일부 LC 문제 해결 주제는 시간이 지남에 따라 기기 기술이 향상되더라도 LC 실무에 문제가 있기 때문에 결코 오래되지 않습니다. LC 시스템에서 문제가 발생하여 피크 모양이 좋지 않게 되는 데는 여러 가지 이유가 있습니다. 피크 모양과 관련된 문제가 발생하면 이러한 결과에 대한 가능한 원인을 간략하게 나열하면 문제 해결 과정을 간소화하는 데 도움이 됩니다.
이 "LC 문제 해결" 칼럼을 쓰고 매달 주제에 대해 생각하는 것은 재미있었습니다.어떤 주제는 결코 유행에서 벗어나지 않기 때문입니다.크로마토그래피 연구 분야에서 특정 주제나 아이디어는 더 새롭고 더 나은 아이디어로 대체되면서 쓸모없게 되지만, 문제 해결 분야에서는 이 저널(당시 LC 저널)에 첫 문제 해결 기사가 게재된 이후로 일부 주제는 여전히 관련성이 있습니다(1).지난 몇 년 동안 저는 액체 크로마토그래피(LC)에 영향을 미치는 현대적 동향에 여러 LC 문제 해결 섹션을 집중적으로 다뤘습니다(예: 보유에 대한 압력의 영향에 대한 이해의 상대적 비교 [2] 새로운 발전) LC 결과에 대한 해석과 최신 LC 기기를 사용하여 문제를 해결하는 방법.이번 달에는 2021년 12월에 시작한 시리즈(3)를 계속합니다.이 시리즈는 LC 문제 해결의 "생사" 주제 중 일부에 초점을 맞췄습니다.사용하는 시스템의 연령에 관계없이 모든 문제 해결자에게 유용한 요소는 필수적입니다.이 시리즈의 핵심 주제는 매우 관련성이 높습니다. 많은 실험실에 걸려 있는 LCGC의 유명한 "LC 문제 해결 가이드" 벽면 차트(4)에 대한 내용입니다. 이 시리즈의 세 번째 부분에서는 피크 모양이나 피크 특성과 ​​관련된 문제에 초점을 맞추기로 했습니다. 놀랍게도 벽면 차트에는 피크 모양 불량의 잠재적 원인이 44가지나 나열되어 있습니다! 이 모든 문제를 한 편의 기사에서 자세히 다룰 수는 없으므로, 이 주제에 대한 첫 번째 기사에서는 제가 가장 자주 보는 몇 가지 문제에 초점을 맞추겠습니다. 젊은 LC 사용자와 노년층 사용자 모두에게 이 중요한 주제에 대한 유용한 팁과 알림을 제공하기를 바랍니다.
저는 점점 더 "무엇이든 가능하다"라는 말로 문제 해결 질문에 답하고 있습니다. 해석하기 어려운 관찰 결과를 고려할 때 이 답변은 쉽게 보일 수 있지만, 저는 종종 이 답변이 적절하다고 생각합니다. 피크 모양이 좋지 않은 데에는 여러 가지 가능한 원인이 있으므로 문제가 무엇일지 고려할 때 열린 마음을 유지하고 가장 일반적인 가능성에 초점을 맞춰 문제 해결 노력을 시작할 잠재적 원인의 우선순위를 정하는 것이 중요합니다. 이 점은 매우 중요합니다.
모든 문제 해결 과정에서 핵심 단계이지만, 제 생각에는 과소평가되는 단계 중 하나는 해결해야 할 문제가 있음을 인식하는 것입니다. 문제가 있음을 인식한다는 것은 도구에서 발생하는 현상이 이론, 경험적 지식, 그리고 경험에 의해 형성되는 우리의 기대와 다르다는 것을 인식하는 것을 의미합니다(5). 여기서 언급된 "피크 모양"은 실제로 피크의 모양(대칭, 비대칭, 매끈함, 솜털 모양, 선단, 꼬리 모양 등)뿐만 아니라 너비도 의미합니다. 실제 피크 모양에 대한 우리의 기대는 간단합니다. 이론(6)은 대부분의 경우 크로마토그래피 피크가 대칭적이고 그림 1a와 같이 가우시안 분포 모양을 따라야 한다는 교과서적 기대를 잘 뒷받침합니다. 피크 너비에서 우리가 기대하는 것은 더 복잡한 문제이며, 이 주제는 다음 글에서 논의할 것입니다. 그림 1의 다른 피크 모양은 관찰될 수 있는 다른 가능성들, 즉 문제가 발생할 수 있는 몇 가지 방식을 보여줍니다. 이 글의 나머지 부분에서는, 이런 모양 유형이 생길 수 있는 몇 가지 구체적인 상황의 예를 논의하는 데 시간을 할애하겠습니다.
때로는 피크가 용출될 것으로 예상되는 크로마토그램에서 전혀 관찰되지 않는 경우가 있습니다. 위의 벽면 차트는 피크가 없는 경우(샘플에 실제로 검출기 반응이 노이즈 위로 충분히 감지될 수 있는 농도의 대상 분석물이 포함되어 있다고 가정할 때) 일반적으로 일부 기기 문제나 잘못된 이동상 조건(관찰된 경우)과 관련이 있음을 나타냅니다. 피크는 대개 너무 "약합니다". 이 범주에 해당하는 잠재적인 문제와 해결책의 짧은 목록은 표 I에서 찾을 수 있습니다.
위에서 언급했듯이, 주의를 기울이고 수정하기 전에 얼마나 많은 피크 확장을 허용해야 하는지에 대한 질문은 복잡한 주제이며, 향후 기사에서 논의할 것입니다.제 경험에 따르면 상당한 피크 확장은 종종 피크 모양의 상당한 변화를 동반하며, 피크 테일링은 프리피크 또는 분할보다 더 흔합니다.그러나 명목상 대칭인 피크도 확장되는데, 이는 몇 가지 다른 이유로 인해 발생할 수 있습니다.
이러한 각 문제는 이전 LC 문제 해결 호에서 자세히 논의되었으며, 이 주제에 관심이 있는 독자는 이전 문서에서 문제의 근본 원인과 잠재적 해결책에 대한 정보를 확인할 수 있습니다. 자세한 내용은 다음과 같습니다.
피크 테일링, 피크 프런팅, 분리는 모두 화학적 또는 물리적 현상으로 인해 발생할 수 있으며, 이러한 문제에 대한 잠재적 해결책 목록은 화학적 문제인지 물리적 문제인지에 따라 크게 달라집니다. 종종 크로마토그램에서 서로 다른 피크를 비교하면 어느 피크가 원인인지에 대한 중요한 단서를 찾을 수 있습니다. 크로마토그램에서 모든 피크가 비슷한 모양을 보인다면 원인은 물리적인 것이 아닐 가능성이 큽니다. 하나 또는 몇 개의 피크만 영향을 받고 나머지는 괜찮아 보인다면 원인은 화학적일 가능성이 큽니다.
피크 테일링의 화학적 원인은 너무 복잡해서 여기서 간략하게 논의할 수 없습니다.관심 있는 독자는 보다 심도 있는 논의를 위해 최근의 "LC 문제 해결" 문제를 참조하십시오(10).그러나 시도해 볼 수 있는 쉬운 방법은 주입된 분석물의 질량을 줄이고 피크 모양이 개선되는지 확인하는 것입니다.그렇다면 이는 문제가 "질량 과부하"라는 좋은 단서입니다.이 경우, 이 방법은 작은 분석물 질량을 주입하는 것으로 제한해야 하거나 크로마토그래피 조건을 변경하여 더 큰 질량을 주입하더라도 좋은 피크 모양을 얻을 수 있도록 해야 합니다.
피크 테일링에는 잠재적인 물리적 이유가 많이 있습니다.가능성에 대한 자세한 논의에 관심이 있는 독자는 "LC 문제 해결"(11)의 최근 문제를 참조하십시오.피크 테일링의 보다 일반적인 물리적 원인 중 하나는 인젝터와 검출기 사이 지점의 연결이 불량한 것입니다(12).극단적인 예가 몇 주 전에 내 연구실에서 얻은 그림 1d에 나와 있습니다.이 경우, 우리는 이전에 사용하지 않았던 새로운 주입 밸브로 시스템을 구축하고 스테인리스 스틸 모세관에 성형된 페룰이 있는 소량 주입 루프를 설치했습니다.몇 가지 초기 문제 해결 실험 후, 우리는 주입 밸브 스테이터의 포트 깊이가 익숙한 것보다 훨씬 깊다는 것을 깨달았고, 그 결과 포트 바닥에 큰 사각 공간이 생겼습니다.이 문제는 주입 루프를 다른 튜브로 교체하면 쉽게 해결되며, 페룰을 적절한 위치로 조정하여 포트 바닥의 사각 공간을 제거할 수 있습니다.
그림 1e에 표시된 것과 같은 피크 전면은 물리적 또는 화학적 문제로 인해 발생할 수도 있습니다. 선단 피크의 일반적인 물리적 원인은 컬럼의 입자층이 제대로 채워지지 않았거나 입자가 시간이 지남에 따라 재조직된 것입니다. 이러한 물리적 현상으로 인한 피크 테일링과 마찬가지로 이를 해결하는 가장 좋은 방법은 컬럼을 교체하고 계속 사용하는 것입니다. 근본적으로 화학적 원인으로 인한 선단 피크 모양은 종종 "비선형" 머무름 조건에서 발생합니다. 이상적인(선형) 조건에서 고정상에 머무른 분석물의 양(따라서 머무름 계수)은 컬럼 내 분석물 농도와 선형적으로 관련됩니다. 크로마토그래피적으로 이는 컬럼에 주입된 분석물의 질량이 증가함에 따라 피크는 더 높아지지만 폭은 넓어지지 않음을 의미합니다. 머무름 거동이 비선형일 때 이러한 관계는 깨지고, 더 많은 질량이 주입됨에 따라 피크가 더 높아질 뿐만 아니라 폭도 넓어집니다. 또한, 비선형 모양은 크로마토그래피 피크의 모양을 결정하여 선단 피크 또는 후단 피크를 발생시킵니다. 피크 테일링(10)을 유발하는 질량 과부하와 마찬가지로 비선형 유지로 인한 피크 리딩도 주입된 분석물 질량을 줄임으로써 진단할 수 있습니다. 피크 모양이 개선되면 리딩 에지를 유발하는 주입 품질을 초과하지 않도록 방법을 수정하거나 크로마토그래피 조건을 변경하여 이러한 동작을 최소화해야 합니다.
때때로 그림 1f에 표시된 것처럼 "분할" 피크처럼 보이는 것을 관찰합니다. 이 문제를 해결하는 첫 번째 단계는 피크 모양이 부분적 공동 용출(즉, 두 가지 다르지만 밀접하게 용출되는 화합물의 존재) 때문인지 확인하는 것입니다. 실제로 두 가지 다른 분석물이 가깝게 용출되는 경우 분리능을 개선하는 문제입니다(예: 선택성, 보유 또는 플레이트 수 증가). 명백한 "분할" 피크는 물리적 성능과 관련이 있습니다. 성능은 컬럼 자체와는 아무런 관련이 없습니다. 종종 이 결정에 가장 중요한 단서는 크로마토그램의 모든 피크가 분할 모양을 나타내는지, 아니면 하나 또는 두 개만 나타내는지입니다. 하나 또는 두 개만 나타내는 경우 공동 용출 문제일 가능성이 높고, 모든 피크가 분할된 경우 컬럼 자체와 관련된 물리적 문제일 가능성이 높습니다.
컬럼 자체의 물리적 특성과 관련된 분할 피크는 일반적으로 입구 또는 출구 프릿이 부분적으로 막히거나 컬럼 내 입자가 재조직되어 컬럼 채널 형성의 특정 영역에서 이동상이 이동상보다 더 빨리 흐르기 때문에 발생합니다(11). 부분적으로 막힌 프릿은 때때로 컬럼을 통한 흐름을 역전시켜 제거할 수 있습니다. 그러나 제 경험에 따르면 이는 일반적으로 장기적인 해결책이라기보다는 단기적인 해결책입니다. 입자가 컬럼 내에서 재결합하는 경우 현대 컬럼의 경우 종종 치명적입니다. 이 시점에서는 컬럼을 교체하고 계속 진행하는 것이 가장 좋습니다.
그림 1g의 피크는 최근 제 연구실에서 발생한 것으로, 일반적으로 신호가 매우 높아 반응 범위의 상한에 도달했음을 나타냅니다. 광흡수 검출기(이 경우 UV-vis)의 경우, 분석물 농도가 매우 높으면 분석물이 검출기 유동 셀을 통과하는 빛의 대부분을 흡수하여 검출되는 빛이 거의 남지 않습니다. 이러한 조건에서 광검출기의 전기 신호는 미광이나 "암전류"와 같은 다양한 노이즈원의 영향을 크게 받아 신호가 분석물 농도와 관계없이 매우 "흐릿하게" 보입니다. 이러한 경우, 분석물의 주입량을 줄임으로써, 즉 주입량을 줄이거나 시료를 희석하거나, 둘 다를 통해 문제를 쉽게 해결할 수 있습니다.
크로마토그래피 학교에서는 검출기 신호(즉, 크로마토그램의 y축)를 샘플의 분석물 농도 지표로 사용합니다. 그래서 신호가 0보다 작은 크로마토그램을 보는 것은 이상하게 보입니다. 간단히 해석하면 이는 음의 분석물 농도를 나타내기 때문입니다. 물론 물리적으로 이는 불가능합니다. 제 경험에 따르면 음의 피크는 광학 흡광도 검출기(예: UV-vis)를 사용할 때 가장 자주 관찰됩니다.
이 경우, 음의 피크는 컬럼에서 용출된 분자가 피크 바로 전후에 이동상 자체보다 적은 빛을 흡수한다는 것을 의미합니다.예를 들어, 비교적 낮은 검출 파장(<230nm)과 이 파장에서 대부분의 빛을 흡수하는 이동상 첨가제를 사용할 때 발생할 수 있습니다.이러한 첨가제는 메탄올과 같은 이동상 용매 성분이나 아세트산염 또는 포름산염과 같은 완충액 성분일 수 있습니다.실제로 음의 피크를 사용하여 검량선을 작성하고 정확한 정량적 정보를 얻을 수 있으므로 그 자체로 피할 근본적인 이유는 없습니다(이 방법은 때때로 "간접 UV 검출"이라고 함)(13).그러나 흡광도 검출의 경우 음의 피크를 완전히 피하고 싶다면 가장 좋은 해결책은 다른 검출 파장을 사용하여 분석물이 이동상보다 더 많이 흡수하도록 하거나 이동상의 구성을 변경하여 분석물보다 빛을 덜 흡수하도록 하는 것입니다.
굴절률(RI) 검출을 사용할 때 음의 피크가 나타날 수도 있는데, 이는 시료에 있는 분석물 이외의 성분(예: 용매 매트릭스)의 굴절률이 이동상의 굴절률과 다를 때입니다. 이는 UV-vis 검출에서도 발생하지만, 이 효과는 RI 검출에 비해 약해지는 경향이 있습니다. 두 경우 모두 시료 매트릭스의 구성을 이동상의 구성과 더 밀접하게 일치시킴으로써 음의 피크를 최소화할 수 있습니다.
LC 문제 해결의 기본 주제에 대한 세 번째 부분에서는 관찰된 피크 모양이 예상 또는 정상적인 피크 모양과 다른 상황을 논의했습니다.이러한 문제에 대한 효과적인 문제 해결은 예상되는 피크 모양에 대한 지식(이론이나 기존 방법에 대한 이전 경험 기반)으로 시작하므로 이러한 예상과의 차이는 명확합니다.피크 모양 문제에는 여러 가지 잠재적 원인(너무 넓음, 꼬리, 선단 등)이 있습니다.이번 호에서는 가장 자주 보는 몇 가지 이유에 대해 자세히 설명합니다.이러한 세부 정보를 알면 문제 해결을 시작하기에 좋은 곳이 되지만 모든 가능성을 파악하는 것은 아닙니다.원인과 해결책에 대한 더 자세한 목록에 관심이 있는 독자는 LCGC "LC 문제 해결 가이드" 벽면 차트를 참조할 수 있습니다.
(4) LCGC "LC 문제 해결 가이드" 벽면 차트.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, 크로마토그래피에서의 데이터 분석 및 신호 처리(Elsevier, New York, NY, 1998), 43-96쪽.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF 및 Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44(2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.