Sesetengah topik penyelesaian masalah LC tidak pernah ketinggalan zaman, kerana terdapat isu dalam amalan LC, walaupun teknologi instrumen bertambah baik dari semasa ke semasa. Terdapat banyak cara masalah boleh timbul dalam sistem LC dan berakhir dalam bentuk puncak yang buruk. Apabila isu yang berkaitan dengan bentuk puncak timbul, senarai pendek kemungkinan punca untuk keputusan ini membantu memudahkan pengalaman penyelesaian masalah kami.
Seronok menulis ruangan "Penyelesaian Masalah LC" ini dan memikirkan topik setiap bulan, kerana sesetengah topik tidak pernah ketinggalan zaman. Semasa dalam bidang penyelidikan kromatografi, topik atau idea tertentu menjadi usang kerana ia digantikan oleh idea yang lebih baharu dan lebih baik, dalam bidang penyelesaian masalah, sejak artikel penyelesaian masalah pertama muncul dalam jurnal ini (Jurnal LC pada masa itu) memandangkan sesetengah topik masih relevan) pada tahun 1983(1). Sejak beberapa tahun kebelakangan ini, saya telah memfokuskan beberapa bahagian Penyelesaian Masalah LC pada trend kontemporari yang mempengaruhi kromatografi cecair (LC) (contohnya, perbandingan relatif pemahaman kita tentang kesan tekanan pada pengekalan [2] Kemajuan Baharu) Tafsiran kami tentang keputusan LC dan cara menyelesaikan masalah dengan instrumen LC moden. Dalam ansuran bulan ini, saya meneruskan siri saya (3), yang bermula pada Disember 2021, yang memfokuskan pada beberapa topik "hidup dan mati" penyelesaian masalah LC — elemen yang bagus untuk mana-mana penyelesai masalah adalah penting, tidak kira usia sistem yang kita gunakan. Topik teras siri ini sangat relevan dengan LCGC yang terkenal Carta dinding “Panduan Penyelesaian Masalah LC” (4) tergantung di banyak makmal. Untuk bahagian ketiga siri ini, saya memilih untuk memberi tumpuan kepada isu-isu yang berkaitan dengan bentuk puncak atau ciri-ciri puncak. Hebatnya, carta dinding menyenaraikan 44 punca potensi bentuk puncak yang buruk! Kita tidak boleh mempertimbangkan semua isu ini secara terperinci dalam satu artikel, jadi dalam ansuran pertama mengenai topik ini, saya akan memberi tumpuan kepada beberapa isu yang paling kerap saya lihat. Saya berharap pengguna LC muda dan tua akan menemui beberapa petua dan peringatan yang berguna mengenai topik penting ini.
Saya mendapati diri saya semakin kerap menjawab soalan penyelesaian masalah dengan "apa sahaja boleh dilakukan". Respons ini mungkin kelihatan mudah apabila mempertimbangkan pemerhatian yang sukar ditafsirkan, tetapi saya mendapati ia sering sesuai. Dengan banyak kemungkinan punca bentuk puncak yang buruk, adalah penting untuk berfikiran terbuka apabila mempertimbangkan masalah yang mungkin timbul, dan untuk dapat mengutamakan punca yang berpotensi untuk memulakan usaha penyelesaian masalah kita, dengan memberi tumpuan kepada kemungkinan yang paling biasa, perkara ini sangat penting.
Langkah utama dalam sebarang latihan penyelesaian masalah — tetapi yang saya fikir dipandang rendah — adalah mengenali bahawa terdapat masalah yang perlu diselesaikan. Menyedari bahawa terdapat masalah selalunya bermaksud mengenali bahawa apa yang berlaku pada alat itu berbeza daripada jangkaan kita, yang dibentuk oleh teori, pengetahuan empirikal dan pengalaman (5). "Bentuk puncak" yang dirujuk di sini sebenarnya bukan sahaja merujuk kepada bentuk puncak (simetri, asimetri, licin, gebu, pinggir hadapan, tailing, dll.), tetapi juga kepada lebarnya. Jangkaan kita untuk bentuk puncak sebenar adalah mudah. ​​Teori (6) menyokong jangkaan buku teks bahawa, dalam kebanyakan kes, puncak kromatografi harus simetri dan mematuhi bentuk taburan Gaussian, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a. Apa yang kita jangkakan daripada lebar puncak adalah isu yang lebih kompleks, dan kita akan membincangkan topik ini dalam artikel akan datang. Bentuk puncak lain dalam Rajah 1 menunjukkan beberapa kemungkinan lain yang boleh diperhatikan—dalam erti kata lain, beberapa cara perkara boleh menjadi salah. Dalam baki ansuran ini, kita akan meluangkan masa membincangkan beberapa contoh khusus situasi yang boleh membawa kepada jenis-jenis bentuk ini.
Kadangkala puncak tidak diperhatikan langsung dalam kromatogram di mana ia dijangka akan dielusi. Carta dinding di atas menunjukkan bahawa ketiadaan puncak (dengan mengandaikan sampel sebenarnya mengandungi analit sasaran pada kepekatan yang sepatutnya menjadikan tindak balas pengesan mencukupi untuk melihatnya di atas hingar) biasanya berkaitan dengan beberapa isu instrumen atau keadaan fasa mudah alih yang salah (jika diperhatikan sama sekali). puncak, biasanya terlalu "lemah"). Senarai pendek masalah dan penyelesaian yang berpotensi dalam kategori ini boleh didapati dalam Jadual I.
Seperti yang dinyatakan di atas, persoalan tentang berapa banyak pelebaran puncak yang perlu diterima sebelum memberi perhatian dan cuba memperbaikinya adalah topik yang rumit yang akan saya bincangkan dalam artikel akan datang. Pengalaman saya ialah pelebaran puncak yang ketara sering disertai dengan perubahan ketara dalam bentuk puncak, dan tailing puncak lebih biasa daripada pra-puncak atau pemisahan. Walau bagaimanapun, puncak simetri nominal juga melebar, yang boleh disebabkan oleh beberapa sebab yang berbeza:
Setiap isu ini telah dibincangkan secara terperinci dalam isu-isu Penyelesaian Masalah LC sebelum ini, dan pembaca yang berminat dengan topik ini boleh merujuk artikel-artikel sebelumnya untuk mendapatkan maklumat tentang punca utama dan penyelesaian yang berpotensi untuk isu-isu ini. Maklumat lanjut.
Pendaratan puncak, pemukaan puncak dan pemisahan semuanya boleh disebabkan oleh fenomena kimia atau fizikal, dan senarai penyelesaian yang berpotensi untuk masalah ini sangat berbeza-beza, bergantung pada sama ada kita berhadapan dengan masalah kimia atau fizikal. Selalunya, dengan membandingkan puncak yang berbeza dalam kromatogram, anda boleh menemui petunjuk penting tentang yang mana merupakan puncanya. Jika semua puncak dalam kromatogram mempamerkan bentuk yang serupa, kemungkinan besar puncanya bukan fizikal. Jika hanya satu atau beberapa puncak yang terjejas, tetapi selebihnya kelihatan baik, kemungkinan besar puncanya adalah kimia.
Punca kimia tailing puncak terlalu rumit untuk dibincangkan secara ringkas di sini. Pembaca yang berminat dirujuk kepada isu "LC Troubleshooting" baru-baru ini untuk perbincangan yang lebih mendalam (10). Walau bagaimanapun, perkara mudah untuk dicuba ialah mengurangkan jisim analit yang disuntik dan melihat sama ada bentuk puncak bertambah baik. Jika ya, maka ini adalah petunjuk yang baik bahawa masalahnya ialah "beban jisim". Dalam kes ini, kaedah mesti dihadkan kepada menyuntik jisim analit kecil, atau keadaan kromatografi mesti diubah supaya bentuk puncak yang baik dapat diperoleh walaupun dengan jisim yang lebih besar disuntik.
Terdapat juga banyak sebab fizikal yang berpotensi untuk tailing puncak. Pembaca yang berminat untuk perbincangan terperinci tentang kemungkinan tersebut dirujuk kepada satu lagi isu terbaru "Penyelesaian Masalah LC" (11). Salah satu punca fizikal tailing puncak yang lebih biasa ialah sambungan yang lemah pada titik antara penyuntik dan pengesan (12). Contoh ekstrem ditunjukkan dalam Rajah 1d, yang diperoleh di makmal saya beberapa minggu yang lalu. Dalam kes ini, kami membina sistem dengan injap suntikan baharu yang belum pernah kami gunakan sebelum ini, dan memasang gelung suntikan isipadu kecil dengan ferrule yang telah dibentuk pada kapilari keluli tahan karat. Selepas beberapa eksperimen penyelesaian masalah awal, kami menyedari bahawa kedalaman port dalam stator injap suntikan jauh lebih dalam daripada yang biasa kami lakukan, mengakibatkan isipadu mati yang besar di bahagian bawah port. Masalah ini mudah diselesaikan dengan menggantikan gelung suntikan dengan tiub lain, kita boleh melaraskan ferrule ke kedudukan yang betul untuk menghapuskan isipadu mati di bahagian bawah port.
Hadapan puncak seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1e juga boleh disebabkan oleh masalah fizikal atau kimia. Punca fizikal biasa bagi pinggir hadapan ialah lapisan zarah lajur tidak tersusun dengan baik, atau zarah telah disusun semula dari semasa ke semasa. Seperti tailing puncak yang disebabkan oleh fenomena fizikal ini, cara terbaik untuk membetulkannya adalah dengan menggantikan lajur dan teruskan. Pada asasnya, bentuk puncak pinggir hadapan yang berasal dari kimia sering timbul daripada apa yang kita panggil keadaan pengekalan "tak linear". Di bawah keadaan ideal (linear), jumlah analit yang dikekalkan oleh fasa pegun (oleh itu, faktor pengekalan) berkaitan secara linear dengan kepekatan analit dalam lajur. Secara kromatografi, ini bermakna apabila jisim analit yang disuntik ke dalam lajur meningkat, puncak menjadi lebih tinggi, tetapi tidak lebih lebar. Hubungan ini terputus apabila tingkah laku pengekalan tidak linear, dan puncak bukan sahaja menjadi lebih tinggi tetapi juga lebih lebar apabila lebih banyak jisim disuntik. Di samping itu, bentuk tak linear menentukan bentuk puncak kromatografi, mengakibatkan pinggir hadapan atau belakang. Seperti beban jisim yang menyebabkan tailing puncak (10), Puncak utama yang disebabkan oleh pengekalan tak linear juga boleh didiagnosis dengan mengurangkan jisim analit yang disuntik. Jika bentuk puncak bertambah baik, kaedah mesti diubah suai agar tidak melebihi kualiti suntikan yang menyebabkan pinggir utama, atau keadaan kromatografi mesti diubah untuk meminimumkan kelakuan ini.
Kadangkala kita memerhatikan apa yang kelihatan seperti puncak "berpecah", seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1f. Langkah pertama dalam menyelesaikan masalah ini adalah untuk menentukan sama ada bentuk puncak adalah disebabkan oleh elusi separa (iaitu, kehadiran dua sebatian yang berbeza tetapi elusinya rapat). Jika sebenarnya terdapat dua analit berbeza yang elusinya berdekatan, maka ia adalah perlu untuk meningkatkan resolusinya (contohnya, dengan meningkatkan selektiviti, pengekalan atau kiraan plat), dan puncak "berpecah" yang ketara berkaitan dengan fizikal. Prestasi tidak ada kena mengena dengan lajur itu sendiri. Selalunya, petunjuk paling penting untuk keputusan ini ialah sama ada semua puncak dalam kromatogram mempamerkan bentuk berpecah, atau hanya satu atau dua. Jika hanya satu atau dua, ia mungkin isu elusi bersama; jika semua puncak berpecah, ia mungkin isu fizikal, kemungkinan besar berkaitan dengan lajur itu sendiri.
Puncak pecahan yang berkaitan dengan sifat fizikal lajur itu sendiri biasanya disebabkan oleh frit masuk atau keluar yang sebahagiannya tersekat, atau penyusunan semula zarah dalam lajur, yang membolehkan fasa bergerak mengalir lebih cepat daripada fasa bergerak di kawasan tertentu pembentukan saluran lajur di kawasan lain (11). Frit yang sebahagiannya tersumbat kadangkala boleh dibersihkan dengan membalikkan aliran melalui lajur; walau bagaimanapun, berdasarkan pengalaman saya, ini biasanya penyelesaian jangka pendek dan bukannya jangka panjang. Ini selalunya membawa maut dengan lajur moden jika zarah bergabung semula dalam lajur. Pada ketika ini, adalah lebih baik untuk menggantikan lajur dan meneruskan.
Puncak dalam Rajah 1g, juga daripada contoh baru-baru ini di makmal saya sendiri, biasanya menunjukkan bahawa isyarat tersebut begitu tinggi sehingga ia telah mencapai hujung julat tindak balas yang tinggi. Bagi pengesan penyerapan optik (UV-vis dalam kes ini), apabila kepekatan analit sangat tinggi, analit menyerap kebanyakan cahaya yang melalui sel aliran pengesan, meninggalkan sangat sedikit cahaya untuk dikesan. Di bawah keadaan ini, isyarat elektrik daripada fotopengesan sangat dipengaruhi oleh pelbagai sumber hingar, seperti cahaya sesat dan "arus gelap", menjadikan isyarat sangat "kabur" dalam penampilan dan tidak bergantung pada kepekatan analit. Apabila ini berlaku, masalah ini selalunya boleh diselesaikan dengan mudah dengan mengurangkan isipadu suntikan analit—mengurangkan isipadu suntikan, mencairkan sampel, atau kedua-duanya.
Dalam sekolah kromatografi, kita menggunakan isyarat pengesan (iaitu, paksi-y dalam kromatogram) sebagai penunjuk kepekatan analit dalam sampel. Jadi, agak pelik melihat kromatogram dengan isyarat di bawah sifar, kerana tafsiran mudahnya ialah ini menunjukkan kepekatan analit negatif – yang sudah tentu tidak mungkin berlaku secara fizikal. Berdasarkan pengalaman saya, puncak negatif paling kerap diperhatikan apabila menggunakan pengesan penyerapan optik (contohnya, UV-vis).
Dalam kes ini, puncak negatif bermaksud molekul yang keluar dari lajur menyerap kurang cahaya daripada fasa mudah alih itu sendiri sejurus sebelum dan selepas puncak. Ini boleh berlaku, contohnya, apabila menggunakan panjang gelombang pengesanan yang agak rendah (<230 nm) dan bahan tambahan fasa mudah alih yang menyerap kebanyakan cahaya pada panjang gelombang ini. Bahan tambahan sedemikian boleh jadi komponen pelarut fasa mudah alih seperti metanol atau komponen penimbal seperti asetat atau format. Seseorang sebenarnya boleh menggunakan puncak negatif untuk menyediakan lengkung penentukuran dan mendapatkan maklumat kuantitatif yang tepat, jadi tidak ada sebab asas untuk mengelakkannya (kaedah ini kadangkala dirujuk sebagai "pengesanan UV tidak langsung") (13). Walau bagaimanapun, jika kita benar-benar ingin mengelakkan puncak negatif sama sekali, dalam kes pengesanan penyerapan, penyelesaian terbaik adalah menggunakan panjang gelombang pengesanan yang berbeza supaya analit menyerap lebih banyak daripada fasa mudah alih, atau mengubah komposisi fasa mudah alih supaya Mereka menyerap kurang cahaya daripada analit.
Puncak negatif juga boleh muncul apabila menggunakan pengesanan indeks biasan (RI) apabila indeks biasan komponen selain analit dalam sampel, seperti matriks pelarut, adalah berbeza daripada indeks biasan fasa mudah alih. Ini juga berlaku dengan pengesanan UV-vis, tetapi kesan ini cenderung dilemahkan berbanding pengesanan RI. Dalam kedua-dua kes, puncak negatif boleh diminimumkan dengan memadankan komposisi matriks sampel dengan fasa mudah alih dengan lebih dekat.
Dalam bahagian ketiga mengenai topik asas penyelesaian masalah LC, saya membincangkan situasi di mana bentuk puncak yang diperhatikan berbeza daripada bentuk puncak yang dijangkakan atau normal. Penyelesaian masalah yang berkesan untuk masalah tersebut bermula dengan pengetahuan tentang bentuk puncak yang dijangkakan (berdasarkan teori atau pengalaman terdahulu dengan kaedah sedia ada), jadi sisihan daripada jangkaan ini adalah jelas. Masalah bentuk puncak mempunyai banyak punca yang berpotensi berbeza (terlalu lebar, ketinggalan, kelebihan utama, dll.). Dalam ansuran ini, saya membincangkan secara terperinci beberapa sebab yang paling kerap saya lihat. Mengetahui butiran ini menyediakan tempat yang baik untuk memulakan penyelesaian masalah, tetapi tidak merangkumi semua kemungkinan. Pembaca yang berminat dengan senarai punca dan penyelesaian yang lebih mendalam boleh merujuk kepada carta dinding "Panduan Penyelesaian Masalah LC" LCGC.
(4) Carta dinding “Panduan Penyelesaian Masalah LC” LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data dan Pemprosesan Isyarat dalam Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), ms. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF dan Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.