Sawetara topik pemecahan masalah LC ora tau ketinggalan jaman, amarga ana masalah ing praktik LC, sanajan teknologi instrumen saya apik. Ana akeh cara masalah bisa muncul ing sistem LC lan pungkasane dadi bentuk puncak sing ala. Nalika masalah sing ana gandhengane karo bentuk puncak muncul, dhaptar cendhak panyebab sing bisa kedadeyan kanggo asil kasebut mbantu nyederhanakake pengalaman pemecahan masalah.
Seneng banget nulis kolom "LC Troubleshooting" iki lan mikir babagan topik saben wulan, amarga sawetara topik ora tau ketinggalan jaman. Nalika ing bidang riset kromatografi, topik utawa ide tartamtu dadi ora relevan amarga diganti karo ide sing luwih anyar lan luwih apik, ing bidang pemecahan masalah, wiwit artikel pemecahan masalah pertama muncul ing jurnal iki (Jurnal LC nalika semana) amarga sawetara topik isih relevan) ing taun 1983 (1). Sajrone sawetara taun kepungkur, aku wis fokus sawetara bagean Pemecahan Masalah LC babagan tren kontemporer sing mengaruhi kromatografi cair (LC) (contone, perbandingan relatif pangerten kita babagan efek tekanan ing retensi [2] Kemajuan Anyar) Interpretasi asil LC lan cara ngatasi masalah nganggo instrumen LC modern. Ing cicilan wulan iki, aku nerusake seri (3), sing diwiwiti ing Desember 2021, sing fokus ing sawetara topik "urip lan pati" saka pemecahan masalah LC - unsur sing apik kanggo pemecah masalah apa wae penting, ora preduli umur sistem sing digunakake. Topik inti saka seri iki relevan banget karo LCGC sing misuwur Bagan tembok "Pandhuan Pemecahan Masalah LC" (4) digantung ing akeh laboratorium. Kanggo bagean katelu saka seri iki, aku milih fokus ing masalah sing ana gandhengane karo bentuk puncak utawa karakteristik puncak. Luar biasa, bagan tembok ndhaptar 44 panyebab potensial sing beda saka bentuk puncak sing kurang apik! Kita ora bisa nimbang kabeh masalah kasebut kanthi rinci ing siji artikel, mula ing angsuran pisanan babagan topik iki, aku bakal fokus ing sawetara sing paling kerep dakdeleng. Muga-muga pangguna LC enom lan tuwa bakal nemokake sawetara tips lan pangeling sing migunani babagan topik penting iki.
Aku saya kerep njawab pitakonan babagan pemecahan masalah nganggo tembung "apa wae bisa". Respon iki katon gampang nalika nimbang pengamatan sing angel diinterpretasikake, nanging aku kerep nganggep iki cocog. Kanthi akeh panyebab sing bisa nyebabake bentuk puncak sing ora apik, penting kanggo tetep mbukak pikiran nalika nimbang apa masalah kasebut, lan supaya bisa menehi prioritas panyebab potensial kanggo miwiti upaya pemecahan masalah, kanthi fokus ing kemungkinan sing paling umum, poin iki penting banget.
Langkah penting ing latihan ngatasi masalah apa wae - nanging sing miturutku kurang digatekake - yaiku ngerteni manawa ana masalah sing kudu dirampungake. Ngenali manawa ana masalah asring tegese ngerteni manawa apa sing kedadeyan karo alat kasebut beda karo pangarepan kita, sing dibentuk dening teori, kawruh empiris, lan pengalaman (5). "Wangun puncak" sing kasebut ing kene sejatine ora mung nuduhake wujud puncak (simetris, asimetris, alus, alus, pinggiran ngarep, tailing, lan liya-liyane), nanging uga jembar. Pangarepan kita kanggo wujud puncak sing nyata iku prasaja. Teori (6) ndhukung pangarepan buku teks manawa, ing umume kasus, puncak kromatografi kudu simetris lan cocog karo wujud distribusi Gaussian, kaya sing dituduhake ing Gambar 1a. Apa sing diarepake saka jembar puncak minangka masalah sing luwih kompleks, lan kita bakal ngrembug topik iki ing artikel mbesuk. Wangun puncak liyane ing Gambar 1 nuduhake sawetara kemungkinan liyane sing bisa diamati - kanthi tembung liya, sawetara cara bisa salah. Ing sisa cicilan iki, kita bakal nggunakake wektu kanggo ngrembug sawetara conto tartamtu babagan kahanan sing bisa nyebabake jinis-jinis wujud iki.
Kadhangkala puncak ora diamati babar pisan ing kromatogram ing ngendi diarepake bakal dielusi. Grafik tembok ing ndhuwur nuduhake yen ora ana puncak (yen sampel kasebut pancen ngemot analit target ing konsentrasi sing kudune nggawe respon detektor cukup kanggo ndeleng ing ndhuwur gangguan) biasane ana gandhengane karo sawetara masalah instrumen utawa kondisi fase gerak sing salah (yen diamati kabeh). puncak, biasane "lemah banget"). Dhaptar cendhak masalah lan solusi potensial ing kategori iki bisa ditemokake ing Tabel I.
Kaya sing wis kasebut ing ndhuwur, pitakonan babagan pira pelebaran puncak sing kudu ditoleransi sadurunge menehi perhatian lan nyoba ndandani minangka topik sing rumit sing bakal dakrembug ing artikel sabanjure. Pengalamanku yaiku pelebaran puncak sing signifikan asring diiringi owah-owahan sing signifikan ing bentuk puncak, lan tailing puncak luwih umum tinimbang pra-puncak utawa pamisahan. Nanging, puncak sing simetris nominal uga melebar, sing bisa disebabake dening sawetara alasan sing beda:
Saben masalah iki wis dirembug kanthi rinci ing edisi sadurunge Troubleshooting LC, lan para pamaca sing kepengin ngerti topik iki bisa ngrujuk artikel sadurunge kanggo informasi babagan panyebab utama lan solusi potensial kanggo masalah kasebut. Rincian liyane.
Peak tailing, peak fronting, lan splitting kabeh bisa disebabake dening fenomena kimia utawa fisik, lan dhaptar solusi potensial kanggo masalah kasebut beda-beda, gumantung saka apa kita ngatasi masalah kimia utawa fisik. Asring, kanthi mbandhingake puncak sing beda-beda ing kromatogram, sampeyan bisa nemokake pitunjuk penting babagan endi sing dadi penyebab. Yen kabeh puncak ing kromatogram nuduhake bentuk sing padha, panyebabe kemungkinan gedhe dudu fisik. Yen mung siji utawa sawetara puncak sing kena pengaruh, nanging liyane katon apik, panyebabe kemungkinan gedhe kimia.
Penyebab kimia saka tailing puncak iku rumit banget kanggo dirembug kanthi ringkes ing kene. Pamaca sing kasengsem dirujuk menyang edisi "LC Troubleshooting" anyar kanggo diskusi sing luwih jero (10). Nanging, perkara sing gampang dicoba yaiku nyuda massa analit sing diinjeksi lan ndeleng apa bentuk puncak saya apik. Yen mangkono, mula iki minangka pitunjuk sing apik yen masalah kasebut yaiku "kelebihan massa". Ing kasus iki, metode kasebut kudu diwatesi mung nyuntikake massa analit cilik, utawa kahanan kromatografi kudu diganti supaya bentuk puncak sing apik bisa dipikolehi sanajan massa sing luwih gedhe diinjeksi.
Ana uga akeh alesan fisik potensial kanggo tailing puncak. Para pamaca sing kepengin diskusi rinci babagan kemungkinan kasebut dirujuk menyang edisi anyar "LC Troubleshooting" (11). Salah sawijining panyebab fisik sing luwih umum saka tailing puncak yaiku sambungan sing ora apik ing titik antarane injektor lan detektor (12). Conto ekstrem dituduhake ing Gambar 1d, sing dipikolehi ing lab sawetara minggu kepungkur. Ing kasus iki, kita mbangun sistem kanthi katup injeksi anyar sing durung nate digunakake sadurunge, lan nginstal loop injeksi volume cilik kanthi ferrule sing wis dicetak ing kapiler stainless steel. Sawise sawetara eksperimen pemecahan masalah awal, kita ngerti manawa ambane port ing stator katup injeksi luwih jero tinimbang sing biasa, sing nyebabake volume mati gedhe ing sisih ngisor port. Masalah iki gampang diatasi kanthi ngganti loop injeksi karo tabung liyane, kita bisa nyetel ferrule menyang posisi sing tepat kanggo ngilangi volume mati ing sisih ngisor port.
Puncak ngarep kaya sing dituduhake ing Gambar 1e uga bisa disebabake dening masalah fisik utawa kimia. Penyebab fisik umum saka pinggiran ngarep yaiku amben partikel kolom ora dikemas kanthi apik, utawa partikel wis diatur maneh sajrone wektu. Kaya tailing puncak sing disebabake dening fenomena fisik iki, cara paling apik kanggo ndandani iki yaiku ngganti kolom lan terus mlaku. Sejatine, bentuk puncak pinggiran ngarep kanthi asal kimia asring muncul saka apa sing diarani kahanan retensi "non-linier". Ing kahanan ideal (linier), jumlah analit sing ditahan dening fase stasioner (mula, faktor retensi) ana hubungane kanthi linier karo konsentrasi analit ing kolom. Sacara kromatografi, iki tegese nalika massa analit sing diinjeksi menyang kolom mundhak, puncak dadi luwih dhuwur, nanging ora luwih amba. Hubungan iki rusak nalika prilaku retensi non-linier, lan puncak ora mung dadi luwih dhuwur nanging uga luwih amba nalika luwih akeh massa diinjeksi. Kajaba iku, bentuk nonlinier nemtokake bentuk puncak kromatografi, sing nyebabake pinggiran ngarep utawa mburi. Kaya kelebihan massa sing nyebabake tailing puncak (10), Puncak leading sing disebabake dening retensi nonlinier uga bisa didiagnosis kanthi nyuda massa analit sing diinjeksi. Yen bentuk puncak saya apik, metode kasebut kudu dimodifikasi supaya ora ngluwihi kualitas injeksi sing nyebabake pinggiran leading, utawa kondisi kromatografi kudu diganti kanggo nyuda prilaku iki.
Kadhangkala kita mirsani apa sing katon minangka puncak "dipisah", kaya sing dituduhake ing Gambar 1f. Langkah pisanan kanggo ngrampungake masalah iki yaiku nemtokake manawa wujud puncak kasebut amarga koelusi parsial (yaiku, anané rong senyawa sing béda nanging raket elusine). Yen sejatine ana rong analit sing béda sing dielusi cedhak, mula prekara kasebut yaiku ningkatake resolusine (contone, kanthi nambah selektivitas, retensi, utawa cacah lempeng), lan puncak "dipisah" sing katon ana gandhengane karo fisik. Kinerja ora ana hubungane karo kolom kasebut dhewe. Asring, pitunjuk sing paling penting kanggo keputusan iki yaiku apa kabeh puncak ing kromatogram nuduhake wujud pamisah, utawa mung siji utawa loro. Yen mung siji utawa loro, mbokmenawa masalah koelusi; yen kabeh puncak dipisah, mbokmenawa masalah fisik, kemungkinan gedhe ana gandhengane karo kolom kasebut dhewe.
Puncak pamisah sing ana gandhengane karo sifat fisik kolom kasebut dhewe biasane amarga frit inlet utawa outlet sing sebagian diblokir, utawa reorganisasi partikel ing kolom, sing ngidini fase gerak mili luwih cepet tinimbang fase gerak ing area tartamtu saka pembentukan saluran kolom. Ing wilayah liyane (11). Frit sing sebagian tersumbat kadhangkala bisa diresiki kanthi mbalikke aliran liwat kolom; Nanging, miturut pengalamanku, iki biasane solusi jangka pendek tinimbang jangka panjang. Iki asring fatal karo kolom modern yen partikel kasebut gabung maneh ing kolom. Ing wektu iki, luwih becik ngganti kolom lan terus.
Puncak ing Gambar 1g, uga saka conto anyar ing labku dhewe, biasane nuduhake yen sinyal kasebut dhuwur banget nganti tekan ujung paling dhuwur saka rentang respon. Kanggo detektor absorbansi optik (UV-vis ing kasus iki), nalika konsentrasi analit dhuwur banget, analit nyerep sebagian besar cahya sing ngliwati sel aliran detektor, saengga sithik banget cahya sing bisa dideteksi. Ing kahanan kasebut, sinyal listrik saka fotodetektor dipengaruhi banget dening macem-macem sumber gangguan, kayata cahya nyasar lan "arus peteng", sing ndadekake sinyal kasebut katon "kabur" lan ora gumantung karo konsentrasi analit. Nalika iki kedadeyan, masalah kasebut asring bisa dirampungake kanthi gampang kanthi nyuda volume injeksi analit—ngurangi volume injeksi, ngencerake sampel, utawa loro-lorone.
Ing sekolah kromatografi, kita nggunakake sinyal detektor (yaiku, sumbu y ing kromatogram) minangka indikator konsentrasi analit ing sampel. Dadi, aneh yen ndeleng kromatogram kanthi sinyal ing ngisor nol, amarga interpretasi sing prasaja yaiku iki nuduhake konsentrasi analit negatif - sing mesthi ora bisa ditindakake sacara fisik. Saka pengalamanku, puncak negatif paling asring diamati nalika nggunakake detektor absorbansi optik (kayata, UV-vis).
Ing kasus iki, puncak negatif mung tegese molekul sing metu saka kolom nyerep cahya luwih sithik tinimbang fase gerak dhewe sadurunge lan sawise puncak. Iki bisa kedadeyan, contone, nalika nggunakake dawa gelombang deteksi sing relatif kurang (<230 nm) lan aditif fase gerak sing nyerep sebagian besar cahya ing dawa gelombang kasebut. Aditif kasebut bisa dadi komponen pelarut fase gerak kayata metanol utawa komponen buffer kayata asetat utawa format. Siji bisa nggunakake puncak negatif kanggo nyiyapake kurva kalibrasi lan entuk informasi kuantitatif sing akurat, mula ora ana alesan dhasar kanggo ngindhari (metode iki kadhangkala diarani "deteksi UV ora langsung") (13). Nanging, yen kita pancen pengin ngindhari puncak negatif kabeh, ing kasus deteksi absorbansi, solusi sing paling apik yaiku nggunakake dawa gelombang deteksi sing beda supaya analit nyerep luwih akeh tinimbang fase gerak, utawa ngganti komposisi fase gerak supaya Dheweke nyerep cahya luwih sithik tinimbang analit.
Puncak negatif uga bisa katon nalika nggunakake deteksi indeks bias (RI) nalika indeks bias komponen liyane kajaba analit ing sampel, kayata matriks pelarut, beda karo indeks bias fase gerak. Iki uga kedadeyan karo deteksi UV-vis, nanging efek iki cenderung dilemahake relatif marang deteksi RI. Ing loro kasus kasebut, puncak negatif bisa diminimalake kanthi luwih cocog karo komposisi matriks sampel karo fase gerak.
Ing bagean katelu babagan topik dhasar pemecahan masalah LC, aku ngrembug kahanan ing ngendi wujud puncak sing diamati beda karo wujud puncak sing diarepake utawa normal. Pemecahan masalah sing efektif kanggo masalah kasebut diwiwiti kanthi kawruh babagan wujud puncak sing diarepake (adhedhasar teori utawa pengalaman sadurunge karo metode sing ana), mula penyimpangan saka pangarepan kasebut jelas. Masalah wujud puncak duwe akeh panyebab potensial sing beda-beda (ke amba banget, tailing, leading edge, lsp.). Ing cicilan iki, aku ngrembug kanthi rinci sawetara alesan sing paling kerep dakdeleng. Ngerteni rincian kasebut nyedhiyakake papan sing apik kanggo miwiti pemecahan masalah, nanging ora bisa nangkep kabeh kemungkinan. Para pamaca sing kepengin ngerti dhaptar panyebab lan solusi sing luwih jero bisa ngrujuk menyang bagan tembok "Pandhuan Pemecahan Masalah LC" LCGC.
(4) Diagram tembok "Pandhuan Ngatasi Masalah LC" LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data lan Pamrosesan Sinyal ing Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), hlm. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF lan Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.