L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano le strategie di foraggiamento e le caratteristiche del ciclo vitale degli insetti. Per compensare le carenze di specifici nutrienti nelle diverse fasi del ciclo vitale, gli insetti possono ottenere tali nutrienti attraverso un'alimentazione supplementare, ad esempio nutrendosi di secrezioni di vertebrati in un processo noto come "pozzanghere". La zanzara Anopheles arabiani sembra essere malnutrita e, pertanto, necessita di nutrienti sia per il metabolismo che per la riproduzione. Lo scopo di questo studio era valutare se l'agitazione di An. arabiensis sull'urina di mucca per l'acquisizione di nutrienti migliori le caratteristiche del ciclo vitale.
Assicurati che sia sicuro. arabiensis è stato attratto dall'odore di urina di mucca fresca, di 24 ore, 72 ore e 168 ore, e le femmine in cerca di ospite e nutrite di sangue (48 ore dopo il pasto di sangue) sono state misurate in un olfattometro a Y, e le femmine gravide sono state valutate per il test di deposizione delle uova. Un'analisi chimica ed elettrofisiologica combinata è stata quindi utilizzata per identificare i composti bioattivi nell'urina di mucca in tutte e quattro le classi di età. Miscele sintetiche di composti bioattivi sono state valutate in prove a Y e sul campo. Per studiare l'urina di mucca e il suo principale composto contenente azoto, l'urea, come potenziali diete supplementari per i vettori della malaria, sono stati misurati i parametri di alimentazione e le caratteristiche del ciclo vitale. Sono state valutate la proporzione di zanzare femmine e la quantità di urina di mucca e urea assorbite. Dopo l'alimentazione, le femmine sono state valutate per la sopravvivenza, il volo vincolato e la riproduzione.
Ricercano il sangue e il nutrimento dell'ospite. In studi di laboratorio e sul campo, gli arabi sono stati attratti dall'odore naturale e sintetico dell'urina di mucca fresca e stagionata. Le femmine gravide erano indifferenti alle reazioni all'urina di mucca nei siti di deposizione delle uova. Le femmine in cerca di un ospite e succhiatrici di sangue assorbono attivamente l'urina e l'urea della mucca e allocano queste risorse in base a compromessi legati al ciclo vitale, in funzione dello stato fisiologico per la fuga, la sopravvivenza o la riproduzione.
Acquisizione e distribuzione di urina di mucca da parte di Anopheles arabinis per migliorare le caratteristiche del ciclo vitale. L'alimentazione supplementare con urina di mucca influisce sulla capacità del vettore direttamente aumentando la sopravvivenza giornaliera e la densità del vettore, e indirettamente modificando l'attività di volo e dovrebbe quindi essere considerata nei modelli futuri.
L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano le caratteristiche di foraggiamento e del ciclo vitale degli insetti [1,2,3]. Gli insetti sono in grado di selezionare e acquisire cibo ed eseguire un'alimentazione compensativa in base alla disponibilità di cibo e ai requisiti nutrizionali [1, 3]. La distribuzione dei nutrienti dipende dal processo del ciclo vitale e può portare a diversi requisiti di qualità e quantità della dieta nelle diverse fasi del ciclo vitale degli insetti [1, 2]. Per compensare le carenze di specifici nutrienti, gli insetti possono ottenere questi nutrienti attraverso un'alimentazione supplementare, come quella a base di fango, vari escrementi e secrezioni di vertebrati e carogne, un processo noto come pozzanghere [2]. Sebbene siano descritte principalmente diverse specie di farfalle e falene, le pozze d'acqua si trovano anche in altri ordini di insetti e l'attrazione verso e l'alimentazione su questi tipi di risorse possono avere effetti significativi sulla salute e su altri tratti del ciclo vitale [2, 4, 5, 6], 7]. La zanzara della malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) emerge come un adulto "malnutrito" [8], quindi l'acqua può svolgere un ruolo importante nelle sue caratteristiche di ciclo vitale, ma questo comportamento è stato finora trascurato. L'uso dell'agitazione come mezzo per aumentare l'assunzione di nutrienti in questo importante veicolo merita attenzione in quanto ciò potrebbe avere importanti conseguenze epidemiologiche.
L'assunzione di azoto nelle zanzare Anopheles femmine adulte è limitata a causa delle basse riserve caloriche accumulate dallo stadio larvale e dell'inefficiente utilizzo del pasto di sangue [9]. Le femmine di Ann. gambiae sl in genere compensano questo integrando con pasti di sangue supplementari [10, 11], mettendo così più persone a rischio di contrarre la malattia e mettendo le zanzare a maggior rischio di predazione. In alternativa, le zanzare possono utilizzare l'alimentazione supplementare con escrementi di vertebrati per acquisire composti azotati che migliorano l'adattamento e la manovrabilità del volo, come dimostrato da altri insetti [2]. A questo proposito, è interessante la forte e distinta attrazione di una delle specie sorelle all'interno del complesso di specie An. gambiae sl, Anopheles arabinis, per l'urina di mucca fresca e invecchiata [12,13,14]. Anopheles arabinis è opportunista nelle sue preferenze di ospite ed è noto per associarsi e nutrirsi di bovini. L'urina di mucca è una risorsa ricca di composti azotati, con l'urea che rappresenta il 50-95% dell'azoto totale nell'urina fresca [15, 16].Con l'invecchiamento dell'urina delle mucche, i microrganismi utilizzano queste risorse per ridurre la complessità dei composti azotati entro 24 ore [15].Con il rapido aumento dell'ammoniaca, associato a un declino dell'azoto organico, prosperano i microrganismi alcalofili (molti dei quali producono composti tossici per le zanzare) [15], che possono essere femmine di Ann. arabiensis attratte preferenzialmente dall'urina invecchiata 24 ore o meno [13, 14].
In questo studio, sono stati ricercati gli Ans ospiti e nutriti di sangue. Durante il suo primo ciclo di gonadotropine, è stata valutata l'acquisizione di composti azotati, tra cui l'urea, tramite la miscelazione dell'urina. Successivamente, è stata condotta una serie di esperimenti per valutare come le zanzare femmine allocano questa potenziale risorsa nutritiva per migliorare la sopravvivenza, la riproduzione e l'ulteriore foraggiamento. Infine, è stato valutato l'odore dell'urina di mucca fresca e invecchiata per determinare se questi fornissero indizi affidabili per gli Ans ospiti e nutriti di sangue. Nella loro ricerca di questa potenziale risorsa nutritiva, gli Ans arabiensis hanno scoperto correlazioni chimiche alla base dell'attrattività differenziale osservata. Miscele di odori sintetici di composti organici volatili (COV) identificati nell'urina invecchiata per 24 ore sono stati ulteriormente valutati in condizioni di campo, estendendo i risultati ottenuti in condizioni di laboratorio e dimostrando l'effetto dell'odore dell'urina bovina su diversi stati fisiologici. Attrazione delle zanzare. I risultati ottenuti confermano che An. La specie Arabiensis acquisisce e distribuisce composti azotati presenti nell'urina dei vertebrati per influenzare le caratteristiche del suo ciclo vitale. Questi risultati vengono discussi nel contesto delle potenziali conseguenze epidemiologiche e di come possono essere utilizzati per la sorveglianza e il controllo del vettore.
Gli Anopheles arabicans (ceppo Dongola) sono stati mantenuti a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% di umidità relativa e un ciclo luce/buio di 12:12 ore. Le larve sono state allevate in vassoi di plastica (20 cm × 18 cm × 7 cm) riempiti con acqua distillata e nutrite con mangime per pesci Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Germania). Le pupe sono state raccolte in coppette da 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, Svezia) e quindi trasferite in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) per consentire l'emergenza degli adulti. Agli adulti è stata fornita una soluzione di saccarosio al 10% ad libitum fino a 4 giorni dopo l'emergenza (dpe), momento in cui alle femmine in cerca di ospite è stata offerta la dieta immediatamente prima dell'esperimento, oppure sono state tenute a digiuno durante la notte con acqua distillata prima dell'esperimento, come descritto di seguito. Femmine utilizzate per gli esperimenti con il tubo di volo sono state tenute a digiuno per sole 4-6 ore con acqua a volontà. Per preparare le zanzare ematofaghe per i successivi bioassay, alle femmine di 4 dpe è stato fornito sangue di pecora defibrotico (Håtunalab, Bro, SE) utilizzando un sistema di alimentazione a membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Le femmine completamente congestionate sono state quindi trasferite in gabbie individuali e alimentate direttamente con la dieta, come descritto di seguito, oppure con saccarosio al 10% a volontà per 3 giorni prima degli esperimenti descritti di seguito. Queste ultime femmine sono state utilizzate per i bioassay in tubo di volo e trasferite in laboratorio, dove hanno avuto acqua distillata a volontà per 4-6 ore prima dell'esperimento.
Sono stati utilizzati test di alimentazione per quantificare il consumo di urina e urea in femmine adulte di An.Arab. Alle femmine in cerca di ospite e nutrite con sangue è stata fornita una dieta contenente l'1% di urina di mucca fresca e invecchiata diluita, varie concentrazioni di urea e due controlli (10% di saccarosio e acqua) per 48 ore. Inoltre, è stato aggiunto colorante alimentare (1 mg ml-1 xilene cianuro FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stoccolma, SE) alla dieta e fornito in una matrice 4 × 4 in provette da microcentrifuga da 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figura 1A) Riempire fino all'orlo (~300 µl). Per evitare la competizione tra le zanzare e i potenziali effetti del colore del colorante, posizionare 10 zanzare in una grande piastra di Petri (12 cm di diametro e 6 cm di altezza; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) in completa oscurità a 25 ± 2 cm °C e 65 ± 5% di umidità relativa. Questi esperimenti sono stati ripetuti da 5 a 10 volte. Dopo l'esposizione alla dieta, le zanzare sono state conservate a -20 °C fino a ulteriori analisi.
Osservare l'urina bovina e l'urea assorbite dall'ospite e dalle femmine di Anopheles arabianus ematofaghe. Nella prova di alimentazione (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O). Le femmine in cerca di un ospite (B) e quelle nutrite con sangue (C) hanno assorbito più saccarosio rispetto a qualsiasi altra dieta testata. Si noti che le femmine in cerca di un ospite hanno assorbito meno urina di mucca di 72 ore rispetto all'urina di mucca di 168 ore (B). Il contenuto medio di azoto totale (± deviazione standard) dell'urina è rappresentato nell'inserto. Le femmine in cerca di un ospite (D, F) e quelle ematofaghe (E, G) assorbono l'urea in modo dose-dipendente. I volumi medi inalati (D, E) con nomi di lettere diversi erano significativamente diversi tra loro (ANOVA a una via con analisi post hoc di Tukey; p < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (BE).La linea tratteggiata rappresenta la retta di regressione log-lineare (F, G)
Per rilasciare il cibo assorbito, le zanzare sono state poste singolarmente in provette da microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 230 µl di acqua distillata e il tessuto è stato disgregato utilizzando un pestello monouso e un motore senza fili (VWR International, Lund, SE), seguito da centrifugazione a 10.000 giri/min per 10 min. Il supernatante (200 µl) è stato trasferito in una micropiastra a 96 pozzetti (Sigma-Aldrich) e l'assorbanza (λ620) è stata determinata utilizzando un lettore di micropiastre basato su spettrofotometro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). In alternativa, le zanzare sono state macinate in 1 ml di acqua distillata, 900 µl dei quali sono stati trasferiti in una cuvetta per l'analisi spettrofotometrica (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Per quantificare l'assunzione alimentare, è stata preparata una curva standard mediante diluizione seriale per ottenere 0,2 Da µl a 2,4 µl di cianuro di xilene a 1 mg ml-1. Quindi, la densità ottica di concentrazioni note di colorante è stata utilizzata per determinare la quantità di cibo ingerita da ciascuna zanzara.
I dati relativi al volume sono stati analizzati mediante analisi della varianza a una via (ANOVA) seguita da confronti a coppie post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Le analisi di regressione lineare hanno descritto l'assunzione di urea dipendente dalla concentrazione e confrontato le risposte tra zanzare in cerca di un ospite e zanzare ematofaghe (GraphPad Prism v8.0.0 per Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Circa 20 µl di campioni di urina per ciascun gruppo di età sono stati legati a Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) e incapsulati in capsule di stagno (8 mm × 5 mm). Le capsule sono state inserite nella camera di combustione di un analizzatore CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per determinare il contenuto di azoto nell'urina fresca e invecchiata secondo il protocollo del produttore. L'azoto totale (g N l-1) è stato quantificato sulla base di concentrazioni note di urea utilizzate come standard.
Per valutare l'effetto della dieta sulla sopravvivenza delle femmine in cerca di ospite e succhiatrici di sangue, le zanzare sono state collocate singolarmente in grandi piastre di Petri (12 cm di diametro e 6 cm di altezza; Semadeni) con un foro coperto da una rete nel coperchio (3 cm di diametro) per la ventilazione e l'alimentazione. Le diete sono state fornite immediatamente dopo 4 dpe e ​​includevano urina di mucca fresca e invecchiata diluita all'1%, quattro concentrazioni di urea e due controlli, saccarosio al 10% e acqua. Ogni dieta è stata pipettata su un tampone dentale (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserito in una siringa da 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), lo stantuffo è stato rimosso e il tampone è stato posizionato sopra una piastra di Petri (figura 1).1A). Cambia la tua dieta ogni giorno. Mantieni il laboratorio come descritto sopra. Le zanzare sopravvissute sono state contate due volte al giorno, mentre le zanzare morte sono state scartate fino alla morte dell'ultima zanzara (n = 40 per trattamento). Sopravvivenza delle zanzare nutrite con varie Le diete sono state analizzate statisticamente utilizzando le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier e i test del log-rank per confrontare le distribuzioni di sopravvivenza tra le diete (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un mulino volante per zanzare personalizzato basato su Attisano et al.[17], realizzato con pannelli acrilici trasparenti spessi 5 mm (10 cm di larghezza x 10 cm di lunghezza x 10 cm di altezza) senza pannelli anteriori e posteriori (Fig. 3: in alto). Un gruppo di rotazione con un tubo verticale realizzato con una colonna per gascromatografia (0,25 mm di diametro interno; 7,5 cm di lunghezza) con le estremità incollate a un ago per insetti sospeso tra una coppia di magneti al neodimio distanti 9 cm. Un tubo orizzontale realizzato con lo stesso materiale (6,5 cm di lunghezza) bisecava il tubo verticale per formare un braccio vincolato e un braccio che portava un piccolo pezzo di foglio di alluminio come segnale di interruzione della luce.
Alle femmine a digiuno da 24 ore è stata somministrata la dieta sopra descritta per 30 minuti prima dell'immobilizzazione. Le zanzare femmine completamente nutrite sono state quindi anestetizzate individualmente sul ghiaccio per 2-3 minuti e fissate a spilli per insetti con cera d'api (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) e poi legate ai bracci dei tubi orizzontali. Mulino volante. Le rotazioni per volo sono state registrate da un data logger costruito su misura, quindi memorizzate e visualizzate utilizzando il software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Il mulino volante è stato collocato in una stanza a temperatura controllata (12 h:12 h, luce:buio, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% UR).
Per visualizzare il modello di attività di volo, sono state calcolate la distanza totale percorsa (m) e il numero totale di attività di volo consecutive per ora nell'arco di 24 ore. Inoltre, le distanze medie percorse dalle singole femmine sono state confrontate tra i trattamenti e analizzate utilizzando l'ANOVA a una via e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), dove la distanza media è stata considerata una variabile dipendente, mentre il trattamento è un fattore indipendente. Infine, il numero medio di giri è calcolato in intervalli di 10 minuti.
Per valutare l'effetto della dieta sulle prestazioni riproduttive di An. arabiensis, sei femmine (4 dpe) sono state trasferite direttamente in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) dopo il prelievo di sangue e quindi alimentate con la dieta sperimentale per 48 ore come descritto sopra. Le diete sono state quindi rimosse e sono state fornite coppette per la deposizione delle uova (30 ml; Nolato Hertila) riempite con 20 ml di acqua distillata il terzo giorno per 48 ore, cambiandole ogni 24 ore. Ogni regime dietetico è stato ripetuto 20-50 volte. Le uova sono state contate e registrate per ogni gabbia sperimentale. Sottocampioni di uova sono stati utilizzati per valutare la dimensione media e la variazione di lunghezza delle singole uova (n ≥ 200 per dieta) utilizzando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) dotato di una fotocamera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Le uova rimanenti sono state mantenute in una stanza a temperatura controllata in condizioni di allevamento standard per 24 ore e un sottocampione di larve di primo stadio appena emerse (n ≥ 200 per dieta) è stato misurato, come descritto sopra. Il numero di uova e le dimensioni di uova e larve sono stati confrontati tra i trattamenti e utilizzando l'ANOVA a una via e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Sono stati raccolti i composti volatili dello spazio di testa da campioni di urina fresca (1 ora dopo il prelievo), invecchiata per 24 ore, 72 ore e 168 ore, prelevati da bovini Zebu di razza Arsi. Per comodità, i campioni di urina sono stati raccolti al mattino presto, mentre le mucche erano ancora nella stalla. I campioni di urina sono stati raccolti da 10 individui e 100-200 ml di ciascun campione sono stati trasferiti in sacchetti di poliammide individuali (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Germania) in fusti di plastica di cloruro di vinile da 3 litri con coperchio. I composti volatili dello spazio di testa di ciascun campione di urina bovina sono stati raccolti direttamente (fresca) o dopo maturazione a temperatura ambiente per 24 ore, 72 ore e 168 ore, ovvero ciascun campione di urina era rappresentativo di ciascun gruppo di età.
Per la raccolta dei volatili dello spazio di testa, è stato utilizzato un sistema a circuito chiuso per far circolare un flusso di gas filtrato con carbone attivo (100 ml min-1) attraverso un sacchetto di poliammide fino alla colonna di adsorbimento per 2,5 ore utilizzando una pompa a vuoto a membrana (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Come controllo, la raccolta dello spazio di testa è stata eseguita da un sacchetto di poliammide vuoto. La colonna di adsorbimento era costituita da un tubo di Teflon (5,5 cm x 3 mm di diametro interno) contenente 35 mg di Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) tra tappi di lana di vetro. Prima dell'uso, la colonna è stata lavata con 1 ml di n-esano ridistillato (Merck, Darmstadt, DE) e 1 ml di pentano (solvente puro al 99,0% di grado GC, Sigma Aldrich). I volatili adsorbiti sono stati eluiti con 400 μl di pentano. Le raccolte dello spazio di testa sono state unite e successivamente conservati a -20 °C fino al momento dell'utilizzo per ulteriori analisi.
Risposte comportamentali di An in cerca di ospite e mangia-sangue. Gli estratti volatili dello spazio di testa raccolti da urina fresca, invecchiata 24 ore, 72 ore e 168 ore sono stati analizzati per estratti volatili da zanzare Arabidopsis utilizzando un olfattometro a tubo di vetro dritto [18]. Gli esperimenti sono stati condotti durante ZT 13-15, il periodo di picco dell'attività di ricerca della casa di An. Arabo [19]. Un olfattometro a tubo di vetro (80 cm × 9,5 cm id) è stato illuminato con 3 ± 1 lx di luce rossa dall'alto. Un flusso d'aria filtrato e umidificato con carbone (25 ± 2 °C, 65 ± 2% di umidità relativa) ha attraversato il bioassay a 30 cm s-1. L'aria viene fatta passare attraverso una serie di schermi a rete in acciaio inossidabile, creando un flusso laminare e una struttura del pennacchio uniforme. Dispenser di tamponi dentali (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), sospeso da una bobina di 5 cm all'estremità sopravvento dell'olfattometro, con cambio dello stimolatore ogni 5 minuti. Per l'analisi, 10 μl di ciascun estratto di headspace, diluito 1:10, sono stati utilizzati come stimolo. Una quantità uguale di pentano è stata utilizzata come controllo. Singole zanzare in cerca di ospite o ematofaghe sono state poste in gabbie di rilascio individuali 2-3 ore prima dell'inizio dell'esperimento. La gabbia di rilascio è stata posizionata sul lato sottovento dell'olfattometro e le zanzare sono state lasciate acclimatare per 1 minuto, quindi la valvola a farfalla della gabbia è stata aperta per il rilascio. L'attrazione al trattamento o al controllo è stata analizzata come la proporzione di zanzare che sono entrate in contatto con la sorgente entro 5 minuti dal rilascio. Ciascun estratto volatile di headspace e controllo sono stati replicati almeno 30 volte e, per evitare gli effetti di un singolo giorno, lo stesso numero di trattamenti e controlli è stato testato in ogni giorno sperimentale. Risposte di ricerca da ospiti e zanzare ematofaghe I set di testo arabo e headspace sono stati analizzati utilizzando la regressione logistica nominale seguita da confronti a coppie per i rapporti di probabilità (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Risposta riproduttiva di An. Gli estratti di spazio di testa di urina di mucca fresca e invecchiata sono stati analizzati in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Bicchieri di plastica (30 mL; Nolato Hertila) riempiti con 20 mL di acqua distillata hanno fornito il substrato di deposizione delle uova e sono stati posizionati negli angoli opposti della gabbia, a 24 cm di distanza. I bicchieri di trattamento sono stati aggiustati con 10 μl di ciascun estratto di spazio di testa a una diluizione 1:10. Una quantità uguale di pentano è stata utilizzata per aggiustare il bicchiere di controllo. I bicchieri di trattamento e di controllo sono stati scambiati tra ogni esperimento per controllare gli effetti della posizione. Dieci femmine nutrite con sangue sono state rilasciate nelle gabbie sperimentali a ZT 9-11 e le uova nei bicchieri sono state contate 24 ore dopo. La formula per il calcolo dell'indice di deposizione delle uova è: (numero di uova deposte nel bicchiere di trattamento – numero di uova deposte nel bicchiere di controllo)/(numero totale di uova deposte). Ogni trattamento è stato ripetuto 8 volte.
L'analisi mediante gascromatografia e rilevamento del modello di antenna elettronica (GC-EAD) di An. arabiensis femmina è stata eseguita come precedentemente descritto [20]. In breve, gli estratti volatili dello spazio di testa fresco sono stati separati utilizzando un Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) dotato di una colonna HP-5 (30 m × 0,25 mm id, spessore del film 0,25 μm, Agilent Technologies). e urina invecchiata. L'idrogeno è stato utilizzato come fase mobile con una velocità di flusso lineare media di 45 cm s-1. Ogni campione (2 μl) è stato iniettato per 30 secondi in modalità splitless con una temperatura di ingresso di 225 °C. La temperatura del forno GC è stata programmata da 35 °C (mantenimento per 3 minuti) a 300 °C (mantenimento per 10 minuti) a 10 °C min-1. Nello splitter dell'effluente GC, sono stati aggiunti 4 psi di azoto e suddivisi 1:1 in un cross Gerstel 3D/2 a basso volume morto (Gerstel, Mülheim, DE) tra il rivelatore a ionizzazione di fiamma e l'EAD. Il capillare dell'effluente GC per l'EAD è stato fatto passare attraverso una linea di trasferimento Gerstel ODP-2, che segue la temperatura del forno GC più 5 °C, in un tubo di vetro (10 cm × 8 mm), dove è stato miscelato con aria umidificata filtrata a carbone (1,5 l min−1). L'antenna è stata posizionata a 0,5 cm dall'uscita del tubo. Ogni singola zanzara rappresentava una replica e, per le zanzare in cerca di un ospite, sono state eseguite almeno tre repliche su campioni di urina di ciascuna età.
Identificazione di composti bioattivi in ​​raccolte di spazio di testa di urina bovina fresca e invecchiata utilizzando un GC combinato e uno spettrometro di massa (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) per elicitare risposte antennali nell'analisi GC-EAD, operante in modalità di ionizzazione a impatto elettronico a 70 eV. Il GC era dotato di una colonna capillare in silice fusa rivestita UI-HP-5MS (60 m × 0,25 mm di diametro interno, 0,25 μm di spessore del film) utilizzando elio come fase mobile con una velocità di flusso lineare media di 35 cm s-1. Un campione di 2 μl è stato iniettato utilizzando le stesse impostazioni dell'iniettore e la stessa temperatura del forno dell'analisi GC-EAD. I composti sono stati identificati in base al loro tempo di ritenzione (indice di Kovát) e spettri di massa confrontati con la libreria personalizzata e la libreria NIST14 (Agilent). I composti identificati sono stati confermati iniettando standard autentici (File aggiuntivo 1: Tabella S2). Per la quantificazione, è stato iniettato acetato di eptile (10 ng, purezza chimica 99,8%, Aldrich) come standard esterno.
Valutazione dell'efficacia di una miscela di odori sintetici composta da composti bioattivi identificati nell'urina fresca e invecchiata per attrarre Ans. arabiensis in cerca di ospite e ematofagi, utilizzando lo stesso olfattometro e protocollo di cui sopra. Le miscele sintetiche imitavano la composizione e le proporzioni dei composti negli estratti volatili dello spazio di testa misto di urina fresca, invecchiata per 24 ore, 48 ore, 72 ore e 168 ore (Figura 5D-G; File aggiuntivo 1: Tabella S2). Per l'analisi, utilizzare 10 μl di una diluizione 1:100 della miscela completamente sintetica, con un tasso di rilascio complessivo che va da circa 140-2400 ng h-1, per valutare l'attrattività per le zanzare ospiti ed ematofaghe. Successivamente, il test viene eseguito su miscele complete, in cui vengono rimosse le miscele sottrattive di singoli composti della miscela completa. Le risposte di ricerca da parte di Ans. arabiensis ospiti ed ematofagi rispetto alle miscele sintetiche e sottrattive sono state analizzate utilizzando valori nominali regressione logistica seguita da confronti a coppie per odds ratio (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Per valutare se l'urina di mucca potesse fungere da segnale ambientale per le zanzare portatrici di malaria, urina di mucca fresca e invecchiata, raccolta come descritto in precedenza, e acqua sono state poste in secchi a rete da 3 litri (100 ml) e collocate in trappole con esca per ospiti (versione BG-HDT; BioGents, Regensburg, Germania). Dieci trappole sono state posizionate a 50 m di distanza l'una dall'altra in un pascolo, a 400 m da un villaggio (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e senza bestiame, in aree di riproduzione permanenti e villaggi. Cinque trappole sono state riscaldate per simulare la presenza di un ospite, mentre cinque sono state lasciate non riscaldate. Ogni posizione di trattamento è stata ruotata ogni notte per un totale di cinque notti. Il numero di zanzare catturate nelle trappole con esca di urina di diversa età è stato confrontato utilizzando la regressione logistica con una distribuzione beta binomiale (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
In un villaggio endemico per la malaria vicino alla città di Maki, nella regione di Oromia, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). Lo studio è stato condotto tra metà agosto e metà settembre, prima della disinfestazione annuale degli ambienti interni, in concomitanza con la lunga stagione delle piogge. Cinque coppie di case (distanti tra loro 20 e 50 m) situate alla periferia del villaggio sono state selezionate per lo studio (Fig. 6A). I ​​criteri utilizzati per la selezione delle case erano: nessun animale ammesso in casa, nessun utilizzo di fornelli (legna da ardere o carbone) consentito (almeno durante il periodo di prova) e case con un massimo di due abitanti, che dormivano in ambienti non trattati con insetticidi. sotto la zanzariera trattata. L'approvazione etica è stata concessa dal Comitato Etico Istituzionale per la Ricerca (IRB/022/2016) della Facoltà di Scienze Naturali (CNS-IRB) dell'Università di Addis Abeba, in conformità con le linee guida stabilite dalla Dichiarazione di Helsinki dell'Associazione Medica Mondiale. Il consenso di ciascun capofamiglia è stato ottenuto con l'assistenza del personale sanitario. L'intero processo è stato approvato dalle amministrazioni locali a livello di distretto e di quartiere ('kebele'). Il disegno sperimentale ha seguito un disegno a quadrato latino 2 × 2, in cui miscele sintetiche e controlli sono stati assegnati a coppie di case la prima notte e scambiati tra le case la notte sperimentale successiva. Questo processo è stato ripetuto dieci volte. Inoltre, per stimare l'attività delle zanzare nelle case selezionate, le trappole CDC sono state impostate per funzionare per cinque notti consecutive all'inizio, a metà e alla fine della prova sul campo alla stessa ora del giorno.
Una miscela sintetica contenente sei composti bioattivi è stata disciolta in eptano (solvente al 97,0% di grado GC, Sigma Aldrich) e rilasciata a 140 ng h-1 utilizzando un dispenser a stoppino di cotone [20]. Il dispenser a stoppino ha permesso il rilascio di tutti i composti in proporzioni costanti durante l'esperimento di 12 ore. L'eptano è stato utilizzato come controllo. La fiala è stata sospesa accanto al punto di ingresso della trappola luminosa dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Figura 6A). Le trappole sono state appese a 0,8 - 1 m dal suolo, vicino ai piedi del letto, e un volontario ha dormito sotto una zanzariera non trattata e azionate tra le 18:00 e le 06:30. Le zanzare catturate in base al sesso e allo stato fisiologico (non nutrite, nutrite, semi-gravide e gravide [21] sono state successivamente analizzate mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) per identificare la specie morfologicamente identificata come A. gambiae sl. Membri del complesso [23]. Nello studio sul campo, la cattura con trappole di case accoppiate è stata analizzata utilizzando un modello di adattamento logistico nominale, dove l'attrazione era la variabile dipendente e il trattamento (miscela sintetica vs controllo) era l'effetto fisso (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Qui riportiamo i valori χ2 e p ​​dal test del rapporto di verosimiglianza.
Valutare se è sicuro. arabiensis è stato in grado di ottenere urina, la sua principale fonte di azoto, urea, tramite alimentazione diretta, entro 48 ore dalla somministrazione per 4 giorni dopo (dpe) prove di alimentazione di femmine in cerca di ospite e nutrite con sangue (Fig. 1A). Sia le femmine in cerca di ospite che quelle che succhiavano sangue hanno assorbito una quantità significativamente maggiore di saccarosio rispetto a qualsiasi altra dieta o acqua (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 e F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, rispettivamente; Fig. 1B,C). Inoltre, le femmine in cerca di ospite hanno mangiato meno urina a 72 ore rispetto all'urina a 168 ore (Fig. 1B). Quando è stata offerta una dieta contenente urea, le femmine in cerca di ospite hanno assorbito una quantità significativamente maggiore di urea a 2,69 mM rispetto a tutte le altre concentrazioni e all'acqua, mentre era indistinguibile dal 10% saccarosio (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Ciò era in contrasto con la risposta delle femmine nutrite con sangue, che in genere assorbivano diete contenenti urea significativamente più di acqua, sebbene significativamente meno del 10% di saccarosio (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). Inoltre, confrontando i due stati fisiologici, le femmine flebotomizzate assorbivano più urea rispetto alle femmine in cerca di ospite alle concentrazioni più basse, e queste femmine assorbivano quantità simili di urea a concentrazioni più elevate (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Mentre l'assunzione da una dieta contenente urea sembrava avere valori ottimali ​​(Fig. 1D,E), le femmine in entrambi gli stati fisiologici erano in grado di modulare la quantità di urea assorbita sull'intero intervallo di concentrazioni di urea in modo log-lineare (Fig. 1F,G). Allo stesso modo, le zanzare sembrano controllare l'assorbimento di azoto regolando la quantità di urina assorbita, poiché la quantità di azoto nell'urina si riflette nella quantità assorbita (Figura 1B, inserti C e B).
Per valutare gli effetti dell'urina e dell'urea sulla sopravvivenza delle zanzare in cerca di un ospite e di quelle ematofaghe, le femmine sono state alimentate con urina di tutte e quattro le età (fresca, 24 h, 72 h e 168 h dopo la deposizione) e con una gamma di concentrazioni di urea, così come acqua distillata e saccarosio al 10% come controllo (Figura 2A). Questa analisi di sopravvivenza ha mostrato che la dieta ha avuto un effetto significativo sulla sopravvivenza complessiva nelle femmine in cerca di un ospite (urina: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) e nelle femmine nutrite con sangue (urina: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E).In tutti gli esperimenti, le femmine alimentate con una dieta a base di urina, urea e acqua avevano tassi di sopravvivenza significativamente inferiori rispetto alle femmine alimentate con una dieta a base di saccarosio (Figura 2B-E).Le femmine in cerca di ospite alimentate con urina fresca e stantia hanno mostrato tassi di sopravvivenza diversi, con quelle alimentate con urina stantia di 72 ore (p = 0,016) che avevano la probabilità di sopravvivenza più bassa (Fig. 2B).Inoltre, le femmine in cerca di ospite alimentate con 135 mM di urea sono sopravvissute più a lungo dei controlli con acqua (p < 0,04) (Fig. 2C).Rispetto all'acqua, le donne alimentate con urina fresca e urina di 24 ore sono sopravvissute più a lungo (rispettivamente p = 0,001 e p = 0,012; Figura 2D), mentre le donne alimentate con urina di 72 ore sono sopravvissute più a lungo di quelle alimentate con urina fresca di femmina corta e urina invecchiata di 24 ore (p < 0,0001 e p = 0,013, rispettivamente; Figura 2D). Quando alimentate con 135 mM di urea, le femmine nutrite con sangue sono sopravvissute più a lungo rispetto a tutte le altre concentrazioni di urea e acqua (p < 0,013; Figura 2E).
Sopravvivenza di zanzare femmine di Anopheles arabinis, sia ospiti che ematofaghe, che si nutrono di urina di mucca e urea. Nel bioassay (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O). La sopravvivenza delle zanzare in cerca di un ospite (B, C) e ematofaghe (D, E) è stata registrata ogni 12 ore fino a quando tutte le femmine nutrite con urina (B, D) e urea (C, E), e i controlli, saccarosio e acqua, non sono morte.
La distanza totale e il numero di giri determinati nel test del mulino di volo in un periodo di 24 ore differivano tra le zanzare in cerca di ospite e quelle ematofaghe, che mostravano un'attività di volo complessivamente inferiore (Fig. 3). Le zanzare in cerca di ospite che fornivano urina fresca e invecchiata o saccarosio e acqua mostravano modelli di volo distinti (Fig. 3), con le femmine che si nutrivano di urina fresca più attive all'alba, mentre quelle nutrite con urina invecchiata 24 e 168 ore mostravano modelli di volo diversi ed erano principalmente diurni. Le zanzare femmine che fornivano saccarosio o urina di 72 ore mostravano attività durante tutto il periodo di 24 ore, mentre le femmine che fornivano acqua erano più attive durante il periodo centrale. Le zanzare nutrite con saccarosio mostravano i livelli di attività più elevati a tarda notte e al mattino presto, mentre quelle che ingerivano urina invecchiata 72 ore subivano un calo costante dell'attività nell'arco di 24 ore (Figura 3).
Prestazioni di volo di femmine di Anopheles arabinis ematofaghe in cerca di un ospite, alimentate con urina di mucca e urea. Nel test del mulino di volo, le zanzare femmine alimentate con urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O) sono state legate a bracci orizzontali a rotazione libera (sopra). Per le femmine in cerca di un ospite (a sinistra) e per quelle ematofaghe (a destra), sono state registrate la distanza totale e il numero di voli all'ora per ciascuna dieta nell'arco di 24 ore (scuro: grigio; chiaro: bianco). La distanza media e il numero medio di voli sono mostrati a destra del grafico dell'attività circadiana. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Per l'analisi statistica, vedere il testo.
In generale, l'attività di volo complessiva delle femmine in cerca di un ospite ha seguito un modello simile a quello della distanza di volo in un periodo di 24 ore. La distanza media di volo è stata influenzata in modo significativo dalla dieta ingerita (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e le femmine in cerca di un ospite che hanno ingerito urina per 72 ore hanno volato per distanze significativamente maggiori rispetto a tutte le altre diete (p < 0,0001), e le zanzare nutrite con saccarosio hanno volato più a lungo rispetto alle zanzare nutrite con urina fresca (p = 0,022) e con urina invecchiata per 24 ore (p = 0,022). In contrasto con il modello di attività di volo descritto dalla dieta a base di urina, le femmine in cerca di un ospite nutrite con urea hanno mostrato un'attività di volo persistente in un periodo di 24 ore, con un picco durante la seconda metà della fase di buio (Fig. 3). Sebbene i modelli di attività fossero simili, le femmine in cerca di un ospite nutrite con urea hanno aumentato significativamente la distanza media di volo a seconda della concentrazione assorbita (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Le femmine in cerca di ospite nutrite con qualsiasi concentrazione di urea hanno volato più a lungo delle femmine nutrite con acqua o saccarosio (p < 0,03).
L'attività di volo complessiva delle zanzare ematofaghe è risultata stabile e sostenuta per 24 ore in tutte le diete, con un aumento dell'attività urinaria durante la seconda metà del periodo di buio per le femmine alimentate con acqua, così come per le femmine alimentate con urina fresca e di 24 ore (immagine 3). Mentre la dieta a base di urina ha influenzato significativamente la distanza media di volo nelle femmine alimentate con sangue (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), la dieta a base di urea non ha avuto lo stesso effetto (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Con altre diete a base di urina e di controllo (fresca, p = 0,0091; 72 ore, p = 0,0022; 168 ore, p = 0,001; saccarosio, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Gli effetti dell'alimentazione con urina e urea sui parametri riproduttivi sono stati valutati in bioassay di deposizione delle uova (Figura 4A) e sono stati studiati in base al numero di uova deposte da ciascuna femmina, alle dimensioni delle uova e alle larve di primo stadio appena schiuse. Il numero di uova deposte. Le femmine arabe alimentate con urina variavano in base alla dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Le femmine alimentate con un pasto di urina e sangue di 24 ore deponevano un numero significativamente maggiore di uova rispetto alle femmine alimentate con altre diete a base di urina ed erano simili a quelle alimentate con saccarosio (Fig. 4B). Allo stesso modo, le dimensioni delle uova deposte dalle femmine alimentate con urina variavano in base alla dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), con le femmine alimentate con urina e saccarosio per 24 ore che deponevano uova significativamente più grandi rispetto alle femmine alimentate con acqua, mentre le uova delle femmine alimentate con 168 ore di urina erano significativamente più piccole (Fig. 4C). Inoltre, la dieta a base di urina ha influenzato significativamente le dimensioni delle larve (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), con larve significativamente più grandi emerse dalle uova deposte da femmine alimentate con urina di 24 e 72 ore rispetto alle uova deposte da femmine alimentate con acqua e con urina per 168 ore (Figura 4D).
Prestazioni riproduttive di zanzare femmine di Anopheles arabinis alimentate con urina di mucca e urea. Zanzare femmine nutrite con sangue sono state alimentate con diete composte da urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O) per 48 ore prima di essere poste in bioassay e ottenere substrati per la deposizione delle uova 48 ore (A). Il numero di uova (B, E), le dimensioni delle uova (C, F) e le dimensioni delle larve (D, G) sono state influenzate significativamente dalla dieta fornita (urina di mucca: BD; urea: EG). Le medie per ciascun parametro misurato utilizzando nomi di lettere diversi erano significativamente diverse tra loro (ANOVA a una via utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media
Essendo il principale componente azotato dell'urina, l'urea, quando fornita come dieta alle femmine nutrite con sangue, ha influenzato significativamente i parametri riproduttivi in ​​tutti gli studi. Il numero di uova deposte dalle femmine nutrite con urea, dopo un pasto di sangue, a seconda della concentrazione di urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), le femmine nutrite con concentrazioni di urea comprese tra 134 µM e 1,34 mM hanno deposto più uova (Figura 4E). Le femmine nutrite con concentrazioni di urea pari o superiori a 134 µM depongono uova più grandi rispetto alle femmine nutrite con acqua (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F), e la dimensione delle larve, sebbene influenzata da concentrazioni simili di urea nelle madri (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) è risultata più variabile (Fig. 4G).
Attrazione complessiva verso gli estratti volatili dello spazio di testa dell'urina bovina in cerca di ospite. L'arabicina valutata nell'olfattometro a tubo di vetro (Fig. 5A) è stata significativamente influenzata dall'età dell'urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). L'analisi post hoc ha mostrato che l'odore di urina stantia a 24 ore ha causato livelli di attrattiva significativamente più elevati rispetto a tutti gli altri trattamenti (72 ore: p = 0,0060, 168 ore: p = 0,012, pentano: p = 0,00070), ad eccezione dell'odore di urina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Sebbene l'attrazione complessiva delle zanzare ematofaghe verso l'odore di urina non fosse significativamente diversa (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), queste femmine sono risultate significativamente più attraenti verso gli estratti volatili dello spazio di testa rispetto a quelli invecchiati 72 ore urina rispetto ai controlli (p = 0,0066; Figura 5C).
Risposte comportamentali agli odori naturali e sintetici di urina di mucca nella ricerca di Anopheles arabianus ospiti e ematofagi. Schema dell'olfattometro a tubo di vetro (A). Attrazione degli estratti volatili dello spazio di testa di urina di mucca fresca e invecchiata verso zanzare ospiti (B) ed ematofaghe (C). Trova la reazione dei tentacoli del Signore An. Sono mostrati gli estratti dello spazio di testa isolati da urina di mucca fresca (D), invecchiata per 24 ore (E), 72 ore (F) e 168 ore (G). Le tracce di rilevamento dell'antenna elettronica (EAD) mostrano le variazioni di tensione in risposta ai composti bioattivi nello spazio di testa eluiti dal gascromatografo e rilevati da un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). La barra di scala rappresenta l'ampiezza della risposta (mV) rispetto al tempo di ritenzione (s). Sono mostrate le proprietà e i tassi di rilascio (µg h-1) dei composti biologicamente attivi. Un singolo asterisco (*) indica una risposta costante a bassa ampiezza. I doppi asterischi (**) indicano risposte non riproducibili.Trova l'ospite (H) e l'insetto ematofago (I) An. arabiensis ha un'attrattiva diversa per miscele sintetiche di odori di urina di mucca fresca e invecchiata.Le proporzioni medie di zanzare attratte da nomi di lettere diversi erano significativamente diverse tra loro (ANOVA a una via con analisi post hoc di Tukey; p < 0,05).Le barre di errore rappresentano l'errore standard della scala
Nelle femmine di Ann. arabiensis, 72 e 120 ore dopo il pasto di sangue, durante la deposizione delle uova, non è stata mostrata alcuna preferenza per gli estratti volatili dello spazio di testa di urina di mucca fresca e invecchiata rispetto ai controlli con pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; File aggiuntivo 1: Fig. S1).
Per le femmine di Ann. arabiensis, le analisi GC-EAD e GC-MS hanno identificato otto, sei, tre e tre composti bioattivi (Figura 5D-G). Sebbene siano state osservate differenze nel numero di composti che hanno indotto risposte elettrofisiologiche, la maggior parte di questi composti era presente in ciascun estratto volatile dello spazio di testa raccolto da urina fresca e invecchiata. Pertanto, per ciascun estratto, solo i composti che hanno prodotto una risposta fisiologica dalle antenne femminili al di sopra della soglia sono stati inclusi nelle analisi successive.
Il tasso di rilascio totale di composti volatili bioattivi nella raccolta dello spazio di testa è aumentato da 29 µg h-1 nell'urina fresca a 242 µg h-1 nell'urina invecchiata per 168 ore, principalmente a causa di aumenti di p-cresolo e m-formaldeide. Al contrario, i tassi di rilascio di altri composti, come il 2-cicloesen-1-one e il decanale, sono diminuiti con l'aumentare dell'età dell'urina, il che è correlato con la diminuzione osservata dell'intensità del segnale (abbondanza) nel cromatogramma (Fig. 5D-G pannello di sinistra) e le risposte fisiologiche a questi composti (Fig. 5D-G pannello di destra).
Nel complesso, la miscela sintetica presentava un rapporto naturale simile di composti bioattivi identificati negli estratti volatili degli spazi di testa dell'urina fresca e invecchiata (Fig. 5D–G) e non sembrava suscitare un'attrazione significativa nella ricerca di un ospite (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) o di zanzare ematofaghe (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Tuttavia, i confronti a coppie post hoc tra i trattamenti hanno mostrato che le zanzare in cerca di un ospite erano significativamente attratte dalla miscela sintetica di urina invecchiata per 24 ore rispetto ai controlli con pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Per valutare il ruolo dei singoli componenti nelle miscele sintetiche di urina invecchiata per 24 ore, sei miscele sottrattive sono state valutate rispetto a miscele complete nel test a Y, in cui i singoli composti sono stati rimossi. Per le zanzare in cerca di ospite, la sottrazione dei singoli composti dalla miscela completa ha avuto un effetto significativo sulle risposte comportamentali (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; File supplementare 1: Figura S2A), tutte le miscele sottrattive erano più attraenti di quelle completamente mescolate. Al contrario, la rimozione dei singoli composti dalla miscela completamente sintetica non ha influenzato le risposte comportamentali delle zanzare ematofaghe (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), con l'eccezione del decanale, che ha determinato livelli inferiori rispetto alla miscela completa Attrazione (p = 0,022; File supplementare 1: Figura S2B).
In un villaggio endemico per la malaria in Etiopia, l'efficacia di una miscela sintetica di urina di mucca di 24 ore nell'attirare le zanzare in condizioni di campo è stata valutata per dieci notti (Fig. 6A). Sono state catturate e identificate un totale di 4.861 zanzare, di cui il 45,7% erano Anthropus gambiae sl, il 18,9% erano Anopheles pharoensis e il 35,4% erano Culex spp. (File aggiuntivo 1: Tabella S1). Anopheles arabinis è l'unico membro del complesso di specie An. Gambian identificato mediante analisi PCR. In media, sono state catturate 320 zanzare per notte, durante le quali le trappole con esche a base di miscela sintetica hanno catturato più zanzare rispetto alle trappole accoppiate senza miscela (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Trappole senza esca sono state posizionate in ciascuna delle cinque notti di controllo all'inizio, a metà e alla fine della prova. Numeri simili di Le zanzare sono state catturate in ogni coppia di trappole, indicando l'assenza di bias tra le case (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) e nessun declino della popolazione durante il periodo di studio. Rispetto alle trappole di controllo, il numero di zanzare catturate nelle trappole contenenti la miscela sintetica è aumentato significativamente: in cerca di ospite (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), con recente pasto di sangue (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e gravide (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; File aggiuntivo 1: Tabella S1). Ciò si riflette anche nel numero totale di zanzare catturate: in cerca di ospite > ematofaghe > gravide > semi-gravide > maschio.
Valutazione sul campo dell'efficacia di una miscela sintetica di odore di urina di mucca della durata di 24 ore. Le prove sul campo sono state condotte nell'Etiopia centro-meridionale (mappa), vicino alla città di Maki (riquadro), utilizzando una trappola luminosa dei Centers for Disease Control (CDC) (a destra) in case accoppiate, con un disegno a quadrato latino (immagine aerea) (A). Le fototrappole CDC con esca odorosa sintetica attraggono e catturano femmine di Anopheles arabesques (B), ma non di Anopheles farroes (C), in modo diverso, un effetto dipendente dallo stato fisiologico. Inoltre, queste trappole hanno catturato un numero significativamente maggiore di zanzare ospiti Culex. (D) Rispetto al controllo. Le barre a sinistra rappresentano l'indice di selezione medio delle zanzare catturate in coppie di trappole con esca odorosa (verde) e di controllo (vuote) (N = 10), mentre le barre a destra rappresentano l'indice di selezione medio in coppie di trappole di controllo (vuote; N = 5). Gli asterischi indicano i livelli di significatività statistica (*p = 0,01 e ***p < 0,0001)
Le tre specie sono state catturate in modo diverso nelle trappole contenenti miscele sintetiche. Alla ricerca dell'ospite (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), dell'alimentazione ematica (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e della gravidanza (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), un esemplare di .arabiensis è stato catturato nella trappola che rilasciava la miscela sintetica (Fig. 6B), mentre la quantità di An non differiva. Sono stati trovati esemplari di Pharoensis in diversi stati fisiologici (Fig. 6C). Per Culex, è stato trovato solo un aumento significativo del numero di zanzare alla ricerca di ospiti nelle trappole innescate con la miscela sintetica (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), rispetto alle trappole di controllo.
Sono state utilizzate trappole con esche per ospiti, posizionate al di fuori dei potenziali ospiti, tra i siti di riproduzione e le comunità rurali in Etiopia, per valutare se le zanzare della malaria utilizzino l'odore di urina di mucca come segnale dell'habitat dell'ospite. In assenza di segnali dell'ospite, calore e con o senza la presenza di odore di urina di mucca, non sono state catturate zanzare (File aggiuntivo 1: Figura S3). Tuttavia, in presenza di alta temperatura e odore di urina di mucca, le zanzare femmine della malaria sono state attratte e catturate, sebbene in numero ridotto, indipendentemente dall'età dell'urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; File aggiuntivo 1: Figura S3). Al contrario, i controlli con acqua non hanno catturato zanzare della malaria ad alte temperature (File aggiuntivo 1: Figura S3).
Le zanzare della malaria acquisiscono e distribuiscono composti contenenti azoto attraverso l'alimentazione compensativa con urina di mucca (cioè, pozzanghere) per migliorare le caratteristiche del ciclo vitale, in modo simile ad altri insetti [2, 4, 24, 25, 26]. L'urina di mucca è una risorsa rinnovabile facilmente disponibile, strettamente associata ai luoghi di riposo per i vettori della malaria, come stalle e vegetazione alta vicino alle case rurali e ai siti di riproduzione. Le zanzare femmine individuano questa risorsa tramite l'olfatto e sono in grado di regolare l'assorbimento di composti azotati nell'urina, inclusa l'urea, il principale componente azotato dell'urina [15, 16]. A seconda dello stato fisiologico della zanzara femmina, i nutrienti nell'urina vengono allocati per migliorare l'attività di volo e la sopravvivenza delle zanzare femmine in cerca di un ospite, nonché la sopravvivenza e le caratteristiche riproduttive degli individui che si nutrono di sangue durante il primo ciclo gonadotropico. Pertanto, la miscelazione dell'urina svolge un ruolo nutrizionale importante per i vettori della malaria che sono chiusi come gli adulti malnutriti [8], poiché fornisce alle zanzare femmine la capacità di acquisire importanti composti azotati impegnandosi nell'alimentazione a basso rischio. Questa scoperta ha significative conseguenze epidemiologiche, poiché le femmine aumentano la loro aspettativa di vita, l'attività e la capacità riproduttiva, tutti fattori che influenzano la capacità del vettore. Inoltre, questo comportamento potrebbe essere l'obiettivo di futuri programmi di gestione dei vettori.