L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano il foraggiamento degli insetti e i tratti della storia della vita. Per compensare le carenze di nutrienti specifici nelle diverse fasi della vita, gli insetti possono ottenere questi nutrienti attraverso l'alimentazione supplementare, ad esempio nutrendosi delle secrezioni dei vertebrati in un processo noto come pozzanghere. La zanzara Anopheles arabiani sembra essere malnutrita e, pertanto, richiede nutrienti sia per il metabolismo che per la riproduzione. Lo scopo di questo studio era valutare se An.arabiensis l'agitazione sull'urina di vacca per l'acquisizione di nutrienti migliora le caratteristiche della storia della vita.
L'arabiensis è stato attratto dall'odore dell'urina di vacca fresca, di 24, 72 e 168 ore, e le femmine in cerca di ospite e nutrite con sangue (48 ore dopo il pasto di sangue) sono state misurate in un olfattometro con tubo a Y e le femmine gravide sono state valutate per il test di deposizione delle uova. i composti attivi sono stati valutati nel tubo a Y e nelle prove sul campo. Per studiare l'urina di mucca e il suo principale composto contenente azoto, l'urea, come potenziali diete supplementari per i vettori della malaria, sono stati misurati i parametri di alimentazione e le caratteristiche della storia della vita. Sono state valutate la proporzione di zanzare femmine e la quantità di urina di mucca e urea assorbita.
Cercare il sangue e il nutrimento dell'ospite. Negli studi di laboratorio e sul campo, gli arabi erano attratti dal profumo naturale e sintetico dell'urina di vacca fresca e invecchiata. Le femmine gravide erano indifferenti alle risposte dell'urina di vacca nei siti di deposizione delle uova.
Anopheles arabinis acquisizione e distribuzione di urina di vacca per migliorare le caratteristiche della storia di vita. L'alimentazione supplementare di urina di vacca influisce direttamente sulla capacità del vettore aumentando la sopravvivenza giornaliera e la densità del vettore e indirettamente alterando l'attività di volo e dovrebbe quindi essere considerata nei modelli futuri.
L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano il foraggiamento degli insetti e le caratteristiche della storia della vita [1,2,3]. Gli insetti sono in grado di selezionare e acquisire cibo ed eseguire un'alimentazione compensativa in base alla disponibilità di cibo e ai requisiti dei nutrienti [1, 3]. La distribuzione dei nutrienti dipende dal processo della storia della vita e può portare a requisiti diversi per la qualità e la quantità della dieta nelle diverse fasi della vita degli insetti [1, 2]. e carogne, un processo noto come pozzanghere [2]. Sebbene sia descritta principalmente una varietà di specie di farfalle e falene, le pozze d'acqua si verificano anche in altri ordini di insetti e l'attrazione e l'alimentazione di questi tipi di risorse può avere effetti significativi sulla salute e su altri tratti della storia della vita [2, 4, 5, 6],7]. caratteristiche della storia della vita, ma questo comportamento è stato finora trascurato. L'uso dell'agitazione come mezzo per aumentare l'assunzione di nutrienti in questo importante veicolo merita attenzione in quanto ciò può avere importanti conseguenze epidemiologiche.
L'assunzione di azoto nelle zanzare Anopheles femmine adulte è limitata a causa delle basse riserve caloriche trasportate dallo stadio larvale e dell'utilizzo inefficiente della farina di sangue [9]. La femmina Ann.gambiae sl tipicamente compensa ciò integrando con pasti di sangue supplementari [10, 11], mettendo così più persone a rischio di contrarre la malattia e mettendo le zanzare a maggior rischio di predazione. da altri insetti [2]. A questo proposito, è interessante la forte e distinta attrazione di una delle specie sorelle all'interno di An. Il complesso di specie sl del Gambia, Anopheles arabinis, urina di vacca fresca e invecchiata [12,13,14], è interessante. Man mano che l'urina di vacca invecchia, i microrganismi utilizzano queste risorse per ridurre la complessità dei composti azotati entro 24 ore [15]. Con il rapido aumento dell'ammoniaca, associato a un declino dell'azoto organico, prosperano i microrganismi alcalofili (molti dei quali producono composti tossici per le zanzare) [15], che possono essere femmine Ann.arabiensis è attratta preferenzialmente dall'urina di età pari o inferiore a 24 ore [13, 14].
In questo studio, sono stati cercati AN dell'ospite e alimentati con il sangue. Durante il suo primo ciclo di gonadotropine, l'arabiensis è stato valutato per l'acquisizione di composti azotati, tra cui l'urea, mediante la miscelazione delle urine. Successivamente, è stata condotta una serie di esperimenti per valutare come le zanzare femmine allocano questa potenziale risorsa nutritiva per migliorare la sopravvivenza, la riproduzione e l'ulteriore foraggiamento. arabiensis ha scoperto correlazioni chimiche dietro l'attrattiva differenziale osservata. Le miscele di odore sintetico di composti organici volatili (COV) identificate nell'urina invecchiata di 24 ore sono state ulteriormente valutate in condizioni di campo, estendendo i risultati ottenuti in condizioni di laboratorio e dimostrando l'effetto dell'odore di urina bovina su diversi stati fisiologici.Attrazione delle zanzare. I risultati ottenuti confermano che An.arabiensis acquisisce e distribuisce composti azotati trovati nelle urine dei vertebrati per influenzare le caratteristiche della storia della vita. Questi risultati sono discussi nel contesto delle potenziali conseguenze epidemiologiche e come possono essere utilizzati per la sorveglianza e il controllo dei vettori.
Anopheles arabicans (ceppo Dongola) sono stati mantenuti a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH e un ciclo luce:buio di 12:12 h. Le larve sono state allevate in vassoi di plastica (20 cm × 18 cm × 7 cm) riempiti con acqua distillata e alimentati con mangime per pesci Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Le pupe sono state raccolte in tazze da 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp , SE) e quindi trasferite in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) per consentire l'emergenza degli adulti. Agli adulti è stata fornita una soluzione di saccarosio al 10% ad libitum fino a 4 giorni dopo l'emergenza (dpe), a quel punto alle femmine in cerca di ospite è stata offerta una dieta immediatamente prima dell'esperimento, oppure sono state fatte morire di fame durante la notte con acqua distillata prima dell'esperimento, come descritto di seguito. per sole 4-6 ore con acqua ad libitum. Per preparare le zanzare succhiasangue per i successivi test biologici, a 4 femmine dpe è stato fornito sangue di montone defibrotico (Håtunalab, Bro, SE) utilizzando un sistema di alimentazione a membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Regno Unito). le femmine sono state utilizzate per i saggi biologici in tubo di volo e trasferite in laboratorio, quindi hanno avuto acqua distillata ad libitum per 4-6 ore prima dell'esperimento.
Sono stati utilizzati saggi di alimentazione per quantificare il consumo di urina e urea nelle femmine adulte An.Arab. Alle femmine in cerca di ospite e alimentate con sangue è stata fornita una dieta contenente l'1% di urina di vacca fresca e invecchiata diluita, varie concentrazioni di urea e due controlli (10% di saccarosio e acqua) per 48 ore. aggiunto alla dieta e fornito in una matrice 4 × 4 in provette per microcentrifuga da 250 microlitri (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figura 1A) Riempire fino al bordo (~ 300 microlitri). °C e 65 ± 5% di umidità relativa. Questi esperimenti sono stati ripetuti da 5 a 10 volte. Dopo l'esposizione alla dieta, le zanzare sono state poste a -20 °C fino a ulteriori analisi.
Cerca l'urina bovina e l'urea assorbita dall'ospite e dalla femmina succhiasangue Anopheles arabianus. Nella prova di alimentazione (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di vacca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O). Urina di vacca di 8 ore (B). Il contenuto medio di azoto totale (± deviazione standard) dell'urina è rappresentato nel riquadro. Le femmine che cercano l'ospite (D, F) e succhiano il sangue (E, G) assorbono l'urea in modo dose-dipendente. I volumi medi inalati (D, E) con nomi di lettere diversi erano significativamente differenti l'uno dall'altro (ANOVA unidirezionale utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p <0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (BE). la linea rappresenta la linea di regressione log-lineare (F, G)
Per rilasciare il cibo assorbito, le zanzare sono state poste individualmente in provette per microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 230 μl di acqua distillata e il tessuto è stato disgregato utilizzando un pestello monouso e un motore senza fili (VWR International, Lund, SE), seguito da centrifugazione a 10 krpm per 10 min. lettore di micropiastre basato su trofotometro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). In alternativa, le zanzare sono state macinate in 1 ml di acqua distillata, 900 µl della quale sono stati trasferiti in una cuvetta per l'analisi spettrofotometrica (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). 4 µl di 1 mg ml-1 cianuro di xilene. Quindi, la densità ottica delle concentrazioni note di colorante è stata utilizzata per determinare la quantità di cibo ingerita da ciascuna zanzara.
I dati del volume sono stati analizzati utilizzando l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) seguita dai confronti a coppie post hoc di Tukey (JMP Pro, V14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US 1989-2007). Analisi di regressione lineare. Software, San Diego, CA, USA).
Circa 20 µl di campioni di urina di ciascun gruppo di età sono stati legati su Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) e incapsulati in capsule di stagno (8 mm × 5 mm). Le capsule sono state inserite nella camera di combustione di un analizzatore CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per determinare il contenuto di azoto nelle urine fresche e invecchiate secondo il protocollo del produttore. Azoto totale (g N l-1) è stato quantificato sulla base delle concentrazioni note di urea utilizzate come standard.
Per valutare l'effetto della dieta sulla sopravvivenza delle femmine che cercano l'ospite e succhiano il sangue, le zanzare sono state poste individualmente in grandi piastre di Petri (12 cm di diametro e 6 cm di altezza; Semadeni) con un foro coperto da una rete nel coperchio (3 cm di diametro) per la ventilazione e l'approvvigionamento di cibo. tampone dentale (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserito in una siringa da 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), lo stantuffo rimosso e posto sopra una capsula di Petri ( figura 1). 1A). Cambia la tua dieta ogni giorno. Mantieni il laboratorio come descritto sopra. è stato analizzato statisticamente utilizzando le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meyer e i test log-rank per confrontare i confronti della distribuzione della sopravvivenza tra le diete (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un mulino volante per zanzare personalizzato basato su Attisano et al.[17], realizzato con pannelli acrilici trasparenti spessi 5 mm (larghezza 10 cm x lunghezza 10 cm x altezza 10 cm) senza pannelli anteriore e posteriore (Fig. 3: in alto). (6,5 cm L) tagliava in due il tubo verticale per formare un braccio legato e un braccio che portava un piccolo pezzo di foglio di alluminio come segnale di interruzione della luce.
Alle femmine affamate per 24 ore è stata somministrata la dieta di cui sopra per 30 minuti prima del contenimento. Le zanzare femmine completamente nutrite sono state quindi anestetizzate individualmente sul ghiaccio per 2-3 minuti e attaccate agli spilli degli insetti con cera d'api (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) e quindi legate ai bracci dei tubi orizzontali. 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Il mulino volante è stato collocato in una stanza a clima regolato (12 h:12 h, luce: buio, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Per visualizzare lo schema dell'attività di volo, sono stati calcolati la distanza totale percorsa (m) e il numero totale di attività di volo consecutive per ora su un periodo di 24 ore. Inoltre, le distanze medie percorse dalle singole donne sono state confrontate tra i trattamenti e analizzate utilizzando l'ANOVA unidirezionale e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), dove la distanza media era considerata una variabile dipendente, mentre il trattamento è un fattore indipendente. Inoltre, il numero medio di giri è calcolato in incrementi di 10 minuti.
Per valutare l'effetto della dieta sulle prestazioni riproduttive di An.arabiensis, sei femmine (4 dpe) sono state trasferite direttamente in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) dopo la raccolta del sangue e quindi hanno fornito la dieta sperimentale per 48 ore come descritto sopra. t ogni regime dietetico 20-50 volte. Le uova sono state contate e registrate per ogni gabbia sperimentale. Sottocampioni di uova sono stati utilizzati per valutare la dimensione media e la variazione di lunghezza delle singole uova (n ≥ 200 per dieta) utilizzando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) dotato di una Leica Camera (DFC) 320 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). Le uova rimanenti sono state conservate in una stanza a clima controllato in condizioni di allevamento standard per 24 ore e un sottocampione di larve di 1° stadio appena emerse (n ≥ 200 per dieta) è stato misurato, come descritto sopra. Il numero di uova e la dimensione delle uova e delle larve sono state confrontate tra i trattamenti e utilizzando l'ANOVA unidirezionale e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I volatili dello spazio di testa da urina fresca (1 ora dopo il campionamento), 24 ore, 72 ore e 168 ore sono stati raccolti da campioni prelevati da bovini Zebù, razze Arsi. Per comodità, i campioni di urina sono stati raccolti al mattino presto mentre le mucche erano ancora nella stalla. ., Minden, DE) in 3 l di poliammide con coperchio In fusti di plastica in cloruro di vinile. I volatili dello spazio di testa di ciascun campione di urina bovina sono stati raccolti direttamente (freschi) o dopo la maturazione a temperatura ambiente per 24 ore, 72 ore e 168 ore, ovvero ogni campione di urina era rappresentativo di ciascun gruppo di età.
Per la raccolta dei volatili nello spazio di testa, è stato utilizzato un sistema a circuito chiuso per far circolare un flusso di gas filtrato con carbone attivo (100 ml min-1) attraverso una sacca di poliammide alla colonna di adsorbimento per 2,5 ore utilizzando una pompa a vuoto a diaframma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Come controllo, la raccolta nello spazio di testa è stata eseguita da una sacca di poliammide vuota. di Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) tra tappi di lana di vetro. Prima dell'uso, la colonna è stata lavata con 1 ml di n-esano ridistillato (Merck, Darmstadt, DE) e 1 ml di pentano (grado GC con solvente puro al 99,0%, Sigma Aldrich). I volatili adsorbiti sono stati eluiti con 400 μl di pentano. -20°C fino all'utilizzo per ulteriori analisi.
Sono state analizzate le risposte comportamentali di An in cerca di ospite e in mangiatore di sangue. Gli estratti volatili dello spazio di testa raccolti da urina fresca, di 24 ore, 72 ore e 168 ore sono stati analizzati per gli estratti volatili delle zanzare Arabidopsis utilizzando un olfattometro con tubo di vetro diritto [18]. Gli esperimenti sono stati condotti durante ZT 13-15, il periodo di picco dell'attività di ricerca di casa di An. × 9,5 cm id) è stato illuminato con 3 ± 1 lx di luce rossa dall'alto. Il flusso d'aria umidificato e filtrato con carbone (25 ± 2 °C, 65 ± 2% di umidità relativa) ha superato il test biologico a 30 cm s-1. all'estremità sopravvento dell'olfattometro, con lo stimolatore che cambia ogni 5 minuti. Per l'analisi, 10 μl di ciascun estratto dello spazio di testa, diluito 1:10, sono stati usati come stimolo. Una quantità uguale di pentano è stata usata come controllo. acclimatarsi per 1 minuto, quindi la valvola a farfalla della gabbia è stata aperta per il rilascio. L'attrazione per il trattamento o il controllo è stata analizzata come la proporzione di zanzare che sono entrate in contatto con la fonte entro 5 minuti dal rilascio. Ogni estratto volatile dello spazio di testa e controllo sono stati replicati almeno 30 volte e, per evitare gli effetti di un giorno, lo stesso numero di trattamenti e controlli è stato testato in ogni giorno sperimentale. saggi confronti per rapporti dispari (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An's spawning response. Estratti dello spazio di testa da urina di vacca fresca e invecchiata sono stati analizzati in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Bicchieri di plastica (30 mL; Nolato Hertila) riempiti con 20 mL di acqua distillata hanno fornito il substrato di deposizione delle uova e sono stati collocati in angoli opposti della gabbia, a 24 cm di distanza. Una quantità uguale di pentano è stata utilizzata per regolare la coppetta di controllo. Le coppette di trattamento e di controllo sono state scambiate tra ogni esperimento per controllare gli effetti di posizione. Dieci femmine alimentate con sangue sono state rilasciate nelle gabbie sperimentali a ZT 9-11 e le uova nelle coppette sono state contate 24 ore dopo.
L'analisi gascromatografica e di rilevamento del pattern dell'antenna elettronica (GC-EAD) della femmina An.arabiensis è stata eseguita come descritto in precedenza [20]. In breve, gli estratti volatili freschi dello spazio di testa sono stati separati utilizzando un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, USA) dotato di una colonna HP-5 (30 m × 0,25 mm di diametro interno, 0,25 μm di spessore del film, Agilent Technologies).e l'invecchiamento dell'urina. L'idrogeno è stato utilizzato come fase mobile con una portata lineare media di 45 cm s-1. Ogni campione (2 μl) è stato iniettato per 30 secondi in modalità splitless con una temperatura di ingresso di 225 ° C. La temperatura del forno GC è stata programmata da 35 ° C (3 minuti di attesa) a 300 ° C (10 minuti di attesa) a 10 ° C min-1. è stato aggiunto e diviso 1:1 in un incrocio a basso volume morto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) tra il rivelatore a ionizzazione di fiamma e l'EAD. posizionato a 0,5 cm dall'uscita del tubo. Ogni singola zanzara rappresentava una replica e, per le zanzare in cerca di ospite, sono state eseguite almeno tre repliche su campioni di urina di ciascuna età.
Identificazione di composti bioattivi nelle raccolte dello spazio di testa di urina bovina fresca e invecchiata utilizzando un GC combinato e uno spettrometro di massa (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) per suscitare risposte antennali nell'analisi GC-EAD, operando in modalità di ionizzazione per impatto elettronico a 70 eV. .25 μm di spessore del film) utilizzando l'elio come fase mobile con una portata lineare media di 35 cm s-1. Un campione da 2 μl è stato iniettato utilizzando le stesse impostazioni dell'iniettore e la stessa temperatura del forno dell'analisi GC-EAD. I composti sono stati identificati in base al loro tempo di ritenzione (indice di Kovát) e spettri di massa rispetto alla libreria personalizzata e alla libreria NIST14 (Agilent). I composti identificati sono stati confermati iniettando standard autentici (File aggiuntivo 1: Tabella S 2). Per la quantificazione, è stato iniettato eptil acetato (10 ng, 99,8% di purezza chimica, Aldrich) come standard esterno.
Valutare l'efficacia di una miscela di odori sintetici costituita da composti bioattivi identificati nell'urina fresca e invecchiata per attrarre Ans.arabiensis che cerca l'ospite e succhia il sangue, utilizzando lo stesso olfattometro e lo stesso protocollo di cui sopra. Per l'analisi, utilizzare 10 μl di una diluizione 1:100 della miscela completamente sintetica, con un tasso di rilascio complessivo compreso tra circa 140-2400 ng h-1, per valutare l'attrattiva per le zanzare ospite e succhiasangue. Successivamente, il test viene eseguito su miscele complete, in cui vengono rimosse miscele sottrattive di singoli composti della miscela completa. regressione seguita da confronti a coppie per rapporti dispari (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Per valutare se l'urina di vacca potesse servire come spunto per l'habitat ospite per le zanzare della malaria, l'urina di vacca fresca e invecchiata, raccolta come descritto sopra, e l'acqua sono state poste in secchi a rete da 3 litri (100 ml) e poste in trappole per esche per ospiti.(Versione BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE).Dieci trappole posizionate a 50 m di distanza l'una dall'altra in pascoli, a 400 m dalla comunità del villaggio (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e nessun bestiame, su allevamenti permanenti e villaggi.Cinque trappole sono state riscaldate per simulare la presenza di un ospite, mentre cinque trappole sono state lasciate non riscaldate. i numeri di quito catturati in trappole innescate con urina di età diverse sono stati confrontati utilizzando la regressione logistica con una distribuzione binomiale beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
In un villaggio endemico della malaria vicino alla città di Maki, nella regione di Oromia, in Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). Lo studio è stato condotto tra metà agosto e metà settembre prima dell'irrorazione residua annuale al chiuso, insieme a una lunga stagione delle piogge. per selezionare le case sono stati: non sono ammessi animali in casa, non è consentito cucinare al chiuso (traendo legna o carbone) (almeno durante il periodo di prova), e case con un massimo di due abitanti, che dormono in insetticidi.sotto la zanzariera trattata. L'approvazione etica è stata concessa dall'Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) della Faculty of Natural Sciences (CNS-IRB), Addis Ababa University, in conformità con le linee guida stabilite dalla World Medical Association Declaration of Helsinki. Design quadrato latino 2 × 2, in cui le miscele sintetiche e i controlli sono stati assegnati alle case accoppiate la prima notte e scambiati tra le case la notte sperimentale successiva. Questo processo è stato ripetuto dieci volte.
Una miscela sintetica contenente sei composti bioattivi è stata sciolta in eptano (grado GC solvente 97,0%, Sigma Aldrich) e rilasciata a 140 ng h-1 utilizzando un distributore di stoppino di cotone [20]. Il distributore di stoppino ha permesso a tutti i composti di essere rilasciati in proporzioni costanti durante l'esperimento di 12 ore. , FL, USA; Figura 6A). Le trappole sono state appese a 0,8 – 1 m dal suolo, vicino ai piedi del letto, e un volontario ha dormito sotto una zanzariera non trattata e operato tra le 18:00 e le 06:30. Membri del complesso [23] Nello studio sul campo, l'intrappolamento di case accoppiate è stato analizzato utilizzando un modello di adattamento logistico nominale, in cui l'attrazione era la variabile dipendente e il trattamento (miscela sintetica vs controllo) era l'effetto fisso (JMP® 14.0.0.SAS Institute Inc.).Qui riportiamo i valori χ2 e p dal test del rapporto di verosimiglianza.
Valutare se è sicuro. L'arabiensis è stato in grado di ottenere l'urina, la sua principale fonte di azoto, l'urea, mediante alimentazione diretta, entro 48 ore dalla somministrazione per 4 giorni dopo (dpe) le prove di alimentazione femminile in cerca di ospite e nutrite con sangue (Fig. 1A). 99) = 56,00, p <0,0001, rispettivamente; Fig. 1B, C).Inoltre, le femmine in cerca di ospite mangiavano meno nelle urine a 72 ore rispetto a quelle a 168 ore (Fig. 1B). (10.813) = 15,72, p <0,0001; Figura 1D). Ciò era in contrasto con la risposta delle donne alimentate con sangue, che in genere assorbivano una quantità significativamente maggiore di diete contenenti urea rispetto all'acqua, anche se significativamente meno del 10% di saccarosio (F(10,557) = 78,35, p <0,0001; Figura 1).1E). le femmine lebotomizzate assorbivano più urea rispetto alle femmine in cerca di ospite alle concentrazioni più basse, e queste femmine assorbivano quantità simili di urea a concentrazioni più elevate (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001;Fig. 1F, G). Mentre l'assunzione da una dieta contenente urea sembrava avere valori ottimali (Fig. 1D, E), le femmine in entrambi gli stati fisiologici erano in grado di modulare la quantità di urea assorbita nell'intero intervallo di concentrazioni di urea in modo log-lineare (Fig. 1F, G).). Allo stesso modo, le zanzare sembrano controllare il loro assorbimento di azoto regolando la quantità di urina assorbita, poiché la quantità di azoto nelle urine si riflette nella quantità assorbita (Figura 1B, inserti C e B).
Per valutare gli effetti dell'urina e dell'urea sulla sopravvivenza delle zanzare che cercano l'ospite e succhiano il sangue, le femmine sono state alimentate con urina di tutte e quattro le età (fresca, 24 ore, 72 ore e 168 ore dopo la deposizione) e una gamma di concentrazioni di urea, così come acqua distillata e il 10% di saccarosio servivano come controllo (Figura 2A). 8.5, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; Fig. 2B, C) e femmine alimentate con sangue (urina: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0. 0001; Figura 2D, E). In tutti gli esperimenti, le femmine alimentate con una dieta a base di urina, urea e acqua avevano tassi di sopravvivenza significativamente inferiori rispetto alle femmine alimentate con una dieta a base di saccarosio (Figura 2B-E). l'urea è sopravvissuta più a lungo dei controlli dell'acqua (p <0,04) (Fig.2C). Rispetto all'acqua, le donne alimentate con urina fresca e urina delle 24 ore sono sopravvissute più a lungo (p = 0,001 e p = 0,012, rispettivamente; Figura 2D), mentre le donne alimentate con urina delle 72 ore sono sopravvissute più a lungo di quelle alimentate con urina fresca femminile corta e urina invecchiata di 24 ore (p <0,0001 e p = 0,013, rispettivamente; Figura 2D). più a lungo di tutte le altre concentrazioni di urea e acqua (p <0,013; Figura 2E).
Sopravvivenza della femmina Anopheles arabinis ospite e succhiasangue che si nutre di urina di vacca e urea. Nel saggio biologico (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di vacca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O). E), e i controlli, saccarosio e acqua, sono morti
La distanza totale e il numero di giri determinati nel test del mulino di volo su un periodo di 24 ore differivano tra zanzare in cerca di ospite e zanzare succhiasangue, che mostravano una minore attività di volo complessiva (Fig. 3). principalmente diurne. Le zanzare femmine che fornivano saccarosio o urina delle 72 ore mostravano attività durante tutto il periodo di 24 ore, mentre le femmine che fornivano acqua erano più attive durante il periodo intermedio.
Prestazioni di volo di femmine di Anopheles arabinis succhiasangue in cerca di cacciatori che si nutrono di urina di vacca e urea. registrati (scuro: grigio; chiaro: bianco). La distanza media e il numero medio di attacchi sono mostrati a destra del grafico dell'attività circadiana. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Analisi statistica vedi testo
In generale, l'attività di volo complessiva delle femmine in cerca di ospite ha seguito un modello simile a quello della distanza di volo nell'arco di 24 ore. La distanza media di volo è stata significativamente influenzata dalla dieta ingerita (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e le femmine in cerca di ospite che hanno ingerito 72 ore di urina hanno percorso distanze significativamente maggiori rispetto a tutte le altre diete (p < 0,0001), e le zanzare alimentate con saccarosio hanno volato più a lungo di quelle fresche (p = 0,022) e zanzare alimentate con urina di 24 ore (p = 0,022). Contrariamente al modello di attività di volo descritto dalla dieta delle urine, le femmine in cerca di ospite alimentate con urea hanno mostrato un'attività di volo persistente per un periodo di 24 ore, con un picco durante la seconda metà della fase oscura (Fig. 3). 38) = 1310,91, p < 0,0001). Le femmine alla ricerca di un ospite alimentate con qualsiasi concentrazione di urea hanno volato più a lungo delle femmine alimentate con acqua o saccarosio (p < 0,03).
L'attività di volo complessiva delle zanzare succhiasangue è stata stabile e sostenuta per 24 ore attraverso tutte le diete, con un aumento dell'attività urinaria durante la seconda metà del periodo di buio per le femmine nutrite con acqua così come nelle femmine alimentate con acqua fresca e di 24 ore (immagine 3). .36, p = 0,24) .con altre urine e dieta di controllo (fresco, p = 0,0091; 72 ore, p = 0,0022; 168 ore, p = 0,001; saccarosio, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Gli effetti dell'alimentazione di urina e urea sui parametri riproduttivi sono stati valutati in saggi biologici di deposizione delle uova (Figura 4A) e sono stati studiati in base al numero di uova deposte da ciascuna femmina, dimensione dell'uovo e larve di primo stadio appena schiuse. Il numero di uova deposte. più uova rispetto alle femmine alimentate con altre diete urinarie ed erano simili a quelle alimentate con saccarosio (Fig. 4B). Allo stesso modo, la dimensione delle uova deposte dalle femmine alimentate con urina variava in base alla dieta (F (5, 209) = 12,85, p <0,0001), con l'urina delle 24 ore e le femmine alimentate con saccarosio deponevano uova significativamente più grandi rispetto alle femmine alimentate con acqua, mentre le uova delle femmine alimentate con 168 ore di urina erano significativamente più piccole (Fig. 4C). Inoltre, la dieta delle urine ha influenzato significativamente la dimensione delle larve (F(5, 187) = 7,86, p <0,0001), con larve significativamente più grandi che emergono dalle uova deposte da femmine alimentate con urina di 24 e 72 ore rispetto alle uova deposte da larve di uova. Femmine alimentate con acqua e 168 ore (Figura 4D).
Le prestazioni riproduttive delle femmine di Anopheles arabinis si nutrono di urina di vacca e urea. Le zanzare femmine alimentate con sangue sono state alimentate con diete costituite da urina di vacca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O) per 48 ore prima dell'inserimento nei test biologici e dell'ottenimento di substrati per la deposizione delle uova 48 ore (A). Il numero di uova (B, E), la dimensione dell'uovo (C, F) e la dimensione delle larve (D, G) sono stati significativamente influenzati dalla dieta fornita (urina di vacca: BD; urea: EG). Le medie per ciascun parametro misurato utilizzando diversi nomi di lettere erano significativamente diverse l'una dall'altra (ANOVA unidirezionale utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p <0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media
Essendo il principale componente azotato dell'urina, l'urea, quando fornita come dieta alle femmine nutrite con sangue, ha influenzato in modo significativo i parametri riproduttivi in ​​tutti gli studi. concentrazioni di urea di 134 µM o superiori depongono uova più grandi rispetto alle femmine alimentate con acqua (F(10, 4245) = 36,7; p <0,0001; Figura 4F), e la dimensione larvale, sebbene influenzata da concentrazioni simili di urea nelle madri (F(10, 3305) = 37,9; p <0,0001) era più variabile (Fig. 4G).
Attrazione generale per gli estratti volatili dello spazio di testa dell'urina bovina in cerca di ospite. L'arabiensis valutato nell'olfattometro con tubo di vetro (Fig. 5A) è stato significativamente influenzato dall'età delle urine (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). L'analisi post hoc ha mostrato che l'odore di urina stantia a 24 ore ha causato livelli significativamente più elevati di attrattiva rispetto a tutti gli altri trattamenti (72 ore: p = 0,0060, 168 ore : p = 0,012, pentano: p = 0,00070), ad eccezione dell'odore di urina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Sebbene l'attrazione complessiva delle zanzare succhiasangue per l'odore di urina non fosse significativamente diversa (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), queste femmine sono risultate significativamente più attraenti per gli estratti volatili dello spazio di testa rispetto all'urina invecchiata di 72 ore rispetto ai controlli (p = 0,0066; Figura 5C).
Risposte comportamentali agli odori di urina di mucca naturale e sintetica nella ricerca di Anopheles arabianus ospite e nutrito con sangue. Schema dell'olfattometro del tubo di vetro (A). G) viene mostrata l'urina di vacca invecchiata. Le tracce di rilevamento dell'antenna elettronica (EAD) mostrano le variazioni di tensione in risposta ai composti bioattivi nello spazio di testa eluito dal gascromatografo e rilevato da un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). La barra della scala rappresenta l'ampiezza della risposta (mV) rispetto al tempo di ritenzione (s). risposte ducibili.Trova l'ospite (H) e il succhiasangue (I) An.arabiensis ha attrattive diverse per miscele sintetiche di odori di urina di vacca fresca e invecchiata.p < 0.05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della scala
Femmina Ann.arabiensis, 72 ore e 120 ore dopo la farina di sangue, durante la deposizione delle uova, non è stata mostrata alcuna preferenza per gli estratti volatili dello spazio di testa da urina di vacca fresca e invecchiata rispetto ai controlli pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; File aggiuntivo 1: Fig. S1).
Per la femmina Ann.arabiensis, le analisi GC-EAD e GC-MS hanno identificato otto, sei, tre e tre composti bioattivi (Figura 5D-G). Sebbene siano state osservate differenze nel numero di composti che hanno suscitato risposte elettrofisiologiche, la maggior parte di questi composti erano presenti in ogni estratto volatile dello spazio di testa raccolto da urina fresca e invecchiata. Pertanto, per ciascun estratto, solo i composti che hanno prodotto una risposta fisiologica dalle antenne femminili al di sopra della soglia sono stati inclusi in ulteriori analisi.
Il tasso di rilascio totale dei composti bioattivi nella raccolta dello spazio di testa è aumentato da 29 µg h-1 nelle urine fresche a 242 µg h-1 nelle urine di 168 ore, principalmente a causa dell'aumento del p-cresolo e della m-formaldeide Fenolo e del fenolo. cromatogramma (Fig. 5D)-G pannello sinistro) e risposte fisiologiche a questi composti (Fig. 5D-G pannello destro).
Nel complesso, la miscela sintetica aveva un rapporto naturale simile di composti bioattivi identificati in estratti volatili di spazi di testa di urina freschi e invecchiati (Fig. 5D-G) e non sembrava suscitare un appello significativo nella ricerca di un ospite (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; Fig. 5H) o zanzare succhiasangue (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; Fig. 5I). Tuttavia, i confronti a coppie post hoc tra i trattamenti hanno mostrato che le zanzare in cerca di host erano significativamente attraenti per la miscela sintetica di urina invecchiata di 24 ore rispetto ai controlli pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Per valutare il ruolo dei singoli componenti nelle miscele sintetiche di urina invecchiata 24 ore, sei miscele sottrattive sono state valutate rispetto alle miscele complete nel test del tubo a Y, in cui sono stati rimossi i singoli composti. di Più piccolo di quello completamente miscelato. Al contrario, la rimozione dei singoli composti dalla miscela completamente sintetica non ha influenzato le risposte comportamentali delle zanzare succhiasangue (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), con l'eccezione del decanale, che ha portato a livelli inferiori rispetto all'attrazione della miscela completa (p = 0,022; File aggiuntivo 1: Figura S2B).
In un villaggio endemico della malaria in Etiopia, l'efficacia di una miscela sintetica di urina di vacca delle 24 ore nell'attirare le zanzare in condizioni di campo è stata valutata per dieci notti (Fig. 6A). Sono state catturate e identificate un totale di 4.861 zanzare, di cui il 45,7% erano Anthropus.gambiae sl, il 18,9% erano Anopheles pharoensis e il 35,4% erano Culex spp. (File aggiuntivo 1: Tabella S1). Anopheles arabinis è l'unico membro del complesso di specie An.Gambian identificato dall'analisi PCR. In media, sono state catturate 320 zanzare per notte, durante le quali le trappole con esche miste sintetiche hanno catturato più zanzare rispetto alle trappole accoppiate senza mistura (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). r numeri di zanzare sono stati catturati in ciascuna coppia di trappole, indicando nessuna distorsione tra le case (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) e nessun declino della popolazione durante il periodo di studio. χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e gravidanza (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;File aggiuntivo 1: Tabella S1). Ciò si riflette anche nel numero totale di zanzare catturate: ospite in cerca di > succhiasangue > incinta > semi-gravida > maschio.
Valutazione sul campo dell'efficacia di una miscela di odore di urina di vacca sintetica per 24 ore. Le prove sul campo sono state condotte nell'Etiopia centro-meridionale (mappa), vicino alla città di Maki (inserto), utilizzando una trappola luminosa del Centers for Disease Control (CDC) (a destra) in case accoppiate, con un design quadrato latino (immagine aerea) (A). effetto fisiologico dipendente dallo stato. Inoltre, queste trappole hanno catturato un numero significativamente maggiore di zanzare Culex ospiti. (D) Rispetto al controllo. Le barre a sinistra rappresentano l'indice di selezione medio delle zanzare catturate in coppie di esca odorosa (verde) e trappole di controllo (aperte) (N = 10), mentre le barre a destra rappresentano l'indice di selezione medio in coppie di trappole di controllo (aperte; N = 5).).Gli asterischi indicano i livelli di significatività statistica (*p = 0,01 e ***p < 0,0001)
Le tre specie sono state catturate in modo diverso in trappole contenenti miscele sintetiche. Ricerca dell'ospite (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), alimentazione del sangue (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e gravidanza (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) un .arabiensis è stato intrappolato in la trappola che rilasciava la miscela sintetica (Fig. 6B), mentre la quantità di An non differiva. Sono stati trovati Pharoensis in diversi stati fisiologici (Fig. 6C). Per Culex, è stato riscontrato solo un aumento significativo del numero di zanzare in cerca di ospiti nelle trappole innescate con la miscela sintetica (χ2 (1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), rispetto alle trappole di controllo.
Per valutare se le zanzare della malaria utilizzano l'odore di urina di mucca come segnale dell'habitat dell'ospite, sono state utilizzate trappole con esche per ospiti situate al di fuori di potenziali ospiti tra i siti di riproduzione e le comunità rurali in Etiopia. .29, p = 0,13;File aggiuntivo 1: Figura S3).Al contrario, i controlli dell'acqua non hanno catturato le zanzare della malaria ad alte temperature (File aggiuntivo 1: Figura S3).
Le zanzare della malaria acquisiscono e distribuiscono composti contenenti azoto attraverso l'alimentazione compensativa con l'urina di mucca (cioè pozzanghere) per migliorare i tratti della storia della vita, simili ad altri insetti [2, 4, 24, 25, 26]. , il principale componente azotato nelle urine [15, 16]. A seconda dello stato fisiologico della zanzara femmina, i nutrienti nelle urine sono allocati per migliorare l'attività di volo e la sopravvivenza delle zanzare femmine in cerca di ospite, così come la sopravvivenza e le caratteristiche riproduttive degli individui nutriti con sangue durante il primo ciclo gonadotropico. alimentazione a rischio. Questa scoperta ha conseguenze epidemiologiche significative, poiché le femmine aumentano la loro aspettativa di vita, attività e produzione riproduttiva, che influiscono sulla capacità del vettore. Inoltre, questo comportamento potrebbe essere l'obiettivo di futuri programmi di gestione del vettore.