجة، وشغّل المصيدة بين الساعة 6:00 مساءً و6:30 صباحًا. خضعت البعوضات التي تم اصطيادها، مصنفة حسب الجنس والحالة الفسيولوجية (غير متغذية، متغذية، شبه حامل، وحامل) [21]، لفحص لاحق باستخدام تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد النوع. تم تحديدها مورفولوجيًا على أنها من نوع البعوضة الأنوفيلية الغامبية (Anopheles gambiae sl.)، وهي من أعضاء المجموعة [23]. في الدراسة الميدانية، تم تحليل نصب الفخاخ في المنازل المزدوجة باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي الاسمي، حيث كان عامل الجذب هو المتغير التابع، والمعالجة (مزيج اصطناعي مقابل المجموعة الضابطة) هي التأثير الثابت (JMP® 14.0.0، معهد SAS). نعرض هنا قيم χ² وقيم p من اختبار نسبة الاحتمال.
تم تقييم مدى أمانه. تمكنت ذبابة الفاكهة العربية (Arabiensis) من الحصول على البول، وهو مصدرها الرئيسي للنيتروجين، اليوريا، عن طريق التغذية المباشرة، في غضون 48 ساعة من إعطائها لمدة 4 أيام بعد تجارب تغذية الإناث الباحثة عن العائل والمتغذية على الدم (الشكل 1أ). امتصت كلتا المجموعتين من الإناث، الباحثة عن العائل والمتغذية على الدم، كمية أكبر بكثير من السكروز مقارنة بأي نظام غذائي آخر أو الماء (F(5,426) = 20.15، p < 0.0001 و F(5,299) = 56.00، p < 0.0001، على التوالي؛ الشكل 1ب، ج). علاوة على ذلك، تناولت الإناث الباحثة عن العائل كمية أقل من الطعام في البول بعد 72 ساعة مقارنة بالبول بعد 168 ساعة (الشكل 1ب). عند تقديم نظام غذائي يحتوي على اليوريا، امتصت الإناث الباحثة عن العائل كمية أكبر بكثير من اليوريا عند تركيز 2.69 ملي مولار مقارنة بجميع التركيزات الأخرى والماء، بينما لم يكن بالإمكان تمييزها عن 10% سكروز (F(10,813) = 15.72، p < 0.0001؛ الشكل 1D). يتناقض هذا مع استجابة الإناث اللاتي تغذىْنَ على الدم، واللاتي امتصمن عادةً كميات أكبر بكثير من الأنظمة الغذائية المحتوية على اليوريا مقارنةً بالماء، وإن كانت أقل بكثير من 10% سكروز (F(10,557) = 78.35، p < 0.0001؛ الشكل 1E). علاوة على ذلك، عند المقارنة بين الحالتين الفسيولوجيتين، امتصت الإناث اللاتي خضعنَ لعملية سحب الدم كمية أكبر من اليوريا مقارنةً بالإناث اللاتي يبحثنَ عن العائل عند أدنى التركيزات، وامتصت هذه الإناث كميات مماثلة من اليوريا عند التركيزات الأعلى (F(1,953) = 78.82، p < 0.0001؛ الشكل 1F، G). في حين بدا أن تناول اليوريا من نظام غذائي يحتوي على اليوريا له قيم مثالية (الشكل 1D، E)، فإن الإناث في كلتا الحالتين تمكنت الحالات الفيزيولوجية من تعديل كمية اليوريا الممتصة على كامل نطاق تركيزات اليوريا بطريقة لوغاريتمية خطية (الشكل 1F، G). وبالمثل، يبدو أن البعوض يتحكم في امتصاصه للنيتروجين عن طريق تنظيم كمية البول الممتصة، حيث تنعكس كمية النيتروجين في البول في الكمية الممتصة (الشكل 1B، C والأجزاء الداخلية B).
لتقييم تأثير البول واليوريا على بقاء البعوض الباحث عن العائل والماص للدم، تم تغذية الإناث ببول من جميع الأعمار الأربعة (طازج، 24 ساعة، 72 ساعة، و168 ساعة بعد الإفراز) ومجموعة من تراكيز اليوريا، بالإضافة إلى الماء المقطر ومحلول السكروز بنسبة 10% كمجموعة ضابطة (الشكل 2أ). أظهر تحليل البقاء هذا أن النظام الغذائي كان له تأثير كبير على البقاء الكلي للإناث الباحثة عن العائل (البول: χ² = 108.5، df = 5، p < 0.0001؛ اليوريا: χ² = 122.8، df = 5، p < 0.0001؛ الشكل 2ب، ج) والإناث المتغذية على الدم (البول: χ² = 93.0، df = 5، p < 0.0001؛ اليوريا: χ² = 137.9، (df ​​= 5، p < 0.0001؛ الشكل 2D، E). في جميع التجارب، كانت معدلات بقاء الإناث اللاتي تغذين على نظام غذائي من البول واليوريا والماء أقل بكثير مقارنةً بالإناث اللاتي تغذين على نظام غذائي من السكروز (الشكل 2B-E). أظهرت الإناث الباحثات عن العائل اللاتي تغذين على بول طازج وبول قديم معدلات بقاء مختلفة، حيث كانت الإناث اللاتي تغذين على بول قديم لمدة 72 ساعة (p = 0.016) لديهن أدنى احتمال للبقاء (الشكل 2B). علاوة على ذلك، عاشت الإناث الباحثات عن العائل اللاتي تغذين على 135 ملي مول من اليوريا لفترة أطول من مجموعة التحكم التي تغذت على الماء (p < 0.04) (الشكل 2C). مقارنةً بالماء، عاشت الإناث اللاتي تغذين على بول طازج وبول قديم لمدة 24 ساعة لفترة أطول (p = 0.001 و p = 0.012 على التوالي؛ الشكل 2D)، بينما عاشت الإناث اللاتي تغذين على بول قديم لمدة 72 ساعة لفترة أطول من الإناث اللاتي تغذين على بول طازج قصير وبول قديم لمدة 24 ساعة (p < 0.0001). و p = 0.013 على التوالي؛ الشكل 2D). عند تغذية الإناث التي تغذت على 135 مليمول من اليوريا، عاشت الإناث التي تغذت على الدم لفترة أطول من جميع التركيزات الأخرى لليوريا والماء (p < 0.013؛ الشكل 2E).
بقاء إناث بعوضة الأنوفيلس أرابينيس المضيفة والماصة للدم عند تغذيتها على بول الأبقار واليوريا. في التجربة البيولوجية (أ)، تم تزويد إناث البعوض بنظام غذائي يتكون من بول أبقار طازج وقديم، وتراكيز مختلفة من اليوريا، والسكروز (10%)، والماء المقطر (H2O). تم تسجيل بقاء البعوض الباحث عن المضيف (ب، ج) والماص للدم (د، هـ) كل 12 ساعة حتى نفقت جميع الإناث التي تغذت على البول (ب، د) واليوريا (ج، هـ)، بالإضافة إلى المجموعة الضابطة التي تغذت على السكروز والماء.
اختلفت المسافة الإجمالية وعدد الدورات التي تم تحديدها في اختبار الطيران على مدار 24 ساعة بين البعوض الباحث عن العائل والبعوض الماص للدماء، حيث أظهر الأخير نشاط طيران أقل بشكل عام (الشكل 3). أظهر البعوض الباحث عن العائل الذي تم تزويده ببول طازج أو قديم أو سكروز وماء أنماط طيران مميزة (الشكل 3)، حيث كانت الإناث التي تتغذى على البول الطازج أكثر نشاطًا عند الفجر، بينما تلك التي تتغذى على بول قديم لمدة 24 و168 ساعة. أظهر البعوض الذي تغذى على البول أنماط طيران مختلفة وكان نهاريًا في المقام الأول. أظهرت إناث البعوض التي تم تزويدها بالسكروز أو بول قديم لمدة 72 ساعة نشاطًا طوال فترة الـ 24 ساعة، بينما كانت الإناث التي تم تزويدها بالماء أكثر نشاطًا خلال منتصف الفترة. أظهر البعوض الذي تغذى على السكروز أعلى مستويات النشاط في وقت متأخر من الليل وفي الصباح الباكر، بينما شهد البعوض الذي تناول بولًا قديمًا لمدة 72 ساعة انخفاضًا مطردًا في النشاط على مدار 24 ساعة (الشكل 3).
أداء طيران إناث بعوضة الأنوفيلس أرابينيس الماصة للدماء، الباحثة عن فرائسها، والتي تتغذى على بول الأبقار واليوريا. في اختبار الطيران، تم ربط إناث البعوض التي تتغذى على بول الأبقار الطازج والقديم، وتراكيز مختلفة من اليوريا، والسكروز (10%)، والماء المقطر (H2O) بأذرع أفقية تدور بحرية (أعلاه). بالنسبة للإناث الباحثة عن العائل (يسار) والماصة للدماء (يمين)، تم تسجيل إجمالي المسافة وعدد الرحلات في الساعة لكل نظام غذائي على مدار 24 ساعة (داكن: رمادي؛ فاتح: أبيض). يظهر متوسط ​​المسافة ومتوسط ​​عدد الرحلات على يمين الرسم البياني للنشاط اليومي. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. للاطلاع على التحليل الإحصائي، انظر النص.
بشكل عام، اتبع نشاط الطيران الإجمالي للإناث الباحثة عن العائل نمطًا مشابهًا لنمط مسافة الطيران على مدار 24 ساعة. تأثر متوسط ​​مسافة الطيران بشكل كبير بنوع الغذاء المُتناول (F(5, 138) = 28.27، p < 0.0001)، وطارت الإناث الباحثة عن العائل التي تناولت بولًا لمدة 72 ساعة لمسافات أطول بشكل ملحوظ مقارنةً بجميع الأنظمة الغذائية الأخرى (p < 0.0001)، كما طارت البعوضات التي تغذت على السكروز لمسافات أطول من تلك التي تغذت على البول الطازج (p = 0.022) والبول المُخزن لمدة 24 ساعة (p = 0.022). على عكس نمط نشاط الطيران الموصوف في النظام الغذائي القائم على البول، أظهرت الإناث الباحثة عن العائل التي تغذت على اليوريا نشاط طيران مستمرًا على مدار 24 ساعة، وبلغ ذروته خلال النصف الثاني من فترة الظلام (الشكل 3). على الرغم من تشابه أنماط النشاط، إلا أن الإناث الباحثة عن العائل التي تغذت على اليوريا زادت بشكل ملحوظ من متوسط ​​مسافة الطيران اعتمادًا على التركيز المُمتص (F(5, 138) = 28.27، p < 0.0001). 138) = 1310.91، p < 0.0001). طارت الإناث الباحثة عن العائل والتي تم تغذيتها بأي تركيز من اليوريا لفترة أطول من الإناث التي تم تغذيتها بالماء أو السكروز (p < 0.03).
كان نشاط الطيران العام للبعوض الماص للدماء مستقرًا ومستمرًا على مدار 24 ساعة في جميع الأنظمة الغذائية، مع زيادة في نشاط البول خلال النصف الثاني من فترة الظلام للإناث التي تغذت على الماء، وكذلك للإناث التي تغذت على الماء الطازج والبالغ من العمر 24 ساعة (الصورة 3). في حين أن النظام الغذائي القائم على البول أثر بشكل كبير على متوسط ​​مسافة الطيران لدى الإناث التي تغذت على الدم (F(5, 138) = 4.83، p = 0.0004)، فإن النظام الغذائي القائم على اليوريا لم يؤثر (F(5, 138) = 1.36، p = 0.24). مع الأنظمة الغذائية الأخرى القائمة على البول والنظام الغذائي الضابط (طازج، p = 0.0091؛ 72 ساعة، p = 0.0022؛ 168 ساعة، p = 0.001؛ سكروز، p = 0.0017؛ ماء مقطر، p = 0.036).
تم تقييم تأثير التغذية بالبول واليوريا على المعايير التناسلية في اختبارات حيوية لوضع البيض (الشكل 4أ)، ودُرست هذه التأثيرات وفقًا لعدد البيض الذي وضعته كل أنثى، وحجم البيضة، وعدد اليرقات حديثة الفقس في الطور الأول. تفاوت عدد البيض الذي وضعته إناث السلحفاة العربية التي تغذت على البول باختلاف النظام الغذائي (F(5,222) = 4.38، p = 0.0008؛ الشكل 4ب). وضعت الإناث التي تغذت على وجبة من البول والدم لمدة 24 ساعة بيضًا أكثر بكثير من الإناث التي تغذت على أنظمة غذائية أخرى من البول، وكان عددها مشابهًا لتلك التي تغذت على السكروز (الشكل 4ب). وبالمثل، تفاوت حجم البيض الذي وضعته الإناث التي تغذت على البول باختلاف النظام الغذائي (F(5, 209) = 12.85، p < 0.0001)، حيث وضعت الإناث التي تغذت على البول والسكروز لمدة 24 ساعة بيضًا أكبر بكثير من الإناث التي تغذت على الماء، بينما كان حجم بيض الإناث التي تغذت على البول لمدة 168 ساعة أكبر بكثير. كانت أصغر حجماً بشكل ملحوظ (الشكل 4ج). بالإضافة إلى ذلك، أثر النظام الغذائي القائم على البول بشكل كبير على حجم اليرقات (F(5, 187) = 7.86، p < 0.0001)، حيث خرجت يرقات أكبر حجماً بشكل ملحوظ من البيض الذي وضعته إناث تغذت على البول لمدة 24 و72 ساعة مقارنة بالبيض الذي وضعته إناث تغذت على الماء وإناث تغذت على البول لمدة 168 ساعة (الشكل 4د).
الأداء التناسلي لإناث بعوضة الأنوفيلة العربية التي تتغذى على بول الأبقار واليوريا. تم تغذية إناث البعوض التي تغذت على الدم بأنظمة غذائية تتكون من بول أبقار طازج وقديم، وتراكيز مختلفة من اليوريا، والسكروز (10%)، والماء المقطر (H2O) لمدة 48 ساعة قبل وضعها في التجارب البيولوجية والحصول على ركائز وضع البيض (أ). تأثر عدد البيض (ب، هـ)، وحجم البيض (ج، و)، وحجم اليرقات (د، ز) بشكل كبير بالنظام الغذائي المقدم (بول الأبقار: ب د؛ اليوريا: هـ ج). كانت المتوسطات لكل معلمة تم قياسها باستخدام أسماء أحرف مختلفة مختلفة بشكل كبير عن بعضها البعض (تحليل التباين أحادي الاتجاه باستخدام تحليل Tukey اللاحق؛ p < 0.05). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط.
باعتبارها المكون النيتروجيني الرئيسي للبول، أثرت اليوريا، عند تقديمها كغذاء للإناث المتغذية على الدم، بشكل ملحوظ على المعايير التناسلية في جميع الدراسات. تفاوت عدد البيض الذي وضعته الإناث المتغذية على اليوريا، بعد وجبة الدم، تبعًا لتركيز اليوريا (F(11, 360) = 4.69؛ p < 0.0001)، حيث وضعت الإناث المتغذية على تركيزات يوريا تتراوح بين 134 ميكرومول و1.34 مليمول عددًا أكبر من البيض (الشكل 4E). كما وضعت الإناث المتغذية على تركيزات يوريا تبلغ 134 ميكرومول أو أعلى بيضًا أكبر حجمًا من الإناث المتغذية على الماء (F(10, 4245) = 36.7؛ p < 0.0001؛ الشكل 4F)، وكان حجم اليرقات، على الرغم من تأثره بتركيزات مماثلة من اليوريا لدى الأمهات (F(10, 3305) = 37.9؛ p < 0.0001)، أكثر تباينًا (الشكل 4G).
انجذاب البعوض عمومًا لمستخلصات المركبات المتطايرة من بول الأبقار الباحثة عن العائل. تأثرت إناث بعوضة أرابينسيس، التي تم تقييمها في جهاز قياس الشم الأنبوبي الزجاجي (الشكل 5أ)، بشكل ملحوظ بعمر البول (χ² = 15.9، df = 4، p = 0.0032؛ الشكل 5ب). أظهر تحليل ما بعد الاختبار أن رائحة البول الراكد بعد 24 ساعة تسببت في مستويات جاذبية أعلى بشكل ملحوظ مقارنةً بجميع المعالجات الأخرى (72 ساعة: p = 0.0060، 168 ساعة: p = 0.012، البنتان: p = 0.00070)، باستثناء رائحة البول الطازج (p = 0.13؛ الشكل 5ب). على الرغم من أن الانجذاب العام للبعوض الماص للدم لرائحة البول لم يكن مختلفًا بشكل ملحوظ (χ² = 8.78، df = 4، p = 0.067؛ الشكل 5ج)، فقد وُجد أن هذه الإناث أكثر انجذابًا بشكل ملحوظ لمستخلصات المركبات المتطايرة من بول الأبقار الباحثة عن العائل. مقارنة المستخلصات المتطايرة مع البول الذي مضى عليه 72 ساعة مقارنة بالضوابط (p = 0.0066؛ الشكل 5C).
الاستجابات السلوكية لروائح بول الأبقار الطبيعية والاصطناعية في البحث عن العائل وبعوضة الأنوفيلة العربية المتغذية على الدم. رسم تخطيطي لجهاز قياس الشم ذي الأنبوب الزجاجي (أ). انجذاب المستخلصات المتطايرة من الفراغ العلوي لبول الأبقار الطازج والقديم إلى العائل (ب) والبعوض الماص للدم (ج). ابحث عن رد فعل اللوامس لدى بعوضة الأنوفيلة العربية. تظهر مستخلصات الفراغ العلوي المعزولة من بول الأبقار الطازج (د)، والقديم لمدة 24 ساعة (هـ)، و72 ساعة (و)، و168 ساعة (ز). تُظهر آثار الكشف بواسطة هوائي الإلكترون (EAD) تغيرات الجهد استجابةً للمركبات النشطة بيولوجيًا في الفراغ العلوي المستخلص من جهاز كروماتوغرافيا الغاز والمكتشف بواسطة كاشف تأين اللهب (FID). يمثل شريط المقياس سعة الاستجابة (مللي فولت) مقابل زمن الاحتفاظ (ثانية). تظهر خصائص ومعدلات إطلاق المركبات النشطة بيولوجيًا (ميكروغرام/ساعة). تشير علامة النجمة المفردة (*) إلى استجابة منخفضة السعة ثابتة. تشير العلامات النجمية (**) إلى الاستجابات غير القابلة للتكرار. حدد المضيف (H) والبعوضة الماصة للدم (I). تُظهر بعوضة الأنوفيلة العربية (An.arabiensis) انجذابًا متفاوتًا لمزيج اصطناعي من روائح بول البقر الطازج والقديم. كانت النسب المتوسطة للبعوض المنجذب لأسماء الأحرف المختلفة مختلفة بشكل ملحوظ عن بعضها البعض (تحليل التباين أحادي الاتجاه باستخدام اختبار توكي اللاحق؛ p < 0.05). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمقياس.
لم تظهر إناث Ann.arabiensis، بعد 72 ساعة و 120 ساعة من تناول وجبة الدم، أثناء التبويض، أي تفضيل لمستخلصات المواد المتطايرة في الفراغ العلوي من بول الأبقار الطازج والقديم مقارنة بضوابط البنتان (χ2 = 3.07، p > 0.05؛ ملف إضافي 1: الشكل S1).
بالنسبة لإناث فراشة Ann.arabiensis، حددت تحليلات GC-EAD وGC-MS ثمانية، وستة، وثلاثة، وثلاثة مركبات نشطة بيولوجيًا على التوالي (الشكل 5D-G). على الرغم من ملاحظة اختلافات في عدد المركبات التي أثارت استجابات كهروفيزيولوجية، إلا أن معظم هذه المركبات كانت موجودة في كل مستخلص متطاير من الفراغ العلوي تم جمعه من البول الطازج والقديم. لذلك، بالنسبة لكل مستخلص، تم تضمين المركبات التي أنتجت استجابة فسيولوجية من قرون استشعار الإناث فوق العتبة فقط في التحليلات اللاحقة.
ارتفع معدل إطلاق المركبات النشطة بيولوجيًا المتطايرة في مجموعة الفراغ العلوي من 29 ميكروغرام/ساعة في البول الطازج إلى 242 ميكروغرام/ساعة في البول الذي مضى عليه 168 ساعة، ويعزى ذلك بشكل رئيسي إلى زيادة تركيز الفينول، بالإضافة إلى بارا-كريسول وميتا-فورمالديهايد. في المقابل، انخفضت معدلات إطلاق مركبات أخرى، مثل 2-سيكلوهكسين-1-ون وديكانال، مع ازدياد عمر البول، وهو ما يتوافق مع الانخفاض الملحوظ في شدة الإشارة (الوفرة) في مخطط الكروماتوغرافيا (الشكل 5D-G، اللوحة اليسرى) والاستجابات الفسيولوجية لهذه المركبات (الشكل 5D-G، اللوحة اليمنى).
بشكل عام، احتوى المزيج الاصطناعي على نسبة مماثلة من المركبات النشطة بيولوجيًا الموجودة في المستخلصات المتطايرة من فراغات الهواء في البول الطازج والقديم (الشكل 5D-G)، ولم يظهر أنه يجذب البعوض بشكل ملحوظ في البحث عن عائل (χ2 = 8.15، df = 4، p = 0.083؛ الشكل 5H) أو البعوض الماص للدماء (χ2 = 4.91، df = 4، p = 0.30؛ الشكل 5I). ومع ذلك، أظهرت المقارنات الزوجية اللاحقة بين المعالجات أن البعوض الباحث عن عائل كان منجذبًا بشكل ملحوظ إلى المزيج الاصطناعي من البول القديم لمدة 24 ساعة مقارنةً بضوابط البنتان (p = 0.0086؛ الشكل 5H).
لتقييم دور المكونات الفردية في الخلائط الاصطناعية من البول المُعتق لمدة 24 ساعة، تم تقييم ستة خلائط مُستبعدة مقابل الخلائط الكاملة في اختبار أنبوب Y، حيث تم استبعاد المركبات الفردية. بالنسبة للبعوض الباحث عن العائل، كان لاستبعاد المركبات الفردية من الخليط الكامل تأثير كبير على الاستجابات السلوكية (χ² = 19.63، df = 6، p = 0.0032؛ الملف الإضافي 1: الشكل S2A)، وكانت جميع الخلائط المُستبعدة أكثر جاذبية من الخلائط المختلطة بالكامل. في المقابل، لم يؤثر استبعاد المركبات الفردية من الخليط الاصطناعي بالكامل على الاستجابات السلوكية للبعوض الماص للدم (χ² = 11.38، df = 6، p = 0.077)، باستثناء الديكانال، الذي أدى إلى مستويات أقل مقارنةً بالخليط الكامل (p = 0.022؛ الملف الإضافي 1: الشكل S2B).
في قرية موبوءة بالملاريا في إثيوبيا، جرى تقييم فعالية مزيج اصطناعي من بول الأبقار على مدار 24 ساعة في جذب البعوض في ظروف ميدانية لمدة عشر ليالٍ (الشكل 6أ). تم اصطياد 4861 بعوضة وتحديد أنواعها، منها 45.7% من نوع Anthropus gambiae sl، و18.9% من نوع Anopheles pharoensis، و35.4% من أنواع Culex spp. (الملف الإضافي 1: الجدول S1). يُعدّ Anopheles arabinis العضو الوحيد من مجموعة أنواع An. Gambiae الذي تم تحديده بواسطة تحليل PCR. في المتوسط، تم اصطياد 320 بعوضة في الليلة الواحدة، وخلال هذه الفترة، اصطادت المصائد المزودة بطُعم من المزيج الاصطناعي عددًا أكبر من البعوض مقارنةً بالمصائد المقابلة غير المزودة بمزيج (χ²(0, 3196) = 170.0، p < 0.0001). وُضعت مصائد غير مزودة بطُعم في كل ليلة من ليالي المراقبة الخمس في البداية والمنتصف والنهاية. خلال التجربة، تم اصطياد أعداد متقاربة من البعوض في كل زوج من المصائد، مما يشير إلى عدم وجود تحيز بين المنازل (χ²(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³، p > 0.05) وعدم وجود انخفاض في أعداد البعوض خلال فترة الدراسة. بالمقارنة مع مصائد الضبط، ازداد عدد البعوض الذي تم اصطياده في المصائد التي تحتوي على الخليط الاصطناعي بشكل ملحوظ: البعوض الباحث عن العائل (χ²(0, 2107) = 138.7، p < 0.0001)، والبعوض الذي تغذى على الدم مؤخرًا (χ²(0, 650) = 32.2، p < 0.0001)، والبعوض الحامل (χ²(0, 228) = 6.27، p = 0.0123؛ الملف الإضافي 1: الجدول S1). وينعكس هذا أيضًا في إجمالي عدد البعوض الذي تم اصطياده: البعوض الباحث عن العائل > البعوض الماص للدم > البعوض الحامل > البعوض شبه الحامل > الذكور.
تقييم ميداني لفعالية مزيج رائحة بول البقر الاصطناعي لمدة 24 ساعة. أُجريت التجارب الميدانية في جنوب وسط إثيوبيا (الخريطة)، بالقرب من مدينة ماكي (المُدرجة)، باستخدام مصيدة ضوئية من مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) (على اليمين) في منازل متقابلة، بتصميم مربع لاتيني (صورة جوية) (أ). تجذب المصائد الضوئية من مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها، المزودة بطعم ذي رائحة اصطناعية، إناث بعوضة الأنوفيلة العربية (ب)، ولكنها لا تجذب إناث بعوضة الأنوفيلة الفارو (ج)، بطريقة مختلفة، وهو تأثير يعتمد على الحالة الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، اصطادت هذه المصائد أعدادًا متزايدة بشكل ملحوظ من بعوض الكيولكس المضيف. (د) مقارنةً بالمجموعة الضابطة. تمثل الأعمدة على اليسار متوسط ​​مؤشر الانتقاء للبعوض الذي تم اصطياده في أزواج من مصائد الطعم ذي الرائحة (أخضر) والمجموعة الضابطة (مفتوحة) (عدد العينات = 10)، بينما تمثل الأعمدة على اليمين متوسط ​​مؤشر الانتقاء في أزواج من مصائد المجموعة الضابطة (مفتوحة؛ عدد العينات = 5). تشير العلامات النجمية إلى مستويات الدلالة الإحصائية (*p = 0.01 و ***p < 0.0001)
تم اصطياد الأنواع الثلاثة بطرق مختلفة في المصائد التي تحتوي على مخاليط اصطناعية. عند البحث عن العائل (χ²(1, 1345) = 71.7، p < 0.0001)، والتغذية على الدم (χ²(1, 517) = 16.7، p < 0.0001)، والحمل (χ²(1, 180) = 6.11، p = 0.0134)، تم اصطياد بعوضة الأنوفيلة العربية (An. arabiensis) في المصيدة التي تطلق الخليط الاصطناعي (الشكل 6ب)، بينما لم يختلف مقدار الأنوفيلة الفرعونية (Pharoensis) في حالات فسيولوجية مختلفة (الشكل 6ج). بالنسبة لبعوضة الكيولكس (Culex)، لوحظت زيادة معنوية فقط في عدد البعوض الباحث عن العائل في المصائد التي تحتوي على الخليط الاصطناعي (χ²(1,1319) = 12.6، p = 0.0004؛ الشكل 6د)، مقارنةً بمصائد التحكم.
استُخدمت مصائد طُعم المضيف، الموضوعة خارج نطاق المضيفين المحتملين بين مواقع التكاثر والمجتمعات الريفية في إثيوبيا، لتقييم ما إذا كانت بعوضة الملاريا تستخدم رائحة بول البقر كمؤشر على وجود المضيف. في غياب مؤشرات المضيف، والحرارة، ومع وجود رائحة بول البقر أو بدونها، لم يتم اصطياد أي بعوض (الملف الإضافي 1: الشكل S3). ومع ذلك، في وجود درجة حرارة عالية ورائحة بول البقر، انجذبت إناث بعوضة الملاريا وتم اصطيادها، وإن كان بأعداد قليلة، بغض النظر عن عمر البول (χ²(5, 25) = 2.29، p = 0.13؛ الملف الإضافي 1: الشكل S3). في المقابل، لم تصطد عينات المياه الضابطة بعوضة الملاريا في درجات الحرارة العالية (الملف الإضافي 1: الشكل S3).
تكتسب بعوضة الملاريا مركبات النيتروجين وتوزعها من خلال التغذية التعويضية على بول الأبقار (أي البرك) لتحسين خصائص دورة حياتها، على غرار الحشرات الأخرى [2، 4، 24، 25، 26]. يُعد بول الأبقار موردًا متجددًا متوفرًا بسهولة ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بأماكن راحة نواقل الملاريا، مثل حظائر الأبقار والنباتات الطويلة القريبة من المنازل الريفية ومواقع التكاثر. تحدد إناث البعوض هذا المورد عن طريق حاسة الشم، وهي قادرة على تنظيم امتصاص مركبات النيتروجين في البول، بما في ذلك اليوريا، المكون النيتروجيني الرئيسي في البول [15، 16]. اعتمادًا على الحالة الفسيولوجية لأنثى البعوض، تُخصص العناصر الغذائية الموجودة في البول لتعزيز نشاط الطيران وبقاء إناث البعوض الباحثة عن العائل، بالإضافة إلى خصائص البقاء والتكاثر للأفراد الذين تغذىوا على الدم خلال الدورة التناسلية الأولى. لذلك، يلعب اختلاط البول دورًا غذائيًا مهمًا لنواقل الملاريا التي تُشبه البالغين الذين يعانون من سوء التغذية [8]، حيث يوفر لإناث البعوض القدرة على الحصول على مركبات نيتروجينية مهمة من خلال التغذية منخفضة المخاطر. لهذه النتيجة تبعات وبائية هامة، حيث تزيد الإناث من متوسط ​​عمرها المتوقع ونشاطها وإنتاجها التناسلي، وكلها عوامل تؤثر على قدرة النواقل على نقل الأمراض. علاوة على ذلك، قد يكون هذا السلوك هدفًا لبرامج إدارة النواقل المستقبلية.