L'acquisition et la distribution des nutriments intègrent les stratégies de recherche de nourriture et les caractéristiques du cycle de vie des insectes. Pour compenser les carences en nutriments spécifiques à différents stades de leur développement, les insectes peuvent se les procurer par un apport alimentaire complémentaire, par exemple en se nourrissant de sécrétions de vertébrés, un processus appelé « puddles ». Le moustique Anopheles arabiensis semble souffrir de malnutrition et a donc besoin de nutriments pour son métabolisme et sa reproduction. Cette étude visait à évaluer si l'agitation d'An. arabiensis sur de l'urine de vache pour l'acquisition de nutriments améliore ses caractéristiques du cycle de vie.
Assurez-vous de sa sécurité. L'espèce *Arabiensis* a été attirée par l'odeur d'urine de vache fraîche, âgée de 24 heures, 72 heures et 168 heures. Les femelles en recherche d'hôte et gorgées de sang (48 heures après le repas sanguin) ont été mesurées dans un olfactomètre en Y, et les femelles gestantes ont été soumises à un test de ponte. Une analyse chimique et électrophysiologique combinée a ensuite été utilisée pour identifier les composés bioactifs dans l'urine de vache pour les quatre classes d'âge. Des mélanges synthétiques de composés bioactifs ont été évalués dans des essais en Y et sur le terrain. Afin d'étudier l'urine de vache et son principal composé azoté, l'urée, comme compléments alimentaires potentiels pour les vecteurs du paludisme, les paramètres d'alimentation et les caractéristiques du cycle de vie ont été mesurés. La proportion de moustiques femelles et la quantité d'urine de vache et d'urée absorbée ont été évaluées. Après le repas sanguin, la survie, le vol en position attachée et la reproduction des femelles ont été évalués.
Elles recherchent le sang et la nourriture de leur hôte. Lors d'études en laboratoire et sur le terrain, les singes arabes ont été attirés par l'odeur naturelle et synthétique de l'urine de vache fraîche et vieillie. Les femelles gestantes sont restées indifférentes aux réactions à l'urine de vache sur les sites de ponte. Les femelles en quête d'hôte et se nourrissant de sang absorbent activement l'urine et l'urée de vache et répartissent ces ressources en fonction des compromis liés à leur cycle de vie, selon leur état physiologique (vol, survie ou reproduction).
L'acquisition et la distribution d'urine de vache par Anopheles arabinis améliorent les caractéristiques de son cycle de vie. L'alimentation complémentaire à base d'urine de vache affecte directement la capacité vectorielle en augmentant la survie quotidienne et la densité vectorielle, et indirectement en modifiant l'activité de vol ; elle devrait donc être prise en compte dans les modèles futurs.
L'acquisition et la distribution des nutriments intègrent les caractéristiques de recherche de nourriture et du cycle de vie des insectes [1,2,3]. Les insectes sont capables de sélectionner et d'acquérir leur nourriture et d'adapter leur alimentation en fonction de la disponibilité alimentaire et de leurs besoins nutritionnels [1,3]. La distribution des nutriments dépend du cycle de vie et peut entraîner des besoins différents en termes de qualité et de quantité d'alimentation selon les stades de développement [1,2]. Pour compenser les carences en nutriments spécifiques, les insectes peuvent les obtenir par une alimentation complémentaire, par exemple en se nourrissant de boue, d'excréments et de sécrétions de vertébrés, ou de charognes ; ce processus est connu sous le nom de « points d'eau » [2]. Bien que de nombreuses espèces de papillons soient principalement décrites, les points d'eau existent également chez d'autres ordres d'insectes, et l'attraction et l'alimentation autour de ces ressources peuvent avoir des effets significatifs sur la santé et d'autres caractéristiques du cycle de vie [2,4,5,6,7]. Le moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae sensu lato (sl), émerge à l'état adulte « malnutri » [8], l'abreuvement peut donc jouer un rôle important. Le rôle de l'agitation dans les caractéristiques de son cycle de vie a été négligé jusqu'à présent. L'utilisation de l'agitation comme moyen d'accroître l'apport en nutriments chez cet important vecteur mérite d'être étudiée, car cela pourrait avoir d'importantes conséquences épidémiologiques.
L'apport en azote chez les moustiques Anopheles femelles adultes est limité en raison de leurs faibles réserves caloriques héritées du stade larvaire et d'une utilisation inefficace du repas sanguin [9]. Les femelles d'Ann. gambiae sl compensent généralement ce déficit par des repas sanguins supplémentaires [10, 11], exposant ainsi davantage de personnes au risque de contracter la maladie et les moustiques à un risque accru de prédation. Par ailleurs, les moustiques peuvent utiliser des excréments de vertébrés comme source d'azote pour acquérir des composés qui améliorent leur adaptation et leur agilité en vol, comme cela a été démontré chez d'autres insectes [2]. À cet égard, l'attrait marqué et spécifique de l'une des espèces jumelles du complexe d'espèces An. gambiae sl, Anopheles arabinis, pour l'urine de vache fraîche et vieillie [12, 13, 14], est intéressant. Anopheles arabinis est opportuniste dans ses préférences d'hôtes et est connu pour s'associer aux bovins et s'en nourrir. L'urine de vache est une ressource riche en composés azotés, l'urée représentant 50 à 95 % de l'azote total. L'urine fraîche [15, 16]. Au fur et à mesure que l'urine de vache vieillit, les micro-organismes utilisent ces ressources pour réduire la complexité des composés azotés en 24 heures [15]. Avec l'augmentation rapide de l'ammoniac, associée à une diminution de l'azote organique, les micro-organismes alcalophiles (dont beaucoup produisent des composés toxiques pour les moustiques) se développent [15], ce qui peut expliquer pourquoi les femelles d'Ann. arabiensis sont préférentiellement attirées par l'urine âgée de 24 heures ou moins [13, 14].
Dans cette étude, la présence d'Anopheles arabiensis gorgés de sang et ayant donné naissance à un hôte a été recherchée. Au cours de son premier cycle gonadotrope, l'acquisition de composés azotés, notamment l'urée, par mélange d'urine chez Anopheles arabiensis a été évaluée. Ensuite, une série d'expériences a été menée pour déterminer comment les moustiques femelles utilisent cette ressource nutritive potentielle pour améliorer leur survie, leur reproduction et leur recherche de nourriture. Enfin, l'odeur d'urine de vache fraîche et vieillie a été analysée afin de déterminer si elle fournissait des indices fiables pour l'hôte et les Anopheles arabiensis gorgés de sang. Dans leur recherche de cette ressource nutritive potentielle, Anopheles arabiensis a découvert des corrélations chimiques à l'origine de l'attractivité différentielle observée. Des mélanges odorants synthétiques de composés organiques volatils (COV) identifiés dans de l'urine vieillie de 24 heures ont été évalués sur le terrain, confirmant les résultats obtenus en laboratoire et démontrant l'effet de l'odeur d'urine bovine sur différents états physiologiques. Attraction des moustiques. Les résultats obtenus confirment qu'Anopheles arabiensis… L'espèce *Arabiensis* acquiert et distribue des composés azotés présents dans l'urine des vertébrés, influençant ainsi ses caractéristiques biologiques. Ces résultats sont discutés dans le contexte de leurs conséquences épidémiologiques potentielles et de leur utilisation possible pour la surveillance et le contrôle des vecteurs.
Les Anopheles arabicans (souche Dongola) ont été maintenus à 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % d'humidité relative et sous un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 ​​h. Les larves ont été élevées dans des bacs en plastique (20 cm × 18 cm × 7 cm) remplis d'eau distillée et nourries avec de l'aliment pour poissons Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Allemagne). Les pupes ont été recueillies dans des gobelets de 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Suède) puis transférées dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm ; MegaView Science, Taichung, Taïwan) pour permettre l'émergence des adultes. Ces derniers ont reçu une solution de saccharose à 10 % à volonté jusqu'à 4 jours après l'émergence (JAE). À ce stade, les femelles en quête d'hôte ont reçu de la nourriture juste avant l'expérience, ou ont été mises à jeun pendant la nuit avec de l'eau distillée avant l'expérience, comme décrit précédemment. Les femelles utilisées pour les expériences en tube de vol ont été mises à jeun pendant seulement 4 à 6 heures, avec de l'eau à volonté. Pour préparer les moustiques hématophages aux bioessais ultérieurs, des femelles âgées de 4 jours après l'éclosion (dpe) ont reçu du sang de mouton défibrotique (Håtunalab, Bro, Suède) à l'aide d'un système d'alimentation sur membrane (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Royaume-Uni). Les femelles ayant atteint leur congestion vasculaire ont ensuite été transférées dans des cages individuelles et nourries soit directement, comme décrit ci-dessous, soit avec une solution de saccharose à 10 % à volonté pendant 3 jours avant les expériences décrites ci-dessous. Ces dernières femelles ont été utilisées pour les bioessais en tube de vol, puis transférées au laboratoire et ont eu accès à de l'eau distillée à volonté pendant 4 à 6 heures avant l'expérience.
Des tests d'alimentation ont été utilisés pour quantifier la consommation d'urine et d'urée chez les femelles adultes d'Anopheles arabica. Les femelles en recherche d'hôte et celles ayant déjà pris un repas de sang ont reçu pendant 48 h un régime alimentaire contenant 1 % d'urine de vache fraîche et vieillie diluée, différentes concentrations d'urée, et deux solutions témoins (10 % de saccharose et eau). De plus, un colorant alimentaire (1 mg ml⁻¹ de cyanure de xylène FF ; CAS 2650-17-1 ; Sigma-Aldrich, Stockholm, Suède) a été ajouté au régime et présenté dans une matrice 4 × 4 dans des tubes à microcentrifuger de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, Californie, États-Unis ; Figure 1A). Remplir jusqu'au bord (~300 µl). Afin d'éviter la compétition entre les moustiques et les effets potentiels de la coloration, 10 moustiques ont été placés dans une grande boîte de Petri (12 cm de diamètre et 6 cm de hauteur ; Semadeni, Ostermundigen, Suisse ; Figure 1A) dans l'obscurité complète à 25 °C. ± 2 cm °C et 65 ± 5 % d'humidité relative. Ces expériences ont été répétées 5 à 10 fois. Après exposition au régime alimentaire, les moustiques ont été placés à -20 °C jusqu'à leur analyse ultérieure.
Recherchez l'urine bovine et l'urée absorbées par l'hôte et la femelle hématophage d'Anopheles arabianus. Lors de l'essai d'alimentation (A), les moustiques femelles ont reçu un régime alimentaire composé d'urine de vache fraîche et vieillie, de différentes concentrations d'urée, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H₂O). Les femelles en recherche d'hôte (B) et celles ayant pris un repas de sang (C) ont absorbé plus de saccharose que celles ayant reçu tout autre régime alimentaire testé. Notez que les femelles en recherche d'hôte ont absorbé moins d'urine de vache de 72 heures que d'urine de vache de 168 heures (B). La teneur moyenne en azote total (± écart-type) de l'urine est représentée dans l'encart. Les femelles en recherche d'hôte (D, F) et celles ayant pris un repas de sang (E, G) absorbent l'urée de manière dose-dépendante. Les volumes inhalés moyens (D, E) avec des lettres différentes étaient significativement différents (ANOVA à un facteur avec test post-hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. la moyenne (BE). La ligne pointillée droite représente la droite de régression log-linéaire (F, G)
Pour libérer les aliments absorbés, les moustiques ont été placés individuellement dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 ml contenant 230 µl d'eau distillée. Les tissus ont été broyés à l'aide d'un pilon jetable et d'un moteur sans fil (VWR International, Lund, Suède), puis centrifugés à 10 000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant (200 µl) a été transféré dans une microplaque à 96 puits (Sigma-Aldrich) et l'absorbance (λ 620) a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne). Alternativement, les moustiques ont été broyés dans 1 ml d'eau distillée, dont 900 µl ont été transférés dans une cuvette pour analyse spectrophotométrique (λ 620 nm ; UV 1800, Shimadzu, Kista, Suède). Pour quantifier l'ingestion alimentaire, une courbe d'étalonnage a été préparée par dilutions en série jusqu'à obtenir des volumes de 0,2 µl à 1,5 µl. 2,4 µl de cyanure de xylène à 1 mg ml-1. Ensuite, la densité optique des concentrations connues de colorant a été utilisée pour déterminer la quantité de nourriture ingérée par chaque moustique.
Les données volumiques ont été analysées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie de comparaisons post hoc par paires de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, États-Unis, 1989–2007). Les analyses de régression linéaire ont décrit l'absorption d'urée en fonction de la concentration et comparé les réponses entre les moustiques à la recherche d'un hôte et les moustiques hématophages (GraphPad Prism v8.0.0 pour Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis).
Environ 20 µl d'échantillons d'urine de chaque groupe d'âge ont été fixés sur Chromosorb® W/AW (10 mg, 80/100 mesh, Sigma Aldrich) et encapsulés dans des capsules en étain (8 mm × 5 mm). Les capsules ont été insérées dans la chambre de combustion d'un analyseur CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) afin de déterminer la teneur en azote des urines fraîches et vieillies, conformément au protocole du fabricant. L'azote total (g N l⁻¹) a été quantifié à partir de concentrations connues d'urée utilisées comme étalon.
Pour évaluer l'effet du régime alimentaire sur la survie des femelles lors de la recherche d'hôtes et de la prise de sang, les moustiques ont été placés individuellement dans de grandes boîtes de Petri (12 cm de diamètre et 6 cm de hauteur ; Semadeni) dont le couvercle était muni d'un orifice grillagé (3 cm de diamètre) pour la ventilation et l'alimentation. Les régimes alimentaires ont été administrés immédiatement après 4 jours post-exposition (dpe) et comprenaient de l'urine de vache fraîche et vieillie diluée à 1 %, quatre concentrations d'urée et deux solutions témoins : du saccharose à 10 % et de l'eau. Chaque régime alimentaire a été déposé à la pipette sur un tampon dentaire (DAB Dental AB, Upplands Väsby, Suède) inséré dans une seringue de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, Suède), le piston retiré, puis le tampon placé sur une boîte de Petri (figure 1A). Le régime alimentaire devait être modifié quotidiennement. Le laboratoire devait être maintenu dans les conditions décrites précédemment. Les moustiques survivants ont été comptés deux fois par jour, tandis que les moustiques morts ont été éliminés jusqu'à la mort du dernier moustique (n = 40 par traitement). La survie des moustiques nourris avec différents régimes alimentaires a été analysée statistiquement. Courbes de survie de Kaplan-Meyer et tests de log-rank pour comparer les distributions de survie entre les régimes alimentaires (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un dispositif de vol pour moustiques personnalisé, inspiré d'Attisano et al. [17], est constitué de panneaux acryliques transparents de 5 mm d'épaisseur (10 cm de large x 10 cm de long x 10 cm de haut), sans panneaux avant ni arrière (Fig. 3 : haut). Un système pivotant comprend un tube vertical en acrylique transparent (diamètre intérieur 0,25 mm ; longueur 7,5 cm) dont les extrémités sont collées à une aiguille entomologique suspendue entre deux aimants en néodyme distants de 9 cm. Un tube horizontal en acrylique transparent (6,5 cm de long) divise le tube vertical en deux, formant ainsi un bras articulé et un bras portant un petit morceau de papier aluminium servant de signal lumineux.
Des femelles à jeun depuis 24 heures ont reçu le régime alimentaire décrit ci-dessus pendant 30 minutes avant d'être immobilisées. Les moustiques femelles rassasiées ont ensuite été anesthésiées individuellement sur de la glace pendant 2 à 3 minutes, puis fixées à des épingles entomologiques à l'aide de cire d'abeille (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, Suède) et attachées aux bras des tubes horizontaux. Le nombre de tours par vol a été enregistré par un enregistreur de données conçu sur mesure, puis stocké et visualisé à l'aide du logiciel PC-Lab 2000™ (v4.01 ; Velleman, Gavere, Belgique). Le dispositif de vol a été placé dans une pièce à climat contrôlé (12 h : 12 h, lumière : obscurité, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % HR).
Pour visualiser le profil d'activité de vol, la distance totale parcourue (m) et le nombre total de vols consécutifs ont été calculés par heure sur une période de 24 heures. De plus, les distances moyennes parcourues par chaque femelle ont été comparées entre les différents traitements et analysées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'un test post-hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), la distance moyenne étant considérée comme la variable dépendante et le traitement comme le facteur indépendant. Enfin, le nombre moyen de vols a été calculé par intervalles de 10 minutes.
Pour évaluer l'effet du régime alimentaire sur les performances reproductives d'Anopheles arabinensis, six femelles (4 jours après ponte) ont été transférées directement dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) après prélèvement sanguin, puis soumises au régime alimentaire expérimental pendant 48 h comme décrit précédemment. Les régimes alimentaires ont ensuite été retirés et des coupelles de ponte (30 ml ; Nolato Hertila) remplies de 20 ml d'eau distillée ont été fournies le troisième jour pendant 48 heures, renouvelées toutes les 24 heures. Chaque régime alimentaire a été répété 20 à 50 fois. Les œufs ont été comptés et enregistrés pour chaque cage expérimentale. Des sous-échantillons d'œufs ont été utilisés pour évaluer la taille moyenne et la variation de longueur des œufs individuels (n ≥ 200 par régime alimentaire) à l'aide d'un microscope Dialux-20 (DM1000 ; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) équipé d'une caméra Leica (DFC) 320 R2 ; Leica Microsystems Ltd., DE). Les œufs restants ont été conservés dans une pièce climatisée dans des conditions d'élevage standard pendant 24 h, et un sous-échantillon de larves de 1er stade récemment émergées (n ≥ 200 par régime alimentaire) a été mesuré, comme décrit ci-dessus. Le nombre d'œufs et la taille des œufs et des larves ont été comparés entre les traitements à l'aide d'une ANOVA à un facteur et d'une analyse post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Les composés volatils de l'espace de tête d'urine fraîche (1 h après prélèvement), et d'urines vieillies pendant 24 h, 72 h et 168 h, ont été collectés à partir d'échantillons prélevés sur des zébus de race Arsi. Par commodité, les prélèvements d'urine ont été effectués tôt le matin, lorsque les vaches étaient encore à l'étable. Les échantillons d'urine ont été prélevés sur 10 individus et 100 à 200 ml de chaque échantillon ont été transférés dans des sachets individuels en polyamide (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Allemagne) placés dans des fûts en plastique de 3 l contenant du polyamide avec couvercle et du chlorure de vinyle. Les composés volatils de l'espace de tête de chaque échantillon d'urine bovine ont été collectés soit directement (urine fraîche), soit après maturation à température ambiante pendant 24 h, 72 h et 168 h, chaque échantillon étant ainsi représentatif de chaque groupe d'âge.
Pour la collecte des composés volatils de l'espace de tête, un système en boucle fermée a été utilisé pour faire circuler un flux gazeux filtré sur charbon actif (100 ml min⁻¹) à travers un sac en polyamide jusqu'à la colonne d'adsorption pendant 2,5 h, grâce à une pompe à vide à membrane (KNF Neuberger, Fribourg, Allemagne). Un prélèvement d'espace de tête a été effectué à partir d'un sac en polyamide vide, servant de témoin. La colonne d'adsorption était constituée d'un tube en téflon (5,5 cm × 3 mm de diamètre intérieur) contenant 35 mg de Porapak Q (50/80 mesh ; Waters Associates, Milford, MA, États-Unis) entre des bouchons de laine de verre. Avant utilisation, la colonne a été rincée avec 1 ml de n-hexane redistillé (Merck, Darmstadt, Allemagne) et 1 ml de pentane (solvant de qualité GC, pureté 99,0 %, Sigma Aldrich). Les composés volatils adsorbés ont été élués avec 400 µl de pentane. Les échantillons d'espace de tête ont été regroupés puis conservés à -20 °C jusqu'à leur utilisation pour des analyses ultérieures.
Réponses comportementales de recherche d'hôte et de prédation sanguine chez les moustiques Anopheles. Les extraits volatils de l'espace de tête, prélevés sur de l'urine fraîche et vieillie pendant 24 h, 72 h et 168 h, ont été analysés à l'aide d'un olfactomètre à tube de verre droit [18]. Les expériences ont été menées entre ZT 13 et 15, période de pointe de l'activité de recherche d'hôte des moustiques Anopheles [19]. Un olfactomètre à tube de verre (80 cm × 9,5 cm de diamètre intérieur) a été éclairé par le haut avec une lumière rouge de 3 ± 1 lx. Un flux d'air filtré au charbon actif et humidifié (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % d'humidité relative) a traversé le dispositif de bioessai à une vitesse de 30 cm s⁻¹. L'air est filtré à travers une série de grilles en acier inoxydable, créant un flux laminaire et une structure de panache uniforme. Un distributeur de tampons dentaires (4 cm × 1 cm ; L:D ; DAB Dental) a été utilisé. AB), suspendu à une bobine de 5 cm à l'extrémité exposée au vent de l'olfactomètre, le stimulateur étant changé toutes les 5 minutes. Pour l'analyse, 10 μl de chaque extrait d'espace de tête, dilué au 1/10, ont été utilisés comme stimulus. Une quantité équivalente de pentane a servi de témoin. Des moustiques en quête d'hôte ou hématophages ont été placés individuellement dans des cages de lâcher 2 à 3 heures avant le début de l'expérience. La cage de lâcher a été placée sous le vent de l'olfactomètre, et les moustiques ont été laissés s'acclimater pendant 1 minute, puis la vanne papillon de la cage a été ouverte pour les libérer. L'attraction pour le traitement ou le témoin a été analysée comme la proportion de moustiques entrant en contact avec la source dans les 5 minutes suivant le lâcher. Chaque extrait volatil d'espace de tête et le témoin ont été testés au moins 30 fois, et pour éviter les effets d'une seule journée, le même nombre de traitements et de témoins a été testé chaque jour d'expérience. Les réponses de recherche des moustiques hôtes et gorgés de sang ont été analysées. Les ensembles d'extraits d'espace de tête arabes et témoins ont été analysés à l'aide de régression logistique nominale suivie de comparaisons par paires pour les rapports de cotes (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Réponse de ponte d'An. Des extraits d'espace de tête d'urine de vache fraîche et vieillie ont été analysés dans des cages Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm ; MegaView Science). Des gobelets en plastique (30 mL ; Nolato Hertila) remplis de 20 mL d'eau distillée ont servi de substrat de ponte et ont été placés dans les coins opposés de la cage, à 24 cm de distance. Les gobelets de traitement ont été ajustés avec 10 μl de chaque extrait d'espace de tête à une dilution de 1:10. Une quantité égale de pentane a été utilisée pour ajuster le gobelet témoin. Les gobelets de traitement et témoins ont été intervertis entre chaque expérience pour contrôler les effets de position. Dix femelles gorgées de sang ont été introduites dans les cages expérimentales entre ZT 9 et 11 et les œufs dans les gobelets ont été comptés 24 heures plus tard. La formule pour calculer l'indice de ponte est : (nombre d'œufs pondus dans le gobelet de traitement – ​​nombre d'œufs pondus dans le gobelet témoin) / (nombre total d'œufs pondus). Chaque traitement était répété 8 fois.
L'analyse par chromatographie en phase gazeuse et détection par antenne électronique (GC-EAD) de la femelle An.arabiensis a été réalisée comme décrit précédemment [20]. En bref, les extraits volatils de l'espace de tête frais ont été séparés à l'aide d'un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, États-Unis) équipé d'une colonne HP-5 (30 m × 0,25 mm id, épaisseur de film de 0,25 μm, Agilent Technologies). et d'urine vieillissante. L'hydrogène a été utilisé comme phase mobile avec un débit linéaire moyen de 45 cm s⁻¹. Chaque échantillon (2 μl) a été injecté pendant 30 secondes en mode sans division avec une température d'entrée de 225 °C. La température du four du GC a été programmée de 35 °C (palier de 3 minutes) à 300 °C (palier de 10 minutes) à 10 °C min⁻¹. Dans le séparateur d'effluent du GC, 4 psi d'azote ont été ajoutés et divisés 1:1 dans un croisement Gerstel 3D/2 à faible volume mort (Gerstel, Mülheim, Allemagne) entre le détecteur à ionisation de flamme et l'EAD. Le capillaire d'effluent du GC pour l'EAD a été acheminé à travers une ligne de transfert Gerstel ODP-2, qui suit la température du four du GC plus 5 °C, dans un tube en verre (10 cm × 8 mm), où il a été mélangé avec de l'air filtré sur charbon et humidifié (1,5 l min−1). L'antenne a été placée à 0,5 cm de la sortie du tube. Chaque moustique individuel a constitué une réplique, et pour les moustiques à la recherche d'un hôte, au moins trois répliques ont été effectuées sur des échantillons d'urine de chaque âge.
Identification des composés bioactifs dans les prélèvements d'espace de tête d'urine bovine fraîche et vieillie par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS ; GC 6890 et MS 5975 ; Agilent Technologies) afin de susciter des réponses antennaires lors de l'analyse GC-EAD, fonctionnant en mode d'ionisation par impact électronique à 70 eV. Le GC était équipé d'une colonne capillaire en silice fondue HP-5MS revêtue d'UI (60 m × 0,25 mm de diamètre interne, épaisseur de film de 0,25 μm) utilisant l'hélium comme phase mobile avec un débit linéaire moyen de 35 cm s⁻¹. Un échantillon de 2 μl a été injecté en utilisant les mêmes paramètres d'injection et de température du four que pour l'analyse GC-EAD. Les composés ont été identifiés en fonction de leur temps de rétention (indice de Kovát) et de leurs spectres de masse, comparés à la bibliothèque personnalisée et à la bibliothèque NIST14 (Agilent). Les composés identifiés ont été confirmés par injection d'étalons authentiques (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). Pour la quantification, l'acétate d'heptyle (10 ng, pureté chimique de 99,8 %, Aldrich) a été injecté comme étalon externe.
L'efficacité d'un mélange odorant synthétique composé de composés bioactifs identifiés dans l'urine fraîche et vieillie a été évaluée pour attirer les moustiques Anopheles arabinensis en quête d'hôte et hématophages, à l'aide du même olfactomètre et du même protocole que précédemment. Les mélanges synthétiques reproduisaient la composition et les proportions des composés présents dans les extraits volatils de l'espace de tête d'urine fraîche et d'urine vieillie pendant 24, 48, 72 et 168 heures (Figure 5D-G ; Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). Pour l'analyse, 10 μl d'une dilution au 1/100 du mélange entièrement synthétique, avec un taux de libération global compris entre 140 et 2400 ng h⁻¹ environ, ont été utilisés pour évaluer l'attractivité pour l'hôte et les moustiques hématophages. Le test a ensuite été réalisé sur des mélanges complets, après soustraction des mélanges de composés individuels du mélange complet. Les réponses de recherche des moustiques Anopheles arabinensis hôtes et gorgés de sang ont été analysées en comparant les mélanges synthétiques et les mélanges soustractifs. régression logistique nominale suivie de comparaisons par paires pour les rapports de cotes (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Afin d'évaluer si l'urine de vache pouvait servir d'indicateur d'habitat pour les moustiques vecteurs du paludisme, de l'urine de vache fraîche et vieillie, collectée comme décrit précédemment, et de l'eau ont été placées dans des seaux grillagés de 3 litres (100 ml) et installées dans des pièges à appât (version BG-HDT ; BioGents, Regensburg, Allemagne). Dix pièges ont été placés à 50 m d'intervalle dans un pâturage, à 400 m d'un village (Silay, Éthiopie, 5°53′24″N, 37°29′24″E), en l'absence de bétail, sur des aires de reproduction permanentes et à proximité des villages. Cinq pièges ont été chauffés pour simuler la présence d'un hôte, tandis que les cinq autres sont restés froids. Chaque site de traitement a été changé chaque nuit pendant cinq nuits. Le nombre de moustiques capturés dans les pièges appâtés avec de l'urine d'âges différents a été comparé par régression logistique avec une distribution bêta-binomiale (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Dans un village d'endémie palustre près de la ville de Maki, dans la région d'Oromia, en Éthiopie (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E ; Figure 6A), l'étude a été menée entre la mi-août et la mi-septembre, avant la pulvérisation annuelle d'insecticides à effet rémanent à l'intérieur des habitations, et pendant une longue saison des pluies. Cinq paires de maisons (distantes de 20 à 50 m) situées à la périphérie du village ont été sélectionnées pour l'étude (Fig. 6A). Les critères de sélection étaient les suivants : interdiction de posséder des animaux à l'intérieur des maisons, interdiction de cuisiner à l'intérieur (au bois ou au charbon de bois) (au moins pendant la période d'étude), et maisons abritant au maximum deux habitants dormant dans des habitations non traitées aux insecticides. Sous la moustiquaire imprégnée, l'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche institutionnelle (IRB/022/2016) de la Faculté des sciences naturelles (CNS-IRB) de l'Université d'Addis-Abeba, conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale. Le consentement de chaque chef de ménage a été obtenu avec l'aide du personnel de santé publique. L'ensemble du processus a été validé par les administrations locales au niveau du district et du quartier (« kebele »). Le dispositif expérimental était un carré latin 2 × 2 : les mélanges synthétiques et les témoins ont été attribués à des paires de maisons la première nuit, puis intervertis la nuit suivante. Ce processus a été répété dix fois. De plus, afin d'estimer l'activité des moustiques dans les maisons sélectionnées, des pièges CDC ont été programmés pour fonctionner pendant cinq nuits consécutives, au début, au milieu et à la fin de l'essai, à la même heure.
Un mélange synthétique contenant six composés bioactifs a été dissous dans de l'heptane (97,0 % de solvant de qualité GC, Sigma Aldrich) et libéré à raison de 140 ng h⁻¹ à l'aide d'un diffuseur à mèche de coton [20]. Ce diffuseur a permis la libération de tous les composés dans des proportions constantes tout au long des 12 heures de l'expérience. L'heptane a servi de témoin. Le flacon a été suspendu à proximité du point d'entrée du piège lumineux des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, États-Unis ; Figure 6A). Les pièges étaient suspendus à 0,8–1 m du sol, près du pied du lit, et un volontaire dormait sous une moustiquaire non traitée. Les pièges étaient actionnés entre 18h00 et 6h30. Les moustiques capturés, classés selon leur sexe et leur état physiologique (à jeun, nourris, semi-gestationnels et gestants [21]), ont ensuite été analysés par PCR afin d'identifier l'espèce, morphologiquement identifiée comme A. gambiae. sl. Membres du complexe [23]. Dans l'étude de terrain, le piégeage des maisons appariées a été analysé à l'aide d'un modèle logistique nominal, où l'attraction était la variable dépendante et le traitement (mélange synthétique vs témoin) l'effet fixe (JMP® 14.0.0, SAS Institute Inc.). Nous présentons ici les valeurs χ² et p issues du test du rapport de vraisemblance.
Évaluer l'innocuité de l'administration. *Arabiensis* a pu obtenir l'urine, sa principale source d'azote, l'urée, par alimentation directe, dans les 48 heures suivant l'administration, pendant 4 jours après la fin de l'expérience (JPE), lors d'essais d'alimentation de femelles en recherche d'hôte et hématophages (Fig. 1A). Les femelles en recherche d'hôte et les femelles hématophages ont absorbé significativement plus de saccharose que tout autre régime alimentaire ou l'eau (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 et F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, respectivement ; Fig. 1B,C). De plus, les femelles en recherche d'hôte ont consommé moins d'urine à 72 heures qu'à 168 heures (Fig. 1B). Lorsqu'on leur a proposé un régime alimentaire contenant de l'urée, les femelles en recherche d'hôte ont absorbé une quantité significativement plus importante d'urée à 2,69 mM que toutes les autres concentrations et l'eau, tandis que l'absorption était indiscernable de celle observée avec une concentration de 10 %. Le saccharose (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001 ; Figure 1D) contrastait avec la réponse des femelles gorgées de sang, qui absorbaient généralement une quantité significativement plus importante d'aliments contenant de l'urée que d'eau, bien que significativement inférieure à 10 % de saccharose (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001 ; Figure 1E). De plus, en comparant les deux états physiologiques, les femelles ayant subi une phlébotomie absorbaient plus d'urée que les femelles à la recherche d'un hôte aux concentrations les plus faibles, et ces dernières absorbaient des quantités similaires d'urée aux concentrations plus élevées (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001 ; Fig. 1F, G). Bien que l'apport d'un régime contenant de l'urée semble avoir atteint des valeurs optimales (Fig. 1D, E), les femelles, quel que soit leur état physiologique, étaient capables de moduler la quantité d'urée absorbée. sur toute la gamme des concentrations d'urée de manière log-linéaire (Fig. 1F,G). De même, les moustiques semblent contrôler leur absorption d'azote en régulant la quantité d'urine absorbée, car la quantité d'azote dans l'urine se reflète dans la quantité absorbée (Figure 1B, C et B encarts).
Afin d'évaluer les effets de l'urine et de l'urée sur la survie des moustiques femelles en quête d'hôtes et se nourrissant de sang, des femelles ont été nourries avec de l'urine à quatre stades de développement différents (fraîche, 24 h, 72 h et 168 h après dépôt) et avec diverses concentrations d'urée. De l'eau distillée et une solution de saccharose à 10 % ont servi de témoins (Figure 2A). Cette analyse de survie a montré que le régime alimentaire avait un effet significatif sur la survie globale des femelles en quête d'hôtes (urine : χ² = 108,5, ddl = 5, p < 0,0001 ; urée : χ² = 122,8, ddl = 5, p < 0,0001 ; Fig. 2B, C) et des femelles se nourrissant de sang (urine : χ² = 93,0, ddl = 5, p < 0,0001 ; urée : χ² = 137,9 ... 0,0001 ; Figure 2D,E). Dans toutes les expériences, les femelles nourries avec un régime composé d’urine, d’urée et d’eau présentaient des taux de survie significativement inférieurs à ceux des femelles nourries avec un régime à base de saccharose (Figure 2B-E). Les femelles en recherche d’hôte nourries avec de l’urine fraîche ou périmée présentaient des taux de survie différents, celles nourries avec de l’urine périmée de 72 h (p = 0,016) ayant la plus faible probabilité de survie (Fig. 2B). De plus, les femelles en recherche d’hôte nourries avec 135 mM d’urée ont survécu plus longtemps que les témoins nourris à l’eau (p < 0,04) (Fig. 2C). Comparées à l’eau, les femelles nourries avec de l’urine fraîche et de l’urine de 24 h ont survécu plus longtemps (p = 0,001 et p = 0,012, respectivement ; Figure 2D), tandis que celles nourries avec de l’urine de 72 h ont survécu plus longtemps que celles nourries avec de l’urine fraîche de courte durée et de l’urine vieillie de 24 h (p < 0,0001). et p = 0,013, respectivement ; Figure 2D). Lorsqu'elles étaient nourries avec 135 mM d'urée, les femelles nourries au sang ont survécu plus longtemps que toutes les autres concentrations d'urée et d'eau (p < 0,013 ; Figure 2E).
Survie des moustiques femelles Anopheles arabinis, hôtes et hématophages, nourris avec de l'urine de vache et de l'urée. Lors du bioessai (A), les moustiques femelles ont reçu un régime alimentaire composé d'urine de vache fraîche et vieillie, de différentes concentrations d'urée, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H₂O). La survie des moustiques en quête d'hôtes (B, C) et hématophages (D, E) a été enregistrée toutes les 12 heures jusqu'à ce que toutes les femelles se soient nourries d'urine (B, D) et d'urée (C, E), et que les témoins (saccharose et eau) soient décédés.
La distance totale parcourue et le nombre de vols effectués lors du test en simulateur de vol sur une période de 24 heures différaient entre les moustiques en quête d'hôte et les moustiques hématophages, ces derniers présentant une activité de vol globalement moindre (Fig. 3). Les moustiques en quête d'hôte ayant reçu de l'urine fraîche ou vieillie, ou du saccharose et de l'eau, ont présenté des profils de vol distincts (Fig. 3). Les femelles se nourrissant d'urine fraîche étaient plus actives à l'aube, tandis que celles nourries d'urine vieillie de 24 ou 168 heures l'étaient moins. Les moustiques se nourrissant d'urine ont présenté des profils de vol différents et étaient principalement diurnes. Les femelles ayant reçu du saccharose ou de l'urine vieillie de 72 heures ont montré une activité tout au long de la période de 24 heures, tandis que celles ayant reçu de l'eau étaient plus actives en milieu de période. Les moustiques nourris au saccharose ont présenté les niveaux d'activité les plus élevés tard dans la nuit et tôt le matin, tandis que ceux ayant ingéré de l'urine vieillie de 72 heures ont connu une diminution progressive de leur activité sur 24 heures (Fig. 3).
Performances de vol des femelles Anopheles arabinis hématophages en quête d'hôtes, nourries d'urine de vache et d'urée. Lors du test en simulateur de vol, les moustiques femelles, nourries d'urine de vache fraîche et vieillie, d'urée à différentes concentrations, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H₂O), étaient attachées à des bras horizontaux rotatifs (voir ci-dessus). Pour les femelles en quête d'hôtes (à gauche) et les femelles hématophages (à droite), la distance totale parcourue et le nombre de vols par heure pour chaque régime alimentaire ont été enregistrés sur une période de 24 heures (gris foncé ; blanc clair). La distance moyenne et le nombre moyen de vols sont indiqués à droite du graphique d'activité circadienne. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Analyse statistique : voir le texte.
En général, l'activité de vol globale des femelles en quête d'hôte suivait un schéma similaire à celui de la distance de vol sur une période de 24 heures. La distance de vol moyenne était significativement affectée par le régime alimentaire ingéré (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), et les femelles en quête d'hôte ayant ingéré de l'urine pendant 72 heures volaient sur des distances significativement plus longues que celles ayant reçu les autres régimes (p < 0,0001). De plus, les moustiques nourris au saccharose volaient plus longtemps que ceux nourris à l'urine fraîche (p = 0,022) ou à l'urine vieillie de 24 heures (p = 0,022). Contrairement au schéma d'activité de vol décrit par le régime à base d'urine, les femelles en quête d'hôte nourries à l'urée présentaient une activité de vol persistante sur une période de 24 heures, avec un pic pendant la seconde moitié de la phase nocturne (Fig. 3). Bien que les schémas d'activité soient similaires, les femelles en quête d'hôte nourries à l'urée présentaient une augmentation significative de la distance de vol moyenne en fonction de la concentration absorbée. (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Les femelles à la recherche d'un hôte nourries avec n'importe quelle concentration d'urée ont volé plus longtemps que les femelles nourries avec de l'eau ou du saccharose (p < 0,03).
L'activité de vol globale des moustiques hématophages est restée stable et soutenue pendant 24 heures, quel que soit le régime alimentaire. On a observé une augmentation de l'activité urinaire durant la seconde moitié de la période nocturne chez les femelles nourries à l'eau, ainsi que chez celles nourries avec de l'urine fraîche ou vieille de 24 heures (image 3). Alors que le régime à base d'urine a significativement affecté la distance de vol moyenne chez les femelles nourries au sang (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), le régime à base d'urée n'a eu aucun effet (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Des différences significatives ont été observées avec les autres régimes à base d'urine et le régime témoin (urine fraîche, p = 0,0091 ; urine de 72 heures, p = 0,0022 ; urine de 168 heures, p = 0,001 ; saccharose, p = 0,0017 ; eau distillée, p = 0,036).
Les effets de l'alimentation à base d'urine et d'urée sur les paramètres de reproduction ont été évalués par des bioessais de ponte (Figure 4A) et étudiés en fonction du nombre d'œufs pondus par chaque femelle, de leur taille et du nombre de larves de premier stade nouvellement écloses. Le nombre d'œufs pondus par les femelles arabes nourries à l'urine variait selon le régime alimentaire (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008 ; Fig. 4B). Les femelles ayant reçu un repas d'urine et de sang pendant 24 heures ont pondu significativement plus d'œufs que celles ayant reçu d'autres régimes à base d'urine, et leurs résultats étaient similaires à ceux des femelles nourries au saccharose (Fig. 4B). De même, la taille des œufs pondus par les femelles nourries à l'urine variait selon le régime alimentaire (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001). Les femelles ayant reçu un repas d'urine et de sang pendant 24 heures ont pondu des œufs significativement plus gros que les femelles nourries à l'eau, tandis que les œufs des femelles ayant reçu un repas d'urine pendant 168 heures étaient plus petits. significativement plus petites (Fig. 4C). De plus, le régime alimentaire à base d'urine a significativement affecté la taille des larves (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), les larves issues d'œufs pondus par des femelles nourries à l'urine pendant 24 et 72 heures étant significativement plus grandes que celles issues d'œufs pondus par des femelles nourries à l'eau et des femelles nourries à l'urine pendant 168 heures (Figure 4D).
Performances reproductives des femelles d'Anopheles arabinis nourries à l'urine de vache et à l'urée. Des moustiques femelles gorgées de sang ont été nourries pendant 48 heures avec des régimes alimentaires composés d'urine de vache fraîche et vieillie, de différentes concentrations d'urée, de saccharose (10 %) et d'eau distillée (H₂O), avant d'être utilisées pour des bioessais et le prélèvement des substrats de ponte (A). Le nombre d'œufs (B, E), leur taille (C, F) et la taille des larves (D, G) ont été significativement affectés par le régime alimentaire (urine de vache : BD ; urée : EG). Les moyennes de chaque paramètre, désignées par des lettres différentes, étaient significativement différentes (ANOVA à un facteur suivie d'un test post-hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne.
L'urée, principal composant azoté de l'urine, a significativement influencé les paramètres de reproduction des femelles ayant consommé du sang, lorsqu'elle était administrée dans leur alimentation. Le nombre d'œufs pondus par les femelles nourries à l'urée, après un repas de sang, était proportionnel à la concentration d'urée (F(11, 360) = 4,69 ; p < 0,0001). Les femelles nourries avec des concentrations d'urée comprises entre 134 µM et 1,34 mM ont pondu davantage d'œufs (Figure 4E). Les femelles nourries avec des concentrations d'urée supérieures ou égales à 134 µM ont pondu des œufs plus gros que celles nourries à l'eau (F(10, 4245) = 36,7 ; p < 0,0001 ; Figure 4F). La taille des larves, bien qu'affectée par des concentrations d'urée similaires chez les mères (F(10, 3305) = 37,9 ; p < 0,0001), était plus variable (Figure 4G).
L'attraction globale pour les extraits volatils d'urine bovine en quête d'hôtes a été évaluée chez *Arabiensis* à l'aide d'un olfactomètre à tube de verre (Fig. 5A). Cette attraction était significativement influencée par l'âge de l'urine (χ² = 15,9, ddl = 4, p = 0,0032 ; Fig. 5B). L'analyse post-hoc a montré que l'odeur d'urine rance (24 heures) induisait une attractivité significativement plus élevée que tous les autres traitements (72 heures : p = 0,0060, 168 heures : p = 0,012, pentane : p = 0,00070), à l'exception de l'odeur d'urine fraîche (p = 0,13 ; Fig. 5B). Bien que l'attraction globale des moustiques hématophages pour l'odeur d'urine ne soit pas significativement différente (χ² = 8,78, ddl = 4, p = 0,067 ; Fig. 5C), ces femelles se sont révélées significativement plus attractives pour les extraits volatils d'urine que pour les autres traitements. Urine vieillie de 72 heures comparée aux témoins (p = 0,0066 ; Figure 5C).
Réponses comportementales aux odeurs d'urine de vache naturelle et synthétique lors de la recherche d'hôtes et de moustiques Anopheles arabianus gorgés de sang. Schéma de l'olfactomètre à tube de verre (A). Attraction des extraits volatils de l'espace de tête d'urine de vache fraîche et vieillie vers les moustiques hôtes (B) et hématophages (C). Déterminer la réaction des tentacules du moustique Anopheles arabianus. Les extraits de l'espace de tête isolés d'urine de vache fraîche (D), vieillie 24 heures (E), 72 heures (F) et 168 heures (G) sont présentés. Les tracés de détection par antenne électronique (EAD) montrent les variations de tension en réponse aux composés bioactifs présents dans l'espace de tête, élués du chromatographe en phase gazeuse et détectés par un détecteur à ionisation de flamme (FID). L'échelle représente l'amplitude de la réponse (mV) en fonction du temps de rétention (s). Les propriétés et les vitesses de libération (µg h-1) des composés bioactifs sont indiquées. Un astérisque (*) indique une réponse de faible amplitude constante. Deux astérisques (**) indiquent une réponse non reproductible. Réponses. Identifiez l'hôte (H) et le parasite hématophage (I). Anopheles arabinensis présente différentes attirances pour des mélanges synthétiques d'odeurs d'urine de vache fraîche et vieillie. Les proportions moyennes de moustiques attirés par les différents noms de lettres étaient significativement différentes (ANOVA à un facteur avec test post-hoc de Tukey ; p < 0,05). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de l'échelle.
Chez les femelles d'Ann.arabiensis, 72 h et 120 h après le repas de sang, pendant la ponte, aucune préférence n'a été montrée pour les extraits volatils de l'espace de tête de l'urine de vache fraîche et vieillie par rapport aux témoins au pentane (χ2 = 3,07, p > 0,05 ; Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1).
Chez les femelles d’Ann. arabiensis, les analyses GC-EAD et GC-MS ont identifié respectivement huit, six, trois et trois composés bioactifs (Figure 5D-G). Bien que des différences aient été observées dans le nombre de composés induisant des réponses électrophysiologiques, la plupart de ces composés étaient présents dans chaque extrait volatil de l’espace de tête, prélevé à partir d’urine fraîche et vieillie. Par conséquent, pour chaque extrait, seuls les composés ayant produit une réponse physiologique des antennes des femelles supérieure au seuil ont été inclus dans les analyses ultérieures.
Le taux de libération total des composés bioactifs volatils dans l'espace de tête a augmenté de 29 µg h-1 dans l'urine fraîche à 242 µg h-1 dans l'urine vieillie de 168 heures, principalement en raison des augmentations du p-crésol et du m-formaldéhyde, ainsi que du phénol. En revanche, les taux de libération d'autres composés, tels que la 2-cyclohexén-1-one et le décanal, ont diminué avec l'augmentation de l'âge de l'urine, ce qui était corrélé à la diminution observée de l'intensité du signal (abondance) dans le chromatogramme (Fig. 5D-G, panneau de gauche) et des réponses physiologiques à ces composés (Fig. 5D-G, panneau de droite).
Globalement, le mélange synthétique présentait un ratio naturel similaire de composés bioactifs identifiés dans les extraits volatils d'urine fraîche et vieillie (Fig. 5D–G) et ne semblait pas susciter d'attrait significatif pour la recherche d'un hôte (χ² = 8,15, ddl = 4, p = 0,083 ; Fig. 5H) ni pour les moustiques hématophages (χ² = 4,91, ddl = 4, p = 0,30 ; Fig. 5I). Cependant, des comparaisons post hoc par paires entre les traitements ont montré que les moustiques en quête d'un hôte étaient significativement attirés par le mélange synthétique d'urine vieillie de 24 h par rapport aux témoins au pentane (p = 0,0086 ; Fig. 5H).
Pour évaluer le rôle des différents composants dans des mélanges synthétiques d'urine vieillie de 24 h, six mélanges soustractifs ont été comparés à des mélanges complets dans le test du tube en Y, où chaque composé avait été retiré. Chez les moustiques en quête d'hôte, le retrait de chaque composé du mélange complet a eu un effet significatif sur les réponses comportementales (χ² = 19,63, ddl = 6, p = 0,0032 ; Fichier supplémentaire 1 : Figure S2A) : tous les mélanges soustractifs étaient plus attractifs que le mélange complet. En revanche, le retrait de chaque composé du mélange synthétique complet n'a pas affecté les réponses comportementales des moustiques hématophages (χ² = 11,38, ddl = 6, p = 0,077), à l'exception du décanal, dont l'attraction était plus faible que dans le mélange complet (p = 0,022 ; Fichier supplémentaire 1 : Figure S2B).
Dans un village d'Éthiopie touché par le paludisme, l'efficacité d'un mélange synthétique d'urine de vache (conservée pendant 24 heures) pour attirer les moustiques a été évaluée pendant dix nuits (Fig. 6A). Au total, 4 861 moustiques ont été capturés et identifiés, dont 45,7 % étaient des Anthropocus gambiae sl, 18,9 % des Anopheles pharoensis et 35,4 % des Culex spp. (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Anopheles arabinis est le seul membre du complexe d'espèces An. gambiae identifié par PCR. En moyenne, 320 moustiques ont été capturés par nuit. Les pièges appâtés avec le mélange synthétique ont capturé davantage de moustiques que les pièges témoins non appâtés (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Des pièges non appâtés ont été installés lors des cinq nuits témoins, au début, au milieu et à la fin de la période. Dans chaque paire de pièges, un nombre similaire de moustiques a été capturé, indiquant l'absence de biais entre les habitations (χ²(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³, ​​p > 0,05) et l'absence de déclin de la population durant la période d'étude. Comparé aux pièges témoins, le nombre de moustiques capturés dans les pièges contenant le mélange synthétique a significativement augmenté : recherche d'hôte (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), repas sanguin récent (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) et gestation (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123 ; voir le tableau S1 du fichier supplémentaire 1). Ceci se reflète également dans le nombre total de moustiques capturés : recherche d'hôte > repas sanguin > gestation > semi-gestation > mâles.
Évaluation sur le terrain de l'efficacité d'un mélange d'odeur synthétique d'urine de vache pendant 24 heures. Des essais sur le terrain ont été menés dans le centre-sud de l'Éthiopie (carte), près de la ville de Maki (encart), à l'aide d'un piège lumineux des Centres de contrôle et de prévention des maladies (CDC) (à droite), placé dans des maisons jumelées selon un plan en carré latin (image aérienne) (A). Les pièges lumineux des CDC, appâtés avec l'odeur synthétique, attirent et capturent les femelles d'Anopheles arabesques (B), mais pas celles d'Anopheles farroes (C), selon un effet dépendant de l'état physiologique. De plus, ces pièges ont capturé un nombre significativement accru de moustiques hôtes du genre Culex (D). Comparaison avec le témoin. Les barres de gauche représentent l'indice de sélection moyen des moustiques capturés dans les paires de pièges appâtés (vert) et de pièges témoins (ouverts) (N = 10), tandis que les barres de droite représentent l'indice de sélection moyen dans les paires de pièges témoins (ouverts ; N = 5). Les astérisques indiquent les niveaux de signification statistique (*p = 0,01 et ***p < 0,0001).
Les trois espèces ont été capturées différemment dans les pièges contenant des mélanges synthétiques. La recherche d'hôtes (χ²(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), la prise de sang (χ²(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) et la gestation (χ²(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) étaient significativement plus fréquentes chez *Anopheles arabinensis* dans le piège diffusant le mélange synthétique (Fig. 6B), tandis que la quantité d'*Anopheles pharoensis* dans différents états physiologiques était similaire (Fig. 6C). Concernant *Culex*, seule une augmentation significative du nombre de moustiques en recherche d'hôtes a été observée dans les pièges appâtés avec le mélange synthétique (χ²(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004 ; Fig. 6D), comparativement aux pièges témoins.
Des pièges à appâts, placés à l'extérieur des hôtes potentiels, entre les sites de reproduction et les communautés rurales d'Éthiopie, ont été utilisés pour évaluer si les moustiques vecteurs du paludisme utilisent l'odeur d'urine de vache comme signal d'habitat. En l'absence de signaux d'hôte, de chaleur et en présence ou non d'odeur d'urine de vache, aucun moustique n'a été capturé (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). Cependant, en présence de températures élevées et d'odeur d'urine de vache, des moustiques femelles vecteurs du paludisme ont été attirés et capturés, bien qu'en petit nombre, indépendamment de l'âge de l'urine (χ²(5, 25) = 2,29, p = 0,13 ; Fichier supplémentaire 1 : Figure S3). En revanche, les pièges témoins (à base d'eau) n'ont pas permis de capturer de moustiques vecteurs du paludisme à températures élevées (Fichier supplémentaire 1 : Figure S3).
Les moustiques vecteurs du paludisme acquièrent et distribuent des composés azotés en se nourrissant d'urine de vache (notamment dans les flaques d'eau) afin d'améliorer leurs caractéristiques de cycle de vie, à l'instar d'autres insectes [2, 4, 24, 25, 26]. L'urine de vache est une ressource renouvelable et facilement accessible, étroitement associée aux lieux de repos des vecteurs du paludisme, tels que les étables et la végétation haute à proximité des habitations rurales et des sites de ponte. Les moustiques femelles repèrent cette ressource grâce à leur odorat et sont capables de réguler l'absorption des composés azotés présents dans l'urine, notamment l'urée, principal composant azoté [15, 16]. Selon l'état physiologique de la femelle, les nutriments contenus dans l'urine sont utilisés pour améliorer l'activité de vol et la survie des femelles en quête d'hôtes, ainsi que la survie et les caractéristiques reproductives des individus ayant ingéré du sang lors du premier cycle gonadotrope. Par conséquent, le mélange d'urine joue un rôle nutritionnel important pour les vecteurs du paludisme qui restent cloîtrés, à l'instar des adultes malnutris [8], car il permet aux moustiques femelles d'acquérir des composés azotés essentiels. Ce comportement alimentaire à faible risque a des conséquences épidémiologiques importantes, car il augmente l'espérance de vie, l'activité et la capacité de reproduction des femelles, autant de facteurs qui influent sur la capacité vectorielle. De plus, ce comportement pourrait être la cible de futurs programmes de gestion des vecteurs.