Alcuni argomenti relativi alla risoluzione dei problemi in cromatografia liquida (LC) rimangono sempre attuali, poiché permangono problematiche nella pratica LC, nonostante il continuo miglioramento della tecnologia degli strumenti. Esistono molti modi in cui possono insorgere problemi in un sistema LC e portare a una forma del picco non ottimale. Quando si presentano problemi relativi alla forma del picco, un breve elenco delle possibili cause di tali risultati semplifica la risoluzione dei problemi.
È stato divertente scrivere questa rubrica "Risoluzione dei problemi in LC" e pensare agli argomenti ogni mese, perché alcuni argomenti non passano mai di moda. Mentre nel campo della ricerca cromatografica certi argomenti o idee diventano obsoleti in quanto superati da idee più nuove e migliori, nel campo della risoluzione dei problemi, dal primo articolo sulla risoluzione dei problemi apparso su questa rivista (l'LC Journal all'epoca) poiché alcuni argomenti sono ancora rilevanti) nel 1983(1). Negli ultimi anni, ho concentrato diverse sezioni di Risoluzione dei problemi in LC sulle tendenze contemporanee che influenzano la cromatografia liquida (LC) (ad esempio, il confronto relativo della nostra comprensione dell'effetto della pressione sulla ritenzione [2] Nuovi progressi) La nostra interpretazione dei risultati LC e come risolvere i problemi con i moderni strumenti LC. Nella puntata di questo mese, continuo la mia serie (3), iniziata nel dicembre 2021, che si è concentrata su alcuni degli argomenti "di vita o di morte" della risoluzione dei problemi in LC: elementi che sono ottimi per qualsiasi risolutore di problemi sono essenziali, indipendentemente dall'età del sistema che stiamo utilizzando. L'argomento centrale di questa serie è molto rilevante per il famoso grafico a parete "LC Troubleshooting Guide" (4) dell'LCGC, appeso in molti laboratori. Per la terza parte di questa serie, ho scelto di concentrarmi sui problemi relativi alla forma o alle caratteristiche del picco. Incredibilmente, il grafico a parete elenca 44 diverse potenziali cause di una forma del picco scadente! Non possiamo considerare tutti questi problemi in dettaglio in un solo articolo, quindi in questa prima parte sull'argomento, mi concentrerò su alcuni di quelli che vedo più spesso. Spero che gli utenti di LC, giovani e meno giovani, trovino alcuni suggerimenti e promemoria utili su questo importante argomento.
Mi ritrovo sempre più spesso a rispondere alle domande sulla risoluzione dei problemi con "tutto è possibile". Questa risposta può sembrare facile quando si considerano osservazioni difficili da interpretare, ma la trovo spesso appropriata. Con molte possibili cause di una forma del picco non ottimale, è importante mantenere una mente aperta quando si considera quale potrebbe essere il problema ed essere in grado di dare priorità alle potenziali cause per iniziare i nostri sforzi di risoluzione dei problemi, concentrandoci sulle possibilità più comuni, questo punto è molto importante.
Un passaggio fondamentale in qualsiasi esercizio di risoluzione dei problemi, ma che a mio avviso è sottovalutato, è riconoscere che esiste un problema da risolvere. Riconoscere che esiste un problema spesso significa riconoscere che ciò che accade allo strumento è diverso dalle nostre aspettative, che sono plasmate dalla teoria, dalla conoscenza empirica e dall'esperienza (5). La "forma del picco" a cui si fa riferimento qui si riferisce in realtà non solo alla forma del picco (simmetrica, asimmetrica, liscia, soffice, bordo anteriore, coda, ecc.), ma anche alla larghezza. Le nostre aspettative sulla forma effettiva del picco sono semplici. La teoria (6) supporta bene l'aspettativa da manuale che, nella maggior parte dei casi, i picchi cromatografici dovrebbero essere simmetrici e conformarsi alla forma di una distribuzione gaussiana, come mostrato nella Figura 1a. Ciò che ci aspettiamo dalla larghezza dei picchi è una questione più complessa e discuteremo questo argomento in un articolo futuro. Le altre forme dei picchi nella Figura 1 mostrano alcune delle altre possibilità che potrebbero essere osservate, in altre parole, alcuni dei modi in cui le cose potrebbero andare storte. Nel resto di questo In questa puntata, dedicheremo del tempo ad analizzare alcuni esempi specifici di situazioni che possono portare a queste tipologie di forme.
A volte i picchi non vengono osservati affatto nel cromatogramma in cui ci si aspetterebbe che vengano eluiti. Il grafico a parete sopra riportato indica che l'assenza di un picco (supponendo che il campione contenga effettivamente l'analita target a una concentrazione tale da rendere la risposta del rivelatore sufficiente a rilevarlo al di sopra del rumore) è solitamente correlata a un problema dello strumento o a condizioni errate della fase mobile (se presente). I picchi sono generalmente troppo "deboli"). Un breve elenco di potenziali problemi e soluzioni in questa categoria è riportato nella Tabella I.
Come accennato in precedenza, la questione di quanto allargamento del picco sia tollerabile prima di prestare attenzione e cercare di correggerlo è un argomento complesso che tratterò in un articolo futuro. La mia esperienza mi dice che un allargamento significativo del picco è spesso accompagnato da un cambiamento significativo nella forma del picco, e la coda del picco è più comune del pre-picco o della scissione. Tuttavia, anche i picchi nominalmente simmetrici risultano allargati, il che può essere causato da diverse ragioni:
Ciascuno di questi problemi è stato trattato in dettaglio nei numeri precedenti di Troubleshooting LC, e i lettori interessati a questi argomenti possono consultare tali articoli per informazioni sulle cause principali e sulle possibili soluzioni. Maggiori dettagli.
La formazione di code, fronti e sdoppiamenti dei picchi possono essere causati da fenomeni chimici o fisici, e l'elenco delle possibili soluzioni a questi problemi varia notevolmente a seconda che si tratti di un problema chimico o fisico. Spesso, confrontando i diversi picchi in un cromatogramma, è possibile trovare indizi importanti su quale sia la causa. Se tutti i picchi in un cromatogramma presentano forme simili, la causa non è probabilmente fisica. Se solo uno o pochi picchi sono interessati, mentre gli altri appaiono normali, la causa è molto probabilmente chimica.
Le cause chimiche dell'allungamento del picco sono troppo complesse per essere discusse brevemente qui. Il lettore interessato può consultare il recente numero di "LC Troubleshooting" per una discussione più approfondita (10). Tuttavia, un semplice tentativo consiste nel ridurre la massa dell'analita iniettato e verificare se la forma del picco migliora. In tal caso, questo è un buon indizio che il problema è il "sovraccarico di massa". In questo caso, il metodo deve essere limitato all'iniezione di piccole masse di analita, oppure le condizioni cromatografiche devono essere modificate in modo da ottenere una buona forma del picco anche con masse maggiori iniettate.
Esistono anche molte potenziali ragioni fisiche per la coda del picco. I lettori interessati a una discussione dettagliata delle possibilità sono invitati a consultare un altro numero recente di "LC Troubleshooting" (11). Una delle cause fisiche più comuni della coda del picco è una connessione scadente in un punto tra l'iniettore e il rivelatore (12). Un esempio estremo è mostrato nella Figura 1d, ottenuto nel mio laboratorio alcune settimane fa. In questo caso, abbiamo costruito un sistema con una nuova valvola di iniezione che non avevamo mai usato prima e abbiamo installato un piccolo circuito di iniezione con una ghiera che era stata modellata su un capillare di acciaio inossidabile. Dopo alcuni esperimenti iniziali di risoluzione dei problemi, ci siamo resi conto che la profondità della porta nello statore della valvola di iniezione era molto maggiore di quella a cui eravamo abituati, con conseguente grande volume morto sul fondo della porta. Questo problema si risolve facilmente sostituendo il circuito di iniezione con un altro tubo, possiamo regolare la ghiera nella posizione corretta per eliminare il volume morto sul fondo della porta.
I fronti di picco come quelli mostrati nella Figura 1e possono anche essere causati da problemi fisici o chimici. Una causa fisica comune del bordo anteriore è che il letto di particelle della colonna non è ben impaccato o che le particelle si sono riorganizzate nel tempo. Come per la coda del picco causata da questo fenomeno fisico, il modo migliore per risolvere questo problema è sostituire la colonna e continuare. Fondamentalmente, le forme del picco del bordo anteriore di origine chimica derivano spesso da quelle che chiamiamo condizioni di ritenzione "non lineari". In condizioni ideali (lineari), la quantità di analita trattenuta dalla fase stazionaria (quindi, il fattore di ritenzione) è linearmente correlata alla concentrazione dell'analita nella colonna. Cromatograficamente, questo significa che all'aumentare della massa di analita iniettata nella colonna, il picco diventa più alto, ma non più largo. Questa relazione si interrompe quando il comportamento di ritenzione è non lineare e i picchi non solo diventano più alti ma anche più larghi all'aumentare della massa iniettata. Inoltre, le forme non lineari determinano la forma dei picchi cromatografici, risultando in un bordo anteriore o posteriore bordi.Come con il sovraccarico di massa che causa la coda del picco (10), anche l'anticipo del picco causato dalla ritenzione non lineare può essere diagnosticato riducendo la massa dell'analita iniettato.Se la forma del picco migliora, il metodo deve essere modificato per non superare la qualità di iniezione che causa l'anticipo, oppure le condizioni cromatografiche devono essere modificate per minimizzare questo comportamento.
A volte osserviamo quello che sembra essere un picco "sdoppiato", come mostrato nella Figura 1f. Il primo passo per risolvere questo problema è determinare se la forma del picco è dovuta a una co-eluizione parziale (ovvero, la presenza di due composti distinti ma che elucono in prossimità). Se effettivamente ci sono due analiti diversi che elucono vicini, allora si tratta di migliorare la loro risoluzione (ad esempio, aumentando la selettività, la ritenzione o il numero di piatti teorici), e i picchi apparentemente "sdoppiati" sono correlati alle prestazioni fisiche. Le prestazioni non hanno nulla a che fare con la colonna stessa. Spesso, l'indizio più importante per questa decisione è se tutti i picchi nel cromatogramma presentano forme sdoppiate o solo uno o due. Se si tratta solo di uno o due, è probabilmente un problema di co-eluizione; se tutti i picchi sono sdoppiati, è probabilmente un problema fisico, molto probabilmente correlato alla colonna stessa.
I picchi sdoppiati correlati alle proprietà fisiche della colonna stessa sono solitamente dovuti a filtri di ingresso o di uscita parzialmente bloccati, o alla riorganizzazione delle particelle nella colonna, che consente alla fase mobile di fluire più velocemente rispetto alla fase mobile in determinate aree della formazione del canale della colonna in altre regioni (11). I filtri parzialmente ostruiti possono talvolta essere liberati invertendo il flusso attraverso la colonna; tuttavia, nella mia esperienza, questa è solitamente una soluzione a breve termine piuttosto che a lungo termine. Questo è spesso fatale con le colonne moderne se le particelle si ricombinano all'interno della colonna. A questo punto, è meglio sostituire la colonna e continuare.
Il picco nella Figura 1g, anch'esso relativo a un caso recente nel mio laboratorio, di solito indica che il segnale è così elevato da aver raggiunto il limite superiore dell'intervallo di risposta. Per i rivelatori ad assorbanza ottica (UV-vis in questo caso), quando la concentrazione dell'analita è molto elevata, l'analita assorbe la maggior parte della luce che attraversa la cella di flusso del rivelatore, lasciando pochissima luce da rilevare. In queste condizioni, il segnale elettrico del fotorivelatore è fortemente influenzato da varie fonti di rumore, come la luce diffusa e la "corrente di buio", rendendo il segnale molto "sfocato" e indipendente dalla concentrazione dell'analita. Quando ciò accade, il problema può spesso essere facilmente risolto riducendo il volume di iniezione dell'analita, diluendo il campione o entrambi.
Nei corsi di cromatografia, utilizziamo il segnale del rivelatore (ovvero l'asse y nel cromatogramma) come indicatore della concentrazione dell'analita nel campione. Pertanto, può sembrare strano osservare un cromatogramma con un segnale inferiore a zero, poiché la semplice interpretazione è che ciò indichi una concentrazione negativa dell'analita, il che ovviamente non è fisicamente possibile. Nella mia esperienza, i picchi negativi si osservano più spesso quando si utilizzano rivelatori ad assorbanza ottica (ad esempio, UV-Vis).
In questo caso, un picco negativo significa semplicemente che le molecole che eluiscono dalla colonna assorbono meno luce della fase mobile stessa immediatamente prima e dopo il picco. Ciò può verificarsi, ad esempio, quando si utilizzano lunghezze d'onda di rilevamento relativamente basse (<230 nm) e additivi della fase mobile che assorbono la maggior parte della luce a queste lunghezze d'onda. Tali additivi possono essere componenti del solvente della fase mobile come il metanolo o componenti del tampone come l'acetato o il formiato. È possibile utilizzare i picchi negativi per preparare una curva di calibrazione e ottenere informazioni quantitative accurate, quindi non c'è una ragione fondamentale per evitarli di per sé (questo metodo è talvolta indicato come "rilevamento UV indiretto") (13). Tuttavia, se vogliamo davvero evitare completamente i picchi negativi, nel caso del rilevamento dell'assorbanza, la soluzione migliore è utilizzare una diversa lunghezza d'onda di rilevamento in modo che l'analita assorba più luce della fase mobile, oppure modificare la composizione della fase mobile in modo che assorba meno luce degli analiti.
Picchi negativi possono comparire anche quando si utilizza la rilevazione dell'indice di rifrazione (RI) quando l'indice di rifrazione di componenti diversi dall'analita nel campione, come la matrice del solvente, è diverso dall'indice di rifrazione della fase mobile. Questo accade anche con la rilevazione UV-Vis, ma questo effetto tende ad essere attenuato rispetto alla rilevazione RI. In entrambi i casi, i picchi negativi possono essere minimizzati facendo in modo che la composizione della matrice del campione corrisponda più fedelmente a quella della fase mobile.
Nella terza parte sull'argomento di base della risoluzione dei problemi LC, ho discusso le situazioni in cui la forma del picco osservato differisce da quella prevista o normale. Una risoluzione efficace di tali problemi inizia con la conoscenza delle forme del picco previste (basata sulla teoria o sull'esperienza pregressa con i metodi esistenti), in modo che le deviazioni da queste aspettative siano evidenti. I problemi relativi alla forma del picco possono avere molteplici cause (eccessiva ampiezza, coda, bordo anteriore, ecc.). In questa parte, analizzo in dettaglio alcune delle cause che riscontro più frequentemente. Conoscere questi dettagli fornisce un buon punto di partenza per la risoluzione dei problemi, ma non copre tutte le possibilità. I ​​lettori interessati a un elenco più approfondito di cause e soluzioni possono consultare il poster "Guida alla risoluzione dei problemi LC" di LCGC.
(4) Tabella murale LCGC “Guida alla risoluzione dei problemi LC”.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisi dei dati ed elaborazione del segnale in cromatografia (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.