Achiziția și distribuția nutrienților integrează hrana insectelor și trăsăturile de viață ale insectelor. Pentru a compensa deficiențele în nutrienți specifici în diferite stadii de viață, insectele pot obține acești nutrienți prin hrănire suplimentară, de exemplu, hrănindu-se cu secreții de vertebrate într-un proces cunoscut sub numele de bălți.arabiensis agitația pe urina de vacă pentru achiziția de nutrienți îmbunătățește caracteristicile istoriei vieții.
Asigurați-vă că este sigur. Arabiensis a fost atras de mirosul de urină de vacă proaspătă, de 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore, iar femelele căutate de gazdă și hrănite cu sânge (48 de ore după masa de sânge) au fost măsurate într-un olfactometru cu tub Y, iar femelele gravide au fost utilizate pentru teste electrochimice și combinate pentru analize chimice. Identificați compușii bioactivi în urina de vacă la toate cele patru clase de vârstă. Amestecuri sintetice de compuși bioactivi au fost evaluate în probe în Y și pe teren. Pentru a investiga urina de vacă și principalul său compus care conține azot, uree, ca potențiale diete suplimentare pentru vectorii malariei, s-au măsurat parametrii de hrănire și caracteristicile istoriei vieții. au fost evaluate pentru supraviețuire, zbor legat și reproducere.
Căutați sângele și hrana gazdei. În studiile de laborator și de teren, arabii au fost atrași de parfumul natural și sintetic al urinei proaspete și îmbătrânite de vacă. Femelele gravide au fost indiferente față de răspunsurile urinei de vacă în locurile de depunere a icrelor. , sau reproducere.
Anopheles arabinis achiziționarea și distribuirea urinei de vacă pentru caracteristici îmbunătățite ale istoriei de viață. Hrănirea suplimentară cu urină de vacă afectează capacitatea vectorului în mod direct prin creșterea supraviețuirii zilnice și a densității vectorului și indirect prin modificarea activității de zbor și, prin urmare, ar trebui luată în considerare în modelele viitoare.
Achiziția și distribuția nutrienților integrează hrana insectelor și caracteristicile istoriei vieții [1,2,3].Insectele sunt capabile să selecteze și să achiziționeze hrană și să efectueze hrănire compensatorie pe baza disponibilității alimentelor și a cerințelor de nutrienți [1, 3].Distribuția nutrienților depinde de procesul istoriei vieții și poate duce la cerințe diferite pentru calitatea și cantitatea dietei în diferite stadii de viață ale insectelor. hrănirea suplimentară, cum ar fi cu noroi, diverse excremente și secreții de vertebrate și trup, un proces cunoscut sub numele de bălți [2]. Deși sunt descrise în primul rând o varietate de specii de fluturi și molii, gropile de adăpare apar și în alte ordine de insecte, iar atracția și hrănirea cu aceste tipuri de resurse poate avea efecte semnificative asupra sănătății și a altor trăsături de viață [5, 6, 6, 6, 6, 8]. nopheles gambiae sensu lato (sl) apare ca un adult „malnutrit” [8], astfel încât udarea poate juca un rol important în caracteristicile sale de viață, dar acest comportament a fost neglijat până acum. Utilizarea agitației ca mijloc de creștere a aportului de nutrienți în acest vehicul important merită atenție, deoarece aceasta poate avea consecințe epidemiologice importante.
Aportul de azot la femelele adulte de țânțari Anopheles este limitat din cauza rezervelor calorice scăzute transportate din stadiul larvar și a utilizării ineficiente a hranei de sânge [9]. Femelele Ann.gambiae sl compensează în mod obișnuit acest lucru prin suplimentarea cu alimente suplimentare cu sânge [10, 11], punând astfel mai mulți oameni la risc de a contracta boala și, în mod alternativ, la un risc mai mare de utilizare a bolii. hrănirea suplimentară a excrementelor vertebratelor pentru a dobândi compuși azotați care sporesc adaptarea și manevrabilitatea zborului, așa cum au demonstrat alte insecte [2]. În acest sens, atracția puternică și distinctă a uneia dintre speciile frate din An. Complexul de specii sl Gambian, Anopheles arabinis, urină de vacă proaspătă și îmbătrânită [12,13,14] este cunoscută interesul gazdei sale, preferințele și arabini. Urina de vacă este o resursă bogată în compuși azotați, ureea reprezentând 50-95% din azotul total din urina proaspătă [15, 16]. Pe măsură ce urina de vacă îmbătrânește, microorganismele folosesc aceste resurse pentru a reduce complexitatea compușilor azotați în 24 de ore [15]. dintre care produc compuși toxici pentru țânțari) prosperă [15], care poate fi femela. Ann.arabiensis este atrasă de preferință de urina în vârstă de 24 de ore sau mai puțin [13, 14].
În acest studiu, s-au căutat Ans gazdă și hrăniți cu sânge. În timpul primului său ciclu de gonadotropină, arabiensis a fost evaluat pentru achiziționarea de compuși azotați, inclusiv uree, prin amestecarea urinei. În continuare, au fost efectuate o serie de experimente pentru a evalua modul în care țânțarii femele alocă această potențială resursă nutritivă pentru o supraviețuire îmbunătățită, reproducere proaspătă și hrană proaspătă. pentru a determina dacă acestea au furnizat indicii fiabile pentru Anul gazdă și hrănit cu sânge. În căutarea acestei potențiale resurse nutriționale, arabiensis a descoperit corelații chimice în spatele atractivității diferențiale observate. Amestecuri de miros sintetice de compuși organici volatili (COV) identificate în urina îmbătrânită de 24 de ore au fost evaluate în continuare în condiții de teren, extinzându-se și rezultatele obținute în condiții de laborator, demonstrând efectele diferite ale stărilor de laborator asupra bovinelor.Atractia tantarilor.Rezultatele obtinute confirma ca An.arabiensis dobândește și distribuie compuși azotați găsiți în urina vertebratelor pentru a influența caracteristicile istoriei vieții. Aceste rezultate sunt discutate în contextul potențialelor consecințe epidemiologice și al modului în care pot fi utilizați pentru supravegherea și controlul vectorilor.
Anopheles arabicans (tulpina Dongola) s-au menținut la 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH și un ciclu lumină:întuneric de 12:12 h. Larvele au fost crescute în tăvi de plastic (20 cm × 18 cm × 7 cm) umplute cu apă distilată și hrănite cu Tetramin® hrana pentru pești (Tetramin®, hrana pentru pește, 30 ml). lato Hertila, Åstorp, SE) și apoi transferate în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) pentru a permite apariția adulților. Adulților li s-a furnizat o soluție de zaharoză 10% ad libitum până la 4 zile post-emergere (dpe), moment în care, înainte de experimentul gazdă, femelele au fost distilate înaintea experimentului cu apă sau distilate înaintea nopții. Așa cum este descris mai jos. Femelele folosite pentru experimentele cu tuburi de zbor au fost înfometate doar 4-6 ore cu apă ad libitum. Pentru a pregăti țânțarii suge de sânge pentru biotestele ulterioare, 4 femele dpe au fost furnizate cu sânge defibrotic de oaie (Håtunalab, Bro, SE) folosind un sistem de hrănire cu membrană (Hemotek Discovery Workshops, Accrington). de mai jos, sau 10% zaharoză ad libitum timp de 3 zile înainte de experimentele descrise mai jos. Acestea din urmă femele au fost folosite pentru biotestele cu tuburi de zbor și transferate în laborator, apoi au avut apă distilată ad libitum timp de 4-6 ore înainte de experiment.
Testele de hrănire au fost utilizate pentru a cuantifica consumul de urină și uree la femelele adulte An.Arab. Femelelor în căutarea de gazdă și hrănite cu sânge li sa oferit o dietă care conținea 1% urină de vacă proaspătă și îmbătrânită diluată, diferite concentrații de uree și două martori (10% zaharoză și apă) timp de 48 de ore. 1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) a fost adăugat la dietă și furnizat într-o matrice 4 × 4 în tuburi de microcentrifugă de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, SUA; Figura 1A) Umpleți până la margine (~300 µl). în diametru și 6 cm înălțime; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) în întuneric complet la 25 ± 2 cm °C și 65 ± 5% umiditate relativă. Aceste experimente au fost repetate de 5 până la 10 ori. După expunerea la dietă, țânțarii au fost plasați la -20 °C până la analiza ulterioară.
Căutați urina bovină și uree absorbite de gazdă și femela care suge sângele Anopheles arabianus. În studiul de hrănire (A), țânțarilor femele li s-a oferit o dietă constând din urină de vacă proaspătă și îmbătrânită, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O). Femelele care caută au absorbit urina de vacă de 72 de ore în mai puțin de 168 de ore (B). Conținutul total mediu de azot (± abaterea standard) al urinei este reprezentat în insert. Femelele care caută gazdă (D, F) și sug sânge (E, G) preiau uree într-o doză dependentă de doză. ANOVA folosind analiza post-hoc a lui Tukey; p < 0,05).Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei (BE). Linia dreaptă punctată reprezintă linia de regresie log-liniară (F, G)
Pentru a elibera alimentele absorbite, țânțarii au fost plasați individual în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml care conțineau 230 µl de apă distilată, iar țesutul a fost distrus folosind un pistil de unică folosință și un motor fără fir (VWR International, Lund, SE), urmat de centrifugare la 10 krpm timp de 10 min. gma-Aldrich) și absorbanța (λ620) au fost determinate utilizând un cititor de microplăci bazat pe spectrofotometru (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). În mod alternativ, țânțarii au fost măcinați în 1 ml apă distilată, din care 900 µl au fost transferați într-o analiză cuvetă cuvetă Shimmetric UV, λ 800 µl, spectrofotometrică, spectroscopie UV ista, SE). Pentru a cuantifica aportul alimentar, a fost pregătită o curbă standard prin diluare în serie pentru a produce 0,2 µl până la 2,4 µl de 1 mg ml-1 cianură de xilen. Apoi, densitatea optică a concentrațiilor cunoscute de colorant a fost utilizată pentru a determina cantitatea de hrană ingerată de fiecare țânțar.
Datele de volum au fost analizate utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de comparații post-hoc în perechi ale lui Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Analizele de regresie liniară au descris aportul de uree dependent de concentrație și au comparat răspunsurile între sângele și sângele de sânge (pachetul de sânge) 0 pentru Mac, software GraphPad, San Diego, CA, SUA).
Aproximativ 20 µl de probe de urină din fiecare grupă de vârstă au fost legați pe Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) și încapsulate în capsule de staniu (8 mm × 5 mm). Capsulele au fost introduse în camera de ardere a unui analizor CHNS/O (Flash 2000) rină conform protocolului producătorului. Azotul total (g N l-1) a fost cuantificat pe baza concentrațiilor cunoscute de uree utilizate ca standard.
Pentru a evalua efectul dietei asupra supraviețuirii femeilor care caută gazde și supt sânge, țânțarii au fost așezați individual în vase Petri mari (12 cm în diametru și 6 cm în înălțime; Semadeni) cu o gaură acoperită cu plasă în capac (3 cm în diametru) cu Pentru ventilație și aprovizionare cu hrană. , și două controale, 10% zaharoză și apă. Fiecare dietă a fost pipetată pe un tampon dentar (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) introdus într-o seringă de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), pistonul a fost îndepărtat și plasat deasupra unei plăci Petri (figura 1). au fost numărați de două ori pe zi, în timp ce țânțarii morți au fost aruncați până la moartea ultimului țânțar (n = 40 per tratament). Supraviețuirea țânțarilor hrăniți cu diverse diete a fost analizată statistic folosind curbele de supraviețuire Kaplan-Meyer și teste log-rank pentru a compara comparațiile distribuției de supraviețuire între diete (IBM SPSS Statistics.0.004).
O moară zburătoare de țânțari personalizată bazată pe Attisano și colab.[17], realizată din panouri acrilice transparente de 5 mm grosime (10 cm lățime x 10 cm lungime x 10 cm înălțime) fără panouri frontale și posterioare (Fig. 3: sus). Un ansamblu pivot cu un tub vertical format dintr-o coloană de cromatografie gazoasă (0,25 mm d.a.) cu o pereche de insecte suspendate între 5 cm id; um magneți distanță de 9 cm. Un tub orizontal din același material (6,5 cm L) a bisectat tubul vertical pentru a forma un braț legat și un braț care transporta o mică bucată de folie de aluminiu ca semnal de întrerupere a luminii.
Femelelor înfometate timp de 24 de ore li s-a administrat dieta de mai sus timp de 30 de minute înainte de reținere. Femelele hrănite complet au fost apoi anesteziate individual pe gheață timp de 2-3 minute și atașate de știfturi de insecte cu ceară de albine (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) și apoi legate prin tuburi orizontale. -Logger de date construit, apoi stocat și afișat folosind software-ul PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Moara de zbor a fost amplasată într-o cameră climatizată (12 h:12 h, lumină: întuneric, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Pentru a vizualiza tiparul activității de zbor, distanța totală zburată (m) și numărul total de activități de zbor consecutive au fost calculate pe oră pe o perioadă de 24 de ore. În plus, distanțele medii parcurse de femele individuale au fost comparate între tratamente și analizate utilizând ANOVA unidirecțională și analiza post-hoc a lui Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS, factorul independent de tratament, în care distanța medie a fost considerată un număr independent de tratament). de runde se calculează în trepte de 10 minute.
Pentru a evalua efectul dietei asupra performanțelor de reproducere a An.arabiensis, șase femele (4 dpe) au fost transferate direct în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) după recoltarea sângelui și apoi au furnizat dieta experimentală timp de 48 de ore, așa cum este descris mai sus. Dietele au fost apoi îndepărtate și cupe de depunere a icrelor (30 ml; Nolato Hertila s-au umplut cu apă distilată la fiecare a treia 20 de ore, umplut cu apă distilată la fiecare 20 ml în fiecare a treia zi). 24 de ore. Se repetă fiecare regim alimentar de 20-50 de ori. Ouăle au fost numărate și înregistrate pentru fiecare cușcă experimentală. Au fost utilizate subprobele de ouă pentru a evalua dimensiunea medie și variația lungimii ouălor individuale (n ≥ 200 per dietă) folosind un microscop Dialux-20 (DM1000; 2;Leica Microsystems Ltd., DE). Ouăle rămase au fost ținute într-o cameră cu climă controlată, în condiții standard de creștere, timp de 24 de ore și a fost măsurat un subeșantion de larve din primul stadiu (n ≥ 200 per dietă), așa cum este descris mai sus. JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Volatile din spațiul de cap din urina proaspătă (1 oră după eșantionare), 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore au fost colectate din probe colectate de la bovine Zebu, rase Arsi. Pentru comoditate, probe de urină au fost colectate dimineața devreme, în timp ce vacile erau încă în hambar. (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) în poliamidă de 3 l cu capac În bidoane de plastic cu clorură de vinil. Volatile din spațiul de cap din fiecare probă de urină bovină au fost colectate fie direct (proaspătă), fie după maturare la temperatura camerei timp de 24 ore, 72 ore și 168 ore, adică reprezentative pentru fiecare probă de urină de vârstă.
Pentru colectarea substanțelor volatile în spațiul de cap, s-a folosit un sistem cu buclă închisă pentru a circula un curent de gaz filtrat cu cărbune activ (100 ml min-1) printr-o pungă de poliamidă către coloana de adsorbție timp de 2,5 ore folosind o pompă de vid cu diafragmă (KNF Neuberger, Freiburg, DE). x 3 mm id) conținând 35 mg de Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) între dopuri din vată de sticlă. Înainte de utilizare, coloana a fost spălată cu 1 ml n-hexan redistilat (Merck, Darmstadt, DE) și 1 ml pentan (99,0% solvent adsorbiți cu SigmaO GC pur, adsorbiți cu 99,0%). μl de pentan. Colecțiile de spațiu de cap au fost reunite și apoi stocate la -20°C până când sunt utilizate pentru analize ulterioare.
Răspunsurile comportamentale ale căutării gazdei și ale mâncătorilor de sânge. Extractele volatile An.Headspace colectate din urină proaspătă, în vârstă de 24 de ore, 72 de ore și 168 de ore au fost analizate pentru extractele volatile de la țânțarii Arabidopsis folosind un olfactometru cu tub drept de sticlă [18]. ].Un olfactometru cu tub de sticlă (80 cm × 9,5 cm id) a fost iluminat cu 3 ± 1 lx de lumină roșie de sus. Fluxul de aer filtrat și umidificat cu cărbune de lemn (25 ± 2 °C, 65 ± 2% umiditate relativă) a trecut biotestul la 30 cm s-1. dozator de tampon (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspendat dintr-o bobină de 5 cm pe capătul din vânt al olfactometrului, cu schimbarea stimulatorului la fiecare 5 minute. Pentru analiză, 10 μl din fiecare extract de cap, diluat 1:10, a fost folosit ca stimul. cuști cu 2-3 ore înainte de începerea experimentului. Cușca de eliberare a fost așezată în partea din aval a olfactometrului, iar țânțarii au fost lăsați să se aclimatizeze timp de 1 minut, apoi valva fluture a cuștii a fost deschisă pentru a elibera. și pentru a evita efectele oricărei zile, același număr de tratamente și controale au fost testate în fiecare zi experimentală. Căutați răspunsuri de la gazdă și hrănite cu sânge Ans. Seturile arabe versus headspace au fost analizate folosind regresia logistică nominală urmată de comparații pe perechi pentru rapoarte impare (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Răspunsul lui An de depunere a icrelor. Extractele din spațiul de cap din urină de vacă proaspătă și îmbătrânită au fost analizate în cuști Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Cupe de plastic (30 mL; Nolato Hertila) umplute cu 20 mL de apă distilată cu condiția substratului de depunere a icrelor și au fost plasate în colțurile opuse, cu 24 cm de distanță, s-au reglat 24 cm. din fiecare extract de spațiu de cap la o diluție de 1:10. O cantitate egală de pentan a fost utilizată pentru a ajusta cupa de control. Au fost schimbate cupe de tratament și de control între fiecare experiment pentru a controla efectele de poziție. Zece femele hrănite cu sânge au fost eliberate în cuști experimentale la ZT 9-11 și ouăle în cupe au fost numărate 24 de ore mai târziu. numărul de ouă depuse în cupa de control)/(numărul total de ouă depuse).Fiecare tratament a fost repetat de 8 ori.
Analiza cromatografică gazoasă și de detectare a modelului de antenă electronică (GC-EAD) a femelei An.arabiensis a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [20]. Pe scurt, extractele volatile proaspete ale spațiului de cap au fost separate folosind un Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) echipat cu o coloană HP-5 (30 m × 0,25 mm id, film Agilent Technologies 0,25 mm grosime, μm μm).Hidrogenul a fost folosit ca fază mobilă cu un debit liniar mediu de 45 cm s-1. Fiecare probă (2 μl) a fost injectată timp de 30 de secunde în modul splitless cu o temperatură de intrare de 225 °C. Temperatura cuptorului GC a fost programată de la 35 °C (3 minute hold) la 300 °C (3 minute hold) la 300 °C la 100 °C minut. separator, s-au adăugat 4 psi de azot și s-au împărțit 1:1 într-o cruce Gerstel 3D/2 cu volum mort scăzut (Gerstel, Mülheim, DE) între detectorul de ionizare a flăcării și EAD. Capilarul de efluent GC pentru EAD a fost trecut printr-o linie de transfer Gerstel ODP-2, care urmărește temperatura cuptorului GC plus temperatura cuptorului GC, unde a fost amestecat cu 5 ° C, filtru de cărbune, unde a fost amestecat cu 5 ° C, filtru de carbon aer mediu (1,5 l min−1). Antena a fost plasată la 0,5 cm de la ieșirea tubului. Fiecare țânțar individual a reprezentat o replicare, iar pentru țânțarii care caută gazda, au fost efectuate cel puțin trei replici pe probe de urină de fiecare vârstă.
Identificarea compușilor bioactivi în colecțiile de urină de bovină proaspătă și îmbătrânită folosind un spectrometru combinat GC și de masă (GC-MS; 6890 GC și 5975 MS; Agilent Technologies) pentru a obține răspunsuri antene în analiza GC-EAD, funcționând în modul de ionizare cu impact de electroni la 70 eV. 25 mm diametru interior, 0,25 μm grosimea filmului) utilizând heliu ca fază mobilă cu un debit liniar mediu de 35 cm s-1. O probă de 2 μl a fost injectată folosind aceleași setări ale injectorului și aceleași temperatură a cuptorului ca pentru analiza GC-EAD. compușii dentificați au fost confirmați prin injectarea de standarde autentice (Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). Pentru cuantificare, acetat de heptil (10 ng, 99,8% puritate chimică, Aldrich) a fost injectat ca standard extern.
Evaluarea eficacității unui amestec sintetic de mirosuri constând din compuși bioactivi identificați în urina proaspătă și îmbătrânită pentru a atrage Ans.arabiensis care caută și suge sângele gazdei, utilizând același olfatometru și același protocol ca mai sus. Amestecuri sintetice au imitat compoziția și proporțiile compușilor din extractele volatile mixte din spațiul capului de proaspăt, 248-hour-hour, 248-hour-hour, 248-hour-hour, 248-hour, Urină îmbătrânită (Figura 5D-G; Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). Pentru analiză, utilizați 10 μl dintr-o diluție de 1:100 a amestecului complet sintetic, cu o rată totală de eliberare cuprinsă între aproximativ 140-2400 ng h-1, pentru a evalua atractivitatea pentru gazdă și pentru absorbția de sânge. compușii individuali ai amestecului complet sunt îndepărtați. Răspunsurile de căutare de la gazdă și hrănite cu sânge Ans.Arab vs amestecurile sintetice și subtractive au fost analizate folosind regresia logistică nominală urmată de comparații pe perechi pentru rapoarte impare (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Pentru a evalua dacă urina de vacă ar putea servi drept indiciu de habitat gazdă pentru țânțarii malariei, urina de vacă proaspătă și îmbătrânită, colectată așa cum este descris mai sus, și apă au fost plasate în găleți cu ochiuri de 3 l (100 ml) și puse în capcane de momeală gazdă.(Versiune BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Zece capcane amplasate la 50 m una de alta în pășune, la 400 m de comunitatea satului (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) și nicio vite, pe locurile de reproducere permanente și sate. s-au rotit noaptea pentru un total de cinci nopți. Numărul de țânțari capturat în capcane momeale cu urină de diferite vârste au fost comparate utilizând regresia logistică cu o distribuție binomială beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Într-un sat cu malarie endemică din apropierea orașului Maki, regiunea Oromia, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). Studiul a fost efectuat între mijlocul lunii august și mijlocul lunii septembrie, înainte de stropirea anuală reziduală interioară, împreună cu o lungă perioadă de timp ploios, situată în afara sezonului ploios. selectate pentru studiu (Fig. 6A).Criteriile utilizate pentru selectarea caselor au fost: interzicerea animalelor în casă, gătitul în interior (cel puțin în perioada de probă) și case cu maximum doi locuitori, care dorm în neinsecticide.sub plasa de țânțari tratată. Aprobarea etică a fost acordată de Consiliul Instituțional de Analiză Etică a Cercetării (IRB/022/2016) al Facultății de Științe Naturale (CNS-IRB), Universitatea Addis Abeba, în conformitate cu liniile directoare stabilite de Declarația Asociației Medicale Mondiale de la Helsinki. „kebele”). Designul experimental a urmat un design pătrat latin 2 × 2, în care amestecurile sintetice și controalele au fost atribuite caselor pereche în prima noapte și schimbate între case în următoarea noapte experimentală. Acest proces a fost repetat de zece ori.
Un amestec sintetic care conține șase compuși bioactivi a fost dizolvat în heptan (97,0% solvent GC Grad, Sigma Aldrich) și eliberat la 140 ng H-1 folosind un distribuitor de bumbac [20]. Distribuitorul Wick a permis ca toți compuși să fie eliberat în proporții constante pe parcursul experimentului de 12 ore. C) Capcana ușoară (John W. Hock Company, Gainesville, FL, SUA; Figura 6a). Capcanele au fost atârnate cu 0,8-1 m deasupra solului, lângă piciorul patului, iar un voluntar dormit sub un mosquito netratat și a funcționat între 18:00 și 06: 30.Mosquitoes capturat de sex și de statut fiziologic (s-a ferit, semi-pregnant, iar sarcina [21] a fost subliniat, semi-pregnant, iar sarcina [21] a fost subliniat, semi-pregnant, iar sarcina [21] a fost subliniat, semi-pregnant, iar sarcina [21] a fost subliniat, semi-pregnant și sarcina [21] Analiza reacției în lanț (PCR) pentru a identifica speciile identificate morfologic ca A. gambiae Sl. Membrii complexului [23]. În studiul de teren, capcana de capcană a caselor pereche a fost analizată folosind un model nominal de potrivire logistică, unde atracția a fost variabila dependentă și tratamentul (amestecul sintetic vs control) a fost efectul fix (JMP® 14.0.0. Institutul SAS Inc.).Aici, raportăm valorile χ2 și p din testul raportului de probabilitate.
Evaluați dacă este sigur. Arabiensis a reușit să obțină urină, principala sa sursă de azot, ureea, prin hrănire directă, în 48 de ore de la administrare, timp de 4 zile după (dpe) încercări de hrănire a femeilor hrănite cu gazdă și hrănite cu sânge (Fig. 1A). 0001 și F(5299) = 56,00, respectiv p < 0,0001, Fig. 1B, C).În plus, femelele care caută gazdă au mâncat mai puțin în urină la 72 de ore, comparativ cu urina la 168 de ore (Fig. 1B). în toate celelalte concentrații și apă, deși nu se distinge de 10% zaharoză (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Acest lucru a fost în contrast cu răspunsul femelelor hrănite cu sânge, care în mod obișnuit au absorbit semnificativ mai multe diete care conțin uree decât apă, deși (180% mai puțină sucroză) 5, p < 0,0001; Figura 1).1E).În plus, când se compară între cele două stări fiziologice, femelele flebotomizate au absorbit mai multă uree decât femelele care căutau gazdă la cele mai scăzute concentrații, iar aceste femele au absorbit cantități similare de uree la concentrații mai mari (F(1,953)= 70,800,000, < 71,80,0001;Fig. 1F, G). În timp ce aportul dintr-o dietă care conține uree părea să aibă valori optime (Fig. 1D, E), femelele în ambele stări fiziologice au fost capabile să moduleze cantitatea de uree absorbită pe întregul interval de concentrații de uree într-un mod log-liniar (Fig. 1F, G).). În mod similar, țânțarii par să-și controleze absorbția de azot prin reglarea cantității de urină absorbită, deoarece cantitatea de azot din urină se reflectă în cantitatea absorbită (Figura 1B, inserții C și B).
Pentru a evalua efectele urinei și ureei asupra supraviețuirii țânțarilor care caută gazde și supt sânge, femelele au fost hrănite cu urină de toate cele patru vârste (proaspătă, 24 ore, 72 ore și 168 ore după depunere) și o gamă de concentrații de uree, precum și apă distilată și zaharoză 10% a servit ca un control semnificativ al supraviețuirii. la femelele care caută gazdă (urină: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; uree: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) și femelele hrănite cu sânge (urină: χ2 = χ0, = pf 0,0001; 2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2D, E). În toate experimentele, femelele hrănite cu o dietă cu urină, uree și apă au avut rate de supraviețuire semnificativ mai mici în comparație cu femelele hrănite cu o dietă cu zaharoză (Figura 2B-E). 0,016) având cea mai mică probabilitate de supraviețuire (Fig. 2B). În plus, femelele care caută gazdă hrănite cu 135 mM uree au supraviețuit mai mult decât martorii cu apă (p < 0,04) (Fig.2C). În comparație cu apă, femeile hrănite cu urină proaspătă și urină de 24 de ore au supraviețuit mai mult (p = 0,001 și, respectiv, p = 0,012; Figura 2D), în timp ce femeile hrănite cu urină de 72 de ore au supraviețuit mai mult decât cele hrănite cu urină proaspătă scurtă și urină în vârstă de 24 de ore (p = 0,001, respectiv p = 0,00 Wh). ro hrănite cu 135 mM uree, femelele hrănite cu sânge au supraviețuit mai mult decât toate celelalte concentrații de uree și apă (p < 0,013; Figura 2E).
Supraviețuirea femelelor gazdă și suptătoare de sânge Anopheles arabinis care se hrănesc cu urină de vacă și uree. În biotestul (A), țânțarilor femele li s-a oferit o dietă constând din urină de vacă proaspătă și îmbătrânită, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O). femelele hrănite cu urină (B, D) și uree (C, E), iar martorii, zaharoză și apă, sunt moarte
Distanța totală și numărul de runde determinate în testul de zbor pe o perioadă de 24 de ore au diferit între țânțarii care caută gazdă și țânțarii suge de sânge, care au prezentat o activitate de zbor mai mică (Fig. 3). Țânțarii în vârstă de 68 de ore care s-au hrănit cu urină au prezentat modele de zbor diferite și au fost în principal diurni. Țânțarii femele care au furnizat zaharoză sau urină de 72 de ore au prezentat activitate pe parcursul perioadei de 24 de ore, în timp ce femelele care au furnizat apă au fost mai active la mijlocul perioadei. urina îmbătrânită a cunoscut o scădere constantă a activității pe parcursul a 24 de ore (Figura 3).
Performanța de zbor a femelei Anopheles arabinis care se hrănește cu urină de vacă și uree. În testul de zbor, țânțarii femele s-au hrănit cu urină de vacă proaspătă și îmbătrânită, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O) au fost legate de brațele orizontale, care se rotesc liber (pentru brațele care se rotesc liber (pentru brațele gazdă, femelele care se rotesc liber). au fost înregistrate distanța și numărul de zboruri pe oră pentru fiecare dietă pe o perioadă de 24 de ore (întuneric: gri; lumină: alb). Distanța medie și numărul mediu de atacuri sunt afișate în dreapta graficului activității circadiane. Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei. Analiza statistică vezi textul
În general, activitatea generală de zbor a femelelor care caută gazdă a urmat un model similar cu cel al distanței de zbor pe o perioadă de 24 de ore. Distanța medie de zbor a fost afectată semnificativ de dieta ingerată (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), iar femelele care caută gazdă au ingerat 72 de ore de urină și zburat semnificativ (în comparație cu toate celelalte distanțe mai lungi). țânțarii hrăniți cu crose au zburat mai mult decât cei proaspeți (p = 0,022) și țânțarii hrăniți cu urină în vârstă de 24 de ore (p = 0,022). Spre deosebire de tiparul de activitate de zbor descris de dieta cu urină, femelele care caută gazde hrănite cu uree au prezentat activitate de zbor persistentă pe o perioadă de 24 de ore (în perioada de vârf a găzduirii). Femelele care caută uree au crescut semnificativ distanța medie de zbor în funcție de concentrația absorbită (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001).
Activitatea generală de zbor a țânțarilor care suge sânge a fost stabilă și susținută timp de 24 de ore în toate dietele, cu o activitate crescută a urinei în a doua jumătate a perioadei întunecate pentru femelele hrănite cu apă, precum și la femelele hrănite în stare proaspătă și în vârstă de 24 de ore (imaginea 3). nu a făcut (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) .cu altă urină și dietă de control (proaspătă, p = 0,0091; 72 ore, p = 0,0022; 168 ore, p = 0,001; zaharoză, p = 0,0017; p = 0,0017; dH).
Efectele hrănirii cu urină și uree asupra parametrilor de reproducere au fost evaluate în biotestele de depunere a ouălor (Figura 4A) și au fost investigate în funcție de numărul de ouă depuse de fiecare femelă, dimensiunea ouălor și larvele de prim stadiu nou eclozionate. Numărul de ouă depuse. Fig. 4B). Femelele hrănite cu urină de 24 de ore, făinile de sânge au depus semnificativ mai multe ouă decât femelele hrănite cu alte diete cu urină și au fost similare cu cele hrănite cu zaharoză (Fig. 4B). Femelele hrănite cu zaharoză au depus ouă semnificativ mai mari decât femelele hrănite cu apă, în timp ce ouăle femelelor hrănite cu 168 de ore de urină au fost semnificativ mai mici (Fig. 4C). Femele hrănite cu urină de 72 de ore decât din ouăle depuse din larve de ouă. Femele hrănite cu apă și 168 de ore cu urină (Figura 4D).
Performanța reproductivă a femelelor Anopheles arabinis care se hrănește cu urină de vacă și uree. Femelele hrănite cu sânge au fost hrănite cu diete constând din urină de vacă proaspătă și îmbătrânită, diferite concentrații de uree, zaharoză (10%) și apă distilată (H2O) timp de 48 de ore înainte de a fi introduse în biotestele și obținerea de ouă de 48 ore (B, E, substraturi), număr de ouă (F, E, 48 ore). mărimea rvae (D, G) au fost afectate semnificativ de dieta oferită (urină de vacă: BD; uree: EG). Mediile pentru fiecare parametru măsurat folosind nume de litere diferite au fost semnificativ diferite între ele (ANOVA unidirecțională utilizând analiza post-hoc a lui Tukey; p < 0,05). Barele de eroare reprezintă eroarea standard a mediei
Ca componentă azotată majoră a urinei, ureea, atunci când este oferită ca dietă femelelor hrănite cu sânge, a afectat semnificativ parametrii reproductivi în toate studiile. Numărul de ouă depuse de femelele hrănite cu uree, după o masă de sânge, în funcție de concentrația de uree (F(11, 360) = 4,69; p < 0,001 m3 uree, concentrația femelelor între fed 4 m3,1 uree au depus mai multe ouă (Figura 4E). Femelele hrănite cu concentrații de uree de 134 µM sau mai mari depun ouă mai mari decât femelele hrănite cu apă (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F) și dimensiunea larvelor, deși sunt afectate de concentrații similare de uree (F(10, 4245) = 36,7; 0001) a fost mai variabilă (Fig. 4G).
Atracția generală pentru extractele volatile din spațiul capului de urină bovină care caută gazdă. Arabiensisul evaluat în olfactometrul cu tub de sticlă (Fig. 5A) a fost afectat semnificativ de vârsta urinei (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). alte tratamente (72 de ore: p = 0,0060, 168 de ore: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), Cu excepția mirosului de urină proaspătă (p = 0,13; Figura 5B). Deși atracția generală a țânțarilor care suge sângele față de urină nu a fost semnificativă (d = 8,87 = 2 = miros de urină diferit). .067; Fig. 5C), aceste femele s-au dovedit a fi semnificativ mai atractive pentru extractele volatile din spațiul capului în comparație cu urina în vârstă de 72 de ore, comparativ cu martorii (p = 0,0066; Figura 5C).
Răspunsuri comportamentale la mirosurile naturale și sintetice ale urinei de vacă în căutarea gazdei și a țânțarilor hrăniți cu sânge. Schema olfactometrului cu tub de sticlă (A). Sunt prezentate urina de vacă în vârstă de 72 de ore (F) și 168 de ore (G). Urmele de detecție a antenei de electroni (EAD) arată modificări de tensiune ca răspuns la compușii bioactivi din spațiul de cap eluați de la cromatograful în gaz și detectate de un detector de ionizare în flacără (FID). Compușii sunt afișați. Un singur asterisc (*) indică un răspuns consistent de amplitudine scăzută. Asteriscurile duble (**) indică răspunsuri nereproductibile. Găsiți gazda (H) și sugătorul de sânge (I). c analiza;p < 0,05).Barele de eroare reprezintă eroarea standard a scalei
Femela Ann.arabiensis, la 72 de ore și 120 de ore după masa de sânge, în timpul depunerii, nu s-a arătat nicio preferință pentru extractele volatile din spațiul capului din urina de vacă proaspătă și îmbătrânită în comparație cu martorii pentan (χ2 = 3,07, p > 0,05; Fișier suplimentar 1: Fig. S1).
Pentru femeile Ann.arabiensis, analizele GC-EAD și GC-MS au identificat opt, șase, trei și trei compuși bioactivi (Figura 5D-G). hold au fost incluse în analizele ulterioare.
Rata totală de eliberare volatilă a compușilor bioactivi din colecția spațiului de cap a crescut de la 29 µg h-1 în urina proaspătă la 242 µg h-1 în urina îmbătrânită de 168 de ore, în principal datorită creșterii p-crezolului și m-formaldehidei Fenolul, precum și fenolul. scăderea observată a intensității semnalului (abundența) în cromatogramă (Fig. 5D)-G panoul din stânga) și răspunsurile fiziologice la acești compuși (Fig. 5D-G panoul din dreapta).
În general, amestecul sintetic a avut o proporție naturală similară de compuși bioactivi identificați în extractele volatile din spațiile de cap de urină proaspătă și îmbătrânită (Fig. 5D-G) și nu a părut să obțină un atracție semnificativă în căutarea unei gazde (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) sau p. Cu toate acestea, comparațiile post-hoc în perechi între tratamente au arătat că țânțarii care caută gazdă au fost semnificativ atractivi pentru amestecul sintetic de urină în vârstă de 24 de ore, comparativ cu martorii pentan (p = 0,0086; Figura 5H).
Pentru a evalua rolul componentelor individuale în amestecuri sintetice de urină îmbătrânită de 24 de ore, șase amestecuri subtractive au fost evaluate față de amestecuri complete în testul cu tub Y, în care compușii individuali au fost îndepărtați. Pentru țânțarii care caută gazdă, scăderea compușilor individuali din amestecul complet a avut un efect semnificativ asupra răspunsurilor comportamentale (χ62, 30; În schimb, îndepărtarea compușilor individuali din amestecul complet sintetic nu a afectat răspunsurile comportamentale ale țânțarilor care suge sângele (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), cu excepția faptului că a rezultat în comparație cu un nivel mai scăzut de decan (0,077). 22; Fișier suplimentar 1: Figura S2B).
Într-un sat cu malarie endemică din Etiopia, eficacitatea unui amestec sintetic de urină de vacă de 24 de ore în atragerea țânțarilor în condiții de câmp a fost evaluată timp de zece nopți (Fig. 6A). Au fost capturați și identificați un total de 4.861 de țânțari, dintre care 45,7% au fost Anthrophes. 35,4% au fost Culex spp. (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Anopheles arabinis este singurul membru al complexului de specii An.Gambian identificat prin analiza PCR. În medie, 320 de țânțari au fost capturați pe noapte, timp în care capcanele cu momeli în amestec sintetic au prins mai mulți țânțari decât capcane pereche, χ190(pg. 0,0001) .Capcanele nemomelite au fost instalate în fiecare dintre cele cinci nopți de control la începutul, mijlocul și sfârșitul procesului. Număr similar de țânțari au fost capturați în fiecare pereche de capcane, indicând nicio distorsiune între case (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05 și studiul populației cu scădere a numărului de control în perioada de 0.005. Quito-urile prinse în capcanele care conțin amestecul sintetic a fost semnificativ crescută: căutarea gazdei (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), hrănire recentă cu sânge (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) și sarcină = 0,20,χ282(0,2,χ282) ;Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Acest lucru se reflectă, de asemenea, în numărul total de țânțari capturați: gazdă care caută > suge de sânge > gravidă > semi gravidă > mascul.
Evaluarea pe teren a eficacității unui amestec sintetic de miros de urină de vacă de 24 de ore. Testele de teren au fost efectuate în sud-centrala Etiopiei (hartă), în apropiere de orașul Maki (inserat), folosind o capcană luminoasă Centers for Disease Control (CDC) (dreapta) în case pereche, cu un design pătrat latin (captură aeriană) și atracție foto-aerică. nopheles arabesques (B), dar nu Anopheles farroes (C), într-o manieră diferită, un efect fiziologic dependent de stare. În plus, aceste capcane au capturat un număr semnificativ crescut de țânțari Culex gazdă. (D) În comparație cu controlul. Barele din stânga reprezintă indicele mediu de selecție al țânțarilor prinși în perechi de țânțari prinși în perechi de țânțari (în timp ce) și de control în dreapta reprezintă indicele mediu de selecție în perechi de capcane de control (deschise; N = 5).).Asteriscurile indică niveluri de semnificație statistică (*p = 0,01 și ***p < 0,0001)
Cele trei specii au fost capturate diferit în capcane care conțin amestecuri sintetice. Căutarea gazdei (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), hrănirea cu sânge (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) și sarcina (χ2(1, 1345) =, χ81. .arabiensis a fost prins în capcană eliberând amestecul sintetic (Fig. 6B), în timp ce cantitatea de An nu a fost diferită. S-a găsit Pharoensis în diferite stări fiziologice (Fig. 6C). Pentru Culex, doar o creștere semnificativă a numărului de țânțari care caută gazde a fost găsită în capcanele momelate cu amestecul sintetic (p.13 =129)(p. 4; Fig. 6D), comparativ cu capcanele de control.
Capcanele de momeală pentru gazdă situate în afara gazdelor potențiale între locurile de reproducere și comunitățile rurale din Etiopia au fost folosite pentru a evalua dacă țânțarii malariei folosesc mirosul de urină de vacă ca indiciu al habitatului gazdă. În absența indicilor gazdei, căldură și cu sau fără prezența mirosului de urină de vacă, nu au fost capturați țânțari (Fișier suplimentar 1: Figura 1: prezența femelelor de temperatură înaltă și a femelei). degetele de la picioare au fost atrase și capturate, deși în număr mic, independent de vârsta urinei (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Fișier suplimentar 1: Figura S3). În schimb, controalele de apă nu au capturat țânțari de malarie la temperaturi ridicate (Fișier suplimentar 1: Figura S3).
Țânțarii de malarie dobândesc și distribuie compuși care conțin azot prin hrănirea compensatorie cu urina de vacă (adică, bălți) pentru a îmbunătăți trăsăturile istoriei vieții, similar cu alte insecte [2, 4, 24, 25, 26]. țânțarii găsesc această resursă prin miros și sunt capabili să regleze absorbția compușilor azotați în urină, inclusiv ureea, componenta majoră a azotului din urină [15, 16]. În funcție de starea fiziologică a țânțarilor femele, nutrienții din urină sunt alocați pentru a îmbunătăți activitatea de zbor și supraviețuirea, supraviețuirea și supraviețuirea individului femelelor cu caracter de reproducere și reproducere. În timpul primului ciclu gonadotrop. Prin urmare, amestecul de urină joacă un rol nutrițional important pentru vectorii malariei care sunt închiși ca și adulții malnutriți [8], deoarece oferă țânțarilor femele capacitatea de a dobândi compuși azotați importanți prin angajarea în hrănire cu risc scăzut. poate fi ținta viitoarelor programe de management al vectorilor.