栄養素の獲得と分配は、昆虫の採餌と生活史の形質を統合します。さまざまな生活段階での特定の栄養素の欠乏を補うために、昆虫は、たとえば水たまりとして知られるプロセスで脊椎動物の分泌物を食べることによって、補足摂食を通じてこれらの栄養素を得ることができます。蚊のハマダラカハマダラカは栄養失調にあるようであり、したがって代謝と生殖の両方に栄養素を必要とします。この研究の目的は、An. かどうかを評価することでした。栄養素を獲得するために牛の尿にアラビエンシスを撹拌すると、生活史の特徴が改善されます。
安全であることを確認してください。アラビエンシスは、生後24時間、72時間、および168時間経過した新鮮な牛の尿の匂いに引き寄せられ、宿主を探して採血した雌（採血後48時間）をY字管嗅覚計で測定し、妊娠中の雌を産卵検査のために評価しました。その後、化学分析と電気生理学的分析を組み合わせて、4つの年齢クラスすべての牛の尿中の生物活性化合物を特定しました。生理活性化合物は、Y チューブとフィールド試験で評価されました。マラリア媒介動物の潜在的な補足食として牛の尿とその主要な窒素含有化合物尿素を調査するために、摂食パラメーターと生活史の特徴が測定されました。メスの蚊の割合と吸収される牛の尿と尿素の量が評価されました。給餌後、メスの生存、繋留飛行、生殖について評価されました。
宿主の血液と栄養を求めます。実験室や野外調査で、アラブ人は新鮮な牛尿と熟成した牛の尿の自然な香りと合成の香りに惹かれました。妊娠中の雌は、産卵場所での牛の尿への反応には無関心でした。宿主を求める雌と吸血する雌は積極的に牛の尿と尿素を吸収し、飛行、生存、または繁殖のための生理学的状態の関数として生活史のトレードオフに従ってこれらの資源を割り当てます。
ハマダラカハマダラカは、生活史の特徴を改善するために牛の尿を取得し、分配します。牛の尿の補足給餌は、毎日の生存率とベクター密度の増加によって媒介能力に直接的に影響を与え、飛行活動の変化によって間接的に影響を与えるため、将来のモデルで考慮される必要があります。
栄養素の獲得と分配は、昆虫の採餌と生活史の特徴を統合しています[1、2、3]。昆虫は食物を選択して獲得し、食物の入手可能性と栄養素の要件に基づいて代償摂食を行うことができます[1、3]。栄養素の分配は生活史のプロセスに依存し、昆虫のさまざまな生活段階で食事の質と量に対する異なる要件につながる可能性があります[1、2]。特定の栄養素の欠乏を補うために、昆虫は泥やさまざまな餌などの補足摂食を通じてこれらの栄養素を入手できます。脊椎動物の排泄物や分泌物、腐肉など、水たまりとして知られるプロセス[2]。さまざまな蝶や蛾の種が主に記載されていますが、水飲み場は他の昆虫の目にも発生し、これらの種類の資源への誘引と摂食は、健康やその他の生活史形質に重大な影響を与える可能性があります[2、4、5、6]、7]。マラリア蚊ハマダラカハマダラカ（Anopheles gambiae sensu lato (sl)）は、 「栄養失調」の成体 [8] であるため、水やりは生活史の特徴において重要な役割を果たしている可能性がありますが、この行動はこれまで無視されてきました。この重要な輸送手段における栄養摂取量を増やす手段としての撹拌の使用は、重要な疫学的結果をもたらす可能性があるため、注意を払う必要があります。
ハマダラカのメス成虫の窒素摂取量は、幼虫期からのカロリー貯蔵量が少ないことと吸血粉の非効率な利用により制限されています[9]。メスのアンニガンビエ sl は通常、血粉を補給することでこれを補います[10, 11]。これにより、より多くの人がこの病気に感染するリスクにさらされ、蚊が捕食されるリスクが高まります。あるいは、蚊は、窒素の補給を利用することもできます。他の昆虫によって実証されているように、脊椎動物の排泄物は、適応と飛行の機動性を高める窒素化合物を獲得します[2]。この点で、アンの兄弟種の1つであるハマダラカの強くて独特の魅力は、ガンビアのsl種の複合体であるハマダラカ・アラビニス、新鮮で熟成した牛の尿[12、13、14]で興味深いです。ハマダラカ・アラビニスは宿主の好みにおいて日和見的であり、牛と結びつき、牛を食べることが知られています。牛の尿は資源です。窒素化合物が豊富で、尿素は新鮮な尿中の全窒素の 50 ～ 95% を占めます [15、16]。牛の尿が老化すると、微生物はこれらの資源を利用して 24 時間以内に窒素化合物の複雑さを軽減します [15]。有機窒素の減少に伴うアンモニアの急速な増加により、好アルカリ性微生物 (その多くは蚊に有毒な化合物を生成します) が繁殖します [15]。メスのアンナラビエンシスは、24 時間以内の尿に優先的に誘引されます [13、14]。
この研究では、宿主と吸血されたアンを探しました。最初のゴナドトロピン周期中に、アラビエンシスが尿を混合することによって尿素を含む窒素化合物の獲得について評価されました。次に、メスの蚊がこの潜在的な栄養資源をどのように割り当てて生存、生殖、さらなる採餌を改善するかを評価するために一連の実験が行われました。最後に、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿の匂いが、宿主と吸血されたアンに信頼できる手がかりを提供するかどうかを判断するために評価されました。潜在的な栄養資源であるアラビエンシスは、観察された異なる魅力の背後にある化学的相関関係を発見した。24時間熟成した尿中に同定された揮発性有機化合物（VOC）の合成臭気混合物を野外条件下でさらに評価し、実験室条件下で得られた結果を拡張し、牛尿の臭気がさまざまな生理学的状態に及ぼす影響を実証した。蚊の誘引。得られた結果により、An が確認されました。アラビエンシスは、脊椎動物の尿に含まれる窒素化合物を取得して分布させ、生活史の特徴に影響を与えます。これらの結果は、潜在的な疫学的な影響と、ベクターの監視と制御にどのように使用できるかという文脈で議論されています。
ハマダラカ属アラビカンス (ドンゴラ株) を 25 ± 2 °C、65 ± 5% RH、12:12 時間の明暗サイクルで維持しました。幼虫は蒸留水を満たしたプラスチック製トレイ (20 cm × 18 cm × 7 cm) で飼育し、Tetramin® フィッシュフード (Tetra Werke、Melle、DE) を与えました。蛹は 30 ml カップ (Nolato) に収集しました。 Hertila、Åstorp、SE）、その後、バグドームケージ（30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science、台中、台湾）に移して成虫の羽化を可能にしました。成体には、羽化後 4 日間（dpe）まで 10% スクロース溶液を自由に与え、その時点で宿主を求める雌には実験直前に餌を与えるか、実験前に蒸留水で一晩絶食させました。フライトチューブ実験に使用したメスは、水を自由に摂取させながら、わずか 4 ～ 6 時間だけ絶食させました。その後のバイオアッセイ用に吸血蚊を準備するために、膜栄養システム (Hemotek Discovery Workshops、アクリントン、英国) を使用して、4 匹の dpe メスに脱繊維羊の血液 (Håtunalab、SE、ブロ、SE) を与えました。その後、完全にうっ血したメスを個々のケージに移し、下記のように直接餌を与えるか、または 10% スクロースを与えました。後者のメスはフライトチューブバイオアッセイに使用され、実験室に移送され、実験前に 4 ～ 6 時間蒸留水を自由に摂取させた。
摂食アッセイを使用して、成人のアラブ雌の尿と尿素の消費量を定量化しました。宿主を求めている雌と採血雌に、1% 希釈した新鮮な牛尿と熟成牛の尿素、さまざまな濃度の尿素、および 2 つの対照 (10% ショ糖と水) を含む餌を 48 時間与えました。さらに、食品着色料 (1 mg ml-1 キシレンシアン化物 FF、CAS 2650-17-1、Sigma-Ald) rich、ストックホルム、SE）を食事に加え、250 μl 微量遠心管（Axygen Scientific、ユニオンシティ、カリフォルニア州、米国、図 1A）の 4 × 4 マトリックスで供給しました。端まで満たします（〜 300 μl）。蚊間の競合と染料の色の潜在的な影響を避けるために、大きなペトリ皿（直径 12 cm、高さ 6 cm、Semadeni、Ostermundi）に 10 匹の蚊を置きます。 gen, CH; 図 1A) 25 ± 2 cm °C、相対湿度 65 ± 5% の完全な暗闇で。これらの実験を 5 ～ 10 回繰り返しました。餌に曝露した後、蚊をさらなる分析まで -20 °C に置きました。
宿主と吸血メスのハマダラカハマダラカが吸収したウシ尿と尿素を探します。給餌試験 (A) では、メスの蚊に、新鮮な牛尿と熟成させた牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース (10%)、蒸留水 (H2O) からなる餌を与えました。宿主を求めるメス (B) と吸血したメス (C) は、テストした他のどの餌よりも多くのショ糖を吸収しました。吸収された 72 時間の牛の尿は、168 時間の牛の尿よりも少ない (B)。尿の平均総窒素含有量 (±標準偏差) が挿入図に示されています。宿主を求める雌 (D、F) と吸血雌 (E、G) は、用量依存的に尿素を摂取します。異なる文字名の平均吸入量 (D、E) は、互いに大きく異なりました (Tukey の事後分析を使用した一元配置分散分析; p < 0.05)。エラーバーは平均値の標準誤差 (BE) を表します。直線の破線は対数線形回帰直線 (F、G) を表します。
吸収された食物を放出するために、蚊を 230 μl の蒸留水が入った 1.5 ml 微量遠心管に個別に入れ、使い捨て乳棒とコードレスモーター (VWR International、ルンド、SE) を使用して組織を破砕し、続いて 10 krpm で 10 分間遠心分離しました。上清 (200 μl) を 96 ウェルマイクロプレート (Sigma-Aldrich) に移しました。 ）および吸光度（λ620）は、分光光度計ベースのマイクロプレートリーダー（SPECTROStar® Nano、BMG Labtech、デラウェア州オルテンバーグ）nm）を使用して測定しました。あるいは、蚊を1 mlの蒸留水中で粉砕し、その900 μlを分光光度分析用のキュベットに移しました（λ 620 nm; UV 1800、島津、キスタ、SE）。食事摂取量を定量化するため1 mg ml-1 キシレンシアン化物を 0.2 μl ～ 2.4 μl 生成するために、段階希釈によって標準曲線を作成しました。次に、既知の色素濃度の光学濃度を使用して、各蚊が摂取した食物の量を決定しました。
体積データは、一元配置分散分析 (ANOVA) に続いて Tukey の事後ペアワイズ比較を使用して分析されました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.、米国ノースカロライナ州ケアリー、1989 ～ 2007 年)。線形回帰分析は、濃度依存性の尿素摂取量を記述し、宿主探索蚊と吸血蚊の間の反応を比較しました (Mac 用 GraphPad Prism v8.0.0、GraphPad ソフトウェア) 、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）。
各年齢層からの尿サンプル約 20 μl を Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 メッシュ、Sigma Aldrich) に結合させ、錫カプセル (8 mm × 5 mm) にカプセル化しました。カプセルを CHNS/O 分析装置 (Flash 2000、Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) の燃焼室に挿入し、メーカーのプロトコールに従って新鮮な尿と古い尿の窒素含有量を測定しました。総窒素(g N l-1) は、標準として使用される既知の尿素濃度に基づいて定量化されました。
宿主探索および吸血雌の生存に対する食餌の影響を評価するために、換気と給餌用に蓋にメッシュで覆われた穴（直径 3 cm）を備えた大きなペトリ皿（直径 12 cm、高さ 6 cm、Semadeni）に蚊を個別に入れました。食餌は 4 dpe の直後に与えられ、1% 希釈した新鮮な牛尿と熟成牛尿、4 つの濃度の尿素、および 2 つの対照、10% スクロースと水が含まれていました。各食餌5 ml シリンジ (Thermo Fisher Scientific、ヨーテボリ、SE) に挿入した歯科用タンポン (DAB Dental AB、南東部、ウプランズ ヴァスビー) にピペットで移し、プランジャーを取り外し、ペトリ皿の上に置きました (図 1).1A)。食事を毎日変更します。上記のように研究室を維持します。生存している蚊を 1 日 2 回数え、死んだ蚊は最後の月まで廃棄しました。キトは死亡した（治療ごとに n = 40）。さまざまな食餌を与えられた蚊の生存を、カプラン・マイヤー生存曲線とログランク検定を使用して統計的に分析し、食餌間の生存分布の比較を比較しました（IBM SPSS Statistics 24.0.0.0）。
Attisano et al.[17]に基づいた特注の蚊飛びミル。前面パネルと背面パネルのない、厚さ 5 mm の透明なアクリル パネル (幅 10 cm x 長さ 10 cm x 高さ 10 cm) で作られています (図 3: 上)。ガスクロマトグラフィー カラム (内径 0.25 mm、長さ 7.5 cm) で作られた垂直チューブを備えたピボット アセンブリ。9 cm 離れた一対のネオジム磁石の間に吊り下げられた昆虫針に両端が接着されています。同じ素材 (長さ 6.5 cm) で作られた水平チューブが垂直チューブを二分して、繋がれたアームと、光を遮断する信号としてアルミ箔の小片を運ぶアームを形成しました。
24時間絶食させたメスに拘束前に上記の食事を30分間与えた。その後、十分に餌を与えたメスの蚊を個別に氷上で2～3分間麻酔し、蜜蝋で昆虫ピンに取り付け（Joel Svenssons Vaxfabrik AB、ムンカ・リュングビー、SE）、水平チューブのアームに縛り付けた。フライングミル。飛行ごとの回転数を特注のデータロガーで記録し、その後、 PC-Lab 2000™ ソフトウェア (v4.01; Velleman、Gavere、BE) を使用して保存および表示しました。フライトミルを気候制御された部屋 (12 時間:12 時間、明: 暗、25 ± 2 °C、65 ± 5% RH) に置きました。
飛行活動のパターンを視覚化するために、総飛行距離 (m) と連続飛行活動の総数が 24 時間にわたって 1 時間ごとに計算されました。さらに、個々の女性の平均飛行距離が治療間で比較され、一元配置 ANOVA と Tukey のポストホック分析 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.) を使用して分析されました。平均距離は従属変数とみなされますが、治療は独立した要素と考えられます。さらに、平均ラウンド数は次のように計算されます。 10分単位。
An.arabiensis の生殖能力に対する食餌の影響を評価するために、採血後 6 匹のメス (4 dpe) をバグドーム ケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm) に直接移し、上記のように実験食を 48 時間与えました。その後、食餌を取り除き、20 ml の蒸留水を満たした産卵カップ (30 ml; Nolato Hertila) を 3 日目に 48 時間与え、24 時間ごとに交換しました。各食餌療法を 20 ～ 50 回繰り返します。各実験ケージごとに卵を数え、記録しました。ライカ カメラ (DFC) 320 R2 を備えた Dialux-20 顕微鏡 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar、デラウェア州ウェッツラー) を使用して、卵のサブサンプルを使用して、個々の卵の平均サイズと長さの変動 (食餌ごとに n ≥ 200) を評価しました。残りの卵は標準飼育条件下で温度管理された部屋で 24 時間保管し、上記のように最近羽化した 1 齢幼虫のサブサンプル (食餌ごとに n ≥ 200) を測定しました。一元配置 ANOVA と Tukey のポストホック分析 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc) を使用して、処理間で卵の数と卵と幼虫のサイズを比較しました。 。）。
新鮮な尿（サンプリング後 1 時間）、24 時間、72 時間、および 168 時間経過した尿からのヘッドスペース揮発性物質を、アルシ種のゼブ牛から採取したサンプルから採取しました。便宜上、牛がまだ納屋にいる間に早朝に尿サンプルを採取しました。尿サンプルを 10 頭から採取し、各サンプル 100 ～ 200 ml を個別のポリアミドベーキングバッグ（Toppits Cofresco、Frischhalte）に移しました。各ウシ尿サンプルからのヘッドスペース揮発性物質は、直接（新鮮）、または室温で 24 時間、72 時間、および 168 時間熟成させた後に収集されました。つまり、各尿サンプルは各年齢グループを代表するものでした。
ヘッドスペース揮発性物質の収集では、閉ループシステムを使用して、ダイアフラム真空ポンプ (KNF Neuberger、デラウェア州フライブルク) を使用して、活性炭でろ過したガス流 (100 ml min-1) をポリアミドバッグを通して吸着カラムに 2.5 時間循環させました。対照として、空のポリアミドバッグからヘッドスペース収集を実行しました。吸着カラムは、 35 mg の Porapak Q (50/80 メッシュ; Waters Associates、米国マサチューセッツ州ミルフォード) をグラスウールプラグの間に充填しました。使用前に、カラムを 1 ml の再蒸留 n-ヘキサン (Merck、ダルムシュタット、デラウェア州) および 1 ml のペンタン (99.0% 純度の溶媒 GC グレード、Sigma Aldrich) でフラッシュしました。吸着した揮発性物質を 400 μl のペンタンで溶出しました。ヘッドスペースコレクションをプールし、さらなる分析に使用するまで-20℃で保管しました。
宿主探索および吸血アンの行動反応。24 時間、72 時間、および 168 時間経過した新鮮な尿から収集したヘッドスペースの揮発性抽出物を、ストレートガラス管嗅覚計を使用してシロイヌナズナ蚊からの揮発性抽出物について分析しました [18]。実験は、アンの故郷探索活動のピーク期間である ZT 13 ～ 15 の間に行われました。アラブ [19]。ガラス管嗅覚計 (内径 80 cm × 9.5 cm) を上から 3 ± 1 lx の赤色光で照射しました。木炭濾過し加湿した空気流 (25 ± 2 °C、相対湿度 65 ± 2%) が 30 cm s-1 でバイオアッセイを通過しました。空気は一連のステンレス鋼メッシュ スクリーンを通過し、層流と均一なプルーム構造を生成します。歯科用タンポン ディスペンサー (4 cm × 1 cm) ; L:D; DAB Dental AB)、嗅覚計の風上端にある 5 cm コイルから吊り下げ、刺激装置を 5 分ごとに交換しました。分析には、1:10 に希釈した各ヘッドスペース抽出物 10 μl を刺激として使用しました。同量のペンタンを対照として使用しました。個々の宿主探索蚊または吸血蚊を、開始の 2 ～ 3 時間前に個別の放出ケージに入れました。放出ケージを嗅覚計の風下側に置き、蚊を 1 分間順応させた後、ケージのバタフライ バルブを開いて放出しました。放出後 5 分以内に発生源と接触した蚊の割合として、処理または対照への誘引率を分析しました。各ヘッドスペース揮発性抽出物と対照を少なくとも 30 回複製し、1 日の影響を避けるために、同じ回数の処理と対照を行いました。ホストおよび血液を与えられたAnsからの応答を求めます。アラビア語対ヘッドスペースセットを、名目ロジスティック回帰に続いて奇数比のペアワイズ比較を使用して分析しました(JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.)。
新鮮および老化した牛の尿からのヘッドスペース抽出物を、バグドームケージ（30 cm×30 cm×30 cm;メガビュー科学）で分析しました。等量のペンタンを使用してコントロールカップを調整しました。治療とコントロールカップを各実験とコントロールカップを、位置効果のために制御するために交換されました。テン血で育てられた雌は、24時間後にカップの卵にカウントされました。卵が置かれた卵）。
メスの An.arabiensis のガスクロマトグラフィーおよび電子アンテナパターン検出 (GC-EAD) 分析は、以前に記載されているように [20] 実行されました。簡単に説明すると、HP-5 カラム (内径 30 m × 0.25 mm、膜厚 0.25 μm、Agilent Technologies) を備えた Agilent Technologies 6890 GC (米国カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、新鮮なヘッドスペース揮発性抽出物を分離しました。平均線流速 45 cm s-1 の移動相として水素を使用しました。入口温度 225 °C のスプリットレス モードで各サンプル (2 μl) を 30 秒間注入しました。GC オーブン温度は 10 °C min-1 で 35 °C (3 分間保持) から 300 °C (10 分間保持) にプログラムされました。GC 流出液スプリッター内4 psi の窒素を追加し、Gerstel 3D/2 ロー デッド ボリューム クロス (Gerstel、デラウェア州ミュールハイム) で炎イオン化検出器と EAD の間で 1:1 に分割しました。EAD 用の GC 流出キャピラリーは、GC オーブン温度プラス 5 °C を追跡する Gerstel ODP-2 移送ラインを通過し、ガラス管 (10 cm × 8 mm) に入れられ、そこで炭素濾過された加湿空気と混合されました。アンテナはチューブの出口から 0.5 cm の位置に配置しました。各個体の蚊が 1 回の反復を占め、宿主を求める蚊については、各年齢の尿サンプルに対して少なくとも 3 回の反復が行われました。
GC と質量分析計 (GC-MS、6890 GC および 5975 MS、Agilent Technologies) を組み合わせて使用​​し、70 eV の電子衝撃イオン化モードで動作する GC-EAD 分析で触角応答を引き出す、新鮮および熟成ウシ尿のヘッドスペース コレクション内の生物活性化合物の同定。GC には、HP-5MS UI コーティングされたフューズド シリカ キャピラリー カラム (内径 60 m × 0.25 mm) が装備されていました。 、平均線流速 35 cm s-1 で移動相としてヘリウムを使用し、GC-EAD 分析と同じインジェクター設定とオーブン温度を使用して 2 μl のサンプルを注入しました。化合物は、カスタム ライブラリおよび NIST14 ライブラリ (Agilent) と比較した保持時間 (Kovát 指数) および質量スペクトルに基づいて同定されました。同定された化合物は、本物の標準物質 (追加ファイル) を注入することによって確認されました。 1: 表 S2)。定量化のために、酢酸ヘプチル (10 ng、化学純度 99.8%、Aldrich) を外部標準として注入しました。
上記と同じ嗅覚計とプロトコルを使用して、新鮮な尿と古い尿で同定された生理活性化合物からなる合成臭気混合物の、宿主探索性および吸血性の Ans.arabiensis を誘引する有効性を評価します。合成混合物は、新鮮、24 時間、48 時間、72 時間、および 168 時間の熟成尿の混合ヘッドスペース揮発性抽出物中の化合物の組成と割合を模倣しました (図 5D-G; 追加ファイル 1:表 S2)。分析には、宿主および吸血蚊に対する誘引性を評価するために、全体の放出速度が約 140 ～ 2400 ng h-1 の範囲の完全合成混合物の 1:100 希釈液 10 μl を使用します。その後、試験は完全な混合物に対して実行され、完全な混合物から単一化合物のサブトラクティブ混合物が除去されます。宿主および吸血された Ans.Arab 対合成混合物およびサブトラクティブ混合物からの応答を求めます。名目ロジスティック回帰とそれに続く奇数比のペアワイズ比較を使用して分析しました (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.)。
牛の尿がマラリア蚊の宿主生息地の手がかりとなるかどうかを評価するために、上記のように収集した新鮮な牛尿と熟成した牛の尿、および水をメッシュの入った3リットルバケツ（100ml）に入れ、宿主餌トラップにセットしました。(BG-HDT バージョン; BioGents、レーゲンスブルク、デラウェア州)。村落コミュニティ (エチオピア、シライ、北緯 5 度 53´24´´、東経 37 度 29´24´´) から 400 m 離れた牧草地に 50 メートル離れた場所に 10 個のトラップを設置し、恒久的な繁殖地と村に牛は置かなかった。5 つのトラップは宿主の存在をシミュレートするために加熱され、5 つのトラップは加熱されずに放置された。各処理場所は合計 5 つで毎晩ローテーションされる。異なる年齢の尿を餌としたトラップで捕獲された蚊の数を、ベータ二項分布によるロジスティック回帰を使用して比較しました（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。
エチオピア、オロミア地方のマキ町近くのマラリア常在村（北緯8度11分08秒、東経38度81分70秒、図6A）。研究は、長い雨季に加え、毎年屋内残留噴霧が行われる前の8月中旬から9月中旬までの間に行われた。村の郊外にある5組の家屋（20～50メートル離れている）が研究のために選ばれた（図6A）。家の選択に使用された基準は、家の中に動物が立ち入らないこと、室内での調理（薪や木炭の汲み取り）が許可されていないこと（少なくとも試用期間中）、最大2人の住人が殺虫剤の中で眠っている家であることだった。処理された蚊帳の下で。倫理的承認は、世界医師会ヘルシンキ宣言によって定められたガイドラインに従って、アディスアベバ大学自然科学部（CNS-IRB）の施設内研究倫理審査委員会（IRB/022/2016）によって与えられました。健康増進スタッフの支援を受けて、各世帯主の同意を得ました。プロセス全体は、地区および区の地方行政（「ケベレ」）によって承認されています。実験計画は 2 × 2 のラテン方陣計画に従い、合成混合物と対照を最初の夜にペアの家に割り当て、次の実験の夜に家の間で交換しました。このプロセスを 10 回繰り返しました。さらに、選択した家における蚊の活動を推定するために、CDC トラップを圃場試験の開始時、中間時、終了時に 5 晩連続で同じ時間帯に稼働するように設定しました。
6 つの生理活性化合物を含む合成混合物をヘプタン (97.0% 溶媒 GC グレード、Sigma Aldrich) に溶解し、綿芯ディスペンサーを使用して 140 ng h-1 で放出しました [20]。芯ディスペンサーを使用すると、12 時間の実験を通じてすべての化合物を一定の割合で放出できました。ヘプタンを対照として使用しました。バイアルは疾病管理予防センター (CDC) ライト トラップ (John W. H.) の入口ポイントの隣に吊り下げられました。 ock Company、ゲインズビル、フロリダ州、米国; 図 6A).トラップはベッドの足元近くの地面から 0.8 ～ 1 m の高さに吊り下げられ、ボランティアは未処理の蚊帳の下で眠り、18:00 から 06:30 まで稼働しました。性別および生理的状態 (給餌されていない、給餌されていない、半妊娠中、妊娠中 [21]) ごとに捕獲された蚊は、その後ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 分析を使用してスクリーニングされました。形態学的に A. gambiae sl と同定された種を特定する 複合体のメンバー [23]. フィールド調査では、誘引力が従属変数、処理 (合成混合物対対照) が固定効果である名目ロジスティック適合モデルを使用して、ペアハウスのトラップ捕獲が分析されました (JMP® 14.0.0.SAS Institute Inc.）。ここでは、尤度比検定からの χ2 値と p 値を報告します。
安全かどうかを評価する。アラビエンシスは、宿主探索および吸血メスの給餌試験（dpe）後4日間の投与から48時間以内に、直接摂食によってその主な窒素源である尿素を得ることができた（図1A）。宿主探索メスと吸血メスの両方が、他の餌や水よりも有意に多くのスクロースを吸収した（F(5,426) = 20.15、p < 0.0001およびF (5,299) = 56.00、p < 0.0001、それぞれ;図 1B、C) さらに、宿主を求める雌は、168 時間の尿と比較して、72 時間の尿中の摂取量が減少しました (図 1B)。これは、通常、10% スクロースよりも大幅に少ないにもかかわらず、水よりも有意に多くの尿素を含む食事を吸収する血液で育てられた雌の反応とは対照的でした (F(10,557) = 78.35、p < 0.0001; 図 1)。 E) さらに、2 つの生理学的状態を比較すると、最低濃度では瀉血を受けた雌の方が宿主探索雌よりも多くの尿素を吸収し、これらの雌はより高い濃度では同量の尿素を吸収した (F(1,953)= 78.82、p < 0.0001;尿素を含む食事からの摂取量には最適な値があるように見えましたが（図 1D、E）、両方の生理学的状態にある女性は、尿素濃度の全範囲にわたって対数線形方式で尿素の吸収量を調節できました（図 1F、G）。同様に、尿中の窒素量が吸収量に反映されるため、蚊は尿の吸収量を調節することで窒素の取り込みを制御しているようです（図 1B、C、B 挿入図）。
宿主探索蚊および吸血蚊の生存に対する尿と尿素の影響を評価するために、メスに 4 つの年齢すべての尿 (新鮮、沈着後 24 時間、72 時間、および 168 時間) および一定範囲の尿素濃度の尿を与え、さらに蒸留水および 10% ショ糖を対照として与えました (図 2A)。この生存分析は、食餌が宿主探索メスの全生存に重大な影響を与えることを示しました (尿: χ2 = 108.5、df = 5、p < 0.0001; 尿素: χ2 = 122.8、df = 5、p < 0.0001; 図 2B、C) および血液給餌雌 (尿: χ2 = 93.0、df = 5、p < 0.0001; 尿素: χ2 = 137.9、df) = 5、p < 0.0001; 図 2D、E)。すべての実験において、尿、尿素、水の餌を与えられたメスは、スクロース餌を与えられたメスと比較して生存率が著しく低かった (図 2B ～ E)。新鮮な尿と古い尿を与えられた宿主探索メスは異なる生存率を示し、72 時間の古い尿を与えられたメス (p = 0.016) は生存確率が最も低かった (図 2B)。さらに、135 mM 尿素を与えられた宿主探索メスは、水コントロールよりも長く生存しました (p < 0.04) (図 1)。水と比較して、新鮮な尿と 24 時間の尿を与えられた女性はより長く生存しました (それぞれ p = 0.001 および p = 0.012; 図 2D)。一方、72 時間の尿を与えられた女性は女性の短い新鮮な尿および 24 時間熟成された尿を与えられた女性よりも長く生存しました (それぞれ p < 0.0001 および p = 0.013; 図 2D)。 135 mM 尿素を与えられた場合、血液で育てられた女性他のすべての濃度の尿素および水よりも長く生存しました (p < 0.013; 図 2E)。
牛の尿と尿素を食べる宿主と吸血メスのハマダラカの生存。バイオアッセイ (A) では、メスの蚊に新鮮な牛尿と熟成させた牛尿、さまざまな濃度の尿素、ショ糖 (10%)、蒸留水 (H2O) からなる餌を与えました。宿主を求める蚊 (B、C) と吸血する蚊 (D、E) の生存率を、すべてのメスが絶滅するまで 12 時間ごとに記録しました。尿 (B、D) と尿素 (C、E) を与えられた動物、および対照であるスクロースと水は死亡しました。
24時間のフライトミルテストで決定された総距離とラウンド数は、宿主を探す蚊と吸血する蚊では異なり、全体的に飛行活動が少ないことが示されました（図3）。新鮮で熟成した尿またはショ糖と水を与えた宿主を探す蚊は、明確な飛行パターンを示し（図3）、新鮮な尿を食べる雌は夜明けにより活発になり、一方、24時間および168時間熟成した蚊を与える雌はより活発でした。尿を食べた蚊は異なる飛行パターンを示し、主に昼行性でした。ショ糖または72時間の尿を与えたメスの蚊は24時間を通して活動を示しましたが、水を与えたメスの蚊は期間中期により活動的でした。ショ糖を与えた蚊は深夜と早朝に最も高いレベルの活動を示しましたが、72時間熟成した尿を摂取した蚊は24時間にわたって活動が着実に低下しました(図3)。
牛の尿と尿素を餌とする、ハンターを求めて吸血するメスのハマダラカの飛行性能。フライトミルテストでは、新鮮な牛の尿と熟成させた牛の尿、さまざまな濃度の尿素、ショ糖（10％）、蒸留水（H2O）を餌とするメスの蚊を、自由に回転する水平アーム（上）に繋ぎ止めた。宿主を探すメス（左）と吸血するメス（右）の、1時間あたりの総飛行距離と回数24 時間にわたる各食事の運動が記録されました (暗: 灰色、明: 白)。平均距離と平均発作回数が概日活動グラフの右側に表示されます。エラーバーは平均値の標準誤差を表します。統計分析は本文を参照してください。
一般に、宿主を求めるメスの全体的な飛行活動は、24 時間にわたる飛行距離のパターンと同様のパターンに従いました。平均飛行距離は、摂取した餌によって大きく影響され (F(5, 138) = 28.27、p < 0.0001)、72 時間の尿を摂取した宿主探しのメスは、他のすべての餌と比較して有意に長い距離を飛行しました (p < 0.0001)。足の指は、新鮮な（p = 0.022）および24時間経った尿（p = 0.022）を与えられた蚊よりも長く飛んだ。尿食によって説明された飛行活動パターンとは対照的に、尿素を与えられた宿主探索メスは24時間にわたって持続的な飛行活動を示し、暗期の後半にピークに達した（図3）。活動パターンは類似していたが、尿素を与えられた宿主探索メスは、条件に応じて平均飛行距離を有意に増加させた。吸収濃度 (F(5, 138) = 1310.91、p < 0.0001)。任意の濃度の尿素を与えた宿主探索雌は、水またはショ糖を与えた雌よりも長く飛行しました (p < 0.03)。
吸血蚊の全体的な飛行活動は、すべての食餌で 24 時間にわたって安定しており、水で飼育されたメスと生後 24 時間の新鮮な餌を与えられたメスの暗期の後半に尿の活動が増加しました (画像 3)。尿食は吸血メスの平均飛距離に大きな影響を与えましたが (F(5, 138) = 4.83、p = 0.0004)、尿素食は影響しませんでした (F(5, 1) 38) = 1.36、p = 0.24) 他の尿および対照食を使用した場合 (新鮮、p = 0.0091; 72 時間、p = 0.0022; 168 時間、p = 0.001; スクロース、p = 0.0017; dH2O、p = 0.036)。
生殖パラメータに対する尿および尿素摂取の影響は、産卵バイオアッセイで評価され（図 4A）、各メスが産んだ卵の数、卵のサイズ、新たに孵化した一齢幼虫に従って調査されました。産卵数は、尿を与えられたアラブ系メスは食事によって異なりました（F（5,222） = 4.38、p = 0.0008; 図 4B）。メスは 24 時間尿と血液を与えられました。同様に、尿で育てたメスが産む卵のサイズは食事によって異なり（F(5, 209) = 12.85、p < 0.0001）、24時間尿とショ糖で育てたメスは水で育てたメスよりも有意に大きな卵を産みましたが、尿で育てたメスの卵は168個でした。さらに、尿食は幼虫のサイズに有意な影響を及ぼし（F(5, 187) = 7.86、p < 0.0001）、卵幼虫から産んだ卵よりも、生後 24 時間および 72 時間の尿を与えた雌が産んだ卵から出現する幼虫の方が有意に大きかった。水与えおよび 168 時間尿与えた雌（図 4D）。
牛の尿と尿素を摂食するメスのハマダラカの繁殖能力。血液を与えられたメスの蚊に、新鮮な牛尿と熟成させた牛の尿、さまざまな濃度の尿素、スクロース（10％）、蒸留水（H2O）からなる餌を48時間与えてから、バイオアッセイに入れて産卵基質を取得した48時間（A）。卵の数（B、E）、卵の大きさ（C、F）と幼虫サイズ (D、G) は、与えられた食事によって大きく影響されました (牛の尿: BD、尿素: EG)。異なる文字名を使用して測定された各パラメータの平均値は、互いに大きく異なりました (Tukey の事後分析を使用した一元配置分散分析; p < 0.05)。エラー バーは平均値の標準誤差を表します。
尿の主要な窒素成分である尿素は、採血雌に餌として与えられた場合、すべての研究において生殖パラメータに有意な影響を及ぼした。 採血後に尿素を与えられた雌が産む卵の数は、尿素濃度に応じて（F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001）、134 µM ～ 1.34 mM の尿素濃度を与えられた雌はより多くの卵を産んだ（図 4E）。 134 μM 以上の尿素濃度で給餌されたメスは、水で給餌されたメスよりも大きな卵を産み (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; 図 4F)、幼虫のサイズは、母親の同様の尿素濃度の影響を受けながらも (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001)、より変動しやすかった (図 4G)。
宿主を求めるウシ尿のヘッドスペース揮発性抽出物に対する全体的な誘引。ガラス管嗅覚計で評価したアラビエンシス（図5A）は、尿年齢の影響を大きく受けた（χ2 = 15.9、df = 4、p = 0.0032、図5B）。事後分析では、24時間の古い尿臭が他のすべての処理と比較して有意に高いレベルの誘引を引き起こすことが示された（72時間：p = 0.0） 060、168 時間: p = 0.012、ペンタン: p = 0.00070)、新鮮な尿の匂いを除いて (p = 0.13、図 5B)。尿の匂いに対する吸血蚊の全体的な誘引力には有意な差はありませんでしたが (χ2 = 8.78、df = 4、p = 0.067、図 5C)、これらのメスは尿の匂いに対して有意に魅力的であることがわかりました。ヘッドスペース揮発性抽出物を 72 時間熟成した尿と対照と比較した (p = 0.0066、図 5C)。
宿主および吸血ハマダラカの探索における天然および合成の牛尿の匂いに対する行動反応。ガラス管嗅覚計の概略図 (A)。新鮮な牛尿と熟成した牛尿からのヘッドスペース揮発性抽出物の宿主 (B) および吸血蚊 (C) への誘引。アン卿の触手反応を見つける。新鮮な (D)、24 時間 (E)、72 時間から分離されたヘッドスペース抽出物(F) および 168 時間経過した牛の尿 (G) を示しています。電子アンテナ検出 (EAD) トレースは、ガスクロマトグラフから溶出され、水素炎イオン化検出器 (FID) によって検出されたヘッドスペース内の生物活性化合物に応答した電圧変化を示しています。スケール バーは、応答振幅 (mV) 対保持時間 (s) を表しています。生物活性化合物の特性と放出速度 (μg h-1) が示されています。単一のアスタリスク (*) は、一貫性のあることを示します。低振幅応答。二重アスタリスク (**) は再現不可能な応答を示します。宿主 (H) と吸血者 (I) を見つけます。アラビエンシスは、新鮮な牛の尿の匂いと熟成した牛の尿の匂いの合成混合物に対して異なるアピールをします。異なる文字名に誘引される蚊の平均割合は、互いに大きく異なりました (Tukey の事後分析を使用した一元配置 ANOVA;p < 0.05)。エラーバーはスケールの標準誤差を表します。
産卵中の採血後 72 時間および 120 時間のメスのアンナラビエンシスでは、ペンタン対照と比較して、新鮮および熟成牛の尿からのヘッドスペース揮発性抽出物に対して優先性は示されませんでした（χ2 = 3.07、p > 0.05; 追加ファイル 1：図 S1）。
メスのアンナラビエンシスの場合、GC-EAD および GC-MS 分析により、8、6、3、および 3 つの生理活性化合物が同定されました (図 5D-G)。電気生理学的反応を誘発する化合物の数には違いが観察されましたが、これらの化合物のほとんどは、新鮮な尿と古い尿から収集された各ヘッドスペースの揮発性抽出物に存在していました。したがって、各抽出物について、メスの触角から閾値を超える生理学的反応を生じた化合物のみがさらなる分析に含まれました。
ヘッドスペース収集における生理活性化合物の総揮発性放出速度は、新鮮な尿の 29 μg h-1 から 168 時間経過尿の 242 μg h-1 まで増加しました。これは、主に p-クレゾールと m-ホルムアルデヒド、フェノールの増加によるものです。対照的に、2-シクロヘキセン-1-オンやデカナールなどの他の化合物の放出速度は、尿年齢の増加とともに減少し、これは観察された信号強度の減少と相関していました。クロマトグラム (図 5D)-G 左パネル) およびこれらの化合物に対する生理学的反応 (図 5D-G 右パネル) における存在量)。
全体として、合成混合物は、新鮮な尿ヘッドスペースと古い尿ヘッドスペースの揮発性抽出物で同定された生理活性化合物の天然比と同様であり（図5D-G）、宿主（χ2 = 8.15、df = 4、p = 0.083、図5H）や吸血蚊（χ2 = 4.91、df = 4、p = 0.30、図5H）の探索において顕著な魅力を引き出すようには見えませんでした。しかし、処理間の事後ペアワイズ比較により、宿主を求める蚊は、ペンタン対照と比較して、24時間熟成尿の合成混合物に対して有意に誘引されることが示された（p = 0.0086、図5H）。
24 時間経過した尿の合成混合物における個々の成分の役割を評価するために、個々の化合物が除去された Y チューブ アッセイで完全な混合物に対して 6 つのサブトラクティブ混合物が評価されました。宿主を求める蚊の場合、完全な混合物から個々の化合物を差し引くことは行動反応に有意な影響を及ぼしました (χ2 = 19.63、df = 6、p = 0.0032; 追加ファイル 1: 図 S2A)。対照的に、完全合成混合物からの個々の化合物の除去は、デカナールを除いて、吸血蚊の行動反応に影響を与えず(χ2 = 11.38、df = 6、p = 0.077)、完全混合物と比較して誘引レベルが低下しました(p = 0.022、追加ファイル1:図S2B)。
エチオピアのマラリア常在村で、野外条件下で蚊を誘引する24時間牛尿の合成混合物の有効性が10日間評価された（図6A）。合計4,861匹の蚊が捕獲され識別され、そのうち45.7％がAnthropus.gambiae sl、18.9％がハマダラカ・ファロエンシス、35.4％がCulex sppであった。 (追加ファイル 1: 表 S1)。ハマダラカ アラビニスは、PCR 分析によって同定されたガンビア種複合体の唯一のメンバーです。平均して、一晩あたり 320 匹の蚊が捕獲されました。その間、合成混合餌を使用したトラップの方が、混合物を使用しないペアのトラップよりも多くの蚊を捕獲しました (χ2(0, 3196) = 170.0、p < 0.0001)。餌のないトラップはそれぞれに設置されました。試験の開始時、中間期、終了時の5つのコントロールの夜。各ペアのトラップで同様の数の蚊が捕獲されたが、これは家屋間に偏りがなく(χ2(0, 1665) = 9 × 10-13、p > 0.05)、研究期間中に個体数の減少がないことを示している。コントロールのトラップと比較して、合成混合物を含むトラップに捕獲された蚊の数は大幅に増加した:宿主を探している(χ2(0, 2107)) = 138.7、p < 0.0001）、最近の授乳（χ2(0, 650) = 32.2、p < 0.0001）および妊娠（χ2(0, 228) = 6.27、p = 0.0123;追加ファイル 1: 表 S1)。これは、捕獲された蚊の総数にも反映されています: 宿主探し > 吸血 > 妊娠中 > 半妊娠中 > オス。
24時間合成牛尿臭気混合物の有効性の野外評価。野外試験はマキ町（挿入図）近くのエチオピア中南部（地図）で、ラテン方陣デザイン（航空写真）のペアハウスで疾病管理センター（CDC）の光トラップ（右）を使用して実施された（A）。合成臭気を餌としたCDC光トラップはメスのハマダラカ（B）を誘引して捕獲するが、ハマダラカファロー（C）は誘引しない（C）。さらに、これらのトラップは、宿主であるアカイエカの数を大幅に増加させました。(D) 対照との比較。左側の棒は、臭気餌 (緑色) と対照 (開放) トラップのペア (N = 10) で捕獲された蚊の平均選択指数を表し、右側の棒は、対照トラップ (開放、N = 5) のペアで捕獲された蚊の平均選択指数を表します。).アスタリスクは統計的有意水準を示します (*p = 0.01 および ***p < 0.0001)
3 種は、合成混合物を含むトラップで異なる方法で捕獲されました。宿主の探索 (χ2(1, 1345) = 71.7、p < 0.0001)、吸血 (χ2(1, 517) = 16.7、p < 0.0001)、および妊娠 (χ2(1, 180) = 6.11、p = 0.0134) で .arabiensis が捕獲されました。トラップは合成混合物を放出しましたが（図6B）、Anの量には違いはありませんでした。さまざまな生理学的状態のファロエンシスが見つかりました（図6C）。アカイエカの場合、対照トラップと比較して、合成混合物を餌としたトラップでは、宿主を求める蚊の数の有意な増加のみが見られました（χ2（1,1319）= 12.6、p = 0.0004、図6D）。
エチオピアの繁殖地と農村部の間の潜在的宿主の外側に設置された宿主餌トラップを使用して、マラリア蚊が宿主生息地の合図として牛の尿の匂いを使用するかどうかを評価しました。宿主の合図、熱が存在しない場合、牛の尿の匂いの有無にかかわらず、蚊は捕獲されませんでした（追加ファイル1：図S3）。しかし、高温と牛の尿の匂いが存在すると、少数ではありますが、尿とは関係なく雌のマラリア蚊が誘引され捕獲されました。年齢 (χ2(5, 25) = 2.29、p = 0.13; 追加ファイル 1: 図 S3)。対照的に、水対照では高温でマラリア蚊を捕獲できませんでした (追加ファイル 1: 図 S3)。
マラリア蚊は、他の昆虫と同様に、生活史形質を強化するために、牛の尿（つまり水たまり）を代償的に摂食することで窒素含有化合物を獲得し分配します[2、4、24、25、26]。牛の尿は、農村の家や産卵場所に近い牛舎や背の高い植物など、マラリア媒介動物の休息場所と密接に関連している、すぐに入手できる再生可能な資源です。メスの蚊は、次の方法でこの資源を見つけます。匂いを嗅ぎ、尿中の主要な窒素成分である尿素を含む尿中の窒素化合物の取り込みを調節することができます[15、16]。メスの蚊の生理学的状態に応じて、尿中の栄養素は、宿主を求めるメスの蚊の飛行活動と生存、および最初の性腺刺激周期中の吸血個体の​​生存と生殖特性を強化するために割り当てられます。したがって、尿の混合は、マラリア媒介動物にとって重要な栄養的役割を果たします。これは、メスの蚊に低リスクの摂食を行うことで重要な窒素化合物を獲得する能力を与えるためである[8]。メスの平均余命、活動性、生殖生産量が増加し、これらすべてが媒介能力に影響を与えるため、この発見は重大な疫学的結果をもたらす。さらに、この行動は将来の媒介動物管理プログラムの対象となる可能性がある。