Mõned LC-veaotsingu teemad ei ole kunagi aegunud, kuna LC-praktikas esineb probleeme isegi siis, kui instrumentide tehnoloogia aja jooksul areneb. LC-süsteemis on palju võimalusi probleemide tekkeks, mis võivad viia halva piigi kujuni. Kui tekivad piigi kujuga seotud probleemid, aitab nende võimalike põhjuste lühike loetelu meie tõrkeotsingu kogemust lihtsustada.
On olnud lõbus kirjutada seda „LC tõrkeotsingu” veergu ja mõelda iga kuu teemadele, sest mõned teemad ei lähe kunagi moest välja. Kuigi kromatograafia valdkonnas muutuvad teatud teemad või ideed vananenuks, kuna need asendatakse uute ja paremate ideedega, on tõrkeotsingu valdkonnas alates esimese tõrkeotsingu artikli ilmumisest selles ajakirjas (tol ajal LC ajakiri) 1983. aastal (1), kuna mõned teemad on endiselt asjakohased. Viimaste aastate jooksul olen keskendunud mitmele LC tõrkeotsingu osale kaasaegsetele suundumustele, mis mõjutavad vedelikkromatograafiat (LC) (näiteks meie arusaamade suhteline võrdlus rõhu mõjust retentsioonile [2] Uued edusammud), meie LC tulemuste tõlgendamisele ja sellele, kuidas tõrkeotsingut teha kaasaegsete LC-instrumentidega. Selle kuu osas jätkan oma sarja (3), mis algas 2021. aasta detsembris ja mis keskendus mõnele LC tõrkeotsingu „elu ja surma” teemale – elemendid, mis sobivad suurepäraselt iga tõrkeotsija jaoks, on olulised, olenemata kasutatava süsteemi vanusest. Selle sarja põhiteema on väga oluline LCGC kuulsa „LC tõrkeotsingu juhendi” seinakaardi (4) jaoks, mis ripub... paljudes laborites. Selle sarja kolmandas osas otsustasin keskenduda piigi kuju või piigi omadustega seotud probleemidele. Uskumatu, et seinale kinnitatud diagrammil on loetletud 44 erinevat võimalikku halva piigi kuju põhjust! Me ei saa kõiki neid probleeme ühes artiklis üksikasjalikult käsitleda, seega keskendun teema esimeses osas mõnele neist, mida ma kõige sagedamini näen. Loodan, et noored ja vanad LC kasutajad leiavad sellel olulisel teemal kasulikke näpunäiteid ja meeldetuletusi.
Üha sagedamini vastan tõrkeotsingu küsimustele lausega „kõik on võimalik“. See vastus võib tunduda lihtne, kui arvestada raskesti tõlgendatavaid vaatlusi, kuid minu arvates on see sageli sobiv. Kuna halva tipu kuju võib põhjustada palju erinevaid põhjuseid, on oluline probleemi kaalumisel avatud meelt säilitada ja potentsiaalseid põhjuseid tähtsuse järjekorda seada, et alustada tõrkeotsingut, keskendudes kõige levinumatele võimalustele. See punkt on väga oluline.
Igas tõrkeotsingu harjutuses on võtmetähtsusega samm – aga minu arvates alahinnatud –, et on olemas probleem, mis vajab lahendamist. Probleemi olemasolu tunnistamine tähendab sageli mõistmist, et tööriistaga toimuv erineb meie ootustest, mis on kujundatud teooria, empiiriliste teadmiste ja kogemuste põhjal (5). Siin viidatud „tipu kuju” ei viita tegelikult mitte ainult piigi kujule (sümmeetriline, asümmeetriline, sile, kohev, esiservaga, sabaga jne), vaid ka laiusele. Meie ootused tegeliku piigi kuju suhtes on lihtsad. Teooria (6) toetab hästi õpiku ootust, et enamikul juhtudel peaksid kromatograafilised piigid olema sümmeetrilised ja vastama Gaussi jaotuse kujule, nagu on näidatud joonisel 1a. See, mida me piigi laiuselt ootame, on keerulisem küsimus ja me arutame seda teemat tulevases artiklis. Teised piigi kujud joonisel 1 näitavad mõningaid muid võimalusi, mida võiks täheldada – teisisõnu, mõningaid viise, kuidas asjad võivad valesti minna. Selle osa ülejäänud osas arutame mõningaid konkreetseid näiteid olukordadest, mis võivad viia nende kujunditeni. tüübid.
Mõnikord ei täheldata kromatogrammil piike üldse seal, kus need peaksid elueeruma. Ülaltoodud seinadiagramm näitab, et piigi puudumine (eeldades, et proov sisaldab sihtanalüüti kontsentratsioonis, mis peaks detektori reaktsiooni muutma piisavaks selle nägemiseks müra kohal) on tavaliselt seotud mõne seadme probleemi või valede liikuva faasi tingimustega (kui neid üldse täheldatakse). Piigid on tavaliselt liiga "nõrgad"). Selle kategooria võimalike probleemide ja lahenduste lühike loetelu on esitatud tabelis I.
Nagu eespool mainitud, on küsimus, kui palju tipu laienemist tuleks taluda enne sellele tähelepanu pööramist ja selle parandamise proovimist, keeruline teema, mida arutlen tulevases artiklis. Minu kogemus näitab, et tipu olulise laienemisega kaasneb sageli tipu kuju oluline muutus ning tipu sabastumine on sagedasem kui tipueelne või lõhenemine. Siiski laienevad ka nominaalselt sümmeetrilised tipud, millel võivad olla mitmed erinevad põhjused:
Kõiki neid probleeme on üksikasjalikult käsitletud ajakirja Troubleshooting LC eelmistes numbrites ning nendest teemadest huvitatud lugejad saavad nendest varasematest artiklitest teavet nende probleemide algpõhjuste ja võimalike lahenduste kohta. Lisateavet leiate siit.
Piigi sabastumine, piigi esiosa moodustumine ja lõhenemine võivad kõik olla põhjustatud keemilistest või füüsikalistest nähtustest ning nende probleemide võimalike lahenduste loend on väga erinev, olenevalt sellest, kas tegemist on keemilise või füüsikalise probleemiga. Sageli saab kromatogrammi erinevate piikide võrdlemisel leida olulisi vihjeid selle kohta, kumb on süüdlane. Kui kõik kromatogrammi piigid on sarnase kujuga, pole põhjus tõenäoliselt füüsikaline. Kui mõjutatud on ainult üks või mõned piigid, kuid ülejäänud näevad head välja, on põhjus tõenäoliselt keemiline.
Piikide sabastumise keemilised põhjused on liiga keerulised, et neid siin lühidalt käsitleda. Huvitatud lugejat suunatakse põhjalikuma arutelu saamiseks ajakirja „LC Troubleshooting” hiljutisesse numbrisse (10). Siiski on lihtne proovida vähendada süstitud analüüdi massi ja vaadata, kas piigi kuju paraneb. Kui jah, siis on see hea vihje, et probleemiks on „massi ülekoormus”. Sellisel juhul peab meetod piirduma väikeste analüüdi masside süstimisega või tuleb kromatograafilisi tingimusi muuta nii, et isegi suuremate masside süstimisel oleks võimalik saada häid piigi kujusid.
Tipptaseme saba tekkimisel on ka palju võimalikke füüsikalisi põhjuseid. Lugejatele, kes on huvitatud võimaluste üksikasjalikust arutamisest, soovitatakse lugeda ajakirja „LC Troubleshooting” (11) hiljutist numbrit. Üks levinumaid tipptaseme saba tekkimise füüsikalisi põhjuseid on halb ühendus injektori ja detektori vahelises punktis (12). Äärmuslik näide on näidatud joonisel 1d, mis on saadud minu laboris paar nädalat tagasi. Sel juhul ehitasime süsteemi uue sissepritseklapiga, mida me polnud varem kasutanud, ja paigaldasime väikese mahuga sissepritsekontuuri, mille ferrul oli vormitud roostevabast terasest kapillaarile. Pärast mõningaid esialgseid tõrkeotsingu katseid saime aru, et sissepritseklapi staatori pordi sügavus oli palju suurem kui me harjunud olime, mille tulemuseks oli pordi põhjas suur tühimaht. Seda probleemi saab hõlpsalt lahendada, asendades sissepritsekontuuri teise toruga, saame ferruli õigesse asendisse reguleerida, et pordi põhjas olev tühimaht kõrvaldada.
Joonisel 1e kujutatud tipurinded võivad olla põhjustatud ka füüsikalistest või keemilistest probleemidest. Esiserva tavaline füüsikaline põhjus on see, et kolonni osakestekiht ei ole hästi pakitud või et osakesed on aja jooksul ümber korraldatud. Nagu ka selle füüsikalise nähtuse põhjustatud tipu saba puhul, on parim viis selle parandamiseks kolonn välja vahetada ja jätkata. Põhimõtteliselt tekivad keemilise päritoluga tipukujud sageli nn mittelineaarsetest retentsioonitingimustest. Ideaalsetes (lineaarsetes) tingimustes on statsionaarses faasis kinnipeetud analüüdi hulk (seega retentsioonitegur) lineaarselt seotud analüüdi kontsentratsiooniga kolonnis. Kromatograafiliselt tähendab see, et kolonni süstitud analüüdi massi suurenedes muutub piik kõrgemaks, kuid mitte laiemaks. See seos katkeb, kui retentsioonikäitumine on mittelineaarne ja tipud mitte ainult ei muutu kõrgemaks, vaid ka laiemaks, kui süstitakse rohkem massi. Lisaks määravad mittelineaarsed kujud kromatograafiliste piikide kuju, mille tulemuseks on esi- või tagaservad. Nagu massi ülekoormuse korral, mis põhjustab tipu saba (10), võib mittelineaarse retentsiooni põhjustatud tipu esiserv diagnoosida saab ka süstitud analüüdi massi vähendamise teel. Kui piigi kuju paraneb, tuleb meetodit muuta, et mitte ületada süstimise kvaliteeti, mis põhjustab juhtserva, või tuleb kromatograafilisi tingimusi muuta, et seda käitumist minimeerida.
Mõnikord täheldame midagi, mis näib olevat "lõhenenud" piik, nagu on näidatud joonisel 1f. Selle probleemi lahendamise esimene samm on kindlaks teha, kas piigi kuju on tingitud osalisest koelueerimisest (st kahe erineva, kuid lähedalt elueeruva ühendi olemasolust). Kui tegelikult elueeruvad kaks erinevat analüüti lähestikku, siis on vaja parandada nende lahutusvõimet (näiteks selektiivsuse, retentsiooni või plaatide arvu suurendamise teel) ja näilised "lõhenenud" piigid on seotud füüsikaliste omadustega. Toimivusel pole kolonni endaga mingit pistmist. Sageli on selle otsuse kõige olulisem vihje see, kas kõik kromatogrammi piigid näitavad lõhenenud kuju või ainult üks või kaks. Kui see on ainult üks või kaks, on see tõenäoliselt koelueerimise probleem; kui kõik piigid on lõhenenud, on see tõenäoliselt füüsikaline probleem, mis on tõenäoliselt seotud kolonni endaga.
Kolonni enda füüsikaliste omadustega seotud lõhenenud piigid on tavaliselt tingitud osaliselt blokeeritud sisse- või väljalaskefrittidest või osakeste ümberkorraldusest kolonnis, mis võimaldab liikuval faasil voolata kiiremini kui liikuval faasil kolonni kanali moodustumise teatud piirkondades, teistes piirkondades (11). Osaliselt ummistunud fritti saab mõnikord puhastada kolonni läbiva voolu ümberpööramisega; minu kogemuse põhjal on see aga tavaliselt lühiajaline, mitte pikaajaline lahendus. See on tänapäevaste kolonnide puhul sageli saatuslik, kui osakesed kolonnis taasühinevad. Sel hetkel on kõige parem kolonn välja vahetada ja jätkata.
Joonisel 1g olev piik, mis pärineb samuti hiljutisest juhtumist minu enda laboris, näitab tavaliselt, et signaal on nii tugev, et see on jõudnud reageerimisvahemiku ülemisse otsa. Optiliste neeldumisdetektorite (antud juhul UV-vis) puhul, kui analüüdi kontsentratsioon on väga kõrge, neelab analüüt suurema osa detektori voolukambrist läbivast valgusest, jättes tuvastamiseks väga vähe valgust. Nendes tingimustes mõjutavad fotodetektori elektrilist signaali tugevalt mitmesugused müraallikad, näiteks hajameelne valgus ja „tumevool“, mis muudab signaali välimuselt väga „häguseks“ ja analüüdi kontsentratsioonist sõltumatuks. Sellisel juhul saab probleemi sageli hõlpsalt lahendada analüüdi süstimismahu vähendamisega – vähendades süstimismahtu, lahjendades proovi või mõlemat.
Kromatograafiakoolis kasutame detektori signaali (st kromatogrammi y-telge) proovi analüüdi kontsentratsiooni indikaatorina. Seega tundub kummaline näha kromatogrammi, mille signaal on alla nulli, kuna lihtne tõlgendus on see, et see näitab negatiivset analüüdi kontsentratsiooni – mis muidugi pole füüsiliselt võimalik. Minu kogemuse kohaselt täheldatakse negatiivseid piike kõige sagedamini optiliste neeldumisdetektorite (nt UV-vis) kasutamisel.
Sellisel juhul tähendab negatiivne piik lihtsalt seda, et kolonnist elueeruvad molekulid neelavad vahetult enne ja pärast piiki vähem valgust kui liikuv faas ise. See võib juhtuda näiteks suhteliselt madalate detekteerimislainepikkuste (<230 nm) ja liikuva faasi lisandite kasutamisel, mis neelavad enamiku valgusest nendel lainepikkustel. Sellised lisandid võivad olla liikuva faasi lahustikomponendid, näiteks metanool, või puhverkomponendid, näiteks atsetaat või formaat. Negatiivseid piike saab tegelikult kasutada kalibreerimiskõvera koostamiseks ja täpse kvantitatiivse teabe saamiseks, seega pole põhimõttelist põhjust neid iseenesest vältida (seda meetodit nimetatakse mõnikord ka "kaudseks UV-detektsiooniks") (13). Kui aga tahame negatiivseid piike täielikult vältida, on neeldumise detekteerimise puhul parim lahendus kasutada erinevat detekteerimislainepikkust, nii et analüüt neelab rohkem kui liikuv faas, või muuta liikuva faasi koostist nii, et need neelavad vähem valgust kui analüüdid.
Negatiivsed piigid võivad ilmneda ka murdumisnäitaja (RI) tuvastamisel, kui proovis sisalduvate analüüdiväliste komponentide, näiteks lahusti maatriksi, murdumisnäitaja erineb liikuva faasi murdumisnäitajast. See juhtub ka UV-vis detekteerimisel, kuid see efekt kipub olema RI detekteerimisega võrreldes nõrgem. Mõlemal juhul saab negatiivseid piike minimeerida, sobitades proovi maatriksi koostise liikuva faasi koostisega täpsemalt.
Kolmandas osas, mis käsitles LC tõrkeotsingu põhiteemat, arutasin olukordi, kus vaadeldav piigi kuju erineb oodatavast või normaalsest piigi kujust. Selliste probleemide tõhus tõrkeotsing algab eeldatavate piigi kujude tundmisest (teooria või olemasolevate meetoditega saadud eelneva kogemuse põhjal), seega on kõrvalekalded nendest ootustest ilmsed. Piigi kuju probleemidel on palju erinevaid võimalikke põhjuseid (liiga lai, saba, esiserv jne). Selles osas arutlen üksikasjalikult mõningaid põhjuseid, mida ma kõige sagedamini näen. Nende üksikasjade tundmine on hea koht tõrkeotsingu alustamiseks, kuid see ei hõlma kõiki võimalusi. Lugejad, kes on huvitatud põhjalikumast põhjuste ja lahenduste loendist, saavad vaadata LCGC seinale kinnitatud tabelit „LC tõrkeotsingu juhend”.
(4) LCGC seinale kinnitatav tabel „LC tõrkeotsingu juhend”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Andmeanalüüs ja signaalitöötlus kromatograafias (Elsevier, New York, NY, 1998), lk 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF ja Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.