Einige Themen zur Fehlersuche in der Flüssigkeitschromatographie (LC) sind zeitlos, da es auch bei fortschreitender Geräteentwicklung immer wieder Probleme in der LC-Praxis gibt. Es gibt viele Ursachen für Fehler in einem LC-System, die zu einer schlechten Peakform führen können. Treten Probleme mit der Peakform auf, vereinfacht eine kurze Liste möglicher Ursachen die Fehlersuche erheblich.
Es hat mir viel Spaß gemacht, diese Kolumne „LC-Fehlerbehebung“ zu schreiben und jeden Monat über neue Themen nachzudenken, denn manche Themen sind zeitlos. Während in der Chromatographieforschung bestimmte Themen oder Ideen veralten, weil sie von neueren und besseren abgelöst werden, ist dies im Bereich der Fehlerbehebung anders. Seit dem ersten Artikel zu diesem Thema in dieser Zeitschrift (damals das LC Journal) im Jahr 1983 (1) sind einige Themen immer noch relevant. In den letzten Jahren habe ich mich in mehreren Abschnitten der LC-Fehlerbehebung auf aktuelle Trends in der Flüssigkeitschromatographie (LC) konzentriert (zum Beispiel auf den Vergleich unseres Verständnisses des Einflusses von Druck auf die Retention [2] Neue Fortschritte), auf unsere Interpretation von LC-Ergebnissen und auf die Fehlersuche mit modernen LC-Geräten. In diesem Monat setze ich meine Reihe (3) fort, die im Dezember 2021 begann und sich mit einigen der wichtigsten Aspekte der LC-Fehlerbehebung befasste – Elemente, die für jeden Fehlersucher hilfreich und unerlässlich sind, unabhängig vom Alter des verwendeten Systems. Das Kernthema ist… Diese Artikelreihe ist eng mit dem bekannten Wanddiagramm „LC Troubleshooting Guide“ (4) der LCGC verknüpft, das in vielen Laboren hängt. Im dritten Teil dieser Reihe konzentriere ich mich auf Probleme im Zusammenhang mit der Peakform bzw. den Peakcharakteristika. Unglaublich, aber das Wanddiagramm listet 44 verschiedene mögliche Ursachen für eine schlechte Peakform auf! Da wir all diese Probleme nicht in einem einzigen Artikel detailliert behandeln können, werde ich mich in diesem ersten Teil auf einige der häufigsten konzentrieren. Ich hoffe, dass sowohl junge als auch erfahrene LC-Anwender hilfreiche Tipps und Hinweise zu diesem wichtigen Thema finden.
Immer häufiger antworte ich auf Fragen zur Fehlersuche mit „Alles ist möglich“. Diese Antwort mag angesichts schwer zu interpretierender Beobachtungen einfach erscheinen, doch ich halte sie oft für angebracht. Da es viele mögliche Ursachen für eine schlechte Peakform gibt, ist es wichtig, bei der Fehlersuche unvoreingenommen vorzugehen und potenzielle Ursachen zu priorisieren. Wir sollten uns dabei auf die häufigsten Möglichkeiten konzentrieren – dieser Punkt ist sehr wichtig.
Ein entscheidender Schritt bei jeder Fehlersuche – der meiner Meinung nach jedoch unterschätzt wird – ist die Erkenntnis, dass ein Problem vorliegt, das gelöst werden muss. Dies bedeutet oft, dass das Verhalten des Messgeräts von unseren Erwartungen abweicht, die durch Theorie, empirisches Wissen und Erfahrung geprägt sind (5). Die hier erwähnte „Peakform“ bezieht sich nicht nur auf die Form des Peaks (symmetrisch, asymmetrisch, glatt, uneben, Vorderflanke, Ausläufer usw.), sondern auch auf seine Breite. Unsere Erwartungen an die tatsächliche Peakform sind einfach. Die Theorie (6) bestätigt die Lehrbucherwartung, dass chromatographische Peaks in den meisten Fällen symmetrisch sein und der Form einer Gaußverteilung entsprechen sollten, wie in Abbildung 1a dargestellt. Die Erwartungen an die Peakbreite sind komplexer und werden in einem späteren Artikel behandelt. Die anderen Peakformen in Abbildung 1 zeigen einige der möglichen Ergebnisse – also einige der möglichen Fehlerquellen. Im Folgenden werden wir die Peakformen genauer betrachten. In diesem Teil werden wir uns mit einigen konkreten Beispielen von Situationen befassen, die zu diesen Formtypen führen können.
Manchmal sind im Chromatogramm, in dem die erwarteten Peaks eluiert werden sollten, gar nicht zu beobachten. Das obige Wanddiagramm zeigt, dass das Fehlen eines Peaks (vorausgesetzt, die Probe enthält den Zielanalyten in einer Konzentration, die eine ausreichende Detektorantwort zur Erkennung über dem Rauschen ermöglichen sollte) üblicherweise auf ein Geräteproblem oder falsche Bedingungen der mobilen Phase zurückzuführen ist (sofern überhaupt Peaks beobachtet werden). Eine kurze Liste potenzieller Probleme und Lösungen in dieser Kategorie findet sich in Tabelle I.
Wie bereits erwähnt, ist die Frage, wie viel Peakverbreiterung toleriert werden sollte, bevor man ihr Aufmerksamkeit schenkt und versucht, sie zu beheben, ein komplexes Thema, das ich in einem zukünftigen Artikel behandeln werde. Meine Erfahrung zeigt, dass eine signifikante Peakverbreiterung oft mit einer signifikanten Veränderung der Peakform einhergeht und dass Peak-Tailing häufiger auftritt als Vorpeak-Verbreiterung oder Peak-Aufspaltung. Allerdings können auch nominell symmetrische Peaks verbreitert sein, was verschiedene Ursachen haben kann:
Jedes dieser Probleme wurde bereits in früheren Ausgaben von „Troubleshooting LC“ ausführlich behandelt. Interessierte Leser finden in diesen Artikeln Informationen zu den Ursachen und möglichen Lösungen. Weitere Details.
Peakverbreiterung, Peakanhebung und Peakaufspaltung können durch chemische oder physikalische Phänomene verursacht werden. Die möglichen Lösungsansätze variieren stark, je nachdem, ob es sich um ein chemisches oder physikalisches Problem handelt. Oftmals lassen sich durch den Vergleich der verschiedenen Peaks in einem Chromatogramm wichtige Hinweise auf die Ursache finden. Weisen alle Peaks in einem Chromatogramm ähnliche Formen auf, ist die Ursache höchstwahrscheinlich nicht physikalischer Natur. Sind nur ein oder wenige Peaks betroffen, während die übrigen unauffällig erscheinen, ist die Ursache höchstwahrscheinlich chemischer Natur.
Die chemischen Ursachen für Peak-Tailing sind zu komplex, um sie hier kurz zu behandeln. Interessierte Leser finden eine ausführlichere Erläuterung in der aktuellen Ausgabe von „LC Troubleshooting“ (10). Ein einfacher Lösungsansatz besteht darin, die Masse des injizierten Analyten zu reduzieren und zu prüfen, ob sich die Peakform verbessert. Falls ja, deutet dies auf eine „Massenüberladung“ hin. In diesem Fall muss die Methode auf die Injektion kleiner Analytmassen beschränkt oder die chromatographischen Bedingungen so angepasst werden, dass auch bei größeren injizierten Massen gute Peakformen erzielt werden können.
Es gibt zahlreiche mögliche physikalische Ursachen für Peak-Tailing. Leser, die an einer detaillierten Diskussion der Möglichkeiten interessiert sind, seien auf eine kürzlich erschienene Ausgabe von „LC Troubleshooting“ (11) verwiesen. Eine der häufigsten physikalischen Ursachen für Peak-Tailing ist eine mangelhafte Verbindung zwischen Injektor und Detektor (12). Ein extremes Beispiel, das vor einigen Wochen in meinem Labor aufgenommen wurde, ist in Abbildung 1d dargestellt. In diesem Fall bauten wir ein System mit einem neuen Injektionsventil, das wir zuvor noch nicht verwendet hatten, und installierten eine Injektionsschleife mit kleinem Volumen und einer auf eine Edelstahlkapillare aufgegossenen Ferrule. Nach ersten Fehlersuchversuchen stellten wir fest, dass die Anschlusstiefe im Stator des Injektionsventils deutlich größer war als gewohnt, was zu einem großen Totvolumen am unteren Ende des Anschlusses führte. Dieses Problem lässt sich leicht beheben, indem man die Injektionsschleife durch ein anderes Rohr ersetzt und die Ferrule in die richtige Position bringt, um das Totvolumen am unteren Ende des Anschlusses zu eliminieren.
Peakfronten wie in Abbildung 1e dargestellt können auch durch physikalische oder chemische Probleme verursacht werden. Eine häufige physikalische Ursache für die Vorderflanke ist eine unzureichende Packung des Partikelbetts der Säule oder eine mit der Zeit erfolgte Reorganisation der Partikel. Wie bei der durch dieses physikalische Phänomen verursachten Peakverbreiterung ist die beste Lösung der Austausch der Säule. Grundsätzlich entstehen Vorderflanken-Peakformen chemischen Ursprungs oft durch sogenannte „nichtlineare“ Retentionsbedingungen. Unter idealen (linearen) Bedingungen ist die Menge des von der stationären Phase zurückgehaltenen Analyten (und damit der Retentionsfaktor) linear mit der Konzentration des Analyten in der Säule verknüpft. Chromatografisch bedeutet dies, dass mit zunehmender injizierter Analytmasse der Peak höher, aber nicht breiter wird. Diese Beziehung ist bei nichtlinearem Retentionsverhalten gestört, und die Peaks werden mit zunehmender injizierter Masse nicht nur höher, sondern auch breiter. Darüber hinaus bestimmen nichtlineare Prozesse die Form chromatographischer Peaks und führen zu Vorder- oder Hinterflanken. Ähnlich wie bei einer Massenüberladung, die zu Peakverbreiterung führt. (10) Eine durch nichtlineare Retention verursachte Peakvorverlagerung kann auch durch Reduzierung der injizierten Analytmasse diagnostiziert werden. Verbessert sich die Peakform, muss die Methode so modifiziert werden, dass die Injektionsqualität, die die Vorverlagerung verursacht, nicht überschritten wird, oder die chromatographischen Bedingungen müssen geändert werden, um dieses Verhalten zu minimieren.
Manchmal beobachten wir scheinbar aufgespaltene Peaks, wie in Abbildung 1f dargestellt. Der erste Schritt zur Lösung dieses Problems besteht darin, festzustellen, ob die Peakform auf eine partielle Co-Elution zurückzuführen ist (d. h. auf das Vorhandensein zweier unterschiedlicher, aber eng beieinander liegender Verbindungen). Wenn tatsächlich zwei verschiedene Analyten nahe beieinander eluieren, geht es darum, deren Auflösung zu verbessern (z. B. durch Erhöhung der Selektivität, Retention oder Bodenzahl), und die scheinbar aufgespaltenen Peaks sind auf physikalische Probleme zurückzuführen. Die Leistungsfähigkeit hat nichts mit der Säule selbst zu tun. Der wichtigste Hinweis für diese Entscheidung ist oft, ob alle Peaks im Chromatogramm aufgespaltene Peaks aufweisen oder nur ein oder zwei. Sind es nur ein oder zwei, handelt es sich wahrscheinlich um ein Co-Elutionsproblem; sind alle Peaks aufgespalten, ist es wahrscheinlich ein physikalisches Problem, höchstwahrscheinlich im Zusammenhang mit der Säule selbst.
Aufgespaltene Peaks, die auf die physikalischen Eigenschaften der Säule zurückzuführen sind, entstehen üblicherweise durch teilweise verstopfte Ein- oder Auslassfritten oder durch eine Reorganisation der Partikel in der Säule. Dadurch kann die mobile Phase in bestimmten Bereichen der Säule schneller fließen als in anderen (11). Teilweise verstopfte Fritte lässt sich manchmal durch Umkehrung der Flussrichtung in der Säule reinigen; meiner Erfahrung nach ist dies jedoch meist nur eine kurzfristige Lösung. Bei modernen Säulen kann dies fatale Folgen haben, wenn sich die Partikel innerhalb der Säule rekombinieren. In diesem Fall ist es ratsam, die Säule auszutauschen und die Analyse fortzusetzen.
Der Peak in Abbildung 1g, der ebenfalls aus einem kürzlich in meinem Labor beobachteten Fall stammt, deutet in der Regel darauf hin, dass das Signal so hoch ist, dass es den oberen Bereich des Messbereichs erreicht hat. Bei optischen Absorptionsdetektoren (in diesem Fall UV-Vis) absorbiert der Analyt bei sehr hoher Konzentration den größten Teil des durch die Detektorzelle hindurchtretenden Lichts, sodass nur sehr wenig Licht detektiert werden kann. Unter diesen Bedingungen wird das elektrische Signal des Photodetektors stark von verschiedenen Rauschquellen wie Streulicht und Dunkelstrom beeinflusst, wodurch das Signal sehr unscharf und unabhängig von der Analytkonzentration erscheint. In solchen Fällen lässt sich das Problem oft einfach durch Reduzierung des Injektionsvolumens beheben – entweder durch Verringerung des Injektionsvolumens, durch Verdünnen der Probe oder durch beides.
In der Chromatographie-Ausbildung nutzen wir das Detektorsignal (d. h. die y-Achse im Chromatogramm) als Indikator für die Analytkonzentration in der Probe. Daher erscheint es ungewöhnlich, ein Chromatogramm mit einem Signal unter Null zu sehen, da die einfache Interpretation eine negative Analytkonzentration anzeigt – was physikalisch natürlich nicht möglich ist. Meiner Erfahrung nach werden negative Peaks am häufigsten bei der Verwendung optischer Absorptionsdetektoren (z. B. UV-Vis) beobachtet.
In diesem Fall bedeutet ein negativer Peak lediglich, dass die von der Säule eluierenden Moleküle unmittelbar vor und nach dem Peak weniger Licht absorbieren als die mobile Phase selbst. Dies kann beispielsweise bei Verwendung relativ niedriger Detektionswellenlängen (<230 nm) und mobiler Phasenzusätze auftreten, die den größten Teil des Lichts bei diesen Wellenlängen absorbieren. Solche Zusätze können Lösungsmittelkomponenten der mobilen Phase wie Methanol oder Pufferkomponenten wie Acetat oder Formiat sein. Negative Peaks können sogar zur Erstellung einer Kalibrierkurve und zur Gewinnung genauer quantitativer Informationen genutzt werden, sodass es grundsätzlich keinen Grund gibt, sie zu vermeiden (diese Methode wird manchmal als „indirekte UV-Detektion“ bezeichnet) (13). Wenn negative Peaks jedoch bei der Absorptionsdetektion vollständig vermieden werden sollen, ist die beste Lösung, eine andere Detektionswellenlänge zu verwenden, sodass der Analyt mehr Licht absorbiert als die mobile Phase, oder die Zusammensetzung der mobilen Phase so zu ändern, dass sie weniger Licht absorbiert als die Analyten.
Negative Peaks können auch bei der Brechungsindexdetektion (RI-Detektion) auftreten, wenn der Brechungsindex von Komponenten in der Probe, die nicht der Analyt sind (z. B. die Lösungsmittelmatrix), vom Brechungsindex der mobilen Phase abweicht. Dies tritt auch bei der UV/Vis-Detektion auf, ist dort aber im Vergleich zur RI-Detektion tendenziell abgeschwächt. In beiden Fällen lassen sich negative Peaks minimieren, indem die Zusammensetzung der Probenmatrix besser an die der mobilen Phase angepasst wird.
Im dritten Teil zum Thema LC-Fehlerbehebung habe ich Situationen besprochen, in denen die beobachtete Peakform von der erwarteten oder normalen Peakform abweicht. Eine effektive Fehlersuche setzt die Kenntnis der erwarteten Peakformen voraus (basierend auf Theorie oder Erfahrung mit bestehenden Methoden), sodass Abweichungen von diesen Erwartungen sofort erkennbar sind. Probleme mit der Peakform können viele verschiedene Ursachen haben (zu breit, Ausläufer, Anstiegsflanke usw.). In diesem Teil gehe ich detailliert auf einige der häufigsten Ursachen ein. Diese Kenntnisse bieten einen guten Ausgangspunkt für die Fehlersuche, decken aber nicht alle Möglichkeiten ab. Leser, die an einer ausführlicheren Liste von Ursachen und Lösungen interessiert sind, können die Wandtafel „LC Troubleshooting Guide“ des LCGC konsultieren.
(4) LCGC „LC Troubleshooting Guide“ Wanddiagramm. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datenanalyse und Signalverarbeitung in der Chromatographie (Elsevier, New York, NY, 1998), S. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF und Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.