Кээ бир LC көйгөйлөрүн чечүү темалары эч качан эскирбейт, анткени LC практикасында көйгөйлөр бар, ал тургай аспаптардын технологиясы убакыттын өтүшү менен жакшырган сайын. LC системасында көйгөйлөр пайда болуп, начар чоку формасында болушу мүмкүн болгон көптөгөн жолдор бар. Чоку формасына байланыштуу көйгөйлөр пайда болгондо, бул натыйжалардын мүмкүн болгон себептеринин кыскача тизмеси биздин көйгөйлөрдү чечүү тажрыйбабызды жөнөкөйлөтүүгө жардам берет.
Бул "LC көйгөйлөрүн чечүү" рубрикасын жазып, ар ай сайын темалар жөнүндө ой жүгүртүү кызыктуу болду, анткени кээ бир темалар эч качан модадан чыкпайт. Хроматографияны изилдөө жаатында айрым темалар же идеялар эскирип калат, анткени алардын ордуна жаңы жана жакшыраак идеялар келет, көйгөйлөрдү чечүү жаатында, биринчи көйгөйдү чечүү макаласы ушул журналда (ал кездеги LC журналында) 1983-жылы пайда болгондон бери (1). Акыркы бир нече жылдын ичинде мен LC көйгөйлөрүн чечүүнүн бир нече бөлүмдөрүн суюк хроматографияга (LC) таасир этүүчү заманбап тенденцияларга (мисалы, басымдын кармоого тийгизген таасирин түшүнүүбүздүн салыштырмалуу салыштыруусу [2] Жаңы жетишкендиктер), LC жыйынтыктарын чечмелөөбүз жана заманбап LC инструменттери менен көйгөйлөрдү кантип чечүү керектиги боюнча багыттадым. Бул айдагы чыгарылышта мен 2021-жылдын декабрында башталган сериямды (3) улантып жатам, ал LC көйгөйлөрүн чечүүнүн "өмүр жана өлүм" темаларына багытталган — биз колдонуп жаткан системанын жашына карабастан, ар кандай көйгөйлөрдү чечүү үчүн эң сонун элементтер маанилүү. Бул сериянын негизги темасы абдан актуалдуу. LCGC компаниясынын белгилүү "LC көйгөйлөрүн чечүү боюнча колдонмо" дубал диаграммасы (4) көптөгөн лабораторияларда илинип турат. Бул сериянын үчүнчү бөлүгүндө мен чокунун формасына же чокунун мүнөздөмөлөрүнө байланыштуу маселелерге көңүл бурууну чечтим. Таң калыштуусу, дубал диаграммасында чокунун формасынын начар болушунун 44 ар кандай мүмкүн болгон себептери келтирилген! Бул маселелердин баарын бир макалада кененирээк карап чыга албайбыз, андыктан бул тема боюнча биринчи бөлүмдө мен эң көп көргөн маселелердин айрымдарына токтолом. Жаш жана кары LC колдонуучулары бул маанилүү тема боюнча пайдалуу кеңештерди жана эскертүүлөрдү табат деп үмүттөнөм.
Мен көйгөйлөрдү чечүү боюнча суроолорго барган сайын "баары мүмкүн" деп жооп берип жатканымды байкадым. Бул жооп чечмелөө кыйын болгон байкоолорду эске алганда оңой көрүнүшү мүмкүн, бирок мен көп учурда аны туура деп эсептейм. Чокунун начар формасынын көптөгөн мүмкүн болгон себептери менен, көйгөй эмнеде болушу мүмкүн экенин карап жатканда ачык ой жүгүртүү жана көйгөйлөрдү чечүү аракеттерин баштоо үчүн мүмкүн болгон себептерге артыкчылык берүү маанилүү, эң кеңири таралган мүмкүнчүлүктөргө көңүл буруп, бул жагдай абдан маанилүү.
Ар кандай көйгөйлөрдү чечүү көнүгүүсүндөгү негизги кадам - ​​бирок менимче, бааланбай калган нерсе - чечилиши керек болгон көйгөй бар экенин таануу. Көйгөй бар экенин таануу көбүнчө курал менен эмне болуп жатканы биздин күтүүлөрүбүздөн айырмаланарын, алар теория, эмпирикалык билим жана тажрыйба менен калыптанаарын таанууну билдирет (5). Бул жерде айтылган "чоку формасы" чындыгында чокунун формасына гана эмес (симметриялуу, асимметриялык, жылмакай, үлпүлдөк, алдыңкы чети, куйругу ж.б.), ошондой эле туурасына да тиешелүү. Чыныгы чоку формасына болгон күтүүлөрүбүз жөнөкөй. Теория (6) көпчүлүк учурларда хроматографиялык чокулар симметриялуу болушу керек жана 1a-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, Гаусс бөлүштүрүлүшүнүн формасына туура келиши керек деген окуу китебиндеги күтүүнү жакшы колдойт. Чокулардын туурасынан эмнени күтөбүз - бул татаалыраак маселе жана биз бул теманы келечектеги макалада талкуулайбыз. 1-сүрөттөгү башка чоку формалары байкалышы мүмкүн болгон башка мүмкүнчүлүктөрдүн айрымдарын көрсөтөт - башкача айтканда, нерселердин туура эмес кетишинин айрым жолдору. Бул бөлүктүн калган бөлүгүндө биз мүмкүн болгон кырдаалдардын айрым конкреттүү мисалдарын талкуулоого убакыт бөлөбүз. ушул формалардын пайда болушуна алып келет.
Кээде чокулар хроматограммада такыр байкалбайт, алар элюцияланат деп күтүлүүдө. Жогорудагы дубал диаграммасы чокунун жоктугу (үлгү чындыгында детектордун реакциясын ызы-чуунун үстүндө көрүүгө жетиштүү кыла турган концентрациядагы максаттуу аналитти камтыйт деп болжолдонгондо), адатта, кандайдыр бир аспаптын көйгөйүнө же туура эмес кыймылдуу фаза шарттарына байланыштуу экенин көрсөтүп турат (эгерде такыр байкалбаса). чокулар, адатта өтө "алсыз"). Бул категориядагы мүмкүн болгон көйгөйлөрдүн жана чечимдердин кыскача тизмесин I таблицадан тапса болот.
Жогоруда айтылгандай, чокулардын канчалык кеңейишине көңүл буруп, аны оңдоого аракет кылуудан мурун жол берүү керек деген маселе - бул келечектеги макалада талкуулай турган татаал тема. Менин тажрыйбам көрсөткөндөй, чокулардын олуттуу кеңейиши көбүнчө чокулардын формасынын олуттуу өзгөрүшү менен коштолот жана чокулардын куйругу чокуга чейинки же бөлүнүүгө караганда көбүрөөк кездешет. Бирок, номиналдык симметриялуу чокулар да кеңейет, бул бир нече ар кандай себептерден улам келип чыгышы мүмкүн:
Бул маселелердин ар бири "Кыйынчылыктарды чечүү LC" журналынын мурунку сандарында кеңири талкууланган жана бул темаларга кызыккан окурмандар бул көйгөйлөрдүн негизги себептери жана аларды чечүүнүн мүмкүн болгон жолдору жөнүндө маалымат алуу үчүн мурунку макалаларга кайрыла алышат. Кененирээк маалымат.
Чокулардын куйруктарынын пайда болушу, чокулардын фронтондошуусу жана бөлүнүү химиялык же физикалык кубулуштардан улам келип чыгышы мүмкүн жана бул көйгөйлөрдү чечүүнүн мүмкүн болгон жолдорунун тизмеси химиялык же физикалык көйгөй менен күрөшүп жатканыбызга жараша ар кандай болот. Көп учурда хроматограммадагы ар кандай чокуларды салыштыруу менен, ким күнөөлүү экени жөнүндө маанилүү белгилерди таба аласыз. Эгерде хроматограммадагы бардык чокулар окшош формада болсо, анда себеп, кыязы, физикалык эмес. Эгерде бир же бир нече чокулар гана жабыркаса, бирок калгандары жакшы көрүнсө, анда себеп, кыязы, химиялык болушу мүмкүн.
Чокулардын калдыктарынын химиялык себептерин бул жерде кыскача талкуулоо өтө татаал. Кызыккан окурманга тереңирээк талкуулоо үчүн жакында чыккан "LC көйгөйлөрүн чечүү" чыгарылышына кайрылабыз (10). Бирок, сайылган аналиттин массасын азайтуу жана чокунун формасы жакшырып жатканын көрүү оңой. Эгер ошондой болсо, анда бул көйгөй "массанын ашыкча жүктөлүшү" экенин көрсөткөн жакшы белги. Бул учурда, ыкма кичинекей аналит массаларын сайуу менен чектелиши керек же чоңураак массалар сайылганда да жакшы чоку формаларын алуу үчүн хроматографиялык шарттарды өзгөртүү керек.
Ошондой эле, чокулардын калдыктарынын көптөгөн физикалык себептери болушу мүмкүн. Мүмкүнчүлүктөрдү деталдуу талкуулоого кызыккан окурмандар "LC көйгөйлөрүн чечүү" (11) журналынын жакында чыккан санына кайрылышат. Чокулардын калдыктарынын эң кеңири таралган физикалык себептеринин бири - инжектор менен детектордун ортосундагы чекиттеги начар байланыш (12). Эң экстремалдуу мисал бир нече жума мурун менин лабораториямда алынган 1d-сүрөттө көрсөтүлгөн. Бул учурда, биз мурда колдонбогон жаңы инжекциялык клапан менен система куруп, дат баспас болоттон жасалган капиллярга калыпка салынган ферруласы бар кичинекей көлөмдөгү инжекциялык циклди орноттук. Баштапкы көйгөйлөрдү чечүү эксперименттеринен кийин, инжекциялык клапан статорундагы порттун тереңдиги биз көнгөндөн алда канча терең экенин, натыйжада порттун түбүндө чоң өлүк көлөм пайда болгонун түшүндүк. Бул көйгөй инжекциялык циклди башка түтүк менен алмаштыруу менен оңой чечилет, биз порттун түбүндөгү өлүк көлөмдү жок кылуу үчүн ферруланы туура абалга келтире алабыз.
1e-сүрөттө көрсөтүлгөндөй чоку фронттору физикалык же химиялык көйгөйлөрдөн да келип чыгышы мүмкүн. Алдыңкы четтин кеңири таралган физикалык себеби - мамычанын бөлүкчөлөрүнүн катмары жакшы топтолбогондугу же бөлүкчөлөрдүн убакыттын өтүшү менен кайра уюшулгандыгы. Бул физикалык кубулуштан улам пайда болгон чокулардын калдыктары сыяктуу эле, муну оңдоонун эң жакшы жолу - мамычаны алмаштыруу жана улантуу. Негизинен, химиялык келип чыгышы бар алдыңкы четтин чоку формалары көбүнчө биз "сызыктуу эмес" кармоо шарттары деп атаган нерседен келип чыгат. Идеалдуу (сызыктуу) шарттарда, стационардык фаза тарабынан кармалып калган аналиттин көлөмү (демек, кармоо коэффициенти) мамычадагы аналиттин концентрациясына сызыктуу байланыштуу. Хроматографиялык жактан алганда, бул мамычага сайылган аналиттин массасы көбөйгөн сайын, чоку бийик болуп калат, бирок кеңейбейт дегенди билдирет. Бул байланыш кармоо жүрүм-туруму сызыктуу эмес болгондо бузулат жана чокулар бийик гана эмес, көбүрөөк масса сайылган сайын кеңейет. Мындан тышкары, сызыктуу эмес формалар хроматографиялык чокулардын формасын аныктайт, натыйжада алдыңкы же арткы четтер пайда болот. Чокулардын калдыктарын пайда кылган массанын ашыкча жүктөлүшү сыяктуу эле (10), чоку Сызыктуу эмес кармалуудан келип чыккан алдыңкы катмарды сайылган аналит массасын азайтуу менен да аныктоого болот. Эгерде чокунун формасы жакшырса, анда ыкма алдыңкы четин пайда кылган сайуу сапатынан ашпашы үчүн өзгөртүлүшү керек же бул жүрүм-турумду минималдаштыруу үчүн хроматографиялык шарттар өзгөртүлүшү керек.
Кээде биз 1f-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, "бөлүнгөн" чокуга окшош нерсени байкайбыз. Бул маселени чечүүнүн биринчи кадамы - чокунун формасы жарым-жартылай биргелешип элюциядан (б.а., эки башка, бирок тыгыз элюцияланган кошулмалардын болушунан) келип чыгаарын аныктоо. Эгерде чындыгында бири-бирине жакын жайгашкан эки башка аналит болсо, анда алардын чечилишин жакшыртуу маселеси (мисалы, селективдүүлүктү, кармоону же пластиналардын санын көбөйтүү менен) жана көрүнүп турган "бөлүнгөн" чокулар физикалык мүнөздөмөлөргө байланыштуу. Аткаруу тилкенин өзүнө эч кандай тиешеси жок. Көп учурда бул чечимдин эң маанилүү белгиси - хроматограммадагы бардык чокулар бөлүнгөн формаларды көрсөтөбү же бир же эки ганабы. Эгер ал бир же эки гана болсо, анда бул, кыязы, биргелешип элюция маселеси; эгерде бардык чокулар бөлүнгөн болсо, анда бул, кыязы, физикалык маселе, кыязы, тилкенин өзүнө байланыштуу.
Колоннанын өзүнүн физикалык касиеттерине байланыштуу бөлүнгөн чокулар, адатта, кирүүчү же чыгуучу фриттердин жарым-жартылай тыгылып калышынан же колоннадагы бөлүкчөлөрдүн кайра уюштурулушунан улам пайда болот, бул колонна каналынын пайда болушунун айрым аймактарында мобилдик фазанын мобилдик фазага караганда тезирээк агышына мүмкүндүк берет (башка аймактарда) (11). Жарым-жартылай тыгылып калган фритти кээде колонна аркылуу агымды тескери буруу менен тазалоого болот; бирок, менин тажрыйбам боюнча, бул көбүнчө узак мөөнөттүү эмес, кыска мөөнөттүү чечим. Эгерде бөлүкчөлөр колоннанын ичинде кайра биригип кетсе, бул көбүнчө заманбап колонналарда өлүмгө алып келет. Бул учурда, колоннаны алмаштырып, улантуу жакшы.
1g-сүрөттөгү чоку, ошондой эле менин өзүмдүн лабораториямда жакында эле болгон окуядан алынган, адатта, сигналдын жооп диапазонунун жогорку чегине жеткенин көрсөтүп турат. Оптикалык абсорбциялык детекторлор үчүн (бул учурда ультрафиолет-көрүнүш), аналиттин концентрациясы өтө жогору болгондо, аналит детектор агымынын клеткасынан өткөн жарыктын көпчүлүк бөлүгүн сиңирип алат, натыйжада аныктала турган жарык өтө аз калат. Мындай шарттарда фотодетектордон келген электрдик сигналга ар кандай ызы-чуу булактары, мисалы, сырткы жарык жана "караңгы ток" катуу таасир этет, бул сигналды сырткы көрүнүшү боюнча өтө "бүдөмүк" кылат жана аналиттин концентрациясынан көз карандысыз кылат. Мындай болгондо, көйгөйдү көбүнчө аналиттин сайуу көлөмүн азайтуу - сайуу көлөмүн азайтуу, үлгүнү суюлтуу же экөө тең менен оңой чечүүгө болот.
Хроматография мектебинде биз үлгүдөгү аналит концентрациясынын индикатору катары детектор сигналын (б.а., хроматограммадагы y огу) колдонобуз. Ошондуктан, сигналы нөлдөн төмөн болгон хроматограмманы көрүү кызыктай сезилет, анткени жөнөкөй чечмелөө бул аналит концентрациясынын терс экенин көрсөтөт - албетте, бул физикалык жактан мүмкүн эмес. Менин тажрыйбамда, оптикалык абсорбция детекторлорун (мисалы, ультрафиолет-көрүнүш) колдонгондо терс чокулар көп байкалат.
Бул учурда, терс чоку жөн гана мамычанын сыртынан чыгып жаткан молекулалар чокуга чейин жана андан кийин мобилдик фазанын өзүнө караганда азыраак жарыкты сиңирет дегенди билдирет. Бул, мисалы, салыштырмалуу төмөн детектордук толкун узундуктарын (<230 нм) жана ушул толкун узундуктарында жарыктын көпчүлүк бөлүгүн сиңирген мобилдик фазалык кошулмаларды колдонгондо болушу мүмкүн. Мындай кошулмалар метанол сыяктуу мобилдик фазалык эриткич компоненттери же ацетат же формат сыяктуу буфердик компоненттер болушу мүмкүн. Чындыгында, калибрлөө ийри сызыгын даярдоо жана так сандык маалымат алуу үчүн терс чокуларды колдонсо болот, андыктан алардан качуунун эч кандай негизги себеби жок (бул ыкма кээде "кыйыр ультрафиолет аныктоо" деп аталат) (13). Бирок, эгерде биз чындап эле терс чокулардан толугу менен качкыбыз келсе, сиңирүүнү аныктоодо, эң жакшы чечим - аналит мобилдик фазага караганда көбүрөөк сиңириши үчүн башка детектордук толкун узундугун колдонуу же мобилдик фазанын курамын аналиттерге караганда азыраак жарыкты сиңириши үчүн өзгөртүү.
Терс чокулар, ошондой эле, эриткич матрицасы сыяктуу үлгүдөгү аналиттен башка компоненттердин сынуу көрсөткүчү мобилдик фазанын сынуу көрсөткүчүнөн айырмаланганда, сынуу көрсөткүчүн (РИ) аныктоодо да пайда болушу мүмкүн. Бул ультрафиолет нурларын аныктоодо да болот, бирок бул эффект РИ аныктоого салыштырмалуу басаңдайт. Эки учурда тең, үлгү матрицасынын курамын мобилдик фазанын курамына көбүрөөк дал келтирүү менен терс чокуларды азайтууга болот.
LC көйгөйлөрүн чечүүнүн негизги темасы боюнча үчүнчү бөлүктө мен байкалган чокунун формасы күтүлгөн же кадимки чокунун формасынан айырмаланган кырдаалдарды талкууладым. Мындай көйгөйлөрдү натыйжалуу чечүү күтүлгөн чокунун формаларын билүүдөн башталат (теорияга же учурдагы ыкмалар менен мурунку тажрыйбага негизделген), андыктан бул күтүүлөрдөн четтөөлөр айдан ачык. Чокунун формасынын көйгөйлөрүнүн көптөгөн ар кандай себептери бар (өтө кең, куйрук, алдыңкы чети ж.б.). Бул бөлүмдө мен эң көп көргөн себептердин айрымдарын кененирээк талкуулайм. Бул маалыматтарды билүү көйгөйлөрдү чечүүнү баштоо үчүн жакшы жерди камсыз кылат, бирок бардык мүмкүнчүлүктөрдү камтый албайт. Себептердин жана чечимдердин кеңири тизмесине кызыккан окурмандар LCGCнин "LC көйгөйлөрүн чечүү боюнча колдонмосу" дубал диаграммасын караса болот.
(4) LCGC “LC Кыйынчылыктарды чечүү боюнча колдонмо” дубал диаграммасы. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) А. Фелингер, Хроматографиядагы маалыматтарды талдоо жана сигналдарды иштетүү (Elsevier, Нью-Йорк, Нью-Йорк, 1998), 43-96-беттер.
(8) Вахаб М.Ф., Дасгупта П.К., Каджо А.Ф. жана Армстронг Д.В., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.