Usvajanje i distribucija hranjivih tvari integrira ishranu insekata i karakteristike životnog ciklusa. Kako bi nadoknadili nedostatke specifičnih hranjivih tvari u različitim životnim fazama, insekti mogu dobiti te hranjive tvari putem dopunske ishrane, na primjer, hranjenjem izlučevinama kičmenjaka u procesu poznatom kao stvaranje lokvi. Čini se da je komarac Anopheles arabiani pothranjen i stoga mu je potrebna hranjiva tvar i za metabolizam i za reprodukciju. Cilj ove studije bio je procijeniti da li agitacija An. arabiensis na kravljem urinu radi usvajanja hranjivih tvari poboljšava karakteristike životnog ciklusa.
Pobrinite se da je sigurno. arabiensis je privukao miris svježeg, 24-satnog, 72-satnog i 168-satnog kravljeg urina, a ženke koje traže domaćina i hranjene krvlju (48 sati nakon obroka krvi) mjerene su u Y-cijevi olfaktometra, a gravidne ženke su procijenjene za test mriještenja. Zatim je korištena kombinirana kemijska i elektrofiziološka analiza za identifikaciju bioaktivnih spojeva u kravljem urinu u sve četiri dobne skupine. Sintetičke smjese bioaktivnih spojeva procijenjene su u Y-cijevi i terenskim ispitivanjima. Kako bi se istražio kravlji urin i njegov glavni spoj koji sadrži dušik, urea, kao potencijalne dopunske prehrane za vektore malarije, izmjereni su parametri hranjenja i karakteristike životnog ciklusa. Procijenjen je udio ženki komaraca i količina apsorbiranog kravljeg urina i uree. Nakon hranjenja, ženke su procijenjene na preživljavanje, let u privezanom položaju i reprodukciju.
Traže krv i hranu domaćina. U laboratorijskim i terenskim studijama, Arape je privukao prirodni i sintetički miris svježeg i starog kravljeg urina. Trudne ženke su bile ravnodušne prema reakcijama kravljeg urina na mjestima mriještenja. Ženke koje traže domaćina i sišu krv aktivno apsorbiraju kravlji urin i ureu i raspoređuju ove resurse prema kompromisima tokom životnog ciklusa kao funkciju fiziološkog stanja za let, preživljavanje ili reprodukciju.
Anopheles arabinis prikuplja i distribuira kravlji urin radi poboljšanja karakteristika životnog ciklusa. Dodatno hranjenje kravljim urinom direktno utiče na kapacitet vektora povećanjem dnevnog preživljavanja i gustine vektora, a indirektno promjenom aktivnosti leta, te bi stoga trebalo uzeti u obzir u budućim modelima.
Prikupljanje i distribucija hranjivih tvari integrira karakteristike ishrane insekata i životnog ciklusa [1,2,3]. Insekti su u stanju birati i nabaviti hranu te vršiti kompenzacijsko hranjenje na osnovu dostupnosti hrane i potreba za hranjivim tvarima [1, 3]. Distribucija hranjivih tvari ovisi o životnom ciklusu i može dovesti do različitih zahtjeva za kvalitetom i količinom prehrane u različitim životnim fazama insekata [1, 2]. Kako bi nadoknadili nedostatke specifičnih hranjivih tvari, insekti mogu dobiti te hranjive tvari putem dopunskog hranjenja, kao što je blato, razni izmet i sekreti kičmenjaka i strvine, proces poznat kao lokve [2]. Iako je prvenstveno opisan niz vrsta leptira i moljaca, pojilišta se javljaju i kod drugih redova insekata, a privlačenje i hranjenje ovim vrstama resursa može imati značajan utjecaj na zdravlje i druge životne osobine [2, 4, 5, 6],7]. Malarijski komarac Anopheles gambiae sensu lato (sl) pojavljuje se kao 'pothranjena' odrasla jedinka [8], tako da zalijevanje može igrati važnu ulogu u njegovim životnim karakteristikama, ali ovo ponašanje je do sada bilo zanemareno. Upotreba agitacije kao sredstva za povećanje unosa hranjivih tvari u ovom važnom mehanizmu zaslužuje pažnju jer može imati važne epidemiološke posljedice.
Unos dušika kod odraslih ženki komaraca vrste Anopheles ograničen je zbog niskih kalorijskih rezervi koje nose iz larvalne faze i neefikasnog korištenja krvnog brašna [9]. Ženka vrste Ann.gambiae sl obično to kompenzira dopunjavanjem obroka krvi [10, 11], čime se više ljudi izlaže riziku od zaraze bolešću, a komarci većem riziku od predatora. Alternativno, komarci mogu koristiti dopunsko hranjenje izlučevinama kičmenjaka kako bi stekli dušične spojeve koji poboljšavaju adaptaciju i sposobnost leta, kao što su pokazali drugi insekti [2]. U tom smislu, zanimljiva je jaka i izrazita privlačnost jedne od srodnih vrsta unutar gambijskog kompleksa vrsta vrste An.Gambian sl, Anopheles arabinis, svježeg i starog kravljeg urina [12,13,14]. Anopheles arabinis je oportunistički u svojim preferencijama domaćina i poznato je da se povezuje sa stokom i hrani se njome. Kravlji urin je resurs bogat dušičnim spojevima, pri čemu urea čini 50-95% ukupnog dušika u svježem urinu [15, 16]. Kako kravlji urin stari, Mikroorganizmi koriste ove resurse za smanjenje složenosti dušičnih spojeva u roku od 24 sata [15]. S brzim porastom amonijaka, povezanim sa smanjenjem organskog dušika, napreduju alkalofilni mikroorganizmi (od kojih mnogi proizvode spojeve otrovne za komarce) [15], što može biti slučaj. Ženke Ann.arabiensis preferirano privlači urin star 24 sata ili manje [13, 14].
U ovoj studiji, tražene su životinje domaćina i one koje se hrane krvlju. Tokom svog prvog ciklusa gonadotropina, arabiensis je procijenjen na akviziciju dušičnih spojeva, uključujući ureu, miješanjem urina. Zatim je proveden niz eksperimenata kako bi se procijenilo kako ženke komaraca raspoređuju ovaj potencijalni nutrijentni resurs za poboljšano preživljavanje, reprodukciju i daljnje traženje hrane. Konačno, procijenjen je miris svježeg i starog kravljeg urina kako bi se utvrdilo da li oni pružaju pouzdane tragove za životinje domaćina i one koje se hrane krvlju. U svojoj potrazi za ovim potencijalnim nutrijentnim resursom, arabiensis je otkrio hemijske korelacije iza uočene diferencijalne privlačnosti. Sintetičke mješavine mirisa isparljivih organskih spojeva (VOC) identificirane u 24-satnom urinu dalje su procijenjene u terenskim uvjetima, proširujući rezultate dobivene u laboratorijskim uvjetima i demonstrirajući utjecaj mirisa goveđeg urina na različita fiziološka stanja. Privlačnost komaraca. Dobijeni rezultati potvrđuju da An. arabiensis stiče i distribuira dušične spojeve koji se nalaze u urinu kičmenjaka kako bi utjecao na karakteristike životnog ciklusa. Ovi rezultati se razmatraju u kontekstu potencijalnih epidemioloških posljedica i kako se mogu koristiti za nadzor i kontrolu vektora.
Anopheles arabicans (soj Dongola) držane su na temperaturi od 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relativne vlažnosti i ciklusu svjetlosti i tame od 12:12 sati. Larve su uzgajane u plastičnim posudama (20 cm × 18 cm × 7 cm) napunjenim destiliranom vodom i hranjene hranom za ribe Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Njemačka). Kukuljice su sakupljene u čašice od 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Švedska), a zatim prebačene u Bugdorm kaveze (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajvan) kako bi se omogućilo izlijeganje odraslih individua. Odraslim individuama je obezbijeđen 10% rastvor saharoze ad libitum do 4 dana nakon izlijeganja (dpe), kada je ženkama koje traže domaćina ponuđena dijeta neposredno prije eksperimenta ili su izgladnjivane preko noći uz destiliranu vodu prije eksperimenta, kao što je opisano u nastavku. Ženke korištene za eksperimente s letnim cijevima izgladnjivane su samo 4-6 sati s vodom ad libitum. Kako bi se komarci koji sišu krv pripremili za naknadne biološke testove, 4 ženke dpe su dobile defibrotičnu ovčju krv (Håtunalab, Bro, SE) korištenjem sistema membranskog hranjenja (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Potpuno zagušene ženke su zatim prebačene u pojedinačne kaveze i direktno su im davana hrana, kao što je opisano u nastavku, ili 10% saharoze ad libitum 3 dana prije eksperimenata opisanih u nastavku. Ove posljednje ženke su korištene za biološke testove u letnim cijevima i prebačene u laboratoriju, a zatim su primale destiliranu vodu ad libitum 4-6 sati prije eksperimenta.
Testovi hranjenja korišteni su za kvantificiranje potrošnje urina i uree kod odraslih ženki An.Arab rase. Ženke koje traže domaćina i hranjene krvlju dobile su dijetu koja je sadržavala 1% razrijeđenog svježeg i starog kravljeg urina, različite koncentracije uree i dvije kontrolne grupe (10% saharoze i vode) tokom 48 sati. Osim toga, u dijetu je dodana prehrambena boja (1 mg ml-1 ksilen cijanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) i isporučena u matrici 4 × 4 u mikrocentrifugalnim epruvetama od 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Slika 1A) Napunite do ruba (~300 µl). Da biste izbjegli konkurenciju između komaraca i potencijalne efekte boje, stavite 10 komaraca u veliku Petrijevu zdjelicu (12 cm u promjeru i 6 cm u visinu; Semadeni, Ostermundigen, CH; Slika 1A) u potpunom mraku na 25 ± 2 cm °C i 65 ± 5% relativne vlažnosti. Ovi eksperimenti ponovljeni su 5 do 10 puta. Nakon izlaganja hrani, komarci su smješteni na -20 °C do daljnje analize.
Tražite goveđi urin i ureu koje apsorbiraju domaćin i ženka Anopheles arabianus koja siše krv. U pokusu hranjenja (A), ženkama komaraca je data prehrana koja se sastojala od svježeg i starog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O). Ženke koje traže domaćina (B) i ženke koje se hrane krvlju (C) apsorbirale su više saharoze od bilo koje druge testirane prehrane. Treba napomenuti da su ženke koje traže domaćina apsorbirale 72-satni kravlji urin manje od 168-satnog kravljeg urina (B). Prosječni ukupni sadržaj dušika (± standardna devijacija) urina prikazan je na umetku. Ženke koje traže domaćina (D, F) i ženke koje sišu krv (E, G) unose ureu na način koji ovisi o dozi. Prosječni udahnuti volumeni (D, E) s različitim slovnim nazivima značajno su se razlikovali jedan od drugog (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake greške predstavljaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (BE). Isprekidana linija predstavlja logaritamsko-linearnu regresijsku liniju (F, G).
Da bi se oslobodila apsorbirana hrana, komarci su pojedinačno stavljani u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 ml koje su sadržavale 230 µl destilirane vode, a tkivo je razbijano pomoću jednokratne tučka i bežičnog motora (VWR International, Lund, SE), nakon čega je slijedilo centrifugiranje pri 10 krpm tokom 10 minuta. Supernatant (200 µl) je prebačen na mikroploču sa 96 jažica (Sigma-Aldrich) i apsorbancija (λ620) je određena pomoću čitača mikroploča na bazi spektrofotometra (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Alternativno, komarci su samljeveni u 1 ml destilirane vode, od čega je 900 µl prebačeno u kivetu za spektrofotometrijsku analizu (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Za kvantifikaciju unosa hrane, standardna krivulja je pripremljena serijskim razrjeđivanjem da bi se dobilo 0,2 µl do 2,4 µl ksilena od 1 mg ml-1. cijanid. Zatim je optička gustoća poznatih koncentracija boje korištena za određivanje količine hrane koju je svaki komarac progutao.
Podaci o volumenu analizirani su korištenjem jednosmjerne analize varijanse (ANOVA), nakon čega su uslijedila Tukeyjeva post hoc poređenja parova (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD, 1989–2007). Linearne regresijske analize opisale su unos uree ovisno o koncentraciji i uporedile odgovore između komaraca koji traže domaćina i komaraca koji sišu krv (GraphPad Prism v8.0.0 za Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).
Otprilike 20 µl uzoraka urina iz svake starosne grupe vezano je na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i inkapsulirano u limene kapsule (8 mm × 5 mm). Kapsule su umetnute u komoru za sagorijevanje CHNS/O analizatora (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) kako bi se odredio sadržaj dušika u svježem i starom urinu prema protokolu proizvođača. Ukupni dušik (g N l-1) kvantificiran je na osnovu poznatih koncentracija uree korištenih kao standard.
Kako bi se procijenio utjecaj prehrane na preživljavanje ženki koje traže domaćina i sišu krv, komarci su pojedinačno smješteni u velike Petrijeve zdjelice (promjera 12 cm i visine 6 cm; Semadeni) s rupom prekrivenom mrežicom u poklopcu (promjera 3 cm) radi ventilacije i opskrbe hranom. Prehrana je obezbijeđena direktno nakon 4 dana nakon otvaranja usta i uključivala je 1% razrijeđenog svježeg i starog kravljeg urina, četiri koncentracije uree i dvije kontrole, 10% saharoze i vode. Svaka prehrana je pipetirana na zubni tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) umetnut u špricu od 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), klip je uklonjen i postavljen na vrh Petrijeve zdjelice (slika 1).1A). Mijenjajte prehranu svaki dan. Održavajte laboratoriju kako je gore opisano. Preživjeli komarci su brojani dva puta dnevno, dok su mrtvi komarci odbačeni sve dok posljednji komarac nije uginuo (n = 40 po tretmanu). Preživljavanje komaraca hranjenih različitim prehranama statistički je analizirano korištenjem Kaplan-Meyerovih krivulja preživljavanja i log-rank testova. za poređenje distribucije preživljavanja između dijeta (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Prilagođeni leteći mlin za komarce prema Attisanu i suradnicima [17], napravljen od prozirnih akrilnih ploča debljine 5 mm (10 cm širine x 10 cm dužine x 10 cm visine) bez prednje i stražnje ploče (Sl. 3: gore). Okretni sklop s vertikalnom cijevi napravljenom od kolone za plinsku kromatografiju (unutarnji promjer 0,25 mm; dužina 7,5 cm) s krajevima zalijepljenim za iglu za insekte obješenu između para neodimskih magneta udaljenih 9 cm. Horizontalna cijev napravljena od istog materijala (dužina 6,5 ​​cm) prepolovila je vertikalnu cijev kako bi formirala privezanu ruku i ruku koja je nosila mali komad aluminijske folije kao signal za prekid svjetlosti.
Ženke koje su gladovale 24 sata hranjene su gore navedenom dijetom 30 minuta prije fiksiranja. Potpuno nahranjene ženke komaraca zatim su pojedinačno anestezirane na ledu 2-3 minute i pričvršćene na igle za insekte pčelinjim voskom (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), a zatim vezane za krakove horizontalnih cijevi. Leteći mlin. Broj okretaja po letu zabilježen je pomoću posebno izrađenog uređaja za bilježenje podataka, a zatim pohranjen i prikazan pomoću PC-Lab 2000™ softvera (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Leteći mlin je smješten u prostoriju s reguliranom klimom (12 h:12 h, svjetlo:tama, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% relativne vlažnosti).
Da bi se vizualizirao obrazac aktivnosti leta, ukupna pređena udaljenost (m) i ukupan broj uzastopnih aktivnosti leta izračunati su po satu tokom perioda od 24 sata. Pored toga, prosječne pređene udaljenosti pojedinačnih ženki upoređene su između tretmana i analizirane korištenjem jednosmjerne ANOVA i Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdje je prosječna udaljenost smatrana zavisnom varijablom, dok je tretman nezavisni faktor. Dodatno, prosječan broj rundi izračunava se u koracima od 10 minuta.
Da bi se procijenio utjecaj prehrane na reproduktivne performanse An.arabiensis, šest ženki (4 dpe) je direktno prebačeno u Bugdorm kaveze (30 cm × 30 cm × 30 cm) nakon uzimanja krvi, a zatim im je obezbijeđena eksperimentalna prehrana tokom 48 sati kao što je gore opisano. Prehrana je zatim uklonjena, a posude za mriješćenje (30 ml; Nolato Hertila) napunjene sa 20 ml destilirane vode obezbijeđene su trećeg dana tokom 48 sati, mijenjajući ih svaka 24 sata. Svaki režim prehrane ponoviti 20-50 puta. Jaja su prebrojana i zabilježena za svaki eksperimentalni kavez. Poduzorci jaja su korišteni za procjenu srednje veličine i varijacije dužine pojedinačnih jaja (n ≥ 200 po prehrani) korištenjem mikroskopa Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Njemačka) opremljenog Leica kamerom (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Njemačka). Preostala jaja su držana u klimatiziranoj prostoriji pod standardnim uvjetima uzgoja tokom 24 sata, a poduzorak nedavno izlijeganih larvi prvog stadija (n ≥ 200 po prehrani) je mjeren, kao što je gore opisano. Broj jaja i veličina jaja i larvi su upoređeni između tretmana korištenjem jednosmjerne ANOVA i Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Isparljive materije iz svježeg (1 sat nakon uzorkovanja), urina odležanog 24 sata, 72 sata i 168 sati prikupljene su iz uzoraka goveda rasa Zebu i Arsi. Radi lakšeg snalaženja, uzorci urina prikupljeni su rano ujutro dok su krave još bile u štali. Uzorci urina prikupljeni su od 10 jedinki i 100-200 ml svakog uzorka prebačeno je u pojedinačne poliamidne vrećice za pečenje (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Njemačka) u poliamidnim bačvama od 3 l s poklopcem u plastičnim bačvama od vinilklorida. Isparljive materije iz svakog uzorka goveđeg urina prikupljene su ili direktno (svježe) ili nakon sazrijevanja na sobnoj temperaturi tokom 24 sata, 72 sata i 168 sati, tj. svaki uzorak urina bio je reprezentativan za svaku starosnu grupu.
Za sakupljanje isparljivih materija iz headspace-a, korišten je sistem zatvorene petlje za cirkulaciju struje gasa filtriranog aktivnim ugljem (100 ml min-1) kroz poliamidnu vrećicu do adsorpcijske kolone tokom 2,5 sata korištenjem dijafragmalne vakuum pumpe (KNF Neuberger, Freiburg, Njemačka). Kao kontrola, sakupljanje iz headspace-a izvršeno je iz prazne poliamidne vrećice. Adsorpcijska kolona je napravljena od teflonske cijevi (5,5 cm x 3 mm un. promjera) koja sadrži 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, SAD) između čepova od staklene vune. Prije upotrebe, kolona je isprana sa 1 ml redestiliranog n-heksana (Merck, Darmstadt, Njemačka) i 1 ml pentana (99,0% čistoće, rastvarač, GC kvaliteta, Sigma Aldrich). Adsorbovane isparljive materije su eluirane sa 400 μl pentana. Sakupljene materije iz headspace-a su sakupljene i zatim pohranjene na -20°C do upotrebe za daljnju analizu.
Bihevioralne reakcije komaraca An koji traže domaćina i jedu krv. Isparljivi ekstrakti iz headspace prostora prikupljeni iz svježeg, 24-satnog, 72-satnog i 168-satnog urina analizirani su na isparljive ekstrakte komaraca Arabidopsis pomoću ravne staklene cijevi olfaktometara [18]. Eksperimenti su provedeni tokom ZT 13-15, perioda vrhunca Anove aktivnosti traženja doma. Arab [19]. Staklena cijev olfaktometar (80 cm × 9,5 cm unutrašnji prečnik) osvijetljena je sa 3 ± 1 lx crvene svjetlosti odozgo. Protok zraka filtriran kroz aktivni ugalj i ovlažen (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relativne vlažnosti) prošao je biotest brzinom od 30 cm s-1. Zrak se propušta kroz niz mrežastih sita od nehrđajućeg čelika, stvarajući laminarni tok i ujednačenu strukturu perjanice. Dozator za zubne tampone (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), obješen sa zavojnice od 5 cm na kraju okrenutom prema vjetru... olfaktometra, sa promjenom stimulatora svakih 5 minuta. Za analizu je korišteno 10 μl svakog ekstrakta iz prostora iznad plazme, razrijeđenog 1:10, kao stimulus. Jednaka količina pentana korištena je kao kontrola. Pojedinačni komarci koji traže domaćina ili sišu krv smješteni su u pojedinačne kaveze za puštanje 2-3 sata prije početka eksperimenta. Kavez za puštanje postavljen je na stranu olfaktometra niz vjetar, a komarci su ostavljeni da se aklimatiziraju 1 minutu, a zatim je leptir ventil kaveza otvoren za puštanje. Privlačnost prema tretmanu ili kontroli analizirana je kao udio komaraca koji su došli u kontakt s izvorom u roku od 5 minuta od puštanja. Svaki hlapljivi ekstrakt iz prostora iznad plazme i kontrola replicirani su najmanje 30 puta, a kako bi se izbjegli efekti bilo kojeg jednog dana, isti broj tretmana i kontrola testiran je svakog eksperimentalnog dana. Odgovori na traženje od domaćina i Ans hranjenih krvlju. Arabic u odnosu na headspace setove analizirani su korištenjem nominalne logističke regresije, nakon čega su uslijedila poređenja parova za omjere neparnih (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
An-ov odgovor na mrijest. Ekstrakti iz slobodnog prostora urina svježe i stare kravlje mokraće analizirani su u Bugdorm kavezima (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastične čašice (30 mL; Nolato Hertila) napunjene sa 20 mL destilovane vode služile su kao supstrat za mrijest i postavljene su u suprotne uglove kaveza, na udaljenosti od 24 cm. Čašice za tretman su podešene sa 10 μl svakog ekstrakta iz slobodnog prostora u razrjeđenju 1:10. Jednaka količina pentana korištena je za podešavanje kontrolne čašice. Čašice za tretman i kontrolne čašice su zamijenjene između svakog eksperimenta kako bi se kontrolisali efekti položaja. Deset ženki hranjenih krvlju pušteno je u eksperimentalne kaveze u ZT 9-11, a jaja u čašicama su prebrojana 24 sata kasnije. Formula za izračunavanje indeksa mrijesta je: (broj jaja položenih u čašicu za tretman - broj jaja položenih u kontrolnu čašicu) / (ukupan broj položenih jaja). Svaki tretman je ponovljen 8 puta.
Analiza ženke An.arabiensis metodom gasne hromatografije i detekcije elektronskog antenskog dijagrama (GC-EAD) provedena je kako je prethodno opisano [20]. Ukratko, svježi isparljivi ekstrakti iz headspacea odvojeni su korištenjem Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, SAD) opremljenog HP-5 kolonom (30 m × 0,25 mm un. promjera, debljina filma 0,25 μm, Agilent Technologies). i starenje urina. Vodonik je korišten kao mobilna faza sa prosječnom linearnom brzinom protoka od 45 cm s-1. Svaki uzorak (2 μl) je ubrizgavan 30 sekundi u režimu bez razdvajanja sa ulaznom temperaturom od 225 °C. Temperatura GC peći je programirana od 35 °C (zadržavanje 3 minute) do 300 °C (zadržavanje 10 minuta) pri 10 °C min-1. U razdjelniku efluenta GC-a, dodato je 4 psi azota i razdvojeno 1:1 u Gerstel 3D/2 ukrštenom uređaju niske mrtve zapremine (Gerstel, Mülheim, Njemačka) između detektora jonizacije plamena i EAD-a. Kapilara efluenta GC-a za EAD je propuštena kroz Gerstel ODP-2 prenosnu liniju, koja prati temperaturu GC peći plus 5 °C, u staklenu cijev (10 cm × 8 mm), gdje je pomiješana sa zrakom filtriranim ugljikom, ovlaženim zrakom (1,5 l min-1). Antena je postavljena 0,5 cm od izlaz cijevi. Svaki pojedinačni komarac predstavljao je jednu replikaciju, a za komarce koji traže domaćina, najmanje tri replikacije su izvršene na uzorcima urina svake starosti.
Identifikacija bioaktivnih spojeva u kolekcijama svježeg i ostarjelog goveđeg urina u headspaceu korištenjem kombinovanog GC i masenog spektrometra (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) za izazivanje antenskih odgovora u GC-EAD analizi, radeći u modu ionizacije elektronskim udarom na 70 eV. GC je bio opremljen HP-5MS UI-obloženom kapilarnom kolonom od fuzioniranog silicija (unutrašnji promjer 60 m × 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm) koristeći helij kao mobilnu fazu sa prosječnom linearnom brzinom protoka od 35 cm s-1. Uzorak od 2 μl je ubrizgan korištenjem istih postavki injektora i temperature pećnice kao za GC-EAD analizu. Spojevi su identificirani na osnovu njihovog vremena zadržavanja (Kovátov indeks) i masenih spektara u poređenju sa prilagođenom bibliotekom i NIST14 bibliotekom (Agilent). Identificirani spojevi su potvrđeni ubrizgavanjem autentičnih standarda (Dodatna datoteka 1: Tabela S2). Za kvantifikaciju, heptil acetat (10 ng, Kao eksterni standard ubrizgan je hemijski čistač (99,8%, Aldrich).
Procjena efikasnosti sintetičke mješavine mirisa koja se sastoji od bioaktivnih spojeva identificiranih u svježem i starom urinu, u privlačenju Ans.arabiensis, koji traži domaćina i siše krv, korištenjem istog olfaktometara i protokola kao gore. Sintetičke mješavine oponašale su sastav i udjele spojeva u miješanim isparljivim ekstraktima svježeg, 24-satnog, 48-satnog, 72-satnog i 168-satnog urina (Slika 5D-G; Dodatna datoteka 1: Tabela S2). Za analizu, koristite 10 μl razrjeđenja 1:100 potpuno sintetičke mješavine, s ukupnom brzinom oslobađanja u rasponu od približno 140-2400 ng h-1, za procjenu privlačnosti za domaćina i komarce koji sišu krv. Nakon toga, test se provodi na potpunim mješavinama, u kojima se uklanjaju subtraktivne mješavine pojedinačnih spojeva potpune mješavine. Traži odgovore od domaćina i Ans.arabiensis koji se hrani krvlju. Arab u odnosu na sintetičke i subtraktivne mješavine analizirani su korištenjem nominalne logističke regresije, nakon čega slijede parne usporedbe za omjere neparnih vrijednosti (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institut Inc.).
Da bi se procijenilo da li kravlji urin može poslužiti kao znak za stanište domaćina za malarijska komaraca, svježi i stari kravlji urin, prikupljen kao što je gore opisano, i voda stavljeni su u mrežaste kante od 3 l (100 ml) i postavljeni u klopke s mamcima za domaćine (BG-HDT verzija; BioGents, Regensburg, Njemačka). Deset klopki postavljeno je na udaljenosti od 50 m na pašnjaku, 400 m od seoske zajednice (Silay, Etiopija, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i bez stoke, na stalnim mjestima za razmnožavanje i u selima. Pet klopki je zagrijano kako bi se simuliralo prisustvo domaćina, dok je pet klopki ostavljeno nezagrijano. Svaka lokacija tretmana rotira se svake noći ukupno pet noći. Broj komaraca uhvaćenih u klopkama s mamcima od urina različite starosti upoređen je korištenjem logističke regresije s beta binomnom distribucijom (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
U selu u blizini grada Maki, regija Oromia, Etiopija (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Slika 6A), endemskom za malariju. Studija je provedena između sredine augusta i sredine septembra prije godišnjeg prskanja rezidualnim herbicidima u zatvorenom prostoru, uz dugu kišnu sezonu. Za studiju je odabrano pet pari kuća (udaljenih 20–50 m) smještenih na periferiji sela (Slika 6A). Kriteriji korišteni za odabir kuća bili su: životinje nisu dozvoljene u kući, kuhanje u zatvorenom prostoru (vučenje drva za ogrjev ili drvenog uglja) nije bilo dozvoljeno (barem tokom probnog perioda) i kuće sa maksimalno dva stanovnika, koje spavaju u neinsekticidnim prostorijama. ispod tretirane mreže protiv komaraca. Etičko odobrenje dao je Odbor za institucionalnu reviziju etike istraživanja (IRB/022/2016) Fakulteta prirodnih nauka (CNS-IRB) Univerziteta u Adis Abebi, u skladu sa smjernicama utvrđenim Helsinškom deklaracijom Svjetskog medicinskog udruženja. Saglasnost svakog nosioca domaćinstva dobijena je uz pomoć osoblja za zdravstvene savjete. Cijeli proces podržavaju lokalne administracije na nivou okruga i odjeljenja („kebele“). Eksperimentalni dizajn pratio je dizajn latinskog kvadrata 2 × 2, u kojem su sintetičke smjese i kontrole dodijeljene uparenim kućama prve noći i zamjenjivane između kuća sljedeće eksperimentalne noći. Ovaj proces je ponovljen deset puta. Osim toga, kako bi se procijenila aktivnost komaraca u odabranim kućama, CDC klopke su postavljene da rade pet uzastopnih noći na početku, u sredini i na kraju terenskog ispitivanja u isto doba dana.
Sintetička smjesa koja sadrži šest bioaktivnih spojeva rastvorena je u heptanu (97,0% otapalo GC čistoće, Sigma Aldrich) i ispuštana brzinom od 140 ng h-1 pomoću dozatora s pamučnim fitiljem [20]. Dozator s fitiljem omogućio je da se svi spojevi oslobađaju u konstantnim omjerima tokom 12-satnog eksperimenta. Heptan je korišten kao kontrola. Bočica je obješena pored ulazne tačke svjetlosne zamke Centra za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, SAD; Slika 6A). Zamke su obješene 0,8 – 1 m iznad tla, blizu podnožja kreveta, a volonter je spavao ispod netretirane mreže protiv komaraca i radio je između 18:00 i 06:30. Komarci uhvaćeni po spolu i fiziološkom statusu (nehranjeni, hranjeni, polugravidni i gravidni [21]) naknadno su pregledani pomoću analize lančane reakcije polimeraze (PCR) kako bi se identificirala vrsta morfološki identificirana kao A. gambiae sl. Članovi kompleksa [23]. Na terenu U ovoj studiji, hvatanje uparenih kuća u zamke analizirano je korištenjem nominalnog logističkog modela prilagođavanja, gdje je privlačnost bila zavisna varijabla, a tretman (sintetička smjesa vs. kontrola) fiksni efekat (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Ovdje izvještavamo o χ2 i p-vrijednostima ​​iz testa omjera vjerovatnoće.
Procijenite da li je sigurno. arabiensis je bio u stanju da dobije urin, svoj glavni izvor azota, ureu, direktnim hranjenjem, u roku od 48 sati od davanja tokom 4 dana nakon (dpe) ispitivanja hranjenja ženki koje traže domaćina i hranjene krvlju (slika 1A). I ​​ženke koje traže domaćina i ženke koje sišu krv apsorbovale su značajno više saharoze nego bilo koja druga dijeta ili voda (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respektivno; slike 1B,C). Nadalje, ženke koje traže domaćina jele su manje urina nakon 72 sata u poređenju sa urinom nakon 168 sati (slika 1B). Kada im je ponuđena dijeta koja sadrži ureu, ženke koje traže domaćina apsorbovale su značajno veću količinu uree pri 2,69 mM u poređenju sa svim ostalim koncentracijama i vodom, dok su se ne razlikovale od 10% saharoze (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Slika 1D). Ovo je bilo u suprotnosti s odgovorom ženki hranjenih krvlju, koje su obično apsorbirale značajno više hrane koja sadrži ureu nego vode, iako značajno manje od 10% saharoze (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Slika 1).1E). Nadalje, prilikom poređenja dva fiziološka stanja, flebotomizirane ženke apsorbirale su više uree od ženki koje traže domaćina pri najnižim koncentracijama, a ove ženke apsorbirale su slične količine uree pri višim koncentracijama (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Slika 1F, G). Dok se čini da unos iz prehrane koja sadrži ureu ima optimalne vrijednosti (Slika 1D, E), ženke u oba fiziološka stanja bile su u stanju modulirati količinu apsorbirane uree u cijelom rasponu koncentracija uree na logaritamski linearan način (Slika 1F, G). Slično tome, čini se da komarci kontroliraju unos dušika reguliranjem količine apsorbiranog urina, budući da se količina dušika u urinu odražava na apsorbiranu količinu (umetci na slici 1B, C i B).
Kako bi se procijenili učinci urina i uree na preživljavanje komaraca koji traže domaćina i koji sišu krv, ženke su hranjene urinom svih četiriju dobnih skupina (svježim, 24 sata, 72 sata i 168 sati nakon taloženja), a niz koncentracija uree, kao i destilirana voda i 10% saharoza, služili su kao kontrola (Slika 2A). Ova analiza preživljavanja pokazala je da ishrana ima značajan utjecaj na ukupno preživljavanje kod ženki koje traže domaćina (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Slika 2B, C) i ženki koje su se hranile krvlju (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Slika 2D,E). U svim eksperimentima, ženke hranjene urinom, ureom i vodom imale su značajno niže stope preživljavanja u poređenju sa ženkama hranjenim saharozom (Slika 2B-E). Ženke koje traže domaćina, a hranjene su svježim i ustajalim urinom, pokazale su različite stope preživljavanja, pri čemu su one koje su hranjene 72-satnim ustajalim urinom (p = 0,016) imale najnižu vjerovatnoću preživljavanja (Slika 2B). Nadalje, ženke koje traže domaćina, hranjene 135 mM ureom, preživjele su duže od kontrolne grupe koja je primala vodu (p < 0,04) (Slika 2C). U poređenju s vodom, žene hranjene svježim urinom i 24-satnim urinom preživjele su duže (p = 0,001 i p = 0,012, respektivno; Slika 2D), dok su žene hranjene 72-satnim urinom preživjele duže od onih koje su hranjene kratkim svježim urinom i 24-satnim urinom (p < 0,0001 i p = 0,013, respektivno; Slika 2D). Kada su hranjene 135 mM ureom, Ženke hranjene krvlju preživjele su duže od svih ostalih koncentracija uree i vode (p < 0,013; Slika 2E).
Preživljavanje domaćina i ženki Anopheles arabinis koje sišu krv, hranjenih kravljim urinom i ureom. U biološkom testu (A), ženkama komaraca je obezbijeđena ishrana koja se sastojala od svježeg i starog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilovane vode (H2O). Preživljavanje komaraca koji traže domaćina (B, C) i komaraca koji sišu krv (D, E) bilježeno je svakih 12 sati dok sve ženke koje su se hranile urinom (B, D) i ureom (C, E), te kontrolne ženke, saharoza i voda, nisu uginule.
Ukupna udaljenost i broj krugova određeni u testu leta tokom perioda od 24 sata razlikovali su se između komaraca koji traže domaćina i komaraca koji sišu krv, koji su pokazali manju ukupnu aktivnost leta (Slika 3). Komarci koji traže domaćina i koji su davali svježi i ostarjeli urin ili saharozu i vodu pokazali su različite obrasce leta (Slika 3), pri čemu su ženke koje su se hranile svježim urinom bile aktivnije u zoru, dok su one koje su se hranile 24 i 168 sati starim komarcima. Komarci koji su se hranili urinom pokazali su različite obrasce leta i bili su prvenstveno dnevni. Ženke komaraca koje su davale saharozu ili 72-satni urin pokazale su aktivnost tokom cijelog 24-satnog perioda, dok su ženke koje su davale vodu bile aktivnije tokom sredine perioda. Komarci hranjeni saharozom pokazali su najviši nivo aktivnosti kasno noću i rano ujutro, dok su oni koji su unosili 72 sata star urin iskusili stalan pad aktivnosti tokom 24 sata (Slika 3).
Performanse leta ženki Anopheles arabinis koje sišu krv, a koje traže domaćina, hrane se kravljim urinom i ureom. U testu leta, ženke komaraca koje su se hranile svježim i starim kravljim urinom, različitim koncentracijama uree, saharoze (10%) i destilovane vode (H2O), bile su privezane za horizontalne, slobodno rotirajuće krakove (gore). Za ženke koje traže domaćina (lijevo) i ženke koje sišu krv (desno), zabilježeni su ukupna udaljenost i broj letova na sat za svaku ishranu tokom perioda od 24 sata (tamno: sivo; svijetlo: bijelo). Prosječna udaljenost i prosječan broj napada prikazani su desno od grafikona cirkadijalne aktivnosti. Trake greške predstavljaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti. Statistička analiza - pogledajte tekst.
Općenito, ukupna aktivnost leta ženki koje traže domaćina pratila je obrazac sličan onome koji se odnosi na udaljenost leta tokom perioda od 24 sata. Prosječna udaljenost leta bila je značajno pogođena unesenom hranom (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a ženke koje traže domaćina, a koje su konzumirale 72 sata urina, preletjele su značajno veće udaljenosti u poređenju sa svim ostalim vrstama prehrane (p < 0,0001), a komarci hranjeni saharozom letjeli su duže od komaraca hranjenih svježim (p = 0,022) i 24 sata starim urinom (p = 0,022). Za razliku od obrasca aktivnosti leta opisanog prehranom urinom, ženke koje traže domaćina hranjene ureom pokazale su perzistentnu aktivnost leta tokom perioda od 24 sata, dostižući vrhunac tokom druge polovine tamne faze (Slika 3). Iako su obrasci aktivnosti bili slični, ženke koje traže domaćina hranjene ureom značajno su povećale prosječnu udaljenost leta ovisno o apsorbiranoj koncentraciji (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Ženke koje traže domaćina, a hranjene bilo kojom koncentracijom uree, letjele su duže od ženki hranjenih vodom ili saharozom (p < 0,03).
Ukupna aktivnost leta komaraca koji sišu krv bila je stabilna i održana tokom 24 sata u svim vrstama ishrane, s povećanom aktivnošću urina tokom druge polovine tamnog perioda kod ženki hranjenih vodom, kao i kod ženki hranjenih svježom vodom i ženki starih 24 sata (slika 3). Dok je ishrana urinom značajno uticala na prosječnu udaljenost leta kod ženki hranjenih krvlju (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), ishrana ureom nije (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) kod drugih vrsta urina i kontrolne ishrane (svježi urin, p = 0,0091; 72 sata, p = 0,0022; 168 sati, p = 0,001; saharoza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Utjecaji hranjenja urinom i ureom na reproduktivne parametre procijenjeni su biološkim testovima polaganja jaja (Slika 4A) i istraženi su prema broju jaja koje je položila svaka ženka, veličini jaja i novoizleglim larvama prvog stadija. Broj položenih jaja. Ženke arapskog afričkog ... 187) = 7,86, p < 0,0001), sa značajno većim larvama koje izlaze iz jaja koje su položile ženke stare 24 i 72 sata hranjene urinom nego iz jaja koje su položile larve jaja. Ženke hranjene vodom i hranjene urinom 168 sati (Slika 4D).
Reproduktivne performanse ženki Anopheles arabinis koje se hrane kravljim urinom i ureom. Ženke komaraca hranjene krvlju hranjene su dijetama koje se sastoje od svježeg i starog kravljeg urina, različitih koncentracija uree, saharoze (10%) i destilirane vode (H2O) tokom 48 sati prije stavljanja u biološke testove i dobijanja supstrata za polaganje jaja 48 sati (A). Broj jaja (B, E), veličina jaja (C, F) i veličina larvi (D, G) bili su značajno pogođeni obezbijeđenom ishranom (kravlji urin: BD; urea: EG). Prosjeci za svaki parametar izmjeren korištenjem različitih slovnih naziva značajno su se razlikovali jedan od drugog (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake greške predstavljaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti.
Kao glavna dušična komponenta urina, urea, kada se daje kao prehrana ženkama hranjenim krvlju, značajno je utjecala na reproduktivne parametre u svim studijama. Broj jaja koje su položile ženke hranjene ureom, nakon obroka krvi, ovisno o koncentraciji uree (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), ženke hranjene koncentracijama uree između 134 µM i 1,34 mM položile su više jaja (Slika 4E). Ženke hranjene koncentracijama uree od 134 µM ili više položile su veća jaja od ženki hranjenih vodom (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Slika 4F), a veličina larvi, iako je bila pod utjecajem sličnih koncentracija uree kod majki (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), bila je varijabilnija (Slika 4G).
Ukupna privlačnost prema isparljivim ekstraktima iz prostora iznad urina goveda koji traže domaćina. Na vrstu *arabiensis* procijenjenu u olfaktometru sa staklenom cijevi (Slika 5A) značajno je utjecala starost urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Slika 5B). Post hoc analiza pokazala je da miris ustajalog urina nakon 24 sata uzrokuje značajno veći nivo privlačnosti u poređenju sa svim ostalim tretmanima (72 sata: p = 0,0060, 168 sati: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), osim mirisa svježeg urina (p = 0,13; Slika 5B). Iako ukupna privlačnost komaraca koji sišu krv mirisu urina nije bila značajno drugačija (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Slika 5C), utvrđeno je da su ove ženke značajno privlačnije isparljivim ekstraktima iz prostora iznad urina u poređenju sa urinom starim 72 sata u poređenju sa kontrolnom grupom (p = 0,0066; Slika 5C).
Bihevioralni odgovori na mirise prirodnog i sintetičkog kravljeg urina u potrazi za domaćinom i komarcima Anopheles arabianus koji se hrane krvlju. Shema olfaktometra sa staklenom cijevi (A). Privlačenje isparljivih ekstrakata iz svježeg i ostarjelog kravljeg urina na domaćina (B) i komarce koji sišu krv (C). Pronađite reakciju pipaka Lorda An. Prikazani su ekstrakti iz svježeg (D), 24-satnog (E), 72-satnog (F) i 168-satnog (G) kravljeg urina. Tragovi detekcije elektronske antene (EAD) pokazuju promjene napona kao odgovor na bioaktivne spojeve u gornjem prostoru eluirane iz plinskog kromatografa i detektirane detektorom plamene ionizacije (FID). Mjerna traka predstavlja amplitudu odgovora (mV) u odnosu na vrijeme zadržavanja (s). Prikazana su svojstva i brzine oslobađanja (µg h-1) biološki aktivnih spojeva. Jedna zvjezdica (*) označava konzistentan odgovor niske amplitude. Dvostruke zvjezdice (**) označavaju nereproducibilne odgovore. Pronađite domaćina (H) i komarce koji sišu krv. (I) An.arabiensis ima različitu privlačnost prema sintetičkim mješavinama mirisa svježeg i starog kravljeg urina. Prosječni udjeli komaraca privučenih različitim slovima značajno su se razlikovali jedan od drugog (jednosmjerna ANOVA korištenjem Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Trake greške predstavljaju standardnu ​​grešku skale.
Ženka Ann.arabiensis, 72 sata i 120 sati nakon obroka krvi, tokom mrijesta, nije pokazana preferencija za isparljive ekstrakte iz svježeg i starog kravljeg urina u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala pentan (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatna datoteka 1: Slika S1).
Za ženke Ann.arabiensis, GC-EAD i GC-MS analize su identificirale osam, šest, tri i tri bioaktivna spoja (Slika 5D-G). Iako su uočene razlike u broju spojeva koji su izazvali elektrofiziološke odgovore, većina ovih spojeva bila je prisutna u svakom hlapljivom ekstraktu iz prostora iznad urina prikupljenom iz svježeg i starog urina. Stoga su za svaki ekstrakt u daljnje analize uključeni samo spojevi koji su proizveli fiziološki odgovor ženskih antena iznad praga.
Ukupna brzina oslobađanja hlapljivih bioaktivnih spojeva u kolekciji iznad urina povećala se sa 29 µg h-1 u svježem urinu na 242 µg h-1 u urinu starom 168 sati, uglavnom zbog p-krezola i m-formaldehida. Povećanje fenola, kao i fenola, smanjivalo se sa povećanjem starosti urina, što je bilo u korelaciji sa uočenim smanjenjem intenziteta signala (obilja) u kromatogramu (Slika 5D)-G lijevi panel) i fiziološkim odgovorima na ove spojeve (Slika 5D-G desni panel).
Sveukupno, sintetička smjesa imala je sličan prirodni omjer bioaktivnih spojeva identificiranih u hlapljivim ekstraktima svježeg i odležanog urina (slika 5D–G) i nije se činilo da izaziva značajnu privlačnost u potrazi za domaćinom (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; slika 5H) ili komarcima koji sišu krv (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; slika 5I). Međutim, post hoc poređenja parova između tretmana pokazala su da su komarci koji traže domaćina bili značajno privlačniji sintetičkoj smjesi urina odležanog 24 sata u poređenju s kontrolama s pentanom (p = 0,0086; slika 5H).
Da bi se procijenila uloga pojedinačnih komponenti u sintetičkim smjesama urina odležanog 24 sata, šest subtraktivnih smjesa je procijenjeno u odnosu na potpune smjese u Y-cijevi, u kojem su pojedinačni spojevi uklonjeni. Kod komaraca koji traže domaćina, oduzimanje pojedinačnih spojeva iz potpune smjese imalo je značajan utjecaj na bihevioralne reakcije (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Dodatna datoteka 1: Slika S2A), sve subtraktivne smjese su bile privlačnije od potpuno izmiješanih. Nasuprot tome, uklanjanje pojedinačnih spojeva iz potpuno sintetičke smjese nije utjecalo na bihevioralne reakcije komaraca koji sišu krv (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s izuzetkom dekanala, koji je rezultirao nižim nivoima privlačnosti u poređenju s potpunom smjesom (p = 0,022; Dodatna datoteka 1: Slika S2B).
U selu u Etiopiji, endemskom za malariju, procijenjena je efikasnost sintetičke mješavine 24-satnog kravljeg urina u privlačenju komaraca u poljskim uslovima tokom deset noći (slika 6A). Ukupno je uhvaćeno i identifikovano 4.861 komarac, od kojih je 45,7% bilo Anthropus.gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis i 35,4% Culex spp. (Dodatna datoteka 1: Tabela S1). Anopheles arabinis je jedini član kompleksa vrsta An.Gambian identifikovan PCR analizom. U prosjeku je uhvaćeno 320 komaraca po noći, a tokom tog vremena zamke sa sintetičkim mješavinama mamaca uhvatile su više komaraca nego uparene zamke bez mješavine (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Zamke bez mamaca postavljene su svake od pet kontrolnih noći na početku, u sredini i na kraju ispitivanja. Sličan broj komaraca uhvaćen je u svakom paru zamki, što ukazuje... Nema pristranosti između kuća (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i nema pada populacije tokom perioda istraživanja. U poređenju sa kontrolnim klopkama, broj komaraca uhvaćenih u klopkama koje sadrže sintetičku smjesu značajno je povećan: traženje domaćina (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedavno hranjenje krvlju (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i gravidnost (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Dodatna datoteka 1: Tabela S1). Ovo se takođe odražava na ukupan broj uhvaćenih komaraca: traženje domaćina > krvosači > gravidni > polugravidni > mužjak.
Terenska evaluacija efikasnosti 24-satne sintetičke mješavine mirisa kravljeg urina. Terenska ispitivanja provedena su u južno-centralnoj Etiopiji (mapa), blizu grada Maki (umetnuti dio), korištenjem svjetlosne zamke Centra za kontrolu bolesti (CDC) (desno) u parnim kućama, s dizajnom latinskog kvadrata (zračna slika) (A). Sintetičke CDC foto-zamke s mirisnim mamcima privlače i hvataju ženke Anopheles arabesques (B), ali ne i Anopheles farroes (C), na drugačiji način, efekat koji ovisi o fiziološkom stanju. Osim toga, ove zamke su uhvatile značajno povećan broj komaraca domaćina Culex. (D) U usporedbi s kontrolom. Trake s lijeve strane predstavljaju prosječni indeks selekcije komaraca uhvaćenih u parovima zamki s mirisnim mamcem (zeleno) i kontrolnim (otvorenim) zamkama (N = 10), dok trake s desne strane predstavljaju prosječni indeks selekcije u parovima kontrolnih zamki (otvorene; N = 5). Zvjezdice označavaju statističke nivoe značajnosti (*p = 0,01 i ***p < 0,0001).
Tri vrste su uhvaćene na različite načine u klopkama koje su sadržavale sintetičke smjese. Traženje domaćina (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), hranjenje krvlju (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i trudnoća (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) pokazalo je da je .arabiensis uhvaćen u klopci ispuštajući sintetičku smjesu (slika 6B), dok se količina An nije razlikovala. Pronađeni su Pharaensis u različitim fiziološkim stanjima (slika 6C). Kod Culexa je uočeno samo značajno povećanje broja komaraca koji traže domaćine u klopkama s mamcima od sintetičke smjese (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; slika 6D) u poređenju s kontrolnim klopkama.
Zamke za domaćine, smještene izvan potencijalnih domaćina između mjesta za razmnožavanje i ruralnih zajednica u Etiopiji, korištene su za procjenu da li malarijski komarci koriste miris kravljeg urina kao znak za stanište domaćina. U odsustvu znakova domaćina, toplote, i sa ili bez prisustva mirisa kravljeg urina, nijedan komarac nije uhvaćen (Dodatna datoteka 1: Slika S3). Međutim, u prisustvu visoke temperature i mirisa kravljeg urina, ženke malarijskih komaraca su privučene i uhvaćene, iako u malom broju, nezavisno od starosti urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Dodatna datoteka 1: Slika S3). Nasuprot tome, kontrolne grupe s vodom nisu uhvatile malarične komarce na visokim temperaturama (Dodatna datoteka 1: Slika S3).
Komarci protiv malarije nabavljaju i distribuiraju spojeve koji sadrže dušik putem kompenzacijskog hranjenja kravljim urinom (tj. lokvama) kako bi poboljšali karakteristike životnog ciklusa, slično kao i drugi insekti [2, 4, 24, 25, 26]. Kravlji urin je lako dostupan obnovljivi resurs koji je usko povezan s mjestima odmora za vektore malarije, kao što su štale i visoka vegetacija u blizini seoskih kuća i mjesta za mrijest. Ženke komaraca lociraju ovaj resurs mirisom i sposobne su regulirati unos dušičnih spojeva u urinu, uključujući ureu, glavnu dušičnu komponentu u urinu [15, 16]. Ovisno o fiziološkom stanju ženke komarca, hranjive tvari u urinu se dodjeljuju kako bi se poboljšala aktivnost leta i preživljavanje ženki komaraca koje traže domaćina, kao i preživljavanje i reproduktivne karakteristike jedinki koje se hrane krvlju tokom prvog gonadotropnog ciklusa. Stoga, miješanje urina igra važnu nutritivnu ulogu za vektore malarije koji su zatvoreni poput pothranjenih odraslih [8], jer pruža ženkama komaraca mogućnost da nabavljaju važne dušične spojeve sudjelovanjem u hranjenju niskog rizika. Ovo otkriće ima značajne epidemiološke posljedice, jer ženke povećavaju svoj životni vijek, aktivnost i reproduktivni učinak, što sve utiče na kapacitet vektora. Nadalje, ovo ponašanje može biti meta budućih programa upravljanja vektorima.