De opname en distributie van voedingsstoffen integreert de foerageer- en levenscycluskenmerken van insecten. Om tekorten aan specifieke voedingsstoffen in verschillende levensstadia te compenseren, kunnen insecten deze voedingsstoffen verkrijgen door middel van aanvullende voeding, bijvoorbeeld door zich te voeden met secreties van gewervelde dieren in een proces dat bekend staat als 'plassen'. De mug Anopheles arabiani lijkt ondervoed te zijn en heeft daarom voedingsstoffen nodig voor zowel de stofwisseling als de voortplanting. Het doel van deze studie was om te onderzoeken of het roeren van An. arabiensis op koeienurine voor de opname van voedingsstoffen de levenscycluskenmerken verbetert.
Zorg ervoor dat het veilig is. Arabiensis werd aangetrokken door de geur van verse, 24 uur, 72 uur en 168 uur oude koeienurine. Gastheerzoekende en bloedzuigende (48 uur na de bloedmaaltijd) vrouwtjes werden gemeten in een Y-buisolfactometer en drachtige vrouwtjes werden beoordeeld op hun paaigedrag. Vervolgens werd een gecombineerde chemische en elektrofysiologische analyse gebruikt om bioactieve stoffen in koeienurine te identificeren in alle vier leeftijdsgroepen. Synthetische mengsels van bioactieve stoffen werden geëvalueerd in Y-buis- en veldproeven. Om koeienurine en de belangrijkste stikstofhoudende verbinding ureum te onderzoeken als potentiële aanvullende voeding voor malariamuggen, werden voedingsparameters en levenscycluskenmerken gemeten. Het percentage vrouwelijke muggen en de hoeveelheid geabsorbeerde koeienurine en ureum werden beoordeeld. Na de voeding werden de vrouwtjes beoordeeld op overleving, vastgebonden vlucht en voortplanting.
Ze zoeken naar het bloed en de voeding van de gastheer. In laboratorium- en veldstudies werden Arabische zeugen aangetrokken door de natuurlijke en synthetische geur van verse en oude koeienurine. Zwangere vrouwtjes reageerden onverschillig op de geur van koeienurine op de paaiplaatsen. Gastheerzoekende en bloedzuigende vrouwtjes absorberen actief koeienurine en ureum en verdelen deze hulpbronnen op basis van afwegingen in hun levenscyclus, afhankelijk van hun fysiologische toestand, voor vlucht, overleving of voortplanting.
De opname en verspreiding van koeienurine door Anopheles arabinis voor verbeterde levenscycluskenmerken. Het bijvoeren van koeienurine beïnvloedt de vectorcapaciteit direct door de dagelijkse overleving en vectordichtheid te verhogen, en indirect door de vliegactiviteit te veranderen. Dit aspect dient daarom in toekomstige modellen te worden meegenomen.
De opname en distributie van voedingsstoffen integreert de foerageer- en levenscycluskenmerken van insecten [1,2,3]. Insecten zijn in staat voedsel te selecteren en te verwerven en compenserend te eten op basis van de beschikbaarheid van voedsel en de voedingsbehoeften [1, 3]. De distributie van voedingsstoffen hangt af van het levenscyclusproces en kan leiden tot verschillende eisen aan de kwaliteit en kwantiteit van het dieet in verschillende levensstadia van insecten [1, 2]. Om tekorten aan specifieke voedingsstoffen te compenseren, kunnen insecten deze voedingsstoffen verkrijgen door middel van aanvullende voeding, zoals modder, verschillende uitwerpselen en afscheidingen van gewervelde dieren, en aas, een proces dat bekend staat als 'plassen' [2]. Hoewel er voornamelijk een verscheidenheid aan vlinder- en mottensoorten wordt beschreven, komen waterpoelen ook voor bij andere insectenordes, en de aantrekkingskracht tot en het eten van dit soort hulpbronnen kan aanzienlijke effecten hebben op de gezondheid en andere levenscycluskenmerken [2, 4, 5, 6, 7]. De malariamug Anopheles gambiae sensu lato (sl) komt tevoorschijn als een 'ondervoed' volwassen insect [8], dus water kan een belangrijke rol spelen. in zijn levenscycluskenmerken, maar dit gedrag is tot nu toe verwaarloosd. Het gebruik van agitatie als middel om de voedingsinname bij dit belangrijke voertuig te verhogen, verdient aandacht, aangezien dit belangrijke epidemiologische gevolgen kan hebben.
De stikstofopname bij volwassen vrouwelijke Anopheles-muggen is beperkt vanwege de lage calorische reserves die ze vanuit het larvenstadium hebben opgebouwd en de inefficiënte benutting van de bloedmaaltijd [9]. Vrouwelijke Ann.gambiae sl compenseert dit doorgaans door extra bloedmaaltijden te nuttigen [10, 11], waardoor meer mensen het risico lopen de ziekte op te lopen en muggen een groter risico lopen om ten prooi te vallen aan roofdieren. Als alternatief kunnen muggen zich voeden met uitwerpselen van gewervelde dieren om stikstofverbindingen te verkrijgen die hun aanpassingsvermogen en vliegmanoeuvreerbaarheid verbeteren, zoals is aangetoond bij andere insecten [2]. In dit opzicht is de sterke en duidelijke aantrekkingskracht van een van de verwante soorten binnen het An.gambiae sl-soortencomplex, Anopheles arabinis, op verse en bewaarde koeienurine [12, 13, 14] interessant. Anopheles arabinis is opportunistisch in zijn gastheervoorkeuren en staat erom bekend dat hij zich associeert met runderen en zich daarop voedt. Koeienurine is een bron rijk aan stikstofverbindingen, waarbij ureum 50-95% van de totale stikstof in verse urine uitmaakt. [15, 16]. Naarmate koeienurine ouder wordt, gebruiken micro-organismen deze hulpbronnen om de complexiteit van stikstofverbindingen binnen 24 uur te verminderen [15]. Door de snelle toename van ammoniak, die gepaard gaat met een afname van organische stikstof, gedijen alkalofiele micro-organismen (waarvan vele verbindingen produceren die giftig zijn voor muggen) [15]. Vrouwelijke Ann. arabiensis wordt bij voorkeur aangetrokken tot urine die 24 uur of jonger is [13, 14].
In deze studie werd gezocht naar gastheer- en bloedgevoede Ans. Tijdens de eerste gonadotropinecyclus werd bij Anopheles arabiensis de opname van stikstofverbindingen, waaronder ureum, door middel van urinevermenging onderzocht. Vervolgens werd een reeks experimenten uitgevoerd om te bepalen hoe vrouwelijke muggen deze potentiële voedingsbron verdelen voor een betere overleving, voortplanting en verdere voedselverwerving. Ten slotte werd de geur van verse en oude koeienurine beoordeeld om te bepalen of deze betrouwbare aanwijzingen opleverde voor gastheer- en bloedgevoede An. In hun zoektocht naar deze potentiële voedingsbron ontdekten Anopheles arabiensis chemische correlaties achter de waargenomen differentiële aantrekkelijkheid. Synthetische geurmengsels van vluchtige organische stoffen (VOC's) die werden geïdentificeerd in 24 uur oude urine werden verder geëvalueerd onder veldomstandigheden, waarmee de resultaten verkregen onder laboratoriumomstandigheden werden uitgebreid en het effect van de geur van runderurine op verschillende fysiologische toestanden werd aangetoond. Muggenaantrekking. De verkregen resultaten bevestigen dat An. Arabiensis neemt stikstofverbindingen op die in de urine van gewervelde dieren voorkomen en verspreidt deze om de levenscycluskenmerken te beïnvloeden. Deze resultaten worden besproken in de context van mogelijke epidemiologische gevolgen en hoe ze kunnen worden gebruikt voor vectorbewaking en -bestrijding.
Anopheles arabicans (Dongola-stam) werden gehouden bij 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relatieve luchtvochtigheid en een licht-donkercyclus van 12:12 uur. Larven werden gekweekt in plastic bakken (20 cm × 18 cm × 7 cm) gevuld met gedestilleerd water en gevoed met Tetramin® visvoer (Tetra Werke, Melle, Duitsland). Poppen werden verzameld in bekers van 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Zweden) en vervolgens overgebracht naar Bugdorm-kooien (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) om de volwassen insecten te laten uitkomen. Volwassen insecten kregen tot 4 dagen na het uitkomen (dpe) onbeperkt toegang tot een 10% sucroseoplossing. Op dat moment kregen vrouwtjes die op zoek waren naar een gastheer vlak voor het experiment voedsel aangeboden, of werden ze een nacht lang uitgehongerd met gedestilleerd water. zoals hieronder beschreven. Vrouwtjes die werden gebruikt voor experimenten in de vliegbuis werden slechts 4-6 uur uitgehongerd, maar kregen onbeperkt water. Om bloedzuigende muggen voor te bereiden voor de daaropvolgende bioassays, kregen vrouwtjes van 4 dagen oud ontvezeld schapenbloed (Håtunalab, Bro, SE) via een membraanvoedingssysteem (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, VK). Volledig verzadigde vrouwtjes werden vervolgens overgebracht naar individuele kooien en kregen direct voeding, zoals hieronder beschreven, of 10% sucrose onbeperkt gedurende 3 dagen voorafgaand aan de hieronder beschreven experimenten. De laatstgenoemde vrouwtjes werden gebruikt voor bioassays in de vliegbuis en overgebracht naar het laboratorium, waar ze vervolgens 4-6 uur voor aanvang van het experiment onbeperkt gedestilleerd water kregen.
Voedingsproeven werden gebruikt om de consumptie van urine en ureum bij volwassen vrouwelijke An. Arab-muggen te kwantificeren. Gastheerzoekende en bloedzuigende vrouwtjes kregen gedurende 48 uur een dieet aangeboden dat 1% verdunde verse en gerijpte koeienurine, verschillende concentraties ureum en twee controles (10% sucrose en water) bevatte. Daarnaast werd voedselkleurstof (1 mg ml-1 xyleencyanide FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) aan het dieet toegevoegd en aangeboden in een 4 × 4 matrix in microcentrifugebuisjes van 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, VS; Figuur 1A). Vul tot de rand (~300 µl). Om concurrentie tussen muggen en mogelijke effecten van de kleurstof te vermijden, werden 10 muggen in een grote petrischaal (12 cm diameter en 6 cm hoogte; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figuur 1A) in volledige duisternis geplaatst bij 25 ± 2 cm °C en 65 ± 5% relatieve luchtvochtigheid. Deze experimenten werden 5 tot 10 keer herhaald. Na blootstelling aan het dieet werden de muggen bij -20 °C bewaard tot verdere analyse.
Zoek naar runderurine en ureum geabsorbeerd door de gastheer en bloedzuigende vrouwtjes van de Anopheles arabianus-mug. In een voedingsproef (A) kregen vrouwelijke muggen een dieet bestaande uit verse en gerijpte runderurine, verschillende concentraties ureum, sucrose (10%) en gedestilleerd water (H2O). Gastheerzoekende (B) en bloedzuigende (C) vrouwtjes absorbeerden meer sucrose dan bij elk ander getest dieet. Merk op dat gastheerzoekende vrouwtjes 72-uurs runderurine minder absorbeerden dan 168-uurs runderurine (B). Het gemiddelde totale stikstofgehalte (± standaarddeviatie) van de urine wordt weergegeven in de inzet. Gastheerzoekende (D, F) en bloedzuigende (E, G) vrouwtjes nemen ureum op een dosisafhankelijke manier op. De gemiddelde ingeademde volumes (D, E) met verschillende letterbenamingen verschilden significant van elkaar (eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoc analyse; p < 0,05). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde weer. (BE).De rechte stippellijn geeft de log-lineaire regressielijn weer (F, G)
Om geabsorbeerd voedsel vrij te maken, werden muggen afzonderlijk in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml geplaatst die 230 µl gedestilleerd water bevatten. Het weefsel werd vervolgens verstoord met behulp van een wegwerpstamper en een draadloze motor (VWR International, Lund, SE), gevolgd door centrifugatie bij 10.000 tpm gedurende 10 minuten. Het supernatant (200 µl) werd overgebracht naar een 96-wells microplaat (Sigma-Aldrich) en de absorptie (λ620 nm) werd bepaald met behulp van een spectrofotometer-gebaseerde microplaatlezer (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE). Als alternatief werden de muggen fijngemalen in 1 ml gedestilleerd water, waarvan 900 µl werd overgebracht naar een cuvet voor spectrofotometrische analyse (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Om de voedselinname te kwantificeren, werd een standaardcurve opgesteld door seriële verdunning tot een concentratie van 0,2 µl tot 2,4 µl van 1 mg ml-1 xyleencyanide. Vervolgens werd de optische dichtheid van bekende kleurstofconcentraties gebruikt om de hoeveelheid voedsel te bepalen die elke mug had ingenomen.
Volumegegevens werden geanalyseerd met behulp van een eenzijdige variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's post-hoc paarsgewijze vergelijkingen (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, VS, 1989–2007). Lineaire regressieanalyses beschreven de concentratieafhankelijke ureumopname en vergeleken de reacties tussen gastheerzoekende en bloedzuigende muggen (GraphPad Prism v8.0.0 voor Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, VS).
Ongeveer 20 µl urinemonsters van elke leeftijdsgroep werden gebonden aan Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) en ingekapseld in tin capsules (8 mm × 5 mm). De capsules werden in de verbrandingskamer van een CHNS/O-analysator (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) geplaatst om het stikstofgehalte in verse en verouderde urine te bepalen volgens het protocol van de fabrikant. Het totale stikstofgehalte (g N l-1) werd gekwantificeerd op basis van bekende ureumconcentraties die als standaard werden gebruikt.
Om het effect van het dieet op de overleving van gastheerzoekende en bloedzuigende vrouwtjesmuggen te beoordelen, werden de muggen individueel in grote petrischalen geplaatst (12 cm diameter en 6 cm hoogte; Semadeni) met een met gaas bedekt gat in het deksel (3 cm diameter) voor ventilatie en voedselaanvoer. Het dieet werd direct na 4 dagen na infectie (dpe) verstrekt en bestond uit 1% verdunde verse en gerijpte koeienurine, vier concentraties ureum en twee controles: 10% sucrose en water. Elk dieet werd met een pipet op een tandheelkundige tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) aangebracht, die in een spuit van 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE) werd geplaatst, waarna de zuiger werd verwijderd en het geheel op een petrischaal werd gelegd (figuur 1A). Verander het dieet dagelijks. Onderhoud het laboratorium zoals hierboven beschreven. Overlevende muggen werden tweemaal daags geteld, terwijl dode muggen werden verwijderd totdat de laatste mug stierf (n = 40 per behandeling). Overleving van De overlevingskansen van muggen die met verschillende diëten werden gevoed, werden statistisch geanalyseerd met behulp van Kaplan-Meier-overlevingscurven en log-rank-toetsen om de overlevingsverdeling tussen de diëten te vergelijken (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Een op maat gemaakte vliegende molen voor muggen, gebaseerd op Attisano et al.[17], gemaakt van 5 mm dikke, transparante acrylpanelen (10 cm breed x 10 cm lang x 10 cm hoog) zonder voor- en achterpanelen (Fig. 3: boven). Een draaipuntconstructie met een verticale buis gemaakt van een gaschromatografiekolom (0,25 mm binnendiameter; 7,5 cm lengte) waarvan de uiteinden zijn vastgelijmd aan een insectennaald die is opgehangen tussen een paar neodymiummagneten op 9 cm afstand van elkaar. Een horizontale buis van hetzelfde materiaal (6,5 cm lengte) doorsnijdt de verticale buis om een ​​vastgebonden arm te vormen en een arm die een klein stukje aluminiumfolie draagt ​​als lichtonderbrekend signaal.
Vrouwtjesmuggen die 24 uur hadden gevast, kregen het bovenstaande dieet gedurende 30 minuten voordat ze werden vastgezet. Volledig gevoede vrouwtjesmuggen werden vervolgens individueel gedurende 2-3 minuten op ijs verdoofd en met bijenwas aan insectenpinnen bevestigd (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) en vervolgens vastgebonden aan de armen van de horizontale buizen. Vliegmolen. Het aantal omwentelingen per vlucht werd geregistreerd door een speciaal gebouwde datalogger, waarna de gegevens werden opgeslagen en weergegeven met behulp van PC-Lab 2000™ software (v4.01; Velleman, Gavere, BE). De vliegmolen werd geplaatst in een klimaatgeregelde ruimte (12 uur licht: 12 uur donker, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Om het vliegpatroon te visualiseren, werden de totale afgelegde afstand (m) en het totale aantal opeenvolgende vluchten per uur berekend over een periode van 24 uur. Daarnaast werden de gemiddelde afgelegde afstanden van individuele vrouwtjes vergeleken tussen de verschillende behandelingen en geanalyseerd met behulp van een eenweg-ANOVA en Tukey's post-hoc analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), waarbij de gemiddelde afstand als afhankelijke variabele werd beschouwd en de behandeling als onafhankelijke factor. Bovendien werd het gemiddelde aantal rondes berekend in intervallen van 10 minuten.
Om het effect van het dieet op de reproductieve prestaties van An. arabiensis te beoordelen, werden zes vrouwtjes (4 dagen oud) na bloedafname direct overgebracht naar Bugdorm-kooien (30 cm × 30 cm × 30 cm) en vervolgens gedurende 48 uur voorzien van het experimentele dieet zoals hierboven beschreven. Op de derde dag werden de diëten verwijderd en werden er gedurende 48 uur paaibekers (30 ml; Nolato Hertila) gevuld met 20 ml gedestilleerd water geplaatst, die elke 24 uur werden ververst. Elk dieetregime werd 20-50 keer herhaald. De eieren werden geteld en geregistreerd voor elke experimentele kooi. Submonsters van eieren werden gebruikt om de gemiddelde grootte en de lengtevariatie van individuele eieren te bepalen (n ≥ 200 per dieet) met behulp van een Dialux-20 microscoop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) uitgerust met een Leica Camera (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). De overgebleven eieren werden 24 uur lang in een klimaatgeregelde ruimte onder standaard kweekomstandigheden bewaard, en een submonster van recent uitgekomen larven in het eerste stadium (n ≥ 200 per dieet) werd gemeten, zoals hierboven beschreven. Het aantal eieren en de grootte van de eieren en larven werden vergeleken tussen de behandelingen met behulp van een eenweg-ANOVA en Tukey's post-hoc analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
De vluchtige stoffen in de headspace van verse (1 uur na bemonstering), 24 uur, 72 uur en 168 uur oude urine werden verzameld van Zeboe-runderen van het Arsi-ras. Voor het gemak werden de urinemonsters 's ochtends vroeg verzameld, terwijl de koeien nog in de stal stonden. Urinemonsters werden verzameld van 10 individuen en 100-200 ml van elk monster werd overgebracht naar afzonderlijke polyamide bakzakken (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) in 3 liter polyamide vaten met deksel, die waren gemaakt van vinylchloride. De vluchtige stoffen in de headspace van elk runderurinemonster werden verzameld, hetzij direct (vers) hetzij na rijping bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, 72 uur en 168 uur. Elk urinemonster was dus representatief voor elke leeftijdsgroep.
Voor het opvangen van vluchtige stoffen in de gasfase werd een gesloten systeem gebruikt om een ​​met actieve kool gefilterde gasstroom (100 ml min-1) gedurende 2,5 uur door een polyamidezak naar de adsorptiekolom te leiden met behulp van een membraanvacuümpomp (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Als controle werd de gasfase opgevangen vanuit een lege polyamidezak. De adsorptiekolom bestond uit Teflon-slang (5,5 cm x 3 mm binnendiameter) met 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, VS) tussen glaswolpluggen. Vóór gebruik werd de kolom gespoeld met 1 ml geherdistilleerde n-hexaan (Merck, Darmstadt, DE) en 1 ml pentaan (99,0% zuiver oplosmiddel, GC-kwaliteit, Sigma Aldrich). De geadsorbeerde vluchtige stoffen werden geëlueerd met 400 μl pentaan. De gasfase-opvangmonsters werden samengevoegd en Vervolgens worden ze bewaard bij -20 °C tot ze voor verdere analyse worden gebruikt.
Gedragsreacties van gastheerzoekende en bloedzuigende An. Headspace vluchtige extracten verzameld uit verse, 24-uurs, 72-uurs en 168-uurs oude urine werden geanalyseerd op vluchtige extracten van Arabidopsis-muggen met behulp van een rechte glazen buisolfactometer [18]. De experimenten werden uitgevoerd tijdens ZT 13-15, de piekperiode van An's huiszoekende activiteit. Arab [19]. Een glazen buisolfactometer (80 cm × 9,5 cm binnendiameter) werd van bovenaf verlicht met 3 ± 1 lx rood licht. Een met houtskool gefilterde en bevochtigde luchtstroom (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relatieve vochtigheid) passeerde de bioassay met een snelheid van 30 cm s-1. De lucht wordt door een reeks roestvrijstalen gaasschermen geleid, waardoor een laminaire stroming en een uniforme pluimstructuur ontstaan. Tandheelkundige tampondispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), opgehangen aan een 5 cm lange spoel aan de loefzijde van de olfactometer, waarbij de stimulator elke 5 minuten werd vervangen. Voor de analyse werd 10 μl van elk headspace-extract, verdund 1:10, gebruikt als stimulus. Een gelijke hoeveelheid pentaan werd gebruikt als controle. Individuele gastheerzoekende of bloedzuigende muggen werden 2-3 uur voor aanvang van het experiment in afzonderlijke kooien geplaatst. De kooi werd aan de loefzijde van de olfactometer geplaatst en de muggen kregen 1 minuut de tijd om te acclimatiseren, waarna de vlinderklep van de kooi werd geopend om ze vrij te laten. De aantrekking tot de behandeling of controle werd geanalyseerd als het percentage muggen dat binnen 5 minuten na vrijlating in contact kwam met de bron. Elk vluchtig headspace-extract en elke controle werden minstens 30 keer herhaald en om de effecten van één dag te vermijden, werd op elke experimentele dag hetzelfde aantal behandelingen en controles getest. Zoekreacties van gastheer en bloedzuigende muggen Antwoord: De vergelijkingen tussen Arabische en headspace-sets werden geanalyseerd met behulp van nominale logistische regressie, gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen voor odds ratio's (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
De paairespons van An. Headspace-extracten van verse en verouderde koeienurine werden geanalyseerd in Bugdorm-kooien (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastic bekers (30 ml; Nolato Hertila) gevuld met 20 ml gedestilleerd water dienden als paaisubstraat en werden in tegenoverliggende hoeken van de kooi geplaatst, op 24 cm afstand van elkaar. De behandelingsbekers werden aangevuld met 10 μl van elk headspace-extract in een verdunning van 1:10. Een gelijke hoeveelheid pentaan werd gebruikt om de controlebeker aan te vullen. De behandelings- en controlebekers werden tussen elk experiment verwisseld om positionele effecten te controleren. Tien bloedgevoede vrouwtjes werden tussen ZT 9 en 11 in de experimentele kooien geplaatst en de eieren in de bekers werden 24 uur later geteld. De formule voor het berekenen van de paai-index is: (aantal gelegde eieren in de behandelingsbeker – aantal gelegde eieren in de controlebeker) / (totaal aantal gelegde eieren). Elke behandeling werd herhaald. 8 keer.
Gaschromatografische en elektronenantennepatroondetectie (GC-EAD) analyse van vrouwelijke An.arabiensis werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [20]. Kort gezegd werden verse vluchtige extracten uit de headspace gescheiden met behulp van een Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, VS) uitgerust met een HP-5 kolom (30 m × 0,25 mm binnendiameter, 0,25 μm filmdikte, Agilent Technologies). en verouderde urine. Waterstof werd gebruikt als mobiele fase met een gemiddelde lineaire stroomsnelheid van 45 cm s⁻¹. Elk monster (2 μl) werd gedurende 30 seconden geïnjecteerd in splitloze modus met een inlaattemperatuur van 225 °C. De GC-oventemperatuur werd geprogrammeerd van 35 °C (3 minuten vasthouden) tot 300 °C (10 minuten vasthouden) met een stijging van 10 °C min⁻¹. In de GC-effluentsplitter werd 4 psi stikstof toegevoegd en 1:1 gesplitst in een Gerstel 3D/2 low dead volume cross (Gerstel, Mülheim, DE) tussen de vlamionisatiedetector en de EAD. De GC-effluentcapillair voor de EAD werd door een Gerstel ODP-2 transferlijn, die de GC-oventemperatuur plus 5 °C volgt, naar een glazen buis (10 cm × 8 mm) geleid, waar het werd gemengd met koolstofgefilterde, bevochtigde lucht (1,5 l min⁻¹). De antenne werd op 0,5 cm afstand van de uitgang van de buis geplaatst. Elke individuele mug telde als één herhaling, en voor gastheerzoekende muggen werden minstens drie herhalingen uitgevoerd op urinemonsters van elke leeftijd.
Identificatie van bioactieve stoffen in headspace-monsters van verse en verouderde runderurine met behulp van een gecombineerde GC- en massaspectrometer (GC-MS; 6890 GC en 5975 MS; Agilent Technologies) om antennale responsen op te wekken in GC-EAD-analyse, werkend in de elektronenimpactionisatiemodus bij 70 eV. De GC was uitgerust met een HP-5MS UI-gecoate gesmolten silica capillaire kolom (60 m × 0,25 mm binnendiameter, 0,25 μm filmdikte) met helium als mobiele fase en een gemiddelde lineaire stroomsnelheid van 35 cm s⁻¹. Een monster van 2 μl werd geïnjecteerd met dezelfde injectorinstellingen en oventemperatuur als voor de GC-EAD-analyse. Stoffen werden geïdentificeerd op basis van hun retentietijd (Kovát-index) en massaspectra, vergeleken met de aangepaste bibliotheek en de NIST14-bibliotheek (Agilent). Geïdentificeerde stoffen werden bevestigd door injectie van authentieke standaarden (Aanvullend bestand 1: Tabel S2). Voor kwantificering werd heptylacetaat (10 ng, 99,8% chemische zuiverheid, Aldrich) geïnjecteerd als externe standaard.
De effectiviteit van een synthetisch geurmengsel, bestaande uit bioactieve stoffen die zijn geïdentificeerd in verse en verouderde urine, om gastheerzoekende en bloedzuigende Ans. arabiensis-muggen aan te trekken, werd geëvalueerd met behulp van dezelfde olfactometer en hetzelfde protocol als hierboven beschreven. De synthetische mengsels bootsten de samenstelling en verhoudingen na van de verbindingen in gemengde vluchtige extracten van verse, 24-uurs, 48-uurs, 72-uurs en 168-uurs verouderde urine (Figuur 5D-G; Aanvullend bestand 1: Tabel S2). Voor de analyse werd 10 μl van een 1:100 verdunning van het volledig synthetische mengsel gebruikt, met een totale afgiftesnelheid variërend van ongeveer 140-2400 ng h-1, om de aantrekkelijkheid voor gastheer- en bloedzuigende muggen te beoordelen. Vervolgens werd de test uitgevoerd op complete mengsels, waarbij subtractieve mengsels van afzonderlijke verbindingen uit het complete mengsel werden verwijderd. De zoekreacties van gastheer- en bloedgevoede Ans. arabiensis-muggen op de synthetische en subtractieve mengsels werden geanalyseerd. met behulp van nominale logistische regressie, gevolgd door paarsgewijze vergelijkingen voor odds ratio's (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Om te beoordelen of koeienurine als gastheerhabitatsignaal voor malariamuggen kan dienen, werden verse en bewaarde koeienurine, verzameld zoals hierboven beschreven, en water in emmers van 3 liter met gaas (100 ml) gedaan en in lokvallen geplaatst (BG-HDT-versie; BioGents, Regensburg, Duitsland). Tien vallen werden op 50 meter afstand van elkaar in een weiland geplaatst, op 400 meter van een dorp (Silay, Ethiopië, 5°53´24´´N, 37°29´24´´O) en zonder vee, op permanente broedplaatsen en in dorpen. Vijf vallen werden verwarmd om de aanwezigheid van een gastheer te simuleren, terwijl vijf vallen onverwarmd bleven. Elke behandelingslocatie werd gedurende vijf nachten geroteerd. Het aantal muggen dat in de vallen met urine van verschillende leeftijden werd gevangen, werd vergeleken met behulp van logistische regressie met een bèta-binomiale verdeling (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
In een dorp waar malaria endemisch is, nabij de stad Maki in de regio Oromia, Ethiopië (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ O; Figuur 6A). Het onderzoek werd uitgevoerd tussen half augustus en half september, vóór de jaarlijkse binnenshuis bespuiting met insecticiden, en tijdens een lang regenseizoen. Vijf paren huizen (20-50 m van elkaar verwijderd) aan de rand van het dorp werden geselecteerd voor het onderzoek (Fig. 6A). De criteria voor de selectie van de huizen waren: geen dieren toegestaan ​​in huis, niet binnenshuis koken (het gebruik van brandhout of houtskool) toegestaan ​​(ten minste gedurende de proefperiode), en huizen met maximaal twee bewoners die in niet-geïnsecticeerde ruimtes sliepen. onder het behandelde muggennet. Ethische goedkeuring is verleend door de Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) van de Faculteit Natuurwetenschappen (CNS-IRB) van de Universiteit van Addis Ababa, in overeenstemming met de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van de Wereld Medische Associatie. Toestemming van elk gezinshoofd werd verkregen met de hulp van medewerkers van de gezondheidsvoorlichting. Het gehele proces wordt ondersteund door de lokale overheden op districts- en wijkniveau ('kebele'). Het experimentele ontwerp volgde een 2 × 2 Latijns vierkant ontwerp, waarbij synthetische mengsels en controles werden toegewezen aan gepaarde huizen op de eerste nacht en tussen de huizen werden verwisseld op de volgende experimentele nacht. Dit proces werd tien keer herhaald. Daarnaast werden, om de muggenactiviteit in geselecteerde huizen te schatten, de CDC-vallen ingesteld om gedurende vijf opeenvolgende nachten te draaien aan het begin, midden en einde van de veldproef, op hetzelfde tijdstip van de dag.
Een synthetisch mengsel met zes bioactieve verbindingen werd opgelost in heptaan (97,0% oplosmiddel GC-kwaliteit, Sigma Aldrich) en vrijgegeven met een snelheid van 140 ng h-1 met behulp van een katoenen lontdispenser [20]. De lontdispenser zorgde ervoor dat alle verbindingen gedurende het 12 uur durende experiment in constante verhoudingen werden vrijgegeven. Heptaan werd gebruikt als controle. Het flesje werd opgehangen naast de ingang van de lichtval van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, VS; Figuur 6A). De vallen werden 0,8 – 1 m boven de grond opgehangen, vlakbij het voeteneinde van het bed, en een vrijwilliger sliep onder een onbehandeld klamboe en bediende de vallen tussen 18:00 en 06:30. Gevangen muggen, gesorteerd op geslacht en fysiologische status (niet gevoed, gevoed, halfzwanger en zwanger [21]), werden vervolgens gescreend met behulp van polymerasekettingreactie (PCR)-analyse om de soort te identificeren die morfologisch werd geïdentificeerd als A. gambiae. sl. Leden van het complex [23]. In het veldonderzoek werd de vangst van gekoppelde huizen met behulp van een nominaal logistisch model geanalyseerd, waarbij aantrekking de afhankelijke variabele was en behandeling (synthetisch mengsel versus controle) het vaste effect (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hier rapporteren we de χ²- en p-waarden van de likelihood ratio-test.
Evalueer of het veilig is. Arabiensis was in staat om urine, de belangrijkste stikstofbron, ureum, te verkrijgen door directe voeding, binnen 48 uur na toediening gedurende 4 dagen na (dpe) gastheerzoekende en bloedzuigende vrouwtjesvoedingsproeven (Fig. 1A). Zowel gastheerzoekende als bloedzuigende vrouwtjes absorbeerden significant meer sucrose dan enig ander dieet of water (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 en F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectievelijk; Fig. 1B,C). Bovendien aten gastheerzoekende vrouwtjes minder urine na 72 uur vergeleken met urine na 168 uur (Fig. 1B). Wanneer een dieet met ureum werd aangeboden, absorbeerden gastheerzoekende vrouwtjes een significant grotere hoeveelheid ureum bij 2,69 mM vergeleken met alle andere concentraties en water, terwijl dit niet te onderscheiden was van 10%. sucrose (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figuur 1D). Dit stond in contrast met de reactie van vrouwtjes die bloed hadden gedronken, die doorgaans significant meer ureumhoudende diëten absorbeerden dan water, zij het significant minder dan 10% sucrose (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figuur 1E). Bovendien absorbeerden vrouwtjes die bloed hadden afgezogen meer ureum dan vrouwtjes die een gastheer zochten bij de laagste concentraties, en absorbeerden deze vrouwtjes vergelijkbare hoeveelheden ureum bij hogere concentraties (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Hoewel de inname van een ureumhoudend dieet optimale waarden leek te hebben (Fig. 1D, E), waren vrouwtjes in beide fysiologische toestanden in staat om de inname te moduleren. De hoeveelheid geabsorbeerde ureum neemt over het gehele bereik van ureumconcentraties log-lineair toe (Fig. 1F,G). Op dezelfde manier lijken muggen hun stikstofopname te reguleren door de hoeveelheid geabsorbeerde urine te reguleren, aangezien de hoeveelheid stikstof in de urine wordt weerspiegeld in de geabsorbeerde hoeveelheid (Figuur 1B, C en B inzetstukken).
Om de effecten van urine en ureum op de overleving van gastheerzoekende en bloedzuigende muggen te beoordelen, werden vrouwtjes gevoed met urine van alle vier de leeftijden (vers, 24 uur, 72 uur en 168 uur na depositie) en een reeks ureumconcentraties, evenals gedestilleerd water en 10% sucrose als controle (Figuur 2A). Deze overlevingsanalyse toonde aan dat het dieet een significant effect had op de algehele overleving bij gastheerzoekende vrouwtjes (urine: χ² = 108,5, df = 5, p < 0,0001; ureum: χ² = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) en bloedzuigende vrouwtjes (urine: χ² = 93,0, df = 5, p < 0,0001; ureum: χ² = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figuur 2D,E). In alle experimenten hadden vrouwtjes die gevoed werden met een dieet van urine, ureum en water significant lagere overlevingskansen vergeleken met vrouwtjes die gevoed werden met een sucrosedieet (Figuur 2B-E). Gastheerzoekende vrouwtjes die gevoed werden met verse en oude urine vertoonden verschillende overlevingskansen, waarbij degenen die gevoed werden met 72 uur oude urine (p = 0,016) de laagste overlevingskans hadden (Fig. 2B). Bovendien overleefden gastheerzoekende vrouwtjes die gevoed werden met 135 mM ureum langer dan de controlegroep met water (p < 0,04) (Fig. 2C). Vergeleken met water overleefden vrouwtjes die gevoed werden met verse urine en 24 uur oude urine langer (respectievelijk p = 0,001 en p = 0,012; Figuur 2D), terwijl vrouwtjes die gevoed werden met 72 uur oude urine langer overleefden dan degenen die gevoed werden met verse urine en 24 uur oude urine (p < 0,0001 en p = 0,013, respectievelijk; Figuur 2D). Wanneer ze gevoed werden met 135 mM ureum, overleefden de vrouwtjes die bloed kregen langer dan bij alle andere concentraties ureum en water (p < 0,013; Figuur 2E).
Overleving van gastheer- en bloedzuigende vrouwelijke Anopheles arabinis-muggen die zich voeden met koeienurine en ureum. In de bioassay (A) kregen vrouwelijke muggen een dieet bestaande uit verse en oude koeienurine, verschillende concentraties ureum, sucrose (10%) en gedestilleerd water (H2O). De overleving van gastheerzoekende (B, C) en bloedzuigende (D, E) muggen werd elke 12 uur geregistreerd totdat alle vrouwtjes die zich hadden gevoed met urine (B, D) en ureum (C, E), en de controles, sucrose en water, dood waren.
De totale afstand en het aantal rondjes dat in de vliegmolentest over een periode van 24 uur werd bepaald, verschilden tussen gastheerzoekende en bloedzuigende muggen, die over het algemeen minder vliegactiviteit vertoonden (Fig. 3). Gastheerzoekende muggen die verse en oude urine of sucrose en water aanboden, vertoonden verschillende vliegpatronen (Fig. 3). Vrouwtjes die zich voedden met verse urine waren actiever bij zonsopgang, terwijl vrouwtjes die zich voedden met 24 en 168 uur oude urine actiever waren. Muggen die zich voedden met urine vertoonden verschillende vliegpatronen en waren voornamelijk overdag actief. Vrouwtjes die sucrose of 72 uur oude urine aanboden, vertoonden activiteit gedurende de gehele periode van 24 uur, terwijl vrouwtjes die water aanboden actiever waren in het midden van de periode. Muggen die zich voedden met sucrose vertoonden de hoogste activiteit laat in de nacht en vroeg in de ochtend, terwijl muggen die 72 uur oude urine innamen een gestage afname in activiteit vertoonden gedurende 24 uur (Figuur 3).
Vliegprestaties van bloedzuigende vrouwelijke Anopheles arabinis-muggen die op zoek zijn naar een gastheer en zich voeden met koeienurine en ureum. In de vliegmolentest werden vrouwelijke muggen, gevoed met verse en oude koeienurine, verschillende concentraties ureum, sucrose (10%) en gedestilleerd water (H₂O), vastgemaakt aan horizontale, vrij roterende armen (zie afbeelding). Voor gastheerzoekende (links) en bloedzuigende (rechts) vrouwtjes werden de totale afstand en het aantal vluchten per uur voor elk dieet gedurende een periode van 24 uur geregistreerd (donker: grijs; licht: wit). De gemiddelde afstand en het gemiddelde aantal vluchten worden rechts van de grafiek van de circadiane activiteit weergegeven. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde weer. Zie tekst voor statistische analyse.
Over het algemeen vertoonde de algehele vliegactiviteit van gastheerzoekende vrouwtjes een patroon dat vergelijkbaar was met dat van de vliegafstand over een periode van 24 uur. De gemiddelde vliegafstand werd significant beïnvloed door het ingenomen dieet (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), en gastheerzoekende vrouwtjes die 72 uur urine hadden ingenomen, vlogen significant langere afstanden in vergelijking met alle andere diëten (p < 0,0001), en muggen die sucrose hadden gegeten, vlogen langer dan muggen die verse (p = 0,022) en 24 uur oude urine hadden gegeten (p = 0,022). In tegenstelling tot het vliegactiviteitspatroon dat werd beschreven door het urinedieet, vertoonden gastheerzoekende vrouwtjes die ureum hadden gegeten een aanhoudende vliegactiviteit gedurende een periode van 24 uur, met een piek tijdens de tweede helft van de donkere fase (Fig. 3). Hoewel de activiteitspatronen vergelijkbaar waren, verhoogden gastheerzoekende vrouwtjes die ureum hadden gegeten de gemiddelde vliegafstand significant, afhankelijk van de geabsorbeerde concentratie (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Vrouwtjes die op zoek waren naar een gastheer en gevoed werden met een willekeurige concentratie ureum, vlogen langer dan vrouwtjes die gevoed werden met water of sucrose (p < 0,03).
De algehele vliegactiviteit van bloedzuigende muggen bleef stabiel en aanhoudend gedurende 24 uur bij alle diëten, met een verhoogde activiteit van urine tijdens de tweede helft van de donkere periode bij vrouwtjes die water hadden gegeten, evenals bij vrouwtjes die verse en 24 uur oude urine hadden gegeten (afbeelding 3). Hoewel het urinedieet de gemiddelde vliegafstand bij bloedgevoede vrouwtjes significant beïnvloedde (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), had het ureumdieet dit niet (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) in vergelijking met andere urine- en controlediëten (vers, p = 0,0091; 72 uur, p = 0,0022; 168 uur, p = 0,001; sucrose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
De effecten van voeding met urine en ureum op reproductieve parameters werden beoordeeld in bioassays met eierlegging (Figuur 4A) en werden onderzocht aan de hand van het aantal gelegde eieren per vrouwtje, de eiergrootte en het aantal pas uitgekomen larven in het eerste stadium. Het aantal gelegde eieren varieerde per dieet bij vrouwtjes van Arabische rupsen die met urine werden gevoed (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Vrouwtjes die 24 uur lang urine en bloed als maaltijd kregen, legden significant meer eieren dan vrouwtjes die andere urinediëten kregen en waren vergelijkbaar met vrouwtjes die sucrose kregen (Fig. 4B). Evenzo varieerde de grootte van de eieren die door vrouwtjes met urine werden gevoed, per dieet (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), waarbij vrouwtjes die 24 uur lang urine en sucrose kregen significant grotere eieren legden dan vrouwtjes die water kregen, terwijl de eieren van vrouwtjes die 168 uur lang met urine werden gevoed significant kleiner waren (Fig. 4C). Daarnaast had het urinedieet een significant effect op de larvale grootte (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), waarbij significant grotere larven tevoorschijn kwamen uit eieren gelegd door 24 en 72 uur oude vrouwtjes die met urine waren gevoed dan uit eieren gelegd door vrouwtjes die met water waren gevoed en vrouwtjes die 168 uur met urine waren gevoed (Figuur 4D).
Voortplantingsprestaties van vrouwelijke Anopheles arabinis-muggen die zich voeden met koeienurine en ureum. Bloedgevoede vrouwelijke muggen kregen gedurende 48 uur voeding bestaande uit verse en gerijpte koeienurine, verschillende concentraties ureum, sucrose (10%) en gedestilleerd water (H2O) voordat ze in bioassays werden geplaatst en eierlegsubstraten werden verkregen (A). Het aantal eieren (B, E), de eiergrootte (C, F) en de larvengrootte (D, G) werden significant beïnvloed door het aangeboden dieet (koeienurine: BD; ureum: EG). De gemiddelden voor elke parameter, gemeten met verschillende letterbenamingen, verschilden significant van elkaar (eenweg-ANOVA met Tukey's post-hoc analyse; p < 0,05). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde weer.
Ureum, het belangrijkste stikstofbestanddeel van urine, had, wanneer het als voedsel werd aangeboden aan vrouwtjes die bloed hadden gedronken, een significant effect op de voortplantingsparameters in alle onderzoeken. Het aantal eieren dat werd gelegd door vrouwtjes die ureum kregen na een bloedmaaltijd, was afhankelijk van de ureumconcentratie (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Vrouwtjes die ureumconcentraties tussen 134 µM en 1,34 mM kregen, legden meer eieren (Figuur 4E). Vrouwtjes die ureumconcentraties van 134 µM of hoger kregen, legden grotere eieren dan vrouwtjes die water kregen (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figuur 4F), en de larvale grootte, hoewel beïnvloed door vergelijkbare ureumconcentraties bij de moeders (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), was variabeler (Figuur 4G).
De algehele aantrekkingskracht van de gastheerzoekende runderurine op vluchtige extracten in de headspace werd significant beïnvloed door de leeftijd van de urine (χ² = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). Post-hoc analyse toonde aan dat de geur van oude urine na 24 uur significant hogere aantrekkingskrachten veroorzaakte in vergelijking met alle andere behandelingen (72 uur: p = 0,0060, 168 uur: p = 0,012, pentaan: p = 0,00070), met uitzondering van de geur van verse urine (p = 0,13; Fig. 5B). Hoewel de algehele aantrekkingskracht van bloedzuigende muggen op de geur van urine niet significant verschilde (χ² = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), bleken deze vrouwtjes significant aantrekkelijker te zijn voor de vluchtige extracten in de headspace vergeleken met de andere behandelingen. met 72 uur oude urine vergeleken met controles (p = 0,0066; Figuur 5C).
Gedragsreacties op natuurlijke en synthetische koeienurinegeuren tijdens de zoektocht naar gastheer- en bloedzuigende Anopheles arabianus-muggen. Schematische weergave van de glazen buisolfactometer (A). Aantrekking van vluchtige extracten uit de headspace van verse en verouderde koeienurine door gastheer- (B) en bloedzuigende (C) muggen. Vind de tentakelreactie van de Anopheles arabianus. Headspace-extracten geïsoleerd uit verse (D), 24 uur (E), 72 uur (F) en 168 uur (G) verouderde koeienurine worden weergegeven. Elektronenantennedetectie (EAD)-sporen tonen spanningsveranderingen als reactie op bioactieve stoffen in de headspace die uit de gaschromatograaf zijn geëlueerd en gedetecteerd door een vlamionisatiedetector (FID). De schaalbalk geeft de responsamplitude (mV) weer ten opzichte van de retentietijd (s). De eigenschappen en afgiftesnelheden (µg h-1) van de biologisch actieve stoffen worden weergegeven. Een enkele asterisk (*) geeft een consistente respons met lage amplitude aan. Dubbele asterisken (**) geven aan niet-reproduceerbare reacties. Vind de gastheer (H) en de bloedzuiger (I). An. arabiensis reageert verschillend op synthetische mengsels van verse en oude koeienurinegeuren. De gemiddelde proporties muggen die werden aangetrokken door verschillende letternamen verschilden significant van elkaar (eenrichtings-ANOVA met Tukey's post-hoc analyse; p < 0,05). Foutbalken geven de standaardfout van de schaal weer.
Vrouwelijke Ann. arabiensis vertoonden 72 uur en 120 uur na een bloedmaaltijd tijdens het paaien geen voorkeur voor vluchtige extracten uit de headspace van verse en verouderde koeienurine in vergelijking met pentaancontroles (χ2 = 3,07, p > 0,05; Aanvullend bestand 1: Fig. S1).
Bij vrouwelijke Ann. arabiensis werden met behulp van GC-EAD- en GC-MS-analyses respectievelijk acht, zes, drie en drie bioactieve verbindingen geïdentificeerd (Figuur 5D-G). Hoewel er verschillen werden waargenomen in het aantal verbindingen dat elektrofysiologische reacties teweegbracht, waren de meeste van deze verbindingen aanwezig in elk vluchtig extract uit de headspace, verzameld uit verse en verouderde urine. Daarom werden voor elk extract alleen verbindingen die een fysiologische reactie van de vrouwelijke antennes boven de drempelwaarde produceerden, meegenomen in verdere analyses.
De totale vluchtige afgiftesnelheid van bioactieve stoffen in de headspace-collectie nam toe van 29 µg h⁻¹ in verse urine tot 242 µg h⁻¹ in 168 uur oude urine, voornamelijk als gevolg van p-cresol en m-formaldehyde. De fenolconcentratie nam eveneens toe. Daarentegen namen de afgiftesnelheden van andere stoffen, zoals 2-cyclohexen-1-on en decanal, af met toenemende urineleeftijd. Dit correleerde met de waargenomen afname in signaalintensiteit (abundantie) in het chromatogram (Fig. 5D-G, linkerpaneel) en fysiologische reacties op deze stoffen (Fig. 5D-G, rechterpaneel).
Over het algemeen had het synthetische mengsel een vergelijkbare natuurlijke verhouding van bioactieve stoffen die werden geïdentificeerd in vluchtige extracten van verse en verouderde urine (Fig. 5D–G) en leek het geen significante aantrekkingskracht uit te oefenen op de zoektocht naar een gastheer (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) of bloedzuigende muggen (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Post-hoc paarsgewijze vergelijkingen tussen de behandelingen lieten echter zien dat gastheerzoekende muggen significant aantrekkelijker waren voor het synthetische mengsel van 24 uur oude urine vergeleken met de pentaancontrole (p = 0,0086; Figuur 5H).
Om de rol van individuele componenten in synthetische mengsels van 24 uur oude urine te beoordelen, werden zes subtractieve mengsels vergeleken met complete mengsels in de Y-buistest, waarbij individuele verbindingen werden verwijderd. Voor gastheerzoekende muggen had het verwijderen van individuele verbindingen uit het complete mengsel een significant effect op de gedragsreacties (χ² = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Aanvullend bestand 1: Figuur S2A). Alle subtractieve mengsels waren aantrekkelijker dan volledig gemengde mengsels. Daarentegen had het verwijderen van individuele verbindingen uit het volledig synthetische mengsel geen invloed op de gedragsreacties van bloedzuigende muggen (χ² = 11,38, df = 6, p = 0,077), met uitzondering van decanal, dat resulteerde in lagere aantrekkingskrachten vergeleken met het complete mengsel (p = 0,022; Aanvullend bestand 1: Figuur S2B).
In een dorp in Ethiopië waar malaria endemisch is, werd de effectiviteit van een synthetisch mengsel van 24 uur oude koeienurine bij het aantrekken van muggen onder veldomstandigheden gedurende tien nachten geëvalueerd (Fig. 6A). In totaal werden 4861 muggen gevangen en geïdentificeerd, waarvan 45,7% Anthropus gambiae sl., 18,9% Anopheles pharoensis en 35,4% Culex spp. waren (Aanvullend bestand 1: Tabel S1). Anopheles arabinis is het enige lid van het An. gambiae-soortencomplex dat door PCR-analyse is geïdentificeerd. Gemiddeld werden 320 muggen per nacht gevangen, waarbij vallen met het synthetische mengsel meer muggen vingen dan gepaarde vallen zonder mengsel (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Op elk van de vijf controlenachten aan het begin, midden en einde van de proef werden vallen zonder lokmiddel geplaatst. Vergelijkbare aantallen In elk paar vallen werden muggen gevangen, wat aangeeft dat er geen bias was tussen huizen (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) en geen populatieafname gedurende de onderzoeksperiode. Vergeleken met controlevallen was het aantal muggen dat in de vallen met het synthetische mengsel werd gevangen significant hoger: gastheerzoekend (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), recent bloedzuigend (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) en zwanger (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Aanvullend bestand 1: Tabel S1). Dit wordt ook weerspiegeld in het totale aantal gevangen muggen: gastheerzoekend > bloedzuigend > zwanger > halfzwanger > mannelijk.
Veldonderzoek naar de werkzaamheid van een 24-uurs synthetisch mengsel met koeienurinegeur. Veldproeven werden uitgevoerd in zuid-centraal Ethiopië (kaart), nabij de stad Maki (inzet), met behulp van een lichtval van de Centers for Disease Control (CDC) (rechts) in paren huizen, met een Latijns vierkant ontwerp (luchtfoto) (A). Met synthetische geurlokstof voorziene CDC-fotovallen trekken vrouwelijke Anopheles arabesques aan en vangen ze (B), maar geen Anopheles farroes (C), op een andere manier, een fysiologisch-toestandafhankelijk effect. Daarnaast vingen deze vallen significant meer van de gastheer Culex-muggen (D) vergeleken met de controle. De balken aan de linkerkant geven de gemiddelde selectie-index weer van muggen gevangen in paren van geurlokstofvallen (groen) en controlevallen (open) (N = 10), terwijl de balken aan de rechterkant de gemiddelde selectie-index weergeven in paren van controlevallen (open; N = 5). ).Sterretjes geven statistische significantieniveaus aan (*p = 0,01 en ***p < 0,0001)
De drie soorten werden verschillend gevangen in vallen met synthetische mengsels. Op zoek naar een gastheer (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), bloedzuigend (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) en zwanger (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) werd een .arabiensis gevangen in de val met het synthetische mengsel (Fig. 6B), terwijl de hoeveelheid An niet verschilde. Pharoensis in verschillende fysiologische toestanden werden aangetroffen (Fig. 6C). Voor Culex werd alleen een significante toename van het aantal muggen dat op zoek was naar een gastheer gevonden in vallen met het synthetische mengsel (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), vergeleken met controlevallen.
In Ethiopië werden lokvallen met gastheerlokstoffen geplaatst buiten potentiële gastheergebieden, tussen broedplaatsen en plattelandsgemeenschappen, om te onderzoeken of malariamuggen de geur van koeienurine gebruiken als gastheerlokmiddel. Zonder gastheerlokmiddelen, bij hoge temperaturen en met of zonder de aanwezigheid van koeienurinegeur werden geen muggen gevangen (Aanvullend bestand 1: Figuur S3). In aanwezigheid van hoge temperaturen en koeienurinegeur werden vrouwelijke malariamuggen echter aangetrokken en gevangen, zij het in kleine aantallen, onafhankelijk van de leeftijd van de urine (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Aanvullend bestand 1: Figuur S3). Daarentegen werden in de controlevallen met water geen malariamuggen gevangen bij hoge temperaturen (Aanvullend bestand 1: Figuur S3).
Malariamuggen verkrijgen en verspreiden stikstofhoudende verbindingen door compenserend te eten van koeienurine (d.w.z. plassen) om levenscycluskenmerken te verbeteren, net als andere insecten [2, 4, 24, 25, 26]. Koeienurine is een gemakkelijk verkrijgbare, hernieuwbare bron die nauw verbonden is met rustplaatsen voor malariamuggen, zoals koeienstallen en hoge vegetatie in de buurt van landelijke woningen en paaiplaatsen. Vrouwelijke muggen lokaliseren deze bron door te ruiken en kunnen de opname van stikstofverbindingen in urine reguleren, waaronder ureum, de belangrijkste stikstofcomponent in urine [15, 16]. Afhankelijk van de fysiologische toestand van de vrouwelijke mug worden voedingsstoffen in de urine toegewezen om de vliegactiviteit en overleving van gastheerzoekende vrouwelijke muggen te verbeteren, evenals de overleving en reproductieve kenmerken van bloedgevoede individuen tijdens de eerste gonadotrope cyclus. Daarom speelt het mengen van urine een belangrijke nutritionele rol voor malariamuggen die gesloten zijn zoals ondervoede volwassen muggen [8], omdat het vrouwelijke muggen de mogelijkheid biedt om belangrijke stikstofverbindingen te verkrijgen door deel te nemen aan Voeding met een laag risico. Deze bevinding heeft belangrijke epidemiologische gevolgen, aangezien vrouwtjes hun levensverwachting, activiteit en voortplantingsvermogen verhogen, wat allemaal van invloed is op de capaciteit van de vector. Bovendien kan dit gedrag het doelwit zijn van toekomstige vectorbestrijdingsprogramma's.