액체 크로마토그래피(LC) 문제 해결 관련 주제 중 일부는 시간이 지나도 변함없이 중요합니다. 기기 기술이 발전하더라도 LC 실제 분석 과정에서 발생하는 문제점들은 여전히 ​​유효하기 때문입니다. LC 시스템에서는 다양한 원인으로 인해 피크 모양이 불량해지는 경우가 발생할 수 있습니다. 피크 모양 관련 문제가 발생했을 때, 가능한 원인들을 간략하게 정리해 두면 문제 해결 과정을 간소화하는 데 도움이 됩니다.
"LC 문제 해결" 칼럼을 쓰고 매달 주제를 고민하는 것은 즐거운 일이었습니다. 어떤 주제는 결코 유행을 타지 않기 때문입니다. 크로마토그래피 연구 분야에서는 특정 주제나 아이디어가 새로운 아이디어에 의해 구식화되지만, 문제 해결 분야에서는 이 저널(당시 LC 저널)에 첫 번째 문제 해결 관련 기사가 실린 1983년(1)부터 여전히 유효한 주제들이 있습니다. 지난 몇 년 동안 저는 액체 크로마토그래피(LC)에 영향을 미치는 최신 동향(예: 압력이 유지 시간에 미치는 영향에 대한 이해의 상대적 비교[2] 새로운 발전)과 LC 결과 해석, 최신 LC 기기를 사용한 문제 해결 방법에 초점을 맞춰 여러 LC 문제 해결 섹션을 작성했습니다. 이번 달에는 2021년 12월에 시작한 시리즈(3)를 이어가며 LC 문제 해결의 "생사"와 같은 몇 가지 핵심 요소, 즉 사용하는 시스템의 연식과 관계없이 모든 문제 해결사에게 필수적인 요소들을 다룹니다. 이 시리즈의 핵심 주제는 다음과 같습니다. LCGC의 유명한 "LC 문제 해결 가이드" 벽 차트(4)는 많은 실험실에 걸려 있습니다. 이 시리즈의 세 번째 부분에서는 피크 모양 또는 피크 특성과 ​​관련된 문제에 초점을 맞추기로 했습니다. 놀랍게도 벽 차트에는 불량한 피크 모양의 잠재적 원인이 44가지나 나열되어 있습니다! 한 기사에서 이러한 모든 문제를 자세히 다룰 수는 없으므로 이 주제에 대한 첫 번째 기사에서는 제가 가장 자주 접하는 몇 가지 문제에 집중하겠습니다. 젊은 LC 사용자든 나이든 LC 사용자든 이 중요한 주제에 대한 유용한 팁과 상기 사항을 찾을 수 있기를 바랍니다.
저는 문제 해결 질문에 "무엇이든 가능합니다"라고 대답하는 경우가 점점 늘어나고 있습니다. 해석하기 어려운 관찰 결과를 고려할 때 이러한 답변은 쉬워 보일 수 있지만, 종종 적절하다고 생각합니다. 피크 모양이 불량한 데에는 여러 가지 원인이 있을 수 있으므로, 문제의 원인을 고려할 때 열린 마음을 갖고 가장 흔한 가능성에 집중하여 문제 해결 노력을 시작할 때 잠재적 원인의 우선순위를 정하는 것이 중요합니다. 이 점이 매우 중요합니다.
문제 해결 과정에서 중요한 단계이지만, 종종 과소평가되는 단계는 해결해야 할 문제가 있음을 인식하는 것입니다. 문제가 있음을 인식한다는 것은 종종 도구에서 발생하는 현상이 이론, 경험적 지식 및 경험에 의해 형성된 우리의 기대와 다르다는 것을 인식하는 것을 의미합니다(5). 여기서 언급하는 "피크 모양"은 피크의 모양(대칭, 비대칭, 매끄러운, 뭉툭한, 선단, 꼬리 등)뿐만 아니라 너비도 포함합니다. 실제 피크 모양에 대한 우리의 기대는 간단합니다. 이론(6)은 대부분의 경우 크로마토그래피 피크가 대칭이며 그림 1a에 나타낸 것처럼 가우시안 분포의 모양을 따라야 한다는 교과서적인 기대를 잘 뒷받침합니다. 피크 너비에 대한 기대는 더 복잡한 문제이며, 이 주제는 향후 기사에서 다룰 것입니다. 그림 1의 다른 피크 모양은 관찰될 수 있는 다른 가능성, 즉 문제가 발생할 수 있는 몇 가지 방식을 보여줍니다. 이번 기사의 나머지 부분에서는 이러한 형태가 나타날 수 있는 구체적인 상황 사례들을 몇 가지 살펴보고 토론하는 시간을 갖겠습니다.
때때로 크로마토그램에서 예상되는 피크가 전혀 관찰되지 않는 경우가 있습니다. 위의 도표는 피크가 나타나지 않는 경우(시료에 목표 분석물질이 노이즈보다 높은 농도로 존재하여 검출기 반응이 충분히 감지될 수 있다고 가정할 때)는 일반적으로 기기 문제 또는 잘못된 이동상 조건(피크가 관찰되지 않는 경우 포함)과 관련이 있음을 보여줍니다. 이러한 경우 피크가 너무 약하게 나타나는 경우가 많습니다. 이와 관련된 잠재적인 문제와 해결책은 표 I에서 확인할 수 있습니다.
위에서 언급했듯이, 피크 폭이 어느 정도까지 넓어져야 문제가 해결될 수 있는지에 대한 문제는 복잡한 주제이며, 추후 다른 글에서 자세히 다루겠습니다. 제 경험상, 상당한 피크 폭 확장은 종종 피크 모양의 상당한 변화를 동반하며, 피크 꼬리 부분은 피크 앞쪽이나 분할보다 더 흔하게 나타납니다. 하지만 명목상 대칭인 피크도 넓어질 수 있는데, 이는 몇 가지 다른 원인에 의해 발생할 수 있습니다.
이러한 문제들은 LC 문제 해결 시리즈의 이전 호에서 자세히 다루어졌으며, 해당 주제에 관심 있는 독자는 이전 기사를 참조하여 문제의 근본 원인과 잠재적 해결책에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 더 자세한 내용은 여기를 참조하십시오.
피크 꼬리끌림, 피크 앞끌림, 그리고 분리는 모두 화학적 또는 물리적 현상에 의해 발생할 수 있으며, 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 문제의 원인이 화학적인지 물리적인지에 따라 매우 다양합니다. 크로마토그램에서 여러 피크를 비교하면 원인을 파악하는 데 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 크로마토그램의 모든 피크가 비슷한 모양을 보인다면 물리적인 원인은 아닐 가능성이 높습니다. 하나 또는 몇 개의 피크만 영향을 받고 나머지는 정상이라면 화학적 원인일 가능성이 높습니다.
피크 테일링의 화학적 원인은 너무 복잡하여 여기에서 간략하게 논의하기 어렵습니다. 더 자세한 내용은 최근 발행된 "LC Troubleshooting"을 참조하십시오(10). 그러나 쉽게 시도해 볼 수 있는 방법은 주입하는 분석물질의 질량을 줄여서 피크 모양이 개선되는지 확인하는 것입니다. 만약 그렇다면, 이는 "질량 과부하"가 문제의 원인이라는 좋은 단서가 됩니다. 이 경우, 분석물질 주입량을 소량으로 제한하거나, 더 많은 양의 분석물질을 주입하더라도 양호한 피크 모양을 얻을 수 있도록 크로마토그래피 조건을 변경해야 합니다.
피크 테일링에는 여러 가지 물리적 원인이 있을 수 있습니다. 자세한 내용은 "LC Troubleshooting"의 최근 호(11)를 참조하십시오. 피크 테일링의 일반적인 물리적 원인 중 하나는 주입기와 검출기 사이의 연결 불량입니다(12). 몇 주 전 저희 연구실에서 얻은 극단적인 예가 그림 1d에 나와 있습니다. 이 경우, 이전에 사용하지 않았던 새로운 주입 밸브를 사용하여 시스템을 구축하고 스테인리스 스틸 모세관에 페룰이 성형된 소용량 주입 루프를 설치했습니다. 초기 문제 해결 실험 후, 주입 밸브 스테이터의 포트 깊이가 기존보다 훨씬 깊어 포트 바닥에 큰 데드 볼륨이 발생하는 것을 확인했습니다. 이 문제는 주입 루프를 다른 튜브로 교체하고 페룰을 적절한 위치로 조정하여 포트 바닥의 데드 볼륨을 제거하면 쉽게 해결할 수 있습니다.
그림 1e에 나타난 것과 같은 피크 전면은 물리적 또는 화학적 문제로 인해 발생할 수도 있습니다. 피크 전면 돌출의 일반적인 물리적 원인은 컬럼의 입자층이 고르게 충전되지 않았거나 시간이 지남에 따라 입자가 재배열된 것입니다. 이러한 물리적 현상으로 인한 피크 테일링과 마찬가지로, 이를 해결하는 가장 좋은 방법은 컬럼을 교체하고 계속 진행하는 것입니다. 근본적으로, 화학적 원인으로 인한 피크 전면 돌출 모양은 종종 "비선형" 유지 조건이라고 부르는 것에서 발생합니다. 이상적인(선형) 조건에서 고정상에 유지되는 분석물질의 양(따라서 유지 인자)은 컬럼 내 분석물질 농도와 선형적으로 관련됩니다. 크로마토그래피적으로 이는 컬럼에 주입된 분석물질의 질량이 증가함에 따라 피크가 더 높아지지만 너비는 변하지 않는다는 것을 의미합니다. 유지 거동이 비선형적일 경우 이러한 관계가 깨지고, 주입된 질량이 증가함에 따라 피크는 더 높아질 뿐만 아니라 더 넓어집니다. 또한, 비선형 모양은 크로마토그래피 피크의 모양을 결정하여 전면 돌출 또는 후면 돌출을 초래합니다. 피크 테일링(10)을 유발하는 질량 과부하, 비선형 유지로 인한 피크 선행은 주입된 분석물 질량을 줄여서 진단할 수도 있습니다. 피크 모양이 개선되면 선행 가장자리를 유발하는 주입 품질을 초과하지 않도록 방법을 수정하거나 이러한 현상을 최소화하도록 크로마토그래피 조건을 변경해야 합니다.
때때로 그림 1f에서처럼 "분리된" 피크처럼 보이는 현상이 관찰됩니다. 이 문제를 해결하는 첫 번째 단계는 피크 모양이 부분적인 동시 용출(즉, 서로 다르지만 가깝게 용출되는 두 가지 화합물의 존재) 때문인지 확인하는 것입니다. 실제로 두 가지 다른 분석 물질이 가까이 용출되는 경우, 분해능을 개선하는 문제(예: 선택성, 유지 시간 또는 이론단 수 증가)이며, 겉보기에 "분리된" 피크는 컬럼 자체의 성능과는 무관한 물리적 문제와 관련이 있습니다. 이 문제를 판단하는 데 가장 중요한 단서는 크로마토그램의 모든 피크가 분리된 모양을 보이는지, 아니면 하나 또는 두 개의 피크만 분리된 모양을 보이는지 여부입니다. 하나 또는 두 개의 피크만 분리된 모양을 보인다면 동시 용출 문제일 가능성이 높고, 모든 피크가 분리된 모양을 보인다면 컬럼 자체와 관련된 물리적 문제일 가능성이 가장 높습니다.
컬럼 자체의 물리적 특성과 관련된 분할 피크는 일반적으로 입구 또는 출구 프릿이 부분적으로 막히거나 컬럼 내 입자의 재배열로 인해 발생하며, 이로 인해 이동상이 컬럼 채널 형성의 특정 영역에서 다른 영역보다 더 빠르게 흐르게 됩니다(11). 부분적으로 막힌 프릿은 때때로 컬럼을 통한 흐름 방향을 반대로 하여 제거할 수 있지만, 제 경험상 이는 일반적으로 장기적인 해결책이 아니라 단기적인 해결책입니다. 최신 컬럼에서는 입자가 컬럼 내에서 재결합될 경우 치명적인 경우가 많습니다. 이 경우 컬럼을 교체하고 계속 진행하는 것이 가장 좋습니다.
그림 1g의 피크는 제 연구실에서 최근에 관찰된 사례와 마찬가지로, 신호가 응답 범위의 상한에 도달했음을 나타냅니다. 광흡수 검출기(이 경우 UV-vis)의 경우, 분석물 농도가 매우 높으면 분석물이 검출기 유동 셀을 통과하는 빛의 대부분을 흡수하여 검출되는 빛이 매우 적어집니다. 이러한 조건에서 광검출기의 전기 신호는 산란광 및 "암전류"와 같은 다양한 잡음원의 영향을 크게 받아 신호가 매우 흐릿하게 나타나고 분석물 농도와 무관해집니다. 이러한 경우, 분석물 주입량을 줄이거나, 시료를 희석하거나, 또는 둘 다를 통해 문제를 쉽게 해결할 수 있습니다.
크로마토그래피 수업에서는 검출기 신호(즉, 크로마토그램의 y축)를 시료 내 분석물질 농도의 지표로 사용합니다. 따라서 크로마토그램에서 신호가 0보다 낮은 값을 보이는 것은 이상하게 느껴질 수 있습니다. 이는 단순히 분석물질 농도가 음수라는 의미로 해석될 수 있는데, 물론 물리적으로 불가능합니다. 제 경험상, 음의 피크는 광학 흡광 검출기(예: UV-vis)를 사용할 때 가장 자주 관찰됩니다.
이 경우, 음의 피크는 단순히 컬럼에서 용출되는 분자가 피크 바로 앞뒤에서 이동상 자체보다 빛을 덜 흡수한다는 것을 의미합니다. 이는 예를 들어 상대적으로 낮은 검출 파장(<230 nm)을 사용하거나 이러한 파장에서 대부분의 빛을 흡수하는 이동상 첨가제를 사용할 때 발생할 수 있습니다. 이러한 첨가제에는 메탄올과 같은 이동상 용매 성분이나 아세트산염 또는 포름산염과 같은 완충액 성분이 포함될 수 있습니다. 실제로 음의 피크를 사용하여 검정 곡선을 작성하고 정확한 정량 정보를 얻을 수 있으므로 이를 피해야 할 근본적인 이유는 없습니다(이 방법을 때때로 "간접 UV 검출"이라고 합니다)(13). 그러나 흡광도 검출에서 음의 피크를 완전히 피하려면 분석물이 이동상보다 더 많이 흡수하도록 다른 검출 파장을 사용하거나 이동상의 조성을 변경하여 분석물보다 빛을 덜 흡수하도록 하는 것이 가장 좋은 해결책입니다.
굴절률(RI) 검출법을 사용할 때, 시료 내 분석물질 이외의 성분(예: 용매 매트릭스)의 굴절률이 이동상의 굴절률과 다를 경우 음의 피크가 나타날 수 있습니다. 이는 UV-vis 검출법에서도 발생하지만, RI 검출법에 비해 그 영향이 약화되는 경향이 있습니다. 두 경우 모두, 시료 매트릭스의 조성을 이동상의 조성과 더 가깝게 일치시킴으로써 음의 피크를 최소화할 수 있습니다.
LC 문제 해결의 기본 주제인 3부에서는 관찰된 피크 모양이 예상 또는 정상적인 피크 모양과 다른 상황에 대해 논의했습니다. 이러한 문제를 효과적으로 해결하려면 예상 피크 모양에 대한 지식(이론 또는 기존 방법을 사용한 경험을 바탕으로)이 필수적이며, 이를 통해 예상에서 벗어나는 부분을 쉽게 파악할 수 있습니다. 피크 모양 문제는 (너무 넓거나, 꼬리 부분이 길거나, 앞쪽 가장자리에 치우치거나 등) 다양한 원인이 있을 수 있습니다. 이번 편에서는 제가 가장 자주 접하는 몇 가지 원인을 자세히 살펴보겠습니다. 이러한 세부 사항을 아는 것은 문제 해결을 시작하는 데 좋은 출발점이 되지만, 모든 가능성을 포괄하는 것은 아닙니다. 보다 자세한 원인 및 해결 방법 목록을 원하시는 독자는 LCGC의 "LC 문제 해결 가이드" 벽 차트를 참조하십시오.
(4) LCGC "LC 문제 해결 가이드" 벽 차트.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, 크로마토그래피의 데이터 분석 및 신호 처리(Elsevier, 뉴욕, NY, 1998), 43-96쪽.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF 및 Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.