Získávání a distribuce živin integruje vlastnosti hmyzího hledání potravy a životní historie. Aby se kompenzovaly nedostatky specifických živin v různých životních fázích, hmyz může tyto živiny získávat doplňkovým krmením, například krmením sekrety obratlovců v procesu známém jako louže. Zdá se, že komár Anopheles arabiani je podvyživený, a zda tedy potřebuje živiny pro tento metabolismus i rozmnožování.arabiensis agitace na kravské moči za účelem získání živin zlepšuje životní charakteristiky.
Ujistěte se, že je to bezpečné. Arabiensis byl přitahován pachem čerstvé, 24hodinové, 72hodinové a 168hodinové kravské moči a samice hledající hostitele a krmené krví (48 hodin po krmení krve) byly měřeny v olfaktometru Y-tube a těhotné samice byly hodnoceny pro biochemický test tření. Poté byla použita kombinovaná chemická a elektrofyziologická směs moči ve všech čtyřech věkových kategoriích. Množství bioaktivních látek bylo hodnoceno v Y-zkumavce a polních testech. Pro zkoumání kravské moči a její hlavní dusíkaté sloučeniny močoviny jako potenciální doplňkové stravy pro přenašeče malárie byly měřeny parametry krmení a životní charakteristiky. Byl hodnocen podíl samic komárů a množství kravské moči a absorbované močoviny. Po krmení byly samice hodnoceny z hlediska útěku, přežití a rozmnožování, byly uvázány.
Hledejte krev a výživu hostitele. V laboratorních a terénních studiích byli Arabové přitahováni přírodní a syntetickou vůní čerstvé a staré kravské moči. Těhotné samice byly lhostejné k reakcím kravské moči v místech tření. Samice hledající hostitele a sající krev sající samice aktivně absorbují kravskou moč a močovinu a přidělují tyto zdroje podle životního stavu nebo útěku pro funkci reprodukce nebo fyziologického přežití.
Anopheles arabinis získávání a distribuce kravské moči pro zlepšení životních charakteristik. Doplňkové krmení kravské moči ovlivňuje kapacitu vektorů přímo zvýšením denního přežití a hustoty vektorů a nepřímo změnou letové aktivity, a proto by mělo být uvažováno v budoucích modelech.
Získávání a distribuce živin integruje shánění potravy hmyzu a charakteristiky životní historie [1,2,3]. Hmyz je schopen vybírat a získávat potravu a provádět kompenzační krmení na základě dostupnosti potravy a požadavků na živiny [1, 3]. Distribuce živin závisí na procesu životní historie a může vést k různým požadavkům na kvalitu a množství potravy v různých životních fázích hmyzu [1, 2]. K získání těchto živin může hmyz prostřednictvím různých živin získat různé živiny, různé živiny, mohou kompenzovat různé živiny, různé živiny, mus exkrementy a sekrety obratlovců a mršiny, což je proces známý jako louže [2]. Ačkoli jsou primárně popsány různé druhy motýlů a můr, napajedla se vyskytují i ​​u jiných řádů hmyzu a přitažlivost k těmto druhům zdrojů a jejich krmení může mít významný vliv na zdraví a další rysy životní historie [2, 4, 5, 6] ambilasenso ambito 6. l) se objeví jako „podvyživený“ dospělý [8], takže zavlažování může hrát důležitou roli v jeho životních charakteristikách, ale toto chování bylo dosud zanedbáváno. Použití agitovanosti jako prostředku ke zvýšení příjmu živin v tomto důležitém vehikulu si zaslouží pozornost, protože to může mít závažné epidemiologické důsledky.
Příjem dusíku u dospělých samic komárů rodu Anopheles je omezený kvůli nízkým kalorickým rezervám přenášeným z larválního stadia a neefektivnímu využití krevní moučky [9]. Samice Ann.gambiae sl to obvykle kompenzuje doplňováním doplňkové krevní stravy [10, 11], čímž vystavuje více lidí riziku nakažení onemocněním a zvyšuje riziko komárů. výměšky tebrate získat dusíkaté sloučeniny, které zlepšují adaptaci a letovou manévrovatelnost, jak prokázal jiný hmyz [2]. V tomto ohledu je zajímavá silná a zřetelná přitažlivost jednoho ze sourozeneckých druhů v rámci An. The Gambie sl species complex, Anopheles arabinis, čerstvá a stařená kravská moč [12,13,14]. je zdroj bohatý na dusíkaté sloučeniny, přičemž močovina tvoří 50–95 % celkového dusíku v čerstvé moči [15, 16]. Jak kravská moč stárne, mikroorganismy využívají tyto zdroje ke snížení složitosti dusíkatých sloučenin do 24 hodin [15]. S rychlým nárůstem amoniaku, spojeným s poklesem organických dusíkatých látek na toxické mikroorganismy (1 alkalofilní) což může být žena Ann.arabiensis je přednostně přitahována močí ve věku 24 hodin nebo méně [13, 14].
V této studii se hledali hostitelé a krví krmení Ans. Během svého prvního gonadotropinového cyklu byla arabiensis hodnocena na získávání dusíkatých sloučenin, včetně močoviny, mícháním moči. Dále byla provedena řada experimentů, aby se zjistilo, jak samičky komárů přidělují tento potenciální zdroj živin pro lepší přežití, reprodukci a další hodnocení, zda byla hostiteli poskytnuta spolehlivá krev a pach čerstvé moči. .Při hledání tohoto potenciálního zdroje výživy objevili arabiensis chemické korelace za pozorovanou rozdílnou atraktivitou. Syntetické pachové směsi těkavých organických sloučenin (VOC) identifikované v moči staré 24 hodin byly dále hodnoceny v terénních podmínkách, rozšířily výsledky získané v laboratorních podmínkách a prokázaly vliv zápachu hovězí moči na různé fyziologické stavy.Přitahování komárů. Získané výsledky potvrzují, že An.arabiensis získává a distribuuje dusíkaté sloučeniny nalezené v moči obratlovců za účelem ovlivnění životních charakteristik. Tyto výsledky jsou diskutovány v kontextu potenciálních epidemiologických důsledků a jak je lze použít pro sledování a kontrolu vektorů.
Anopheles arabicans (kmen Dongola) byly udržovány při teplotě 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativní vlhkosti a cyklu světlo:tma 12:12 h. Larvy byly chovány v plastových miskách (20 cm × 18 cm × 7 cm) naplněných destilovanou vodou a krmeny Tetramin® rybím kelímkem, shromážděným No3up DE, mle. ila, Åstorp, SE) a poté přeneseny do klecí Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tchaj-wan), aby umožnily vzejití dospělých jedinců. Dospělým byl poskytnut 10% roztok sacharózy ad libitum až do 4 dnů po vzejití (dpe), v tomto okamžiku byly pokusným samicám bezprostředně před vyřazením nabídnuta voda, která byla předem vypuštěna, nebo byly přes noc nabídnuty samicám hledajícím dietu, jak je popsáno níže. Ale použitá pro experimenty s letovou trubicí byla hladověna pouze 4-6 hodin s vodou ad libitum. K přípravě komárů sajících krev pro následné biologické testy byla 4 dpe samičkám poskytnuta defibrotická ovčí krev (Håtunalab, Bro, SE) pomocí membránového krmného systému (Hemotek Discovery Workshops, Accrington a samice byly poté převedeny přímo na dietu Accrington a samice1, jak je popsáno níže, UK1). % sacharózy ad libitum po dobu 3 dnů před níže popsanými experimenty. Posledně jmenované samice byly použity pro biotesty v letové trubici a přeneseny do laboratoře a poté měly před experimentem destilovanou vodu ad libitum po dobu 4-6 hodin.
Krmné testy byly použity ke kvantifikaci spotřeby moči a močoviny u dospělých arabských samic. Samice hledající hostitele a krmené samice dostaly potravu obsahující 1 % zředěné čerstvé a odleželé kravské moči, různé koncentrace močoviny a dvě kontroly (10 % sacharózy a vody) po dobu 48 hodin. Kromě toho potravinářské barvivo (1 mg cyanid-17-1xylen) ch, Stockholm, SE) byla přidána do stravy a dodávána v matrici 4 × 4 v 250 µl mikrocentrifugačních zkumavkách (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; obrázek 1A) Naplňte po okraj (~300 µl). Abyste se vyhnuli konkurenci mezi komáry a potenciálním účinkům barvy barviva, umístěte do misky 10 a 2 cm velkého průměru komárů; gen, CH;Obrázek 1A) v úplné tmě při 25 ± 2 cm °C a 65 ± 5 % relativní vlhkosti. Tyto experimenty byly opakovány 5 až 10krát.Po vystavení dietě byli komáři umístěni do teploty -20 °C až do další analýzy.
Hledejte bovinní moč a močovinu absorbované hostitelem a samičkami Anopheles arabianus sajícími krev. V krmné studii (A) byla samičkám komárů poskytnuta strava skládající se z čerstvé a stařené kravské moči, různé koncentrace močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O). samice absorbovaly 72hodinovou kravskou moč méně než 168hodinovou kravskou moč (B). Průměrný celkový obsah dusíku (± směrodatná odchylka) v moči je uveden ve vložce. Samice hledající hostitele (D, F) a sající krev (E, G) vychytávají močovinu způsobem závislým na dávce. Průměrné vdechované objemy (D, E) pomocí různých názvů p. .05). Chybové úsečky představují standardní chybu průměru (BE). Rovná přerušovaná čára představuje logaritmickou lineární regresní čáru (F, G)
K uvolnění absorbované potravy byli komáři jednotlivě umístěni do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 230 ul destilované vody a tkáň byla rozrušena pomocí jednorázového tloučku a akumulátorového motoru (VWR International, Lund, SE), následovala centrifugace při 10 krpm po dobu 10 min. λ620) byla stanovena pomocí spektrofotometru založeného čtečky mikrodestiček (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativně byli komáři rozemleti v 1 ml destilované vody, z níž 900 ul bylo přeneseno do kyvety pro spektrofotometrickou analýzu, Kista, quanty, SE, 60 nm dieta, Todz; standardní křivka byla připravena sériovým ředěním za získání 0,2 ul až 2,4 ul 1 mg ml-1 xylenkyanidu. Poté byla optická hustota známých koncentrací barviva použita ke stanovení množství potravy, kterou každý komár pozřel.
Objemová data byla analyzována pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) následované Tukeyho post hoc párovým porovnáním (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). phPad Software, San Diego, CA, USA).
Přibližně 20 µl vzorků moči z každé věkové skupiny bylo navázáno na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) a zapouzdřeno do cínových kapslí (8 mm × 5 mm). podle protokolu výrobce. Celkový dusík (g N l-1) byl kvantifikován na základě známých koncentrací močoviny použité jako standard.
Pro posouzení vlivu diety na přežití samic hledajících hostitele a sající krev, byli komáři jednotlivě umístěni do velkých Petriho misek (12 cm v průměru a 6 cm na výšku; Semadeni) s otvorem pokrytým síťkou ve víku (3 cm v průměru) s ventilací a zásobováním potravinami. .Každá dieta byla napipetována na dentální tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) vložený do 5ml injekční stříkačky (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), píst byl odstraněn a umístěn na Petriho misku (obrázek 1).1A). Přežívání komárů krmených různými dietami bylo statisticky analyzováno pomocí Kaplan-Meyerových křivek přežití a log-rank testů pro porovnání distribuce přežití mezi jednotlivými dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Zakázkový mlýnek na létající komáry založený na Attisano et al.[17], vyrobený z 5 mm silných čirých akrylátových panelů (10 cm široký x 10 cm dlouhý x 10 cm vysoký) bez předních a zadních panelů (obr. 3: nahoře). Otočná sestava s vertikální trubkou vyrobenou z plynové chromatografické kolony (0,25 mm id; 7,5 cm od sebe vodorovný pár magnetů vyrobených z neodymových jehel z 9 cm lepených konců. stejný materiál (6,5 cm L) rozpůlil svislou trubici a vytvořil uvázané rameno a rameno, které neslo malý kousek hliníkové fólie jako signál přerušující světlo.
Samice hladovějící 24 hodin dostaly výše uvedenou dietu po dobu 30 minut před omezením. Plně krmené komáří samice byly poté jednotlivě anestetizovány na ledu po dobu 2-3 minut a připevněny k hmyzím špendlíkům včelím voskem (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) a poté byly zaznamenávány na horizontální zkumavky pomocí log.Fly of the custom. ger, poté uloženy a zobrazeny pomocí softwaru PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Letmý mlýn byl umístěn do místnosti s regulací klimatu (12 h: 12 h, světlo: tma, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RH).
Pro vizualizaci vzoru letové aktivity byla vypočtena celková uletěná vzdálenost (m) a celkový počet po sobě jdoucích letových aktivit za hodinu během 24hodinového období. Kromě toho byly průměrné vzdálenosti ulétané jednotlivými ženami porovnány mezi jednotlivými ošetřeními a analyzovány pomocí jednosměrné ANOVA a Tukeyho post hoc analýzy (JMP Pro, v14.0.0, kde průměrná vzdálenost byla považována za proměnnou, SAS Institute Inc., Ad). počet kol se počítá v 10minutových krocích.
Pro posouzení vlivu stravy na reprodukční výkonnost An.arabiensis bylo šest samic (4 dpe) po odběru krve přemístěno přímo do klecí Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) a poté jim byla poskytnuta experimentální strava po dobu 48 hodin, jak je popsáno výše. Diety byly odstraněny a misky na tření (30 ml; Nolato 20 Hertila byly naplněny každé 2 hodiny vody 48 hodin). hodin. Opakujte každý dietní režim 20–50krát. Vejce byla spočítána a zaznamenána pro každou experimentální klec. Dílčí vzorky vajec byly použity k posouzení průměrné velikosti a variace délky jednotlivých vajec (n ≥ 200 na dietu) pomocí mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, vybavený 20FC kamerou Leica; DE)Leica Microsystems Ltd., DE). Zbývající vajíčka byla držena v místnosti s řízenou teplotou za standardních podmínek chovu po dobu 24 hodin a byl změřen podvzorek nedávno vylíhnutých larev v 1. instaru (n ≥ 200 na dietu), jak je popsáno výše. Počet vajíček a velikost vajíček a larev (analýza s použitím Tukey post's1, AN.0AS1, AN.MP) byla porovnána Inc.).
Těkavé látky z horního prostoru z čerstvé (1 h po odběru), 24 h, 72 h a 168 h staré moči byly odebrány ze vzorků odebraných od dobytka Zebu, rasy Arsi. Pro pohodlí byly vzorky moči odebírány brzy ráno, když byly krávy ještě ve stáji. Vzorky moči byly odebrány od 10 jedinců a 100-200 ml každého vzorku z polyamidu Friesco Toppitch GmbH byly přeneseny Co., Minden, DE) ve 3 l polyamidu s víkem V plastových sudech z vinylchloridu. Těkavé látky v prostoru hlavy z každého vzorku bovinní moči byly sbírány buď přímo (čerstvé) nebo po zrání při pokojové teplotě po dobu 24 h, 72 h a 168 h, tj. každý vzorek moči byl reprezentativní pro každou věkovou skupinu.
Pro sběr těkavých látek v horním prostoru byl použit systém s uzavřenou smyčkou k cirkulaci proudu plynu filtrovaného aktivním uhlím (100 ml min-1) přes polyamidový sáček do adsorpční kolony po dobu 2,5 hodiny pomocí membránové vakuové pumpy (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Jako kontrola byl sběr headspace proveden z prázdné vany nebo z prázdného polyamidového sáčku obsahujícího 5 cm teflonu. 35 mg Porapaku Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mezi zátkami ze skleněné vaty. Před použitím byla kolona propláchnuta 1 ml redestilovaného n-hexanu (Merck, Darmstadt, DE) a 1 ml pentanu (rozpouštědlo o čistotě 99,0 % GC grade, Sigma. sbírky byly spojeny a poté skladovány při -20 °C až do použití pro další analýzu.
Behaviorální reakce těkavých extraktů An.Headspace, které hledají hostitele a požívají krev, odebrané z čerstvé, 24hodinové, 72hodinové a 168hodinové moči staré, byly analyzovány na těkavé extrakty z komárů Arabidopsis pomocí olfaktometru s rovnou skleněnou trubicí [18]. Experimenty byly prováděny během ZT 13-15. olfaktometr (80 cm × 9,5 cm id) byl osvětlen 3 ± 1 lx červeného světla shora. Proud vzduchu filtrovaný a zvlhčený dřevěným uhlím (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativní vlhkost) prošel biotestem při 30 cm s-1. cm; L:D; DAB Dental AB), zavěšené na 5 cm cívce na návětrném konci olfaktometru, se stimulátorem se mění každých 5 minut. K analýze bylo jako stimul použito 10 μl každého extraktu z headspace, zředěného 1:10. Předtím bylo použito stejné množství pentanu jako kontrola. Individuální vyhledávání hostitelů bylo zahájeno hledáním komárů nebo vypouštěním krve do 3 hodin. uvolňovací klec byla umístěna na povětrnou stranu čichometru a komáři se nechali aklimatizovat po dobu 1 minuty a poté se otevřel motýlkový ventil klece, aby se uvolnil. Přitažlivost k ošetření nebo kontrole byla analyzována jako podíl komárů, kteří přišli do kontaktu se zdrojem do 5 minut po vypuštění. Každý headspace se vyhnul těkavým účinkům při každém ošetření a kontrolám se opakoval stejný počet kontrol a kontrola byly opakovány alespoň 30krát. Byly testovány každý experimentální den. Reakce na hledání od hostitele a krve krmených Ans. Arabské versus headspace sady byly analyzovány pomocí nominální logistické regrese následované párovým porovnáním pro liché poměry (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Reakce An na tření. Extrakty z čerstvé a staré kravské moči byly analyzovány v klecích Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). ředění 1:10. Stejné množství pentanu bylo použito k úpravě kontrolního kelímku. Ošetřovací a kontrolní kelímky byly mezi každým experimentem vyměněny, aby se kontrolovaly účinky na polohu. Deset samic krmených krví bylo vypuštěno do experimentálních klecí v ZT 9-11 a vejce v kelímcích byla spočítána o 24 hodin později. Vzorec pro výpočet počtu vajíček počet vajíček/ počet nakladených vajíček v kelímku je celkem: snesená vajíčka). Každé ošetření bylo opakováno 8krát.
Analýza plynové chromatografie a detekce vzoru elektronové antény (GC-EAD) u samice An. arabiensis byla provedena, jak bylo popsáno dříve [20]. Stručně řečeno, čerstvé těkavé extrakty z horního prostoru byly separovány pomocí Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) vybavené kolonou HP-5 (30 m × 0,25 m tloušťka filmu Agil Technologie, 5 mm id).a stárnoucí moč. Jako mobilní fáze byl použit vodík s průměrným lineárním průtokem 45 cm s-1. Každý vzorek (2 μl) byl vstřikován po dobu 30 sekund v splitless režimu se vstupní teplotou 225 °C. Teplota GC pece byla naprogramována od 35 °C (3 minuty zadržování) do 300 °C při 10 minutách oddělování 10 minut. dusíku bylo přidáno a rozděleno 1:1 v Gerstel 3D/2 kříži s nízkým mrtvým objemem (Gerstel, Mülheim, DE) mezi plamenově ionizačním detektorem a EAD. GC odtoková kapilára pro EAD byla vedena přes přenosovou linku Gerstel ODP-2, která sleduje teplotu GC pece plus 5 °C, do skleněné trubice s 10 mm filtrem a 10 cm filtrovaného uhlíkem (10 cm filtru). min-1). Anténa byla umístěna 0,5 cm od výstupu z trubice. Každý jednotlivý komár představoval jeden replikát a pro komáry hledající hostitele byly provedeny alespoň tři replikáty na vzorcích moči každého věku.
Identifikace bioaktivních sloučenin v headspace sbírkách čerstvé a zestárlé bovinní moči pomocí kombinovaného GC a hmotnostního spektrometru (GC-MS; 6890 GC a 5975 MS; Agilent Technologies) k vyvolání anténních odezev v analýze GC-EAD, pracující v režimu ionizace elektronovým nárazem při 70 eV a kolona s taveným 0 HP 0m × 5MS oxidem křemičitým 0UI byla vybavena 6 víčkem oxidu křemičitého-5MS 0UI 0,25 mm vnitřní průměr, tloušťka filmu 0,25 μm) s použitím helia jako mobilní fáze s průměrným lineárním průtokem 35 cm s-1. Vzorek o objemu 2 μl byl vstříknut za použití stejného nastavení injektoru a teploty pece jako pro analýzu GC-EAD. Sloučeniny byly identifikovány na základě jejich retenčního času (index Kovát) a autentické sloučeniny v knihovně hmotnostních spekter byly porovnány s NIST4Agil. (Dodatečný soubor 1: Tabulka S2). Pro kvantifikaci byl jako externí standard injikován heptylacetát (10 ng, 99,8% chemická čistota, Aldrich).
Hodnocení účinnosti syntetické pachové směsi skládající se z bioaktivních sloučenin identifikovaných v čerstvé a zestárlé moči k přilákání Ans.arabiensis hledajícího hostitele a sající krev pomocí stejného čichometru a protokolu jako výše. Syntetické směsi napodobovaly složení a proporce sloučenin ve smíšených těkavých extraktech z horního prostoru čerstvého, 24hodinového, 72-hodinového a 18hodinového, 5D-8hodinového a 16hodinového věku moči Dodatečný soubor 1: Tabulka S2). K analýze použijte 10 μl plně syntetické směsi zředěné 1:100 s celkovou rychlostí uvolňování v rozmezí přibližně 140-2400 ng h-1 pro posouzení atraktivity pro hostitele a komáry sající krev. Poté se test provádí na kompletních směsích hostitele a odebraných kompletních směsích krve, ze kterých se odeberou jednotlivé směsi odebrané krve. Arabské versus syntetické a subtraktivní směsi byly analyzovány pomocí nominální logistické regrese následované párovým porovnáním pro liché poměry (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby bylo možné posoudit, zda by kravská moč mohla sloužit jako stanoviště hostitele pro maláriové komáry, čerstvá a stařená kravská moč, shromážděná, jak je popsáno výše, a voda byly umístěny do síťovaných 3l kbelíků (100 ml) a umístěny do pastí s návnadou hostitele.(verze BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Deset pastí umístěných 50 m od sebe na pastvině, 400 m od vesnické komunity (Silay, Etiopie, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) a žádný dobytek, na stálých hnízdištích a vesnicích se střídalo pět pastí. d každou noc po celkem pět nocí. Počty komárů zachycených v pastích nastražených močí různého stáří byly porovnány pomocí logistické regrese s beta binomickým rozdělením (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Ve vesnici s endemickým výskytem malárie poblíž města Maki, region Oromia, Etiopie (8° 11′ 08″ s. š., 38° 81′ 70″ v. d.; obrázek 6A). Studie byla provedena od poloviny srpna do poloviny září před každoročním vnitřním zbytkovým postřikem, spolu s 05.05.2005 dlouhými deštivými domy umístěnými na 05.05. pro studii byla vybrána vesnice (obr. 6A). Kritéria použitá pro výběr domů byla: v domě není povolena žádná zvířata, nebylo povoleno vaření v interiéru (tasení palivového dříví nebo dřevěného uhlí) (alespoň během zkušební doby) a domy s maximálně dvěma obyvateli, které spaly v neinsekticidech.pod ošetřenou moskytiérou. Etické schválení bylo uděleno Radou pro hodnocení etiky institucionálního výzkumu (IRB/022/2016) Fakulty přírodních věd (CNS-IRB), Univerzita Addis Abeba, v souladu se směrnicemi stanovenými Deklarací Světové lékařské asociace z Helsinek. Souhlas od každé hlavy domácnosti byl získán místní správou celého okresu a vedoucího zdravotnického personálu na konci belgického oddělení Experimentální design se řídil 2 × 2 latinským čtvercovým designem, ve kterém byly syntetické směsi a kontroly přiřazeny párovým domům první noc a vyměněny mezi domy další experimentální noc. Tento proces se opakoval desetkrát. Navíc, aby se odhadla aktivita komárů ve vybraných domech, byly pasti CDC nastaveny tak, aby běžely pět po sobě jdoucích nocí na začátku, uprostřed a na konci polního pokusu.
Syntetická směs obsahující šest bioaktivních sloučenin byla rozpuštěna v heptanu (97,0% rozpouštědlo GC grade, Sigma Aldrich) a uvolňována při 140 ng h-1 pomocí dávkovače bavlněného knotu [20]. Dávkovač knotu umožňoval uvolňování všech sloučenin v konstantních poměrech během 12hodinového experimentu. Heptan byl použit jako kontrola. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Obrázek 6A). Pasti byly zavěšeny 0,8 – 1 m nad zemí, blízko nohou postele, a dobrovolník spal pod neošetřenou moskytiérou a operoval mezi 18:00 a 06:30. Komáři odchyceni podle pohlaví a fyziologického stavu (nekrmení, krmení, krmení pomocí CR2, těhotná reakce 1 polymerasemi) identifikovat druhy morfologicky identifikované jako A. gambiae sl. Členové komplexu [23] V terénní studii bylo odchytávání párových domů analyzováno pomocí nominálního modelu logistického přizpůsobení, kde přitažlivost byla závislou proměnnou a léčba (syntetická směs versus kontrola) byla fixním efektem (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.).Zde uvádíme hodnoty χ2 a p z testu poměru pravděpodobnosti.
Vyhodnoťte, zda je bezpečný. Arabiensis byl schopen získat moč, svůj hlavní zdroj dusíku, močovinu, přímým krmením, během 48 hodin po podání po dobu 4 dnů po (dpe) pokusech s hledáním hostitele a krmením samicemi krmenými krví (obr. 1A). (5 299) = 56,00, p < 0,0001, v tomto pořadí, obr. 1B,C). Kromě toho ženy hledající hostitele jedly méně moči za 72 hodin ve srovnání s močí za 168 hodin (obr. 1B). 10 % sacharózy (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; obrázek 1D). To bylo v rozporu s odpovědí krví krmených žen, které typicky absorbovaly významně více stravy obsahující močovinu než vodu. navíc při srovnání dvou fyziologických stavů flebotomizované samice absorbovaly více močoviny než samice hledající hostitele v nejnižších koncentracích a tyto samice absorbovaly podobná množství močoviny ve vyšších koncentracích (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001;Obr. 1F, G). Zatímco příjem ze stravy obsahující močovinu se zdál mít optimální hodnoty (obr. 1D,E), ženy v obou fyziologických stavech byly schopny modulovat množství absorbované močoviny v celém rozsahu koncentrací močoviny log-lineárním způsobem (obr. 1F,G).Podobně se zdá, že komáři kontrolují příjem dusíku regulací množství absorbované moči, protože množství dusíku v moči se odráží v absorbovaném množství (obrázek 1B, C a B vložky).
Aby bylo možné posoudit účinky moči a močoviny na přežití komárů vyhledávajících hostitele a sajících krev, byly samice krmeny močí všech čtyř věkových kategorií (čerstvá, 24 hodin, 72 hodin a 168 hodin po depozici) a rozsah koncentrací močoviny, stejně jako destilovaná voda a 10% sacharóza prokázaly významný účinek na přežití samic-2A. moč: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; močovina: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; obr. 2B, C) a krví krmené ženy (moč: χ2 = 93,0; 0,0, 010, df 37,9, df = 5, p < 0,0001; Obrázek 2D,E). Ve všech experimentech měly samice krmené potravou z moči, močoviny a vody významně nižší míru přežití ve srovnání se ženami krmenými sacharózovou stravou (obrázek 2B-E). Samice hledající hostitele krmené čerstvou a zatuchlou močí (ty, které měly 72 zatuchlou moč, vykazovaly nejnižší pravděpodobnost přežití 72). Obr. 2B). Kromě toho samice hledající hostitele krmené 135 mM močovinou přežily déle než vodní kontroly (p < 0,04) (obr.2C).Ve srovnání s vodou přežily ženy krmené čerstvou močí a 24hodinovou močí déle (p = 0,001 a p = 0,012, v tomto pořadí; obrázek 2D), zatímco ženy krmené 72hodinovou močí přežily déle než ženy krmené krátkou čerstvou močí a 24hodinovou močí (p < 0,00001 a p = 15mM1; močoviny, krví krmené samice přežily déle než všechny ostatní koncentrace močoviny a vody (p < 0,013; obrázek 2E).
Přežití hostitelské a krev sající samice Anopheles arabinis, která se živí kravskou močí a močovinou. V biologickém testu (A) byla samičkám komárů poskytnuta strava skládající se z čerstvé a stařené kravské moči, různých koncentrací močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O). jsou krmeny močí (B, D) a močovinou (C, E) a kontroly, sacharóza a voda, jsou mrtvé
Celková vzdálenost a počet kol zjištěných v testu letového mlýna během 24hodinového období se lišily mezi komáry hledajícími hostitele a komáry sajícími krev, kteří vykazovali celkově nižší letovou aktivitu (obr. 3). Komáry hledající hostitele, kteří poskytovali čerstvou a stařenou moč nebo sacharózu a vodu, vykazovali odlišné vzorce letu (obr. 3), přičemž samice krmící čerstvou močí 16 byly aktivnější, zatímco mosquito 4h bylo aktivnější. komáři, kteří se živili močí, vykazovaly různé vzory letu a byly primárně denní. Samice komárů, které poskytovaly sacharózu nebo 72hodinovou moč, vykazovaly aktivitu po celých 24 hodin, zatímco samice, které poskytovaly vodu, byly aktivnější během střední periody. Komáři krmení sacharózou vykazovali nejvyšší úroveň aktivity pozdě v noci a ve věku 7-2 hodin ráno, zatímco ve věku 7-4 hodin ráno, komáři měli pokles aktivity. (Obrázek 3).
Letový výkon lovecky vyhledávající samice Anopheles arabinis krmící se kravskou močí a močovinou. V testu letového mlýna byly samice komárů krmeny čerstvou a odleželou kravskou močí, různými koncentracemi močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O) připoutány k horizontálním, volně se otáčejícím ramenům hostitele (volně se otáčející abft) na krev. byla zaznamenávána vzdálenost a počet letů za hodinu pro každou dietu za 24 hodin (tmavá: šedá; světlá: bílá). Průměrná vzdálenost a průměrný počet zápasů jsou zobrazeny vpravo od grafu cirkadiánní aktivity. Chybové úsečky představují standardní chybu průměru. Statistická analýza viz text
Obecně platí, že celková letová aktivita samic hledajících hostitele se řídila vzorem podobným letové vzdálenosti během 24hodinového období. Průměrná letová vzdálenost byla významně ovlivněna požitou stravou (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001) a samice hledající hostitele požily 72 hodin moči, uletěly výrazně delší vzdálenosti (všechny jiné diety uletěly – 1 susp00. prsty na nohou létaly déle než čerství (p = 0,022) a 24hodinoví komáři krmení močí (p = 0,022). Na rozdíl od vzoru letové aktivity popsaného močovou dietou vykazovaly samice krmené močovinou, hledající hostitele, trvalou letovou aktivitu po dobu 24 hodin, přičemž vrcholily během druhé poloviny období hledání hostitele, průměrná aktivita u samic se výrazně zvýšila, průměrná aktivita u samic f 3Alth Obr. vzdálenost v závislosti na absorbované koncentraci (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice hledající hostitele krmené libovolnou koncentrací močoviny létaly déle než samice krmené vodou nebo sacharózou (p < 0,03).
Celková letová aktivita komárů sajících krev byla stabilní a trvala po dobu 24 hodin napříč všemi dietami, se zvýšenou aktivitou moči během druhé poloviny období tmy u samic krmených vodou i u čerstvě krmených a 24 hodin starých samic (obrázek 3). Zatímco močová dieta významně ovlivňovala průměrnou vzdálenost letu u samic krmených krví (F(5, 04 p. 138), dieta = a dieta 040.0838) 5, 138) = 1,36, p = 0,24) s jinou močí a kontrolní dietou (čerstvá, p = 0,0091; 72 hodin, p = 0,0022; 168 hodin, p = 0,001; sacharóza, p = 0,0017; p = dH03).
Účinky krmení močí a močovinou na reprodukční parametry byly hodnoceny v biologických testech kladení vajíček (obrázek 4A) a byly zkoumány podle počtu vajíček snesených každou samicí, velikosti vajíček a nově vylíhnutých larev v prvním instaru. 24hodinová moč, krevní moučka snesla podstatně více vajíček než samice krmené jinou močí a byly podobné těm, které krmily sacharózou (obr. 4B). Stejně tak se velikost vajíček snesených močí krmenými samicemi lišila podle stravy (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), přičemž samice snášely vejce za 24 hodin v moči a samice krmené sacharózou byly výrazně větší než samice. krmené 168 h moči byly výrazně menší (obr. 4C). Kromě toho močová strava významně ovlivňovala velikost larev (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), přičemž z vajíček nakladených 24- a 72hodinovými samicemi krmenými močí se vylézaly podstatně větší larvy než z vajíček snesených od vajíček krmených 1 vajíčky a 1 larvami krmenými močí.
Reprodukční výkonnost samic Anopheles arabinis krmených kravskou močí a močovinou. Krví krmené samice komárů byly krmeny stravou skládající se z čerstvé a stařené kravské moči, různých koncentrací močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O) po dobu 48 hodin před umístěním do biologických testů a stanovení velikosti vajec C, F48 hodin. velikost larev (D, G) byla významně ovlivněna poskytovanou stravou (kravská moč: BD; močovina: EG). Průměry pro každý parametr měřený pomocí různých názvů písmen se od sebe významně lišily (jednosměrná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky představují standardní chybu průměru
Jako hlavní dusíkatá složka moči močovina, pokud byla podávána jako potrava krví krmeným samicím, významně ovlivňovala reprodukční parametry ve všech studiích. Počet vajíček snesených samičkami krmenými močovinou po krevní moučce v závislosti na koncentraci močoviny (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice snesené vajíčky více mezi 13 µM a 13 µM koncentrace močoviny. E). Samice krmené močovinou o koncentracích 134 µM nebo vyšší kladou větší vajíčka než samice krmené vodou (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; obrázek 4F) a velikost larev, ačkoli ovlivněna podobnými koncentracemi močoviny u matek (F(10, 307.5) byla více variabilní; 0 p < 309.04. G).
Celková přitažlivost k těkavým extraktům z horního prostoru bovinní moči hledající hostitele. Arabiensis hodnocená v olfaktometru se skleněnou trubicí (obr. 5A) byla významně ovlivněna stářím moči (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; obr. 5B). Analýza post hoc ukázala, že zatuchlý zápach moči ve srovnání se všemi ostatními úrovněmi přitažlivosti za 24 hodin způsobil významně = 72 až 06 hodin přitažlivosti 0, 168 hodin: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), s výjimkou zápachu čerstvé moči (p = 0,13; obrázek 5B). Přestože celková přitažlivost komárů sajících krev k zápachu moči nebyla významně odlišná (χ2 = 8,78, p5 až df 0,6 byly zjištěny výrazně více u žen. těkavé extrakty v prostoru hlavy ve srovnání se 72hodinovou močí ve srovnání s kontrolami (p = 0,0066; obrázek 5C).
Behaviorální reakce na přirozené a syntetické pachy kravské moči při hledání hostitele a krví krmeného Anopheles arabianus. Schéma skleněného trubicového olfaktometru (A). Přitahování těkavých extraktů z čerstvého a starého kravského moči k hostiteli (B) a krev sajícím (C) komárům, 72-hodinová izolovaná reakce hlavy od Lorda An.E. Jsou zobrazeny F) a 168 hodin (G) stará kravská moč. Stopy detekce elektronové antény (EAD) ukazují změny napětí v reakci na bioaktivní sloučeniny v headspace eluované z plynového chromatografu a detekované plamenovým ionizačním detektorem (FID). Stupnice představuje amplitudu odezvy (mV) proti nízkému retenčnímu času (s). Vlastnosti a konzistentní rychlosti uvolňování (µg. aktivních sloučenin) jsou znázorněny (µg. h.) A. odpověď.Dvojité hvězdičky (**) označují nereprodukovatelné odpovědi.Najděte hostitele (H) a krev sajícího (I) An.arabiensis má různé přitažlivosti pro syntetické směsi čerstvé a staré kravské moči. Průměrné podíly komárů přitahovaných různými názvy písmen se od sebe výrazně lišily (jednosměrná ANOVA pomocí Tukeyho post hoc analýzyp < 0,05). Chybové úsečky představují standardní chybu stupnice
Samice Ann.arabiensis, 72 h a 120 h po krevní moučce, během tření, nebyla prokázána žádná preference pro těkavé extrakty v prostoru nad hlavou z čerstvé a staré kravské moči ve srovnání s pentanovými kontrolami (χ2 = 3,07, p > 0,05; Další soubor 1: Obr. S1).
U samic Ann.arabiensis, GC-EAD a GC-MS analýzy identifikovaly osm, šest, tři a tři bioaktivní sloučeniny (obrázek 5D-G). Přestože byly pozorovány rozdíly v počtu sloučenin, které vyvolaly elektrofyziologické odezvy, většina těchto sloučenin byla přítomna v každém headspace těkavý extrakt odebraný z čerstvé a staré moči. Proto u každého extraktu byly pouze další sloučeniny ze samičích výše uvedených látek, které produkovaly fyziologickou odezvu.
Celková rychlost uvolňování těkavých látek bioaktivních sloučenin ve sbírce headspace se zvýšila z 29 µg h-1 v čerstvé moči na 242 µg h-1 v moči staré 168 hodin, hlavně díky nárůstu p-kresolu a m-formaldehydu Fenol se zvyšuje, stejně jako fenolu. undance) na chromatogramu (obr. 5D)-G levý panel) a fyziologické odpovědi na tyto sloučeniny (obr. 5D-G pravý panel).
Celkově měla syntetická směs podobný přirozený poměr bioaktivních sloučenin identifikovaných v těkavých výtažcích z čerstvé a zestárlé moči (obr. 5D–G) a nezdálo se, že by vyvolala významnou přitažlivost při hledání hostitele (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; obr. 5H) nebo krev sajícího komára = 4fdχ23 = p9dχ24 = komár. 0, obr. 5I). Nicméně post hoc párová srovnání mezi ošetřeními ukázala, že komáři hledající hostitele byli významně atraktivní pro syntetickou směs 24 hodin staré moči ve srovnání s kontrolami s pentanem (p = 0,0086; obrázek 5H).
Pro posouzení úlohy jednotlivých složek v syntetických směsích 24hodinové moči bylo hodnoceno šest subtraktivních směsí oproti kompletním směsím v testu Y-tube, ve kterém byly jednotlivé sloučeniny odstraněny. U komárů hledajících hostitele mělo odečtení jednotlivých sloučenin od kompletní směsi významný vliv na behaviorální reakce (χ2 = 19,63, df: vše 0.2A soubor), další obrázek = 1:203 soubor S2 A byly atraktivnější než Menší než plně smíšené. Naproti tomu odstranění jednotlivých sloučenin z plně syntetické směsi neovlivnilo behaviorální reakce komárů sajících krev (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s výjimkou dekanalu, což vedlo k nižším hladinám ve srovnání s kompletní směsí Attraction (p = 1 B0).
Ve vesnici s endemickým výskytem malárie v Etiopii byla po dobu deseti nocí hodnocena účinnost syntetické směsi 24hodinové kravské moči při přitahování komárů v polních podmínkách (obr. 6A). pp. (Dodatečný soubor 1: Tabulka S1).Anopheles arabinis je jediným členem an.Gambijského druhového komplexu identifikovaného analýzou PCR.V průměru bylo zachyceno 320 komárů za noc, během této doby pasti se syntetickými směsnými návnadami zachytily více komárů než párové pasti bez směsi (χ2(0, 310109.06) = p.0. nastaveno na každou z pěti kontrolních nocí na začátku, uprostřed a na konci pokusu.Podobné počty komárů byly zachyceny v každém páru pastí, což ukazuje, že mezi domy nedochází k žádné odchylce (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) a nedošlo k poklesu populace během období studie. Ve srovnání s chycenými syntetickými pastmi na komáry se počet chycených hostitelů významně zvýšil,χ 2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedávné krmení krví (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) a těhotenství (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123;Dodatečný soubor 1: Tabulka S1). To se také odráží v celkovém počtu zachycených komárů: hostitel vyhledávající > krev sající > těhotná > polotěhotná > samec.
Terénní hodnocení účinnosti 24hodinové syntetické směsi pachu kravské moči. Terénní zkoušky byly provedeny v jižní centrální Etiopii (mapa), poblíž města Maki (vložit), s použitím světelné pasti Centra pro kontrolu nemocí (CDC) (vpravo) v párových domech s latinským čtvercovým designem (letecký snímek) (A). Anopheles farroes (C), jiným způsobem, efekt závislý na fyziologickém stavu. Kromě toho tyto pasti zachytily výrazně zvýšený počet hostitelských komárů Culex.(D) Ve srovnání s kontrolou. Sloupky vlevo představují průměrný index selekce komárů chycených v párech pachové návnady (zelená) a kontrolní (otevřené) indexy pastí (N = 10), zatímco průměr otevřených pruhů v páru kontroly 5 představují pasti;).Hvězdičky označují hladiny statistické významnosti (*p = 0,01 a ***p < 0,0001)
Tyto tři druhy byly zachyceny odlišně v pastích obsahujících syntetické směsi. Hledání hostitele (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), krmení krví (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) a březost (χ2(1, 1801) was3ped thearab = p.6ien past uvolňující syntetickou směs (Obr. 6B), zatímco množství An se nelišilo. Byly nalezeny Pharoensis v různých fyziologických stavech (Obr. 6C). U Culexu byl zjištěn pouze významný nárůst počtu komárů hledajících hostitele v pastích nastražených syntetickou směsí (χ2(1,1319) = 12,6, ve srovnání s kontrolou p. D. = 0. Obr.
Pasti na hostitelské návnady umístěné mimo potenciální hostitele mezi místy rozmnožování a venkovskými komunitami v Etiopii byly použity k posouzení, zda komáři malárie používají pach kravské moči jako narážku hostitelského stanoviště. V nepřítomnosti hostitelských podnětů, tepla a s nebo bez přítomnosti zápachu kravské moči nebyli zachyceni žádní komáři (Dodatečný soubor 1: Zachycená vysoká teplota a mosky u samic coquirie byly přitahovány přítomností samic a coquitowrie). v malých počtech, nezávisle na věku moči (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Doplňkový soubor 1: Obrázek S3). Naproti tomu vodní kontroly nezachytily komáry malárie při vysokých teplotách (Dodatečný soubor 1: Obrázek S3).
Maláričtí komáři získávají a distribuují sloučeniny obsahující dusík kompenzačním krmením kravskou močí (tj. kalužemi), aby se zlepšily životní vlastnosti, podobně jako u jiného hmyzu [2, 4, 24, 25, 26]. Kravská moč je snadno dostupný obnovitelný zdroj úzce spojený s místy odpočinku pro přenašeče malárie, jako jsou venkovská vegetaceFemalecates mosquis a sp. tento zdroj čichem a jsou schopny regulovat příjem dusíkatých sloučenin v moči, včetně močoviny, hlavní dusíkaté složky v moči [15, 16]. V závislosti na fyziologickém stavu samic komárů jsou živiny v moči přidělovány tak, aby zlepšily letovou aktivitu a přežití samic komárů hledajících hostitele, stejně jako přežití a reprodukční vlastnosti u jedinců krmených krví, které hrají důležitou roli při míšení krve u jedinců s krví krmenou krví anotropní výživa. jsou uzavřeni jako podvyživení dospělí [8], protože poskytuje samicím komárů schopnost získat důležité dusíkaté sloučeniny zapojením se do nízkorizikového krmení. Toto zjištění má významné epidemiologické důsledky, protože samice prodlužují délku života, aktivitu a reprodukční výkon, což vše ovlivňuje kapacitu vektorů. Kromě toho může být toto chování cílem budoucích programů řízení vektorů.