Niektóre tematy dotyczące rozwiązywania problemów z układami LC nigdy nie tracą na aktualności, ponieważ w praktyce LC wciąż pojawiają się problemy, nawet gdy technologia przyrządów z czasem się rozwija. Istnieje wiele sposobów, w jakie mogą pojawić się problemy w układzie LC i skutkować złym kształtem szczytów. Gdy pojawiają się problemy związane z kształtem szczytów, krótka lista możliwych przyczyn tych wyników pomaga uprościć proces rozwiązywania problemów.
Pisanie tej kolumny „Rozwiązywanie problemów z chromatografią cieczową” i myślenie o tematach każdego miesiąca było świetną zabawą, ponieważ niektóre tematy nigdy nie wychodzą z mody. Podczas gdy w dziedzinie badań chromatograficznych pewne tematy lub pomysły stają się przestarzałe, ponieważ są zastępowane przez nowsze i lepsze pomysły, w dziedzinie rozwiązywania problemów, odkąd pierwszy artykuł o rozwiązywaniu problemów pojawił się w tym czasopiśmie (wówczas LC Journal), ponieważ niektóre tematy są nadal aktualne) w 1983 roku (1). Przez ostatnie kilka lat skupiłem kilka sekcji Rozwiązywanie problemów z chromatografią cieczową na współczesnych trendach wpływających na chromatografię cieczową (LC) (na przykład względne porównanie naszej wiedzy na temat wpływu ciśnienia na retencję [2] Nowe postępy), nasza interpretacja wyników LC i jak rozwiązywać problemy za pomocą nowoczesnych urządzeń LC. W tym miesiącu kontynuuję moją serię (3), którą rozpocząłem w grudniu 2021 r., która koncentrowała się na niektórych tematach „życia i śmierci” rozwiązywania problemów z chromatografią cieczową — elementy, które są świetne dla każdego rozwiązywacza problemów, są niezbędne, niezależnie od wieku systemu, którego używamy używając.Główny temat tej serii jest bardzo istotny ze słynnej tabeli ściennej „LC Troubleshooting Guide” (4) LCGC wiszącej w wielu laboratoriach.W trzeciej części tej serii postanowiłem skupić się na problemach związanych z kształtem piku lub jego charakterystyką.Niesamowite, że tabela ścienna wymienia 44 różne potencjalne przyczyny złego kształtu piku!Nie możemy omówić wszystkich tych problemów szczegółowo w jednym artykule, więc w tej pierwszej części tego tematu skupię się na tych, z którymi spotykam się najczęściej.Mam nadzieję, że zarówno młodzi, jak i starsi użytkownicy LC znajdą kilka pomocnych wskazówek i przypomnień na ten ważny temat.
Coraz częściej odpowiadam na pytania dotyczące rozwiązywania problemów słowami „wszystko jest możliwe”. Ta odpowiedź może wydawać się łatwa, gdy bierze się pod uwagę obserwacje trudne do zinterpretowania, ale często uważam ją za właściwą. Przy wielu możliwych przyczynach złego kształtu szczytu, ważne jest, aby zachować otwarty umysł, rozważając, na czym może polegać problem, i móc ustalić priorytety potencjalnych przyczyn, aby rozpocząć rozwiązywanie problemów, koncentrując się na tych najczęstszych możliwościach. Ten punkt jest bardzo ważny.
Kluczowym krokiem w każdym ćwiczeniu rozwiązywania problemów — ale moim zdaniem niedocenianym — jest rozpoznanie, że istnieje problem, który należy rozwiązać. Rozpoznanie, że istnieje problem, często oznacza rozpoznanie, że to, co dzieje się z narzędziem, różni się od naszych oczekiwań, które są kształtowane przez teorię, wiedzę empiryczną i doświadczenie (5). „Kształt szczytu”, o którym mowa w tym przypadku, odnosi się w rzeczywistości nie tylko do kształtu szczytu (symetryczny, asymetryczny, gładki, puszysty, krawędź natarcia, ogonowanie itp.), ale także do szerokości. Nasze oczekiwania co do rzeczywistego kształtu szczytu są proste. Teoria (6) dobrze potwierdza podręcznikowe oczekiwanie, że w większości przypadków szczyty chromatograficzne powinny być symetryczne i zgodne z kształtem rozkładu Gaussa, jak pokazano na rysunku 1a. To, czego oczekujemy od szerokości szczytów, jest bardziej złożoną kwestią i omówimy ten temat w przyszłym artykule. Inne kształty szczytów na rysunku 1 pokazują niektóre z innych możliwości, które można zaobserwować — innymi słowy, niektóre sposoby, w jakie rzeczy mogą pójść nie tak. W pozostałej części tego W dalszej części poświęcimy czas na omówienie kilku konkretnych przykładów sytuacji, które mogą prowadzić do tego typu kształtów.
Czasami piki w ogóle nie są widoczne na chromatogramie, w którym powinny zostać wyeluowane. Powyższy diagram ścienny wskazuje, że brak piku (zakładając, że próbka faktycznie zawiera analit docelowy w stężeniu, które powinno sprawić, że odpowiedź detektora będzie wystarczająca, aby go wykryć ponad szumem) jest zwykle związany z jakimś problemem z urządzeniem lub nieprawidłowymi warunkami fazy ruchomej (jeśli w ogóle zostaną zaobserwowane). piki, zwykle zbyt „słabe”). Krótką listę potencjalnych problemów i rozwiązań w tej kategorii można znaleźć w Tabeli I.
Jak wspomniano powyżej, kwestia tego, jak duże poszerzenie piku należy tolerować, zanim zwrócimy na to uwagę i spróbujemy je naprawić, jest złożonym tematem, który omówię w przyszłym artykule. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​znacznemu poszerzeniu piku często towarzyszy znacząca zmiana kształtu piku, a ogonowanie piku jest częstsze niż przedszczytowe lub rozdzielanie. Jednak nominalnie symetryczne piki również ulegają poszerzeniu, co może być spowodowane kilkoma różnymi przyczynami:
Każdy z tych problemów został szczegółowo omówiony w poprzednich wydaniach Troubleshooting LC, a czytelnicy zainteresowani tymi tematami mogą zapoznać się z poprzednimi artykułami, aby uzyskać informacje na temat przyczyn i potencjalnych rozwiązań tych problemów. Więcej szczegółów.
Ogonowanie, czołowanie i rozszczepienie pików mogą być spowodowane zjawiskami chemicznymi lub fizycznymi, a lista potencjalnych rozwiązań tych problemów jest bardzo zróżnicowana, w zależności od tego, czy mamy do czynienia z problemem chemicznym, czy fizycznym. Często porównując różne piki na chromatogramie, można znaleźć ważne wskazówki, który z nich jest winowajcą. Jeśli wszystkie piki na chromatogramie mają podobne kształty, przyczyna najprawdopodobniej nie jest fizyczna. Jeśli problem dotyczy tylko jednego lub kilku pików, a reszta wygląda dobrze, przyczyną najprawdopodobniej jest chemia.
Przyczyny chemiczne ogonowania pików są zbyt złożone, aby omówić je tu pokrótce. Zainteresowany czytelnik może zapoznać się z bardziej szczegółową dyskusją w najnowszym wydaniu „LC Troubleshooting” (10). Jednakże, łatwym sposobem jest zmniejszenie masy wstrzykiwanego analitu i sprawdzenie, czy kształt piku się poprawi. Jeśli tak, to jest to dobry znak, że problemem jest „przeciążenie masą”. W takim przypadku metoda musi być ograniczona do wstrzykiwania małych mas analitu lub warunki chromatograficzne muszą zostać zmienione tak, aby można było uzyskać dobre kształty pików nawet przy wstrzykiwaniu większych mas.
Istnieje również wiele potencjalnych fizycznych przyczyn ogonowania szczytowego. Czytelnicy zainteresowani szczegółową dyskusją na temat możliwości powinni zapoznać się z innym niedawnym wydaniem „LC Troubleshooting” (11). Jedną z częstszych fizycznych przyczyn ogonowania szczytowego jest słabe połączenie w punkcie między wtryskiwaczem a detektorem (12). Ekstremalny przykład pokazano na rysunku 1d, uzyskanym w moim laboratorium kilka tygodni temu. W tym przypadku zbudowaliśmy system z nowym zaworem wtryskowym, którego wcześniej nie używaliśmy, i zainstalowaliśmy pętlę wtryskową o małej objętości z tuleją, która została uformowana na kapilarze ze stali nierdzewnej. Po kilku początkowych eksperymentach rozwiązywania problemów zdaliśmy sobie sprawę, że głębokość portu w stojanie zaworu wtryskowego była znacznie większa, niż byliśmy przyzwyczajeni, co skutkowało dużą martwą objętością na dole portu. Ten problem można łatwo rozwiązać, zastępując pętlę wtryskową inną rurą, możemy wyregulować tuleję do odpowiedniej pozycji, aby wyeliminować martwą objętość na dole portu.
Czoła pików, takie jak pokazane na rysunku 1e, mogą być również spowodowane problemami fizycznymi lub chemicznymi. Częstą przyczyną fizyczną krawędzi natarcia jest to, że złoże cząstek kolumny nie jest dobrze upakowany lub że cząstki z czasem uległy reorganizacji. Podobnie jak w przypadku ogonowania pików spowodowanego tym zjawiskiem fizycznym, najlepszym sposobem na naprawienie tego jest wymiana kolumny i kontynuowanie pracy. Zasadniczo kształty pików krawędzi natarcia o pochodzeniu chemicznym często powstają z tego, co nazywamy „nieliniowymi” warunkami retencji. W idealnych (liniowych) warunkach ilość analitu zatrzymywana przez fazę stacjonarną (a zatem współczynnik retencji) jest liniowo związana ze stężeniem analitu w kolumnie. Chromatograficznie oznacza to, że wraz ze wzrostem masy analitu wstrzykiwanego do kolumny pik staje się wyższy, ale nie szerszy. Ta zależność zostaje zerwana, gdy zachowanie retencji jest nieliniowe, a piki nie tylko stają się wyższe, ale również szersze wraz ze wstrzykiwaniem większej masy. Ponadto nieliniowe kształty określają kształt pików chromatograficznych, co skutkuje wiodącymi lub krawędzie spływu. Podobnie jak w przypadku przeciążenia masą powodującego ogonowanie piku (10), wyprzedzanie piku spowodowane nieliniową retencją można również zdiagnozować poprzez zmniejszenie masy wstrzykiwanego analitu. Jeśli kształt piku ulegnie poprawie, należy zmodyfikować metodę, aby nie przekroczyć jakości wtrysku powodującej krawędź spływu lub należy zmienić warunki chromatograficzne w celu zminimalizowania tego zachowania.
Czasami obserwujemy coś, co wydaje się być „rozszczepionym” szczytem, ​​jak pokazano na rysunku 1f. Pierwszym krokiem w rozwiązaniu tego problemu jest ustalenie, czy kształt szczytu jest spowodowany częściową koelucją (tj. obecnością dwóch odrębnych, ale blisko eluujących związków). Jeśli w rzeczywistości dwa różne anality eluują blisko siebie, to chodzi o poprawę ich rozdzielczości (na przykład poprzez zwiększenie selektywności, retencji lub liczby płytek), a pozornie „rozszczepione” szczyty są związane z parametrami fizycznymi. Wydajność nie ma nic wspólnego z samą kolumną. Często najważniejszą wskazówką przy tej decyzji jest to, czy wszystkie szczyty na chromatogramie wykazują rozdzielone kształty, czy tylko jeden lub dwa. Jeśli jest tylko jeden lub dwa, to prawdopodobnie jest to problem z koelucją; jeśli wszystkie szczyty są rozdzielone, to prawdopodobnie jest to problem fizyczny, najprawdopodobniej związany z samą kolumną.
Rozszczepione piki związane z właściwościami fizycznymi samej kolumny są zwykle spowodowane częściowo zablokowanymi frytami wlotowymi lub wylotowymi albo reorganizacją cząstek w kolumnie, co pozwala na szybszy przepływ fazy ruchomej niż fazy ruchomej w niektórych obszarach formowania kanału kolumny, a w innych obszarach (11). Częściowo zatkany fryt można czasami oczyścić, odwracając przepływ przez kolumnę; jednak z mojego doświadczenia wynika, że ​​jest to zwykle rozwiązanie krótkoterminowe, a nie długoterminowe. W przypadku nowoczesnych kolumn jest to często fatalne w skutkach, jeśli cząstki ponownie łączą się w kolumnie. W tym momencie najlepiej wymienić kolumnę i kontynuować.
Pik na rysunku 1g, również pochodzący z niedawnego przypadku w moim laboratorium, zazwyczaj wskazuje, że sygnał jest tak wysoki, że osiągnął górną granicę zakresu odpowiedzi. W przypadku detektorów absorbancji optycznej (w tym przypadku UV-vis), gdy stężenie analitu jest bardzo wysokie, absorbuje on większość światła przechodzącego przez komorę przepływową detektora, pozostawiając bardzo mało światła do wykrycia. W takich warunkach sygnał elektryczny z fotodetektora jest silnie zakłócany przez różne źródła szumu, takie jak światło rozproszone i „prąd ciemny”, co sprawia, że ​​sygnał jest bardzo „rozmyty” i niezależny od stężenia analitu. W takim przypadku problem można często łatwo rozwiązać, zmniejszając objętość wstrzykiwanego analitu – zmniejszając objętość wstrzykiwanego analitu, rozcieńczając próbkę lub stosując oba te czynniki.
W szkole chromatografii sygnał detektora (tj. oś y na chromatogramie) wykorzystujemy jako wskaźnik stężenia analitu w próbce. Dlatego dziwne jest, że chromatogram przedstawia sygnał poniżej zera, ponieważ najprostszą interpretacją jest to, że wskazuje to na ujemne stężenie analitu – co oczywiście nie jest fizycznie możliwe. Z mojego doświadczenia wynika, że ​​ujemne piki najczęściej obserwuje się przy użyciu detektorów absorbancji optycznej (np. UV-vis).
W tym przypadku ujemny pik oznacza po prostu, że cząsteczki eluowane z kolumny absorbują mniej światła niż sama faza ruchoma bezpośrednio przed i za pikiem. Może się tak zdarzyć na przykład przy użyciu stosunkowo niskich długości fal detekcji (<230 nm) i dodatków fazy ruchomej, które absorbują większość światła przy tych długościach fal. Takimi dodatkami mogą być składniki rozpuszczalnika fazy ruchomej, takie jak metanol, lub składniki buforu, takie jak octan lub mrówczan. Można faktycznie wykorzystać ujemne piki do przygotowania krzywej kalibracji i uzyskania dokładnych informacji ilościowych, więc nie ma fundamentalnego powodu, aby ich unikać per se (ta metoda jest czasami określana jako „pośrednie wykrywanie UV”) (13). Jednak jeśli naprawdę chcemy całkowicie uniknąć ujemnych pików, w przypadku wykrywania absorbancji najlepszym rozwiązaniem jest użycie innej długości fali detekcji, tak aby analit absorbował więcej niż faza ruchoma, lub zmiana składu fazy ruchomej, tak aby absorbowały mniej światła niż anality.
Ujemne piki mogą pojawić się również podczas stosowania detekcji współczynnika refrakcji (RI), gdy współczynnik refrakcji składników innych niż analit w próbce, np. matrycy rozpuszczalnika, jest inny niż współczynnik refrakcji fazy ruchomej. Dzieje się tak również w przypadku detekcji UV-vis, ale efekt ten jest zwykle osłabiony w porównaniu z detekcją RI. W obu przypadkach ujemne piki można zminimalizować poprzez lepsze dopasowanie składu matrycy próbki do składu fazy ruchomej.
W części trzeciej, dotyczącej podstawowego tematu rozwiązywania problemów LC, omówiłem sytuacje, w których obserwowany kształt szczytu różni się od oczekiwanego lub normalnego kształtu szczytu. Skuteczne rozwiązywanie takich problemów zaczyna się od znajomości oczekiwanych kształtów szczytów (opartej na teorii lub wcześniejszym doświadczeniu z istniejącymi metodami), więc odchylenia od tych oczekiwań są oczywiste. Problemy z kształtem szczytu mają wiele różnych potencjalnych przyczyn (zbyt szeroki, ogonowanie, krawędź natarcia itp.). W tej części omawiam szczegółowo niektóre z najczęstszych przyczyn. Znajomość tych szczegółów zapewnia dobry punkt wyjścia do rozwiązywania problemów, ale nie obejmuje wszystkich możliwości. Czytelnicy zainteresowani bardziej szczegółową listą przyczyn i rozwiązań mogą zapoznać się ze schematem ściennym LCGC „LC Troubleshooting Guide”.
(4) LCGC „Przewodnik rozwiązywania problemów z LC” – wykres ścienny. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza danych i przetwarzanie sygnałów w chromatografii (Elsevier, Nowy Jork, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.