کچھ LC ٹربل شوٹنگ کے موضوعات کبھی پرانے نہیں ہوتے ہیں، کیونکہ LC پریکٹس میں مسائل ہوتے ہیں، حتیٰ کہ وقت کے ساتھ ساتھ آلات کی ٹیکنالوجی میں بہتری آتی ہے۔ ایسے بہت سے طریقے ہیں جن سے LC سسٹم میں مسائل پیدا ہو سکتے ہیں اور خراب چوٹی کی شکل میں ختم ہو سکتے ہیں۔ جب چوٹی کی شکل سے متعلق مسائل پیدا ہوتے ہیں، تو ان نتائج کی ممکنہ وجوہات کی ایک مختصر فہرست ہمارے ٹربل شوٹنگ کے تجربے کو آسان بنانے میں مدد کرتی ہے۔
اس "ایل سی ٹربل شوٹنگ" کالم کو لکھنے اور ہر ماہ عنوانات کے بارے میں سوچنے میں مزہ آیا، کیونکہ کچھ عنوانات کبھی بھی انداز سے باہر نہیں ہوتے۔ جب کہ کرومیٹوگرافی کی تحقیق کے میدان میں کچھ عنوانات یا خیالات متروک ہو جاتے ہیں کیونکہ وہ نئے اور بہتر خیالات کے ذریعے تبدیل ہو جاتے ہیں، ٹربل شوٹنگ کے شعبے میں، جب سے یہ ٹربل شوٹنگ جرنل میں کچھ پہلے مضمون شائع ہوا ہے، تب سے موضوعات اب بھی متعلقہ ہیں) 1983 میں مہینے کی قسط میں، میں اپنی سیریز (3) کو جاری رکھ رہا ہوں، جو دسمبر 2021 میں شروع ہوا تھا، جس نے LC کی خرابیوں کا سراغ لگانے کے کچھ "زندگی اور موت" کے موضوعات پر توجہ مرکوز کی تھی — ایسے عناصر جو کسی بھی ٹربل شوٹر کے لیے بہترین ہوتے ہیں، چاہے اس نظام کی عمر کیوں نہ ہو ہم استعمال کر رہے ہیں۔ بہت سی لیبارٹریوں میں لٹکا ہوا ہے۔ اس سیریز کے تیسرے حصے کے لیے، میں نے چوٹی کی شکل یا چوٹی کی خصوصیات سے متعلق مسائل پر توجہ مرکوز کرنے کا انتخاب کیا۔ حیرت انگیز طور پر، وال چارٹ میں چوٹی کی خراب شکل کی 44 مختلف ممکنہ وجوہات کی فہرست دی گئی ہے! ہم ان تمام مسائل پر ایک مضمون میں تفصیل سے غور نہیں کر سکتے، اس لیے اس موضوع پر پہلی قسط میں، میں امید کرتا ہوں کہ کچھ بوڑھے صارفین کی مدد کروں گا جو اکثر نوجوان لوگوں کو تلاش کر سکیں گے۔ اس اہم موضوع پر تجاویز اور یاد دہانیاں۔
میں اپنے آپ کو "کچھ بھی ممکن ہے" کے ساتھ مسائل کا حل کرنے والے سوالات کا تیزی سے جواب دیتا ہوا پاتا ہوں۔ یہ جواب ان مشاہدات پر غور کرتے وقت آسان معلوم ہوتا ہے جن کی تشریح کرنا مشکل ہے، لیکن مجھے یہ اکثر مناسب لگتا ہے۔ خراب چوٹی کی شکل کے بہت سے ممکنہ اسباب کے ساتھ، مسئلہ کیا ہو سکتا ہے اس پر غور کرتے وقت کھلا ذہن رکھنا ضروری ہے، اور ممکنہ وجوہات کو ترجیح دینے کے قابل ہونے کے لیے، ان مسائل کو حل کرنے کی کوششوں پر توجہ مرکوز کرنے کے لیے زیادہ تر کوششیں ہماری مشترکہ کوششوں پر ہوتی ہیں۔ بہت اہم ہے.
کسی بھی ٹربل شوٹنگ کی مشق میں ایک اہم قدم — لیکن ایک جسے میرے خیال میں کم درجہ دیا گیا ہے — یہ تسلیم کرنا ہے کہ ایک مسئلہ ہے جسے حل کرنے کی ضرورت ہے۔ اکثر یہ تسلیم کرنے کا مطلب ہے کہ اس آلے کے ساتھ جو کچھ ہوتا ہے وہ ہماری توقعات سے مختلف ہوتا ہے، جو نظریہ، تجرباتی علم، اور تجربے سے تشکیل پاتا ہے (5)۔ "چوٹی کی شکل" کا حوالہ دیا گیا ہے، جس کا حوالہ درحقیقت یہاں نہیں ہے۔ غیر متناسب، ہموار، فلفی، لیڈنگ ایج، ٹیلنگ، وغیرہ)، بلکہ چوڑائی تک بھی۔ اصل چوٹی کی شکل کے لیے ہماری توقعات سادہ ہیں۔ تھیوری (6) نصابی کتاب کی اس توقع کی اچھی طرح تائید کرتی ہے کہ زیادہ تر معاملات میں، کرومیٹوگرافک چوٹیاں سڈول ہونی چاہئیں اور توقع کے مطابق ہونی چاہئیں۔ چوٹی کی چوڑائی سے ایک زیادہ پیچیدہ مسئلہ ہے، اور ہم مستقبل کے مضمون میں اس موضوع پر بات کریں گے۔ شکل 1 میں چوٹی کی دوسری شکلیں کچھ دوسرے امکانات کو ظاہر کرتی ہیں جن کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے- دوسرے الفاظ میں، کچھ طریقے جن سے چیزیں غلط ہو سکتی ہیں۔
بعض اوقات کرومیٹوگرام میں چوٹیوں کا بالکل بھی مشاہدہ نہیں کیا جاتا ہے جہاں ان کے ختم ہونے کی توقع کی جاتی ہے۔ اوپر والا دیواری چارٹ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ چوٹی کی عدم موجودگی (یہ فرض کرتے ہوئے کہ نمونے میں اصل میں ٹارگٹ اینالائٹ موجود ہے جو اسے شور کے اوپر دیکھنے کے لیے ڈیٹیکٹر کے ردعمل کو کافی بناتا ہے) عام طور پر کسی آلے کے مسئلے سے متعلق ہوتا ہے یا (موبائل کے تمام حالات میں غلط مشاہدہ)۔ چوٹیاں، عام طور پر بہت "کمزور")۔
جیسا کہ اوپر ذکر کیا گیا ہے، یہ سوال کہ توجہ دینے اور اسے ٹھیک کرنے کی کوشش کرنے سے پہلے چوٹی کی چوٹی کو کس حد تک برداشت کیا جانا چاہیے، یہ ایک پیچیدہ موضوع ہے جس پر میں آئندہ مضمون میں بات کروں گا۔ میرا تجربہ یہ ہے کہ چوٹی کی چوٹی کو وسیع کرنے میں اکثر چوٹی کی شکل میں نمایاں تبدیلی آتی ہے، اور چوٹی کی چوٹی کو چوٹی سے پہلے یا تقسیم کرنے سے زیادہ عام ہوتا ہے۔ کچھ مختلف وجوہات کی وجہ سے:
ان مسائل میں سے ہر ایک پر ٹربل شوٹنگ ایل سی کے پچھلے شماروں میں تفصیل سے بات کی گئی ہے، اور ان موضوعات میں دلچسپی رکھنے والے قارئین ان مسائل کی بنیادی وجوہات اور ممکنہ حل کے بارے میں معلومات کے لیے ان پچھلے مضامین کا حوالہ دے سکتے ہیں۔ مزید تفصیلات۔
چوٹی ٹیلنگ، چوٹی فرنٹنگ، اور تقسیم سبھی کیمیائی یا جسمانی مظاہر کی وجہ سے ہو سکتے ہیں، اور ان مسائل کے ممکنہ حل کی فہرست وسیع پیمانے پر مختلف ہوتی ہے، اس بات پر منحصر ہے کہ آیا ہم کسی کیمیائی یا جسمانی مسئلے سے نمٹ رہے ہیں۔ اکثر، کرومیٹوگرام میں مختلف چوٹیوں کا موازنہ کر کے، آپ اس بارے میں اہم اشارے تلاش کر سکتے ہیں کہ کس کے بارے میں مجرم، ایک جیسی شکل میں ایک جیسی شکل ہے۔ ممکنہ طور پر وجہ جسمانی نہیں ہے۔ اگر صرف ایک یا چند چوٹیاں متاثر ہوتی ہیں، لیکن باقی ٹھیک لگتی ہیں، تو زیادہ تر ممکنہ وجہ کیمیائی ہے۔
چوٹی ٹیلنگ کی کیمیائی وجوہات یہاں پر مختصراً بحث کرنے کے لیے بہت پیچیدہ ہیں۔ دلچسپی رکھنے والے قارئین کو مزید گہرائی سے بحث کے لیے "LC ٹربل شوٹنگ" کے حالیہ شمارے کا حوالہ دیا گیا ہے (10)۔ تاہم، کوشش کرنے کے لیے ایک آسان چیز یہ ہے کہ انجکشن والے تجزیہ کار کی مقدار کو کم کریں اور دیکھیں کہ چوٹی کی شکل بہتر ہوتی ہے یا نہیں۔ چھوٹے تجزیہ کاروں کو انجیکشن تک محدود رکھیں، یا کرومیٹوگرافک حالات کو تبدیل کیا جانا چاہیے تاکہ بڑے پیمانے پر انجیکشن لگانے کے باوجود بھی اچھی چوٹی کی شکلیں حاصل کی جاسکیں۔
چوٹی ٹیلنگ کی بہت سی ممکنہ جسمانی وجوہات بھی ہیں۔ امکانات کی تفصیلی گفتگو میں دلچسپی رکھنے والے قارئین کو "LC ٹربل شوٹنگ" (11) کے ایک اور حالیہ شمارے کی طرف رجوع کیا جاتا ہے۔ چوٹی کے چھلکے کی ایک عام فزیکل وجہ انجیکٹر اور ڈیٹیکٹر (12) کے درمیان ایک نقطہ پر ناقص کنکشن ہے۔ اس معاملے میں، ہم نے ایک نئے انجیکشن والو کے ساتھ ایک سسٹم بنایا جسے ہم نے پہلے استعمال نہیں کیا تھا، اور ایک چھوٹے حجم کے انجیکشن لوپ کو ایک فیرول کے ساتھ نصب کیا جسے ایک سٹینلیس سٹیل کیپلیری میں ڈھالا گیا تھا۔ کچھ ابتدائی خرابیوں کا ازالہ کرنے کے تجربات کے بعد، ہم نے محسوس کیا کہ انجیکشن والو سٹیٹر میں پورٹ کی گہرائی زیادہ گہرائی میں استعمال کی گئی تھی، جس کے نتیجے میں ہم نے نچلے حجم کو پورٹ کرنے میں بہت زیادہ گہرائی کی تھی۔ انجیکشن لوپ کو دوسری ٹیوب سے بدل کر آسانی سے حل کیا جاتا ہے، ہم بندرگاہ کے نیچے ڈیڈ والیوم کو ختم کرنے کے لیے فیرول کو مناسب پوزیشن میں ایڈجسٹ کر سکتے ہیں۔
چوٹی کے محاذ جیسے کہ شکل 1e میں دکھائے گئے ہیں جسمانی یا کیمیائی مسائل کی وجہ سے بھی ہو سکتے ہیں۔ معروف کنارے کی ایک عام جسمانی وجہ یہ ہے کہ کالم کا پارٹیکل بیڈ اچھی طرح سے بھرا ہوا نہیں ہے، یا یہ کہ ذرات وقت کے ساتھ ساتھ دوبارہ منظم ہو گئے ہیں۔ جیسا کہ اس جسمانی رجحان کی وجہ سے چوٹی کی ٹیلنگ کے ساتھ، اس کو ٹھیک کرنے کا بہترین طریقہ یہ ہے کہ سیسہ کو تبدیل کیا جائے اور اسے تبدیل کیا جائے۔ کیمیائی ماخذ کے ساتھ چوٹی کی شکلیں اکثر اس سے پیدا ہوتی ہیں جسے ہم "نان لکیری" برقرار رکھنے کے حالات کہتے ہیں۔ مثالی (لکیری) حالات کے تحت، سٹیشنری فیز (لہذا، برقرار رکھنے کا عنصر) کے ذریعہ برقرار رکھنے والے تجزیہ کی مقدار کا کالم میں تجزیہ کار کے ارتکاز سے خطی طور پر تعلق ہوتا ہے۔ لمبا ہو جاتا ہے، لیکن چوڑا نہیں ہوتا۔ یہ تعلق تب ٹوٹ جاتا ہے جب برقرار رکھنے کا رویہ غیر لکیری ہوتا ہے، اور چوٹیاں نہ صرف لمبی ہوتی ہیں بلکہ چوڑی بھی ہوتی ہیں کیونکہ زیادہ بڑے پیمانے پر انجکشن ہوتا ہے۔ اس کے علاوہ، غیر خطی شکلیں کرومیٹوگرافک چوٹیوں کی شکل کا تعین کرتی ہیں، جس کے نتیجے میں آگے یا پیچھے والے کنارے ہوتے ہیں۔ انجیکشن اینالائٹ ماس کو کم کر کے بھی تشخیص کیا جا سکتا ہے۔ اگر چوٹی کی شکل بہتر ہوتی ہے، تو طریقہ کار میں ترمیم کی جانی چاہیے تاکہ انجیکشن کے معیار سے زیادہ نہ ہو جو کہ معروف کنارے کا سبب بنتا ہے، یا اس رویے کو کم کرنے کے لیے کرومیٹوگرافک حالات کو تبدیل کرنا چاہیے۔
بعض اوقات ہم مشاہدہ کرتے ہیں کہ "تقسیم" کی چوٹی کیا دکھائی دیتی ہے، جیسا کہ شکل 1f میں دکھایا گیا ہے۔ اس مسئلے کو حل کرنے کا پہلا مرحلہ یہ طے کرنا ہے کہ آیا چوٹی کی شکل جزوی کو-ایلیوشن کی وجہ سے ہے (یعنی، دو الگ الگ لیکن قریب سے ایلوٹ کرنے والے مرکبات کی موجودگی)۔ اگر حقیقت میں دو مختلف تجزیہ کار ایک دوسرے کے قریب ہو رہے ہیں، تو یہ ان کی بڑھتی ہوئی ریزولوشن، مثال کے طور پر p، ریزولیوشن، مثال کے طور پر منتخب کرنے کا معاملہ ہے۔ شمار)، اور ظاہری "تقسیم" چوٹیاں جسمانی کارکردگی سے متعلق ہیں، کالم سے ہی کوئی تعلق نہیں ہے۔ اکثر، اس فیصلے کا سب سے اہم اشارہ یہ ہے کہ آیا کرومیٹوگرام کی تمام چوٹیاں تقسیم کی شکلیں دکھاتی ہیں، یا صرف ایک یا دو۔ اگر تمام چوٹیوں کو تقسیم کر دیا جاتا ہے، تو یہ ممکنہ طور پر ایک جسمانی مسئلہ ہے، زیادہ تر ممکنہ طور پر کالم ہی سے متعلق ہے۔
خود کالم کی جسمانی خصوصیات سے متعلق سپلٹ چوٹیاں عام طور پر جزوی طور پر بلاک شدہ ان لیٹ یا آؤٹ لیٹ فرٹس، یا کالم میں ذرات کی تنظیم نو کی وجہ سے ہوتی ہیں، جس سے کالم چینل کی تشکیل کے بعض علاقوں میں موبائل فیز کو موبائل فیز سے زیادہ تیزی سے بہنے دیتا ہے۔ تاہم، میرے تجربے میں، یہ عام طور پر طویل المدتی حل کے بجائے مختصر مدت کا ہوتا ہے۔ جدید کالموں کے ساتھ یہ اکثر مہلک ہوتا ہے اگر کالم کے اندر ذرات دوبارہ اکٹھے ہوجائیں۔ اس مقام پر، کالم کو تبدیل کرنا اور جاری رکھنا بہتر ہے۔
شکل 1g میں چوٹی، میری اپنی لیب میں بھی ایک حالیہ مثال سے، عام طور پر اشارہ کرتا ہے کہ سگنل اتنا زیادہ ہے کہ یہ رسپانس رینج کے اونچے سرے پر پہنچ گیا ہے۔ آپٹیکل جاذب ڈٹیکٹر کے لیے (اس معاملے میں UV-vis)، جب analyte کا ارتکاز بہت زیادہ ہوتا ہے، analyte جذب کرتا ہے زیادہ تر روشنی کے بہاؤ کا پتہ لگانے والے کو چھوڑ کر بہت کم روشنی کا پتہ لگاتا ہے۔ حالات میں، فوٹو ڈیٹیکٹر سے برقی سگنل شور کے مختلف ذرائع سے بہت زیادہ متاثر ہوتا ہے، جیسے آوارہ روشنی اور "تاریک کرنٹ"، جس سے سگنل بہت "مبہم" ہوتا ہے اور تجزیہ کرنے والے ارتکاز سے آزاد ہوتا ہے۔ جب ایسا ہوتا ہے تو، تجزیہ کار کے انجیکشن والیوم کو کم کر کے - انجیکشن والیوم کو کم کر کے، نمونے کو کم کر کے، یا دونوں سے مسئلہ کو آسانی سے حل کیا جا سکتا ہے۔
کرومیٹوگرافی اسکول میں، ہم نمونے میں تجزیہ کار ارتکاز کے اشارے کے طور پر ڈیٹیکٹر سگنل (یعنی کرومیٹوگرام میں y-axis) کا استعمال کرتے ہیں۔ لہٰذا صفر سے نیچے سگنل کے ساتھ ایک کرومیٹوگرام دیکھنا عجیب لگتا ہے، جیسا کہ سادہ تشریح یہ ہے کہ یہ اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ منفی تجزیہ نگاری کا زیادہ تر تجربہ ہے، جس میں جسمانی طور پر منفی ارتکاز ممکن نہیں ہے۔ آپٹیکل جاذب ڈٹیکٹر استعمال کرتے وقت اکثر مشاہدہ کیا جاتا ہے (مثال کے طور پر، UV-vis)۔
اس صورت میں، ایک منفی چوٹی کا سیدھا مطلب یہ ہے کہ کالم سے نکلنے والے مالیکیول چوٹی سے پہلے اور بعد میں موبائل فیز سے کم روشنی جذب کرتے ہیں۔ یہ ہو سکتا ہے، مثال کے طور پر، جب نسبتاً کم ڈٹیکشن ویو لینتھ (<230 nm) اور موبائل فیز ایڈیٹیو استعمال کرتے ہیں جو ان طول موج پر زیادہ تر روشنی جذب کرتے ہیں۔ اجزاء جیسے کہ ایسیٹیٹ یا فارمیٹ۔ کوئی بھی انشانکن وکر کو تیار کرنے اور درست مقداری معلومات حاصل کرنے کے لیے درحقیقت منفی چوٹیوں کا استعمال کر سکتا ہے، اس لیے ان سے بچنے کی کوئی بنیادی وجہ نہیں ہے (اس طریقہ کو بعض اوقات "بالواسطہ UV ڈیٹیکشن" کہا جاتا ہے) (13) تاہم، اگر ہم واقعی میں منفی چوٹیوں کا پتہ لگانا چاہتے ہیں، تو منفی چوٹیوں کا پتہ لگانے کے لیے سب سے بہتر حل استعمال کرنا ہے۔ مختلف ڈٹیکشن طول موج تاکہ تجزیہ کار موبائل فیز سے زیادہ جذب کرے، یا موبائل فیز کی ساخت کو تبدیل کریں تاکہ وہ تجزیہ کاروں سے کم روشنی جذب کریں۔
منفی چوٹیاں ریفریکٹیو انڈیکس (RI) کا پتہ لگانے کا استعمال کرتے وقت بھی ظاہر ہو سکتی ہیں جب نمونے میں تجزیہ کار کے علاوہ دیگر اجزاء کا ریفریکٹیو انڈیکس، جیسے سالوینٹ میٹرکس، موبائل فیز کے ریفریکٹیو انڈیکس سے مختلف ہوتا ہے۔ یہ UV-vis ڈیٹیکشن کے ساتھ بھی ہوتا ہے، لیکن یہ اثر کم ہوتا ہے۔ سیمپل میٹرکس کی کمپوزیشن کو موبائل فیز سے ملانا۔
LC ٹربل شوٹنگ کے بنیادی موضوع پر حصہ تین میں، میں نے ان حالات پر تبادلہ خیال کیا جن میں مشاہدہ شدہ چوٹی کی شکل متوقع یا عام چوٹی کی شکل سے مختلف ہوتی ہے۔ اس طرح کے مسائل کا مؤثر حل متوقع چوٹی کی شکلوں کے علم سے شروع ہوتا ہے (نظریہ یا موجودہ طریقوں کے ساتھ پہلے کے تجربے کی بنیاد پر)، لہذا ان توقعات سے انحراف واضح ہے۔ وغیرہ)۔اس قسط میں، میں کچھ وجوہات پر تفصیل سے بات کرتا ہوں جو میں اکثر دیکھتا ہوں۔ ان تفصیلات کو جاننا ٹربل شوٹنگ شروع کرنے کے لیے ایک اچھی جگہ فراہم کرتا ہے، لیکن تمام امکانات کو حاصل نہیں کرتا۔ اسباب اور حل کی مزید گہرائی سے فہرست میں دلچسپی رکھنے والے قارئین LCGC "LC ٹربل شوٹنگ گائیڈ" وال چارٹ کا حوالہ دے سکتے ہیں۔
(4) LCGC "LC ٹربل شوٹنگ گائیڈ" وال چارٹ۔https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)۔
(6) اے فیلنگر، کرومیٹوگرافی میں ڈیٹا تجزیہ اور سگنل پروسیسنگ (ایلسیویئر، نیویارک، نیو یارک، 1998)، پی پی 43-96۔
(8) وہاب ایم ایف، داس گپتا پی کے، کڈجو اے ایف اور آرمسٹرانگ ڈی ڈبلیو، اینال.چم.جرنل.ریو. 907، 31–44 (2016)۔https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043۔