Käbir LC näsazlyklaryny çözmek temalary hiç haçan könelmeýär, sebäbi enjam tehnologiýasy wagtyň geçmegi bilen kämilleşse-de, LC tejribesinde meseleler bar. LC ulgamynda meseleleriň ýüze çykmagynyň we pes pik görnüşinde bolmagynyň köp usullary bar. Pek görnüşi bilen baglanyşykly meseleler ýüze çykanda, bu netijeleriň mümkin bolan sebäpleriniň gysga sanawy biziň näsazlyklary çözmek tejribämizi ýeňilleşdirmäge kömek edýär.
Bu “LC Näsazlyklary Düzetmek” sütunyny ýazmak we her aý temalar barada pikirlenmek gyzykly boldy, sebäbi käbir temalar hiç haçan modadan çykmaýar. Hromatografiýa ylmy-barlag ulgamynda käbir temalar ýa-da pikirler könelişýär, sebäbi olar täze we has gowy pikirler bilen çalşyrylýar, sebäbi näsazlyklary düzetmek ulgamynda, ilkinji näsazlyklary düzetmek makalasy şu žurnalda (şol wagtky LC Žurnaly) 1983-nji ýylda peýda bolandan bäri (1). Soňky birnäçe ýylyň dowamynda men LC Näsazlyklary Düzetmek bölümleriniň birnäçesini suwuk hromatografiýasyna (LC) täsir edýän häzirki zaman tendensiýalaryna gönükdirdim (meselem, basyşyň saklanyşa täsirini düşünişimiziň deňeşdirilmegi [2] Täze Öňe gidişlikler) LC netijeleriniň düşündirilişi we häzirki zaman LC gurallary bilen näsazlyklary nädip düzetmeli. Bu aýky bölümde men 2021-nji ýylyň dekabrynda başlanan seriýamy (3) dowam etdirýärin, ol LC näsazlyklary düzetmegiň käbir “ýaşaýyş we ölüm” temalaryna gönükdirilendir - ulanýan ulgamymyzdan garamazdan, islendik näsazlyklary çözüji üçin ajaýyp elementler möhümdir. Bu seriýanyň esasy temasy örän möhümdir LCGC-niň meşhur “LC Näsazlyklary Düzetmek boýunça Gollanma” diwar diagrammasy (4) köp laboratoriýalarda asylýar. Bu seriýanyň üçünji bölegi üçin men depeleriň görnüşi ýa-da depeleriň häsiýetnamalary bilen baglanyşykly meselelere üns bermegi saýladym. Geň galdyryjy zat, diwar diagrammasynda depeleriň ýaramaz görnüşiniň 44 dürli mümkin bolan sebäbi sanalýar! Bu meseleleriň hemmesini bir makalada jikme-jik gözden geçirip bilmeris, şonuň üçin bu tema boýunça ilkinji bölümde men iň köp görýän käbirlerine ünsi jemlärin. Ýaş we garry LC ulanyjylarynyň bu möhüm tema boýunça käbir peýdaly maslahatlary we ýatlatmalary tapjakdygyna umyt edýärin.
Men özümde näsazlyklary çözmek baradaky soraglara barha köp "ähli zat mümkin" diýip jogap berýänimi duýýaryn. Bu jogap düşündirilmegi kyn bolan gözegçilikleri göz öňünde tutanyňda aňsat ýaly bolup görünmegi mümkin, ýöne men ony köplenç dogry hasaplaýaryn. Pikiň ýaramaz görnüşiniň köp mümkin sebäpleri bilen, meseläniň nämeden ybarat bolup biljekdigini göz öňünde tutanyňda açyk pikirli bolmak we näsazlyklary çözmek üçin tagallalarymyzy başlamak üçin mümkin bolan sebäplere ileri tutulýan ugurlary kesgitläp bilmek möhümdir, iň köp duş gelýän mümkinçiliklere ünsi jemläp, bu nokat örän möhümdir.
Islendik näsazlyklary çözmekde esasy ädim - ýöne meniň pikirimçe, kem baha berlen ädim - çözülmeli meseläniň bardygyny boýun almakdyr. Meseläni boýun almak, köplenç guralyň başdan geçirýän zatlarynyň teoriýa, empirik bilim we tejribe bilen şekillendirilen garaşmalarymyzdan tapawutlydygyny boýun almak diýmekdir (5). Bu ýerde agzalýan "çok şekili" aslynda diňe bir çok şekiline (simmetrik, assimetrik, ýumşak, tüýli, öň tarapy, guýruk we ş.m.) däl, eýsem ini hem aňladýar. Çok şekili üçin garaşmalarymyz ýönekeý. Teoriýa (6) köp halatlarda hromatografik çoklaryň simmetrik bolmalydygy we 1a suratda görkezilişi ýaly Gauss paýlanyşynyň görnüşine laýyk geljekdigi baradaky okuw kitapçasyndaky garaşmany gowy goldaýar. Çok giňliklerinden garaşýan zatlarymyz has çylşyrymly mesele we bu temany geljekki makalada ara alyp maslahatlaşarys. 1-nji suratdaky beýleki çok şekilleri synlanyp bilinjek käbir beýleki mümkinçilikleri görkezýär - başgaça aýdylanda, zatlaryň nädogry bolup biljek käbir ýollaryny. Bu bölümiň galan böleginde, biz mümkin bolan ýagdaýlaryň käbir anyk mysallaryny ara alyp maslahatlaşmaga wagt sarp ederis. şu görnüş görnüşlerine getirýär.
Käwagt hromatogrammada pikler asla syn edilmeýär, şol ýerde olaryň elýutasiýa edilmegine garaşylýar. Ýokardaky diwar diagrammasy pikiň ýoklugynyň (nusgada detektoryň jogabyny şowhundan ýokarda görmek üçin ýeterlik bolmaly konsentrasiýada nyşana analit bar bolsa) adatça käbir gurallar meselesi ýa-da nädogry hereketli faza şertleri bilen baglanyşyklydygyny görkezýär (eger syn edilse). pikler, adatça gaty "gowşak"). Bu kategoriýadaky mümkin bolan meseleleriň we çözgütleriň gysga sanawyny I tablisadan tapyp bolýar.
Ýokarda agzalyp geçilişi ýaly, üns bermezden we ony düzetmäge synanyşmazdan öň, depeleriň näçe derejede giňelmegine çydamly bolmalydygy baradaky mesele, geljekki makalada ara alyp maslahatlaşjak çylşyrymly temadyr. Meniň tejribäm, depeleriň uly giňelmegi köplenç depeleriň görnüşiniň uly üýtgemegi bilen birlikde bolýar we depeleriň guýrugy depelerden öňki ýa-da bölünenden has köp duş gelýär. Şeýle-de bolsa, nominal simmetrik depeler hem giňelýär, bu bolsa birnäçe dürli sebäplere bagly bolup biler:
Bu meseleleriň her biri "Troubleshooting LC" žurnalynyň öňki sanlarynda jikme-jik ara alnyp maslahatlaşyldy we bu temalar bilen gyzyklanýan okyjylar bu meseleleriň esasy sebäpleri we mümkin bolan çözgütleri barada maglumat almak üçin şu öňki makalalara seredip bilerler. Has giňişleýin maglumat.
Pik guýrugy, pikiň öň tarapy we bölünme himiki ýa-da fiziki hadysalar sebäpli ýüze çykyp biler we bu meseleleriň mümkin bolan çözgütleriniň sanawy himiki ýa-da fiziki mesele bilen meşgullanýandygymyza baglylykda dürli-dürli bolýar. Köplenç, hromatogrammadaky dürli pikleri deňeşdirmek arkaly, günäkäriň kimdigi barada möhüm alamatlary tapyp bilersiňiz. Eger hromatogrammadaky ähli pikler meňzeş görnüşlere eýe bolsa, sebäbi fiziki däl bolmagy mümkin. Eger diňe bir ýa-da birnäçe pik täsirlenen bolsa, ýöne galanlary gowy görünýän bolsa, sebäbi himiki bolmagy mümkin.
Pik guýrugynyň himiki sebäpleri bu ýerde gysgaça ara alyp maslahatlaşmak üçin örän çylşyrymly. Gyzyklanýan okyjy has çuňňur ara alyp maslahatlaşmak üçin ýakynda çykan "LC Troubleshooting" sanyna (10) ýüzlenýär. Şeýle-de bolsa, synap görmek üçin aňsat zat, inýeksiýa edilen analitiň massasyny azaltmak we pikiň görnüşiniň gowulaşýandygyny görmekdir. Eger şeýle bolsa, onda bu meseläniň "massanyň artykmaç ýüklenmesi"diginiň gowy alamatydyr. Bu ýagdaýda, usul kiçi analit massalaryny inýeksiýa etmek bilen çäklenmelidir ýa-da uly massalar inýeksiýa edilende hem gowy pik şekillerini alyp boljak ýaly hromatografiki şertler üýtgedilmelidir.
Şeýle hem, pik gabygynyň köp sanly mümkin bolan fiziki sebäpleri bar. Mümkinçilikleriň jikme-jik ara alnyp maslahatlaşylmagy bilen gyzyklanýan okyjylar “LC näsazlyklaryny çözmek” žurnalynyň ýakynda çykan başga bir sanyna (11) ýüzlenýärler. Pik gabygynyň has köp ýaýran fiziki sebäpleriniň biri injektor bilen detektoryň arasyndaky nokatda gowşak baglanyşykdyr (12). Ekstremal mysal birnäçe hepde mundan ozal meniň laboratoriýamda alnan 1d suratda görkezilen. Bu ýagdaýda, biz öň ulanmadyk täze injektor klapany bolan ulgam gurduk we poslamaýan polat kapillýara galyplanan ferrula bilen kiçi göwrümli injektor halkasyny gurnadyk. Ilkinji näsazlyklary çözmek boýunça käbir tejribelerden soň, injektor klapan statoryndaky port çuňlugynyň biziň öwrenişimizden has çuňdugyny we portuň aşagynda uly öli göwrümiň emele gelendigini gördük. Bu mesele injektor halkasyny başga bir turba bilen çalşyrmak arkaly aňsatlyk bilen çözülýär, portuň aşagyndaky öli göwrümiň ýok edilmegi üçin ferrulany dogry ýagdaýa sazlap bileris.
1e-nji suratda görkezilen ýaly depe frontlary fiziki ýa-da himiki meselelerden hem döräp biler. Öňdäki gyranyň umumy fiziki sebäbi, sütün bölejikleriniň düşeginiň gowy gaplanmadyklygy ýa-da bölejikleriň wagtyň geçmegi bilen täzeden düzülmegidir. Bu fiziki hadysa sebäpli depe guýruklary ýaly, muny düzetmegiň iň gowy usuly sütüni çalşyp, dowam etdirmekdir. Esasan, himiki gelip çykyşly öňdäki gyranyň depe şekilleri köplenç "çyzykly däl" saklamak şertleri diýip atlandyrýan zatlarymyzdan döräp biler. Ideal (çyzykly) şertlerde, hereketsiz faza tarapyndan saklanýan analitiň mukdary (şonuň üçin saklamak faktory) sütündäki analitiň konsentrasiýasy bilen çyzykly baglanyşyklydyr. Hromatografik taýdan, bu sütüne inýeksiýa edilen analitiň massasy artdygyça, depe has beýik bolýar, ýöne giň bolmaýar diýmekdir. Bu gatnaşyk saklamak häsiýeti çyzykly däl bolanda bozulýar we depeler diňe bir beýik däl, eýsem has köp massa inýeksiýa edilende has giň bolýar. Mundan başga-da, çyzykly däl şekiller hromatografik depeleriň şekilini kesgitleýär, bu bolsa öňdäki ýa-da yzdaky gyralara getirýär. Çuňňur guýruklara sebäp bolýan massanyň artykmaç ýüklenmesi ýaly (10), depe Çyzyksyz saklanma sebäpli dörän öňdebaryjylygy, inýeksiýa edilen analit massasyny azaltmak arkaly hem anyklap bolýar. Eger pikiň görnüşi gowulaşsa, usul öňdebaryjy gyra sebäp bolýan inýeksiýanyň hilinden geçmez ýaly üýtgedilmeli ýa-da bu hereketi azaltmak üçin hromatografik şertler üýtgedilmeli.
Käwagt biz 1f-nji suratda görkezilişi ýaly, "bölünen" depe ýaly görünýän zady synlaýarys. Bu meseläni çözmegiň ilkinji ädimi, depe görnüşiniň bölekleýin bilelikde elýusiýa (ýagny iki aýry, ýöne ýakyn elýusiýa edýän birleşmeleriň bolmagy) sebäplidigini kesgitlemekdir. Eger hakykatdanam biri-birine ýakyn elýusiýa edýän iki dürli analit bar bolsa, onda bu olaryň çözgüdini gowulandyrmak meselesidir (meselem, selektiwligi, saklanyşyny ýa-da plastinka sanyny köpeltmek arkaly) we görünýän "bölünen" depeler fiziki taýdan baglanyşyklydyr. Işleýişiň sütün bilen hiç hili baglanyşygy ýok. Köplenç bu kararyň iň möhüm açary, hromatogrammadaky ähli depeleriň bölünen şekilleri görkezýändigi ýa-da diňe bir ýa-da iki sanydygydyr. Eger ol diňe bir ýa-da iki bolsa, bu, ähtimal, bilelikde elýusiýa meselesidir; eger ähli depeler bölünen bolsa, bu, ähtimal, fiziki meseledir, ähtimal, sütün bilen baglanyşyklydyr.
Sütüniň öz fiziki häsiýetleri bilen baglanyşykly bölünen depeler, adatça, giriş ýa-da çykyş fritleriniň bölekleýin tıkanmagy ýa-da sütündäki bölejikleriň täzeden gurnalmagy sebäpli ýüze çykýar, bu bolsa sütün kanalynyň emele gelmeginiň käbir ýerlerinde hereketli fazanyň hereketli fazadan has çalt akmagyna mümkinçilik berýär (başga sebitlerde (11). Bölekleýin tıkanan frit käwagt sütündäki akymy yzyna öwürmek arkaly arassalanyp bilner; ýöne, meniň tejribämde, bu adatça uzak möhletli däl-de, gysga möhletli çözgütdir. Häzirki zaman sütünlerinde bölejikler sütün içinde gaýtadan birleşse, bu köplenç ölüme getirýär. Bu nokada sütünini çalşyp, dowam etmek iň gowusydyr.
1g-nji suratdaky iň ýokary dereje, şeýle hem ýakynda meniň öz laboratoriýamda geçirilen mysaldan, adatça signalyň şeýle ýokarydygyny we jogap aralygynyň ýokary derejesine ýetendigini görkezýär. Optiki siňdiriş detektorlary üçin (bu ýagdaýda UV-wis), analit konsentrasiýasy örän ýokary bolanda, analit detektor akym öýjüklerinden geçýän ýagtylygyň köp bölegini özüne siňdirýär we anyklanjak ýagtylyk örän az galýar. Bu şertlerde fotodetektordan gelýän elektrik signalyna dürli ses çeşmeleri, meselem, daşlaşan ýagtylyk we "garaňky tok" güýçli täsir edýär, bu bolsa signalyň görnüşini örän "bulan" edýär we analit konsentrasiýasyndan garaşsyz bolýar. Şeýle bolanda, meseläni köplenç analitiň inýeksiýa göwrümini azaltmak - inýeksiýa göwrümini azaltmak, nusgany suwuklaşdyrmak ýa-da ikisini hem ulanmak arkaly aňsatlyk bilen çözüp bolýar.
Hromatografiýa mekdebinde biz nusgadaky analit konsentrasiýasynyň görkezijisi hökmünde detektor signalyny (ýagny, hromatogrammadaky y okuny) ulanýarys. Şonuň üçin signaly noldan aşak bolan hromatogrammany görmek geň görünýär, sebäbi ýönekeý düşündiriş şeýle: bu negatiw analit konsentrasiýasyny görkezýär - elbetde, bu fiziki taýdan mümkin däl. Meniň tejribämde, optiki siňdiriş detektorlary ulanylanda (meselem, UV-vis) negatiw pikler köplenç syn edilýär.
Bu ýagdaýda, negatiw pik diňe sütünden çykýan molekulalaryň pikden öň we soň hereketli fazanyň özünden az ýagtylygy siňdirýändigini aňladýar. Mysal üçin, bu, deňeşdirme boýunça pes anyklaýyş tolkun uzynlyklary (<230 nm) we şu tolkun uzynlyklarynda ýagtylygyň köpüsini siňdirýän hereketli faza goşundylary ulanylanda ýüze çykyp biler. Şeýle goşundy metanol ýaly hereketli faza eriji bölekleri ýa-da asetat ýa-da format ýaly bufer bölekleri bolup biler. Aslynda, kalibrleme egrisini taýýarlamak we takyk mukdary maglumat almak üçin negatiw pikleri ulanyp bolýar, şonuň üçin olardan gaça durmagyň esasy sebäbi ýok (bu usul käwagt "gytaklaýyn UB anyklaýyş" diýlip atlandyrylýar) (13). Şeýle-de bolsa, eger biz hakykatdanam negatiw piklerden düýbünden gaça durmak islesek, siňdiriş anyklaýyş ýagdaýynda, iň gowy çözgüt analitiň hereketli fazadan has köp siňdirmegi üçin başga bir anyklaýyş tolkun uzynlygyny ulanmak ýa-da hereketli fazanyň düzümini analitlerden has az ýagtylygy siňdirmegi üçin üýtgetmekdir.
Nusgadaky analitden başga komponentleriň, mysal üçin eriji matrisasynyň, döwülme görkezijisi hereketli fazanyň döwülme görkezijisinden tapawutly bolanda, döwülme görkezijisini (RI) anyklamak ulanylanda hem negatiw pikler peýda bolup biler. Bu UV-görnüş anyklamak bilen hem bolýar, ýöne bu täsir RI anyklamasyna garanyňda gowşaýar. Iki ýagdaýda hem, nusga matrisasynyň düzümini hereketli fazanyň düzümine has ýakynlaşdyrmak arkaly negatiw pikleri azaltmak mümkin.
LC näsazlyklaryny çözmegiň esasy mowzugynyň üçünji böleginde men synlanan pik görnüşiniň garaşylýan ýa-da adaty pik görnüşinden tapawutlanýan ýagdaýlary ara alyp maslahatlaşdym. Şeýle meseleleriň netijeli çözülmegi garaşylýan pik görnüşlerini bilmekden başlanýar (teoriýa ýa-da bar bolan usullar bilen öňki tejribä esaslanýar), şonuň üçin bu garaşylýan zatlardan çykmalar aýdyňdyr. Pek görnüşindäki meseleleriň köp dürli mümkin bolan sebäpleri bar (aşa giň, gyrymsy, öň tarapy we ş.m.). Bu bölümde men iň köp görýän sebäplerimiň käbirini jikme-jik ara alyp maslahatlaşýaryn. Bu jikme-jiklikleri bilmek näsazlyklary çözmäge başlamak üçin gowy ýer döredýär, ýöne ähli mümkinçilikleri öz içine almaýar. Sebäpleriň we çözgütleriň has çuňňur sanawy bilen gyzyklanýan okyjylar LCGC-niň “LC näsazlyklaryny çözmek boýunça gollanma” diwar diagrammasyna seredip bilerler.
(4) LCGC “LC Näsazlyklary Düzetmek boýunça Gollanma” diwar diagrammasy. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Hromatografiýada maglumatlary seljermek we signallary işläp taýýarlamak (Elsevier, Nýu-Ýork, Nýu-Ýork, 1998), sah. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF we Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.