栄養の獲得と分配は、昆虫の採餌と生活史特性を統合する。昆虫は、さまざまな生活段階で特定の栄養素が不足している場合、例えば、水たまりと呼ばれるプロセスで脊椎動物の分泌物を食べることによって、これらの栄養素を補給することができる。蚊の Anopheles arabiani は栄養失調のようで、そのため代謝と繁殖の両方に栄養素を必要とする。本研究の目的は、An. arabiensis が栄養獲得のために牛の尿をかき混ぜることで生活史特性が改善されるかどうかを評価することであった。
安全であることを確認してください。arabiensis は新鮮な、24 時間、72 時間、および 168 時間経過した牛の尿の匂いに誘引され、宿主を探している雌と吸血した雌 (吸血後 48 時間) を Y チューブ嗅覚計で測定し、妊娠した雌を産卵テストで評価しました。次に、化学的および電気生理学的分析を組み合わせて、4 つの年齢クラスすべての牛の尿中の生物活性化合物を特定しました。生物活性化合物の合成混合物を Y チューブおよびフィールド試験で評価しました。牛の尿とその主な窒素含有化合物である尿素をマラリア媒介蚊の潜在的な補助食として調査するために、摂食パラメータと生活史特性を測定しました。雌蚊の割合と吸収された牛の尿と尿素の量を評価しました。摂食後、雌の生存、テザー飛行、および繁殖を評価しました。
宿主の血液と栄養を求めて。実験室および野外調査では、アラブ人は新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿の自然な匂いと合成の匂いに引き寄せられた。妊娠中の雌は産卵場所での牛の尿の反応に無関心であった。宿主を探し、血液を吸う雌は、牛の尿と尿素を積極的に吸収し、逃走、生存、または繁殖のための生理的状態に応じて、生活史のトレードオフに従ってこれらの資源を配分する。
アノフェレス・アラビニスは、生活史特性を向上させるために牛の尿を摂取し、それを分配する。牛の尿を補給的に与えることは、日々の生存率とベクター密度を直接的に増加させ、飛行活動を変化させることで間接的にベクター能力に影響を与えるため、今後のモデルで考慮されるべきである。
栄養の獲得と分配は、昆虫の採餌と生活史特性を統合する[1,2,3]。昆虫は、食物の入手可能性と栄養要求に基づいて食物を選択して獲得し、代償摂食を行うことができる[1,3]。栄養素の分配は生活史プロセスに依存し、昆虫の異なる生活段階で食事の質と量に対する異なる要求につながる可能性がある[1,2]。特定の栄養素の欠乏を補うために、昆虫は泥、脊椎動物のさまざまな排泄物や分泌物、腐肉などの補給摂食によってこれらの栄養素を得ることができ、このプロセスは水たまりとして知られている[2]。主にさまざまなチョウやガの種が記載されているが、水たまりは他の昆虫の目にも存在し、これらのタイプの資源への誘引と摂食は、健康やその他の生活史特性に大きな影響を与える可能性がある[2,4,5,6]、7]。マラリア蚊Anopheles gambiae sensu lato (sl)は、 「栄養失調」の成体[8]であるため、給水は生活史特性において重要な役割を果たす可能性があるが、この行動はこれまで無視されてきた。この重要な媒体における栄養摂取量を増やす手段としての攪拌の使用は、重要な疫学的結果をもたらす可能性があるため、注目に値する。
成虫の雌アノフェレス蚊の窒素摂取量は、幼虫期から蓄積されたカロリー貯蔵量が少なく、血液食の利用効率が低いため制限される[9]。雌のAnn.gambiae slは通常、血液食を補給することでこれを補う[10, 11]ため、より多くの人が病気に感染するリスクにさらされ、蚊は捕食されるリスクが高まる。あるいは、他の昆虫で実証されているように[2]、蚊は脊椎動物の排泄物を補給することで、適応と飛行機動性を高める窒素化合物を獲得することができる。この点において、An.gambiae sl種複合体内の姉妹種の1つであるAnopheles arabinisが、新鮮な牛尿と熟成した牛尿に強く明確に誘引されることは興味深い[12,13,14]。Anopheles arabinisは宿主選択において日和見的であり、牛と関連して牛から吸血することが知られている。牛尿は尿は窒素化合物が豊富な資源であり、新鮮な尿中の全窒素の 50 ～ 95% は尿素である [15, 16]。牛の尿が古くなると、微生物はこれらの資源を利用して 24 時間以内に窒素化合物の複雑さを軽減する [15]。有機窒素の減少に伴うアンモニアの急速な増加により、好アルカリ性微生物 (その多くは蚊に有毒な化合物を生成する) が繁殖する [15]。雌の Ann.arabiensis は、24 時間以内の尿に優先的に引き寄せられる可能性がある [13, 14]。
この研究では、宿主と吸血した Ans が探索されました。最初のゴナドトロピン周期の間、尿を混ぜることで尿素を含む窒素化合物の獲得について arabiensis が評価されました。次に、雌蚊がこの潜在的な栄養資源をどのように割り当てて生存、繁殖、およびさらなる採餌を向上させるかを評価する一連の実験が行われました。最後に、新鮮な牛の尿と熟成した牛の尿の臭いが評価され、これらが宿主と吸血した An にとって信頼できる手がかりとなるかどうかを判断しました。この潜在的な栄養資源を探す中で、arabiensis は観察された異なる魅力の背後にある化学的相関関係を発見しました。24 時間熟成した尿で特定された揮発性有機化合物 (VOC) の合成臭気混合物がさらに野外条件下で評価され、実験室条件下で得られた結果を拡張し、牛の尿臭がさまざまな生理的状態に与える影響が実証されました。蚊の誘引。得られた結果は An がarabiensisは脊椎動物の尿中に含まれる窒素化合物を取り込み、それを体内に拡散させることで、生活史特性に影響を与える。これらの結果は、潜在的な疫学的影響と、ベクターの監視および制御にどのように利用できるかという観点から考察される。
アノフェレス・アラビカンス（ドンゴラ系統）は、25 ± 2 °C、65 ± 5% RH、12 時間明期：12 時間暗期のサイクルで飼育した。幼虫は、蒸留水を入れたプラスチックトレイ（20 cm × 18 cm × 7 cm）で飼育し、テトラミン®魚用飼料（Tetra Werke、Melle、ドイツ）を与えた。蛹は30 mlカップ（Nolato Hertila、Åstorp、スウェーデン）に集め、成虫の羽化を促すためにBugdormケージ（30 cm × 30 cm × 30 cm、MegaView Science、台中、台湾）に移した。成虫には、羽化後4日目（dpe）まで10%ショ糖溶液を自由に摂取させた。その後、宿主を探している雌には、実験直前に餌を与えるか、実験前に一晩蒸留水を与えて絶食させた。以下に示します。飛行管実験に使用した雌は、水は自由に摂取できる状態で、4～6 時間だけ絶食させました。吸血蚊をその後のバイオアッセイ用に準備するため、4 dpe 雌に膜給餌システム (Hemotek Discovery Workshops、Accrington、英国) を使用して脱線維化ヒツジ血液 (Håtunalab、Bro、SE) を与えました。その後、完全に充血した雌を個別のケージに移し、以下で説明するように直接餌を与えるか、または以下で説明する実験の 3 日前に 10% スクロースを自由に摂取させました。後者の雌は飛行管バイオアッセイに使用され、研究室に移送され、その後、実験の 4～6 時間前に蒸留水を自由に摂取させました。
摂食アッセイを使用して、成虫の An.Arab 雌の尿と尿素の摂取量を定量しました。宿主を探している雌と吸血した雌に、1% 希釈した新鮮な牛尿と熟成牛尿、さまざまな濃度の尿素、および 2 つのコントロール (10% ショ糖と水) を含む餌を 48 時間与えました。さらに、食品着色料 (1 mg ml-1 キシレンシアニド FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich、ストックホルム、SE) を餌に添加し、250 µl マイクロ遠心チューブ (Axygen Scientific、ユニオンシティ、CA、US; 図 1A) の 4 × 4 マトリックスで供給しました。端まで (~300 µl) 満たします。蚊間の競合と染料色の潜在的な影響を避けるため、10 匹の蚊を大きなペトリ皿 (直径 12 cm、高さ 6 cm; Semadeni、Ostermundigen、 CH（図1A）を、25±2cm℃、相対湿度65±5％の完全な暗闇の中で飼育した。これらの実験は5～10回繰り返された。餌に曝露された蚊は、その後の分析まで-20℃に置かれた。
宿主および吸血雌アノフェレス・アラビアヌスが吸収したウシ尿と尿素を探します。摂食試験（A）では、雌蚊に新鮮なウシ尿と熟成ウシ尿、様々な濃度の尿素、ショ糖（10%）、蒸留水（H2O）からなる餌を与えました。宿主探索（B）および吸血（C）雌は、試験した他のどの餌よりも多くのショ糖を吸収しました。宿主探索雌は、168時間ウシ尿（B）よりも72時間ウシ尿を少なく吸収したことに注意してください。尿の平均総窒素含有量（±標準偏差）は挿入図に示されています。宿主探索（D、F）および吸血（E、G）雌は、用量依存的に尿素を摂取します。異なる文字名を持つ平均吸入量（D、E）は互いに有意に異なっていました（Tukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析、p < 0.05)。誤差範囲は平均の標準誤差(BE)を表します。破線の直線は対数線形回帰直線(F、G)を表します。
吸収された食物を放出するために、蚊を1匹ずつ230 µlの蒸留水が入った1.5 mlマイクロ遠心チューブに入れ、使い捨ての乳棒とコードレスモーター（VWR International、ルンド、スウェーデン）を用いて組織を破砕し、10 krpmで10分間遠心分離した。上清（200 µl）を96ウェルマイクロプレート（Sigma-Aldrich）に移し、分光光度計ベースのマイクロプレートリーダー（SPECTROStar® Nano、BMG Labtech、オルテンベルク、ドイツ）を用いて吸光度（λ620 nm）を測定した。あるいは、蚊を1 mlの蒸留水中で粉砕し、そのうち900 µlを分光光度分析用のキュベットに移した（λ 620 nm; UV 1800、島津製作所、キスタ、スウェーデン）。食事摂取量を定量するために、連続的に標準曲線を作成した。希釈して、1 mg ml-1 キシレンシアニドを 0.2 µl ～ 2.4 µl 生成した。次に、既知の色素濃度の吸光度を使用して、各蚊が摂取した食物の量を決定した。
体積データは、一元配置分散分析（ANOVA）とそれに続くTukeyの事後ペアワイズ比較を用いて分析した（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.、Cary、NC、US、1989～2007）。線形回帰分析により、濃度依存的な尿素摂取量が記述され、宿主探索蚊と吸血蚊の反応が比較された（GraphPad Prism v8.0.0 for Mac、GraphPad Software、San Diego、CA、US）。
各年齢群から約 20 µl の尿サンプルを Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 メッシュ、Sigma Aldrich) に結合させ、錫カプセル (8 mm × 5 mm) に封入した。カプセルを CHNS/O 分析装置 (Flash 2000、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、US) の燃焼室に挿入し、製造元のプロトコルに従って新鮮な尿と熟成尿の窒素含有量を測定した。総窒素 (g N l-1) は、標準として使用される既知の尿素濃度に基づいて定量した。
宿主探索と吸血を行う雌蚊の生存に対する食餌の影響を評価するため、蚊を1匹ずつ、蓋にメッシュで覆われた穴（直径3cm）のある大型ペトリ皿（直径12cm、高さ6cm、Semadeni社製）に入れ、換気と餌の供給を行った。食餌は4日後から与え、1%希釈した新鮮な牛尿と熟成牛尿、4種類の濃度の尿素、および2種類の対照（10%スクロースと水）を含めた。各食餌は、5mlシリンジ（Thermo Fisher Scientific社、ヨーテボリ、スウェーデン）に挿入した歯科用タンポン（DAB Dental AB社、ウップランズ・ヴェスビー、スウェーデン）にピペットで注入し、プランジャーを取り外してペトリ皿の上に置いた（図1）。1A）。毎日食餌を変えてください。実験室は上記のように維持してください。生存している蚊は1日2回数え、死んだ蚊は最後の1日10日まで捨てました。蚊は死亡しました（処理ごとに n = 40）。さまざまな餌を与えられた蚊の生存率は、カプラン・マイヤー生存曲線とログランク検定を使用して統計的に分析され、餌間の生存分布の比較が行われました（IBM SPSS Statistics 24.0.0.0）。
Attisano ら [17] に基づいて作られたカスタムの蚊の飛翔ミル。厚さ 5 mm の透明アクリルパネル (幅 10 cm x 長さ 10 cm x 高さ 10 cm) でできており、前面と背面のパネルはありません (図 3: 上)。ガスクロマトグラフィーカラム (内径 0.25 mm、長さ 7.5 cm) で作られた垂直チューブを備えたピボットアセンブリがあり、両端は 9 cm 離れた一対のネオジム磁石の間に吊り下げられた昆虫針に接着されています。同じ材料で作られた水平チューブ (長さ 6.5 cm) が垂直チューブを二等分し、テザーアームと、光を遮断する信号として小さなアルミホイル片を運ぶアームを形成します。
24時間絶食させた雌に、拘束前に上記の餌を30分間与えた。十分に餌を与えられた雌の蚊を、氷上で2～3分間個別に麻酔し、蜜蝋（Joel Svenssons Vaxfabrik AB、Munka Ljungby、SE）で昆虫ピンに取り付け、水平チューブのアームに結び付けた。飛行ミル。飛行ごとの回転数は、カスタムメイドのデータロガーで記録し、PC-Lab 2000™ソフトウェア（v4.01、Velleman、Gavere、BE）を使用して保存および表示した。飛行ミルは、温度制御された部屋（12時間：12時間、明：暗、25±2℃、65±5%RH）に設置した。
飛行活動のパターンを視覚化するために、24 時間にわたって 1 時間あたりに飛行した総距離 (m) と連続飛行活動の総数が計算されました。さらに、個々の雌が飛行した平均距離が処理間で比較され、一元配置分散分析と Tukey の事後検定 (JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.) を使用して分析されました。この分析では、平均距離が従属変数、処理が独立変数とみなされました。また、平均ラウンド数は 10 分単位で計算されます。
An.arabiensis の繁殖成績に対する食餌の影響を評価するため、採血後、雌 6 匹 (4 日齢) を直接 Bugdorm ケージ (30 cm × 30 cm × 30 cm) に移し、上記のように 48 時間実験食を与えた。その後、食餌を取り除き、3 日目に蒸留水 20 ml を入れた産卵カップ (30 ml; Nolato Hertila) を 48 時間与え、24 時間ごとに交換した。各食餌レジメンを 20 ～ 50 回繰り返した。各実験ケージの卵を数えて記録した。卵のサブサンプルを使用して、ライカ カメラ (DFC) 320 R2 を搭載した Dialux-20 顕微鏡 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar、ドイツ、ヴェッツラー) を使用して、個々の卵の平均サイズと長さの変動 (食餌ごとに n ≥ 200) を評価した。 Leica Microsystems Ltd., DE)。残りの卵は、標準的な飼育条件下で24時間、温度管理された部屋で保管し、最近羽化した1齢幼虫のサブサンプル（各飼料につきn ≥ 200）を上記のように測定した。卵の数、卵と幼虫のサイズは、処理間で一元配置分散分析とTukeyの事後検定（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）を使用して比較した。
ゼブ牛、アルシ種から採取したサンプルから、新鮮な（サンプリング後 1 時間）、24 時間、72 時間、168 時間熟成させた尿のヘッドスペース揮発性物質を採取した。便宜上、尿サンプルは牛がまだ牛舎にいる早朝に採取した。尿サンプルは 10 頭から採取し、各サンプルの 100 ～ 200 ml を個別のポリアミド製ベーキングバッグ (Toppits Cofresco、Frischhalteprodukte GmbH and Co.、Minden、DE) に移し、蓋付きの 3 l ポリアミド製プラスチックドラムに入れた。各牛の尿サンプルからのヘッドスペース揮発性物質は、直接 (新鮮な) または室温で 24 時間、72 時間、168 時間熟成させた後に採取した。つまり、各尿サンプルは各年齢グループを代表するものであった。
ヘッドスペース揮発性物質の採取には、閉ループシステムを使用し、活性炭フィルターを通したガス流（100 ml min-1）をポリアミドバッグを通して吸着カラムに2.5時間循環させた。この際、ダイヤフラム真空ポンプ（KNF Neuberger、フライブルク、ドイツ）を使用した。対照として、空のポリアミドバッグからヘッドスペースを採取した。吸着カラムは、ガラスウールプラグの間に35 mgのPorapak Q（50/80メッシュ、Waters Associates、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国）を充填したテフロンチューブ（5.5 cm x 3 mm 内径）で作製した。使用前に、カラムを再蒸留したn-ヘキサン（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）1 mlとペンタン（純度99.0%のGCグレード溶媒、Sigma Aldrich）1 mlで洗浄した。吸着した揮発性物質はペンタン400 μlで溶出した。ヘッドスペースの採取物をプールし、さらなる分析に使用するまで-20℃で保存してください。
宿主探索および吸血行動を示す An.Arabidopsis 蚊の揮発性抽出物について、新鮮な尿、24 時間、72 時間、および 168 時間経過した尿から採取したヘッドスペース揮発性抽出物を、ストレートガラス管嗅覚計 [18] を使用してシロイヌナズナ蚊の揮発性抽出物について分析した。実験は、An の帰巣活動のピーク期間である ZT 13-15 の間に行われた。ガラス管嗅覚計 (80 cm × 9.5 cm id) を上から 3 ± 1 lx の赤色光で照らした。活性炭フィルターでろ過され加湿された空気の流れ (25 ± 2 °C、相対湿度 65 ± 2%) が 30 cm s-1 でバイオアッセイを通過した。空気は一連のステンレス鋼メッシュスクリーンを通過し、層流と均一なプルーム構造が生成される。歯科用タンポンディスペンサー (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB)を嗅覚計の風上端にある5cmのコイルから吊り下げ、刺激物質を5分ごとに交換した。分析には、各ヘッドスペース抽出液10μlを1:10に希釈したものを刺激物質として使用した。同量のペンタンを対照として使用した。宿主探索性または吸血性の蚊を、実験開始の2～3時間前に個別の放出ケージに入れた。放出ケージは嗅覚計の風下側に設置し、蚊を1分間順応させた後、ケージのバタフライバルブを開けて放出した。処理または対照への誘引は、放出後5分以内に発生源に接触した蚊の割合として分析した。各ヘッドスペース揮発性抽出液と対照は少なくとも30回繰り返し、特定の日の影響を避けるため、各実験で同じ数の処理と対照をテストした。日。宿主と吸血した個体からの反応を探します。アラビア語とヘッドスペースセットは、名義ロジスティック回帰を使用して分析され、その後、オッズ比のペアワイズ比較が行われました（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。
アンの産卵反応。新鮮な牛尿と熟成させた牛尿のヘッドスペース抽出物をBugdormケージ（30 cm × 30 cm × 30 cm、MegaView Science社製）で分析した。20 mLの蒸留水を入れたプラスチックカップ（30 mL、Nolato Hertila社製）を産卵基質とし、ケージの対角の隅に24 cm離して配置した。処理カップには、各ヘッドスペース抽出物を1:10に希釈した10 μlを添加した。対照カップには同量のペンタンを添加した。位置の影響を制御するため、各実験で処理カップと対照カップを交換した。吸血した雌10匹をZT 9-11に実験ケージに放し、24時間後にカップ内の卵を数えた。産卵指数を計算する式は、（処理カップに産み落とされた卵の数 - 対照カップに産み落とされた卵の数）/（総産卵数）である。各処理は8回繰り返した。回。
雌のAn.arabiensisのガスクロマトグラフィーおよび電子アンテナパターン検出（GC-EAD）分析は、以前に記載された方法[20]に従って実施した。簡単に説明すると、新鮮なヘッドスペース揮発性抽出物を、HP-5カラム（30 m × 0.25 mm id、0.25 μm 膜厚、Agilent Technologies製）を備えたAgilent Technologies 6890 GC（米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して分離した。および老化尿。移動相として水素を使用し、平均線流速は45 cm s-1とした。各サンプル（2 μl）を、入口温度225 °Cでスプリットレスモードで30秒間注入した。GCオーブン温度は、35 °C（3分間保持）から300 °C（10分間保持）まで10 °C min-1の速度でプログラムした。GC流出液スプリッターでは、4 psiの窒素を添加し、フレームイオン化検出器とEADの間でGerstel 3D/2低デッドボリュームクロス（Gerstel、Mülheim、DE）で1:1に分割した。EAD用のGC流出液キャピラリーは、GCオーブン温度に5 °Cを加えた温度を追跡するGerstel ODP-2トランスファーラインを介してガラス管（10 cm × 8 mm）に送られ、そこでカーボンフィルターでろ過された加湿空気と混合された。 （1.5 l min−1）。アンテナはチューブの出口から0.5 cmの位置に設置した。蚊1匹につき1回の反復実験を行い、宿主を探している蚊については、各年齢の尿サンプルについて少なくとも3回の反復実験を行った。
新鮮および熟成ウシ尿のヘッドスペース試料中の生物活性化合物の同定には、GC-MS（6890 GCおよび5975 MS、Agilent Technologies社製）を組み合わせ、GC-EAD分析で触角応答を誘発し、70 eVの電子衝撃イオン化モードで動作させた。GCには、HP-5MS UIコーティング溶融シリカキャピラリーカラム（60 m × 0.25 mm内径、0.25 μm膜厚）を装備し、移動相としてヘリウムを用い、平均線流量は35 cm s-1とした。2 μlの試料を、GC-EAD分析と同じインジェクター設定およびオーブン温度で注入した。化合物は、保持時間（Kovát指数）および質量スペクトルをカスタムライブラリおよびNIST14ライブラリ（Agilent社製）と比較することにより同定した。同定された化合物は、標準物質を注入することにより確認した（追加ファイル1：表）。 S2)定量には、外部標準として酢酸ヘプチル（10 ng、化学純度99.8%、Aldrich）を注入した。
新鮮および熟成尿で同定された生物活性化合物からなる合成臭気混合物の、宿主探索および吸血性Ans.arabiensisを誘引する効果を、上記と同じ嗅覚計およびプロトコルを用いて評価した。合成混合物は、新鮮、24時間、48時間、72時間、および168時間熟成尿の混合ヘッドスペース揮発性抽出物中の化合物の組成と比率を模倣した（図5D-G、補足ファイル1：表S2）。分析には、宿主および吸血性蚊に対する誘引性を評価するために、総放出速度が約140～2400 ng h-1の範囲である完全合成混合物の1:100希釈液10 μlを使用した。その後、完全混合物から単一化合物の減算混合物を除去した完全混合物で試験を行った。宿主および吸血したAns.Arabに対する探索反応と合成混合物および減算混合物に対する反応を比較した。名義ロジスティック回帰分析を行い、オッズ比のペアワイズ比較を行った（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。
牛の尿がマラリア蚊の宿主生息地の手がかりとして機能するかどうかを評価するため、上記のように採取した新鮮な牛の尿と熟成させた牛の尿、および水を、網目の付いた3リットルのバケツ（100ml）に入れ、宿主誘引トラップに設置した。 （BG-HDT バージョン、BioGents、レーゲンスブルク、ドイツ）。牧草地に 50 m 間隔で 10 個のトラップを設置し、村落集落から 400 m 離れた場所（エチオピア、シライ、北緯 5°53´24´´、東経 37°29´24´´）に、恒久的な繁殖地と村落に牛を置かずに設置した。5 つのトラップは、宿主の存在をシミュレートするために加熱し、残りの 5 つのトラップは加熱しなかった。各処理場所は、合計 5 晩にわたって毎晩ローテーションした。異なる年齢の尿を餌にしたトラップで捕獲された蚊の数は、ベータ二項分布を使用したロジスティック回帰を使用して比較した（JMP Pro、v14.0.0、SAS Institute Inc.）。
エチオピア、オロミア州のマキの町の近くにあるマラリア流行村（北緯8° 11′ 08″、東経38° 81′ 70″、図6A）で、調査は8月中旬から9月中旬にかけて、毎年恒例の屋内残留噴霧と長い雨季の前に実施されました。村の郊外にある5組の家（20～50m離れている）が調査対象として選ばれました（図6A）。家を選ぶ基準は、家の中に動物を飼うことが許されていないこと、屋内での調理（薪や炭を使うこと）が許されていないこと（少なくとも試験期間中）、そして最大2人の居住者がいて、殺虫剤を使用していない家で寝ていることでした。処理済みの蚊帳の下で。倫理的承認は、世界医師会ヘルシンキ宣言で定められたガイドラインに従って、アディスアベバ大学自然科学部（CNS-IRB）の機関研究倫理審査委員会（IRB/022/2016）によって付与されました。各世帯主からの同意は、保健普及員の協力を得て取得されました。プロセス全体は、地区および区（「ケベレ」）レベルの地方行政によって承認されています。実験設計は、2 × 2 ラテン方格設計に従い、合成混合物と対照が最初の夜にペアの家に割り当てられ、次の実験の夜に家の間で交換されました。このプロセスは 10 回繰り返されました。さらに、選択された家での蚊の活動を推定するために、CDC トラップは、フィールド試験の開始、中間、終了時に、同じ時間帯に 5 夜連続で稼働するように設定されました。
6種類の生物活性化合物を含む合成混合物をヘプタン（97.0%溶媒GCグレード、Sigma Aldrich）に溶解し、綿芯ディスペンサー[20]を用いて140 ng h-1の速度で放出した。この芯ディスペンサーにより、12時間の実験を通して全ての化合物が一定の比率で放出された。ヘプタンは対照として使用した。バイアルは、米国疾病予防管理センター（CDC）ライトトラップ（John W. Hock Company、ゲインズビル、フロリダ州、米国、図6A）の入口付近に吊り下げた。トラップはベッドの足元近くの地面から0.8～1mの高さに吊り下げ、ボランティアは未処理の蚊帳の下で寝て、18:00から06:30の間に操作を行った。性別と生理的状態（未吸血、吸血、妊娠初期、妊娠[21]）で捕獲された蚊は、形態学的に同定された種を特定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を用いてスクリーニングされた。 A. gambiae sl. 複合種のメンバー [23]。野外調査では、ペアになった家屋のトラップ捕獲を名義ロジスティック適合モデルを使用して分析しました。このモデルでは、誘引が従属変数で、処理（合成混合物 vs 対照）が固定効果でした（JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.）。ここでは、尤度比検定からの χ2 値と p 値を報告します。
安全性を評価します。arabiensis は、投与後 4 日 (dpe) の宿主探索雌と吸血雌の摂食試験 (図 1A) で、投与後 48 時間以内に直接摂食により、主な窒素源である尿素である尿を得ることができました。宿主探索雌と吸血雌の両方が、他のどの餌や水よりも有意に多くのショ糖を吸収しました (それぞれ F(5,426) = 20.15、p < 0.0001 および F(5,299) = 56.00、p < 0.0001、図 1B、C)。さらに、宿主探索雌は、168 時間後の尿と比較して、72 時間後の尿の摂取量が少なかった (図 1B)。尿素を含む餌を与えられた場合、宿主探索雌は、他のすべての濃度および水と比較して、2.69 mM の尿素を有意に多く吸収しました。尿素を含む食事からの摂取量は、10% スクロースと区別がつかない (F(10,813) = 15.72、p < 0.0001、図 1D)。これは、通常、水よりも尿素を含む食事の吸収量が有意に多いものの、10% スクロースよりは有意に少ない (F(10,557) = 78.35、p < 0.0001、図 1)。1E)。さらに、2 つの生理状態を比較すると、採血された雌は、最低濃度では宿主を探している雌よりも多くの尿素を吸収し、これらの雌は、高濃度では同様の量の尿素を吸収した (F(1,953)= 78.82、p < 0.0001、図 1F、G)。尿素を含む食事からの摂取量は最適値であるように見えたが (図 1 1D、E）両方の生理状態の雌は、尿素濃度の全範囲にわたって吸収される尿素の量を対数線形的に調節することができた（図1F、G）。同様に、蚊は吸収される尿の量を調節することによって窒素の摂取を制御しているようで、尿中の窒素の量は吸収される量に反映される（図1B、CおよびBの挿入図）。
宿主探索蚊と吸血蚊の生存に対する尿と尿素の影響を評価するために、雌に4つの年齢（新鮮、排泄後24時間、72時間、168時間）の尿とさまざまな濃度の尿素を与え、対照として蒸留水と10％スクロースを与えた（図2A）。この生存分析により、食事は宿主探索雌（尿：χ2 = 108.5、df = 5、p < 0.0001、尿素：χ2 = 122.8、df = 5、p < 0.0001、図2B、C）と吸血雌（尿：χ2 = 93.0、df = 5、p < 0.0001、尿素：χ2 = 137.9、 df = 5、p < 0.0001; 図2D、E）。すべての実験において、尿、尿素、および水を与えられた雌は、ショ糖を与えられた雌と比較して生存率が有意に低かった（図2B-E）。新鮮な尿と古い尿を与えられた宿主探索雌は異なる生存率を示し、72時間古い尿を与えられた雌（p = 0.016）が最も生存確率が低かった（図2B）。さらに、135 mM尿素を与えられた宿主探索雌は、水対照群よりも長く生存した（p < 0.04）（図2C）。水と比較して、新鮮な尿と24時間尿を与えられた雌はより長く生存した（それぞれp = 0.001とp = 0.012; 図2D）が、72時間尿を与えられた雌は、新鮮な尿と24時間古い尿を与えられた雌よりも長く生存した。尿（それぞれp < 0.0001およびp = 0.013、図2D）。135 mMの尿素を与えた場合、血液を与えられた雌は、他のすべての濃度の尿素および水よりも長く生存した（p < 0.013、図2E）。
牛の尿と尿素を餌とした宿主および吸血雌アノフェレス・アラビニスの生存率。バイオアッセイ（A）では、雌蚊に新鮮な牛の尿と熟成させた牛の尿、様々な濃度の尿素、ショ糖（10%）、蒸留水（H2O）からなる餌を与えた。宿主探索（B、C）および吸血（D、E）蚊の生存率を12時間ごとに記録し、尿（B、D）と尿素（C、E）を餌とした雌、および対照群であるショ糖と水を餌とした雌がすべて死亡するまで続けた。
24 時間にわたる飛行ミル試験で決定された総距離とラウンド数は、宿主を探す蚊と吸血蚊で異なり、後者は全体的に飛行活動が少なかった（図 3）。新鮮な尿と熟成尿、またはショ糖と水を与えた宿主を探す蚊は、明確な飛行パターンを示した（図 3）。新鮮な尿を摂取した雌は夜明けに活動的であったが、24 時間および 168 時間熟成尿を摂取した雌は、異なる飛行パターンを示し、主に昼行性であった。ショ糖または 72 時間尿を与えた雌の蚊は 24 時間を通して活動を示したが、水を与えた雌は中間期に活動的であった。ショ糖を摂取した蚊は深夜と早朝に最も高いレベルの活動を示したが、72 時間熟成尿を摂取した蚊は 24 時間にわたって活動が着実に減少した（図 3）。
牛の尿と尿素を餌とする、ハンターを狙う吸血性雌アノフェレス・アラビニスの飛行性能。フライトミル試験では、新鮮な牛の尿、熟成させた牛の尿、様々な濃度の尿素、ショ糖（10%）、蒸留水（H2O）を餌とする雌蚊を、水平に自由に回転するアーム（上図）に繋いだ。宿主を探す雌（左）と吸血する雌（右）について、24時間における各餌の総飛行距離と1時間あたりの飛行回数を記録した（濃い色：灰色、薄い色：白）。平均飛行距離と平均飛行回数は、概日活動グラフの右側に示されている。エラーバーは平均の標準誤差を表す。統計解析については本文を参照。
一般的に、宿主を探す雌の飛行活動は、24時間における飛行距離と同様のパターンを示した。平均飛行距離は摂取した餌によって有意に影響を受け（F(5, 138) = 28.27、p < 0.0001）、72時間尿を摂取した宿主を探す雌は、他のすべての餌と比較して有意に長い距離を飛行した（p < 0.0001）。また、ショ糖を摂取した蚊は、新鮮な尿（p = 0.022）および24時間経過した尿（p = 0.022）を摂取した蚊よりも長く飛行した。尿を餌とした場合の飛行活動パターンとは対照的に、尿素を摂取した宿主を探す雌は、24時間にわたって持続的な飛行活動を示し、暗期の後半にピークを迎えた（図3）。活動パターンは類似していたものの、尿素を摂取した宿主を探す雌は平均飛行距離を有意に増加させた。吸収された濃度に応じて距離が変化（F(5, 138) = 1310.91、p < 0.0001）。尿素を任意の濃度で摂取した宿主探索中の雌は、水またはショ糖を摂取した雌よりも長く飛んだ（p < 0.03）。
吸血蚊の全体的な飛行活動は、すべての餌において 24 時間にわたって安定して持続し、水を与えられた雌と新鮮な 24 時間齢の雌の両方で暗期の後半に尿活動が増加しました (図 3)。尿食は吸血雌の平均飛行距離に有意な影響を与えましたが (F(5, 138) = 4.83、p = 0.0004)、尿素食は影響を与えませんでした (F(5, 138) = 1.36、p = 0.24)。他の尿および対照食 (新鮮、p = 0.0091; 72 時間、p = 0.0022; 168 時間、p = 0.001; スクロース、p = 0.0017; dH2O、p = 0.036) と比較。
尿と尿素の摂取が生殖パラメータに及ぼす影響は、産卵バイオアッセイ（図4A）で評価され、雌1匹あたりの産卵数、卵の大きさ、孵化したばかりの1齢幼虫に基づいて調査された。産卵数は、尿を摂取したアラブの雌によって異なり（F(5,222) = 4.38、p = 0.0008、図4B）、24時間尿と血液を摂取した雌は、他の尿食を摂取した雌よりも有意に多くの卵を産み、ショ糖を摂取した雌と同程度であった（図4B）。同様に、尿を摂取した雌が産んだ卵の大きさも、食事によって異なり（F(5, 209) = 12.85、p < 0.0001）、24時間尿とショ糖を摂取した雌は、水を摂取した雌よりも有意に大きな卵を産んだが、 168 時間尿を与えた雌が産んだ卵から孵化した幼虫は、有意に小さかった（図 4C）。さらに、尿食は幼虫の大きさに有意な影響を与え（F(5, 187) = 7.86、p < 0.0001）、24 時間および 72 時間尿を与えた雌が産んだ卵から孵化した幼虫は、水を与えた雌と 168 時間尿を与えた雌が産んだ卵から孵化した幼虫よりも有意に大きかった（図 4D）。
牛尿と尿素を餌とした雌アノフェレス・アラビニスの繁殖成績。吸血した雌蚊に、新鮮な牛尿と熟成させた牛尿、様々な濃度の尿素、ショ糖（10%）、蒸留水（H2O）からなる餌を48時間与え、その後バイオアッセイを行い、産卵基質を得た（48時間後（A））。卵数（B、E）、卵の大きさ（C、F）、幼虫の大きさ（D、G）は、与えられた餌（牛尿：BD、尿素：EG）によって有意に影響を受けた。異なる文字名で測定された各パラメーターの平均値は、互いに有意に異なっていた（Tukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析、p < 0.05）。エラーバーは平均の標準誤差を表す。
尿の主要な窒素成分である尿素を、血液を摂取した雌に餌として与えたところ、すべての研究で生殖パラメータに有意な影響が見られた。血液摂取後に尿素を与えられた雌が産んだ卵の数は、尿素濃度によって異なり（F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001）、134 µM～1.34 mMの尿素濃度を与えられた雌はより多くの卵を産んだ（図4E）。134 µM以上の尿素濃度を与えられた雌は、水を与えられた雌よりも大きな卵を産み（F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; 図4F）、幼虫の大きさは、母親の尿素濃度が同程度であったにもかかわらず（F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001）、よりばらつきが大きかった（図4G）。
吸血蚊の尿ヘッドスペース揮発性抽出物に対する全体的な誘引性は、ガラス管嗅覚計（図5A）で評価したところ、尿の経過時間によって有意に影響を受けていました（χ2 = 15.9、df = 4、p = 0.0032、図5B）。事後分析では、24時間経過した古い尿の臭いは、他のすべての処理（72時間：p = 0.0060、168時間：p = 0.012、ペンタン：p = 0.00070）と比較して、有意に高い誘引性を引き起こしていることが示されました。ただし、新鮮な尿の臭いは例外でした（p = 0.13、図5B）。吸血蚊の尿の臭いに対する全体的な誘引性は有意差がありませんでしたが（χ2 = 8.78、df = 4、p = 0.067、図5C）、これらの雌は有意に高いことが分かりました。対照群と比較した72時間経過した尿と比較して、ヘッドスペース揮発性抽出物に対する魅力が高かった（p = 0.0066、図5C）。
宿主および吸血したアノフェレス・アラビアヌスを探す際の、天然および合成の牛尿臭に対する行動反応。ガラス管嗅覚計の概略図（A）。新鮮な牛尿および熟成牛尿のヘッドスペース揮発性抽出物の宿主（B）および吸血（C）蚊への誘引。アノフェレス・アラビアヌスの触手反応を探せ。新鮮な（D）、24時間（E）、72時間（F）、および168時間（G）熟成牛尿から分離されたヘッドスペース抽出物を示す。電子アンテナ検出（EAD）トレースは、ガスクロマトグラフから溶出され、フレームイオン化検出器（FID）によって検出されたヘッドスペース中の生物活性化合物に対する電圧変化を示す。スケールバーは、応答振幅（mV）対保持時間（s）を表す。生物活性化合物の特性と放出速度（µg h-1）を示す。単一のアスタリスク（*）は、一貫した低振幅応答を示す。アスタリスク（**）は再現性のない反応を示します。宿主（H）と吸血蚊（I）を見つけてください。An.arabiensisは、新鮮な牛尿と熟成した牛尿の合成混合物に対して異なる魅力を示します。異なる文字名に誘引された蚊の平均割合は、互いに有意に異なっていました（Tukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析、p < 0.05）。エラーバーはスケールの標準誤差を表します。
雌のAnn.arabiensisは、吸血後72時間および120時間、産卵期において、新鮮な牛尿および熟成牛尿のヘッドスペース揮発性抽出物に対して、ペンタン対照と比較して選好性を示さなかった（χ2 = 3.07、p > 0.05；追加ファイル1：図S1）。
雌のAnn.arabiensisについては、GC-EADおよびGC-MS分析により、8、6、3、3の生物活性化合物が同定された（図5D-G）。電気生理学的反応を引き起こす化合物の数に違いが見られたものの、これらの化合物のほとんどは、新鮮な尿と熟成した尿から採取した各ヘッドスペース揮発性抽出物に存在していた。したがって、各抽出物について、閾値を超える雌の触角からの生理学的反応を引き起こした化合物のみが、その後の分析に含まれた。
ヘッドスペース収集における生物活性化合物の総揮発性放出速度は、新鮮な尿の 29 µg h-1 から 168 時間経過した尿の 242 µg h-1 に増加したが、これは主に p-クレゾールと m-ホルムアルデヒドの増加によるものである。フェノールの増加も同様である。対照的に、2-シクロヘキセン-1-オンやデカナールなどの他の化合物の放出速度は、尿の経過時間の増加とともに減少し、これはクロマトグラム (図 5D)-G 左パネル) で観察されたシグナル強度 (存在量) の減少、およびこれらの化合物に対する生理学的反応 (図 5D-G 右パネル) と相関していた。
全体として、合成混合物は、新鮮な尿と熟成した尿のヘッドスペースの揮発性抽出物で同定された生物活性化合物の天然比率と類似しており（図 5D–G）、宿主（χ2 = 8.15、df = 4、p = 0.083、図 5H）または吸血蚊（χ2 = 4.91、df = 4、p = 0.30、図 5I）の探索において有意な魅力を引き出すようには見えなかった。しかし、処理間の事後ペアワイズ比較では、宿主を探している蚊は、ペンタン対照と比較して、24 時間熟成させた尿の合成混合物に対して有意に魅力的であることが示された（p = 0.0086、図 5H）。
24時間経過した尿の合成混合物における個々の成分の役割を評価するために、6つの減算混合物を、個々の化合物を除去した完全な混合物と比較して、Yチューブアッセイで評価した。宿主を探す蚊の場合、完全な混合物から個々の化合物を除去すると、行動反応に有意な影響があった（χ2 = 19.63、df = 6、p = 0.0032、補足ファイル1：図S2A）。すべての減算混合物は、完全に混合されたものよりも魅力的であった。対照的に、完全に合成された混合物から個々の化合物を除去しても、吸血蚊の行動反応には影響がなかった（χ2 = 11.38、df = 6、p = 0.077）。ただし、デカナールは例外で、完全な混合物と比較して誘引レベルが低かった（p = 0.022、補足ファイル1：図S2B）。
エチオピアのマラリア流行村で、24時間牛尿の合成混合物の野外条件下での蚊の誘引効果を10夜にわたって評価した（図6A）。合計4,861匹の蚊が捕獲され、同定された。そのうち45.7%がAnthropus.gambiae sl、18.9%がAnopheles pharoensis、35.4%がCulex spp.であった（補足資料1：表S1）。PCR分析により同定されたAn.Gambian種複合体のメンバーはAnopheles arabinisのみであった。平均して1晩あたり320匹の蚊が捕獲され、その間、合成混合物の餌を入れたトラップは、混合物を入れていないトラップよりも多くの蚊を捕獲した（χ2(0, 3196) = 170.0、p < 0.0001）。餌なしのトラップは試験の開始時、中間、終了時の 5 回の対照夜それぞれで同様の数の蚊が捕獲され、家屋間の偏りはなく (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13、p > 0.05)、研究期間中に個体数の減少もなかったことが示されました。対照トラップと比較して、合成混合物を含むトラップで捕獲された蚊の数は有意に増加しました: 宿主探索 (χ2(0, 2107) = 138.7、p < 0.0001)、最近吸血 (χ2(0, 650) = 32.2、p < 0.0001)、および妊娠 (χ2(0, 228) = 6.27、p = 0.0123; 追加ファイル 1: 表 S1)。これは、捕獲された蚊の総数にも反映されています: 宿主探索 > 吸血 > 妊娠 >妊娠初期 > 男性。
24 時間持続する合成牛尿臭混合物の有効性の現地評価。現地試験は、エチオピア中南部（地図）、マキの町（挿入図）付近で、疾病管理予防センター（CDC）ライトトラップ（右）をペアの家屋に設置し、ラテン方格設計（航空写真）（A）で実施した。合成臭気を餌としたCDCフォトトラップは、メスのアノフェレス・アラベスク（B）を誘引して捕獲するが、アノフェレス・ファロエス（C）は誘引しない。これは生理的状態に依存する効果である。さらに、これらのトラップは、宿主であるイエカの捕獲数を大幅に増加させた。（D）対照と比較。左側の棒グラフは、臭気餌（緑）と対照（白）のトラップのペアで捕獲された蚊の平均選択指数（N = 10）を表し、右側の棒グラフは、対照トラップ（白、N = 5）のペアで捕獲された蚊の平均選択指数を表す。アスタリスクは統計的有意水準を示します（*p = 0.01、***p < 0.0001）。
合成混合物を含むトラップでは、3種の蚊の捕獲状況が異なっていた。合成混合物を放出するトラップでは、宿主を探している（χ2(1, 1345) = 71.7、p < 0.0001）、吸血している（χ2(1, 517) = 16.7、p < 0.0001）、妊娠している（χ2(1, 180) = 6.11、p = 0.0134）a.arabiensisが捕獲された（図6B）が、Anの量に差はなかった。生理状態の異なるPharoensisが見つかった（図6C）。Culexについては、対照トラップと比較して、合成混合物を餌としたトラップで宿主を探している蚊の数に有意な増加が見られた（χ2(1,1319) = 12.6、p = 0.0004、図6D）。
エチオピアの繁殖地と農村地域の間にある潜在的な宿主の外側に設置された宿主誘引トラップを使用して、マラリア蚊が牛の尿の臭いを宿主の生息地の手がかりとして利用しているかどうかを評価した。宿主の手がかりがなく、熱があり、牛の尿の臭いの有無にかかわらず、蚊は捕獲されなかった（追加ファイル 1：図 S3）。しかし、高温と牛の尿の臭いがある場合、雌のマラリア蚊は尿の経過時間に関係なく、少数ではあるが誘引され捕獲された（χ2（5、25）= 2.29、p = 0.13；追加ファイル 1：図 S3）。対照的に、高温では水対照でマラリア蚊は捕獲されなかった（追加ファイル 1：図 S3）。
マラリア蚊は、他の昆虫と同様に、牛の尿（つまり水たまり）を代償的に摂取することで窒素含有化合物を獲得し、分配して生活史特性を高めます[2, 4, 24, 25, 26]。牛の尿は、牛舎や農村の家屋や産卵場所の近くの背の高い植生など、マラリア媒介蚊の休息場所と密接に関連した、容易に入手可能な再生可能な資源です。雌蚊はこの資源を匂いで見つけ、尿中の主要な窒素成分である尿素を含む、尿中の窒素化合物の摂取を調節することができます[15, 16]。雌蚊の生理状態に応じて、尿中の栄養素は、宿主を探している雌蚊の飛行活動と生存、および最初の生殖腺刺激周期中の吸血個体の​​生存と生殖特性を高めるために分配されます。したがって、尿の混合はマラリア媒介蚊にとって重要な栄養的役割を果たします。雌蚊は栄養失調の成人のように口を閉じ、低リスクの摂食を行うことで重要な窒素化合物を獲得する能力を得ます。この発見は疫学的に重大な影響を及ぼします。雌は寿命、活動、繁殖量を増加させ、これらはすべて媒介能力に影響します。さらに、この行動は将来の媒介生物管理プログラムの標的となる可能性があります。