Noen emner for feilsøking av LC er aldri utdaterte, ettersom det finnes problemer i LC-praksis, selv om instrumentteknologien forbedres over tid. Det er mange måter problemer kan oppstå i et LC-system og ende opp i dårlig toppform. Når problemer relatert til toppform oppstår, bidrar en kort liste over mulige årsaker til disse resultatene til å forenkle feilsøkingsopplevelsen vår.
Det har vært gøy å skrive denne spalten «LC-feilsøking» og tenke på temaer hver måned, fordi noen temaer aldri går av moten. Innen kromatografiforskning blir visse temaer eller ideer foreldet etter hvert som de erstattes av nyere og bedre ideer, men innen feilsøking, siden den første feilsøkingsartikkelen dukket opp i dette tidsskriftet (LC Journal på den tiden) siden noen temaer fortsatt er relevante) i 1983 (1). I løpet av de siste årene har jeg fokusert flere LC-feilsøkingsseksjoner på moderne trender som påvirker væskekromatografi (LC) (for eksempel den relative sammenligningen av vår forståelse av effekten av trykk på retensjon [2] Nye fremskritt) Vår tolkning av LC-resultater og hvordan man feilsøker med moderne LC-instrumenter. I denne månedens del fortsetter jeg serien min (3), som startet i desember 2021, som fokuserte på noen av «liv-og-død»-temaene innen LC-feilsøking – elementer som er flotte for enhver feilsøker er viktige, uansett hvor gammelt systemet vi bruker. Kjernetemaet i denne serien er svært relevant for LCGCs berømte veggkart «LC Troubleshooting Guide» (4) som henger i mange laboratorier. I den tredje delen av denne serien valgte jeg å fokusere på problemer knyttet til toppform eller toppkarakteristikker. Utrolig nok viser veggkartet 44 forskjellige potensielle årsaker til dårlig toppform! Vi kan ikke se på alle disse problemene i detalj i én artikkel, så i denne første delen om emnet vil jeg fokusere på noen av de jeg ser oftest. Jeg håper både unge og gamle LC-brukere vil finne noen nyttige tips og påminnelser om dette viktige emnet.
Jeg merker at jeg i økende grad svarer på feilsøkingsspørsmål med «alt er mulig». Dette svaret kan virke enkelt når man vurderer observasjoner som er vanskelige å tolke, men jeg synes det ofte er passende. Med mange mulige årsaker til dårlig toppform, er det viktig å holde et åpent sinn når man vurderer hva problemet kan være, og å kunne prioritere potensielle årsaker for å starte feilsøkingsarbeidet vårt, med fokus på de vanligste mulighetene, dette punktet er svært viktig.
Et viktig trinn i enhver feilsøkingsøvelse – men et som jeg synes er undervurdert – er å erkjenne at det finnes et problem som må løses. Å erkjenne at det finnes et problem betyr ofte å erkjenne at det som skjer med verktøyet er forskjellig fra våre forventninger, som er formet av teori, empirisk kunnskap og erfaring (5). «Toppformen» som det refereres til her refererer faktisk ikke bare til formen på toppen (symmetrisk, asymmetrisk, glatt, luftig, forkant, haleformet osv.), men også til bredden. Våre forventninger til den faktiske toppformen er enkle. Teori (6) støtter godt lærebokens forventning om at de kromatografiske toppene i de fleste tilfeller skal være symmetriske og samsvare med formen til en Gaussisk fordeling, som vist i figur 1a. Det vi forventer av toppbredder er et mer komplekst spørsmål, og vi vil diskutere dette emnet i en fremtidig artikkel. De andre toppformene i figur 1 viser noen av de andre mulighetene som kan observeres – med andre ord, noen av måtene ting kan gå galt på. I resten av denne delen vil vi bruke tid på å diskutere noen spesifikke eksempler på situasjoner som kan føre til disse formtypene.
Noen ganger observeres ikke topper i det hele tatt i kromatogrammet der de forventes å bli eluert. Veggdiagrammet ovenfor indikerer at fraværet av en topp (forutsatt at prøven faktisk inneholder målanalytten i en konsentrasjon som skal gjøre detektorresponsen tilstrekkelig til å se den over støyen) vanligvis er relatert til et instrumentproblem eller feil mobile faseforhold (hvis observert i det hele tatt). Topper, vanligvis for "svake"). En kort liste over potensielle problemer og løsninger i denne kategorien finnes i tabell I.
Som nevnt ovenfor er spørsmålet om hvor mye topputvidelse som bør tolereres før man tar hensyn til og prøver å fikse det et komplekst tema som jeg vil diskutere i en fremtidig artikkel. Min erfaring er at betydelig topputvidelse ofte ledsages av en betydelig endring i toppform, og topphalefall er mer vanlig enn før topp eller splitting. Imidlertid er de nominelt symmetriske toppene også utvidet, noe som kan være forårsaket av noen forskjellige årsaker:
Hvert av disse problemene har blitt diskutert i detalj i tidligere utgaver av Feilsøking LC, og lesere som er interessert i disse emnene kan se disse tidligere artiklene for informasjon om de underliggende årsakene og mulige løsninger på disse problemene. Mer informasjon.
Topphaledannelse, toppfrontdannelse og splitting kan alle være forårsaket av kjemiske eller fysiske fenomener, og listen over mulige løsninger på disse problemene varierer mye, avhengig av om vi har å gjøre med et kjemisk eller fysisk problem. Ved å sammenligne de forskjellige toppene i et kromatogram kan du ofte finne viktige ledetråder om hvilken som er synderen. Hvis alle toppene i et kromatogram har lignende former, er årsaken mest sannsynlig ikke fysisk. Hvis bare én eller noen få topper er påvirket, men resten ser fine ut, er årsaken mest sannsynlig kjemisk.
De kjemiske årsakene til topphaledannelse er for komplekse til å diskutere kort her. Den interesserte leseren henvises til den nylige utgaven av «LC Troubleshooting» for en mer dyptgående diskusjon (10). Imidlertid er det enkelt å prøve å redusere massen til den injiserte analytten og se om toppformen forbedres. I så fall er dette en god indikasjon på at problemet er «masseoverbelastning». I dette tilfellet må metoden begrenses til å injisere små analyttmasser, eller de kromatografiske forholdene må endres slik at gode toppformer kan oppnås selv med større injiserte masser.
Det finnes også mange potensielle fysiske årsaker til peak tailing. Lesere som er interessert i en detaljert diskusjon av mulighetene, henvises til en annen nylig utgave av «LC Troubleshooting» (11). En av de vanligste fysiske årsakene til peak tailing er en dårlig forbindelse på et punkt mellom injektoren og detektoren (12). Et ekstremt eksempel er vist i figur 1d, innhentet i laboratoriet mitt for noen uker siden. I dette tilfellet bygde vi et system med en ny injeksjonsventil som vi ikke hadde brukt før, og installerte en injeksjonssløyfe med lite volum med en hylse som var støpt på et kapillærrør i rustfritt stål. Etter noen innledende feilsøkingseksperimenter innså vi at portdybden i injeksjonsventilstatoren var mye dypere enn vi var vant til, noe som resulterte i et stort dødvolum i bunnen av porten. Dette problemet løses enkelt ved å erstatte injeksjonssløyfen med et annet rør. Vi kan justere hylsen til riktig posisjon for å eliminere dødvolumet i bunnen av porten.
Toppfronter som de som er vist i figur 1e kan også være forårsaket av fysiske eller kjemiske problemer. En vanlig fysisk årsak til forkanten er at partikkellaget i kolonnen ikke er godt pakket, eller at partiklene har reorganisert seg over tid. Som med topphaledannelse forårsaket av dette fysiske fenomenet, er den beste måten å fikse dette på å erstatte kolonnen og fortsette. Fundamentalt sett oppstår toppformer i forkanten med kjemisk opprinnelse ofte fra det vi kaller "ikke-lineære" retensjonsforhold. Under ideelle (lineære) forhold er mengden analytt som holdes tilbake av den stasjonære fasen (derav retensjonsfaktoren) lineært relatert til konsentrasjonen av analytten i kolonnen. Kromatografisk betyr dette at når massen av analytt som injiseres i kolonnen øker, blir toppen høyere, men ikke bredere. Dette forholdet brytes når retensjonsatferden er ikke-lineær, og toppene blir ikke bare høyere, men også bredere etter hvert som mer masse injiseres. I tillegg bestemmer ikke-lineære former formen på kromatografiske topper, noe som resulterer i for- eller bakkanter. Som med masseoverbelastning som forårsaker topphaledannelse (10), forårsaket toppføring ved ikke-lineær retensjon kan også diagnostiseres ved å redusere den injiserte analyttmassen. Hvis toppformen forbedres, må metoden modifiseres for ikke å overskride injeksjonskvaliteten som forårsaker forkanten, eller de kromatografiske forholdene må endres for å minimere denne oppførselen.
Noen ganger observerer vi det som ser ut til å være en «delt» topp, som vist i figur 1f. Det første trinnet i å løse dette problemet er å avgjøre om toppformen skyldes delvis koeluering (dvs. tilstedeværelsen av to distinkte, men tett eluerende forbindelser). Hvis det faktisk er to forskjellige analytter som eluerer tett sammen, handler det om å forbedre oppløsningen deres (for eksempel ved å øke selektivitet, retensjon eller plateantall), og de tilsynelatende «delte» toppene er relatert til fysiske forhold. Ytelse har ingenting med selve kolonnen å gjøre. Ofte er den viktigste ledetråden til denne avgjørelsen om alle toppene i kromatogrammet viser delte former, eller bare én eller to. Hvis det bare er én eller to, er det sannsynligvis et problem med koeluering. Hvis alle toppene er delte, er det sannsynligvis et fysisk problem, mest sannsynlig relatert til selve kolonnen.
Delvis tilstoppede topper relatert til selve kolonnens fysiske egenskaper skyldes vanligvis delvis blokkerte innløps- eller utløpsfritter, eller omorganisering av partikler i kolonnen, slik at den mobile fasen kan strømme raskere enn den mobile fasen i visse områder av kolonnekanalformasjonen i andre regioner (11). Delvis tilstoppet fritte kan noen ganger fjernes ved å reversere strømningen gjennom kolonnen. Etter min erfaring er dette imidlertid vanligvis en kortsiktig snarere enn en langsiktig løsning. Dette er ofte fatalt med moderne kolonner hvis partiklene rekombineres i kolonnen. På dette tidspunktet er det best å bytte ut kolonnen og fortsette.
Toppen i figur 1g, også fra en nylig forekomst i mitt eget laboratorium, indikerer vanligvis at signalet er så høyt at det har nådd den øvre enden av responsområdet. For optiske absorbansdetektorer (UV-vis i dette tilfellet), når analyttkonsentrasjonen er veldig høy, absorberer analytten mesteparten av lyset som passerer gjennom detektorens strømningscelle, slik at det blir svært lite lys igjen som kan detekteres. Under disse forholdene påvirkes det elektriske signalet fra fotodetektoren sterkt av ulike støykilder, for eksempel strølys og "mørk strøm", noe som gjør signalet veldig "uklart" i utseende og uavhengig av analyttkonsentrasjonen. Når dette skjer, kan problemet ofte enkelt løses ved å redusere injeksjonsvolumet til analytten – redusere injeksjonsvolumet, fortynne prøven, eller begge deler.
På kromatografiskolen bruker vi detektorsignalet (dvs. y-aksen i kromatogrammet) som en indikator på analyttkonsentrasjonen i prøven. Så det virker merkelig å se et kromatogram med et signal under null, da den enkle tolkningen er at dette indikerer en negativ analyttkonsentrasjon – noe som selvfølgelig ikke er fysisk mulig. Etter min erfaring observeres negative topper oftest når man bruker optiske absorbansdetektorer (f.eks. UV-vis).
I dette tilfellet betyr en negativ topp ganske enkelt at molekylene som elueres fra kolonnen absorberer mindre lys enn selve den mobile fasen rett før og etter toppen. Dette kan for eksempel forekomme når man bruker relativt lave deteksjonsbølgelengder (<230 nm) og tilsetningsstoffer i den mobile fasen som absorberer mesteparten av lyset ved disse bølgelengdene. Slike tilsetningsstoffer kan være løsemiddelkomponenter i den mobile fasen, som metanol, eller bufferkomponenter som acetat eller formiat. Man kan faktisk bruke negative topper til å utarbeide en kalibreringskurve og oppnå nøyaktig kvantitativ informasjon, så det er ingen grunnleggende grunn til å unngå dem i seg selv (denne metoden blir noen ganger referert til som "indirekte UV-deteksjon") (13). Men hvis vi virkelig ønsker å unngå negative topper helt, er den beste løsningen ved absorbansdeteksjon å bruke en annen deteksjonsbølgelengde slik at analytten absorberer mer enn den mobile fasen, eller endre sammensetningen av den mobile fasen slik at de absorberer mindre lys enn analytter.
Negative topper kan også oppstå ved bruk av brytningsindeksdeteksjon (RI) når brytningsindeksen til andre komponenter enn analytten i prøven, for eksempel løsningsmiddelmatrisen, er forskjellig fra brytningsindeksen til den mobile fasen. Dette skjer også med UV-vis-deteksjon, men denne effekten har en tendens til å bli dempet i forhold til RI-deteksjon. I begge tilfeller kan negative topper minimeres ved å matche sammensetningen av prøvematrisen nærmere den til den mobile fasen.
I del tre om det grunnleggende emnet LC-feilsøking, diskuterte jeg situasjoner der den observerte toppformen avviker fra den forventede eller normale toppformen. Effektiv feilsøking av slike problemer begynner med kunnskap om forventede toppformer (basert på teori eller tidligere erfaring med eksisterende metoder), så avvik fra disse forventningene er åpenbare. Toppformproblemer har mange forskjellige potensielle årsaker (for brede, haleformede, forkantformede osv.). I denne delen diskuterer jeg i detalj noen av årsakene jeg ser oftest. Å kjenne til disse detaljene gir et godt sted å starte feilsøking, men fanger ikke opp alle muligheter. Lesere som er interessert i en mer dyptgående liste over årsaker og løsninger, kan se LCGCs «LC Troubleshooting Guide»-veggkart.
(4) Veggkart for LCGC «Feilsøkingsveiledning for LC». https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Dataanalyse og signalbehandling i kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.