Bəzi LC problemlərinin aradan qaldırılması mövzuları heç vaxt köhnəlmir, çünki alət texnologiyası zaman keçdikcə təkmilləşsə belə, LC təcrübəsində problemlər var. LC sistemində problemlərin yarana biləcəyi və pis pik formada sona çatmasının bir çox yolu var. Pik forma ilə bağlı problemlər yarandıqda, bu nəticələrin mümkün səbəblərinin qısa siyahısı problemlərin aradan qaldırılması təcrübəmizi sadələşdirməyə kömək edir.
Bu "LC Nasazlıqlarının Giderilmesi" sütununu yazmaq və hər ay mövzular haqqında düşünmək əyləncəli idi, çünki bəzi mövzular heç vaxt dəbdən düşmür. Xromatoqrafiya tədqiqatı sahəsində müəyyən mövzular və ya ideyalar köhnəlmiş olur, çünki onları daha yeni və daha yaxşı ideyalar əvəz edir, problemlərin aradan qaldırılması sahəsində, ilk problemlərin aradan qaldırılması məqaləsi bu jurnalda dərc olunduğundan (o vaxt LC Journalında) hələ də aktual mövzular var. 1983(1).Son bir neçə il ərzində mən maye xromatoqrafiyaya (LC) təsir edən müasir tendensiyalara (məsələn, təzyiqin saxlanmaya təsirini başa düşməyimizin nisbi müqayisəsi [2] Yeni Müvəffəqiyyətlər) LC nəticələrini şərhimiz və problemlərin həlli yolları ilə bağlı bir neçə LC Problemlərinin aradan qaldırılması bölmələrinə diqqət yetirmişəm. LC problemlərinin həlli ilə bağlı bəzi "həyat və ölüm" mövzularına diqqət yetirən dekabr 2021 - istifadə etdiyimiz sistemin yaşından asılı olmayaraq hər hansı bir problem həlledicisi üçün əla elementlər vacibdir. Bu seriyanın əsas mövzusu LCGC-nin məşhur "LC Problemləri Giderme Bələdçisi" divar cədvəlinə (4) çox uyğundur. pik xüsusiyyətləri.İnanılmazdır ki, divar cədvəli pis pik formasının 44 müxtəlif potensial səbəbini sadalayır!Biz bu məsələlərin hamısını bir məqalədə ətraflı nəzərdən keçirə bilmərik, ona görə də mövzu ilə bağlı bu ilk hissədə mən ən çox gördüyüm bəzi məsələlərə diqqət yetirəcəyəm. Ümid edirəm ki, gənc və yaşlı LC istifadəçiləri bu mühüm mövzuda bəzi faydalı məsləhətlər və xatırlatmalar tapacaqlar.
Mən özümü getdikcə daha çox “hər şey mümkündür” ifadəsi ilə problemlərin həlli ilə bağlı suallara cavab verirəm. Şərh etmək çətin olan müşahidələri nəzərdən keçirərkən bu cavab asan görünə bilər, lakin mən bunu çox vaxt məqsədəuyğun hesab edirəm. Pik formasının zəif olmasının bir çox mümkün səbəbi ilə problemin nə ola biləcəyini nəzərdən keçirərkən açıq fikirli olmaq və potensial səbəbləri prioritetləşdirmək vacibdir. vacib.mümkün.
Problemin həlli üçün hər hansı bir məşqdə əsas addım – lakin mənim fikrimcə, düzgün qiymətləndirilməmişdir – həll edilməli olan problemin olduğunu qəbul etməkdir. Problemin olduğunu qəbul etmək çox vaxt alətlə baş verənlərin nəzəriyyə, empirik bilik və təcrübə ilə formalaşan gözləntilərimizdən fərqli olduğunu dərk etmək deməkdir (5). asimmetrik, hamar, tüklü, qabaqcıl kənar, quyruq və s.), həm də eninə. Faktiki pik forması üçün gözləntilərimiz sadədir. Nəzəriyyə (6) dərslik gözləntisini yaxşı dəstəkləyir ki, əksər hallarda xromatoqrafik zirvələr simmetrik olmalı və Qauss paylanmasının formasına uyğun olmalıdır, Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, biz bu məsələni daha mürəkkəb və genişlikdən gözləyəcəyik. mövzu gələcək məqalədə. Şəkil 1-dəki digər pik formalar müşahidə oluna biləcək bəzi digər imkanları, başqa sözlə, işlərin səhv gedə biləcəyi bəzi yolları göstərir. Bu hissənin qalan hissəsində biz bu forma növlərinə gətirib çıxara biləcək bəzi konkret vəziyyət nümunələrini müzakirə etməyə vaxt sərf edəcəyik.
Bəzən piklər xromatoqrammada onların yuyulması gözlənilən yerlərdə ümumiyyətlə müşahidə olunmur. Yuxarıdakı divar diaqramı göstərir ki, pikin olmaması (nümunənin əslində detektorun səs-küyün üstündən görünməsi üçün kifayət qədər konsentrasiyada hədəf analiti ehtiva etməsi) adətən alətin bəzi problemi və ya səhv mobil faza şəraiti (ümumiyyətlə müşahidə olunarsa) ilə bağlıdır. zirvələr, adətən çox “zəif”).
Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, diqqət yetirmədən və onu düzəltməyə çalışmadan əvvəl nə qədər zirvə genişlənməsinə dözmək lazımdır sualı gələcək məqalədə müzakirə edəcəyim mürəkkəb bir mövzudur. Mənim təcrübəm ondan ibarətdir ki, əhəmiyyətli pik genişlənməsi çox vaxt pik şəklində əhəmiyyətli dəyişiklik ilə müşayiət olunur və pik quyruqları pikdən əvvəlki və ya parçalanmadan daha çox yayılmışdır. bir neçə fərqli səbəb:
Bu məsələlərin hər biri LC problemlərinin aradan qaldırılmasının əvvəlki saylarında ətraflı müzakirə olunub və bu mövzularla maraqlanan oxucular bu problemlərin əsas səbəbləri və potensial həll yolları haqqında məlumat üçün bu əvvəlki məqalələrə müraciət edə bilərlər. Daha ətraflı.
Pik quyruğu, zirvə cəbhəsi və parçalanma kimyəvi və ya fiziki hadisələrdən qaynaqlana bilər və bu problemlərin həlli yollarının siyahısı kimyəvi və ya fiziki problemlə məşğul olmağımızdan asılı olaraq geniş şəkildə dəyişir. Çox vaxt xromatoqramda müxtəlif zirvələri müqayisə edərək, günahkarın hansının olması ilə bağlı vacib ipuçlarını tapa bilərsiniz. çox güman ki, fiziki deyil. Yalnız bir və ya bir neçə zirvə təsirlənsə, qalanları yaxşı görünürsə, səbəb çox güman ki, kimyəvidir.
Pik tullantılarının kimyəvi səbəbləri burada qısaca müzakirə etmək üçün çox mürəkkəbdir. Maraqlanan oxucu daha ətraflı müzakirə üçün “LC Troubleshooting” jurnalının son buraxılışına istinad edir (10). Bununla belə, cəhd etmək asan olan şey yeridilmiş analitin kütləsini azaltmaq və pik formasının yaxşılaşıb-yaxşılaşmadığını görməkdir. Əgər belədirsə, bu, problemin həddən artıq yüklənməsidir “e. kiçik analit kütlələrinin yeridilməsi ilə məhdudlaşa bilər və ya xromatoqrafik şərait dəyişdirilməlidir ki, daha böyük kütlələrin yeridilməsi ilə belə yaxşı pik formaları əldə olunsun.
Pik tullantıları üçün bir çox potensial fiziki səbəblər də var. İmkanların ətraflı müzakirəsi ilə maraqlanan oxucular “LC Troubleshooting” (11) adlı digər yeni buraxılışa istinad edirlər. Pik tullantılarının daha çox yayılmış fiziki səbəblərindən biri injektor və detektor (12) arasındakı bir nöqtədə zəif əlaqədir. Ekstremal nümunə, bir neçə həftə əvvəl qurulmuş laboratoriyamda göstərilmişdir. əvvəllər istifadə etmədiyimiz yeni enjeksiyon klapanlı sistem və paslanmayan polad kapilyarın üzərinə qəliblənmiş yüksüklü kiçik həcmli enjeksiyon halqası quraşdırdıq. Bəzi ilkin nasazlıqların aradan qaldırılması təcrübələrindən sonra biz anladıq ki, enjeksiyon klapanının statorundakı port dərinliyi öyrəşdiyimizdən çox daha dərin idi və nəticədə dibindəki böyük ölü port problemi asanlıqla həll edildi. başqa bir boru ilə loop, biz limanın altındakı ölü həcmi aradan qaldırmaq üçün yüksükünü lazımi mövqeyə tənzimləyə bilərik.
Şəkil 1e-də göstərildiyi kimi zirvə cəbhələri də fiziki və ya kimyəvi problemlərdən qaynaqlana bilər. Qabaq kənarın ümumi fiziki səbəbi sütunun hissəcik yatağının yaxşı yığılmaması və ya hissəciklərin zamanla yenidən təşkil edilməsidir. Bu fiziki hadisənin yaratdığı pik tullantıda olduğu kimi, bunu düzəltməyin ən yaxşı yolu sütunu dəyişdirmək və biz tez-tez kimyəvi mənşəli şəkildə davam etməkdir. “qeyri-xətti” saxlama şərtləri. İdeal (xətti) şəraitdə stasionar faza tərəfindən saxlanılan analitin miqdarı (deməli, tutma əmsalı) sütundakı analitin konsentrasiyası ilə xətti olaraq bağlıdır. Xromatoqrafik olaraq, bu o deməkdir ki, sütuna yeridilmiş analitin kütləsi artdıqca, pik daha hündür olur, lakin onun retension davranışı daha geniş deyil, daha uzun olur. zirvələr nəinki hündür olur, həm də daha çox kütlə vurulduqca daha da genişlənir. Bundan əlavə, qeyri-xətti formalar xromatoqrafik zirvələrin formasını müəyyən edir, nəticədə qabaqcıl və ya arxada olan kənarlar yaranır. Pik quyruğa səbəb olan kütləvi yüklənmə ilə (10), qeyri-xətti tutma nəticəsində yaranan zirvəyə doğru irəliləmə də enjekte edilmiş formaların azaldılması ilə diaqnostika edilə bilər. qabaqcıl kənara səbəb olan inyeksiya keyfiyyətini aşmayın və ya bu davranışı minimuma endirmək üçün xromatoqrafik şərtlər dəyişdirilməlidir.
Bəzən biz Şəkil 1f-də göstərildiyi kimi “parçalanmış” zirvə kimi görünənləri müşahidə edirik. Bu problemi həll etmək üçün ilk addım pik formasının qismən birgə elüsyona (yəni, iki fərqli, lakin bir-biri ilə yaxından elütasiya edən birləşmənin mövcudluğu) bağlı olub-olmadığını müəyyən etməkdir. Əgər həqiqətən bir-birinə yaxın axan iki fərqli analit varsa, deməli, bu, onların rezolyusiyasının seçilməsi və ya retensiyasının artırılması məsələsidir (məsələn, sayı) və görünən “parçalanmış” zirvələrin fiziki ilə bağlıdır Performansın sütunun özü ilə heç bir əlaqəsi yoxdur. Çox vaxt bu qərarın ən vacib ipucu xromatoqramdakı bütün zirvələrin bölünmüş formalar, yoxsa yalnız bir və ya iki olmasıdır. Əgər bu, yalnız bir və ya ikidirsə, bu, çox güman ki, birgə elüsyon problemidir; bütün zirvələr bölünürsə, bu, çox güman ki, sütunun özü ilə əlaqəli fiziki bir problemdir.
Sütunun özünün fiziki xassələri ilə bağlı split zirvələr adətən qismən bloklanmış giriş və ya çıxış fritləri və ya sütundakı hissəciklərin yenidən təşkili ilə əlaqədardır, bu da sütun kanalının formalaşmasının müəyyən sahələrində mobil fazanın mobil fazadan daha sürətli axmasına imkan verir .digər bölgələrdə (11). lakin, mənim təcrübəmə görə, bu, adətən, uzunmüddətli həll yolu deyil, qısamüddətlidir. Əgər hissəciklər sütun daxilində yenidən birləşərsə, bu, müasir sütunlarda çox vaxt ölümcül olur. Bu nöqtədə, sütunu əvəz edib davam etmək yaxşıdır.
Şəkil 1g-də, həm də öz laboratoriyamdakı son nümunədən olan pik, adətən siqnalın o qədər yüksək olduğunu göstərir ki, o, cavab diapazonunun yüksək sonuna çatıb. Optik absorbsiya detektorları üçün (bu halda UV-vizor), analitin konsentrasiyası çox yüksək olduqda, analit detektor axını hüceyrəsindən keçən işığın çox hissəsini udur və bu siqnalın aşkarlanması üçün fotodan çox az işıq qalır. Səssiz işıq və “qaranlıq cərəyan” kimi müxtəlif səs-küy mənbələrindən güclü təsirə məruz qalaraq siqnalı çox “qeyri-səlis” edir və analit konsentrasiyasından asılı olmayaraq. Bu baş verdikdə, problem tez-tez analitin enjeksiyon həcmini azaltmaqla - inyeksiya həcmini azaltmaqla, nümunəni seyreltməklə və ya hər ikisi ilə asanlıqla həll edilə bilər.
Xromatoqrafiya məktəbində biz nümunədəki analit konsentrasiyasının göstəricisi kimi detektor siqnalından (yəni, xromatoqramdakı y oxu) istifadə edirik. Buna görə də sıfırdan aşağı siqnal olan xromatoqramı görmək qəribə görünür, çünki sadə şərh bu mənfi analit konsentrasiyasını göstərir – əlbəttə ki, fiziki cəhətdən mümkün deyil. UV-vizə).
Bu halda, mənfi pik sadəcə olaraq o deməkdir ki, sütundan axan molekullar pikdən dərhal əvvəl və sonra mobil fazanın özündən daha az işığı udurlar. Bu, məsələn, nisbətən aşağı aşkarlama dalğa uzunluqları (<230 nm) və işığın çox hissəsini bu dalğa uzunluqlarında udan mobil faza əlavələrindən istifadə edərkən baş verə bilər. asetat və ya format. Kalibrləmə əyrisini hazırlamaq və dəqiq kəmiyyət məlumatı əldə etmək üçün əslində mənfi zirvələrdən istifadə etmək olar, ona görə də onlardan qaçmaq üçün heç bir əsas səbəb yoxdur (bu üsul bəzən “dolayı UV aşkarlanması” adlanır) (13). Lakin, həqiqətən də mənfi zirvələrdən tamamilə qaçmaq istəyiriksə, udma vəziyyətində ən yaxşı dalğanın udma aşkarlanmasından istifadə etmək lazımdır. mobil fazadan daha çox və ya mobil fazanın tərkibini dəyişdirin ki, onlar analitlərdən daha az işığı udsunlar.
Nümunədəki analitdən başqa komponentlərin, məsələn, həlledici matrisin sınma indeksi mobil fazanın sınma indeksindən fərqli olduqda, sınma indeksinin (RI) aşkarlanmasından istifadə edərkən mənfi zirvələr də görünə bilər. Bu, UV şüalarının aşkarlanması ilə də baş verir, lakin bu təsir hər iki halda daha çox mənfi uyğunluq aşkar edilərək zəiflədilir. nümunə matrisinin tərkibini mobil fazanın tərkibinə.
LC problemlərinin aradan qaldırılmasının əsas mövzusu üzrə üçüncü hissədə müşahidə edilən pik formasının gözlənilən və ya normal pik şəklindən fərqli olduğu vəziyyətləri müzakirə etdim. Bu cür problemlərin effektiv həlli gözlənilən pik formaları haqqında bilikdən başlayır (nəzəriyəyə və ya mövcud metodlarla əvvəlki təcrübəyə əsaslanaraq), buna görə də bu gözləntilərdən kənara çıxma göz qabağındadır. Pik forma problemlərinin bir çox fərqli geniş potensialı var, bu quraşdırmanın aparıcı səbəbləri, I və s. tez-tez gördüyüm bəzi səbəbləri ətraflı müzakirə edin. Bu təfərrüatları bilmək problemlərin aradan qaldırılmasına başlamaq üçün yaxşı yer təmin edir, lakin bütün imkanları əhatə etmir. Səbəblərin və həll yollarının daha ətraflı siyahısı ilə maraqlanan oxucular LCGC “LC Problemləri Giderme Bələdçisi” divar cədvəlinə müraciət edə bilərlər.
(4) LCGC “LC Problemləri Giderme Bələdçisi” divar cədvəli.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Xromatoqrafiyada Məlumatların Təhlili və Siqnalların Emalı (Elsevier, Nyu York, NY, 1998), səh. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF və Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.