חלק מנושאי פתרון הבעיות ב-LC לעולם אינם מיושנים, שכן ישנן בעיות בפועל של LC, גם כאשר טכנולוגיית המכשירים משתפרת עם הזמן. ישנן דרכים רבות בהן בעיות יכולות להתעורר במערכת LC ולהגיע למצב שיא גרוע. כאשר מתעוררות בעיות הקשורות לצורת השיא, רשימה קצרה של סיבות אפשריות לתוצאות אלו עוזרת לפשט את חוויית פתרון הבעיות שלנו.
היה כיף לכתוב את הטור הזה "פתרון בעיות LC" ולחשוב על נושאים בכל חודש, כי נושאים מסוימים אף פעם לא יוצאים מהאופנה. בעוד שבתחום מחקר הכרומטוגרפיה נושאים או רעיונות מסוימים הופכים למיושנים כשהם מוחלפים על ידי רעיונות חדשים וטובים יותר, בתחום פתרון הבעיות, מאז שהמאמר הראשון על פתרון בעיות הופיע בכתב עת זה (כתב העת LC ​​באותה תקופה) מאז שחלק מהנושאים עדיין רלוונטיים) בשנת 1983 (1). במהלך השנים האחרונות, התמקדתי בכמה מדורים של פתרון בעיות LC במגמות עכשוויות המשפיעות על כרומטוגרפיית נוזלים (LC) (לדוגמה, ההשוואה היחסית של הבנתנו את השפעת הלחץ על אצירת נוזלים [2] התקדמות חדשה) הפרשנות שלנו לתוצאות LC וכיצד לפתור בעיות עם מכשירי LC מודרניים. בפרק החודש, אני ממשיך את הסדרה שלי (3), שהחלה בדצמבר 2021, שהתמקדה בכמה מנושאי "חיים ומוות" של פתרון בעיות LC - אלמנטים נהדרים לכל פותר בעיות הם חיוניים, לא משנה גיל המערכת בה אנו משתמשים. הנושא המרכזי של סדרה זו רלוונטי מאוד לתרשים הקיר המפורסם של LCGC "מדריך פתרון בעיות LC" (4) התלוי ב... מעבדות רבות. בחלק השלישי של סדרה זו, בחרתי להתמקד בנושאים הקשורים לצורת השיא או למאפייני השיא. באופן מדהים, תרשים הקיר מפרט 44 סיבות אפשריות שונות לצורת שיא גרועה! איננו יכולים להתייחס לכל הבעיות הללו בפירוט במאמר אחד, לכן בחלק הראשון בנושא, אתמקד בכמה מהן שאני רואה בתדירות הגבוהה ביותר. אני מקווה שמשתמשי LC צעירים וותיקים ימצאו כמה טיפים ותזכורות מועילים בנושא חשוב זה.
אני מוצא את עצמי עונה יותר ויותר על שאלות לפתרון בעיות ב"הכל אפשרי". תגובה זו אולי נראית קלה כשלוקחים בחשבון תצפיות שקשה לפרש, אבל אני מוצא אותה לעתים קרובות מתאימה. עם סיבות אפשריות רבות לצורת שיא גרועה, חשוב לשמור על ראש פתוח כששוקלים מה הבעיה עשויה להיות, ולהיות מסוגלים לתעדף סיבות פוטנציאליות כדי להתחיל את מאמצי פתרון הבעיות שלנו, תוך התמקדות באפשרויות הנפוצות ביותר, נקודה זו חשובה מאוד.
שלב מפתח בכל תרגיל פתרון בעיות - אבל כזה שלדעתי לא מוערך מספיק - הוא ההכרה שיש בעיה שצריך לפתור. הכרה שיש בעיה פירושה לעתים קרובות הכרה שמה שקורה לכלי שונה מהציפיות שלנו, שמעוצבות על ידי תיאוריה, ידע אמפירי וניסיון (5). "צורת השיא" המתייחסת כאן מתייחסת למעשה לא רק לצורת השיא (סימטרי, אסימטרי, חלק, רך, קצה מוביל, זנב וכו'), אלא גם לרוחב. הציפיות שלנו לצורת השיא בפועל הן פשוטות. תיאוריה (6) תומכת היטב בציפייה של ספרי הלימוד שברוב המקרים, שיאי הכרומטוגרפיה צריכים להיות סימטריים ולתאם לצורת התפלגות גאוסית, כפי שמוצג באיור 1א. מה שאנו מצפים מרוחב שיאים הוא נושא מורכב יותר, ונדון בנושא זה במאמר עתידי. צורות השיא האחרות באיור 1 מראות כמה מהאפשרויות האחרות שניתן לצפות בהן - במילים אחרות, כמה מהדרכים בהן דברים יכולים להשתבש. בהמשך פרק זה, נקדיש זמן לדיון בכמה דוגמאות ספציפיות למצבים שיכולים להוביל ל... סוגי הצורות הללו.
לעיתים, שיאים כלל אינם נצפים בכרומטוגרמה, במקום בו הם צפויים להיחמק. תרשים הקיר שלעיל מצביע על כך שהיעדר שיא (בהנחה שהדגימה אכן מכילה את האנליט המטרה בריכוז שאמור לגרום לתגובת הגלאי להיות מספקת כדי לראותו מעל הרעש) קשור בדרך כלל לבעיה כלשהי במכשיר או לתנאי פאזה ניידת שגויים (אם בכלל נצפים). שיאים, בדרך כלל "חלשים" מדי. רשימה קצרה של בעיות ופתרונות פוטנציאליים בקטגוריה זו ניתן למצוא בטבלה I.
כפי שצוין לעיל, השאלה כמה יש לסבול את הרחבת השיא לפני שמשיכים את תשומת הלב ומנסים לתקן אותה היא נושא מורכב שאדון בו במאמר עתידי. מניסיוני, הרחבת שיא משמעותית מלווה לעתים קרובות בשינוי משמעותי בצורת השיא, וזנב השיא נפוץ יותר מאשר טרום-שיא או פיצול. עם זאת, גם השיאים הסימטריים הנומינליים מורחבים, דבר שיכול להיגרם מכמה סיבות שונות:
כל אחת מהבעיות הללו נדונה בפירוט בגיליונות קודמים של Troubleshooting LC, וקוראים המתעניינים בנושאים אלה יכולים לעיין במאמרים קודמים אלה לקבלת מידע על שורשי הבעיות והפתרונות הפוטנציאליים לבעיות אלו. פרטים נוספים.
זנב שיא, חזית שיא ופיצול - כולם יכולים להיגרם על ידי תופעות כימיות או פיזיקליות, ורשימת הפתרונות הפוטנציאליים לבעיות אלו משתנה מאוד, בהתאם לשאלה האם מדובר בבעיה כימית או פיזיקלית. לעתים קרובות, על ידי השוואת הפסגות השונות בכרומטוגרמה, ניתן למצוא רמזים חשובים לגבי איזו מהן הגורם. אם כל הפסגות בכרומטוגרמה מציגות צורות דומות, סביר להניח שהסיבה אינה פיזיקלית. אם רק פסגה אחת או כמה נפגעות, אך השאר נראות בסדר, סביר להניח שהסיבה היא כימית.
הגורמים הכימיים ל"זנב שיא" מורכבים מכדי לדון בהם בקצרה כאן. הקורא המעוניין מופנה לגיליון האחרון של "LC Troubleshooting" לדיון מעמיק יותר (10). עם זאת, דבר קל לנסות הוא להפחית את המסה של האנליט המוזרק ולראות אם צורת השיא משתפרת. אם כן, זהו רמז טוב לכך שהבעיה היא "עומס יתר של מסה". במקרה זה, יש להגביל את השיטה להזרקת מסות אנליט קטנות, או שיש לשנות את תנאי הכרומטוגרפיה כך שניתן יהיה להשיג צורות שיא טובות גם עם מסות גדולות יותר המוזרקות.
ישנן גם סיבות פיזיקליות פוטנציאליות רבות לשיא זנב. קוראים המעוניינים בדיון מפורט באפשרויות מופנים לגיליון אחרון של "LC Troubleshooting" (11). אחת הסיבות הפיזיות הנפוצות יותר לשיא זנב היא חיבור לקוי בנקודה בין המזרק לגלאי (12). דוגמה קיצונית מוצגת באיור 1d, שהושגה במעבדתי לפני מספר שבועות. במקרה זה, בנינו מערכת עם שסתום הזרקה חדש שלא השתמשנו בו קודם לכן, והתקנו לולאת הזרקה בנפח קטן עם טבעת הידוק שעוצבה על קפילר נירוסטה. לאחר מספר ניסויים ראשוניים לפתרון בעיות, הבנו שעומק הפתח בסטטור שסתום ההזרקה היה עמוק בהרבה ממה שהיינו רגילים אליו, וכתוצאה מכך נפח מת גדול בתחתית הפתח. בעיה זו נפתרת בקלות על ידי החלפת לולאת ההזרקה בצינור אחר, אנו יכולים להתאים את טבעת ההידוק למיקום הנכון כדי לבטל את הנפח המת בתחתית הפתח.
חזיתות שיא כמו אלו המוצגות באיור 1e יכולות להיגרם גם מבעיות פיזיקליות או כימיות. סיבה פיזיקלית נפוצה לקצה הקדמי היא שמצע החלקיקים של העמודה אינו דחוס היטב, או שהחלקיקים התארגנו מחדש עם הזמן. כמו עם זנב שיא הנגרם מתופעה פיזיקלית זו, הדרך הטובה ביותר לתקן זאת היא להחליף את העמודה ולהמשיך הלאה. באופן עקרוני, צורות שיא בקצה הקדמי שמקורן כימי נובעות לעתים קרובות ממה שאנו מכנים תנאי שמירה "לא ליניאריים". בתנאים אידיאליים (ליניאריים), כמות האנליט הנשמרת על ידי הפאזה הנייחת (ומכאן, גורם השמירה) קשורה באופן ליניארי לריכוז האנליט בעמודה. מבחינה כרומטוגרפית, משמעות הדבר היא שככל שמסת האנליט המוזרקת לעמודה עולה, השיא הופך גבוה יותר, אך לא רחב יותר. קשר זה נשבר כאשר התנהגות השמירה אינה ליניארית, והשיאים לא רק הופכים גבוהים יותר אלא גם רחבים יותר ככל שמוזרקת יותר מסה. בנוסף, צורות לא ליניאריות קובעות את צורת השיאים הכרומטוגרפיים, וכתוצאה מכך קצוות קדמיים או נגררים. כמו עם עומס יתר של מסה הגורם לזנב שיא (10), מנהיגות שיא נגרמת ניתן לאבחן ירידה בריכוז האנליט באמצעות שמירה לא ליניארית גם על ידי הפחתת מסת האנליט המוזרק. אם צורת השיא משתפרת, יש לשנות את השיטה כך שלא תעלה על איכות ההזרקה שגורמת לקצה המוביל, או שיש לשנות את תנאי הכרומטוגרפיה כדי למזער התנהגות זו.
לפעמים אנו מבחינים במה שנראה כשיא "מפוצל", כפי שמוצג באיור 1f. הצעד הראשון בפתרון בעיה זו הוא לקבוע האם צורת השיא נובעת משיתוף פעולה חלקי (כלומר, נוכחות של שתי תרכובות נפרדות אך משחררות זו את זו בסמוך). אם ישנם למעשה שני אנליטים שונים המפלטים זה לזה בסמוך, מדובר בשיפור הרזולוציה שלהם (לדוגמה, על ידי הגדלת הסלקטיביות, השימור או ספירת הלוחות), והשיאים ה"מפוצלים" לכאורה קשורים לביצועים פיזיקליים. לביצועים אין שום קשר לעמודה עצמה. לעתים קרובות, הרמז החשוב ביותר להחלטה זו הוא האם כל השיאים בכרומטוגרמה מציגים צורות מפוצלות, או רק אחת או שתיים. אם מדובר רק באחד או שניים, כנראה שמדובר בבעיה של שיתוף פעולה; אם כל השיאים מפוצלים, כנראה שמדובר בבעיה פיזיקלית, שסביר להניח שקשורה לעמודה עצמה.
פיקים מפוצלים הקשורים לתכונות הפיזיקליות של העמודה עצמה נובעים בדרך כלל מחסימות חלקיות של פריטים בכניסה או ביציאה, או ארגון מחדש של חלקיקים בעמודה, מה שמאפשר לפאזה הניידת לזרום מהר יותר מהפאזה הניידת באזורים מסוימים של תצורת תעלת העמודה ובאזורים אחרים (11). פריטים סתומים חלקית ניתנים לעיתים לפינוי על ידי היפוך הזרימה דרך העמודה; עם זאת, מניסיוני, זהו בדרך כלל פתרון לטווח קצר ולא ארוך טווח. זה לעתים קרובות קטלני בעמודות מודרניות אם החלקיקים מתאחדים מחדש בתוך העמודה. בשלב זה, עדיף להחליף את העמודה ולהמשיך.
השיא באיור 1g, גם הוא ממקרה שנערך לאחרונה במעבדה שלי, בדרך כלל מצביע על כך שהאות כה גבוה שהוא הגיע לקצה הגבוה של טווח התגובה. עבור גלאי ספיגה אופטיים (UV-vis במקרה זה), כאשר ריכוז האנליט גבוה מאוד, האנליט סופג את רוב האור העובר דרך תא הזרימה של הגלאי, ומשאיר מעט מאוד אור לגילוי. בתנאים אלה, האות החשמלי מהגלאי הפוטואלקטרי מושפע במידה רבה ממקורות רעש שונים, כגון אור תועה ו"זרם אפל", מה שהופך את האות ל"מטושטש" מאוד במראהו ובלתי תלוי בריכוז האנליט. כאשר זה קורה, ניתן לפתור את הבעיה בקלות על ידי הפחתת נפח ההזרקה של האנליט - הפחתת נפח ההזרקה, דילול הדגימה, או שניהם.
בבית הספר לכרומטוגרפיה, אנו משתמשים באות הגלאי (כלומר, ציר ה-y בכרומטוגרמה) כאינדיקטור לריכוז האנליט בדגימה. לכן נראה מוזר לראות כרומטוגרמה עם אות מתחת לאפס, שכן הפרשנות הפשוטה היא שזה מצביע על ריכוז אנליט שלילי - דבר שכמובן אינו אפשרי פיזיקלית. מניסיוני, שיאים שליליים נצפים לרוב בעת שימוש בגלאי ספיגה אופטיים (למשל, UV-vis).
במקרה זה, שיא שלילי פירושו פשוט שהמולקולות היוצאות מהעמודה בולעות פחות אור מהפאזה הניידת עצמה מיד לפני ואחרי השיא. זה יכול להתרחש, למשל, בעת שימוש באורכי גל גילוי נמוכים יחסית (<230 ננומטר) ותוספי פאזה ניידת הבולעים את רוב האור באורכי גל אלה. תוספים כאלה יכולים להיות רכיבי ממס פאזה ניידת כגון מתנול או רכיבי בופר כגון אצטט או פורמט. למעשה ניתן להשתמש בשיאים שליליים כדי להכין עקומת כיול ולקבל מידע כמותי מדויק, כך שאין סיבה עקרונית להימנע מהם כשלעצמם (שיטה זו מכונה לעיתים "גילוי UV עקיף") (13). עם זאת, אם אנחנו באמת רוצים להימנע משיאים שליליים לחלוטין, במקרה של גילוי ספיגה, הפתרון הטוב ביותר הוא להשתמש באורך גל גילוי שונה כך שהאנליט יבולע יותר מהפאזה הניידת, או לשנות את הרכב הפאזה הניידת כך שהם יבולעים פחות אור מהאנליטים.
שיאים שליליים יכולים להופיע גם בעת שימוש בזיהוי מקדם שבירה (RI) כאשר מקדם השבירה של רכיבים שאינם האנליט בדגימה, כגון מטריצת הממס, שונה ממקדם השבירה של הפאזה הניידת. זה קורה גם בזיהוי UV-vis, אך השפעה זו נוטה להיות מוחלשת יחסית לזיהוי RI. בשני המקרים, ניתן למזער שיאים שליליים על ידי התאמה קרובה יותר של הרכב מטריצת הדגימה לזה של הפאזה הניידת.
בחלק השלישי, העוסק בנושא הבסיסי של פתרון בעיות LC, דנתי במצבים בהם צורת השיא הנצפית שונה מצורת השיא הצפויה או הרגילה. פתרון בעיות יעיל של בעיות כאלה מתחיל בידע של צורות השיא הצפויות (בהתבסס על תיאוריה או ניסיון קודם עם שיטות קיימות), כך שסטיות מהציפיות הללו ברורות. לבעיות צורת שיא יש סיבות פוטנציאליות רבות ושונות (רחבות מדי, זנבות, קצה קדמי וכו'). בחלק זה, אדון בפירוט בכמה מהסיבות שאני רואה בתדירות הגבוהה ביותר. ידיעת פרטים אלה מספקת מקום טוב להתחיל בפתרון בעיות, אך אינה לוכדת את כל האפשרויות. קוראים המעוניינים ברשימה מעמיקה יותר של סיבות ופתרונות יכולים לעיין בתרשים הקיר "מדריך פתרון בעיות LC" של LCGC.
(4) תרשים קיר "מדריך פתרון בעיות LC" של LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) א. פלינגר, ניתוח נתונים ועיבוד אותות בכרומטוגרפיה (אלסוויר, ניו יורק, ניו יורק, 1998), עמ' 43-96.
(8) ווהאב מ.פ., דאסגופטה פ.ק., קאג'ו א.פ. וארמסטרונג ד.וו., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.