Bəzi LC problemlərin aradan qaldırılması mövzuları heç vaxt köhnəlmir, çünki cihaz texnologiyası zamanla inkişaf etsə də, LC təcrübəsində problemlər mövcuddur. LC sistemində problemlərin yaranmasının və pis pik formasına düşməsinin bir çox yolu var. Pik forması ilə bağlı problemlər yarandıqda, bu nəticələrin mümkün səbəblərinin qısa siyahısı problemlərin aradan qaldırılması təcrübəmizi sadələşdirməyə kömək edir.
Bu “LC Problemlərinin Həlli” sütununu yazmaq və hər ay mövzular haqqında düşünmək əyləncəli oldu, çünki bəzi mövzular heç vaxt dəbdən düşmür. Xromatoqrafiya tədqiqatları sahəsində müəyyən mövzular və ya ideyalar köhnəlir, çünki onlar yeni və daha yaxşı ideyalarla əvəz olunur, məsələn, problemlərin həlli sahəsində, ilk problem həlli məqaləsi bu jurnalda (o vaxtkı LC Jurnalı) 1983-cü ildə dərc olunduğundan bəri (1). Son bir neçə ildə maye xromatoqrafiyasına (LC) təsir edən müasir tendensiyalara (məsələn, təzyiqin saxlanmaya təsirini anlamağımızın nisbi müqayisəsi [2] Yeni İrəliləyişlər), maye xromatoqrafiyası nəticələrinin şərhinə və müasir LC cihazları ilə problemlərin necə həll ediləcəyinə diqqət yetirmişəm. Bu ayın bölməsində, 2021-ci ilin dekabr ayında başlayan və LC problemlərin həllinin bəzi “həyat və ölüm” mövzularına yönəlmiş seriyamı (3) davam etdirirəm - istifadə etdiyimiz sistemin yaşından asılı olmayaraq, hər hansı bir problem həll edən üçün əla olan elementlər vacibdir. Bu seriyanın əsas mövzusu... LCGC-nin məşhur “LC Problemlərinin Həlli Təlimatı” divar cədvəli (4) bir çox laboratoriyada asılıb. Bu seriyanın üçüncü hissəsi üçün pik forması və ya pik xüsusiyyətləri ilə bağlı məsələlərə diqqət yetirməyi seçdim. İnanılmazdır ki, divar cədvəlində pik formasının zəif olmasının 44 müxtəlif potensial səbəbi sadalanır! Bütün bu məsələləri bir məqalədə ətraflı nəzərdən keçirə bilmərik, ona görə də mövzu ilə bağlı bu ilk hissədə ən çox gördüyüm bəzi məsələlərə diqqət yetirəcəyəm. Ümid edirəm ki, gənc və yaşlı LC istifadəçiləri bu vacib mövzu ilə bağlı bəzi faydalı məsləhətlər və xatırlatmalar tapacaqlar.
Problemlərin həlli ilə bağlı suallara getdikcə daha çox "hər şey mümkündür" cavabı verirəm. Bu cavab şərh edilməsi çətin olan müşahidələri nəzərdən keçirərkən asan görünə bilər, amma mən bunu çox vaxt uyğun hesab edirəm. Pik formasının zəif olmasının bir çox mümkün səbəbləri nəzərə alınmaqla, problemin nə ola biləcəyini nəzərdən keçirərkən açıq fikirli olmaq və potensial səbəbləri prioritetləşdirmək, problemlərin həlli səylərimizə başlamaq üçün ən çox yayılmış ehtimallara diqqət yetirmək vacibdir, bu məqam çox vacibdir.
Hər hansı bir problemin aradan qaldırılması işində əsas addım - amma düşünürəm ki, qiymətləndirilməyən bir addım - həll edilməli olan bir problemin olduğunu qəbul etməkdir. Bir problemin olduğunu qəbul etmək, tez-tez alətlə baş verənlərin nəzəriyyə, empirik bilik və təcrübə ilə formalaşan gözləntilərimizdən fərqli olduğunu qəbul etmək deməkdir (5). Burada istinad edilən "zirvə forması" əslində yalnız zirvənin formasına (simmetrik, asimmetrik, hamar, tüklü, ön kənar, quyruq və s.) deyil, həm də eninə aiddir. Həqiqi zirvə formasına dair gözləntilərimiz sadədir. Nəzəriyyə (6), əksər hallarda xromatoqrafik zirvələrin simmetrik olması və Şəkil 1a-da göstərildiyi kimi Qaus paylanmasının formasına uyğun olması barədə dərslik gözləntisini yaxşı dəstəkləyir. Pik enlərindən gözlədiyimiz şey daha mürəkkəb bir məsələdir və bu mövzunu gələcək məqalədə müzakirə edəcəyik. Şəkil 1-dəki digər zirvə formaları müşahidə edilə biləcək bəzi digər ehtimalları - başqa sözlə, işlərin səhv gedə biləcəyi bəzi yolları göstərir. Bu hissənin qalan hissəsində, vəziyyətin bəzi konkret nümunələrini müzakirə etməyə vaxt sərf edəcəyik. bu forma tiplərinə gətirib çıxarır.
Bəzən xromatoqramda piklərin elülyasiya edilməsi gözlənildiyi yerlərdə ümumiyyətlə müşahidə olunmur. Yuxarıdakı divar qrafiki göstərir ki, pikin olmaması (nümunənin hədəf analitini detektorun reaksiyasını səs-küyün üzərində görmək üçün kifayət edəcək bir konsentrasiyada ehtiva etməsi fərz edilirsə) adətən hansısa cihaz problemi və ya səhv mobil faza şəraiti (əgər ümumiyyətlə müşahidə olunursa) ilə əlaqədardır. piklər, adətən çox "zəif" olur. Bu kateqoriyadakı potensial problemlərin və həllərin qısa siyahısı Cədvəl I-də tapıla bilər.
Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, diqqət yetirmədən və düzəltməyə çalışmadan əvvəl zirvənin nə qədər genişlənməsinə dözmək lazım olduğu məsələsi, gələcək məqalədə müzakirə edəcəyim mürəkkəb bir mövzudur. Təcrübəm göstərir ki, əhəmiyyətli zirvə genişlənməsi tez-tez zirvənin formasında əhəmiyyətli bir dəyişikliklə müşayiət olunur və zirvə quyruğu zirvədən əvvəlki və ya bölünmüş zirvələrdən daha çox yayılmışdır. Bununla belə, nominal simmetrik zirvələr də genişlənir ki, bu da bir neçə fərqli səbəbdən yarana bilər:
Bu məsələlərin hər biri LC-nin əvvəlki saylarında ətraflı müzakirə olunub və bu mövzularla maraqlanan oxucular bu problemlərin kök səbəbləri və potensial həlləri haqqında məlumat üçün əvvəlki məqalələrə müraciət edə bilərlər. Daha ətraflı məlumat üçün.
Pik quyruğu, pik frontallaşma və parçalanma kimyəvi və ya fiziki hadisələrdən qaynaqlana bilər və bu problemlərin potensial həll yollarının siyahısı kimyəvi və ya fiziki problemlə məşğul olub-olmamağımızdan asılı olaraq geniş şəkildə dəyişir. Çox vaxt xromatoqramdakı müxtəlif pikləri müqayisə etməklə, günahkarın kim olduğuna dair vacib ipuçları tapa bilərsiniz. Xromatoqramdakı bütün piklər oxşar formalar göstərirsə, səbəb çox güman ki, fiziki deyil. Yalnız bir və ya bir neçə pik təsirlənirsə, lakin qalanları yaxşı görünürsə, səbəb çox güman ki, kimyəvidir.
Pik quyruğunun kimyəvi səbəbləri burada qısaca müzakirə etmək üçün çox mürəkkəbdir. Maraqlanan oxucu daha ətraflı müzakirə üçün "LC Problemlərinin Həlli"nin son sayına (10) müraciət edə bilər. Lakin, asanlıqla vurulan analitin kütləsini azaltmaq və pik formasının yaxşılaşıb-yaxşılaşmadığını görmək mümkündür. Əgər belədirsə, bu, problemin "kütlə həddindən artıq yüklənməsi" olduğuna dair yaxşı bir ipucudur. Bu halda, metod kiçik analit kütlələrinin vurulması ilə məhdudlaşdırılmalı və ya xromatoqrafik şərtlər dəyişdirilməlidir ki, daha böyük kütlələr vurulduqda belə yaxşı pik formaları əldə edilə bilsin.
Pik quyruğunun bir çox potensial fiziki səbəbi də var. İmkanların ətraflı müzakirəsi ilə maraqlanan oxucular “LC Problemlərinin Həlli” (11) jurnalının son sayına müraciət edə bilərlər. Pik quyruğunun ən çox yayılmış fiziki səbəblərindən biri injektor və detektor arasındakı nöqtədə zəif əlaqədir (12). Ekstremal bir nümunə bir neçə həftə əvvəl laboratoriyamda əldə edilən Şəkil 1d-də göstərilmişdir. Bu halda, əvvəllər istifadə etmədiyimiz yeni bir injektor klapanı olan bir sistem qurduq və paslanmayan polad kapilyar üzərində qəliblənmiş bir ferrul ilə kiçik həcmli bir injektor döngəsi quraşdırdıq. Bəzi ilkin problemlərin aradan qaldırılması təcrübələrindən sonra, injektor klapan statorundakı port dərinliyinin alışdığımızdan daha dərin olduğunu və portun altındakı böyük bir ölü həcmə səbəb olduğunu anladıq. Bu problem injektor döngəsini başqa bir boru ilə əvəz etməklə asanlıqla həll olunur, portun altındakı ölü həcmi aradan qaldırmaq üçün ferrulanı lazımi vəziyyətə gətirə bilərik.
Şəkil 1e-də göstərilən pik cəbhələri də fiziki və ya kimyəvi problemlərdən qaynaqlana bilər. Ön kənarın ümumi fiziki səbəbi sütunun hissəcik yatağının yaxşı yığılmaması və ya hissəciklərin zamanla yenidən təşkil edilməsidir. Bu fiziki fenomenin yaratdığı pik quyruğunda olduğu kimi, bunu düzəltməyin ən yaxşı yolu sütunu dəyişdirmək və davam etməkdir. Əsasən, kimyəvi mənşəli ön kənar pik formaları tez-tez "qeyri-xətti" saxlama şərtləri adlandırdığımız şeylərdən yaranır. İdeal (xətti) şəraitdə, stasionar faza tərəfindən saxlanılan analit miqdarı (deməli, saxlama əmsalı) sütundakı analitin konsentrasiyası ilə xətti olaraq əlaqəlidir. Xromatoqrafik olaraq, bu o deməkdir ki, sütuna vurulan analit kütləsi artdıqca pik daha hündür olur, lakin daha geniş olmur. Bu əlaqə saxlama davranışı qeyri-xətti olduqda pozulur və daha çox kütlə vurulduqca zirvələr nəinki daha hündür, həm də daha geniş olur. Bundan əlavə, qeyri-xətti formalar xromatoqrafik piklərin formasını müəyyən edir və nəticədə aparıcı və ya arxa kənarlar yaranır. Pik quyruğuna səbəb olan kütlə həddindən artıq yüklənməsində olduğu kimi (10), pik Qeyri-xətti tutmanın yaratdığı aparıcılıq, vurulan analit kütləsini azaltmaqla da diaqnoz edilə bilər. Pik forması yaxşılaşarsa, metod aparıcı kənara səbəb olan inyeksiya keyfiyyətini aşmamaq üçün dəyişdirilməli və ya bu davranışı minimuma endirmək üçün xromatoqrafik şərtlər dəyişdirilməlidir.
Bəzən Şəkil 1f-də göstərildiyi kimi, "bölünmüş" pik kimi görünən bir şey müşahidə edirik. Bu problemi həll etməyin ilk addımı pik formasının qismən birgə elütasiyadan (yəni, iki fərqli, lakin yaxından elütasiya edən birləşmənin olması) qaynaqlanıb-çıxmadığını müəyyən etməkdir. Əgər əslində bir-birinə yaxın elütasiya edən iki fərqli analit varsa, deməli, onların qətnaməsini yaxşılaşdırmaq məsələsidir (məsələn, selektivliyi, saxlanmanı və ya lövhə sayını artırmaqla) və görünən "bölünmüş" piklər fiziki ilə əlaqədardır. Performansın sütunun özü ilə heç bir əlaqəsi yoxdur. Çox vaxt bu qərarın ən vacib ipucu xromatoqramdakı bütün piklərin bölünmüş formalar göstərib-göstərməməsidir, yoxsa yalnız bir və ya iki. Əgər bu, sadəcə bir və ya ikidirsə, bu, ehtimal ki, birgə elütasiya problemidir; əgər bütün piklər bölünübsə, bu, ehtimal ki, fiziki problemdir, çox güman ki, sütunun özü ilə bağlıdır.
Sütunun özünün fiziki xüsusiyyətləri ilə əlaqəli bölünmüş zirvələr, adətən, qismən tıxanmış giriş və ya çıxış fritləri və ya sütundakı hissəciklərin yenidən təşkili ilə əlaqədardır ki, bu da sütun kanalının formalaşmasının müəyyən sahələrində mobil fazanın mobil fazadan daha sürətli axmasına imkan verir (digər bölgələrdə (11). Qismən tıxanmış frit bəzən sütundakı axını tərsinə çevirməklə aradan qaldırıla bilər; lakin, mənim təcrübəmə görə, bu, adətən uzunmüddətli deyil, qısamüddətli bir həlldir. Müasir sütunlarda hissəciklər sütun daxilində yenidən birləşərsə, bu, çox vaxt ölümcül olur. Bu nöqtədə sütunu dəyişdirmək və davam etmək ən yaxşısıdır.
Şəkil 1g-dəki pik, həmçinin öz laboratoriyamda bu yaxınlarda baş verən bir nümunədən götürülmüşdür, adətən siqnalın o qədər yüksək olduğunu və cavab diapazonunun ən yüksək həddinə çatdığını göstərir. Optik udma detektorları üçün (bu halda UB-vis), analit konsentrasiyası çox yüksək olduqda, analit detektor axın hüceyrəsindən keçən işığın çox hissəsini udur və aşkar ediləcək çox az işıq qalır. Bu şərtlər altında fotodetektordan gələn elektrik siqnalı müxtəlif səs-küy mənbələrindən, məsələn, kənar işıq və "qaranlıq cərəyan"dan güclü şəkildə təsirlənir və bu da siqnalın görünüşünü çox "qeyri-səlis" edir və analit konsentrasiyasından asılı deyil. Bu baş verdikdə, problem tez-tez analitin inyeksiya həcmini azaltmaqla - inyeksiya həcmini azaltmaqla, nümunəni durulaşdırmaqla və ya hər ikisini etməklə asanlıqla həll edilə bilər.
Xromatoqrafiya məktəbində nümunədəki analit konsentrasiyasının göstəricisi kimi detektor siqnalından (yəni, xromatoqramdakı y oxundan) istifadə edirik. Buna görə də, siqnalı sıfırdan aşağı olan xromatoqramı görmək qəribə görünür, çünki sadə şərh budur ki, bu, mənfi analit konsentrasiyasını göstərir - əlbəttə ki, bu, fiziki olaraq mümkün deyil. Mənim təcrübəmə əsasən, mənfi piklər ən çox optik udma detektorlarından (məsələn, UV-vis) istifadə edərkən müşahidə olunur.
Bu halda, mənfi pik sadəcə sütundan çıxan molekulların pikdən dərhal əvvəl və sonra mobil fazanın özündən daha az işığı udması deməkdir. Bu, məsələn, nisbətən aşağı aşkarlama dalğa uzunluqlarından (<230 nm) və bu dalğa uzunluqlarında işığın çox hissəsini udan mobil faza əlavələrindən istifadə edərkən baş verə bilər. Bu cür əlavələr metanol və ya asetat və ya format kimi bufer komponentləri kimi mobil faza həlledici komponentləri ola bilər. Kalibrləmə əyrisini hazırlamaq və dəqiq kəmiyyət məlumatı əldə etmək üçün mənfi piklərdən istifadə etmək olar, buna görə də onlardan qaçınmaq üçün heç bir fundamental səbəb yoxdur (bu metod bəzən "dolayı UB aşkarlanması" adlanır) (13). Lakin, əgər həqiqətən mənfi piklərdən tamamilə qaçınmaq istəyiriksə, udma aşkarlanması halında, ən yaxşı həll yolu analit mobil fazadan daha çox udması üçün fərqli bir aşkarlama dalğa uzunluğundan istifadə etmək və ya mobil fazanın tərkibini dəyişdirməkdir ki, onlar analitlərdən daha az işığı udsunlar.
Nümunədəki analitdən başqa komponentlərin, məsələn, həlledici matrisinin, refraktiv indeksi mobil fazanın refraktiv indeksindən fərqli olduqda, refraktiv indeks (RI) aşkarlanmasından istifadə edərkən mənfi piklər də görünə bilər. Bu, UB-viz aşkarlanması ilə də baş verir, lakin bu təsir RI aşkarlanmasına nisbətən zəifləməyə meyllidir. Hər iki halda da, nümunə matrisinin tərkibini mobil fazanın tərkibinə daha yaxından uyğunlaşdırmaqla mənfi piklər minimuma endirilə bilər.
LC problemlərin aradan qaldırılmasının əsas mövzusuna həsr olunmuş üçüncü hissədə müşahidə olunan pik formasının gözlənilən və ya normal pik formasından fərqləndiyi vəziyyətləri müzakirə etdim. Bu cür problemlərin effektiv şəkildə aradan qaldırılması gözlənilən pik formaları haqqında məlumatla başlayır (nəzəriyyəyə və ya mövcud metodlarla əvvəlki təcrübəyə əsaslanaraq), buna görə də bu gözləntilərdən sapmalar göz qabağındadır. Pik forma problemlərinin bir çox müxtəlif potensial səbəbləri var (həddindən artıq geniş, quyruq, ön kənar və s.). Bu hissədə ən çox gördüyüm bəzi səbəbləri ətraflı müzakirə edirəm. Bu detalları bilmək problemlərin aradan qaldırılmasına başlamaq üçün yaxşı bir yer təmin edir, lakin bütün imkanları əhatə etmir. Səbəblərin və həll yollarının daha ətraflı siyahısı ilə maraqlanan oxucular LCGC-nin “LC Problemlərinin Həlli Təlimatı” divar cədvəlinə baxa bilərlər.
(4) LCGC “LC Problemlərin Həlli Təlimatı” divar cədvəli.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Xromatoqrafiyada Məlumatların Təhlili və Siqnalların Emalı (Elsevier, Nyu-York, NY, 1998), səh. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF və Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.