Кейбір LC ақауларын жою тақырыптары ешқашан ескірмейді, себебі LC тәжірибесінде мәселелер бар, тіпті аспап технологиясы уақыт өте келе жақсарған сайын. LC жүйесінде мәселелердің пайда болуының және нашар шың пішініне әкелуінің көптеген жолдары бар. Шың пішініне қатысты мәселелер туындаған кезде, осы нәтижелердің ықтимал себептерінің қысқаша тізімі біздің ақауларды жою тәжірибемізді жеңілдетуге көмектеседі.
Осы «LC ақауларын жою» айдарын жазып, ай сайын тақырыптар туралы ойлану қызықты болды, себебі кейбір тақырыптар ешқашан сәннен шықпайды. Хроматография саласындағы зерттеулерде кейбір тақырыптар немесе идеялар ескіреді, себебі олар жаңа және жақсы идеялармен алмастырылады, ақауларды жою саласында, алғашқы ақауларды жою туралы мақала осы журналда (сол кездегі LC журналында) 1983 жылы пайда болғаннан бері (1). Соңғы бірнеше жылда мен LC ақауларын жоюдың бірнеше бөлімдерін сұйық хроматографияға (LC) әсер ететін заманауи үрдістерге (мысалы, қысымның ұстап тұруға әсерін түсінуіміздің салыстырмалы салыстыруы [2] Жаңа жетістіктер) бағыттадым. LC нәтижелерін түсіндіру және қазіргі заманғы LC құралдарымен ақауларды қалай жою керек. Осы айдағы бөлімде мен 2021 жылдың желтоқсанында басталған сериямды (3) жалғастырамын, ол LC ақауларын жоюдың кейбір «өмір мен өлім» тақырыптарына бағытталған - кез келген ақауларды жою құралы үшін өте қолайлы элементтер біз қолданатын жүйенің жасына қарамастан маңызды. Бұл серияның негізгі тақырыбы өте өзекті. LCGC-нің әйгілі «LC ақауларын жою нұсқаулығы» қабырға диаграммасы (4) көптеген зертханаларда ілулі тұр. Осы серияның үшінші бөлігінде мен шың пішініне немесе шың сипаттамаларына қатысты мәселелерге назар аударуды жөн көрдім. Таңқаларлықтай, қабырға диаграммасында шың пішінінің нашар болуының 44 түрлі ықтимал себебі көрсетілген! Біз бұл мәселелердің барлығын бір мақалада егжей-тегжейлі қарастыра алмаймыз, сондықтан тақырып бойынша осы алғашқы бөлімде мен жиі кездесетін мәселелерге тоқталамын. Жас және кәрі LC пайдаланушылары осы маңызды тақырып бойынша пайдалы кеңестер мен еске салғыштар табады деп үміттенемін.
Мен ақаулықтарды жою сұрақтарына «бәрі мүмкін» деп жауап беретінімді байқадым. Түсіндіру қиын бақылауларды қарастырған кезде бұл жауап оңай болып көрінуі мүмкін, бірақ мен оны көбінесе орынды деп санаймын. Шыңның пішінінің нашар болуының көптеген мүмкін себептерін ескере отырып, мәселенің неден туындауы мүмкін екенін қарастырған кезде ашық ойлы болу және ақаулықтарды жою жұмыстарын бастау үшін ықтимал себептерге басымдық бере білу маңызды, ең көп таралған мүмкіндіктерге назар аудара отырып, бұл мәселе өте маңызды.
Кез келген ақаулықтарды жою жаттығуындағы маңызды қадам - ​​бірақ менің ойымша, бағаланбаған - шешілуі керек мәселе бар екенін мойындау. Мәселе бар екенін мойындау көбінесе құралмен болатын жағдай теория, эмпирикалық білім және тәжірибе арқылы қалыптасатын біздің күткенімізден өзгеше екенін мойындауды білдіреді (5). Мұнда айтылған «шың пішіні» шын мәнінде тек шыңның пішініне ғана емес (симметриялы, асимметриялық, тегіс, үлпілдек, алдыңғы жиек, құйрық және т.б.), сонымен қатар еніне де қатысты. Нақты шың пішініне деген күткеніміз қарапайым. Теория (6) көп жағдайда хроматографиялық шыңдар симметриялы болуы және 1a суретте көрсетілгендей Гаусс үлестірімінің пішініне сәйкес келуі керек деген оқулықтағы күтуді жақсы қолдайды. Шың енінен не күтетініміз күрделірек мәселе, және біз бұл тақырыпты келесі мақалада талқылаймыз. 1-суреттегі басқа шың пішіндері байқалуы мүмкін басқа мүмкіндіктердің кейбірін көрсетеді - басқаша айтқанда, нәрселердің дұрыс болмауы мүмкін кейбір жолдар. Осы бөлімнің қалған бөлігінде біз мүмкін болатын жағдайлардың кейбір нақты мысалдарын талқылауға уақыт бөлеміз. осы пішін түрлеріне әкеледі.
Кейде хроматограммада шыңдар мүлдем байқалмайды, онда олар элюцияланады деп күтілуде. Жоғарыдағы қабырға диаграммасы шыңның болмауы (үлгіде детектордың реакциясын шуылдан жоғары көруге жеткілікті ететін концентрацияда нысана аналиті бар деп есептесек) әдетте қандай да бір құрал мәселесімен немесе дұрыс емес жылжымалы фаза жағдайларымен (егер мүлдем байқалса) байланысты екенін көрсетеді. шыңдар, әдетте тым «әлсіз»). Осы санаттағы ықтимал мәселелер мен шешімдердің қысқаша тізімін I кестеден табуға болады.
Жоғарыда айтылғандай, назар аударып, оны түзетуге тырыспас бұрын шыңдардың қаншалықты кеңеюіне жол беру керек деген мәселе - болашақ мақалада талқылайтын күрделі тақырып. Менің тәжірибем бойынша, шыңдардың айтарлықтай кеңеюі көбінесе шың пішінінің айтарлықтай өзгеруімен қатар жүреді, ал шыңдардың құйрығы шыңға дейінгі немесе бөлінуге қарағанда жиі кездеседі. Дегенмен, номиналды симметриялы шыңдар да кеңейеді, бұл бірнеше түрлі себептерге байланысты болуы мүмкін:
Осы мәселелердің әрқайсысы «Троблемаларды жою LC» журналының алдыңғы сандарында егжей-тегжейлі талқыланды, және осы тақырыптарға қызығушылық танытқан оқырмандар осы мәселелердің түпкі себептері мен ықтимал шешімдері туралы ақпарат алу үшін осы алдыңғы мақалаларды қарай алады. Толығырақ.
Шыңның құйрығы, шыңның фронтингі және бөліну химиялық немесе физикалық құбылыстардан туындауы мүмкін, және бұл мәселелердің ықтимал шешімдерінің тізімі химиялық немесе физикалық мәселемен айналысып жатқанымызға байланысты кеңінен өзгереді. Көбінесе, хроматограммадағы әртүрлі шыңдарды салыстыру арқылы кінәлі кім екені туралы маңызды мәліметтерді табуға болады. Егер хроматограммадағы барлық шыңдар ұқсас пішіндерді көрсетсе, себеп, ең алдымен, физикалық емес. Егер тек бір немесе бірнеше шыңдар әсер етсе, бірақ қалғандары жақсы көрінсе, себеп, ең алдымен, химиялық болуы мүмкін.
Шың қалдықтарының химиялық себептерін мұнда қысқаша талқылау тым күрделі. Қызығушылық танытқан оқырманға тереңірек талқылау үшін жақында шыққан «LC ақаулықтарын жою» санына жүгінеміз (10). Дегенмен, оңай көрінетін нәрсе - енгізілген аналиттің массасын азайту және шың пішінінің жақсарғанын көру. Егер солай болса, онда бұл мәселенің «массаның шамадан тыс жүктелуінде» екендігі туралы жақсы түсінік. Бұл жағдайда әдіс шағын аналит массаларын енгізумен шектелуі керек немесе хроматографиялық жағдайларды өзгерту керек, сонда үлкен массалар енгізілген кезде де жақсы шың пішіндерін алуға болады.
Сондай-ақ, шыңның қалдықтарының көптеген физикалық себептері болуы мүмкін. Мүмкіндіктерді егжей-тегжейлі талқылауға қызығушылық танытқан оқырмандар «LC ақаулықтарын жою» (11) журналының жақында шыққан санына назар аударады. Шыңның қалдықтарының ең көп таралған физикалық себептерінің бірі - инжектор мен детектор арасындағы нүктедегі нашар байланыс (12). Төтенше мысал бірнеше апта бұрын менің зертханамда алынған 1d-суретте көрсетілген. Бұл жағдайда біз бұрын қолданбаған жаңа инжекциялық клапаны бар жүйені құрдық және тот баспайтын болаттан жасалған капиллярға құйылған ферруласы бар шағын көлемді инжекциялық ілмекті орнаттық. Алғашқы ақаулықтарды жою тәжірибелерінен кейін, инжекциялық клапан статорындағы порт тереңдігі біз үйренгеннен әлдеқайда терең екенін, нәтижесінде порттың түбінде үлкен өлі көлем пайда болғанын түсіндік. Бұл мәселе инжекциялық ілмекті басқа түтікпен ауыстыру арқылы оңай шешіледі, біз порттың түбіндегі өлі көлемді жою үшін ферруланы тиісті күйге келтіре аламыз.
1e суретте көрсетілгендей шың фронттары физикалық немесе химиялық мәселелерден де туындауы мүмкін. Алдыңғы жиектің жиі кездесетін физикалық себебі - бағанның бөлшектер қабатының дұрыс жиналмауы немесе бөлшектердің уақыт өте келе қайта құрылуы. Осы физикалық құбылыстан туындаған шың құйрығы сияқты, мұны түзетудің ең жақсы жолы - бағанды ​​ауыстыру және жалғастыру. Негізінде, химиялық шығу тегі бар алдыңғы жиек шыңдарының пішіндері көбінесе біз «сызықтық емес» ұстап тұру жағдайлары деп атайтын нәрседен туындайды. Идеал (сызықтық) жағдайларда стационарлық фаза ұстап тұрған аналит мөлшері (демек, ұстап тұру коэффициенті) бағандағы аналит концентрациясына сызықтық түрде байланысты. Хроматографиялық тұрғыдан бұл бағанға енгізілген аналит массасы артқан сайын шың биік болады, бірақ кең болмайды дегенді білдіреді. Бұл қатынас ұстап тұру әрекеті сызықтық емес болған кезде бұзылады және шыңдар тек биік емес, сонымен қатар масса көбірек енгізілген сайын кеңейеді. Сонымен қатар, сызықтық емес пішіндер хроматографиялық шыңдардың пішінін анықтайды, бұл алдыңғы немесе артқы жиектерге әкеледі. Шың құйрығын тудыратын массаның шамадан тыс жүктелуі сияқты (10), шың Сызықтық емес ұстап қалудан туындаған жетекшілікті енгізілген аналит массасын азайту арқылы да диагностикалауға болады. Егер шыңның пішіні жақсарса, әдіс жетекші жиекті тудыратын енгізу сапасынан аспайтындай етіп өзгертілуі керек немесе бұл мінез-құлықты азайту үшін хроматографиялық жағдайлар өзгертілуі керек.
Кейде біз 1f-суретте көрсетілгендей, «бөлінген» шыңды байқаймыз. Бұл мәселені шешудің алғашқы қадамы - шың пішінінің ішінара бірлесіп элюциялануына байланысты екенін анықтау (яғни, екі бөлек, бірақ тығыз элюцияланатын қосылыстардың болуы). Егер бір-біріне жақын орналасқан екі түрлі аналит болса, онда олардың ажыратымдылығын жақсарту мәселесі (мысалы, селективтілікті, ұстап тұруды немесе пластиналар санын арттыру арқылы), ал көрінетін «бөлінген» шыңдар физикалық сипаттамаларға байланысты. Өнімділіктің бағанның өзіне ешқандай қатысы жоқ. Көбінесе, бұл шешімнің ең маңызды кілті - хроматограммадағы барлық шыңдар бөлінген пішіндерді көрсете ме, әлде тек бір немесе екі шың ба. Егер ол тек бір немесе екі болса, бұл, мүмкін, бірлесіп элюциялану мәселесі; егер барлық шыңдар бөлінген болса, бұл, мүмкін, физикалық мәселе, көбінесе бағанның өзіне байланысты.
Бағанның физикалық қасиеттеріне байланысты бөлінген шыңдар әдетте ішінара бітеліп қалған кіріс немесе шығыс фриттеріне немесе бағандағы бөлшектердің қайта құрылуына байланысты болады, бұл баған арнасының қалыптасуының кейбір аймақтарында жылжымалы фазаның жылжымалы фазаға қарағанда жылдамырақ ағуына мүмкіндік береді (басқа аймақтарда) (11). Жартылай бітеліп қалған фритті кейде баған арқылы ағынды кері бұру арқылы жоюға болады; дегенмен, менің тәжірибем бойынша, бұл әдетте ұзақ мерзімді емес, қысқа мерзімді шешім болып табылады. Егер бөлшектер баған ішінде қайта біріксе, бұл қазіргі заманғы бағандарда көбінесе өлімге әкеледі. Осы кезде бағанды ​​​​орнына қойып, жалғастырған дұрыс.
1g-суреттегі шың, менің өз зертханамда жақында болған жағдайда, әдетте сигналдың жауап диапазонының жоғары шегіне жеткенін көрсетеді. Оптикалық сіңіру детекторлары үшін (бұл жағдайда ультракүлгін сәуле), аналит концентрациясы өте жоғары болған кезде, аналит детектор ағыны ұяшығынан өтетін жарықтың көп бөлігін сіңіреді, бұл анықталатын жарықтың өте аз мөлшерін қалдырады. Мұндай жағдайларда фотодетектордан шығатын электр сигналына әртүрлі шу көздері, мысалы, адасқан жарық және «қараңғы ток» қатты әсер етеді, бұл сигналды сыртқы түрі бойынша өте «бұлыңғыр» етеді және аналит концентрациясына тәуелсіз етеді. Бұл орын алған кезде, мәселені көбінесе аналиттің инъекция көлемін азайту арқылы оңай шешуге болады - инъекция көлемін азайту, үлгіні сұйылту немесе екеуі де.
Хроматография мектебінде біз үлгідегі аналит концентрациясының индикаторы ретінде детектор сигналын (яғни, хроматограммадағы y осін) қолданамыз. Сондықтан сигналы нөлден төмен хроматограмманы көру таңқаларлық болып көрінеді, себебі қарапайым түсіндірме - бұл аналит концентрациясының теріс екенін көрсетеді - бұл, әрине, физикалық тұрғыдан мүмкін емес. Менің тәжірибемде, оптикалық сіңіру детекторларын (мысалы, УК-көрініс) пайдаланған кезде теріс шыңдар көбінесе байқалады.
Бұл жағдайда теріс шың бағаннан шығатын молекулалардың шыңның алдында және одан кейін бірден жылжымалы фазаның өзіне қарағанда аз жарық сіңіретінін білдіреді. Бұл, мысалы, салыстырмалы түрде төмен анықтау толқын ұзындықтарын (<230 нм) және осы толқын ұзындықтарында жарықтың көп бөлігін сіңіретін жылжымалы фазалық қоспаларды қолданған кезде орын алуы мүмкін. Мұндай қоспалар метанол немесе ацетат немесе формат сияқты буферлік компоненттер сияқты жылжымалы фазалық еріткіш компоненттері болуы мүмкін. Калибрлеу қисығын дайындау және дәл сандық ақпарат алу үшін теріс шыңдарды пайдалануға болады, сондықтан олардан аулақ болудың ешқандай негізгі себебі жоқ (бұл әдіс кейде «жанама ультракүлгін анықтау» деп аталады) (13). Дегенмен, егер біз шынымен де теріс шыңдардан мүлдем аулақ болғымыз келсе, сіңіруді анықтау жағдайында ең жақсы шешім - аналит жылжымалы фазаға қарағанда көбірек сіңіретіндей етіп басқа анықтау толқын ұзындығын пайдалану немесе жылжымалы фазаның құрамын аналиттерге қарағанда аз жарық сіңіретіндей етіп өзгерту.
Теріс шыңдар, сондай-ақ, үлгідегі аналиттен басқа компоненттердің, мысалы, еріткіш матрицасы, сыну көрсеткіші жылжымалы фазаның сыну көрсеткішінен өзгеше болған кезде сыну көрсеткішін (СҚ) анықтауды пайдаланған кезде де пайда болуы мүмкін. Бұл УК-көріністі анықтауда да болады, бірақ бұл әсер СҚ анықтауға қатысты әлсірейді. Екі жағдайда да, үлгі матрицасының құрамын жылжымалы фазаның құрамымен дәлірек сәйкестендіру арқылы теріс шыңдарды азайтуға болады.
LC ақауларын жоюдың негізгі тақырыбына арналған үшінші бөлімде мен байқалған шың пішіні күтілетін немесе қалыпты шың пішінінен өзгеше болатын жағдайларды талқыладым. Мұндай мәселелерді тиімді шешу күтілетін шың пішіндерін білуден басталады (теорияға немесе қолданыстағы әдістермен бұрынғы тәжірибеге негізделген), сондықтан бұл күтулерден ауытқулар айқын. Шың пішіні мәселелерінің көптеген әртүрлі ықтимал себептері бар (тым кең, құйрық, алдыңғы жиек және т.б.). Бұл бөлімде мен жиі көретін кейбір себептерді егжей-тегжейлі талқылаймын. Бұл мәліметтерді білу ақауларды жоюды бастау үшін жақсы орын береді, бірақ барлық мүмкіндіктерді қамтымайды. Себептер мен шешімдердің егжей-тегжейлі тізіміне қызығушылық танытқан оқырмандар LCGC «LC ақауларын жою нұсқаулығы» қабырға кестесін қарай алады.
(4) LCGC «LC ақаулықтарды жою нұсқаулығы» қабырға диаграммасы. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Хроматографиядағы деректерді талдау және сигналдарды өңдеу (Elsevier, Нью-Йорк, Нью-Йорк, 1998), 43-96 беттер.
(8) Вахаб М.Ф., Дасгупта П.К., Каджо А.Ф. және Армстронг Д.В., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.