LC sorun giderme konularından bazıları asla eskimez, çünkü cihaz teknolojisi zamanla gelişse bile LC uygulamalarında sorunlar devam etmektedir. Bir LC sisteminde sorunların ortaya çıkmasının ve kötü tepe şekline yol açmasının birçok yolu vardır. Tepe şekliyle ilgili sorunlar ortaya çıktığında, bu sonuçların olası nedenlerinin kısa bir listesi, sorun giderme deneyimimizi basitleştirmeye yardımcı olur.
Bu “LC Sorun Giderme” köşesini yazmak ve her ay konular hakkında düşünmek eğlenceliydi, çünkü bazı konular asla modası geçmiyor. Kromatografi araştırmaları alanında bazı konular veya fikirler, daha yeni ve daha iyi fikirlerle yer değiştirdikçe geçerliliğini yitirirken, sorun giderme alanında, bu dergide (o zamanlar LC Dergisi) ilk sorun giderme makalesinin 1983'te yayınlanmasından bu yana (1), bazı konular hala geçerliliğini koruyor. Son birkaç yıldır, LC Sorun Giderme bölümlerinin birçoğunu sıvı kromatografisini (LC) etkileyen çağdaş trendlere (örneğin, basıncın tutunma üzerindeki etkisine ilişkin anlayışımızın göreceli karşılaştırması [2] Yeni Gelişmeler) ve LC sonuçlarının yorumlanmasına ve modern LC cihazlarıyla nasıl sorun giderileceğine odakladım. Bu ayki yazımda, Aralık 2021'de başlayan ve LC sorun gidermenin "hayat ve ölüm" konularından bazılarına odaklanan serime (3) devam ediyorum - kullandığımız sistemin yaşı ne olursa olsun, herhangi bir sorun giderici için harika olan unsurlar önemlidir. Bu yazının temel konusu... Bu seri, birçok laboratuvarda asılı olan LCGC'nin ünlü "LC Sorun Giderme Kılavuzu" duvar tablosu (4) ile oldukça alakalıdır. Bu serinin üçüncü bölümü için, tepe şekli veya tepe özellikleri ile ilgili sorunlara odaklanmayı seçtim. İnanılmaz bir şekilde, duvar tablosu kötü tepe şeklinin 44 farklı olası nedenini listeliyor! Bu sorunların hepsini tek bir makalede ayrıntılı olarak ele alamayız, bu nedenle bu konudaki ilk bölümde, en sık gördüklerimden bazılarına odaklanacağım. Umarım genç ve yaşlı LC kullanıcıları bu önemli konuda bazı yararlı ipuçları ve hatırlatmalar bulurlar.
Sorun giderme sorularına giderek daha sık "her şey mümkün" diye yanıt verdiğimi fark ediyorum. Bu yanıt, yorumlanması zor gözlemler düşünüldüğünde kolay gibi görünse de, çoğu zaman uygun olduğunu düşünüyorum. Kötü tepe şeklinin birçok olası nedeni varken, sorunun ne olabileceğini düşünürken açık fikirli olmak ve sorun giderme çabalarımıza başlamak için potansiyel nedenleri önceliklendirebilmek, en yaygın olasılıklara odaklanmak çok önemlidir.
Herhangi bir sorun giderme egzersizinde önemli bir adım -ancak bence hafife alınan bir adım- çözülmesi gereken bir sorun olduğunu fark etmektir. Bir sorun olduğunu fark etmek, genellikle alete olanların, teori, ampirik bilgi ve deneyimle şekillenen beklentilerimizden farklı olduğunu fark etmek anlamına gelir (5). Burada bahsedilen "tepe şekli" aslında sadece tepenin şeklini (simetrik, asimetrik, düz, kabarık, ön kenar, kuyruk vb.) değil, aynı zamanda genişliğini de ifade eder. Gerçek tepe şekline ilişkin beklentilerimiz basittir. Teori (6), çoğu durumda kromatografik tepelerin simetrik olması ve Şekil 1a'da gösterildiği gibi bir Gauss dağılımının şekline uyması gerektiği yönündeki ders kitabı beklentisini iyi bir şekilde destekler. Tepe genişliklerinden ne beklediğimiz daha karmaşık bir konudur ve bu konuyu gelecekteki bir makalede ele alacağız. Şekil 1'deki diğer tepe şekilleri, gözlemlenebilecek diğer olasılıklardan bazılarını -yani, işlerin ters gidebileceği bazı yolları- göstermektedir. Bu bölümün geri kalanında, Bu şekil tiplerine yol açabilecek bazı spesifik durum örneklerini tartışmak için zaman ayırın.
Bazen, kromatogramda, elüsyona uğramaları beklenen yerlerde hiç pik gözlemlenmez. Yukarıdaki duvar şeması, bir pikin yokluğunun (örnekte hedef analitin, dedektörün tepkisini gürültü seviyesinin üzerinde görebilecek kadar yeterli bir konsantrasyonda bulunduğunu varsayarsak) genellikle bir cihaz sorunu veya yanlış mobil faz koşullarıyla (eğer hiç gözlemlenirse) ilgili olduğunu göstermektedir. Pikler genellikle çok "zayıf"tır. Bu kategorideki potansiyel sorunların ve çözümlerin kısa bir listesi Tablo I'de bulunabilir.
Yukarıda da belirtildiği gibi, tepe genişlemesinin ne kadarının tolere edilmesi gerektiği ve ne zaman dikkat edilmesi ve düzeltilmesi gerektiği sorusu, gelecekteki bir makalede ele alacağım karmaşık bir konudur. Deneyimime göre, önemli tepe genişlemesi genellikle tepe şeklinde önemli bir değişiklikle birlikte görülür ve tepe kuyruğu, tepe öncesi veya bölünmesinden daha yaygındır. Bununla birlikte, nominal olarak simetrik tepeler de genişler ve bu durum birkaç farklı nedenden kaynaklanabilir:
Bu sorunların her biri, Troubleshooting LC'nin önceki sayılarında ayrıntılı olarak ele alınmıştır ve bu konularla ilgilenen okuyucular, sorunların temel nedenleri ve olası çözümleri hakkında bilgi edinmek için önceki makalelere başvurabilirler. Daha fazla ayrıntı.
Pik kuyruklanması, pik öne çıkması ve pik bölünmesi kimyasal veya fiziksel olaylardan kaynaklanabilir ve bu sorunlara yönelik potansiyel çözümler listesi, kimyasal veya fiziksel bir sorunla mı uğraştığımıza bağlı olarak büyük ölçüde değişir. Genellikle, bir kromatogramdaki farklı pikleri karşılaştırarak, suçlunun hangisi olduğuna dair önemli ipuçları bulabilirsiniz. Bir kromatogramdaki tüm pikler benzer şekiller sergiliyorsa, neden büyük olasılıkla fiziksel değildir. Sadece bir veya birkaç pik etkileniyorsa, ancak geri kalanı normal görünüyorsa, neden büyük olasılıkla kimyasaldır.
Pik kuyruğunun kimyasal nedenleri burada kısaca tartışılamayacak kadar karmaşıktır. İlgilenen okuyucu, daha ayrıntılı bir tartışma için "LC Sorun Giderme"nin son sayısına başvurabilir (10). Bununla birlikte, denenebilecek kolay bir şey, enjekte edilen analitin kütlesini azaltmak ve pik şeklinin iyileşip iyileşmediğini görmektir. Eğer iyileşiyorsa, bu sorunun "kütle aşırı yüklenmesi" olduğuna dair iyi bir ipucudur. Bu durumda, yöntem küçük analit kütlelerinin enjekte edilmesiyle sınırlandırılmalı veya kromatografik koşullar, daha büyük kütleler enjekte edildiğinde bile iyi pik şekilleri elde edilebilecek şekilde değiştirilmelidir.
Pik kuyruklanmasının birçok potansiyel fiziksel nedeni de vardır. Olasılıkların ayrıntılı bir tartışmasıyla ilgilenen okuyucular, “LC Sorun Giderme”nin (11) yakın tarihli bir başka sayısına başvurabilirler. Pik kuyruklanmasının daha yaygın fiziksel nedenlerinden biri, enjektör ve dedektör arasındaki bir noktada zayıf bağlantıdır (12). Aşırı bir örnek, birkaç hafta önce laboratuvarımda elde edilen Şekil 1d'de gösterilmiştir. Bu durumda, daha önce kullanmadığımız yeni bir enjeksiyon valfi ile bir sistem kurduk ve paslanmaz çelik bir kılcal boruya kalıplanmış bir yüksükle küçük hacimli bir enjeksiyon döngüsü kurduk. İlk sorun giderme deneylerinden sonra, enjeksiyon valfi statorundaki port derinliğinin alıştığımızdan çok daha derin olduğunu ve portun dibinde büyük bir ölü hacme neden olduğunu fark ettik. Bu sorun, enjeksiyon döngüsünü başka bir tüple değiştirerek kolayca çözülebilir; portun dibindeki ölü hacmi ortadan kaldırmak için yüksüğü uygun konuma ayarlayabiliriz.
Şekil 1e'de gösterilenlere benzer tepe önleri, fiziksel veya kimyasal sorunlardan da kaynaklanabilir. Ön kenarın yaygın bir fiziksel nedeni, kolonun partikül yatağının iyi paketlenmemiş olması veya partiküllerin zamanla yeniden organize olmasıdır. Bu fiziksel olgudan kaynaklanan tepe kuyruğunda olduğu gibi, bunu düzeltmenin en iyi yolu kolonu değiştirmek ve devam etmektir. Temelde, kimyasal kökenli ön kenar tepe şekilleri genellikle "doğrusal olmayan" tutunma koşulları olarak adlandırdığımız şeylerden kaynaklanır. İdeal (doğrusal) koşullar altında, sabit faz tarafından tutulan analit miktarı (dolayısıyla tutunma faktörü), kolondaki analit konsantrasyonuyla doğrusal olarak ilişkilidir. Kromatografik olarak bu, kolona enjekte edilen analit kütlesi arttıkça tepenin daha uzun, ancak daha geniş olmadığı anlamına gelir. Tutunma davranışı doğrusal olmadığında bu ilişki bozulur ve daha fazla kütle enjekte edildikçe tepeler sadece daha uzun değil, aynı zamanda daha geniş de olur. Ek olarak, doğrusal olmayan şekiller, kromatografik tepelerin şeklini belirleyerek ön veya arka kenarlara neden olur. Kütle aşırı yüklenmesinde olduğu gibi Tepe kuyruğuna neden olur (10), doğrusal olmayan tutunmadan kaynaklanan tepe öne çıkması, enjekte edilen analit kütlesinin azaltılmasıyla da teşhis edilebilir. Eğer tepe şekli iyileşirse, yöntem, öne çıkan kenara neden olan enjeksiyon kalitesini aşmayacak şekilde değiştirilmeli veya bu davranışı en aza indirgemek için kromatografik koşullar değiştirilmelidir.
Bazen Şekil 1f'de gösterildiği gibi "bölünmüş" bir tepe noktası gözlemliyoruz. Bu sorunu çözmenin ilk adımı, tepe noktası şeklinin kısmi birlikte elüsyondan (yani, iki farklı ancak birbirine yakın elüsyon gösteren bileşiğin varlığından) kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemektir. Gerçekten de birbirine yakın elüsyon gösteren iki farklı analit varsa, o zaman mesele bunların çözünürlüğünü iyileştirmektir (örneğin, seçiciliği, tutunmayı veya plaka sayısını artırarak) ve görünürdeki "bölünmüş" tepe noktaları fiziksel performansla ilgilidir ve kolonun kendisiyle hiçbir ilgisi yoktur. Genellikle, bu karar için en önemli ipucu, kromatogramdaki tüm tepe noktalarının bölünmüş şekiller sergileyip sergilemediği veya sadece bir veya ikisinin sergileyip sergilemediğidir. Sadece bir veya iki tane ise, muhtemelen birlikte elüsyon sorunudur; tüm tepe noktaları bölünmüşse, muhtemelen fiziksel bir sorundur ve büyük olasılıkla kolonun kendisiyle ilgilidir.
Kolonun fiziksel özellikleriyle ilgili bölünmüş tepeler genellikle kısmen tıkanmış giriş veya çıkış fritlerinden veya kolondaki parçacıkların yeniden düzenlenmesinden kaynaklanır ve bu da hareketli fazın kolon kanalı oluşumunun belirli bölgelerinde hareketli fazdan daha hızlı akmasına izin verir (11). Kısmen tıkanmış frit bazen kolondan geçen akışı tersine çevirerek temizlenebilir; ancak, deneyimlerime göre, bu genellikle uzun vadeli bir çözümden ziyade kısa vadeli bir çözümdür. Parçacıklar kolon içinde yeniden birleşirse, bu durum modern kolonlarda genellikle ölümcül olur. Bu noktada, kolonu değiştirmek ve devam etmek en iyisidir.
Şekil 1g'deki tepe noktası, kendi laboratuvarımda yakın zamanda yaşanan bir olaydan da anlaşılacağı üzere, sinyalin o kadar yüksek olduğunu ve tepki aralığının üst sınırına ulaştığını gösterir. Optik absorbans dedektörlerinde (bu durumda UV-vis), analit konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, analit dedektör akış hücresinden geçen ışığın çoğunu emer ve algılanacak çok az ışık kalır. Bu koşullar altında, fotodedektörden gelen elektriksel sinyal, başıboş ışık ve "karanlık akım" gibi çeşitli gürültü kaynaklarından büyük ölçüde etkilenir ve sinyalin görünümünü çok "bulanık" hale getirir ve analit konsantrasyonundan bağımsız hale gelir. Bu durumda, sorun genellikle analitin enjeksiyon hacmini azaltarak (enjeksiyon hacmini azaltarak, numuneyi seyrelterek veya her ikisini birden yaparak) kolayca çözülebilir.
Kromatografi eğitiminde, dedektör sinyalini (yani kromatogramdaki y eksenini) numunedeki analit konsantrasyonunun göstergesi olarak kullanırız. Bu nedenle, sıfırın altında bir sinyale sahip bir kromatogram görmek garip görünür, çünkü basit yorumlama bunun negatif bir analit konsantrasyonunu gösterdiğidir - ki bu elbette fiziksel olarak mümkün değildir. Benim deneyimime göre, negatif pikler en sık optik absorbans dedektörleri (örneğin UV-vis) kullanıldığında gözlemlenir.
Bu durumda, negatif bir pik, kolondan ayrılan moleküllerin, pik öncesinde ve sonrasında mobil fazın kendisinden daha az ışık absorbe ettiği anlamına gelir. Bu, örneğin, nispeten düşük algılama dalga boyları (<230 nm) ve bu dalga boylarında ışığın çoğunu absorbe eden mobil faz katkı maddeleri kullanıldığında ortaya çıkabilir. Bu tür katkı maddeleri, metanol gibi mobil faz çözücü bileşenleri veya asetat veya format gibi tampon bileşenleri olabilir. Aslında, kalibrasyon eğrisi hazırlamak ve doğru nicel bilgi elde etmek için negatif pikler kullanılabilir, bu nedenle bunlardan kaçınmak için temel bir neden yoktur (bu yöntem bazen "dolaylı UV algılama" olarak adlandırılır) (13). Bununla birlikte, absorbans algılama durumunda negatif piklerden tamamen kaçınmak istiyorsak, en iyi çözüm, analitin mobil fazdan daha fazla absorbe etmesi için farklı bir algılama dalga boyu kullanmak veya mobil fazın bileşimini analitlerden daha az ışık absorbe edecek şekilde değiştirmektir.
Örnekteki analit dışındaki bileşenlerin (örneğin çözücü matris) kırılma indisi, hareketli fazın kırılma indisinden farklı olduğunda, kırılma indisi (RI) tespiti kullanılırken de negatif pikler ortaya çıkabilir. Bu durum UV-vis tespitiyle de olur, ancak bu etki RI tespitine göre daha az belirgindir. Her iki durumda da, örnek matrisinin bileşimini hareketli fazın bileşimine daha yakın bir şekilde eşleştirerek negatif pikler en aza indirilebilir.
LC sorun gidermenin temel konusuna ilişkin üçüncü bölümde, gözlemlenen tepe şeklinin beklenen veya normal tepe şeklinden farklı olduğu durumları ele aldım. Bu tür sorunların etkili bir şekilde giderilmesi, beklenen tepe şekillerinin (teoriye veya mevcut yöntemlerle ilgili önceki deneyime dayanarak) bilinmesiyle başlar, bu nedenle bu beklentilerden sapmalar açıktır. Tepe şekli sorunlarının birçok farklı potansiyel nedeni vardır (çok geniş, kuyruklu, ön kenar vb.). Bu bölümde, en sık gördüğüm nedenlerden bazılarını ayrıntılı olarak ele alıyorum. Bu ayrıntıları bilmek, sorun gidermeye başlamak için iyi bir başlangıç ​​noktası sağlar, ancak tüm olasılıkları kapsamaz. Daha ayrıntılı bir neden ve çözüm listesiyle ilgilenen okuyucular, LCGC "LC Sorun Giderme Kılavuzu" duvar tablosuna başvurabilirler.
(4) LCGC “LC Sorun Giderme Kılavuzu” duvar tablosu. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Kromatografide Veri Analizi ve Sinyal İşleme (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ve Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.